คู่มือปฏิบัติการแบคทีเรียและเชื้อรา กรมวิทย์ 2561

Chromobacterium spp.
เฉพาะ C. violaceum เทา่ นนั้ ทกี่ อ่ โรคในคน เชอื้ นต้ี ดิ สแี กรมลบ รปู แทง่ สว่ นใหญม่ ากกวา่ รอ้ ยละ 90 มรี งควตั ถุ
violacein v ท�ำใหม้ ีโคโลนสี ีมว่ ง แต่อยา่ งไรกต็ าม บางสายพันธท์ุ ่ีไมม่ รี งควัตถุ ก็สามารถพบได้
ในการเพาะเล้ียงเชือ้ แบคทีเรยี น้ี อาหารเลีย้ งเชือ้ ทวั่ ไปทีม่ ีอยู่ในห้องปฏิบัติการ เช่น BA หรือ CA หรอื Tryptic
soy agar (TSA) สามารถใช้เพาะได้ดี เชอ้ื โตงา่ ยคลา้ ยกับแบคทเี รียกลมุ่ enteric อาจพบ β-hemolysis บน BA ไดใ้ น
บางสายพนั ธ์ุ เชื้อสามารถเจริญได้ทอ่ี ณุ หภมุ ิ 30-37 °C ไม่ตอ้ งการ vCiOol2acโeคinโลดนงั มีนขี้นั นกาาดรจ1ำ� -แ2นmกmเบหอ้ื ลงตังจน้ ากคอ่24นขช้ามง.
ลกั ษณะกลมนนู ผิวเรยี บ และสว่ นใหญม่ สี มี ว่ ง เนอ่ื งจากรงควัตถุ
งา่ ย ถ้าพบโคโลนมี สี มี ว่ งดังกล่าว oxidase ให้ผลบวก อย่างไรกต็ าม ถา้ พบเชอื้ ทไี่ มใ่ หโ้ คโลนีสมี ่วง อาจท�ำใหส้ บั สน
กับ Aeromonas แต่สามารถจำ� แนกออกจาก Aeromonas ไดโ้ ดยการทดสอบ lysine, maltose และ mannitol ให้ผล
ลบทั้งหมด

ตารางที่ 5.8-1 ลกั ษณะทางชวี เคมขี องแบคทเี รยี ในกลมุ่ miscellaneousgram-negativeและแบคทเี รยี อน่ื ทใี่ กลเ้ คยี ง

Test Francisella spp.
Brucella spp.
Pasteurella spp.
Bartonella spp.
Haemophilus spp.
Chromobacterium violaceum
Bordetella bronchiseptica
Ochrobactrum anthropi

Growth on BA v+++ - ++ +
+
Growth on CA +++++++ +
+
Growth on MAC - -v- -++ +
+
Oxidase - ++ -Vv+ -
-
Urease - + v - V ND +
-
Motility - - - - -++

Indole - - +** - V v -

X and/or V factor - - - -+- -
requirement

Cysteine enhancement +* - - - - - -
* F. philomiragia และ F. novicida ไมต่ ้องการ cysteine ในการเจริญ
** P. aerogenes และ P. caballi ใหผ้ ลลบ

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทวั่ ไป 179

Campylobacter spp.
เชอ้ื Campylobacter เปน็ แบคทเี รยี แกรมลบ จดั อยใู่ น family Campylobacteraceae รปู รา่ งเปน็ ทอ่ นโคง้ (curved)
S-shaped หรือเป็นเกลียว (spiral) ขนาด 0.2 - 0.9 x 0.5 - 5.0 μm ติดสีแกรมลบ ไม่สร้างสปอร์ แต่อาจพบ
เปน็ รปู ร่างกลมหรือรี หากเพาะไว้นานหลายวนั เชื้อนีส้ ามารถเคลอื่ นทไ่ี ด้ โดยใช้ polar flagellum ส่วนใหญ่เป็น
CมmีรOicปู 2r,oรaa่าneงdrคo8ลb5้าi%cยกbNaนั c2tเบeชrาอื้iงaสCเจาaรยmิญพpไนัyดlธo้ดุเ์bจใี aนรcิญสteภไrดามใ้วีน2ะ1สทsภี่มpาปี eวcระiิมeasาeณ(rตoอาbอรicากงหซทรเิ จ่ี อื5น.8aต-n2�่ำa)เeวไrลดoาbแ้ เiกลc่ี้ยCไงด.เjช้eเดื้อjuมิตnจอ้i,ัดงCใอ.ชยcบู้่ใoนlรi,รgCยeา.nกfueาstuศVsท,ib่ีมCrี.i5uo%pเsนOalื่อ2i,eง1nจ0sาi%sก,
C. lari, C. hyointestinalis, C. helveticus, C. sputorum, C. concisus, C. curvus, C. rectus, C. showae, C. gracilis,
C. mucosalis, C. lanienae, C. insulaenigrae, C. canadensis, C. hominis, C. avium, C. cuniculorum, และ
C. subantarcticus
เชอื้ ใน genus Campylobacter มที งั้ เปน็ สาเหตขุ องโรคและกลมุ่ ทไ่ี มก่ อ่ โรคเชอื้ ทท่ี ำ� ใหเ้ กดิ โรคทสี่ ำ� คญั C. jejuni
และ C. coli เป็นสายพันธุ์ท่ีเป็นสาเหตุของการติดเชื้อมากที่สุด เชื้อสามารถอยู่ในอาหาร น้�ำ หรือสิ่งแวดล้อม
อื่น ๆ ทนต่อความร้อน ความแห้งแล้ง ดื้อต่อสารต้านจุลชีพในอัตราที่สูง นอกจากน้ี เช้ือ C. fetus, C. lari,
C. upsaliensis และ C. hyointestinalis เป็นสายพันธทุ์ ก่ี อ่ โรคได้ทั้งในมนุษยแ์ ละสตั ว์

