คู่มือปฏิบัติการแบคทีเรียและเชื้อรา กรมวิทย์ 2561

ตารางท่ี 2-4 การเก็บสงิ่ ส่งตรวจเพือ่ วนิ จิ ฉยั โรคติดเชอ้ื รา

ชนดิ สิ่งส่งตรวจ/ ปริมาณ/ภาชนะบรรจุ วธิ ีเกบ็ เวลาและอุณหภูมขิ อง ขอ้ แนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวงั
ต�ำแหน่งท่ีเก็บ แผ่น slide สะอาด
ผิวหนัง ปราศจากไขมัน การน�ำส่ง การเก็บรกั ษา

ผม แผ่น slide สะอาด 1. ใช้ 70% alcohol เช็ด lesion บริเวณที่สงสัย ภายใน 24 ชม. ไม่เกิน 2
ปราศจากไขมนั 2. ใชใ้ บมดี ขดู ผวิ หนงั บรเิ วณขอบของ lesion ทอี่ ุณหภูมหิ ้อง สปั ดาห์
หรือ Petri-dish ใสบ่ น slide ที่อณุ หภูมิหอ้ ง
3. ใชใ้ บมีดเขย่ี ผิวหนงั ทขี่ ูดไดใ้ หม้ ารวมกัน สำ� หรบั
ตรงกลาง slide Dermatophytes
4. นำ� slide อกี แผน่ ปิดทบั แลว้ ใส่ซอง และไมเ่ กิน
กระดาษหรือซอง plasticหรือห่อดว้ ย 1 สัปดาห์
กระดาษ ที่อุณหภมู ิห้อง
สำ� หรับ
Candida

1. ดงึ ผมจากบรเิ วณศรี ษะรอบๆ lesion ภายใน 24 ชม. ไมเ่ กิน 2
ใส่ลงบน slide หรอื Petri-dish ทีอ่ ุณหภูมหิ อ้ ง สัปดาห์

2. น�ำ slide อีกแผน่ ปดิ ทับแลว้ ใสซ่ อง ท่อี ณุ หภูมิหอ้ ง
กระดาษหรอื ซอง plastic หรือห่อดว้ ย
สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 29 กระดาษ

30 คมู่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา ตารางที่ 2-4 การเกบ็ ส่งิ ส่งตรวจเพ่ือวินจิ ฉยั โรคตดิ เชอ้ื รา (ต่อ)

ชนดิ ส่ิงสง่ ตรวจ/ ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุ วธิ เี ก็บ เวลาและอุณหภมู ขิ อง ข้อแนะน�ำหรอื ข้อควรระวัง
ต�ำแหนง่ ทเี่ กบ็
เลบ็ การนำ� สง่ การเก็บรักษา

cornea แผ่น slide สะอาด 1. ขดู บริเวณรอยต่อระหวา่ งเลบ็ สว่ นที่ดกี บั ภายใน 24 ชม. ไมเ่ กนิ 1 สปั ดาห์
CSF ปราศจากไขมนั ส่วนทเี่ สยี ใส่ slide ทีอ่ ณุ หภูมหิ ้อง ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ้ ง
vaginal 2. ใชใ้ บมีดเข่ยี เลบ็ ทขี่ ดู ได้ให้มารวมกนั
secretion ตรงกลาง slide
3. น�ำ slide อีกแผน่ ปดิ ทบั แลว้ ใสซ่ อง
กระดาษหรือซอง plastic หรอื ห่อดว้ ย
กระดาษ

- 1. ใช้ sterile swab จมุ่ น�้ำเกลอื หมาดๆ ส่งทันท่ีภายใน - ถ้าตอ้ งการทำ� KOH preparation ดว้ ย
ปา้ ยท่ี cornea 15 นาที ให้ทำ� swab อีกอัน และปา้ ย swab
2. น�ำ swab ป้ายลงบน mycobiotic agar ทีอ่ ณุ หภูมิหอ้ ง ลงบน slide

1 ml/ภาชนะปราศจาก เกบ็ โดยใช้ sterile technique สง่ ทนั ทีภ่ ายใน -
เช้ือ 15 นาที
ท่อี ุณหภูมหิ อ้ ง

1 ml/ภาชนะสะอาดทมี่ ี swab จาก vagina ใส่ลงในน้�ำเกลอื ส่งทนั ที่ภายใน - 1. ใชต้ รวจหาเชอ้ื รา โดยทำ� saline wet mount
น้ำ� เกลือ 15 นาที 2. กรณีที่ตอ้ งการเพาะหาเชื้อราให้ท�ำ swab
ทอ่ี ุณหภมู ิหอ้ ง อกี 1 วัน ปา้ ยลงบนอาหารเลยี้ งเชอ้ื รา
โดยตรง

ตารางที่ 2-4 การเก็บสง่ิ สง่ ตรวจเพือ่ วินจิ ฉัยโรคตดิ เชื้อรา (ต่อ)

ชนิดสิ่งสง่ ตรวจ/ ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุ วิธีเก็บ เวลาและอุณหภมู ขิ อง ขอ้ แนะน�ำหรอื ข้อควรระวงั
ตำ� แหนง่ ท่ีเกบ็ การน�ำส่ง การเก็บรกั ษา ควรหยด sterile saline ลงไป เพ่ือปอ้ งกนั
ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 8 ชม. ชน้ิ เนือ้ แห้ง
tissue ≥ 1 cumm /ภาชนะ 1. ทำ� biopsy โดยตัดช้ินเนอื้ มาประมาณ ทีอ่ ุณหภูมิห้อง ท่ี 4 °C
ปราศจากเชือ้ อยา่ งนอ้ ย 1 cumm

urine 10–15 ml/ภาชนะ 2. ใสใ่ นภาชนะปราศจากเช้อื ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 24 ชม.
blood ปราศจากเชื้อ เก็บโดยใชว้ ิธีสวนใสภ่ าชนะปราศจากเช้ือ ท่ีอณุ หภมู ิห้อง ที่ 4 °C
5-10 ml/ ขวด ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม.
bone marrow hemoculture เหมือนกับการเจาะเกบ็ เพ่ือเพาะเชอ้ื ทีอ่ ณุ หภมู ิหอ้ ง ท่ีอุณหภูมหิ อ้ ง
body fluids สำ� หรับเพาะเชอ้ื รา แบคทเี รยี
- pleural, synovial ขวด hemoculture ภายใน 2 ชม. ไม่เกิน 24 ชม. ควรทำ� smear ด้วยถา้ ตอ้ งการตรวจหา
- ascitis , bile ส�ำหรบั เพาะเช้ือรา แพทยเ์ ป็นผเู้ จาะ โดยใช้ sterile technique ทีอ่ ุณหภูมิหอ้ ง ทอ่ี ุณหภมู หิ อ้ ง histoplasma หรอื Penicillium marneffei
- pericardial 10-15 ml/ภาชนะ ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 24 ชม.
ปราศจากเช้ือ แพทยเ์ ปน็ ผู้เจาะ โดยใช้ sterile technique ที่อุณหภมู ิหอ้ ง ทอี่ ณุ หภูมหิ อ้ ง

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 31

เอกสารอ้างอิง

1. Baron EJ, Thomson RB. Specimen Collection, Transport , and Processing : Bacteriology. In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical
Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.228-271.
2. Linscott AJ. Specimen Collection, Transport, and Acceptability. In : Garcia LS. Clinical
Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM Press; 2010. P 2.1.1-2.1.26.
3. Miller JM, Holms HT. Specimen Collection, Transport and Storage. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,
Tenover FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 6th ed. Washington, DC: ASM Press;
1995. p. 33-63.
4. NCCLS. Quality control of Microbiological transports Systems; Approved standard. NCCLS
document M40-A. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayene, Pennsylvania 19087-1898,
USA 2003.
5. สุรางค์ เดชศิริเลิศ, สุวรรณา ตระกูลสมบูรณ์, กาญจนา คชินทร. แนวปฏิบัติการเจาะเลือดเพ่ือเพาะเชื้อ
และการเพาะเช้ือก่อโรคจากเลือด. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย; 2553.หน้า 1-10.

32 คมู่ อื การปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

บ3ทที่

การวินจิ ฉัยโรคติดเช้อื จาก
สง่ิ ส่งตรวจด้วย
กลอ้ งจลุ ทรรศน์

การวินจิ ฉัยโรคตดิ เช้อื จากสิ่งสง่ ตรวจด้วยกล้องจลุ ทรรศน์

มาลัย วรจิตร
ณฏั ฐีวรรณ ปนุ่ วนั

หลักการ

การตรวจสิง่ สง่ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์เปน็ วิธีการวนิ จิ ฉัยโรคติดเช้อื อย่างรวดเร็ว จัดเป็น point of care test
การตรวจทางกลอ้ งจลุ ทรรศนอ์ าจดสู ดหรอื ทำ� การยอ้ มสตี า่ งๆ ตามความเหมาะสม เชน่ ยอ้ มแกรม เพอ่ื วนิ จิ ฉยั โรค
ตดิ เชอื้ แบคทเี รยี ยอ้ ม acid fast bacilli (AFB) เพอ่ื วนิ จิ ฉยั การตดิ เชอื้ มยั โคแบคทเี รยี ยอ้ ม modified acid fast bacilli
เพ่ือวินิจฉยั การตดิ เช้ือ Nocardia กบั Rodococcus การใช้ india ink เพ่ือดู yeast cells ที่มี capsule หนาๆ และการ
ใช้ KOH ช่วยยอ่ ย keratin จะชว่ ยใหเ้ หน็ เสน้ ใยเช้อื ราไดช้ ดั ขึ้น
การยอ้ มแกรมเม่อื ย้อมแบคทีเรียดว้ ย crystal violet สีจะซมึ เขา้ ภายในเซลล์ของแบคทีเรียและเมอื่ ย้อมทับด้วย
gram iodine ซ่ึงจะซึมเข้าภายในเซลล์ของแบคทีเรียเช่นกัน สี crystal violet และ iodine จะรวมกันเป็น crystal
iodine complex ซงึ่ มโี มเลกลุ ทใี่ หญข่ น้ึ จงึ ไมส่ ามารถหลดุ ออกจากเซลลไ์ ดเ้ มอื่ ลา้ งนำ�้ แตเ่ มอื่ ลา้ งดว้ ย alcohol/acetone
ซึ่งเป็นสารที่ละลายไขมันได้จึงไปล้างไขมันท่ีผนังเซลล์ของแบคทีเรีย แบคทีเรียที่มีไขมันที่ผนังเซลล์มากจะเกิด
รูขนาดใหญ่ทีผ่ นงั เซลล์ทำ� ให้ crystal iodine complex หลดุ ออกจากเซลล์แบคทีเรยี ได้ จงึ ย้อมติดสี safranin เป็น
สีแดงเรียกแบคทีเรียแกรมลบ แบคทีเรียที่มีไขมันที่ผนังเซลล์น้อยกว่าขนาดของรูท่ีเกิดขึ้น เมื่อล้างด้วย alcohol/
acetone ในลกั ษณะเดยี วกนั จะมขี นาดเลก็ กวา่ crystal iodine complex จงึ ไมห่ ลดุ ออกจากเซลลแ์ ละไมต่ ดิ สี safranin
จงึ ยอ้ มตดิ สมี ่วงเรียกแบคทเี รียแกรมบวก การตดิ สแี กรมจะผิดพลาดไดถ้ า้ ล้างดว้ ย alcohol/acetone มากหรอื น้อย
เกินไป
การยอ้ มแกรมเปน็ วธิ กี ารทใ่ี ชแ้ ยกแบคทเี รยี ทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารจลุ ชวี วทิ ยา โดยอาศยั รปู รา่ ง ขนาด ลกั ษณะเซลล์
และการตดิ สแี กรม ใชใ้ นการวนิ จิ ฉยั สาเหตกุ ารตดิ เชอ้ื เบอื้ งตน้ อยา่ งรวดเรว็ และชว่ ยในการประเมนิ คณุ ภาพของสงิ่
ส่งตรวจ การย้อมแกรมเปน็ วธิ ีท่ี Christian Gram เปน็ ผคู้ ิดขึน้ ในปี ค.ศ. 1884 วิธที ใี่ ช้ในปจั จบุ ันเปน็ วิธที ี่ Hucker
ไดป้ รบั ปรงุ จากวธิ เี ดมิ ใหน้ ำ�้ ยามคี วามคงทม่ี ากขนึ้ และแยกเชอื้ ไดด้ กี วา่ เดมิ (ปี ค.ศ. 1921) นอกจากนยี้ งั มวี ธิ ที พี่ ฒั นา
ให้เหมาะสมกบั การย้อมแบคทเี รยี ชนดิ ตา่ งๆ เชน่ anaerobic bacteria เชอื้ Legionella spp., Campylobacter spp.,
Brucella spp. เปน็ ตน้ การแปลผลการยอ้ มแกรมตอ้ งคำ� นงึ ถงึ การตดิ สี ขนาด รปู รา่ งของเซลลแ์ ละการเรยี งตวั ปจั จยั
ทมี่ ผี ลตอ่ คณุ สมบตั เิ หลา่ น้ี ไดแ้ ก่ อาหารเลยี้ งเชอ้ื การอบเชอ้ื วธิ กี ารยอ้ มสี และสารยบั ยง้ั เชอื้ ทมี่ ใี นการแปลผลการ
ย้อมแกรมจากส่ิงส่งตรวจ นอกจากจะใช้คุณสมบัติดังกล่าวมาใช้ในการแปลผลยังต้องน�ำการตรวจพบเซลล์ชนิด
ต่างๆของรา่ งกายมาพจิ ารณาประกอบด้วย
AFB stain เช้ือมัยโคแบคทีเรียทนต่อการล้างด้วยสารละลายกรด + แอลกอฮอลล์ เม่ือย้อมด้วย carbol
fuchsin เนอื่ งจากมีสว่ นประกอบไขมัน (mycolic acid) ท่ผี นังเซลลม์ าก การย้อมสี acid fast เปน็ วธิ กี ารตรวจหา
มัยโคแบคทเี รียทีเ่ รว็ ท่สี ดุ สามารถใช้ในการดผู ลการรักษาผูป้ ่วย โดยเจอื จาง sediments ท่ีทดสอบความไวและย้อม
หาเชอื้ ที่ตดิ สี acid fast ใน culture วธิ ี acid fast ท่ใี ช้กวา้ งขวางทส่ี ดุ คอื วิธขี อง Kinyoun และ fluorochrome วธิ ี
fluorochrome เป็นวธิ ที แ่ี นะนำ� ใหใ้ ชต้ รวจในส่ิงสง่ ตรวจ เพราะมีความไวสูงและทำ� ได้รวดเรว็ เพราะสามารถตรวจ
ดูด้วยก�ำลังขยายต�่ำ เม่ือได้ผลบวกจึงท�ำการตรวจยืนยันด้วยวิธี Kinyoun ในการย้อม AFB ต้องใช้สไลด์ใหม่และ
สะอาดเสมอ

34 คมู่ อื การปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

ภาพที่ 3-1 การยอ้ มสี acid-fast ในการตรวจหามยั โคแบคทเี รยี

Modified acid fast stain เปน็ เทคนคิ ทใ่ี ชต้ รวจหาเชอื้ partially acid fast เชน่ Nocardia, Rhodococcus เปน็ ตน้
โ ด ยเปลIย่ีnนdiสaีลI้าnงkจจาะกไกมรถ่ ดูกHaCbsloใrนbeแdอโลดกยอเซฮอลลล์เ์หปรน็ อื แHค2SปOซ4ูลใขนอแงอยลีสกตอ์ เฮมอ่อื ลนลำ� ์ยีสต์ท่มี ีแคปซลู มาผสมกับ india ink จะ
เหน็ แคปซูลเปน็ สใี สวาว ๆ รอบเซลล์ของยีสต์ และมพี ื้นหลังสีดำ� ของ india ink สำ� หรบั ยีสต์ทมี่ แี คปซูลทพ่ี บใน
สงิ่ สง่ ตรวจสว่ นใหญเ่ ปน็ Cryptococcus neoformans จงึ ใชว้ ธิ นี ใี้ นการวนิ จิ ฉยั ผปู้ ว่ ยตดิ เชอื้ C. neoformans ในระบบ
ประสาทสว่ นกลาง
การตรวจทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์ โดยไมค่ ำ� นงึ ถงึ วา่ จะใชส้ ยี อ้ มใด โดยทว่ั ไปมวี ตั ถปุ ระสงคข์ องการทำ� คอื เพอื่ ตรวจ
คณุ ภาพของสง่ิ สง่ ตรวจ ชว่ ยในการวนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชอื้ เปน็ แนวทางสำ� หรบั แปลผลการเพาะเชอื้ เพอ่ื เปน็ ตวั บง่ ชว้ี า่
ควรทำ� การทดสอบใดเพ่มิ เตมิ และใชเ้ ป็นตวั ควบคุมคุณภาพการเพาะเช้ือ

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 35

การวินจิ ฉัยโรคตดิ เชอ้ื โดยการตรวจสง่ิ ส่งตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

เปน็ การดำ� เนนิ การในขนั้ แรกเพอื่ วนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชอื้ นบั วา่ เปน็ สง่ิ สำ� คญั มาก โดยเฉพาะอยา่ งยง่ิ โรคตดิ เชอื้ รา เชอื้
เจริญเตบิ โตช้าบนอาหารเพาะเล้ียงเชอื้ ควรรายงานผลเบื้องตน้ ให้แพทย์ทราบก่อน แพทยอ์ าจจะใชข้ ้อมูลในขั้น
ตอนนเี้ ตรยี มทำ� การรกั ษาผปู้ ่วยได้ การวินิจฉยั โรคติดเช้อื ราจากส่งิ ส่งตรวจดว้ ยกล้องจลุ ทรรศน์ ไดแ้ ก่ การตรวจ
สดในสารละลาย 10-30% potassium hydroxide (KOH) การตรวจสดในอนิ เดียองิ ค์ (India ink preparation) การ
ย้อมสีแกรม การยอ้ มสี modified acid-fast และวธิ ียอ้ มสีพเิ ศษตา่ งๆ
วิธีการท่ีใช้วินิจฉัยโรคติดเชื้อราจากสิ่งส่งตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ขึ้นกับชนิดของสิ่งส่งตรวจและชนิดของ
โรคท่ีสงสัย สิ่งส่งตรวจส่วนมากจะท�ำการตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide ส่ิงส่งตรวจที่เหมาะสม
กับการตรวจวิธีน้ี ได้แก่ ผิวหนัง ผม เล็บ และมิวคัสเมมเบรนท่ีสงสัยโรคเกล้ือน (tinea versicolor) โรคกลาก
(dermatophytosis) และ candidiasis นอกจากนย้ี ังเหมาะสมกับการตรวจหา dematiaceous fungi ในสะเก็ดแผล
แหง้ ท่ีผิวหนังท่สี งสัยโรคตดิ เชื้อราท่ีมสี าเหตจุ ากราด�ำ (chromomycosis) สารละลายผสม potassium hydroxide
และ dimethyl sulfoxide เหมาะกบั การตรวจสด สง่ิ ส่งตรวจเลบ็ สง่ิ สง่ ตรวจหนองจากแผลหรอื ชน้ิ เนอ้ื จากแผลท่ี
สงสัยโรค eumycotic mycetoma สารละลายผสมนจ้ี ะยอ่ ย keratin ไดด้ ี ไมต่ ้องลนไฟนำ� ไปดใู ตก้ ลอ้ งจุลทรรศนไ์ ด้
ทนั ที

การวนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชือ้ แบคทเี รียโดยการยอ้ มแกรมสงิ่ สง่ ตรวจผู้ป่วย
สงิ่ ส่งตรวจผปู้ ว่ ยที่เก็บมาใหม่ๆ จะไดผ้ ลถูกต้องทส่ี ุด
วิธปี ฏิบตั ิงาน
1. สีย้อม Hucker’s modification
1.1 stock crystal violet ประกอบด้วย
crystal violet 20 g
ethanol 95% 200 ml
1.2 stock oxalate solution ประกอบดว้ ย
ammonium oxalate 8 g
นำ�้ กลั่น 800 ml
ผสมสารละลาย 1.1 และ 1.2 เขา้ ดว้ ยกนั ตงั้ ไวอ้ ยา่ งนอ้ ย 24 ชวั่ โมง กอ่ นกรองและนำ� ไปใชเ้ ปน็ working solution
1.3 Gram iodine solution ประกอบดว้ ย
iodine crystals 1 g
potassium iodide 2 ml
น�ำ้ กลั่น 240 ml
บด iodine และ potassium iodide ในโกรง่ เติมนำ�้ 2-3 ml บดจนละลายหมดแลว้ เติมน้ำ� กล่ันจนครบ 240 ml
แล้วเติม sodium bicarbonate 5% aqueous solution 60 ml (sodium bicarbonate 3 g ในน�้ำกล่ัน 60 ml) ผสมให้
เขา้ กัน และเกบ็ ในขวดสีนำ�้ ตาล
ข้อควรระวัง iodine เป็นสารกัดกร่อน (corrosive) จึงต้องระวังไม่หายใจเข้าไป ห้ามรับประทานหรือถูก
กับผวิ หนัง