การวนิ ิจฉัยทางห้องปฏบิ ตั กิ าร
การตรวจการติดเชื้อ C. jejuni สามารถตรวจโดยใช้อุจจาระผสมน�้ำเกลือหยดบนแผ่นแก้วตรวจดูด้วย
กล้องจุลทรรศน์ชนิด dark field หรือ phase contrast โดยตรวจหาแบคทีเรียรูปร่างโค้งงอ ท่ีมีการเคลื่อนท่ีเร็ว
ปจั จุบนั ใชว้ ธิ ีการเพาะแยกเชอื้ จากตัวอยา่ งอุจจาระผ้ปู ่วย โดยเก็บใสข่ วดทีส่ ะอาด หรอื เกบ็ เปน็ rectal swab ใสใ่ น
Cary – Blair transport medium นำ� ส่งห้องปฏิบัติการภายใน 2 ชม. หรือหากไมส่ ามารถเพาะเช้อื ไดใ้ หเ้ กบ็ ที่ 4 °C
การเพาะเชอื้ สามารถเลือกใชอ้ าหารเล้ียงเชื้อหลายชนดิ เชน่ 5% BA โดยใช้แผ่นกระดาษกรอง ขนาด 0.45 µm วาง
ลงบนอาหาร BA น�ำ rectal swab ของผปู้ ่วย มาปา้ ยบนแผน่ กระดาษกรอง ตัง้ ทงิ้ ไวน้ าน 30 นาที จากนั้นคีบเอา
แผ่นกระดาษกรองทิง้ ไป แล้วน�ำไปอบในสภาวะ microaerobic (5% O2 10% CO2 85% N2) หรือใช้ anaerobic jar
ทีใ่ ส่ Campy pak (BBL) 1 ซอง ที่อณุ หภมู ิ 37 °C นาน 48 ชม.
นอกจากนี้อาจป้ายอุจจาระลงอาหารเล้ียงเช้ือชนิด selective medium ท่ีมีส่วนผสมของสารต้านจุลชีพ เช่น
Skirrow’s medium ทีม่ สี ่วนผสมของ vancomycin, trimethoprim และ polymyxin B, Butzler’s medium ทีม่ ีสว่ น
ผสมของ bacitracin, cycloheximide, colistin sulphate, cephazolin sodium และ novobiocin หรอื Campy-BAP
ทมี่ สี ว่ นผสมของ vancomycin, polymyxin B, cephalothin sodium และ amphotericin B จากนนั้ นำ� ไปอบในสภาวะ
microaerobic ดงั กล่าวทอ่ี ุณหภูมิ 37 °C ตรวจดโู คโลนีของเชอื้ หลังจากอบเพาะเชอื้ นาน 2-3 วนั โคโลนีของเชื้อ
จะมลี กั ษณะมนั วาวคลา้ ยหยดนำ�้ คา้ ง ขนาด 1-2 mm สเี ทาขาว เมอ่ื นำ� ไปยอ้ มสแี กรมจะเหน็ เปน็ รปู ตวั S หรอื ปกี นก
(Gull wing) ตดิ สีแกรมลบ แต่เช้อื ไม่คอ่ ยตดิ สี safranin ต้องใช้ 0.05-0.1% carbol fuchsin เป็น counter stain แทน


180 คู่มอื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

การทดสอบปฏกิ ิรยิ าทางชวี เคมีเบื้องตน้
เช้ือ Campylobacter ทดสอบ oxidase ใหผ้ ลบวก ทำ� การถา่ ยโคโลนีทพี่ บลงใน BA 3 จาน น�ำไปอบท่สี ภาวะ
microaerobic ทีอ่ ณุ หภูมติ ่างกนั ได้แก่ อณุ หภมู ิ 25°C, 37 °C และ 42 °C เป็นเวลานาน 24-48 ชม.สังเกตผลดังนี้
คือ ถา้ เป็นเชื้อ Campylobacter เชอื้ จะเจรญิ ได้ดใี นสภาวะ microaerobic อุณหภมู ิ 37 °C /42 °C แต่เจริญไดไ้ ม่ดีที่
สภาวะ microaerobic อณุ หภูมิห้อง (25 °C) การแยกพิสจู น์เชือ้ ใหไ้ ดแ้ ต่ละ species สามารถดูไดจ้ ากตารางท่ี 5.8-2
C. jejuni แยกออกจาก Campylobacter สายพนั ธ์ุอนื่ ๆ ด้วย hippurate hydrolysis ซงึ่ C. jejuni ใหผ้ ลบวก ขณะ
ทส่ี ายพันธ์อุ น่ื ใหผ้ ลลบ วธิ กี ารทดสอบ hippurate hydrolysis ดงั ตอ่ ไปนี้
1. เขี่ยเชอ้ื ทดสอบ 2 loopful ลงใน 0.4 ml ของ 1% hippurate solution ในหลอดขนาด 13 x 100 mm

อบหลอดท่ี 37 °C 2 ชม.
2. หยด 0.2 ml ninhydrin reagent เขยา่ และ อบหลอดที่ 37 °C 10 นาที
ผลบวก: เกิดสีมว่ ง
ผลลบ: ไมเ่ ปล่ียนสี หรอื เกดิ สีมว่ งอ่อน

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 181

182 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา ตารางท่ี 5.8-2 การแยกพิสูจน์เชือ้ Campylobacter spp. Growth at/ in/on

Species
α-hemolysis
Oxidase
Catalase
Hippyrate hydrolysis
Urease production
Nitrate reduction
Alkaline phosphatase
H2S, TSI
Acid and H2S, TSI
Indoxyl aceate hydrolysis
25 ˚C (microaerobic)
30 ˚C (microaerobic)
37 ˚C (microaerobic)
42 ˚C (microaerobic)
37 ˚C (anaerobic)
Ambient O2
Nutrient agar
CCDA
MacConkey agar
1% glycine
3.5% NaCl
Resistance to nalidixic acid
Resistance to cephalothin
Requirement for H2
γ-Glutamyl transpeptidase
Flagella

C. upsaliensis ++- - -+- - -+ - + + (+) - - + + - + - - (-) - - +
C. sputorum ++V- - + - + - - - (+) + + + - + (+) V + V (+) - + - +
C. showae +V+ - - + -V-V - +VV + - V + + V - - - + NA +
C. rectus + + (-) - - + - - - + - V - (-) + - (-) - - + - (+) - + NA +
C. mucosalis - + - - - - (+) + - - - +++ + - + + (+) V - (+) - + NA +
C. lari V++ -V+ - - - - -+++ - - + + - + - V+ - - +
C. lanienae -++- -++-V- - NA + + + - NA NA + - - + + - - +
C. jejuni subsp. jejuni ++++-+- - -+ -+++ - - + + - + - -+--+
C. jejuni subsp. doylei ++V+ - - - - - + -++- - - + + - (-) - - - - NA +
C. insulaenigrae NA + + - - + NA - NA - - NA NA - - - NA NA NA + - + + NA NA NA
C. hsuybosinpt.elsatwinsaolinsii V + + - - + (-) + - - - +++ + - + + v v -+-V-+

ตารางที่ 5.8-2 การแยกพสิ จู นเ์ ช้ือ Campylobacter spp. (ตอ่ ) Growth at/ in/on

Species
α-hemolysis
Oxidase
Catalase
Hippyrate hydrolysis
Urease production
Nitrate reduction
Alkaline phosphatase
H2S, TSI
Acid and H2S, TSI
Indoxyl aceate hydrolysis
25 ˚C (microaerobic)
30 ˚C (microaerobic)
37 ˚C (microaerobic)
42 ˚C (microaerobic)
37 ˚C (anaerobic)
Ambient O2
Nutrient agar
CCDA
MacConkey agar
1% glycine
3.5% NaCl
Resistance to nalidixic acid
Resistance to cephalothin
Requirement for H2
γ-Glutamyl transpeptidase
Flagella