36 คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

1.4 Decolorizer ท่ลี า้ งไดช้ า้ คือ ethanol 95% ทีล่ ้างไดป้ านกลาง คอื สารผสมของ acetone-alcohol
(ethanol 95% : reagent grade acetone = 1:1) สารทีล่ ้างได้เร็วที่สดุ คือ acetone (reagent grade)
ขอ้ ควรระวัง ethanol และ acetone เปน็ สารไวไฟ
decolorizer ทใ่ี ชใ้ นการยอ้ มแกรมแบบรวดเร็วคอื (acetone-iodine solution) ประกอบดว้ ย
strong iodine solution :
iodine 10 g
potassium iodide 6 g
น้�ำกลน่ั 10 ml
บด iodine, potassium iodide ในน้�ำกลนั่ ใหล้ ะลายแล้วเติม 10% ethanol ใหค้ รบ 100 ml ผสมให้เข้ากนั
working solution:
strong iodine solution 3.5 ml
acetone 96.5 ml
1.5 counterstain ประกอบดว้ ย
stock solution:
safranin O 2.5 ml
ethanal 95% 100 ml
working solution:
stock solution 10 ml
นำ้� กล่นั 100 ml

2. การเตรียมตวั อย่าง
การ smear ทด่ี คี วรไดเ้ ปน็ ชิน้ เดี่ยว (monolayer) ของเช้อื และเซลล์ มกี ารกระจายสมำ�่ เสมอและสามารถ
ดูลักษณะการเรียงตัวของเช้ือได้ชัดเจน ควรใช้สไลด์ที่สะอาด ปราศจากไข การย้อมจากส่ิงส่งตรวจที่ต้องท�ำการ
เพาะเชือ้ ดว้ ย ถา้ ใชไ้ ปเปตหรือไม้พันส�ำลี (swab) อนั เดียวกนั ตอ้ งท�ำการเพาะเชอื้ กอ่ นเสมอ การทำ� smear สงิ่ ส่ง
ตรวจผู้ป่วยต้องสวมถงุ มือและเคร่อื งปอ้ งกนั อ่ืนท่เี หมาะสม ตามหลกั ของ universal precaution
2.1 สงิ่ สง่ ตรวจทเี่ ปน็ swab ควรแยก swab สำ� หรบั เพาะเชอ้ื และยอ้ มแกรม ใหห้ มนุ swab ไปตามยาว
ของสไลด์ ไมต่ อ้ งกดแรงๆ เพราะจะทำ� ให้เซลลแ์ ตกและการเรยี งตัวของเชื้อเสียไป ในกรณีท่ีได้
รับ swab เพียงอันเดียว ให้ใส่ swab ในน้�ำเกลือปราศจากเช้ือเล็กน้อย แล้วน�ำไป vortex บิด
swab กับฝาผนังด้านในหลอด และนำ� ไป smear บนสไลด์ ปลอ่ ยใหแ้ หง้ ในอากาศ ส่วนท่เี หลอื
ในหลอดใช้ในการเพาะเชอื้
2.2 สิง่ สง่ ตรวจทไี่ มไ่ ดร้ ับเปน็ swab เชน่ หนอง เสมหะ อจุ จาระ ถ้าเป็นหนองทเี่ จาะใส่ syringe มา
ให้ถ่ายหนองท้ังหมดลงในหลอดปราศจากเช้ือ vortex ส่ิงส่งตรวจให้เช้ือกระจายสม่�ำเสมอ
ไม่รับส่ิงส่งตรวจที่อยู่ใน syringe ที่มีเข็มติดมาด้วย ควรให้ปลดเข็มออกจาก syringe ก่อนส่ง
สง่ิ สง่ ตรวจ ใช้ swab ไปเปตหรอื loop ปราศจากเชอ้ื เขย่ี สว่ นของสง่ิ สง่ ตรวจทม่ี หี นองหรอื เลอื ด
ถ้าสิ่งส่งตรวจเหนียวมากอาจหยดน�้ำเกลือปราศจากเช้ือ 1 หยดบนสไลด์เพ่ือเจือจางจะท�ำให้
smear ได้ง่ายขึน้ เกลย่ี สิง่ ส่งตรวจใหก้ ระจายเปน็ ฟลิ ์มบางๆ ปล่อยให้แหง้ ในอากาศ

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทัว่ ไป 37

2.3 น้ำ� ไขสันหลัง และส่งิ คดั หลง่ั อ่นื ๆ การใช้เครอื่ ง cytospin slide centrifuge จะชว่ ย concentrate
ส่ิงคัดหล่ังที่ smear ซึ่งจะช่วยเพิ่มความไวของการย้อมแกรมและลดเวลาท่ีใช้ในการปั่นให้หา
บริเวณท่ีมีส่ิงส่งตรวจได้ง่ายขึ้น ในกรณีท่ีไม่ได้ใช้เคร่ือง cytospin slide centrifuge ให้ปั่นน้�ำ
ไขสันหลัง/ส่ิงคัดหล่ังด้วย centrifuge ใช้ไปเปตปราศจากเช้ือดูดส่วนข้างบนออกให้เหลือ
ประมาณ 0.5 ml vortex เพื่อให้ตะกอนแตกออก จากนั้นใช้ไปเปตปราศจากเช้ือดูดมาหยดบน
สไลด์ สะอาดปราศจากไข 1 หยด ไม่ต้องเกลี่ยสิ่งส่งตรวจให้กระจาย ปล่อยให้แห้งในอากาศ

ภาพที่ 3-2 เครอ่ื ง cytospin slide centrifuge
2.4 ปัสสาวะที่จะย้อมแกรมห้ามปั่น เขย่าขวดให้ปัสสาวะกับตระกอนเข้ากันดี ใช้ไปเปตปราศจาก
เช้ือดูดปัสสาวะมาหยดลงบนสไลด์สะอาดปราศจากไข ไม่ต้องเกลี่ยให้กระจาย ปล่อยให้แห้ง
ในอากาศ
2.5 สง่ิ สง่ ตรวจทีแ่ หง้ หรอื สง่ิ สง่ ตรวจท่ีมีขนาดเล็กมาก ให้ละลายสง่ิ ส่งตรวจในน้ำ� เกลอื ปราศจาก
เชื้อ 0.5 ml ใชไ้ ปเปตปราศจากเช้อื ดูดมาหยดบนสไลด์สะอาดปราศจากไข 1 หยด ใชป้ ลาย
ไปเปตเกล่ียส่ิงสง่ ตรวจให้กระจายเป็นฟลิ ม์ บางๆ ปล่อยให้แห้งในอากาศ

2.6 ชนิ้ เนือ้ (biopsy) อาจท�ำแบบ touch หรือ ground specimen preparation ก็ได้ โดยใชก้ รรไกร
หรือใบมีดท่ีปราศจากเชื้อตัดช้ินเนื้อให้เป็นชิ้นเล็กๆ ใช้ forceps หยิบชิ้นเนื้อมากดบนสไลด์
สะอาดปราศจากไข ใหท้ ำ� หลายๆ ครง้ั โดยใหอ้ ยใู่ กลๆ้ กนั เพอื่ จะไดอ้ า่ นสไลดไ์ ดง้ า่ ย หรอื บดชนิ้
เนื้อใหล้ ะเอียด ใชไ้ ปเปตปราศจากเชอื้ ดดู มาหยดบนสไลดส์ ะอาดปราศจากไข 1 หยด ใช้ปลาย
ไปเปตเกล่ียสิ่งส่งตรวจใหก้ ระจายเป็นฟิล์มบางๆ มีเสน้ ผา่ นศนู ย์กลางประมาณ 1 cm ปลอ่ ยให้
แหง้ ในอากาศ

38 คู่มอื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รียและรา

3. การ fix smear (อาจใชค้ วามร้อนหรอื methanol กไ็ ด้)
3.1 การใช้ความร้อน น�ำสไลด์มาวางบน electric slide warmer 60 °C จนแห้งหรือผ่านสไลด์ที่
แหง้ ในเปลวไฟ 2-3 ครั้ง หรอื เอาสไลดม์ าอังไวห้ นา้ เครื่องเผา loop 5 วินาที อยา่ ใช้ความร้อนมาก
ไปหรอื fix สไลด์ขณะที่ยงั ไมแ่ หง้ และปล่อยให้สไลดเ์ ย็นก่อนน�ำไปย้อมสี
3.2 การใช้ methanol จะช่วยป้องกันไม่ให้เม็ดเลือดแดงและเซลล์อ่ืนๆ ของร่างกายแตก และ
ทำ� ให้มีพ้นื หลงั (background) ท่ดี สู ะอาด การ fix ดว้ ย methanol เปน็ วิธีที่ใชไ้ ดด้ กี ับส่งิ ส่งตรวจ
ผปู้ ่วย โดยเฉพาะปสั สาวะเพราะจะชว่ ยป้องกันไม่ให้หลุด วธิ ที �ำปล่อยให้สไลดท์ ี่ smear แห้งใน
อากาศ แล้วหยด methanol 2-3 หยดบนสไลด์ ปล่อยไว้นาน 1 นาที เท methanol ออก โดย
ไมต่ ้องล้างน้ำ� ปล่อยให้สไลด์แห้ง ไมต่ อ้ งใชค้ วามรอ้ น
4. วิธกี ารย้อมสี
4.1 หยด working crystal violet solution ลงบนสไลด์ทิ้งไวป้ ระมาณ 1 นาที แลว้ ลา้ งน้�ำสะอาด
4.2 หยด Gram iodine บน slide ทง้ิ ไว้ประมาณ 1 นาที แลว้ ล้างน�ำ้ สะอาด
4.3 Decolorize ด้วย acetone iodine แล้วล้างน้ำ� สะอาดทนั ที
4.4 ย้อมทบั ด้วย Safranin 30 วินาที ลา้ งน้ำ� สะอาดแลว้ ผง่ึ ให้แหง้ นำ� ไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ โดย
ตรวจดว้ ยก�ำลงั ขยาย 10 x 10 เทา่ แล้วดรู ายละเอียดดว้ ยก�ำลงั ขยาย 10 x 100 เทา่

การรายงานผลและแปลผลการยอ้ มแกรมสง่ิ ส่งตรวจต่างๆ

1. ผลและการแปลผล ให้ดคู ุณภาพทว่ั ๆ ไปกอ่ นด้วยกำ� ลงั ขยาย 10 x 10 เทา่ โดยดูว่า decolorized ดหี รือไม่ ถา้
ย้อมได้ดีพ้ืนหลังต้องสะอาด ถ้ามีเม็ดเลือดขาวต้องย้อมติดสีแกรมลบ ระวังไม่อ่านตะกอนสีเป็นเช้ือแบคทีเรีย ดู
ความหนาของ smear วา่ เซลลไ์ มท่ บั ซ้อนกันและจะไมท่ �ำใหแ้ ปลผลผิด
2. การตรวจดูด้วยกำ� ลงั ขยาย 10 x 10 เพ่ือดวู ่ามกี ารอกั เสบหรือไม่ โดยดู
- จ�ำนวนของ PMNs, mononuclear cells
- จ�ำนวนของ squamous epithelial cells แบคทเี รียทเ่ี ป็นเชื้อประจำ� ถน่ิ
- ตำ� แหน่งและการเรยี งตวั ของแบคทีเรีย
3. ตรวจด้วยกำ� ลังขยาย 10 x 100 เท่า โดยดหู ลายๆ พนื้ ที่ เพอื่ ดูว่ามเี ชอ้ื หรือไม่
- ถา้ ไมเ่ ห็นเชอื้ ให้รายงานว่า “No organism seen”
- ถ้าพบเช้ือให้รายงานคร่าวๆ และบอกลักษณะของเช้ือท่ีพบ ในกรณีท่ีแบคทีเรียติดสีม่วง อ่านผลเป็น
แกรมบวก ในกรณีท่ีแบคทีเรียติดสีแดง อ่านผลเป็นแกรมลบ บอกรูปร่างลักษณะ เช่น cocci, bacilli
หรือ coccobacilli และการเรยี งตวั เชน่ เป็น chain หรอื clusters เปน็ ตน้
4. ดูรูปรา่ งของแบคทเี รยี ทพ่ี บเป็นส่วนใหญ่
- รปู รา่ งโดยรวมเปน็ coccus, coccoid, coccobacilli, bacilli, fragment, yeast-like
- ลกั ษณะปลายเซลล์ กลม แบน ป่องออก เวา้ เขา้ การบวมออกข้างๆ แสดงว่าอาจมสี ปอร์ แต่อาจเกดิ
จาก vacuole กไ็ ด้ มีรปู ร่างไมแ่ นน่ อน หรอื ตดิ สีไม่แน่นอน เปน็ ต้น
- ลักษณะดา้ นข้าง เป็นลกั ษณะขนาน ทรงรี เวา้ หรือไมแ่ น่นอน

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 39

- รปู ร่างไม่แน่นอน pleomorphism ซง่ึ อาจใช้ค�ำว่า diphtheroid หรอื coryneform ในการบรรยายลักษณะ
ของแบคทีเรียแกรมบวก รูปแท่งที่มรี ปู ร่างไมแ่ นน่ อน หรอื ติดสไี มส่ ม่�ำเสมอ เรียงตวั เป็นซ่ีรั้วหรอื เป็น
มมุ (V และ L shape)
5. การรายงานผล ควรรายงานให้ผู้ที่อ่านรายงานเกิดความสนใจ หรือถ้าผลที่ได้มีความส�ำคัญควรรายงานให้
แพทยท์ ราบทางโทรศพั ท์
- การรายงานผลจากส่ิงส่งตรวจผูป้ ่วย ปสั สาวะใหต้ รวจอย่างนอ้ ย 20 fields ใหร้ ายงานผลวา่ พบเช้อื เม่ือ
เห็นเชื้อเฉลี่ย 1 เซลล์หรือมากกว่า per oil immersion field ซงึ่ แสดงว่ามเี ชอ้ื > 105 CFU/ml
- รายงานจ�ำนวนเชอ้ื ท่ีพบคร่าวๆ โดยรายงานเปน็ ตวั เลข (numerical) หรือบรรยายว่ามากน้อย
(descriptive) กไ็ ดโ้ ดยใช้เกณฑด์ ังน้ี
5.1 การรายงานเปน็ ตวั เลข
1+ (<1 per oil immersion field)
2+ (1 per oil immersion field)
3+ (2 ถงึ 10 per oil immersion field)
4+ (predominant หรอื >10 per oil immersion field)
5.2 การบรรยายว่ามากหรือน้อย
rare (< 1 per oil immersion field)
few (1 ถึง 5 per oil immersion field)
moderate (5 ถงึ 10 per oil immersion field)
many (>10 per oil immersion field)
6. การตรวจสอบการย้อมแกรม หลังจากรายงานผลแล้วให้เก็บสไลด์ไว้นานพอที่จะน�ำกลับมาดูใหม่ได้ โดย
เฉพาะอยา่ งยง่ิ ในกรณที ่ผี ลการเพาะเชือ้ หรือผลการทดสอบอ่นื ๆ ไมไ่ ปดว้ ยกนั การเก็บสไลดใ์ หท้ �ำดงั น้ ี
- ซับ oil ออก ในกรณีทตี่ อ้ งการเกบ็ เป็นสไลดท์ ใี่ ชใ้ นการสอน อาจใช้ xylene ล้าง oil ออก และปิดสไลด ์
ดว้ ย permount และ cover slip เพอ่ื ปอ้ งกนั ไมใ่ หส้ ซี ดี สไลดท์ ไ่ี มใ่ ชแ้ ลว้ ใหท้ ง้ิ เปน็ มลู ฝอยตดิ เชอ้ื และมคี ม
- ถ้าเห็นว่าควรจะท�ำการย้อมสีอ่ืน เมื่อดูผลการย้อมแกรมแล้วแต่ไม่มีส่ิงส่งตรวจท่ีจะน�ำมาย้อมได้ อาจ
ทำ� การยอ้ มสไลดท์ ท่ี ำ� การยอ้ มแกรมแลว้ นไี้ ด้ โดยลา้ ง oil ออกดว้ ย xylene ลา้ งสไลดด์ ว้ ย acetone-alcohol
จนไม่มสี ี แลว้ ดำ� เนินการยอ้ มสใี หม่

การควบคมุ คุณภาพ

1. ตรวจดสู ที ใ่ี ชย้ อ้ มทกุ วนั วา่ ไมม่ ตี ะกอนสี ถา้ มคี วรกรองกอ่ นใช้ การระเหยจะมผี ลตอ่ คณุ ภาพของสที ใ่ี ชจ้ งึ ไม่
ควรเทสใี ส่ขวดครั้งละมากๆ
2. ท�ำการยอ้ มเชอ้ื ทีใ่ ช้ควบคุมคุณภาพ คือ Escherichia coli ATCC 25922 และ Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 หรือ Staphylococcus aureus ATCC 25923 ทกุ วันและทุกครง้ั ทเ่ี ปล่ียนสีใหม่ ผลท่ีควรได้คือ
Escherichia coli เป็นแกรมลบรปู แท่ง
Staphylococcus epidermidis เปน็ แกรมบวกรปู กลม
Staphylococcus aureus เปน็ แกรมบวกรปู กลม

40 คูม่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

หรืออาจใช้สิ่งที่ขูดมาจากซอกฟันมาย้อม เพ่ือควบคุมคุณภาพก็ได้ เพราะจะได้ทั้งแบคทีเรียแกรมลบและ
แกรมบวก
3. ปัจจยั ทีท่ ำ� ใหผ้ ลการย้อมแกรมไมด่ ี
ก. ใช้สไลดท์ ่ีไม่ไดท้ ำ� ความสะอาดกอ่ น การแช่สไลดใ์ น 95% ethanol จะท�ำให้สไลดส์ ะอาดปราศจากไข
เวลาใช้ใหห้ ยิบสไลด์มาเชด็ หรือลนไฟกอ่ น
ข. smear หนาเกนิ ไป
ค. ใชค้ วามร้อนมากไปขณะท่ี fix สไลด์
ง. ล้างนำ�้ มากเกินไปขณะทย่ี ้อมสี
จ. เพือ่ ควบคมุ คุณภาพของการยอ้ มแกรมจงึ ควรมีระบบการตรวจสอบการรายงานผลการย้อมแกรม โดย
หวั หนา้ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทำ� การสมุ่ สไลดท์ ร่ี ายงานแลว้ มาตรวจซำ�้ หรอื เปรยี บเทยี บผลการเพาะเชอ้ื กบั ผล
การย้อมแกรมท่ีรายงานว่ามีความขัดแย้งกันหรือไม่ และควรจัดเก็บตัวอย่างสไลด์ที่สวยๆ ไว้เพ่ือใช้ใน
การสอน

Escherichia coli

Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus

ภาพที่ 3-3 ลักษณะการตดิ สแี ละการเรยี งตวั ของเชอื้ ทีใ่ ช้ควบคมุ คณุ ภาพการย้อมแกรม

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 41

ตารางที่ 3-1 ลกั ษณะของเชอ้ื ทพี่ บในสิ่งส่งตรวจตา่ งๆ และการรายงานผล
ก. แบคทีเรียแกรมบวกที่พบในส่งิ ส่งตรวจผปู้ ่วย

เช้อื การรายงานผล สงิ่ ส่งตรวจ ขอ้ เสนอแนะ

Actinomyces spp. Thin, beaded, branched Cervicofacial ทรวงอก ถา้ มี sulfur granules ล้าง
gram-positive filaments; ช่องทอ้ ง องุ้ เชิงกราน และบดบนสไลดแ์ ละย้อม
may be within sulfur นำ�้ จากปอดหรือนำ้� ล้าง modified AFB stain
granules with peripheral ปอด
clubs

Nocardia spp. Long, thin, branching, เสมหะ นำ�้ ล้างปอด ช้ินเนื้อ ย้อม modified AFB stain
beaded, gram-positive or หนอง เลือด นำ้� ไขสันหลงั การเพาะเชื้อท่ี 45 °C จะ
irregularly staining bacilli ช่วยให้เช้อื เจริญไดเ้ รว็ ขึ้น

Mycobacterium spp. Gram-positive beaded or ทางเดินหายใจ ปสั สาวะ ย้อม AFB stain
gram-neutral bacilli; found ช้นิ เน้ือ น�้ำไขสันหลงั
inside macrophage; bacilli
may be short to long,
banded or beaded, and/or
slightly curved; some
species appear
pleomorphic and coccoid

Corynebacterium spp. Gram-positive เลอื ด ชิ้นเนอื้ แผลท่ผี ิวหนัง หากสงสยั ว่าติดเช้อื
pleomorphic, club-shaped, indwelling catheters C. diphtheriae ในการเพาะ
irregularly staining bacilli ลนิ้ หัวใจเทียม เชอ้ื ให้เพม่ิ อาหารพเิ ศษ
or coccobacilli with ทางเดินหายใจส่วนบนและ
palisading and/or angular สว่ นล่าง
arrangements
C. jeikeium Small coccobacilli
resembling streptococci

Propionibacterium spp. Gram-positive, very เลือด น้�ำไขสันหลัง แผล การหา propionic acid โดย
pleomorphic “diphtheroid” จากผวิ หนงั สง่ิ คัดหลงั่ GLC มักพบเป็นเช้อื ปน
forms that may branch อืน่ ๆ เปื้อนจากผิวหนงั ในขณะ
เกบ็ สิง่ สง่ ตรวจ

42 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

ก. แบคทีเรยี แกรมบวกทพี่ บในสงิ่ สง่ ตรวจผปู้ ว่ ย (ต่อ)