C. hhyyooiinntteessttiinnaalilsis subsp. V + + - - + - + - - (-) + + + - - + + V + - + (-) V - +

C. avium - + W + - + - - - + - NA + + - - - - - - - - + V - +

C. hominis - + - - - V - - NA - - - - NA + - NA NA - + + V - NA NA -

C. helveticus + + - - - + - - - + - V + + - - (+) + - V - - - - - +

C. gracilis - - V - - (+) - - - V - V - V + - + V (+) + - V - NA NA -

C. fetus subsp. venerealis V + (+) - - + - - - - + + + - V - + + V - - V - - NA +

C. fetus subsp. fetus - + + - - + - - - - + + + (+) (-) - + + (+) + - + - - - +

C. curvus (-) + - (-) - + V (-) - V - + V V + - + (+) (+) + - + - + NA +

C. concisus (-) V - - - (-) V - - - - (+) + (+) + - (-) (-) - (-) - (-) - + - +

C. coli (-) + + - - + - V - + - + + + - - + + V + - - + - - +

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 183 C. canadensis - + V - V V - V (-) - - - + + + - - + + V - V - - (+) +

C. cumiculorum + + + - - + - - NA + - NA + (+) - - + (+) - - - V (+) - - +

C. subantarcticus + + + - NA NA NA - - - - NA + + + - + NA (-) (+) NA + - - NA +

+, 90–100 % of strains positive; (+), 75–89 % of strains positive; V, 26–74 % of strains positive; (–), 11–25 % of strains positive; –, 0–10 % of strains positive. w, weakly
positive, NA, No data available. Data for reference species were taken from Foster et al. (2004), Lawson et al. (2001), Logan et al. (2000) and On et al. (1996). Ross
et al. (2009) and Dedryne et al. ( 2010)

เอกสารอ้างองิ
1. Debruyne L, Broman T, BergstrÖm s, Olsen B, On SL, Vandamme P. Campytobacter subantarcticus
Sp. nov., isolated from birds in the sub-Antarctic region. Int J Syst Evol Microbiol. 2010; 60 : 815-9.
2. Foster G, Holmes B, Steigerwalt AG, Lawson PA, Thorne P, Bryer DE, Ross HM, Xerry J, Thompson
PM, Collins MD. Campylobacter insulaenigrae sp. nov., isolated from marine mamals. Int J Syst Evol
Microbiol. 2004; 54 : 2369-73.
3. Holmes B, Pickett J, Holis DG. Pasteurella, In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover
FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 7th ed. Washington, DC: ASM
Press; 1999. p. 632-7.
4. Lawson AJ, On SL, Logan JM, Stenley J, Campylobacter hominis sp. nov., isolated from the human
gastrointertinal trat. Int J Syst Evol Mirobiol. 2001; 51 : 651-60.
5. Leelaporn A, Yongyod S, Limsrivanichakorn , Yungyuen T, Kiratisin P. Francisella novicida
bacteremia, Thailand. Emerg Infect Dis. 2008;14:1935-7.
6. Logan JM, Burnens A, Linton D, Lawson AJ, Stanley J, Campylobacter lanienae sp. nov., a new species
isolated from workers in an abattoir. Int J Syst Evol Microbiol. 2000 ; 2 : 865-72.
7. Maggi RG, Kempf VAJ, Chomel BB, Breitschwerdt EB. Bartonella. In: Versalovic J, Carroll
KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical
Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 786-98.
8. On SL. Identification method for campylobactors, helicobacters and related organisms. Clin Microbiol Rev.
1996; 9 : 405-22.
9. Petersen JM, Schriefer ME, Araj GF. 2011. Francisella and Brucella. In: Versalovic J, Carroll
KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical
Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 751-69.
10. Rossi M, Debruyne, Zanoni RG, Manfreda G, Revez J, vandamme P. Campylobacterarium sp. nov.,
a hippurate-positive species isolated from poultry. Int J Syst evol Microbiol. 2009; 59 : 2364-9
11. Zanoni RG, Debruyne L, Rossi M, Revez J, Vandamme P, Campylobacter cuniculorum sp. nov.,
from rabbits. Int J Syst Evol Microbiol. 2009; 59 : 1666-71.
12. Zbinden R, Graevenitz AV. Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella,
and other fastidious or rarely encountered gram-negative rods. In: Versalovic J, Carroll KC,
Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical
Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 574-87.

184 ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรยี และรา

5.9 การวนิ จิ ฉยั เช้อื กลุ่ม Anaerobic Bacteria ปยิ ะดา หวังรงุ่ ทรัพย์

หลกั การ
การตดิ เชือ้ anaerobic bacteria สว่ นใหญ่เกดิ จากเชือ้ ประจำ� ถิ่นของรา่ งกาย ดงั นัน้ ต�ำแหน่งการติดเช้ือจงึ อยใู่ กล้
กบั ตำ� แหน่งท่มี ีเชอื้ anaerobe เป็นเช้ือประจ�ำถ่ิน เช่น การตดิ เช้ือในลำ� ไส้ ช่องท้อง อุ้งเชงิ กราน เปน็ ต้น การกอ่ โรค
มักเกิดจาก aerobic bacteria และตามดว้ ย anaerobic bacteria จึงพบว่าการตดิ เชื้อ anaerobe มีเช้ือกอ่ โรคหลายชนิด
การติดเช้ือ anaerobic bacteria ที่เกิดจากเช้ือนอกร่างกายก็พบได้เช่นกัน เช่น บาดทะยัก อาหารเป็นพิษจากเชื้อ
Clostridium botulinum แผลติดเชอ้ื (gas gangrene) จากเช้ือ C. perfringens เปน็ ต้น

ขอบเขต
การเพาะแยกเชอ้ื จากตวั อยา่ งผปู้ ว่ ย เพอื่ ตรวจหาเชอ้ื anaerobic bacteria ทเี่ ปน็ สาเหตขุ องโรคตลอดจนการตรวจ
สอบลักษณะตัวเช้ือด้วยวิธีการย้อมแกรมและการตรวจสอบลักษณะโคโลนีเพ่ือจ�ำแนกชนิดของเช้ือ anaerobic
bacteria เบ้ืองตน้

การเก็บตวั อย่างและการน�ำสง่ ตัวอย่างตรวจวนิ จิ ฉัย anaerobic bacteria
1. การเลือกและเก็บสิ่งส่งตรวจ การเลือกส่งิ สง่ ตรวจ เพอ่ื ตรวจวนิ ิจฉัย anaerobic bacteria นอกจากดปู ระวตั ิ
ผปู้ ว่ ย ผลการตรวจของแพทยห์ รอื ขอ้ มลู ทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารอนื่ ๆ แลว้ ตอ้ งคำ� นงึ ถงึ เวลาทเ่ี หมาะสมในการเกบ็ วตั ถุ
ตัวอยา่ ง เกบ็ ตวั อยา่ งในบรเิ วณที่มกี ารตดิ เชอื้ โดยหลกี เล่ียงการปนเปอื้ นของเช้ือประจ�ำถ่ิน (normal flora) บริเวณ
ใกล้เคยี งและจากสง่ิ แวดล้อมภายนอก
2. สิง่ ส่งตรวจทีเ่ หมาะสมสำ� หรับการตรวจหาเช้อื anaerobic bacteria
2.1 หนองจากแผลลกึ หนองจากอวยั วะภายใน เชน่ สมอง ปอด ตับ ชอ่ งทอ้ ง เปน็ ตน้
2.2 สารน�้ำในร่างกายท่ไี ด้มาจากการเจาะดูด (aspirate) จากตำ� แหนง่ ท่ีอยูโ่ ดยตรง เช่น เลอื ด นำ้� ในชอ่ ง
ทอ้ ง (peritoneal fluid) นำ้� ในชอ่ งเย่ือหุ้มปอด (pleural fluid) น�้ำจากข้อ (synovial fluid) นำ�้ ครำ่�
(amniotic fluid) น้ำ� ดี (bile) เป็นต้น
2.3 เนื้อเยอื่ จากการเกบ็ ชน้ิ เนอ้ื (biopsy)
2.4 สงิ่ ส่งตรวจที่เก็บโดยวธิ ีพเิ ศษ เชน่ การเจาะผ่านหลอดคอ การเจาะดดู จากกระเพาะปสั สาวะ
3. ส่งิ สง่ ตรวจที่ไม่เหมาะสมส�ำหรับการตรวจหาเชื้อ anaerobic bacteria
3.1 เสมหะ
3.2 swab ท่ีปา้ ยจากในคอและในจมูก
3.3 อจุ จาระ และ rectal swab
3.4 ปสั สาวะจากการขับถา่ ยหรือการสวนปสั สาวะ (catheterized urine)
3.5 swab ทป่ี า้ ยจากปากมดลกู หรือบริเวณชอ่ งคลอด (cervical swab)
3.6 ส่งิ ส่งตรวจท่ปี นเปอื้ นเชอื้ ประจ�ำถน่ิ (normal flora)
3.7 swab หนองจากปากแผลหรือแผลตื้น

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 185

4. การเก็บส่ิงส่งตรวจและการน�ำสง่ หอ้ งปฏิบัติการ นอกจากการเลือกสิง่ ส่งตรวจทเ่ี หมาะสมสง่ ตรวจวินจิ ฉยั
anaerobic bacteria แล้ว ปจั จัยอนื่ ทม่ี ผี ลตอ่ เชื้อในสิ่งสง่ ตรวจซึง่ ควรกระท�ำให้เหมาะสม ไดแ้ ก่ ปริมาณตวั อย่างที่
เพียงพอ ขนาดและความสะอาดของภาชนะทใ่ี ชใ้ สต่ ัวอย่างความชื้น ปริมาณออกซเิ จน (Eh) อณุ หภมู ใิ นระหวา่ ง
การนำ� ส่ง ระยะเวลาหลังการเก็บตวั อยา่ งจนส่งถึงหอ้ งปฏิบตั กิ าร transport medium ท่ีใช้ในการน�ำส่ง สารท่ีมีผล
ยับยัง้ การเจริญของเช้ือสาร anticoagulant และการปนเป้ือนของยาตา้ นจุลชีพในตัวอย่าง
สงิ่ สง่ ตรวจทเี่ กบ็ มาแลว้ ควรนำ� สง่ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทนั ที เพอ่ื ดำ� เนนิ การตรวจเพาะเชอ้ื โดยเรว็ ทสี่ ดุ ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ้ ง
ไมค่ วรใสต่ เู้ ย็นหรือแชน่ �้ำแขง็ เพราะความเยน็ มีผลต่อการเจริญของ anaerobic bacteria บางชนดิ
4.1 การเกบ็ สงิ่ สง่ ตรวจทเ่ี ปน็ ของเหลว ใชเ้ ขม็ และกระบอกฉดี ยาเกบ็ ตวั อยา่ งแลว้ ไลอ่ ากาศในกระบอกฉดี ยา
(ปอภอราากพศใทจหาี่ห้ ก5มเ.ช9ด-อื้ 1ฉแ)ลดี กะตรนัวณำ�อใีไยสม่าห่ ง่มลลีขงอวใดดนทบขดรวลรดอจปงุแรหการ๊ศสอืจอCากาOจเช2ใชอ้ืเมว้ทธื่ิอี่บเีไกรลบ็ร่อจตาแุวักกอา๊สยศา่อCงอบOกร2จรหาจรกลุ ือกงแหรกะลส๊ บอผอดสกทมฉดแีลดลอยะางแหinลรd้วอื icใขaหวto้ปดrขักทนเข่ใีาช็มด้บลเลง่งก็ ชบท้ีนOป่ี จ2รใุกานยศขาจงวาทดกี่
เชอ้ื ให้เตม็ พอดีเพอื่ แทนท่ีอากาศท้ังหมด

ภาพที่ 5.9-1 Rubber-stoppered collection vial containing an agar indicator system.
4.2 การเก็บส่ิงส่งตรวจทีเ่ ปน็ เน้ือเยอ่ื เนือ้ เยอ่ื เปน็ ส่ิงส่งตรวจทเ่ี หมาะสมเพราะเช้อื จะสามารถอยใู่ นเนื้อเยื่อ
ไดน้ านหลายชัว่ โมง เก็บเนอื้ เยอ่ื ในหลอดทดลองปราศจากเชอ้ื ทบ่ี รรจนุ ้ำ� เกลอื ปริมาณเล็กน้อย เพื่อรกั ษาความชน้ื
และน�ำส่งตรวจในสภาวะไรอ้ ากาศโดยบรรจุในถงุ anaerobic pouch ใส่ anaerobic GasPak (GasPak pouch) (ภาพ
ท่ี 5.9-2)

ภาพที่ 5.9.2 Anaerobic transport system สำ� หรับสิง่ สง่ ตรวจที่เปน็ เนื้อเย่อื

186 คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรียและรา

4.3 การเกบ็ สิง่ สง่ ตรวจท่เี ป็น swab ตวั อย่าง swab เปน็ วัตถุตวั อย่างที่ไมเ่ หมาะสม เน่อื งจากสัมผัสอากาศ
มากไดส้ ง่ิ ส่งตรวจน้อย มกี ารปนเปอ้ื นเช้อื อนื่ ได้ง่าย แหง้ ง่าย อาจมเี ชอื้ ตกคา้ งในใยสำ� ลี สำ� ลีบางชนิดมีสารยบั ยง้ั
การเจริญของเชื้อ หากมคี วามจ�ำเป็นควรเก็บตวั อย่าง swab ใน anaerobic transport system ซึง่ มี soft agar ท่เี ติม
reducing agent (รูปท่ี 5.9-3)