เชื้อ การรายงานผล สิ่งส่งตรวจ ข้อเสนอแนะ
Listeria
Gram-positive small to น�้ำไขสันหลงั เลอื ด น้ำ� คร่�ำ ดู wet mount จากสงิ่ ส่ง
monocytogenes medium coccobacilli that รกหรือชิน้ เนอื้ จาก fetal ตรวจโดยตรง เพ่ือดู
may be pleomorphic; tumbling motility; ถา้ มีเชือ้
Erysipelothrix occur in short chains or หลายชนิดปนกนั การใชว้ ธิ ี
rhusiopathiae palisades; อาจสับสนกบั cold enrichment อาจช่วย
เช้อื Corynebacterium หรอื ให้แยกเช้อื น้ไี ด้
Lactobacillus spp. enterococci
Bacillus spp.
ในช้ินเนื้อรายงานเป็น ชิ้นเนื้อจากผวิ หนงั เก่ียวขอ้ งกับอาชีพทีส่ มั ผสั
Clostridium long, slender, gram- เลือด สตั ว์
perfringens positive bacilli ในเลอื ด
รายงานเปน็ small
“coryneforms”

Medium, straight, uniform มกั พบเป็น mixed infection การเพาะเชือ้ ในสภาวะไร้
gram-positive bacilli with ไมค่ ่อยพบจากเลือดหรอื น�ำ้ ออกซเิ จนจะชว่ ยให้เชื้อ
rounded ends; may form ไขสนั หลงั เจรญิ ได้ดยี งิ่ ข้ึน
chains or spirals;
sometimes short and
coccobacillary

Medium to large อาจพบในส่ิงสง่ ตรวจหลาย มักพบปนเปอื้ นในการเพาะ
square-ended gram- ชนดิ ในผปู้ ่วยที่มีภูมิคุม้ กัน เช้อื อาจพบเป็นสาเหตกุ าร
positive bacilli with บกพร่อง หรอื ผู้ท่ฉี ีดยาเสพ ตดิ เชื้อทต่ี า
parallel sides with or ตดิ และพบเป็นสาเหตกุ าร
without spores; some ติดเชอ้ื ทตี่ า
species have spores that
swell sides; may stain
gram variable or gram
negative with age

Gram-positive large เลือด แผล หนองจากชอ่ ง ทำ� การเพาะเชอื้ บน EY
“boxcars” with no spore; ท้อง แกลาระไอมบพ่ ใบนภPาMวNะทs่ไีอรา้ จOใ2ช้
may stain gram-negative เปน็ เครอื่ งบ่งชว้ี า่ เปน็
clostridial myonecrosis;
เป็นเช้ือประจำ� ถ่นิ ในลำ� ไส้

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทวั่ ไป 43

ก. แบคทีเรยี แกรมบวกทีพ่ บในสง่ิ สง่ ตรวจผู้ปว่ ย (ตอ่ )

เช้ือ การรายงานผล สงิ่ ส่งตรวจ ข้อเสนอแนะ
Clostridium spp. เปน็ เชื้อประจำ� ถิ่นของทาง
Gram-positive, gram- เลือด แผลในชอ่ งทอ้ ง ฝี เดนิ อาหารและระบบ
Streptococcus variable, or gram-negative สืบพนั ธุ์
pneumoniae bacilli, with or without
spores; bacilli may be อาจใช้ Quelling test หรือ
Enterococcus spp. large, slender and short, or การตรวจหา antigen ใน
long; sometimes form สิ่งส่งตรวจบางชนดิ
Streptococcus coils; often small than เช้ือประจ�ำถน่ิ ของทางเดนิ
viridans Bacillus spp. อาหาร พบเปน็ สาเหตุการ
Gram-positive cocci in ทางเดนิ หายใจสว่ นลา่ ง ตดิ เช้อื ในผปู้ ว่ ยท่ไี ดร้ บั การ
pairs, lancet shapes, short เลือด น้ำ� ไขสันหลัง รักษาดว้ ย expanded-
chains สารคัดหลง่ั อ่ืนๆ spectrum cephalosporins
อาจแยกได้ยากกับ
Gram-positive cocci in ปสั สาวะ แผลติดเชื้อ Corynebacterium และ
pairs, short chains; อาจมี เลอื ด ฝีในชอ่ งท้อง lactobacilli อาจใช้ antigen
ลักษณะที่คล้ายกบั detection ส�ำหรบั
S. pneumoniae Streptococcus group A
และ B การพบ S. bovis ใน
Gram-positive cocci in เลือด น้�ำไขสันหลัง เลอื ด มีความสัมพันธก์ ับ
pairs tetrads, clusters มะเรง็ ของ colon (ล�ำไส้)
การเพาะเชอ้ื nutritionally
variant streptococci อาจ
เพาะบน blood agar และท�ำ
cross streak ด้วย S. aureus

44 คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ก. แบคทีเรยี แกรมบวกท่ีพบในสง่ิ สง่ ตรวจผูป้ ว่ ย (ต่อ)

เชื้อ การรายงานผล สิง่ สง่ ตรวจ ข้อเสนอแนะ
Staphylococcus spp. Gram-positive cocci in
pairs, tetrads, clusters ฝี แผลตดิ เชอื้ ทางเดิน เชอ้ื ประจ�ำถ่ินของผิวหนัง
Stomatococcus หายใจ ชิ้นเนอื้ สารคัดหลัง่ และโพรงจมกู
mucilaginosus large gram-positive cocci ตา่ งๆ indwelling catheters
in pairs, tetrad
เลือด (ผ้ปู ว่ ยภมู คิ ้มุ กนั เชื้อประจ�ำถน่ิ ในช่องปาก
บกพร่อง) peritoneal
dialysates

ข. แบคทเี รียแกรมลบทพ่ี บในสง่ิ สง่ ตรวจผปู้ ว่ ย

เชื้อ การรายงานผล สิง่ สง่ ตรวจ ขอ้ เสนอแนะ
เชื้อทีเ่ ป็นสาเหตขุ องการ
Enterobacteriaceae Straight thick baclli; short ทางเดินปัสสาวะ ติดเช้ือในโรงพยาบาลมกั
to medium length with แหลง่ อนื่ ๆ ด้อื สารต้านจลุ ชพี หลาย
rounded ends; antimicrobial ชนดิ
-agent-affected
microorganisms may be อาจใช้วธิ ี direct antigen
pleomorphic, filamentous, detection เพื่อหา
and/or irregular staining Haemophilus type b จาก
สงิ่ ส่งตรวจผูป้ ว่ ยโดยตรง
Haemophilus spp., Small coccoid to bacillary เลือด นำ้� ไขสันหลงั ในการเพาะเชอ้ื ตอ้ งใช้
Pasteurella spp., forms; pleomorphic; often ทางเดนิ หายใจสว่ นลา่ ง อาหารพิเศษ การย้อมจาก
fastidious gram-neg- with filamentous forms ฝี แผลตดิ เช้ือ ตา สง่ิ ส่งตรวจที่มเี ชอื้ หลาย
ative bacilli อาจติดสซี ีด ระบบสืบพนั ธ์ุ ชนิดอาจใช้ Gimenez stain
จะพบเชือ้ ไดด้ ขี ้ึน
Legionella spp. pleomorphic slender ทางเดินหายใจสว่ นล่าง ถ้ามีเช้ือหลายชนิดปนกนั
bacilli of variable lengths การใช้อาหารเลยี้ งเชอ้ื เช่น
that may stain pale ในสง่ิ TCBS จะแยกเช้อื ไดด้ ขี ้นึ
ส่งตรวจผ้ปู ่วยเชอื้ อาจย้อม
สีไม่ตดิ

Vibrio spp. Slightly curved to straight อจุ จาระ แผลติดเชอื้
bacilli

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 45

ข. แบคทเี รยี แกรมลบทพ่ี บในสิง่ สง่ ตรวจผปู้ ว่ ย (ตอ่ )

เช้ือ การรายงานผล ส่ิงสง่ ตรวจ ข้อเสนอแนะ

Pseudomonas spp. Thin bacilli; medium ปัสสาวะ ทางเดินหายใจ ถา้ เปน็ mixed infection ใช้
length to long with สว่ นลา่ ง แผลตดิ เชอ้ื ตา อาหารจ�ำเพาะส�ำหรับเช้อื นี้
rounded to pointy ends; แหลง่ อนื่ ๆ ในผ้ปู ว่ ย เชอ้ื ทเ่ี ป็นสาเหตุการติดเชื้อ
often in pairs; antimicrobial ภมู คิ ้มุ กนั บกพรอ่ ง ในโรงพยาบาลมกั ดอ้ื สาร
-agent-affected ต้านจลุ ชพี หลายชนิด
microorganisms may
appear filamentous, coiled,
and/or pleomorphic

Fusobacterium Long slender bacilli, with ทางเดินหายใจ แผลตดิ เชอ้ื เป็นเช้ือท่ีอยู่ในร่างกาย
nucleatum, tapered to pointed ends; เลือด ฝี
Capnocytophaga spp. “needlelike”; may be in
pairs, end to end, or
filamentous

Fusobacterium Highly pleomorphic bacilli แผล เลือด ฝี เปน็ เชอ้ื ทีอ่ ยู่ในร่างกาย
necrophorum, with rounded to tapered
ends; pale and irregularly
F. mortiferum, or staining, with bizarre
F. varium forms and round bodies

Bacteroides spp. Pleomorphic straight แผล เลือด ฝี อาจใช้วิธี direct fluores-
bacilli with possible cent-antibody stain เป็น
irregular to bipolar เช้ือท่ีอยใู่ นร่างกาย
staining

Neisseria spp., Medium to large cocci in ระบบสบื พันธุ์ ปสั สาวะ การหา N. meningitides
Moraxella catarrhalis, pairs and tetrads, coffee ทางเดนิ หายใจส่วนล่าง บาง serotype อาจใชว้ ิธี
Veillonella spp. bean shaped; no bacilli เลือด สารคัดหล่งั แผลตดิ direct antigen detection ได้
เชอ้ื ฝี ใช้ selective medium ใน
seen การเพาะเชือ้ ท่ีอยปู่ นกัน
หลายชนิด

Campylobacter spp. Thin, curved bacilli อจุ จาระ เลือด ชิน้ เนอื้ จาก การเพาะเชือ้ ในภาวะท่มี ี
Helicobacter spp included S shapes, gull กระเพาะ CO2 เพม่ิ ขึ้น และการใช้
42 °C จะแยกเชื้อได้ดี
wings, long spiral forms ขึน้

46 คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา

ข. แบคทีเรยี แกรมลบทพี่ บในส่ิงสง่ ตรวจผูป้ ว่ ย (ตอ่ )

เชื้อ การรายงานผล สิ่งส่งตรวจ ขอ้ เสนอแนะ
Acinetobacter spp. Medium to large cocci in ปสั สาวะ ทางเดนิ หายใจ
pairs; occasionally ส่วนล่าง เลือด สารคัดหลัง่
coccoid, bacillary, and แผลติดเชอื้ ฝี ชน้ิ เนื้อ
filamentous forms ตดิ สี อุจจาระ แหลง่ อื่นในผู้ปว่ ย
คอ่ นไปทางแกรมบวก ภมู ิคุ้มกนั บกพร่อง

ค. จลุ ชีพอ่นื ๆ ทตี่ รวจไดจ้ ากการทำ� direct smears สิง่ ส่งตรวจผู้ป่วย

เช้อื การรายงานผล สงิ่ ส่งตรวจ ข้อเสนอแนะ

Pneumocystis carinii Gram-negative spherical ปอด และ transtracheal ยืนยันด้วยการย้อมสี
cysts (5-7 μm) often biopsies, bronchial Grocott metenamine-
containing rosette of eight washings and lavage silver, toluidine blue O,
gram-negative intracystic sputum Gram-Weigert, หรอื การ
bodies; or cluster of ย้อม fluorescent stain
gram-negative cysts
surrounded by halos in
background of amorphous
gram-negative material

Candida spp. Gram-positive budding เสมหะ ปสั สาวะ เลอื ด เป็นเช้อื ทีอ่ ยูใ่ นร่างกาย
yeast cell with or without ชนิ้ เนอื้ สง่ิ คดั หล่ังจากชอ่ ง
pseudohyphae; may appear คลอด ทางเดินหายใจสว่ น
stippled or gram neutral บน

Cryptococcus Partially or completely น�ำ้ ไขสันหลัง เลอื ด ช้ินเน้อื ยนื ยนั โดยการทำ� India ink;
neoformans gram-positive round yeast เสมหะ bronchial washings direct antigen detection
cell with clear or red- แผลท่ีผิวหนงั กบั สิ่งสง่ ตรวจโดยตรง
orange halo; yeast cells
may appear stippled or
gram neutral

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 47

ค. จลุ ชีพอ่นื ๆ ทต่ี รวจไดจ้ ากการท�ำ direct smears สิ่งสง่ ตรวจผู้ป่วย (ตอ่ )

เชอื้ การรายงานผล ชนิดของสิง่ สง่ ตรวจ ข้อเสนอแนะ
Blastomyces Bronchial washings,
Gram-variable, broad- เสมหะ หนอง แผลท่ี
dermatitidis based, thick-walled yeast ผิวหนัง
cell with figure-eight
Malassezia furfur appearance ขูดจากผวิ หนัง เลอื ดทเี่ จาะ เพาะในอาหาร lipid-riched
Bottle-shaped yeast cells ผ่าน catheter lines medium
in compact clusters,
usually with short hyphal
elements

ขอ้ จำ� กัดของการย้อมแกรมเพ่อื วินจิ ฉยั โรคตดิ เชอ้ื

1. ควรใช้ผลการตรวจร่างกายและผลการตรวจอ่นื ๆ เพื่อชว่ ยสนบั สนนุ สิ่งทีไ่ ด้จากการยอ้ มแกรม
2. ผลการทดสอบจะถกู ตอ้ งมากนอ้ ยเพยี งใดขนึ้ กบั ความเเมน่ ยำ� ในการทดสอบ และประสบการณข์ องผทู้ ท่ี ำ� การ
ทดสอบและอา่ นผล
3. ควรทำ� การย้อมวิธีอ่นื ร่วมดว้ ยในกรณที ่สี ิ่งสง่ ตรวจเห็นเป็นหนองแต่ย้อมแกรมแล้วไมพ่ บเชือ้
4. สิ่งส่งตรวจท่ีย้อมแกรมแล้วพบเชื้อแต่เพาะเชื้อไม่ข้ึน อาจเน่ืองจากมีเชื้อปนเปื้อนในน้�ำยาท่ีใช้ มีสารต้าน
จุลชพี ในส่ิงส่งตรวจ หรือวิธีการเพาะเช้ือทใี่ ช้ไม่เหมาะสม เช่น อาหารเลยี้ งเช้ือท่ีใช้ บรรยากาศทใ่ี ชใ้ นการ
เพาะเชือ้ เปน็ ตน้
5. ส่ิงส่งตรวจน้อยเกนิ ไปอาจทำ� ให้ผลการย้อมแกรมไม่ถกู ตอ้ ง

ข้อจ�ำกัดของการยอ้ มแกรม

1. ผลการยอ้ มแกรมควรใช้รว่ มกบั ผลการทดสอบอนื่ เช่น การยอ้ มพเิ ศษ การเพาะเชอื้ การหา antigen
2. ทำ� การทดสอบอย่างถกู ต้องและทำ� ตามขอ้ กำ� หนดของการแปลผลเพือ่ ให้ผลที่ไดถ้ ูกตอ้ ง
3. ท�ำการยอ้ มสีอื่นๆ เพิม่ เตมิ ในกรณที ี่ไมพ่ บเช้ือจากการยอ้ มแกรม
4. การพบเช้ือจากการย้อมแกรมแต่เพาะเช้ือไม่ขึ้นอาจเกิดจากมีการปนเปื้อนเชื้อของน�้ำยาท่ีใช้ หรือเช้ือไม่
สามารถข้นึ บนอาหารและบรรยากาศท่ใี ชใ้ นการเพาะเช้ือ
5. ผลการย้อมแกรมทผ่ี ดิ พลาดอาจเกิดจากการเก็บสิง่ สง่ ตรวจมานอ้ ยเกนิ ไป

การวนิ ิจฉัยการตดิ เชอื้ ราโดยการตรวจสดในสารละลาย Potassium hydroxide

การตรวจสดในสารละลาย Potassium hydroxide ไมเ่ หมาะกบั การตรวจหา Histoplasma yeast cells เนอ่ื งจากเชอ้ื มี
ขนาดเล็กดูได้ยาก ดังนั้นถ้าแพทย์สงสัยโรค histoplasmosis ให้ตรวจสิ่งส่งตรวจโดยการย้อมสีแกรม หรือย้อมสี
Giemsa หรอื ยอ้ มสี Wright ถา้ มสี ยี อ้ มทง้ั 2 ชนดิ นพี้ รอ้ มใชอ้ ยใู่ นหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร ในกรณที ส่ี งสยั cryptococcosis ใน
สง่ิ สง่ ตรวจนำ้� ไขสนั หลงั ใหท้ ำ� การตรวจสดใน india ink การยอ้ มสแี กรมมปี ระโยชนใ์ นการตรวจหาแกรมบวก
aerobic actinomycetes แกรมบวกยสี ตใ์ นสกลุ Candida และยงั ชว่ ยใหเ้ หน็ การปนเปอ้ื นของแบคทเี รยี ในสงิ่ สง่ ตรวจ
ไดช้ ดั เจนขนึ้ การยอ้ มสี modified kinyoun acid fast มปี ระโยขนใ์ นการตรวจหา acid-fast aerobic actinomycetes


48 คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

วิธปี ฏบิ ตั ิงาน
1. การตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide
การวนิ จิ ฉัยราในกล่มุ Dermatophytes ทกี่ ่อโรคกลาก
สิง่ สง่ ตรวจ ผิวหนัง ผม
สารละลาย potassium hydroxide (KOH) ใช้ความเขม้ ขน้ 10-30 % โดยชงั่ KOH ละลายในนำ้� กลนั่
100 ml ใชก้ บั ผวิ หนงั และผม

การปฏบิ ัติ หยดสารละลาย KOH 1 หยด ลงบนแผน่ สไลดแ์ กว้ ใช้เข็มเขี่ยแตะส่งิ ส่งตรวจ (ส�ำหรบั
เส้นผมใช้คีมคีบ) จุ่มลงในหยดสารละลาย KOH บนแผ่นสไลด์แก้วท่ีเตรียมไว้ ปิดทับด้วย cover
glass ลนผ่านเปลวไฟ 3 ครงั้ ซับน�้ำยาส่วนเกินออก ท้ิงไว้ 5-30 นาที น�ำไปดูด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ ร่ิม
จากก�ำลังขยาย 10 X และตามดว้ ยกำ� ลังขยาย 40 X

2. การตรวจสดในสารละลายผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide
สิง่ ส่งตรวจ เลบ็
สารละลาย dimethyl sulfoxide 40 ml ผสมกบั นำ�้ กลนั่ 60 ml เติม KOH 20 g คนใหเ้ ขา้ กันจน KOH
ละลายหมด บรรจใุ สข่ วดที่มีจุกหยด
การปฏิบัติ ใช้กรรไกรตัดตัวอย่างเล็บเป็นชิ้นเล็กและบางเท่าที่จะท�ำได้ ใช้คีมคีบช้ินส่วนของเล็บ
จุ่มลงในหยดสารละลายผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide ที่หยดไว้ก่อนแล้ว 1
หยดบนแผน่ สไลดแ์ กว้ ปดิ ทบั ดว้ ย cover glass ไมต่ อ้ งลนไฟ นำ� ไปดใู ตก้ ลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ รมิ่ จากกำ� ลงั
ขยาย 10 X และตามดว้ ยกำ� ลังขยาย 40 X
การอ่านผลและรายงานผล
การตรวจสดโดยสารละลาย potassium hydroxide สำ� หรับสิ่งส่งตรวจผวิ หนังและเล็บ จะเหน็
ลักษณะของราในกลุม่ Dermatophytes เปน็ แบบเส้นใยใสมผี นังก้ันแตกกิ่งก้าน (hyaline branching
septate hyphae) หรอื พบลักษณะอาร์โธโคนิเดีย (arthroconidia) บนอพี ิทเี ลยี ลเซลล์

รายงานผล “hyaline branching septate hyphae, arthroconidia suggesting dermatophytosis”
ส่ิงสง่ ตรวจ เสน้ ผมจะพบลกั ษณะท่ีแตกต่างกนั 3 แบบคือ
1. เชอ้ื สร้างโคนิเดยี รปู ร่างกลมเกาะอย่ภู ายนอกเสน้ ผม (ectothrix) เปน็ ลกั ษณะการก่อโรคของรา
ในกลมุ่ Dermatophytes สกลุ Microsporum
รายงานผล “ectothrix infection suggesting dermatophytosis”
2. เช้อื สรา้ งโคนเิ ดยี รูปร่างกลมเจริญอยภู่ ายในเสน้ ผม (endothrix) เปน็ ลกั ษณะการก่อโรคของรา
ในกล่มุ Dermatophytes สกลุ Trichophyton
รายงานผล “endothrix infection suggesting dermatophytosis”
3. เชอื้ สรา้ งเส้นใยเปน็ ทอ่ นยาวเรียงตัวอยูใ่ นเสน้ ผมเปน็ ลักษณะเฉพาะของรากลมุ่ Dermatophytes
เชื้อ Trichophyton schuenleinii.
รายงานผล “favic infection suggesting dermatophytosis”