ภาพท่ี 5.9-3 Anaerobic transport system ส�ำหรบั ตวั อย่าง swab

4.4 ตัวอยา่ งเช้ือบรสิ ทุ ธ์ิ เชอื้ แบคทเี รยี ท่สี งสยั เป็น anaerobic bacteria ตอ้ งการส่งตรวจยืนยันชนิดของเชอ้ื
ใหน้ �ำส่งตวั อยา่ งเช้ือในสภาวะไรอ้ ากาศ โดยเพาะเลีย้ งเช้อื ใน enrichment media เชน่ BA, cooked meat medium,
enriched thioglycolate medium บรรจใุ น GasPak pouch นำ� ส่งห้องปฏบิ ัตกิ ารอา้ งอิง

วธิ ีปฏบิ ตั ิงาน
1. เม่ือส่ิงส่งตรวจถึงห้องปฏิบัติการ เจ้าหน้าที่ท�ำการตรวจสอบสภาพของตัวอย่างก่อนรับและด�ำเนินการ
ตรวจวนิ จิ ฉัยทันที (แผนภูมิที่ 5.9-1) ถ้ายังไม่สามารถท�ำได้ในขณะน้นั ใหน้ ำ� ตัวอยา่ งเกบ็ ท่อี ุณหภมู หิ อ้ ง
2. สงั เกตลักษณะของตวั อย่าง (macroscopic examination) โดยส่ิงสง่ ตรวจจากผปู้ ว่ ยติดเชื้อ anaerobic bacteria
มีลกั ษณะเด่นชัด เช่น มีกล่ินเหมน็ มแี ก็สเกิดขนึ้ มา มีสีดำ� คล�้ำ มีสแี ดงอฐิ (brick-red fluorescene) เม่อื ดูภายใตแ้ สง
ultraviolet เน่ืองจากมี Porphyromonas spp. และ/หรือ Prevotella spp. มีก้อนสีขาวหรือเหลืองในส่ิงส่งตรวจ
(sulfur granules) ถา้ เปน็ การติดเชอ้ื Actinomyces isaraelii
3. น�ำตัวอยา่ งมาเพาะเล้ยี งเชือ้ บนอาหารเลยี้ งเชื้อตอ่ ไปน้ี (primary plate) คอื Ana BA, BBE, EY, BA และ CA,
liquid enrichment media เช่น enriched thioglycolate broth หรือ cooked meat medium และน�ำไปอบที่ 35-37 °C
ในภาวะทเ่ี หมาะสม คอื Ana BA, BBE และ EY อบในภาวะไรอ้ ากาศ สำ� หรบั CA อบเช้อื ในสภาวะ 5-10% CO2
อาหารทเี่ หลืออบในตู้อบธรรมดา ดงั แผนภมู ิท่ี 5.9-1

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทัว่ ไป 187

แผนภมู ทิ ่ี 5.9-1 วธิ ดี ำ� เนินการตรวจวนิ ิจฉัย anaerobic bacteria เบ้ืองตน้

สง่ิ ส่งตรวจ
(เลอื ด น�้ำจากชอ่ งปอด, หนอง, เน้อื เยื่อ)

ตรวจวิเคราะหต์ วั อย่างโดยตรง เพาะเชื้อ บนอาหารแขง็ เพาะเชื้อ ใน liquid enrichment media
- ตรวจดลู ักษณะของตวั อย่าง - Ana BA, BBE, EY อบเชือ้ ในอากาศปกติ
(macroscopic) อบเชอ้ื ในสภาวะไร้อากาศ 35 ± 2 °C 48 ชม.
- ตรวจดูการยอ้ มแกรม 35 ± 2 °C 48 ชม.
(microscopic) - BA อบเช้อื ในสภาวะ - Ana BA primary plate positive
อากาศปกติ 35 ± 2 °C 24 ชม. 1) อบ เชื้อ 35 ± 2 °C 48 ชม
- CA อบเช้ือในสภาวะ 2) ยอ้ มสแี กรม หากพบว่ามีเชือ้ ท่ี
5-10% CO2 35 ± 2 °C 48 ชม. ยงั แยกไม่ไดใ้ ห้ subculture
- Ana BA primary plate negative

ตรวจสอบผลการเจริญทั้งหมด 1) subculture และยอ้ มสแี กรม
เมือ่ บม่ ครบ7 วันหรือ อาหารขุ่น
2) บ่มเพาะเช้ือ 14 วนั ไมเ่ จริญ
ให้สังเกตดว้ ยตาแลว้ จงึ ทิง้
BA และ CA - Ana BA: เลอื กโคโลนลี ักษณะต่างๆ
- BBE: เลือกโคโลนขี นาด >1 mm ทดสอบ catalase
บันทึกลกั ษณะ - EYA: บนั ทึกผล lipase และ lecithinase เลือกโคโลนลี ักษณะตา่ งๆ
และผลการยอ้ มสแี กรม
เชื้อแตล่ ะลักษณะโคโลนี
- subculture บน Ana BA และ streak ใหไ้ ด้โคโลนเี ดีย่ ว
- subculture บน CA ส�ำหรบั ทดสอบ aerotolerance
- ยอ้ มสแี กรม