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 49

3. การตรวจสดสิง่ สง่ ตรวจทส่ี งสัยโรค cryptococcosis ใน India ink preparation
สง่ิ ส่งตรวจ นำ้� ไขสันหลงั
การปฏบิ ตั ิ หยด india ink 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์แก้วและตามดว้ ย 1 loop เต็มของสง่ิ สง่ ตรวจ ผสม
เข้าด้วยกันและปิดทับด้วย cover glass กดทับเบาๆให้เป็นแผ่นบาง ไล่ฟองอากาศออก น�ำไปดูด้วย
กล้องจุลทรรศน์เร่ิมจากก�ำลังขยาย 10 X และตามด้วยก�ำลงั ขยาย 40 X

การอ่านผลและรายงานผล
พบเซลล์ยสี ต์รูปรา่ งกลม ผนังเซลล์หนา มขี นาดแตกต่างกันไปตงั้ แต่ 3-20μm และพบเซลล์ยีสต์
แตกหนอ่ (budding yeasts) รอยตอ่ ของเซลลเ์ ป็นฐานแคบ พ้ืนสดี ำ� ทเี่ หน็ ในกล้องจุลทรรศน์เปน็ สดี ำ�
ของ india ink ซง่ึ ไม่สามารถซมึ ผ่านเขา้ ส่วนของแคปซลู ได้ จงึ เห็นแคปซลู เป็นสว่ นใส วาว อยู่รอบ
นอกของเซลล์ ความหนาแน่นของเชื้อมีมากข้ึน ความแตกต่างของขนาดของเซลล์ และความหนา
ของแคปซูลก็มีมากข้ึน encapsulated Cryptococci สามารถแยกความแตกต่างได้ชัดเจนกับ
oval blastospores ของ Candida การรายงานผลการตรวจสดสง่ิ สง่ ตรวจทส่ี งสยั โรคครปิ โตคอกโคซสี
ในอนิ เดยี องิ ค์ และตรวจพบ encapsulated yeast cells
รายงานผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”
หรือ “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”

50 คูม่ ือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

เอกสารอ้างอิง

1. Ayers LW. Microscopic Examination of Infected Materials. In: Mahon CR, Manuselis G editors.
Textbook of Diagnostic Microbiology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 2000. p. 261-310.
2. Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, 9th ed. St. Louis:
C.V. Mosby Co.; 1994.
3. Bartholomew JW. Variables influencing results, and the precise definition of steps in gram staining as a
means of standardizing the results obtained. Stain Technol. 1962;37:139-155.
4. Clarridge JE, Mullins JM. Microscopy and staining. In: Howard BJ editor. Clinical and Pathogenic
Microbiology. St. Louis: C.V. Mosby Co.; 1987. p. 87-103.
5. Engelkirk PG, Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In: Laboratory
Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Baltimore: Wolters Kluwer
Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p. 507-540.
6. Hazen KC, Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing (Microscopic Clinical
Specimen Examination). In: Garcia LS editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed.
Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007. p.8.3.1.1-9.
7. Howell SA, Hazen KC. Candida, Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance. In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of
Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.1793-1821.
8. Isenberg HI. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998.
p.39-50.
9. Mangels JI, Cox ME, Lindberg LH. Methanol fixation. An alternative to heat fixation of smears before
staining. Diagn Microbiol Infect Dis. 1984;2:129-137.
10. Murray PR, Washington JA. Microscopic and bacteriologic analysis of sputum. Mayo Clin. Proc.
1975;50:339-344.
11. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Gram stain. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical
Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 39-50.
12. Preston NW, Morrell A. Reproducible results with the Gram stain. J Path Bact. 1962;84:241-243.
13. Shanholtzer CJ, Schaper P, Peterson L. Concentrated Gram stain smears prepared with a cytospin
centrifuge. J Clin Microbiol. 1982;16:1052-1056.
14. Washington JA. Rapid diagnosis by microscopy. Clin Microbiol Newls. 1986;8:135-137.

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 51

52 คมู่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

บ4ทท่ี

ข้ันตอนการเพาะเชื้อ
จากสิง่ ส่งตรวจ

4.1 การเพาะเชือ้ จากเลือด สวุ รรณา ตระกูลสมบรู ณ์
วิภา ตรรี ตั น์วรี พงษ์
ฉันทนา อรญั ญะ

หลกั การ
การติดเชอ้ื แบคทเี รียในกระแสเลอื ด (bacteremia) ถอื เปน็ ภาวะวกิ ฤติทีอ่ าจทำ� ให้ผปู้ ่วยเกดิ ภาวะ septic shock
และเสยี ชวี ติ ไดค้ อ่ นขา้ งสงู การตดิ เชอ้ื อาจมาจากการทเ่ี ชอ้ื เขา้ สเู่ ลอื ดโดยตรงหรอื มาจากตำ� แหนง่ ตา่ งๆ ของรา่ งกาย
ทม่ี กี ารตดิ เชอ้ื ชนดิ นน้ั ๆ อยแู่ ลว้ เชน่ การตดิ เชอื้ จากแผลผา่ ตดั ระบบทางเดนิ หายใจ ระบบปสั สาวะ ระบบสบื พนั ธ์ุ
เป็นตน้
เชอ้ื ทเ่ี ปน็ สาเหตกุ อ่ โรคทพ่ี บบอ่ ยไดแ้ กเ่ ชอื้ ในกลมุ่ Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
spp., Streptococcus group A และ group อน่ื ๆ Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Enterococcus spp., Neisseria meningitidis และ Vibrio spp. เป็นตน้ เชอื้ ประจ�ำถ่นิ เช่น coagulase
negative staphylococci อาจเป็นสาเหตทุ ี่ทำ� ให้เกดิ การตดิ เชือ้ ในผ้ปู ่วยท่ีใส่สายตา่ งๆ เขา้ ไปในร่างกาย ผู้ป่วยมะเรง็
เบาหวาน ผูป้ ว่ ยทมี่ ีภาวะภูมิคุม้ กนั บกพร่อง ภาวะเมด็ เลือดขาวต่ำ� เปน็ ต้น
การพจิ ารณาวา่ เปน็ เชอ้ื กอ่ โรคหรอื ปนเปอ้ื น จะพจิ ารณารว่ มกบั อาการทางคลนิ กิ ของคนไข้ ระยะเวลาการเจรญิ
เติบโตของเช้ือที่ให้ผลบวกในแต่ละขวด จ�ำนวนขวดที่ให้ผลบวก และแบบแผนความไวของสารต้านจุลชีพของ
แตล่ ะขวด การเพาะเชอื้ จากเลอื ดจงึ เปน็ การวนิ จิ ฉยั ทตี่ อ้ งคำ� นงึ ถงึ ความถกู ตอ้ งการรายงานผลทรี่ วดเรว็ เปน็ แนวทาง
ส�ำหรับแพทยใ์ นการเลือกใช้สารต้านจลุ ชพี ทเี่ หมาะสมสำ� หรับผ้ปู ่วย

ขอบเขต
การเจาะเลอื ดเพอ่ื เพาะเช้อื การตรวจรบั สิง่ ส่งตรวจ การเพาะเช้ือจากเลือดดว้ ยวธิ ีทว่ั ไป (conventional method)
หลักการเพาะเชอ้ื จากเลือดด้วยระบบกงึ่ อัตโนมตั ิ การอ่านผลการเพาะเชือ้ การรายงานผลเมือ่ พบเช้อื จากการยอ้ ม
แกรม การรายงานผลเมื่อเสรจ็ สมบรู ณ์ การแปลผลและการควบคมุ คณุ ภาพการเพาะเชือ้ จากเลอื ด

วิธกี ารปฏิบตั งิ าน
ขน้ั ตอนการเจาะเลือดเพ่อื เพาะเชอ้ื
1. ก่อนเจาะเลอื ดควรทำ� ความสะอาดมือ โดยการลา้ งมือดว้ ยน้ำ� ยาท�ำลายเช้ือ เชน่ 4% Chlorhexidine gluconate
หรอื ใช้ alcohol hand rub และสวมถุงมอื สะอาด
2. ท�ำความสะอาดผิวหนังต�ำแหน่งท่ีจะเจาะเลือดด้วย 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol ซึ่งมี
ประสทิ ธภิ าพการฆา่ เชอื้ ดเี ทยี บเทา่ povidone-iodineแตแ่ หง้ เรว็ กวา่ และมรี ะยะเวลาในการรอคอยใหม้ ปี ระสทิ ธภิ าพ
ฆ่าเชือ้ สงู สุดสนั้ กว่า ใช้เวลารอให้แห้งและออกฤทธส์ิ ูงสดุ เพยี ง 30 วนิ าที ขณะท่ี povidone-iodine ใชเ้ วลานานถึง
2 นาที ผปู้ ฏบิ ตั งิ านมักไมร่ อถงึ 2 นาที นอกจากน้ี Chlorhexidine gluconate มฤี ทธ์คิ งเหลือหลงั ทาน�้ำยาดว้ ย จึงเปน็
นำ�้ ยาท่คี วรใชเ้ พื่อลดการปนเปื้อนในการเจาะเลือดเพอื่ เพาะเช้อื
3. การเชด็ ผวิ หนงั ใหว้ นจากดา้ นในออกด้านนอกอยา่ งนอ้ ย 5 cm เชด็ ด้วยความแรงนาน 30 วินาที และรอแหง้

54 ค่มู ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

ไมน่ ้อยกวา่ 30 วินาที เด็กแรกเกิดใช้ 70% alcohol หรอื povidone-iodine
4. เจาะเลือดเพือ่ เพาะเชื้อเม่อื ผูป้ ว่ ยมขี อ้ บ่งชี้สงสัยการตดิ เชอ้ื แบคทีเรยี หรอื เช้ือราในเลือด ควรเจาะช่วงทีม่ กี าร
แบง่ ตัวของเช้ือในเลอื ดจ�ำนวนมาก ระยะเริม่ มไี ข้
5. ควรเจาะเลือดก่อนรับยาปฏิชีวนะ กรณีได้รับยาปฏิชีวนะมาก่อนควรเจาะเร็วท่ีสุดหลังรับยาหรือเจาะที่ 15
นาทกี อ่ นรบั ยาปฏชิ วี นะครงั้ ตอ่ ไป กรณไี มเ่ รง่ ดว่ น เจาะเลอื ดสองครง้ั หา่ งกนั 15-30 นาที กรณตี อ้ งรบี ใหย้ าปฏชิ วี นะ
สามารถเจาะเลือดพร้อมกันจากต�ำแหน่งท่ีต่างกัน ถ้าสงสัยการติดเชื้อล้ินหัวใจเจาะอย่างน้อยสองขวดห่างกัน
12 ชม.
6. เจาะจากเสน้ เลอื ดดำ� บรเิ วณทไ่ี มม่ แี ผลหรอื รอยโรค ปรมิ าณเลอื ดตอ้ งใหไ้ ดต้ ามกำ� หนดของขวดเพาะเชอ้ื กรณี
ไม่สามารถเจาะเลือดได้ตามกำ� หนดตอ้ งบันทกึ ในใบส่งตรวจ
7. ทำ� ความสะอาดจกุ ของขวดเพาะเชอ้ื ดว้ ย 70% alcohol หรือ 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol
8. ใสเ่ ลอื ดลงขวดเพาะเชื้อโดยไมจ่ ำ� เป็นตอ้ งเปลีย่ นเข็ม หมุนขวดเบาๆ เพอ่ื ให้เลือดผสมกบั น�ำ้ ยาเพาะเช้อื
9. น�ำส่งห้องปฏิบัติการทันที ถ้าไม่สามารถส่งได้ทันทีหลังเจาะเลือดควรเก็บท่ีอุณหภูมิห้อง และต้องบันทึก
ระยะเวลาทรี่ อคอยกอ่ นสง่ ตรวจเปน็ ขอ้ มลู เพมิ่ เตมิ ของสง่ิ สง่ ตรวจในใบนำ� สง่ และควรคำ� นงึ ถงึ ผลกระทบทที่ ำ� ให้
เพ่ิมระยะเวลารอคอยผลและมีผลตอ่ ความปลอดภัยของผปู้ ่วยเน่อื งจากตอ้ งรายงานผลเป็นคา่ วกิ ฤต
ขัน้ ตอนการตรวจรับสิ่งสง่ ตรวจ ให้ตรวจสอบสงิ่ ตอ่ ไปน้ี
1. ชอื่ นามสกุลผ้ปู ว่ ยกบั ใบส่งตรวจถกู ต้องครบถว้ นสมบรณู ์
2. สภาพขวดหากพบมรี อยแตกรา้ ว ตอ้ งปฏเิ สธตวั อย่าง
3. ปริมาตรของเลอื ดทีเ่ จาะ ถา้ ไมเ่ หมาะสมต้องระบุในใบรายงานผล
4. การเก็บขวดเลอื ดหลงั จากการเจาะ ตอ้ งมวี ธิ กี ารเกบ็ ทถ่ี ูกตอ้ งเหมาะสมก่อนท�ำการเพาะเชื้อ เชน่ การเก็บ
ในอณุ หภูมทิ ถ่ี ูกต้องเหมาะสม ห้ามน�ำเข้าตเู้ ยน็
5. ไมม่ ีส�ำลีปดิ ทับบนจกุ ยางหรือมีสขี อง iodine บนจุกยาง ถา้ มีควรแจง้ ผู้ใชบ้ ริการใหแ้ ก้ไข
6. ระยะเวลานำ� สง่ หลงั เจาะเลือด ถา้ นานเกินกำ� หนดควรบนั ทึกในใบรายงานผล
การเพาะเช้ือจากเลือดดว้ ยวธิ ีท่ัวไป (conventional method)
การเตรียมอาหารเลย้ี งเช้ืออาจใช้ brain heart infusion broth, tryptic soy broth ทเ่ี ติมสารป้องกันการแข็งตวั ของ
เลือด 0.05% sodium polyanethol sulfonate (SPS) ปรมิ าณเลอื ดที่เก็บส�ำหรบั ผู้ป่วยผูใ้ หญ่ 5-10 ml ตอ่ อาหาร 45
ml สำ� หรบั ผปู้ ว่ ยเดก็ ปรมิ าณเลอื ด 1- 2 ml ตอ่ อาหาร 9 ml โดยอตั ราสว่ นระหวา่ งเลอื ดและปรมิ าณอาหารประมาณ
1:5 ถงึ 1:10 นำ� ขวด hemoculture อบท่ี 35-37 °C นาน 7 วัน ท�ำการเพาะเชื้อหลังอบขวดขา้ มคนื และรายงานผล
เบ้ืองต้น หากเชื้อยังไม่ขึ้นให้สังเกตดูการเจริญของเชื้อทุกวัน ขวดที่มีการเจริญของเชื้อจะมีลักษณะต่อไปนี้คือ
อาหารเล้ยี งเชื้อมีความขนุ่ บรเิ วณผวิ หนา้ หรือขุ่นทั้งขวด มีการแตกท�ำลายของเม็ดเลือดแดง มเี ม็ดสขี าวเลก็ ๆ อยู่
บนผวิ หน้า หรืออยู่เหนอื ชั้นเม็ดเลอื ด ขวดอาหารเลีย้ งเชอ้ื มีฟองกา๊ ซ หรอื ก้อน clot หรือมกี ้อนคล้ายสำ� ลี ในกรณี
ที่พบลกั ษณะดงั กล่าว ใหเ้ พาะเชื้อทนั ทีบน CA, BA และ MAC อบ plate CA ในบรรยากาศ 5-10 % CO2 ท่ี 35-
37 °C นาน 2-3 วนั ส�ำหรับ BA และ MAC อบ ที่ 35-37 °C นาน 2-3 วนั พรอ้ มกบั ป้ายลงสไลดท์ ำ� การยอ้ มแกรม

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 55

การเพาะเชอื้ จากเลอื ดดว้ ยระบบกึง่ อตั โนมัติ (continuously monitored automated blood culture system)
ปรมิ าณเลือดตอ่ ขวดประมาณ 5-8 ml ปริมาณทเี่ หมาะสมจะมีคำ� แนะจากบรษิ ทั ผผู้ ลติ ทบ่ี ง่ ชไ้ี วข้ า้ งขวด นำ�
ขวดใสเ่ ครอื่ งเพาะเชอื้ ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35-37 °C เครอ่ื งจะทำ� การตรวจอตั โนมตั อิ ยา่ งตอ่ เนอื่ งตามหลกั การทแ่ี ตกตา่ งกนั
ไปของแตล่ ะบริษัท ระยะเวลาในการอบขวดเพาะเชอื้ ภายใน 5 วัน ไมม่ คี วามจ�ำเปน็ ท่ตี ้องอบเพาะเชอ้ื เกนิ 5 วนั
สำ� หรับเชื้อทส่ี งสัยในกลุ่ม HACEK, Brucella, Capnocytophaga และ Campylobacter และไมม่ ีความจำ� เป็นใน
การทำ� blind subculture เมอ่ื พบการเจริญของเชื้อระบบจะมีการแจ้งเตือน (alarm) ผ่านหน้าจอ monitor น�ำขวดท่ี
ใหผ้ ลบวกออกมาทำ� การ subculture และย้อมแกรม พร้อมทัง้ โทรแจง้ ผลเบ้ืองต้น และออกใบรายงานผลเป็นลาย
ลักษณ์อักษรตามไปดว้ ยทุกครง้ั
หมายเหต ุ เพ่ือลดอัตราการปนเปื้อนควรใช้ 2% chlorhexidine gluconate in 70% alcohol ทำ� ความสะอาด
บรเิ วณจกุ ยาง หรืออาจใช้ 70% alcohol ในการเช็ดจกุ ขวดเพาะเชื้อ ไมแ่ นะน�ำให้ใช้สารที่มี iodine
เปน็ สว่ นประกอบเช็ดจุกยางเพราะอาจท�ำให้จกุ ยางเปลี่ยนสภาพได้
การอ่านผล
อา่ นผลการเพาะเชอื้ ทำ� การแยกชนดิ เชอื้ ทข่ี น้ึ บนอาหารเพาะเชอ้ื ที่ subculture ไว้ พรอ้ มทงั้ ทดสอบความไวของ
เชื้อตอ่ สารต้านจุลชีพ
การรายงานผล
การรายงานผลเบอื้ งต้น
1. กรณไี มม่ ีเช้ือเจรญิ (no growth) ใหร้ ายงานระยะเวลาทอ่ี บขวด (no growth at 24 hours, no growth at 48
hours หรอื no growth after x days) ท้ังนีจ้ �ำนวนวนั (x) ขนึ้ อยู่กบั นโยบายของห้องปฏิบตั ิการท่ีท�ำความ
ตกลงกบั แพทยใ์ นแตล่ ะโรงพยาบาล
2. กรณมี เี ชอ้ื เจริญ (positive culture) ทำ� การรายงานผลแกรม การตดิ สี รปู รา่ ง และลกั ษณะการเรียงตวั
เพือ่ เป็นประโยชนก์ ับแพทยใ์ นการพจิ ารณาเลอื กใชส้ ารตา้ นจุลชพี ทีเ่ หมาะสมต่อผปู้ ว่ ย การยอ้ มแกรม
ถอื เป็นคา่ วกิ ฤตทิ ี่ต้องรบี รายงานทันที การรายงานผลทางโทรศัพทต์ อ้ งบนั ทึกชื่อผ้รู ับแจ้ง วนั -เวลา
และผทู้ ีท่ �ำการแจ้ง พร้อมออกใบรายงานผลตามหลงั จากการแจง้ ทางโทรศัพทด์ ้วยทุกครั้ง
การรายงานผลท่ีเสรจ็ สมบรูณ์
1. กรณีไม่มีเชื้อเจริญ (no growth) ให้ระบุระยะเวลาที่เพาะเช้ือด้วยเช่น no growth after 7 days ส�ำหรับ
การเพาะเชื้อด้วยวิธี conventional method และ no growth after 5 days ส�ำหรับการเพาะเชื้อด้วยวิธี
continuously monitored automated blood culture system
2. กรณีมีเช้ือเจริญ (positive culture) รายงานผลการวินิจฉัยเชื้อ และผลความไวต่อสารต้านจุลชีพ ระบุ
จ�ำนวนขวดทใ่ี หผ้ ลบวกใน set น้นั
3. กรณีท่ีเพาะเช้ือโดยเคร่ืองตรวจอัตโนมัติ การรายงานเวลาขวดเลือดที่ให้ผลบวก (time to detection)
ในขวดที่เจาะจากเส้นเลือดด�ำ กับขวดที่เจาะจาก catheter ถ้าขวดที่เจาะผ่าน catheter ใช้เวลาที่ให้ผล
บวกนอ้ ยกว่าขวดท่เี จาะจากเส้นเลือดดำ� > 2 ชม. และเชอื้ ท่แี ยกไดจ้ ากท้งั สองขวดเปน็ เช้ือชนิดเดยี วกนั
แสดงว่าการติดเช้ือน้ันน่าจะมีความสัมพันธ์กับการใช้ catheter (Catheter-related bloodstream
infections) ดูความสอดคล้องกบั การติดเชอ้ื ในตำ� แหน่งต่างๆ และผลแกรมทร่ี ายงานเบือ้ งตน้

56 คูม่ อื การปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

4. ในใบรายงานผลควรระบุส่ิงที่ไม่สอดคล้องกับข้อก�ำหนดที่อาจมีผลต่อการเพาะเชื้อด้วยทุกครั้ง เช่น
เจาะเลือดปรมิ าณน้อยเกนิ ไป การส่งตัวอย่างล่าชา้ เปน็ ตน้
การแปลผลการเพาะเช้อื จากเลือด
เน่ืองจากพบมีอุบัติการณ์ของการติดเชื้อในกระแสเลือด ที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรียที่ปรกติไม่ได้เป็นเช้ือก่อโรค
หรือก่อโรคไมร่ นุ แรง เช่น เชอ้ื ประจำ� ถ่นิ (normal flora bacteria) ทีพ่ บในคนปรกติ การแปลผลการเพาะเช้อื จาก
เลอื ด เพอื่ แยกความสำ� คญั ของการพบเชอื้ ดงั กลา่ วออกจากการปนเปอ้ื นทำ� ไดย้ ากมาก เนอ่ื งจากในอกี ดา้ นหนงึ่ การ
พบการปนเป้ือนของเช้อื ในกระแสเลือด อาจทำ� ใหม้ กี ารใช้ยาตา้ นจุลชีพเกนิ ความจ�ำเป็น มีการตรวจวิเคราะหม์ าก
ข้นึ หรอื มกี ารปรกึ ษาแพทยเ์ ฉพาะทาง และเพ่ิมระยะเวลาการอยู่โรงพยาบาลนานขน้ึ ค่าใช้จ่ายทีเ่ ก่ียวเนอ่ื งจากการ
พบผลบวกปลอมของการเพาะเชอื้ ของเลอื ด มมี ากถงึ 40% สำ� หรบั การรบั สารตา้ นจลุ ชพี และการทดสอบ เพอื่ แยก
ชนดิ ของเชอื้ ในหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร การทไี่ ม่สามารถแยก contamination ออกจาก true infection จึงมีผลกระทบมาก
ดงั นนั้ ตวั ชี้บ่งท่ีสามารถช่วยแยก probable pathogen ออกจาก contamination จงึ มคี วามส�ำคัญส�ำหรบั การแปลผล
การเพาะเช้อื จากเลอื ด
ตัวบง่ ชที้ ่ีใช้ในการแปลผลของการเพาะเชอ้ื ในเลอื ด
ตัวบ่งชี้ที่ใช้ในการแปลผล เพ่ือพิจารณาแยกการเพาะเช้ือที่พบเช้ือก่อโรคในกระแสเลือด ออกจากการพบ
เชื้อปนเปื้อนในเลือด ตัวชี้วัดเหล่านี้ใช้แสดงให้แพทย์และห้องปฏิบัติการทราบว่าตัวอย่างตรวจน่าจะมีเช้ือปน
เปื้อนระหวา่ งการเกบ็ ตวั อยา่ งหรอื ในขั้นตอนการวิเคราะห์ เชน่
- ความถข่ี องการพบมีเช้อื ขน้ึ ในขวดจากจำ� นวนขวดทีท่ �ำการเพาะเชอ้ื (positive bottles among collections)
เชน่ การเจาะเลอื ดสามขวดและมเี ช้ือขนึ้ ทัง้ สามขวด หรอื เจาะเลอื ดสองขวดเพาะเชอ้ื ไดท้ ง้ั สองขวด โอกาส
ทีผ่ ปู้ ่วยมกี ารตดิ เชื้อในกระแสเลือดเพียงขวดเดียวจากการเจาะเลือดสามขวด เปน็ ต้น
- ผลการย้อมแกรมจากขวดเลือดเพาะเช้ือ พบเช้ือ gram-positive cocci in cluster แสดงว่าเป็นเช้ือ
staphylococci ซง่ึ อาจจะเปน็ เชือ้ กอ่ โรคคอื Staphylococcus aureus หรือ อาจจะเปน็ เชือ้ ประจ�ำถิน่ ทผี่ วิ หนงั
เป็น coagulase-negative Staphylococcus ซ่ึงไม่ก่อโรค ถ้าย้อมได้ gram-positive rod ตัวโต ชี้บ่งว่าเป็น
Bacillus spp. ซง่ึ เป็นเชือ้ ปนเป้อื นในสงิ่ แวดล้อม แสดงว่ามกี ารปนเปอ้ื นทีต่ ำ� แหนง่ เจาะเลอื ดและทำ� ความ
สะอาดผวิ หนงั ไมด่ ี การชบ้ี ง่ การตดิ เชอื้ ดว้ ยการยอ้ มแกรมอยา่ งเดยี วไมเ่ พยี งพอ เนอื่ งจากเชอื้ บางสว่ นทก่ี ลา่ ว
มานีอ้ าจเปน็ เชอื้ ก่อโรคได้ดว้ ย
- จำ� นวนและชนิดของเม็ดเลอื ดขาวในเลือด ขณะทม่ี กี ารตดิ เชื้อในกระแสเลือดผ้ปู ว่ ยท่มี ภี มู ติ า้ นทานปรกติ
ถา้ มี left shift (>10 % bands) โดยจำ� นวนเมด็ เลอื ดขาวไมเ่ พมิ่ ขนึ้ มกั มคี วามสมั พนั ธก์ บั positive blood culture
- จำ� นวน species ทแี่ ยกไดจ้ ากเลอื ดแตล่ ะขวด เชอ้ื ทเ่ี พาะไดห้ ลายตวั (multiple organisms isolates) มกั สมั พนั ธ์
กับการปนเปื้อน เนอ่ื งจากท�ำความสะอาดผวิ หนงั ไม่ดี การตดิ เชื้อในเลอื ดมกั พบเช้ือเพยี งชนิดเดียว
- อาการแสดงของผู้ป่วย เชน่ มไี ข้สงู หรือไขต้ ำ�่ ๆ ผูป้ ่วยท่ีไม่มไี ข้ แตม่ ี positive blood culture มักเกิดค�ำถามวา่
ผลการเพาะเชอื้ เช่ือถอื ได้หรอื ไม่
- ระยะเวลาทใ่ี ช้ในการเจรญิ เติบโตจนตรวจพบเชื้อ ถา้ เจาะเลอื ดไดเ้ พียงพอเวลาทแี่ บคทเี รียแบ่งตวั จนตรวจ
พบเช้ือได้มักไม่เกนิ 48 ชม. กรณที มี่ ีเชอ้ื ปรมิ าณมาก จนตรวจพบ positive culture ได้เรว็ ในทางกลับกันเช้ือ
ทโ่ี ตชา้ ชบี้ ง่ วา่ มเี ชอื้ ปรมิ าณนอ้ ยมากทเ่ี ขา้ ไปในขวด ซงึ่ มกั มคี วามจำ� เพาะคอื ไมม่ เี ชอื้ ในเลอื ด แตม่ กี ารปนเปอ้ื น
ในขวดเลอื ดจากเชอื้ ท่ีมีแหลง่ จากภายนอก

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 57

เช้อื ทน่ี า่ จะเป็นเชื้อปนเป้อื น (probable contamination)
1. การเพาะไดเ้ ชือ้ ตอ่ ไปนีจ้ ากเลอื ดเพียงขวดเดียว ในขณะท่ที �ำการเพาะเชื้อมากกว่าหรอื เทา่ กบั สองขวด ได้แก่
Bacillus spp., Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes, coagulase-negative staphylococci
2. การพบเชือ้ หลายชนดิ ในเลือดเพยี งขวดเดียวจากการเจาะเลอื ดอยา่ งนอ้ ยสองขวด
3. เชอื้ ทแี่ ยกไดจ้ ากเลอื ดของคนไขท้ ไี่ มม่ อี าการตดิ เชอ้ื หรอื หลกั ฐานทางแพทยไ์ มส่ อดคลอ้ งกบั ผลการเพาะเชอ้ื
4. เช้ือก่อโรคทเ่ี ป็นสาเหตขุ องการติดเชื้อในตำ� แหน่ง primary site เป็นคนละชนิดกบั ทแี่ ยกไดจ้ ากเลือด

เช้ือทน่ี ่าจะเป็นเชอื้ กอ่ โรค (probable pathogen)
1. เชอ้ื ทแ่ี ยกไดเ้ ปน็ ชนดิ เดยี วกบั ทแี่ ยกไดจ้ ากเลอื ดทเี่ จาะซำ้� ใหม่ ในเวลาทต่ี า่ งกนั หรอื เจาะจากตำ� แหนง่ ทตี่ า่ งกนั
2. แยกเช้ือท่ีจ�ำเพาะบางตวั ได้จากเลอื ดของผปู้ ่วยทมี่ ีการติดเชอ้ื endocarditis เชน่ Enterococcus spp. หรอื เช้ือ
แกรมลบชนดิ แทง่
3. เชื้อทจ่ี ำ� เพาะ เชน่ เชือ้ ในกลุ่ม Enterobacteriaceae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus group B และเช้อื แกรมลบชนดิ แอนเอโรบคิ เปน็ ตน้
4. เชอื้ ประจำ� ถนิ่ (normal microbial flora) ทแี่ ยกไดจ้ ากเลอื ดของผปู้ ว่ ยทสี่ งสยั มกี ารตดิ เชอ้ื ในกระแสเลอื ดและ
มี prosthetic devices หรอื มภี มู ิคมุ้ กนั บกพรอ่ ง หรือไดร้ บั สารกดภูมิต้านทาน
5. เชอ้ื ทพ่ี บไดไ้ มบ่ อ่ ยแตแ่ ยกไดจ้ ากผปู้ ว่ ยทม่ี ปี ระวตั พิ เิ ศษเชน่ เดนิ ทางไปตา่ งประเทศหรอื เชอื้ ทใ่ี ชอ้ าวธุ ชวี ภาพ
เช่น Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei
6. เชอ้ื บางชนดิ ทไ่ี ม่สามารถเจริญบนอาหารสังเคราะห์ วนิ ิจฉัยไดโ้ ดย serological test หรือ molecular method
เชน่ Coxiella, Chlamydia spp., Rickettsia spp.

ตารางที่ 4.1-1 แสดงแบคทีเรียที่แยกได้จากเลือดและโอกาสของการปนเปื้อน (false positive) หรือโอกาสของ
การกอ่ โรค (true positive)

Organism % False positive % True positive

Bacillus spp. > 90 < 10
Coagulase-negative staphylococci > 90 < 10
Propionibacterium spp. > 90 < 10
Corynebacterium spp. 80 20
Viridans streptococci 50 50
Clostridium spp. 40 60
Staphylococcus aureus 25 75
Enterococcus spp. 15 85

58 คู่มือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

การควบคุมคณุ ภาพการเพาะเช้อื จากเลอื ดในห้องปฏบิ ัตกิ าร
ห้องปฏิบัติการควรท�ำการควบคุมคุณภาพในทุกขั้นตอนของการเพาะเช้ือจากเลือด โดยมีข้ันตอนการควบคุม
คุณภาพ ดงั นี้
1. การประกันคณุ ภาพการวิเคราะห์
ท�ำการควบคมุ คุณภาพภายใน (internal quality control; IQC) และบันทึกผล ตลอดจนเข้ารว่ มโครงการทดสอบ
ความสามารถระหว่างห้องปฏิบัติการที่จัดขึ้นโดยองค์กรภายนอกในระดับประเทศหรือระดับสากล (external
quality assessment; EQA) หอ้ งปฏิบัตกิ ารทำ� การประกันคุณภาพการเพาะเช้อื จากเลือดได้ดงั นี้
- การควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ยี งเชอื้ ในด้านการส่งเสริมการเจรญิ เติบโตของจลุ ชีพได้ครอบคลุมจลุ ชีพท่ี
เป็นสาเหตกุ ารติดเชอื้ ในเลอื ด
- ควบคุมการปนเป้อื นของเชอ้ื ในอาหารท่ีใช้เพาะเชอ้ื
- ควบคมุ คณุ ภาพการย้อมสีให้ครอบคลุมทั้งเชื้อที่เปน็ positive control และ negative control ทำ� การ
วิเคราะห์และบนั ทกึ ผลแบบเดียวกับการย้อมเลือดของผ้ปู ่วย
- ควบคุมคณุ ภาพการเพาะเช้ือจากเลอื ดในขวด ท�ำทัง้ positive control โดยใส่เชื้อมาตรฐานทเ่ี จือจางดว้ ย
เลอื ดของคนปรกติ ใหม้ ปี รมิ าณเชอื้ แตกตา่ งกนั ลงในขวดเพาะเชอ้ื และทำ� negative control ทใี่ สน่ ำ�้ เกลอื
แทนเชือ้ ทำ� การวิเคราะหแ์ ละบันทึกผลการเพาะเชือ้ แบบเดียวกบั เลือดของผปู้ ่วย
- ท�ำการควบคมุ คณุ ภาพทดสอบความไวของเชื้อมาตรฐานต่อสารต้านจุลชพี ทำ� การวิเคราะหแ์ ละ
บันทกึ ผลแบบเดียวกบั เชอื้ ที่แยกได้จากผ้ปู ่วย
- กำ� หนดเกณฑ์การตัดสนิ การควบคมุ คณุ ภาพกรณีผล IQC ไมอ่ ยใู่ นเกณฑ์ และท�ำบันทึกปฏิบตั กิ ารแก้ไข
- มีการจัดเกบ็ รักษาคณุ ภาพของเชือ้ มาตรฐานทไ่ี ดม้ าจากแหลง่ ที่เช่ือถอื ได้ และเป็นสากลท่อี ้างองิ ได้ เพอื่
นำ� ผลมาใช้ควบคุมคณุ ภาพของการทดสอบความไวตอ่ สารต้านจลุ ชพี คุณภาพอาหารทีใ่ ช้เพาะเชอื้ จาก
เลอื ดและอาหารทใ่ี ช้ท�ำ subculture หรอื การวินจิ ฉยั เช้ือ
- มรี ะบบการวิเคราะหท์ ่สี อบกลบั ได้ (traceable) ถงึ คา่ มาตรฐานสากล (SI unit) มีการบันทกึ รายละเอยี ด
เก่ยี วกับวธิ กี ารวเิ คราะห์ สารมาตรฐาน และเชอ้ื มาตรฐาน
- วัสดุอ้างอิงและเชื้อมาตรฐาน (standard/calibrator) มีคณุ ลกั ษณะเหมาะสม มใี บรับรองคณุ ลกั ษณะหรอื
ข้อมลู อ้างอิงจากผู้ผลติ (MT 5.2.4)
- กรณีทำ� การทดสอบเดยี วกนั แตใ่ ชเ้ คร่ืองมือหลายเครื่องต้องมีการปรบั เทยี บผล มบี นั ทกึ
- ห้องปฏบิ ตั กิ ารตอ้ งเขา้ รว่ มโครงการ EQA กับองคก์ รที่มีคณุ ภาพ เพือ่ เป็นดัชนชี ีว้ ดั ความถูกตอ้ งของผล
การทดสอบท่ีทำ� โดยปฏิบตั ิตอ่ ตวั อยา่ งทไ่ี ดร้ ับเช่นเดยี วกับตัวอย่างทดสอบจากผปู้ ว่ ยกรณที ม่ี ผี ลไมต่ รง
กบั ผล EQA ตอ้ งทำ� การวเิ คราะหห์ าสาเหตุและด�ำเนินการแก้ไข
- มกี ารสอบเทยี บเครอ่ื งมอื ทมี่ ผี ลกระทบตอ่ คณุ ภาพ และมกี ารบำ� รงุ รกั ษาเชงิ ปอ้ งกนั และตรวจสอบความ
พรอ้ มใช้งานของเครอ่ื งตรวจวิเคราะหอ์ ัตโนมัตสิ ำ� หรับการเพาะเชอ้ื จากเลอื ด ทัง้ ส่วนที่เป็น incubator
และระบบ detection ตลอดจนตเู้ ย็นเก็บแผ่นสารทดสอบและสารท่ใี ชท้ ดสอบ
2. ขนั้ ตอนก่อนการวิเคราะห์
- มคี มู่ อื การเกบ็ ตวั อยา่ งและแนวปฏบิ ตั ใิ นการเจาะเลอื ดเพอ่ื เพาะเชอ้ื ใหห้ นว่ ยงานทมี่ าสง่ ตวั อยา่ งวเิ คราะห์
ทำ� การวเิ คราะหท์ นั ที เมอ่ื ไดร้ บั ตวั อยา่ ง หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารตอ้ งกำ� หนดวธิ กี ารเกบ็ รกั ษาตวั อยา่ งและชว่ งเวลา
ทเ่ี ก็บตัวอย่างไว้ โดยผลการทดสอบไม่เปลยี่ นไปและไมท่ �ำการทดสอบสิง่ ส่งตรวจทมี่ คี ณุ ภาพไม่ดีพอ

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 59

- มีการควบคมุ วธิ ีการนำ� สง่ ตัวอยา่ งภายในเวลาและอณุ หภูมิทเ่ี หมาะสม
- มกี ารกำ� หนดเกณฑร์ ับและปฏิเสธตัวอยา่ ง และบนั ทึกรายละเอยี ดสภาพตัวอยา่ งที่ไม่เหมาะสมในการ
รายงานผลดว้ ยทกุ ครัง้ เพ่อื แพทย์จะได้ใชป้ ระโยชน์ในการแปลผล
- มีการช้ีบ่งตัวอยา่ งและใบน�ำสง่ มีบันทึกการรบั ตวั อย่างในสมดุ หรอื ระบบคอมพวิ เตอร์
3. ข้ันตอนการวเิ คราะห์
- ใชว้ ธิ วี เิ คราะหท์ เ่ี ปน็ มาตรฐานหรือวธิ ีอ้างอิงได้ กรณีใชว้ ิธีวิเคราะหท์ ่ีกำ� หนดขนึ้ เองหรอื ดดั แปลงวธิ ี
วิเคราะห์ เช่น ลดสว่ นน�้ำยา หรืออื่นๆ ตอ้ งมขี อ้ มลู การ validate
- แจง้ วธิ ีวิเคราะหใ์ หผ้ ูใ้ ช้บริการทราบรวมทั้งชนดิ และปริมาณของตัวอยา่ งท่ตี ้องการ ถ้าเปลี่ยนแปลงวธิ ี
การตอ้ งแจง้ เปน็ ลายลักษณ์อักษรและมีบันทึกการแจ้ง
- มีคมู่ อื วิธีปฏิบตั หิ รอื ระเบียบปฏบิ ตั ิการวิเคราะห์ ณ จดุ ที่ปฏบิ ัตงิ าน เปน็ เอกสารควบคุมในระบบการ
ควบคุมเอกสาร วธิ ใี นค่มู ือตรงตามทใ่ี ชง้ านจริงและเปน็ ปจั จุบัน
4. ข้นั ตอนหลังการวิเคราะห์
- การรายงานผลขั้นตอนสุดท้ายประกอบด้วยผลตอ่ ไปน้ี ผลจากการย้อมแกรม ผลการวินิจฉยั เช้อื
และผลความไวตอ่ สารตา้ นจลุ ชีพ
- มกี ารตรวจสอบผลการเพาะเชอื้ โดยผ้ทู ี่ได้รบั มอบหมาย
- การย้อมแกรม เป็นวธิ ีการสำ� คญั ทีใ่ ช้บง่ ชว้ี า่ มเี ชอ้ื ขน้ึ ในขวดเลอื ด เม่อื ย้อมพบเชอื้ จากขวด
เพาะเชอื้ จากเลอื ดตอ้ งทำ� การรายงานผลใหแ้ พทยท์ ราบทนั ที ผลการเพาะเชอื้ จากเลอื ดจดั เปน็ คา่ วกิ ฤตทิ ี่
ตอ้ งรายงานเรง่ ดว่ น ตอ้ งใหแ้ พทยด์ แู ลผปู้ ว่ ยไดร้ บั ผลทรี่ ายงานโดยเรว็ ผทู้ รี่ บั ผลทางโทรศพั ทต์ อ้ งบนั ทกึ
ผล เพอ่ื ไวย้ ืนยนั ความถกู ตอ้ ง และผูโ้ ทรแจ้งผลต้องบนั ทกึ ช่ือผู้รบั การแจ้งผล
- เมอ่ื เพาะเชือ้ ขนึ้ (positive blood culture) ต้องรายงานผลทันทีทไ่ี ด้ผลเป็นค่าวิกฤติ การรายงานผลตอ้ ง
รายงานทง้ั ผลจากการยอ้ มแกรม ผลการวนิ จิ ฉยั เชอื้ และผลการทดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี ขอ้ มลู
ทอ่ี าจจะเปน็ ประโยชนต์ อ่ การแปลผล เชน่ สารตา้ นจลุ ชพี ทผี่ ปู้ ว่ ยไดก้ อ่ นเจาะเลอื ดเพาะเชอ้ื ปรมิ าตรของ
เลอื ดที่ใช้เพาะเชือ้ นอ้ ยกวา่ มาตรฐานท่ีกำ� หนดการสง่ ตัวอย่างลา่ ชา้ เปน็ ตน้
การบริหารจัดการระบบคุณภาพของงานห้องปฏิบัติการให้งานขับเคล่ือนตามล�ำดับของการท�ำงานต้องท�ำให้
ครอบคลุมท้ังสามขั้นตอน คือ ขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์ ได้แก่ การส่ังตรวจ การเก็บส่ิงส่งตรวจและน�ำส่งห้อง
ปฏบิ ตั กิ าร และการรบั การปฏิเสธสิ่งสง่ ตรวจ โดยตรวจสอบคณุ ภาพของสงิ่ ส่งตรวจในขนั้ ตอนการวเิ คราะห์ เชน่
วธิ กี ารวเิ คราะห์ การทบทวนและติดตามผลการวเิ คราะห์ ส�ำหรบั ขน้ั ตอนหลงั การวิเคราะห์ ไดแ้ ก่ การรายงานผล
และการรับรองผลการวเิ คราะห์ และการเก็บรักษาและทำ� ลายส่ิงตรวจหลงั การวิเคราะห์
รายงานผลการเพาะเชอื้ จากเลอื ด ควรมกี ารควบคมุ คณุ ภาพของการปฏบิ ตั งิ านทงั้ สามขน้ั ตอนของการวเิ คราะห์
การควบคุมคุณภาพที่ท�ำอย่างจริงจังและต่อเน่ืองเป็นปัจจัยหลักที่ใช้ในการประกันคุณภาพของการเพาะเช้ือจาก
เลอื ดได้ ทำ� ใหแ้ พทยม์ คี วามเชอื่ มน่ั ตอ่ ผลการวเิ คราะห์ อนั จะเปน็ ประโยชนใ์ นการรกั ษาและควบคมุ โรค การควบคมุ
คุณภาพของการวิเคราะห์เป็นวิธีการทางห้องปฏิบัติการที่มีประสิทธิภาพสูงในการลดการปนเปื้อนจากการเพาะ
เชอื้ ในเลอื ด เนอ่ื งจากสามารถใชแ้ ยกเชอ้ื ทเี่ ปน็ สาเหตขุ องการตดิ เชอ้ื ในเลอื ดจรงิ ออกจากเชอื้ ทปี่ นเปอ้ื นหรอื เชอ้ื ที่
ไม่ใช้สาเหตุของการติดเช้ือได้ จึงควรใช้แนวทางปฏิบัติการแปลผลและการควบคุมคุณภาพในการพัฒนาคุณภาพ
การเพาะเชอ้ื จากเลือด