CA scant or no growth CA good growth

รายงานผลการทดสอบ/ลักษณะโคโลนี และการย้อมสแี กรม aerobic bacteria

188 คมู่ ือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

4 การเตรียมส่ิงส่งตรวจและเพาะเช้ือจากส่ิงส่งตรวจ (inoculate) บนอาหารเล้ียงเช้ือ หากด�ำเนินการบนโต๊ะ
ปฏบิ ัติการปกติ กระบวนการทง้ั หมดควรเสร็จสิน้ ภายใน 15-20 นาที เพือ่ ใหต้ วั อย่างสัมผสั กบั อากาศนอ้ ยทีส่ ุด
4.1 ส่ิงส่งตรวจที่เป็นของเหลว เช่น หนองจากแผลลึก สารน�้ำในร่างกาย ให้ผสมสิ่งส่งตรวจโดยใช้
capillary pipette ดดู ข้ึนดูดลงเบาๆ ไมใ่ หเ้ กดิ ฟองอากาศ จนแน่ใจวา่ มกี ารกระจายตัวของเชือ้ ท่ัวท้งั
หลอด แล้วจงึ ดดู วตั ถุตัวอย่างมา หยดบนอาหารเลยี้ งเชอ้ื ชนดิ แขง็ จานละ 1-2 หยด และหยดใส่ใน
อาหารเหลว (liquid enrichment media) ใกล้กับก้นหลอด 1-2 หยด หยดลงบนสไลด์ส�ำหรับ
ยอ้ มแกรม 1 หยด smear สไลด์ และ streak plate
4.2 ส่ิงส่งตรวจท่ีเป็นเน้ือเยื่อ เน้ือเยื่อหรือตัวอย่างท่ีค่อนข้างแข็ง ให้ใช้กรรไกรปราศจากเชื้อตัด
สิ่งสง่ ตรวจใส่ liquid enrichment media ประมาณ 1 ml บดให้เขา้ กนั ดดี ว้ ย tissue grinder หรือผสม
ให้เข้ากันดีกับ liquid media จะไดเ้ ป็นวัตถตุ ัวอย่างเหลว เพาะเชอื้ บนอาหารเลย้ี งเชื้อ โดยปฏิบตั เิ ช่น
เดียวกบั ข้อ 4.1
4.3 สิ่งส่งตรวจทเี่ ปน็ swab หากมี swab 2 อัน ใหใ้ ช้อันแรกป้ายในอาหารแขง็ โดยหมนุ ไปรอบๆ ให้ทั่ว
ประมาณ 1 ใน 4 ของ plate อีกอันหนึ่ง ใส่ลงในอาหารเหลว ถ้ามี swab เพียงอันเดียวให้ใส่ใน
อาหาร เหลวปริมาตร 0.5 - 1 ml บิดไปมาแล้วใช้สว่ นนเ้ี พาะเชื้อบนอาหารแข็งและอาหารเหลว สิง่
สง่ ตรวจทเ่ี ปน็ swab ไมเ่ หมาะที่จะยอ้ มแกรม
4.4 ในกรณีตัวอย่างท่ีต้องการตรวจหาเช้ือ Clostridium spp. เช่นตัวอย่างอุจจาระหรือตัวอย่างจาก
สง่ิ แวดลอ้ ม ควรใชว้ ิธี alcohol shock โดยนำ� ตวั อย่างผสมกบั absolute ethanol ในอตั ราสว่ น 1:1 ตงั้
ไวท้ ี่อุณหภูมิหอ้ งนาน 30 นาที จงึ น�ำตวั อยา่ งถ่ายลงบนอาหารเล้ยี งเชื้อ หรอื วิธี heat shock ก็ใช้ได้ดี
เชน่ กนั โดยน�ำตวั อยา่ งแช่ในอา่ งน�ำ้ รอ้ นที่อณุ หภูมิ 70-80 °C นาน 10-15 นาที ก่อนถ่ายตัวอยา่ งลง
บนอาหารเล้ยี งเชือ้
4.5 ย้อมสแี กรม จากส่งิ ส่งตรวจ (microscopic examination) ตรวจดูผลด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศนก์ �ำลัง ขยาย
10X10 เพ่ือดูลักษณะทั่วไปก่อนจึงดูด้วยก�ำลังขยาย 10X100 โดยสังเกตลักษณะการติดสีของเช้ือ
ขนาดรูปร่าง และจ�ำนวนของเช้ือแต่ละชนิดในสิ่งส่งตรวจ รวมท้ังการสร้างสปอร์ที่มีรูปไข่หรือรูป
กลมและต�ำแหน่งของสปอร์ เช่น กลางเซลล์ (central spore) ปลายเซลล์ (terminal spore) หรือ
ระหวา่ งกลางกบั ปลายเซลล์ (subterminal spore) เปน็ ตน้ ขอ้ มลู ทไ่ี ดจ้ ากการยอ้ มสแี กรมมคี วามสำ� คญั
อย่างมากเป็นข้อมูลเบื้องต้นที่แพทย์สามารถน�ำไปใช้ประกอบการรักษาผู้ป่วยได้ และช่วยในการ
ตดั สินใจเลือกใชอ้ าหารเล้ียงเช้อื ทเี่ หมาะสม (แผนภมู ิท่ี 5.9-2)

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทว่ั ไป 189

แผนภูมิท่ี 5.9-2 แสดงการแบง่ กลุ่มของ anaerobic bacteria

4.6 น�ำอาหารเล้ียงเชื้อ Ana BA, BBE, EY และ liquid enrichment media ที่ทำ� การ inoculate เรียบรอ้ ย
แลว้ อบเชอื้ ใน anaerobic jar ท่อี ุณหภูมิ 35 ± 2 °C นาน 48 ชม. ไมค่ วรเปดิ anaerobic jar กอ่ น 48 ชม.
เพราะจะท�ำให้เชื้อที่ก�ำลังเจริญและเปลี่ยนแปลงลักษณะโคโลนีสัมผัสโดนอากาศและตายได้
หเนาื่อกงอจบากเช้อืanในaeraonbaiecrobbaicctecrhiaamสb่วeนrใหหรญือไ่ วanตaอ่ erOob2iใcนpรoะuหchวeา่ sงชส่วางมาlรoถgaตrรitวhจmสicอบphกaาsรeเจรขญิ อขงกอางรเชเจอ้ื รไิญด้
ชCมlo.sโtดriยdไiuมm่สมั pผerสั frกinับgeOn2sโบดยนเฉEพYาะโคโลนีของ
หลังอบ 24 Bacteroides fragilis group บน BBE หรือ
โคโลนีของ
4.7 อาหารเล้ียงเช้ือ BA ท่ี inoculate เรียบร้อยแล้ว อบเช้ือในสภาวะอากาศปกติ (ambient air) ท่ี
อุณหภมู ิ 35 ± 2 °C นาน 24 ชม.
4.8 CA ที่ inoculate เรยี บร้อยแล้ว อบเช้ือในสภาวะ 5-10% CO2 (Candle jar) หรอื ตอู้ บ CO2 ท่ีอุณหภูมิ
35±2 °C นาน 48 ชม.
4.9 อา่ นผลการเจรญิ ของเชอ้ื บน BA หลงั จากอบเชอื้ ในสภาวะอากาศปกตคิ รบ 24 ชม. โดยสงั เกตลกั ษณะ
ของโคโลนี คุณสมบัติในการย่อยสลายเม็ดเลือดแดง (hemolysis) และย้อมสีแกรม มี Clostridium
หลาย species สามารถเจริญได้ในสภาวะอากาศปกติ แต่ไม่สร้างสปอร์ เช่น C. carnis,
C. haemolyticum และ C. tertium
4.10 อ่านผลการเจรญิ ของเช้อื บน CA หลังจากบม่ เพาะเชอ้ื ในสภาวะ 5-10 % CO2 เปน็ เวลา 48-72 ชม.
สังเกตลกั ษณะโคโลนแี ละยอ้ มสแี กรม

190 คมู่ อื การปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

4.11 ตรวจสอบผลการเจริญของเชื้อบน Ana BA, BBE และ EY หลังจากอบเชื้อในสภาวะไร้อากาศ
เป็นเวลา 48-72 ชม. โดยใช้ stereoscopic microscope หรือ hand lens (X8) ช่วยในการดูลักษณะ
โคโลนีท่มี ขี นาดเลก็ อ่านลักษณะโคโลนขี องเชื้อท่ีพบทั้งหมด ปริมาณของเชอ้ื แตล่ ะลักษณะโคโลนี
โดยบนั ทกึ รายละเอยี ดของโคโลนีคือ ขนาด รูปร่าง (circular, irregular, molar-tooth, breadcrumb)
ขอบ (entire, rhizoid, undulate) รูปด้านข้าง (convex, umbonate, pitting) ความทึบแสง (transparent,
translucent, opaque) สี และอ่นื ๆ เชน่ fluorescence, hemolysis เปน็ ต้น
4.12 เลือกโคโลนีเดี่ยวของเช้ือทุกลักษณะที่พบบน Ana BA (primary plate) มา subculture ให้ได้เช้ือ
บริสุทธ์ิบน Ana BA (secondary plate) ทดสอบ aerotolerance บน Ana BA และย้อมสีแกรม
หากโคโลนีมีขนาดเล็ก ให้ inoculate บน Ana BA อย่างเดียวก่อน เม่ือเช้ือเจริญเพ่ิมปริมาณแล้ว
จงึ ท�ำการทดสอบ aerotolerance และยอ้ มสีแกรม
4.12.1 การทดสอบ aerotolerance บน Ana BA แบง่ plate เปน็ 4 ช่อง ใช้ subculture เช้ือได้
4เoพrgลื่อaกั ตnษรisณวmจะsห)โาคเชเชโื้อล้ือเนจทรี ่ีตอิญ้อบยงเาชกกื้อาใร(นfaCs5tOi-d12i0oโ%uดsย)C,เฉOfaพ2cาทuะl่ีอtเaชณุ tiื้อหvทeภี่เูมหจิรร3ิญือ5ชm±้าi2c(rso°lCaoewrเoป-gb็นircoเวwsลpiาnecg4i8ea-se7rซ2o่ึงbชไiมมc่


เจริญเพียงล�ำพังบน blood agar เช่น Haemophilus spp. และควรค�ำนึงเสมอว่ามีเช้ือ
aerotolerant anaerobic bacteria แกรมบวก nonsporeforming rods หลายชนดิ สามารถ
sเจpรpิญ., ใPนrภoาpวioะniCbOac2teแrลiuะmอาจspเจpร.,ิญBไดif้นid้อoยbๆacใtนerภiาuวmะอsาpกpา. ศแปลกะตLิ เaชc่นtobAacctiilnloums yspceps.

4.12.2 การยอ้ มแกรม นำ� pure colony smear บนสไลด์และยอ้ มแกรม บันทึกลกั ษณะรปู รา่ ง,
การติดสีของเซลล์ รูปร่างและต�ำแหนง่ ของสปอร์
4.13 เลือกโคโลนีที่เจริญบน BBE มีขนาด >1 mm สังเกตปฏิกิริยา esculin hydrolysis (สีด�ำ = บวก)
น�ำเช้ือแต่ละลักษณะโคโลนีไปทดสอบเอนไซม์ catalase โดยเขี่ยเชื้อลงบน glass slide หยด 15%
hถy้าdไมro่เgกeิดnฟdอiงoอxาidกeาศ(1แ5ส%ดงHว2่าOให2)้ผลลงลบบนแเชลื้อะทsดuสbอcuบltuถr้าeมีบฟนองAอาnกaาBศเAกิดทขดึ้นสแอสบดงaวer่าoใtหo้ผleลraบnวcกe

ย้อมสีแกรม โดยกระท�ำเช่นเดียวกับเชื้อที่แยกได้บน Ana BA (primary plate) ในข้อ 4.12
4.14 อ่านผลการสร้างเอนไซม์ lipase และ lecithinase ของเช้ือทุกลักษณะโคโลนี บน EY ถ้าเชื้อ
เจริญแล้วมีผิวหน้าโคโลนีเป็นสีรุ้งมันวาว แสดงว่ามีการสร้าง enzyme lipase (ให้ผล lipase บวก)
ถ้าเช้ือเจริญแล้วให้โซนสีขาวขุ่นรอบโคโลนี แสดงว่ามีการสร้าง enzyme lecithinase (ให้ผล
lecithinase เป็นบวก) subculture เช้ือทุกลักษณะท่ีพบลงบน Ana BA อบเชื้อในสภาวะไร้อากาศ
ท่ี 35 ± 2 °C นาน 48 ชม. EY จะช่วยแยกเช้ือท่ี swarm ออกเป็นโคโลนีเด่ียว ท�ำให้แยกโคโลนี
ได้งา่ ยขึน้
4.15 เปรียบเทียบลักษณะโคโลนีบน Ana BA ท่ี subculture จาก EY (primary plate) กับเชื้อที่แยก
ได้จาก Ana BA (primary plate) เลือกโคโลนีท่แี ตกตา่ งกนั ไปทดสอบ aerotolerance และยอ้ มแกรม
ตอ่ ไป

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 191

4.16 อบ primary plates ซำ้� เพอื่ ทำ� การตรวจสอบในภายหลัง
4.16.1 Ana BA อบเชอื้ ในสภาวะไร้อากาศ 5-7 วัน โดยตรวจสอบผลทกุ 48 ชม. น�ำลกั ษณะ
โคโลนใี หม่ๆ ท่ีพบ มาแยกเชอื้ ใหบ้ ริสทุ ธ์แิ ละทดสอบ aerotolerance
4.16.2 pigmented Prevotella spp., Porphyromonas spp. และ Actinomyces spp. โดยปกตจิ ะมอง
เหน็ หลังจากบ่มในสภาวะไร้อากาศ 2-3 วัน ตรวจสอบ fluorescent และ pigmented
organisms บน Ana BA ใช้ stereoscopic microscope ตรวจสอบลักษณะโคโลนี
“molar tooth” ของ Actinomyces isaraelii
4.16.3 ทงิ้ BBE plates หลงั จากอบ 2-3 วนั เนอื่ งจากอาหารเลย้ี งเชอื้ ชนดิ นจี้ ะสญู เสยี คณุ สมบตั ิ
ความ selective เพราะการระเหยและการเส่อื มของยาปฏชิ ีวนะ
4.17 Liquid enrichment media
4.17.1 กรณีเชื้อเจรญิ บน Ana BA primary plate บม่ liquid enrichment media ท่ี 35 ± 2 °C ใน
สภาวะไร้อากาศ นาน 7 วัน แล้วน�ำมาย้อมแกรม ดวู า่ มเี ช้อื ทีย่ งั แยกไม่ได้ บน plates จงึ
น�ำมา subculture แยกเชื้อใหบ้ รสิ ุทธต์ิ อ่ ไป
4.17.2 กรณีเช้ือไมเ่ จรญิ บน Ana BA primary plate
4.17.2.1 ตรวจสอบการเจริญของ broth culture ทกุ วนั
4.17.2.2 ย้อมสีแกรม และ subculture ลงบน Ana BA และ CA เม่ือ broth ขนุ่ หรอื
เม่อื อบท่ี 35 ± 2 °C ในสภาวะไร้อากาศ ครบ 7 วนั
4.17.2.3 อบ broth culture ทีไ่ ม่พบการเจริญของเชื้อจนครบ 14 วัน ตรวจสอบผลการ
เจริญดว้ ยตาเปลา่ แลว้ จงึ ทง้ิ
คณุ สมบัติเฉพาะที่เปน็ ประโยชนใ์ นการตรวจวินจิ ฉยั เช้อื เบอื้ งตน้ (presumptive identification)
1. ลักษณะเซลล์ของเชอื้ ท่ีตรวจดูไดจ้ ากกล้องจลุ ทรรศน์ ได้แก่ รูปรา่ ง ขนาด การเรียงตัว การสรา้ งสปอร์
การตดิ สีแกรม
2. ลกั ษณะของเชอื้ ที่เจริญบนอาหารแขง็ ไดแ้ ก่ ลกั ษณะโคโลนี การยอ่ ยสลายเม็ดเลือดแดง การดดู กลืนแสง
fluorescence และการสร้างเม็ดสี (pigment)
3. คณุ สมบัติในการสรา้ งเอนไซม์ lecithinase, lipase และ catalase
4. ความยากง่ายในการเจริญเตบิ โตในอาหารเหลว
5. ความทนทานตอ่ ออกซิเจน
6. ความสามารถในการเจริญในอาหารเล้ยี งเชื้อท่ีมี 20 % bile