60 ค่มู ือการปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา

เอกสารอ้างอิง

1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Principles and Procedures for Blood Culture: Approved
Guideline. CLSI document M47-A. Pennsylvania: Wayne; 2007.
2. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation Blood Cultures. In: Isenberg HD editor.
Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 58-62.
3. ก�ำพล สวุ รรณพิมลกลุ , คัคนางค์ นาคสวสั ด.์ิ วิธีลดการปนเปอ้ื นในการเจาะเลอื ดเพอ่ื ส่งเพาะเชื้อ.
ใน: สุรางค์ เดชศริ ิเลิศ, สวุ รรณา ตระกลู สมบรู ณ์, กาญจนา คชินทร บรรณาธิการ. แนวปฏบิ ัตกิ ารเจาะ
เลอื ดเพ่ือเพาะเช้อื และการเพาะเชื้อก่อโรคจากเลอื ด. กรงุ เทพฯ: โรงพิมพ์แหง่ จฬุ าลงกรณ์มหาวิทยาลัย;
2553. หนา้ 7.
4. มาลยั วรจิตร. การดำ� เนนิ การเพาะเชื้อและการรายงานผลการเพาะเชอ้ื จากเลอื ดทางหอ้ งปฏบิ ตั ิการหลกั
การเพาะเช้ือจากเลือดและการวนิ ิจฉัยเชอื้ ก่อโรค. กรุงเทพฯ: คณะเทคนคิ การแพทย์ มหาวิทยาลยั มหดิ ล;
2550. หน้า 79-86.
5. มาลัย วรจติ ร. กระบวนการทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารส�ำหรบั การเพาะเชอ้ื จากเลอื ด. ใน: สรุ างค์ เดชศิริเลศิ ,
สุวรรณา ตระกลู สมบรู ณ,์ กาญจนา คชินทร บรรณาธกิ าร. แนวปฏิบตั ิ การเจาะเลอื ด เพือ่ เพาะเช้อื และการ
เพาะเชื้อก่อโรคจากเลือด. กรงุ เทพฯ: โรงพิมพ์แหง่ จฬุ าลงกรณม์ หาวิทยาลัย; 2553. หนา้ 15-23.
6. วรรณา เพ่งเรืองโรจนชยั . การเพาะเช้ือจากเลือด. คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทเี รียสำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์
และโรงพยาบาลทว่ั ไป. นนทบรุ ี: กองโรงพยาบาลภูมิภาค; 2540.
7. สวุ รรณา ตระกูลสมบรณู ์. การแปลผลและการควบคุมคุณภาพการเพาะเชอ้ื จากเลอื ด. ใน: สุรางค์ เดชศริ ิ
เลิศ, สวุ รรณา ตระกูลสมบูรณ,์ กาญจนา คชินทร บรรณาธิการ. แนวปฏิบตั ิ การเจาะเลือดเพื่อเพาะเชอื้
และการเพาะเช้ือกอ่ โรคจากเลือด. กรงุ เทพฯ: โรงพมิ พ์แห่งจฬุ าลงกรณ์มหาวิทยาลยั ; 2553. หนา้ 27-35.

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 61

4.2 การเพาะเชือ้ จากนำ้� ไขสันหลังและนำ้� สว่ นต่างๆของรา่ งกาย ฉนั ทนา อรญั ญะ
วรรณา เพง่ เรืองโรจนชัย
สุวรรณา ตระกูลสมบรู ณ์

การเพาะเชอ้ื จากน�้ำไขสนั หลงั

หลักการ
นำ้� ไขสนั หลงั เปน็ ของเหลวในรา่ งกายทปี่ ราศจากเชอ้ื มหี นา้ ทห่ี ลอ่ เลยี้ งสมองและไขสนั หลงั ภาวะเยอ่ื หมุ้ สมอง
อกั เสบทเี่ กดิ จากการตดิ เชอ้ื แบคทเี รยี ในนำ้� ไขสนั หลงั ถอื เปน็ ภาวะวกิ ฤตทิ ก่ี อ่ ใหเ้ กดิ อนั ตรายถงึ แกช่ วี ติ ได้ จงึ มคี วาม
ส�ำคัญท่ีตอ้ งรีบทำ� การทดสอบและแจ้งผลให้แพทย์ทราบโดยทันที การทดสอบที่รวดเรว็ และถกู ตอ้ งสามารถชว่ ย
รักษาชีวิตผู้ป่วยหรือลดความพิการได้ การติดเช้ือเพียงเล็กน้อยก็ถือว่ามีความส�ำคัญทางคลินิกท่ีต้องวินิจฉัยและ
ทดสอบความไวต่อสารตา้ นจุลชีพในเช้ือทกุ ชนดิ

ขอบเขต
ขั้นตอนการตรวจรับส่ิงสง่ ตรวจ การเพาะเชือ้ จากน้�ำไขสันหลัง การอ่านผล การเพาะเชือ้ การรายงานผล เมื่อ
พบเช้อื จากการย้อมแกรม การรายงานผลเมื่อเสรจ็ สมบรู ณ์
เช้อื แบคทีเรียทพ่ี บเป็นสาเหตขุ องการตดิ เชื้อในระบบประสาทสว่ นกลางมคี วามสัมพนั ธ์กบั อายขุ องผู้ป่วย คอื
เดก็ แรกคลอด : Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes
เดก็ อายตุ �่ำกวา่ 2 เดือน : Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli
เด็กอายตุ ำ�่ กว่า 10 ปี : Hemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae
เดก็ ท่มี ีอายุมากกวา่ 10 ปแี ละผูใ้ หญ่ : Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, gram negative
bacilli, Listeria monocytogenes

วธิ ีปฏบิ ตั งิ าน
1. ตรวจดูลักษณะและปริมาณของ CSF
1.1 ถ้ามเี ลอื ดปะปนหรอื มคี วามข่นุ ให้บันทึกไว้
1.2 ถ้ามีปริมาณมากกว่า 1 ml และใส ให้นำ� ไปป่นั แยก โดยใชค้ วามเรว็ 2,500 rpm นาน 15 นาที
ใช้ pasteur pipette ปราศจากเชอ้ื ดดู นำ�้ ใสสว่ นบนทงิ้ เหลอื CSF และตะกอนกน้ หลอดประมาณ 0.5 ml
เขยา่ ผสมตะกอนด้วย vortex mixer เพือ่ ใชย้ อ้ มและเพาะเชือ้ ตอ่ ไป
1.3 ถ้า CSF มปี รมิ าณน้อยกว่า 1 ml หรือขนุ่ ไม่ต้องปนั่ ทำ� การเพาะเชอ้ื ไดเ้ ลย
2. ใช้ pasteur pipette ปราศจากเช้อื ดดู CSF หยดลงบน BA, CA, MAC plate ละ 1 หยด สว่ นทีเ่ หลอื ใสใ่ น
fluid thioglycollate medium (FTM) และทำ� smear บน slide เพ่ือยอ้ มแกรม โดยทำ� การตรวจให้เร็วทสี่ ุด
3. streak plate ทัง้ 3 ชนิด น�ำไปบ่มท่ี 35±2 °C นาน 3 วัน โดย BA และ CA บ่มในบรรยากาศ 5-10% CO2
สำ� หรับ FTM ใหบ้ ่ม ที่ 35±2 °C นาน 7 วัน


62 คูม่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

ขอ้ ควรระวงั
1. ควรทำ� การเพาะเชอ้ื ทนั ทที ไี่ ดร้ บั สงิ่ สง่ ตรวจ ถา้ ทำ� ไมไ่ ดใ้ หเ้ กบ็ ในอณุ หภมู หิ อ้ ง หา้ มเกบ็ ในตเู้ ยน็
2. กรณที ไ่ี ด้ CSF ปรมิ าณนอ้ ย ไมส่ ามารถแบง่ หลายขวด เพอ่ื สง่ ตรวจจลุ ชวี วทิ ยา ตรวจทางชวี เคมี และการตรวจ
นบั และแยกชนดิ ของเซลล์ใหเ้ กบ็ CSFทเี่ จาะไดท้ ง้ั หมดใสข่ วดเดยี วแลว้ นำ� สง่ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารจลุ ชวี วทิ ยากอ่ น
ทำ� การปน่ั เพอื่ นำ� ตะกอนไปเพาะเชอ้ื และทำ� direct examination เชน่ ยอ้ มแกรมทำ� india ink แลว้ จงึ นำ� สว่ นใส
ทแี่ ยกได้ ไปตรวจทางชวี วทิ ยา
การอา่ นผล
1. อา่ นผลการยอ้ มแกรมทนั ที ถา้ พบเชอื้ ตอ้ งรายงานผลแบบคา่ วกิ ฤติ
2. ตรวจ plate ดผู ลการเพาะเชอื้ ทกุ วนั ถา้ ไมม่ เี ชอื้ ขนึ้ ใหอ้ บตอ่ จนครบ 3 วนั ถา้ มเี ชอ้ื ขน้ึ ใหย้ อ้ มแกรมและรายงาน
แพทยท์ ดี่ แู ลผปู้ ว่ ยทราบทางโทรศพั ทแ์ บบคา่ วกิ ฤติ และทำ� การวนิ จิ ฉยั เชอ้ื ทกุ ตวั และทดสอบความไวตอ่ สาร
ตา้ นจลุ ชพี
3. ตรวจดู FTM ทกุ วนั อบจนครบ 7 วนั ถา้ มลี กั ษณะขนุ่ สงสยั วา่ นา่ จะมเี ชอ้ื ขนึ้ ให้ subculture บน BA, CA, MAC
และยอ้ มแกรมถา้ เชอ้ื ทขี่ นึ้ เปน็ ชนดิ เดยี วกบั ทขี่ นึ้ ในprimaryplateไมจ่ ำ� เปน็ ตอ้ งวนิ จิ ฉยั ซำ�้ แตถ่ า้ พบขนึ้ ในFTM
เทา่ นน้ั ใหว้ นิ จิ ฉยั เชอ้ื รวมทง้ั ทดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี โดยไมต่ อ้ งระบจุ ำ� นวนเชอื้ ถา้ FTM ขนุ่ เพาะ
เชอ้ื ไมข่ นึ้ ในสภาวะปกตแิ ตย่ อ้ มสแี กรมพบเชอ้ื ใหส้ งสยั วา่ อาจจะเปน็ anaerobicbacteriaใหร้ ายงานผลการยอ้ ม
แกรมพรอ้ มรปู รา่ งและควรสง่ ไปวเิ คราะหต์ อ่
การรายงานผล
1. ถา้ ไมพ่ บเชอ้ื ใหร้ ายงานวา่ “No growth after 3 days” (ตามแผนภมู ทิ ่ี 4.2-1)
2. ถา้ พบเชอ้ื จากการยอ้ มแกรมใหร้ ายงานแพทยท์ ที่ ำ� การรกั ษาผปู้ ว่ ยทางโทรศพั ทท์ นั ที โดยทำ� การบนั ทกึ การ
รายงานและชอ่ื ผรู้ บั แจง้ ผลไว้
3. ถา้ มเี ชอื้ ขน้ึ รายงานจำ� นวนเปน็ numerous, moderate, few หรอื rare กรณเี ชอ้ื ขนึ้ ใน FTM อยา่ งเดยี ว ให้
รายงานชนดิ ของเชอื้ โดยไมต่ อ้ งบอกจำ� นวน และถา้ เชอื้ ขนึ้ ใน FTM หลงั จากวนั ท่ี 3 ไปแลว้ ใหร้ ายงานผล
เปน็ additional report ตามไป
การตรวจหาแอนตเิ จนของเชอื้ ในนำ�้ ไขสนั หลงั ดว้ ย วธิ ี latex agglutination
การตรวจหาแอนตเิ จนของเชอ้ื ทเ่ี ปน็ capsularantigenในนำ�้ ไขสนั หลงั ดว้ ยวธิ ีlatexagglutinationเปน็ การทดสอบ
ทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทใี่ ชน้ ำ�้ เจาะไขสนั หลงั เพอื่ ชว่ ยการวนิ จิ ฉยั การตดิ เชอ้ื ในระบบประสาทไดร้ วดเรว็ กวา่ การเพาะเชอื้
สามารถไดผ้ ลภายในครง่ึ ชว่ั โมง และการทดสอบนส้ี ามารถตรวจหาเชอ้ื ทจ่ี ำ� เพาะชนดิ ไดด้ ว้ ยชดุ นำ้� ยา latex agglutina-
tion ใชต้ รวจหาแอนตเิ จนของเชอื้ แบคทเี รยี ไดห้ ลายชนดิ ไดแ้ ก่ Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae
type b, Neisseria meningitidis, E. coli K-1 และ Streptococcus agalactiae (Group B streptocoocci) สามารถใชต้ รวจ
หาแอนตเิ จนของเชอื้ แบคทเี รยี ในนำ้� ไขสนั หลงั และนำ�้ จากสว่ นตา่ งๆของรา่ งกายไดด้ ว้ ยขอ้ ดขี องวธิ นี คี้ อื ไดผ้ ลรวดเรว็
มคี วามจำ� เพาะความไวสงู สามารถใหผ้ ลดกี วา่ การเพาะเชอื้ โดยเฉพาะในรายทไี่ ดย้ าปฏชิ วี นะมากอ่ นเกบ็ สง่ิ สง่ ตรวจ
การรายงานผล
รายงานlatexagglutinationnegativeหรอื positiveตามผลทไี่ ดแ้ ละตอ้ งระบชุ นดิ ของเชอื้ ดว้ ยเมอื่ ไดผ้ ลตอ้ งรายงาน
แบบคา่ วกิ ฤติ

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 63

การเพาะเชอื้ จากน�้ำในส่วนตา่ งๆของรา่ งกาย
หลกั การ
นำ�้ จากส่วนต่างๆของรา่ งกายเช่น นำ้� จากข้อ (joint/synorial fluid) น้ำ� จากปอด (pleurl fluid) น�้ำจากชอ่ งทอ้ ง
(peritoneal fluid) น้�ำจากถุงหุ้มหัวใจ (pericardio fluid) ในภาวะปกติจะปราศจากเช้ือ การติดเช้ือในต�ำแหน่งดัง
กลา่ ว มคี วามส�ำคญั ทจี่ ะทำ� ใหผ้ ้ปู ว่ ยเสียชีวิตได้ ดงั น้ันการตรวจวินจิ ฉัยท่ีรวดเร็วและถูกต้องมีความส�ำคัญอยา่ งยงิ่
เพอ่ื ใชเ้ ปน็ แนวทางสำ� หรบั ดแู ลผปู้ ว่ ย การเพาะเชอื้ ในตำ� แหนง่ เหลา่ น้ี อาจทำ� ไดย้ ากในบางครง้ั เชอ้ื อาจจะมจี ำ� นวน
นอ้ ยในผปู้ ว่ ยทใี่ สส่ ายตา่ งๆเขา้ ไปในรา่ งกาย ผปู้ ว่ ยทไี่ ดร้ บั ยากดภมู คิ มุ้ กนั การเกบ็ สง่ิ สง่ ตรวจจงึ ตอ้ งระมดั ระวงั การ
ปนเปื้อน เชื้ออ่ืนที่ไม่ได้เป็นเชื้อก่อโรคอย่างแท้จริง เช้ือทุกชนิดท่ีพบในสารน�้ำที่ภาวะปกติปราศจากเชื้อถือว่ามี
ความส�ำคญั และตอ้ งรายงานเชือ้ ทุกชนิดทพี่ บ
ขอบเขต
ข้นั ตอนการตรวจรบั ส่ิงสง่ ตรวจ การเพาะเชอ้ื จากน�้ำจากสว่ นต่างๆของร่างกาย การอา่ นผล การเพาะเช้อื การ
รายงานผล เมือ่ พบเชื้อจากการยอ้ มแกรม การรายงานผลเมื่อเสร็จสมบรู ณ์
แบคทีเรียท่พี บเปน็ สาเหตขุ องการตดิ เช้อื แบง่ ตามประเภทของน้ำ� จากส่วนตา่ งๆ ของร่างกายดงั นี้
- แบคทีเรยี ท่ีเป็นสาเหตขุ องการตดิ เชื้อทพ่ี บใน joint/synovial fluid ได้แก่
Staphylococcus aureus, β-hemolytic streptococci group A และ B (GAS,GBS), S. pneumoniae, Enterococcus spp.
Other streptococci, Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella
osloensis, Corynebacterium spp. และ Mycobacterium spp.
- แบคทีเรยี ทเ่ี ป็นสาเหตุของการติดเชอื้ ทพ่ี บใน pleural fluid ได้แก่
S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, Enterobacteriaceae, Non-fermentative gram-negative bacilli,
other Streptococci, M. tuberculosis และ Nocardia spp.
- แบคทีเรียทเี่ ปน็ สาเหตุของการตดิ เช้ือทพ่ี บใน pericardial fluid ไดแ้ ก่
S. aureus, S. pneumoniae, Group A Streptococcus, Enterobacteriaceae, other gram-negative bacilli และ
M. tuberculosis
- แบคทีเรยี ทีเ่ ปน็ สาเหตขุ องการติดเชอื้ ที่พบใน peritoneal fluid ไดแ้ ก่
Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., S.aureus, Group A Streptococcus, Coagulase negative Stephylococcus
(CNS) และ Streptococcus pneumoniae, Haemophilus spp., anaerobic bacteria, และ nonfermentative
gram-negative bacilli

64 คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรยี และรา

สง่ิ ส่งตรวจ
1. นำ้� จากขอ้ (joint/synovial fluid)
2. น้ำ� จากเยอ่ื หมุ้ ปอด (pleural fluid)
3. นำ้� จากถงุ หุ้มหัวใจ (pericardial fluid)
4. นำ้� จากเย่ือบุชอ่ งทอ้ ง (peritoneal fluid)
ขอ้ ควรระวงั ควรทำ� การเพาะเชอื้ ทนั ทเี มอื่ ไดร้ บั สง่ิ สง่ ตรวจ แตถ่ า้ ยงั ทำ� ไมไ่ ดใ้ หเ้ กบ็ ในอณุ หภมู หิ อ้ ง หา้ มเกบ็ ใสต่ เู้ ยน็
วิธีปฏบิ ัตงิ าน
ใชห้ ลกั การและวิธีการตรวจเชน่ เดียวกับการเพาะเชื้อในน้ำ� ไขสันหลงั โดยมีรายละเอียดเพิ่มเตมิ ในกรณีเก็บส่ิง
ส่งตรวจไม่สามารถสง่ หอ้ งปฏบิ ัติการไดท้ ันที สามารถฉดี sterile body fluid 5 ml ใสใ่ นขวด hemoculture ได้
การตรวจวนิ จิ ฉัย peritoneal dialysis fluid (PDF) ในผ้ปู ว่ ยไตวาย ซึง่ ลา้ งไต โดยการท�ำ peritoneal dialysis ทั้ง
ในกรณี acute dialysis และในกรณีท่ที �ำ CAPD (continuous ambulatory peritoneal dialysis) ผปู้ ่วยจะไดร้ บั การใส่
น�้ำยาล้างไตเข้าไปในช่องท้อง การตรวจ PDF ในผู้ป่วยเหล่านี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจหาภาวะการติดเช้ือในช่อง
ทอ้ ง (peritonitis) อนั เปน็ ภาวะแทรกซ้อนท่ีพบได้บ่อย เชือ้ ทเี่ ปน็ สาเหตุส่วนใหญ่เกดิ จากแบคทีเรยี มสี ่วนนอ้ ยที่
เกิดจากเช้ือรา แบคทีเรียท่ีพบเป็นสาเหตุได้บ่อย ได้แก่ Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,
Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Acinotobacter spp., Enterobacteriaceae
เนอ่ื งจากปรมิ าณเช้อื ในนำ้� PDF โดยท่ัวไปจะมนี อ้ ยมาก (นอ้ ยกว่า 1 ตวั /10 ml ของ PDF) ดังนน้ั แมจ้ ะปน่ั แลว้
มาตรวจโดยการย้อมแกรมกม็ กั จะไมพ่ บเชื้อ การเพาะหาเชือ้ จึงนิยมท�ำโดยนำ� PDF มาไมน่ ้อยกวา่ 10 ml ใสข่ วด
hemoculture อยา่ งนอ้ ย 5 ml และทำ� ตามขน้ั ตอนการวนิ จิ ฉยั เชน่ เดยี วกบั hemoculture แตม่ ขี อ้ เสยี คอื เชอ้ื ทตี่ อ้ งการ
เลอื ดในการเจรญิ เตบิ โต อาจไมข่ น้ึ ในขวดสำ� หรบั เพาะเชอ้ื จากเลอื ด และตอ้ งใชเ้ วลาในการรอคอยผลทเี่ พม่ิ ขนึ้ อยา่ ง
นอ้ ยหนง่ึ วนั เนอื่ งจากตอ้ ง subculture เชอ้ื จากขวดเพาะเชอ้ื เพอื่ นำ� โคโลนขี องเชอื้ มาทำ� การวนิ จิ ฉยั เชอื้ และทดสอบ
ความไวตอ่ สารต้านจุลชีพ
เพ่ือเพมิ่ ประสิทธภิ าพการเพาะเชอื้ จากน้�ำ PDF ควรเก็บตวั อย่างนำ้� PDF 50 ml นำ� ไปปั่นแยก โดยใชค้ วามเรว็
2,500 rpm นาน 30 นาที ดดู น้�ำใสส่วนบนทง้ิ เหลือตะกอนกน้ หลอดประมาณ 0.5 ml เขย่าผสมตะกอนด้วย vortex
mixer เพอื่ ใชย้ อ้ มและเพาะเช้อื

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 65

แผนภมู ิที่ 4.2-1 ขนั้ ตอนการตรวจวนิ จิ ฉัย น้ำ� ไขสนั หลังและน้ำ� จากส่วนต่างๆ ของรา่ งกาย
น้�ำไขสนั หลงั จากสว่ นต่างๆ ของรา่ งกาย (CSF)

ปรมิ าณนอ้ ยหรือขุ่น ปริมาณมากและใส
ปัน่ 2,500 rpm นาน 15 นาที
ไม่ปน่ั
แยก Sediment


ยอ้ มสีแกรม เพาะบน CA, BA, MC FTM

อบ 35±2 °C นาน 3 วนั อบ 35±2 °C นาน 7 วนั
พบเช้อื ไมพ่ บเชอื้ (ดูการเจริญทกุ วัน) (ดกู ารเจริญทกุ วัน)

รายงานทันที ไม่รายงาน พบเชอื้

พบเชื้อ ไม่พบเชอ้ื จ�ำแนกชนดิ และ
ทดสอบความไวของเชือ้
จ�ำแนกชนดิ และ รายงาน ต่อสารต้านจลุ ชพี
ทดสอบความไวของเชื้อ “No growth after 3 days”
ต่อสารต้านจลุ ชพี รายงานผล

รายงานผล

หมายเหตุ
1. FTM ควรอบจนครบ 7 วนั ดกู ารเจรญิ ทุกวนั ถา้ มคี วามข่นุ ในส่วนล่าง อาจเปน็ anaerobic bacteria ให้น�ำ
ยม้อายมอ้ แมกสรมแี กพรรม้อมแรลปู ะรเพา่ งาแะบละนสBง่ Aเพาในะเบชรือ้ รaยnาaกeาrศobCicOb2a3c5te±r2ia°ตCอ่ นไปาน 2 วนั ถา้ ไมม่ เี ชอ้ื ข้นึ ใหร้ ายงานผลการ

2. ควรดคู วามสอดคลอ้ งของผลเพาะเช้อื ที่ไดส้ ัมพันธ์กับการยอ้ มแกรมหรือไม่
3. ในรายทีส่ งสัยเชอ้ื ราให้เกบ็ plate อยา่ งน้อย 1 สัปดาห์
4. ควรเกบ็ สไลดท์ ย่ี อ้ มแกรม เพอื่ ใชใ้ นการทวนสอบผลและสงิ่ สง่ ตรวจไวร้ ะยะหนงึ่ ในกรณที แ่ี พทยอ์ าจขอเพมิ่
รายการทดสอบเกบ็ CSF ทอ่ี ณุ หภูมิ 4 °C เพือ่ ใช้ในกรณีที่แพทย์สงั่ ตรวจ PCR เพิม่

66 คูม่ อื การปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

เอกสารอา้ งองิ

1. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Sterile Body Fluids, Dialysate, and
Urine. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC:
ASM Press; 1998. p. 63-66.

2. York MK, Church DL. Cerebrospinal Fluid Culture. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for
Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 3.7.1-8.

3. มาลยั วรจิตร. แบคทีเรียก่อโรค: Pathogenic Bacteria. กรงุ เทพฯ: สยามศิลปะการพมิ พ์; 2545.
4. วรรณา เพ่งเรอื งโรจนชยั . การเพาะเชื้อจากเลอื ด. คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี สำ� หรบั โรงพยาบาล
ศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป. นนทบุรี: กองโรงพยาบาลภมู ิภาค; 2540. หนา้ 19-22.

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทวั่ ไป 67

4.3 การเพาะเชอื้ จากปัสสาวะ สุวรรณา ตระกลู สมบรู ณ์

หลกั การ
ปัสสาวะ เป็นส่ิงส่งตรวจท่ีส่งเพาะเชื้อในผู้ป่วยที่มีอาการติดเช้ือของทางเดินปัสสาวะและผู้ป่วยที่ไม่มีอาการ
แต่มีความเส่ียงสูงว่าอาจติดเชื้อของทางเดินปัสสาวะ เช้ือที่เป็นสาเหตุของการติดเช้ือทางเดินปัสสาวะส่วนใหญ่
เป็นเชื้อเจริญเร็วเพียงไม่กี่ชนิด เช่น Escherichia coli, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp.,
Proteus spp., และ Pseudomonas spp. ซ่ึงพบในผู้ปว่ ยที่ตดิ เช้อื จากชุมชนและตดิ เชื้อในโรงพยาบาล
การตรวจหาแบคทเี รยี กอ่ โรคจากปสั สาวะ สามารถใชว้ นิ จิ ฉยั การตดิ เชอ้ื แบคทเี รยี ในระบบทางเดนิ ปสั สาวะ ซง่ึ
ตอ้ งทราบชนดิ และปรมิ าณของเชอ้ื แบคทเี รยี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ องการตดิ เชอ้ื การตรวจทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารสำ� หรบั การ
วนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชอื้ ในทางเดนิ ปสั สาวะจงึ ตอ้ งทำ� การเพาะเชอ้ื เพอ่ื หาชนดิ ของเชอื้ แบคทเี รยี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ องการตดิ
เชอ้ื และตรวจนับจ�ำนวนเช้อื แบคทีเรยี ท่ีพบในสิ่งส่งตรวจน้ันดว้ ย
ในภาวะปกตปิ ัสสาวะเปน็ น้ำ� จากร่างกายที่ปราศจากเชื้อ ถ้าเก็บอย่างถกู ตอ้ ง แต่อาจปนเปอื้ นเชือ้ จากบรเิ วณท่ี
ปสั สาวะผา่ นออกมาหรอื ท่อี ย่ขู า้ งเคียง เช่น perineum, prostate, urethra หรอื vagina จึงควรมรี ายละเอียดในการ
เก็บปัสสาวะให้ผรู้ ับบริการ (ดวู ิธีการเก็บจากบทที่ 2) ตวั อยา่ งท่ใี ชใ้ นการเพาะเชอ้ื ส่วนใหญใ่ ช้ midstream urine

วธิ ีปฏบิ ัติงาน
1. การท�ำ colony count โดยใช้ standard calibrated loop
1.1 น�ำขวดทีบ่ รรจสุ ง่ิ สง่ ตรวจมาเขย่าเบาๆให้ปัสสาวะเป็นเนอ้ื เดยี วกนั
1.2 ใช้ calibrated loop ขนาด 0.001 ml หรือ 0.01 ml จมุ่ ในแนวดิ่งลงในสง่ิ สง่ ตรวจแลว้ ยก loop ขึ้นตรงๆ
จะไดส้ ิง่ ส่งตรวจตดิ เต็ม loop พอดี
1.3 น�ำไปเพาะบนอาหารเล้ียงเช้ือ BA โดย streak เป็นเส้นตรงบริเวณกลางจานเพาะเช้ือ จากด้านบน
จนถึงด้านล่าง จากนั้นให้น�ำ loop เดิมขีดเป็นเส้นตรงให้ตั้งฉากกับแนวเดิม ขีดไปมาถ่ีๆ หลายๆ ขีด
คลา้ ยกา้ งปลา ดังรูป



ภาพท่ี 4.3-1 วิธีการเพาะปสั สาวะบน BA

68 คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรยี และรา

1.4 ทำ� การเพาะเช้ือลงบน MACโดย streak ด้วย loop ปราศจากเช้ือให้โคโลนแี ยกกัน
1.5 อบจานเพาะเชอื้ ท่ี 35 °C นาน 24 ชม. แลว้ นำ� มาตรวจดแู ละนับจำ� นวนโคโลนขี องแบคทีเรีย ให้อบจาน

เพาะท่สี งสยั ยีสตห์ รอื เช้อื ราจนครบ 48 ชม. จงึ นบั จำ� นวนโคโลนี
1.6 อบจานเพาะเชอื้ ครบ 24 ชม. แลว้ ไมพ่ บเชอ้ื แบคทเี รยี หรอื ครบ 48 ชม. แลว้ ไมพ่ บยสี ตห์ รอื เชอ้ื รา รายงาน
“No growth after 1 (or 2) day”

1.7 อบจานเพาะเช้ือครบ 24 ชม. แล้วพบเชือ้ แบคทเี รีย หรอื ครบ 48 ชม. แลว้ พบยีสตห์ รอื เช้อื รา ทำ� การนับ
ชนดิ และจำ� นวนโคโลนขี องเชอื้ ทเ่ี จรญิ บนBAแลว้ รายงานผลเปน็ จำ� นวนcolonyformingunitในปสั สาวะ
1 ml (CFU/ml)
การนบั จำ� นวนเช้อื แบคทีเรยี ในปสั สาวะ ทำ� การนบั จ�ำนวนแบคทเี รยี ทเี่ จรญิ บน BA โดยถ้าใช้ calibrated loop
ปรมิ าตร 0.001 ml ให้คณู จำ� นวนแบคทีเรยี ท่นี บั ไดด้ ้วย 1,000 แตถ่ ้าใช้ calibrated loop ปรมิ าตร 0.01 ml ใหค้ ูณ
จ�ำนวนแบคทีเรียท่ีรับได้ด้วย 100 จะได้จ�ำนวนแบคทีเรียมีหน่วยเป็น CFU/ml เช่น ใช้ calibrated loop ขนาด
0.001 ml นบั เช้อื ได้ 1 โคโลนี ใหร้ ายงานเชือ้ = 103 CFU/ml

ตารางที่ 4.3-1 การค�ำนวณจ�ำนวนโคโลนีที่นบั ได้เมอ่ื ใช้ loop เทียบมาตรฐาน 0.001 ml

จ�ำนวนโคโลนีท่ีนบั ได้ จำ� นวนเชอ้ื ทรี่ ายงานเปน็ CFU/ml

1 103
10 104
100 105
>100 >105

1.8 น�ำเชื้อท่ีเพาะได้ colony count ตามเกณฑ์ในตารางท่ี 4.3-1ไปตรวจวินิจฉัยชนิดของเชื้อและ ทดสอบ
ความไวตอ่ สารตา้ นจุลชีพ

2. การเพาะเชอื้ และทำ� colony count โดยใช้ Bacteruristrip
2.1 เขยา่ ปสั สาวะเบาๆ ให้ปัสสาวะเป็นเน้ือเดียวกนั
2.2 ใช้ปากคบี ท่ีปราศจากเชอื้ คบี แถบ Bacteruristrip จ่มุ ลงในปสั สาวะให้ถงึ ขดี ท่ีก�ำหนดไว้ รอ

ใหป้ สั สาวะดดู ซับเขา้ กระดาษกรองประมาณ 5 วินาที
2.3 แตะ Bacteruristrip ลงบน plate อาหารเลี้ยงเช้ือ BA กดให้ส่วนที่เปียกปสั สาวะแนบสนทิ กับ
ผวิ หน้าของอาหารเลยี้ งเช้อื ประมาณ 10 วนิ าที แลว้ ยกขึน้ นำ� แถบทีจ่ ุ่มปัสสาวะท้งิ แบบขยะ
ติดเชื้อ (บริเวณน้ีสำ� หรบั ท�ำ colony count)
2.4 ใชแ้ ถบ Bacteruristrip อกี แผ่นจมุ่ ปัสสาวะแลว้ นำ� ไปแตะบน BA plate เดียวกันบนต�ำแหนง่
หา่ งจากรอยแรก และแตะบน MAC แลว้ streak ดว้ ย loop ปราศจากเชื้อใหโ้ คโลนีแยกกัน
2.5 อบ plate ท่ี 35 °C นาน 24 ชม. แล้วน�ำมาตรวจดแู ละนับจำ� นวนโคโลนีของแบคทีเรยี ถา้ ไม่พบ
เชือ้ แบคทเี รยี ให้อบต่ออีก 24 ชม. แลว้ นำ� มาอา่ น plate ใหม่ จึงนบั จ�ำนวนโคโลนี

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทวั่ ไป 69

ตารางที่ 4.3-2 การค�ำนวณจ�ำนวนโคโลนีทน่ี ับไดเ้ มอื่ ใช้ Bacteruristrip

จำ� นวน โคโลนี ท่ีนบั ได้ จ�ำนวนเชอื้ ท่ีรายงานเป็น CFU/ml

1-6 103
7-20 104
21-34 105
> 35 >105

2.6 นำ� เชือ้ ที่เพาะ colony count ได้ตามเกณฑ์ในตารางที่ 4.3-2 ไปตรวจวนิ ิจฉยั ชนดิ ของเชือ้ และ ทดสอบ
ความไวตอ่ สารต้านจุลชพี

การอ่านผล
การนบั จำ� นวนเชื้อแบคทเี รียในปสั สาวะ ท�ำการนับจำ� นวนโคโลนีทเี่ จริญบน BA โดยถ้าใช้ calibrated loop
ปรมิ าตร 0.001 ml. ใหค้ ณู จำ� นวนโคโลนที น่ี บั ไดด้ ว้ ย 1,000 แตถ่ า้ ใช้ calibrated loop ปรมิ าตร 0.01 ml ใหค้ ณู จำ� นวน
โคโลนที ร่ี ับได้ด้วย 100 จะไดจ้ �ำนวนแบคทีเรียมหี นว่ ยเป็น CFU/ml
ถ้าใช้ paper strip ใหน้ ับชนดิ และจำ� นวนโคโลนีของเชื้อที่เจริญบนรอย streak แลว้ เทียบเปน็ จำ� นวน colony
forming unit ในปัสสาวะ 1 ml และรายงานผลเป็น CFU/ml ถ้ามเี ชื้อแบคทเี รยี มากกว่า 1 ชนดิ ใหน้ บั โคโลนแี ละ
รายงานแตล่ ะชนดิ แยกกนั ถา้ มเี ชอ้ื เจรญิ บน BA และ MAC หากเปน็ เชอื้ ชนดิ เดยี วกนั ใหน้ บั และรายงานผลจำ� นวน
โคโลนจี าก BA
เช้ือท่ีข้ึนน้อยกว่า 104 CFU/ml ไม่ต้องแยกวินิจฉัยชนิดของเช้ือและไม่ท�ำการทดสอบความไวต่อสารต้าน
จลุ ชพี ยกเวน้ Staphylococcus saprophyticus, Salmonella spp. และ Burkholderia pseudomallei ตอ้ งทำ� การทดสอบ
ความไวตอ่ สารตา้ นจุลชีพเสมอแม้ colony count นอ้ ยกวา่ 104 หรอื 103 CFU/ml

การรายงานผล
1. การรายงานผล เม่อื ไมพ่ บการเจริญชองเช้ือบนอาหารเลย้ี งเชอ้ื รายงาน “No growth after 2 days”
2. การรายงานผลเมอ่ื พบเชอื้ บนอาหารเลยี้ งเชอ้ื ใหร้ ายงานจำ� นวนเชอื้ ทพ่ี บเปน็ CFU/ml ตามดว้ ยชอื่ เชอื้ และ
ผลความไว (ถา้ มี) เชน่ 105 CFU/ml of Escherichia coli
3. กรณีทพ่ี บเชื้อหลายชนดิ (≥3 ชนิด) ให้รายงานว่า “Mixed culture, please repeat”

การแปลผลการเพาะเชือ้ จากปัสสาวะ เพาะไดเ้ ช้อื หนง่ึ ชนดิ ทีม่ ีปริมาณมากกวา่ หรอื เทา่ กับ 105 CFU/ml ถอื วา่
มนี ยั สำ� คญั บง่ ชถ้ี งึ ภาระการตดิ เชอ้ื ในทางเดนิ ปสั สาวะจากเชอ้ื ทเ่ี พาะได้ ในเดก็ และผปู้ ว่ ยทม่ี อี าการทางคลนิ กิ หรอื
เพาะเช้ือได้ชนิดเดียว หรือพบเม็ดเลือดขาวปัสสาวะร่วมด้วยอาจใช้เกณฑ์พบเชื้อน้อยกว่า 104 CFU/ml เป็นนัย
สำ� คญั บง่ ชกี้ ารตดิ เชอื้ ถา้ พบเชอื้ หลายชนดิ ปนกนั ในปรมิ าณใกลเ้ คยี งกนั มกั บง่ ชก้ี ารปนเปอ้ื นและไมม่ คี วามสำ� คญั
ทางคลนิ กิ การตดิ เชอื้ หลายชนดิ ผสมกนั อาจพบไดแ้ ตไ่ มบ่ อ่ ย จงึ ควรสง่ ตวั อยา่ งตรวจซำ้� ตวั อยา่ งทเี่ กบ็ โดยตรงจาก
สายสวนไตหรอื จากการเจาะกระเพาะปสั สาวะอาจใชเ้ กณฑพ์ บเชอื้ ปรมิ าณนอ้ ยกวา่ 102 CFU/ml เปน็ นยั สำ� คญั ใน

70 คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

การแปลผลการตดิ เชอื้ เมอื่ พจิ ารณารว่ มกบั อาการทางคลนิ กิ เนอื่ งจากการแปลผลการเพาะเชอ้ื จากปสั สาวะทม่ี วี ธิ ี
การเก็บที่ต่างกันใช้เกณฑ์ท่ีต่างกันดังแสดงในตาราง 4.3-3 ทางห้องปฏิบัติการจึงต้องทราบวิธีการเก็บตัวอย่าง
ปสั สาวะ และตอ้ งระบวุ ธิ ีการเกบ็ ตวั อย่างปัสสาวะในใบรายงายผลเสมอ
การเพาะเชอื้ แบคทเี รยี จากปสั สาวะตอ้ งทำ� ทนั ทหี ลงั เกบ็ ปสั สาวะเนอื่ งจากแบคทเี รยี สามารถแบง่ ตวั เพม่ิ จำ� นวน
ในน�ำ้ ปสั สาวะถ้าท้งิ ไว้นานเกนิ 1 ชม. จะท�ำใหป้ ริมาณของเชอื้ เพิม่ มากกว่าความเป็นจริงและมีผลตอ่ การแปลผล
การตรวจ

ตารางที่ 4.3-3 เกณฑ์พิจารณานำ� เชื้อไปแยกวินจิ ฉัยชนิดและทดสอบความไวต่อสารตา้ นจุลชีพ สำ� หรบั
แบคทีเรียท่ีแยกไดจ้ ากปัสสาวะ

จ�ำนวน Colony count การแยกวินจิ ฉัยชนิดและการทดสอบความไวต่อสารต้านจลุ ชีพ
ชนดิ ของเช้ือท่ี (CFU/ml)
ปสั สาวะ ปสั สาวะ
เพาะได้ใน ชนดิ A Midstream urine ชนดิ B Catheter urine
สง่ิ ส่งตรวจ

≥ 105 ID และ AST ID และ AST
Ignore ID และ AST* ID และ AST
1 ชนิด 104 Ignore ID และ AST** ID และ AST ถา้ เป็น Pathogen
ID และ AST ทง้ั สองชนิด ID และ AST
103 ID และ AST Ignore ID และ AST ถ้าเป็น
Ignore Pathogen (โดยทว่ั ไปเชอื้ กอ่ โรคมี
เชือ้ แตล่ ะชนิด ≥ 105 Ignore ตวั เดียว)
Mixed organisms > 3 types
2 ชนดิ เชอื้ ชนดิ แรก ≥ 105 โปรดส่งตรวจซ้�ำ Mixed organisms > 3 types
เชอื้ ชนิดที่สอง < 105 โปรดส่งตรวจซ้�ำ

เชือ้ แต่ละชนิด < 105

เชือ้ แต่ละชนดิ ≥ 105

3 ชนิด เช้อื ชนดิ แรก ≥ 105 ID และ AST Ignore ID และ AST ถ้าเป็น
เชื้อชนิดท่สี อง < 105 Ignore Pathogen (โดยทว่ั ไปเชอื้ กอ่ โรคมี
ตัวเดียว)
เช้ือชนดิ ท่ีสาม < 105 Ignore

เชือ้ แต่ละชนดิ < 105 Mixed organisms > 3 types Mixed organisms > 3 types
โปรดส่งตรวจซำ้� โปรดสง่ ตรวจซำ�้

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 71

ชนดิ A คือ Midstream urine, neonatal bagged urine, indwelling catheter (Foley catheter urine, ileal conduit
urine suprapubic catheter) และ ชนิด B คือ In and out catheter urines, suprapublic-tapped urine
ID = Identification, AST = Antimicrobial susceptibility test
Ignore = ไมต่ อ้ งแยกวนิ จิ ฉยั ชนดิ ของเชอื้ และไมท่ ำ� การทดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี ยกเวน้ Staphylococcus
saprophyticus, Salmonella spp., และ Burkholderia pseudomallei ต้องทำ� การทดสอบความไวต่อสารต้านจลุ ชีพ
เสมอแม้ colony count นอ้ ยกว่า 104 หรอื 103 CFU/ml
* = เชอ้ื ท่แี ยกไดจ้ ากผู้ปว่ ยทไี่ ด้รบั สารตา้ นจุลชีพ หรอื ผู้ป่วยชายท่มี อี าการตดิ เช้ือในระบบปสั สาวะ
** = เช้อื ทแ่ี ยกไดจ้ ากผู้ป่วยที่มีอาการตดิ เช้อื ในระบบปัสสาวะ
เอกสารอา้ งอิง
1. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Infection of the Urinary Tract. In: Bailey& Scott’s

Diagnostic Microbiology, 12th ed. St. Louis: Mosby Elsevier; 2007. p. 842-55.
2. Microbiology Department. Procedure Manual of Mount Sinai Hospital/ Toronto Medical

Laboratories Shared Microbiological Service: Section Urine culture manual; Toronto: Mount
Sinai Hospital; 2004.
3. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Urine Cultures. In: Isenberg
HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press;
1998. p. 95-101.

72 ค่มู ือการปฏิบตั งิ านแบคทเี รยี และรา

4.4 การเพาะเชอื้ จากอุจจาระ/Rectal Swab

สวุ รรณา ตระกลู สมบูรณ์
สจุ ิตรา มานะกลุ

หลกั การ
สง่ิ ส่งตรวจท่ไี ดจ้ ากทางเดินอาหาร เชน่ อจุ จาระ หรอื rectal swab เปน็ สิ่งส่งตรวจทม่ี ีเช้อื อ่นื ๆ นอกเหนือจาก
เชอื้ กอ่ โรคปนเปอ้ื นจำ� นวนมากเพราะเปน็ แหลง่ ทม่ี เี ชอ้ื normalfloraหลากหลายชนดิ ในปรมิ าณมากมที งั้ gram-positive
bacteria และ gram-negative bacteria และเชอื้ กอ่ โรคทพ่ี บอาจมปี รมิ าณเพยี งเลก็ นอ้ ย การเพาะเชอื้ จงึ ตอ้ งมขี น้ั ตอน
การท�ำ enrichment เพ่ือเพ่ิมจ�ำนวนเช้ือก่อโรค และต้องมีข้ันตอนเพาะเช้ือด้วย selective media เพ่ือลดปริมาณ
normal flora จึงสามารถเพิ่มประสทิ ธิภาพการตรวจหาเชือ้ ก่อโรค
การติดเชื้อของทางเดินอาหารอาจมีสาเหตุจากจุลชีพต่างๆ ในการเพาะเชื้อแบคทีเรียท่ีเป็นสาเหตุอุจจาระร่วง
ในงาน routine ควรคำ� นงึ ถงึ เชอ้ื ทพ่ี บไดบ้ อ่ ยและสามารถเพาะไดง้ า่ ย แมว้ า่ แบคทเี รยี บางชนดิ อาจพบไดใ้ นอจุ จาระ
ของผปู้ ว่ ยทไ่ี ดร้ บั สารตา้ นจลุ ชพี ชนดิ broad-spectrum เชน่ Pseudomonasaeruginosa,Candidaspp.,Staphylococcus
aureus บทบาทในการทำ� ใหเ้ กดิ อจุ จาระรว่ งยงั ไมช่ ดั เจน การตรวจพบเชอ้ื เหลา่ นจี้ ำ� นวนมากในอจุ จาระ อาจรายงาน
ให้ผู้ใชบ้ รกิ าร โดยระบุด้วยว่าพบเปน็ predominate microorganism
ขอบเขต
การรบั สง่ิ สง่ ตรวจ คณุ ภาพอจุ จาระ/rectal swab ทส่ี ง่ เพาะเชอื้ อาหารเพาะเลย้ี งเชอ้ื ทใี่ ช้ วธิ กี ารเพาะเชอื้ การอา่ น
ผล และการรายงานผล
การเก็บสิง่ สง่ ตรวจ
สิ่งส่งตรวจส�ำหรับเพาะเช้ือจากระบบทางเดินอาหารมีสองชนิด คือ อุจจาระและการป้ายอุจจาระท่ีปนเปื้อน
บริเวณรอบๆ รูทวารหนกั ท่เี รียกวา่ rectal swab
1. อุจจาระ (feces, stool):

1.1 การเกบ็ ตัวอย่าง
1.1.1 เกบ็ อุจจาระบรเิ วณที่ผดิ ปกติ เช่น เหลว เปน็ มกู เลือด เป็นตน้ ประมาณ 2 g

1.2 ภาชนะบรรจุ
1.2.1 ขวดหรือกระปุกสะอาด ปากกวา้ ง ฝาเกลยี วปดิ สนทิ สง่ ให้ถึงหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารภายใน 1 ชม.ที่

อุณหภมู ิห้อง
1.2.2 เก็บใส่ Cary-Blair transport medium โดยใชไ้ ม้ swab ป้ายอุจจาระ ประมาณ 2 g จมุ่ ลงในอาหาร

เล้ยี งเช้ือให้มิด swab น�ำส่งทันที กรณีทจี่ ำ� เปน็ ควรส่งภายใน 24 ชม. ทีอ่ ุณหภูมิห้อง
2. rectal swab

2.1 การเกบ็ ตัวอยา่ ง
2.1.1 ใชไ้ ม้พนั ส�ำลีสอดเข้ารูทวารหนัก ลกึ ประมาณ 1 นิ้ว
2.1.2 หมุนไมพ้ ันสำ� ลีรอบก้นแบบปาด เพื่อใหไ้ ด้เน้ืออุจจาระ
2.1.3 ดงึ ไม้พันส�ำลีออก ควรเห็นเน้ืออจุ จาระติดบนส�ำลจี งึ จะเปน็ การเกบ็ ตวั อยา่ งที่ดี

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 73

2.2 ภาชนะบรรจุ
2.2.1 ไม้พนั สำ� ลีท่ีเก็บอจุ จาระได้ใสข่ วดสะอาด ส่งใหถ้ งึ ห้องตรวจภายใน 1 ชม.
2.2.2 Rectal swab ที่ใสใ่ น Cary-Blair transport medium นำ� สง่ ทนั ที กรณีท่ไี ม่สามารถสง่ ทนั ทีควรส่ง
ภายใน 24 ชม. ที่อุณหภูมหิ ้อง
ข้อควรระวงั
1. การเก็บอุจจาระ เพ่ือเพาะเชื้อก่อโรค ไม่แนะน�ำให้ท�ำในผู้ป่วยท่ีนอนในโรงพยาบาลมากกว่า 3 วัน หาก
ผู้ป่วยนอนในโรงพยาบาลมากกว่า 3 วัน และมีอาการอุจจาระร่วงควรค�ำนึงถึงเช้ือ Clostridium difficile
2. อุจจาระท่ีต้องเพาะเช้ือควรเป็นที่ถ่ายใหม่ๆ ไม่ควรเก็บไว้นาน เนื่องจากเชื้อก่อโรคอุจจาระร่วงโดยเฉพาะ
Vibrio cholera ตายงา่ ยในอุณหภมู ิ ทีส่ งู กว่า 30 °C
3. การเก็บ rectal swab ให้ท�ำเฉพาะในผ้ปู ว่ ยเดก็ ส�ำหรบั ผู้ใหญ่ควรเกบ็ เป็นอจุ จาระ ยกเว้นกรณีที่เก็บอจุ จาระ
ไมไ่ ด้ การเพาะเชอ้ื จากอจุ จาระมีความไวในการตรวจหาเชอ้ื ท่เี ปน็ สาเหตุของโรคอจุ จาระร่วงมากกว่าส่งิ สง่
ตรวจท่เี ป็น rectal swab เพราะมีปริมาณเช้ือน้อยกวา่ และสิง่ สง่ ตรวจอาจแหง้ เกินไปจนเช้อื ตาย
4. อุจจาระทน่ี �ำส่งเพาะเช้อื นานเกิน 2 ชม. ตอ้ งใสใ่ น Cary-Blair transport medium เพ่อื รกั ษาไมใ่ ห้เชอ้ื ตาย โดย
เฉพาะ Campylobacter และ Vibrio spp. และควรลดปริมาณ agar ใน Cary-Blair medium จาก 0.5% เปน็
0.16% ส�ำหรบั เช้ือ Campylobacter spp. และเชื้อทัง้ สองชนดิ ท่ีกลา่ วน้ไี มส่ ามารถเก็บรกั ษาใน transport
medium ท่ีมี glycerol
แบคทีเรยี ประจำ� ถ่ินในระบบทางเดนิ อาหาร ไดแ้ ก่
- Escherichia coli - Klebsiella spp.
- Enterobacter - Proteus
- Citrobacter - Morganella
- Providencia - Seratia
- Pseudomonas - Alcaligenes faecalis
- Lactobacillus - Enterococci
- Anaerobic bacteria - Coagulase-negative staphylococci
แบคทเี รียก่อโรคในระบบทางเดินอาหาร ได้แก่
1. Infectious diarrhea
- Salmonella spp. - Shigella spp.
- Vibrio spp. - Aeromonas spp.
- Plesiomonas shigelloides - Yersinia enterocolitica
- Escherichia coli (EPEC, ETEC, EHEC, EIEC)
- Campylobacter jejuni - Campylobacter coli
- Campylobacter spp. - Clostridium difficile
- Clostridium perfringens - Bacillus cereus

74 คมู่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รียและรา

2. Toxin producing
- Staphylococcus aureus
- Bacillus cereus
- Clostridium botulinum
3. กระเพาะอาหารอักเสบหรอื แผลทีก่ ระเพาะอาหาร ลำ� ไสเ้ ล็กสว่ นตน้
(gastritis, gastric and duodenal ulcers)
- Helicobacter pylori

การเพาะเชื้อจากระบบทางเดนิ อาหารเพอ่ื หาเช้ือกอ่ โรค
อาหารเพาะเล้ียงเช้ือส�ำหรับตรวจหาเช้ือที่เป็นสาเหตุของโรคอุจจาระร่วง ต้องมีหลายชนิด เพ่ือให้ได้
ประสทิ ธภิ าพจงึ ตอ้ งเพาะเลยี้ งทง้ั ในอาหารเหลวและอาหารวนุ้ พรอ้ มกนั ทงั้ ทเี่ ปน็ อาหารenrichmentเพอื่ เพม่ิ จำ� นวน
เชื้อกอ่ โรคทีจ่ �ำเพาะ และตอ้ งมขี น้ั ตอนเพาะเชอ้ื ด้วย selective media เพอ่ื ลดปริมาณ normal flora เมอื่ อาหารเหลว
มีเชอื้ ข้นึ ต้องนำ� มาเพาะแยกเชอ้ื บนอาหารวุ้น เพอื่ น�ำโคโลนขี องเช้อื มาแยกวนิ จิ ฉยั ชนดิ ของเช้ือและทดสอบความ
ไวตอ่ สารตา้ นจุลชีพ อาหารท่ีใช้เพาะเลยี้ งมีดังนี้
1. Enriched media: BA
2. Differential media: MAC
3. Selective media: SS, XLD และ TCBS
4. Enrichment media: GN broth และ APW

ตารางที่ 4.4-1 เชื้อและอาหารเล้ียงเช้อื ที่เกยี่ วข้อง

เชือ้ อาหารเพาะเลีย้ งเช้ือทีเ่ หมาะสม

Salmonella spp. GN broth, XLD*, MAC*
Shigella spp. MSRV และ GN broth ใช้สำ� หรับเล้ียงเชือ้ Salmonella spp.
Vibrio spp. APW, TCBS
Yersinia enterocolitica Yersinia selective agar base, Bile esculin agar
Campylobacter spp. BA base No.2, Campylobacter selective medium

1. ป้ายอจุ จาระหรือ rectal swab ลงบน BA, MAC, SS หรือ XLD และ TCBS ให้ได้โคโลนแี ยกจากกัน
2. ใสส่ ิง่ ส่งตรวจใน GN broth, APW และ BPW
3. น�ำจานเพาะเล้ียงและหลอดอาหารเหลวทั้งหมด อบที่ 35-37 °C เป็นเวลา 18-24 ชม. ส�ำหรับ APW
อบ 6-8 ชม. และอบ BPW ที่ 42 °C เป็นเวลา 24 ชม.
4. เพาะเช้ือจาก APW ลงบน TCBS, เพาะเชื้อจาก GN broth ลงบน SS อบท่ี 35-37 °C เปน็ เวลา 18-24 ชม.
และเพาะเช้ือจาก BPW ลงบน MSRV อบที่ 42 °C เปน็ เวลา 18-24 ชม.


สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 75

5. ตรวจเช้อื ทขี่ ้นึ บนอาหารแต่ละชนิด เพื่อนำ� โคโลนบี น SS และ MSRV ทีส่ งสยั Salmonella หรอื Shigella
และโคโลนสี ีเหลืองและสเี ขยี วบน TCBS ไปทดสอบแยกชนิดของเชอื้ โดยวธิ ีทางชวี เคมี
6. น�ำเชื้อบน TSI ที่สงสยั Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae O1 และ Vibrio cholerae O139 ไปท�ำ slide
agglutination test กับ antiserum ท่ีจ�ำเพาะต่อเช้ือ เพอ่ื รายงานผลข้ันต้น
7. ท�ำการทดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจุลชพี เฉพาะเชื้อกอ่ โรค
8. รายงานผลการเพาะเชอื้ และผลการทดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี

แบคทีเรยี กอ่ โรคทต่ี รวจพบ
Shigella เป็น non-hydrogen sulfide producing nonlactose fermenter Enterobacteriaceae มี 4 species 4 sero-
groups คือ S. dysenteriae group A, S. flexneri group B, S. boydii group C และ S. sonnei group D
Salmonella สว่ นใหญ่เปน็ nonlactose fermenter ทส่ี รา้ ง hydrogen sulfide ยกเว้น serovar Arizona ทมี่ กั ferment
lactose และ serovar Paratyphi-A ทไ่ี ม่สรา้ ง hydrogen sulfide Salmonella เป็นสาเหตขุ องโรคไทฟอยด์ อาหารเป็น
พษิ และโลหิตเป็นพิษ ได้แก่ S. Paratyphi-A, S. Paratyphi-B, S. Paratyphi-C, S. Typhimurium, S. Enteritidis,
S. Choleraesuis, S. Typhi และ S. Arizona
Vibrio เป็น gram-negative curved rod ลักษณะแท่งโค้งงอคล้าย comma-shape ให้ผล oxidase บวก
V. cholerae มีหลาย serogroup แต่ท่ีท�ำให้เกิดอหิวาตกโรคที่มีอาการท้องร่วงรุนแรงคือ serogroup O1 และ
O139 serogroup O1 ยังแบ่งเป็น biotype Classical และ El tor ส�ำหรับ serogroup อื่นมักเรียกว่าเป็น non
agglutination Vibrio หรอื NAG-Vibrio ทำ� ใหเ้ กิดท้องเสยี ธรรมดาหรือติดเชื้อในระบบอ่ืนๆ ของร่างกาย Vibrio
species ทกี่ อ่ โรคไดบ้ อ่ ยคอื V. parahaemolyticus เปน็ สาเหตขุ องอาหารทะเลเปน็ พษิ และV. vulnificus เปน็ lactose
fermenter Vibrio เป็นสาเหตขุ องการติดเชื้อทแ่ี ผล และโลหิตเปน็ พษิ รุนแรงถึงแกช่ ีวติ
Aeromonas เปน็ แทง่ ตรง curve rod หรอื coccobacilli ทใี่ หผ้ ล oxidase บวก แยกได้จากน�ำ้ จดื นำ�้ กรอ่ ยทส่ี กปรก
และแผลของสัตว์น�้ำ A. hydrophila เป็นสาเหตุของอาหารเป็นพิษและการติดเช้ือนอกระบบทางเดินอาหาร
A. caviae และ A. veronii biovar sobria เป็นเชอื้ ก่อโรคเชน่ เดียวกัน
Plesiomonas shigelloides ท�ำให้เกิดโรคเช่นเดียวกับ Aeromonas มีลักษณะผลการทดสอบทางชีวเคมี และ
O antigen คลา้ ยกบั Shigella sonnei มาก แต่ P. shigelloides เคลอ่ื นที่ และให้ผล arginine dihydrolase, lysine และ
ornithine decarboxylase เป็นบวก
Campylobacter และ Helicobacter รูปร่างเปน็ pleomorphic spiral, half spiral คลา้ ย S-shape, gull wing shape
หรือ comma sเชhaื้อpทeี่พอบาจกพ่อบโรเปครน็ ะแบทบ่งหทรางอื เดcินocอcาoหidารเปแน็ละmระicบroบaอeื่rนoๆphใilนicคเนจไรดิญ้บใ่อนยบรครือยาCก.าศjeทju่ีมnี iC, OC2. 3-5% และ
มี 4O22 3-15% C. fetus ตดิ ต่อจากสัตวม์ าสูค่ นทำ� ใหเ้ กดิ โลหติ เปน็ พิษ coli เจริญ
ที่ °C ได้ดี
Helicobacter pylori ไมไ่ ดเ้ ปน็ สาเหตุของโรคอจุ จาระร่วงแตท่ �ำให้เกิดแผลทีก่ ระเพาะอาหารและลำ� ไสส้ ่วนตน้
gram-negative half spiral bacilli หรือ gull wing shape เจรญิ แบบ microaerophilic ท่ี 37 °C ในบรรยากาศทม่ี ี
Oca2ta5l%ys,tCแOต่2s1u0p%pleแmลeะntNด2้ว8ย5g%asส-gาeมnาeรrถatเiพnาgะaเgชeอ้ื nใtนกาmรiเcพroาะaeเชroือ้ pตhอ้ilงicกcรoอnงdอiจุtiจonารใะนทaีผ่ nสaมerกoบัbeนiำ�้ nเcกuลbอื at1iomnljaโดr ยทหไ่ี มย่มดี
ลงบนกระดาษกรองขนาด 0.65 μm ทวี่ างบนผวิ ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื อบที่37°Cนาน1ชม.ในภาวะmicroaerophilic
เพื่อกรองเอาเช้อื อ่นื ๆ ออกไปใหม้ แี ตเ่ ชือ้ Campylobacter spp. อย่บู นผวิ วุน้ โดยดึงแผน่ กระดาษกรองออกแล้วบม่
จานเพาะเลยี้ งต่อที่ 42 °C ในภาวะ microaerophilic

76 คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทเี รียและรา

การรายงานผล
1. กรณพี บเชื้อก่อโรค ใหร้ ายงานผลช่อื เชอ้ื และผลการทดสอบความไวต่อสารต้านจลุ ชีพ (ยกเวน้ S. aureus
เพราะเชื้อน้ีไม่สร้าง toxin ในล�ำไส้)
2. กรณไี ม่พบเชือ้ ก่อโรค รายงาน
“No Salmonella, Shigella, Vibrio, Aeromonas or Plesiomonas isolated“
หากพบเชอ้ื ก่อโรค Salmonella spp., Shigella spp. หรือ Vibrio cholerae หลงั การท�ำ serum grouping ให้เก็บ
เชื้อใส่ NA สง่ ตรวจยนื ยนั และทำ� strain typing ทศี่ ูนย์วิทยาศาสตร์การแพทย์หรอื กรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ เพอื่
เฝา้ ระวงั การระบาดในระดบั ประเทศและนานาชาติ สำ� หรบั เชอ้ื Vibrio cholerae เมอื่ พบตอ้ งรายงานดว่ นไปยงั หนว่ ย
งานทีส่ ่งตัวอยา่ งและงานควบคมุ โรคติดเชื้อ เพอื่ สอบสวนและเฝา้ ระวงั ทางระบาดวทิ ยา

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 77

78 คมู่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา แผนภูมิท่ี 4.4-1 ขนั้ ตอนการตรวจวนิ จิ ฉัย เชอื้ จากอจุ จาระ/Rectal Swab

direct plating stool or rectal swab culture enrichment buffer PW
MAC (or EMB) XLD APW
TCBS GN broth

slide agglutination ทำเหมือน direct plating
identification + susceptibility testing
identification + susceptibility testing
report report