192 คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทเี รยี และรา

ตารางท่ี 5.9-1 การอา่ นผล anaerobic bacteria

ชนิดของแบคทเี รีย ลกั ษณะเมอ่ื ย้อมแกรม ลักษณะโคโลนี

Anaerobic แกรมลบ rods

Prevotella melaninogenica Coccobacilli กลม ผิวโค้งขึ้นเล็กน้อย ขอบเรียบ
Bacteroides fragilis group ตรงกลางสีน้�ำตาลด�ำ ขอบสีน�้ำตาล
Fusobacterium mortiferum ออ่ น สยี งิ่ เข้มขึ้นเมอื่ อบไวน้ านขึ้น
Fusobacterium necrophorum
Fusobacterium nucleatum pleomorphicrodsปลายเซลลม์ น ตดิ กลม ผวิ โคง้ ขน้ึ เลก็ นอ้ ย ขอบเรยี บ สี
สซี ดี อยเู่ ปน็ เซลลเ์ ดยี่ วหรอื คู่มกั เหน็ ขนุ่ มัวหรือขาว ดอื้ penicillin เจริญ
Peptococcus niger พบ vacuoles ภายในเซลล์ ได้ดใี นอาหารทีม่ ีน้ำ� ดี 20%
Anaerobic Cocci
สซี ดี ตดิ สไี มส่ มำ่� เสมอ pleomorphic กลม ขอบโคโลนมี ีเสน้ ใย ผวิ โค้งขนี้
rodsเซลลบ์ วมหวั ทา้ ยแหลมเรยี งตอ่ เล็กน้อย หรอื เปน็ รอยนนู ตรงกลาง
กันเปน็ เสน้ โคโลนีอ่อนนมุ่ non-hemolytic

pleomorphic rods ปลายเซลล์มน กลมขอบโคโลนหี ยกั ปลายแหลม ผวิ
หรือแบน อาจเรียงต่อกันเป็นเสน้ โคง้ ขนี้ เลก็ นอ้ ย หรอื เปน็ รอยนนู ตรง

กลางหรอื เปน็ สนั โคโลนใี สหรอื ขนุ่

ติดสีซดี ผอมยาว คล้ายกระสวยทอ กลม ขอบโคโลนไี มส่ มำ�่ เสมอ ผวิ โคง้
ผ้า ปลายแหลม อยู่เป็นเซลล์คู่ ขน้ี เลก็ นอ้ ย หรอื โคง้ ขนึ้ สงู ขนุ่ ดา้ น
ลักษณะเหมือนเข็มหรือผลึกของ บนมลี ายหรอื เหมอื นเศษขนมปงั ชน้ิ
safranin เล็กๆ non-hemolytic

แกรมบวก เซลล์กลม อยเู่ ป็นเซลล์ กลม ขอบเรยี บ ผวิ โคง้ ขน้ื เลก็ นอ้ ย สี
เด่ียว คู่ ส่ีเซลล์ หรือไมส่ มำ่� เสมอ ดำ� ผิวเป็นเงา ขนาดเล็กมาก

Peptostreptococcus spp. แกรมบวก เซลลก์ ลม อยูเ่ ป็นค่แู ละ ขอบเรียบ ผิวโค้งข้ึนเล็กน้อย สีเทา
เป็นเส้นสาย ขาวขุ่น

Veillonella parvula แกรมลบ เซลล์กลม อยู่เป็นคู่สอง กลม ขอบเรียบ สขี าวเทา
หรือเป็นสายสนั้ ๆ

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium botulinum แกรมบวก แท่งกลมตรง อยู่เป็น กลม โคโลนี อาจไม่สม่�ำเสมอ สีขาว
เซลล์เดี่ยวหรือคู่ สปอร์อยู่ใต้ส่วน เทา ผวิ ด้าน ให้ β-hemolytic
ปลายเซลล์ (sub-terminal)

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 193

ตารางที่ 5.9-1 การอา่ นผล anaerobic bacteria (ตอ่ )

ชนดิ ของแบคทีเรีย ลักษณะเมอื่ ยอ้ มแกรม ลกั ษณะโคโลนี

Clostridium difficile แกรมบวกแทง่ กลมตรงอาจเรยี งตอ่ กลม ผิวด้านหรืออาจเป็นเงา แบน
กนั เปน็ สายมี 2–6 เซลล์ สปอรร์ ปู ไข่ หรอื โคง้ เล็กนอ้ ย สคี รมี เหลอื งหรือ
อยใู่ ตส้ ว่ นปลายเซลล์ (Oval sub-ter- เทา แตกเป็นแขนงคล้ายราก มกี ลิน่
minal) คล้ายคอกมา้ (horse stable odor)

Clostridium perfringens แกรมบวก แท่งตรงปลายตัด (box กลม เปน็ เงา สเี ทาหรอื เทาเหลอื ง ให้
carappearance)มกั พบแกรมลบปน double zone beta hemolysis บางครงั้
อยู่ด้วยอยู่เป็นเซลล์เด่ียวหรือคู่ ไม่ พบโคโลนีหยาบเป็นเส้นฝอย
พบสปอร์ในอาหารเล้ียงเช้ือและส่ิง lecithinase positive
ส่งตรวจ

Clostridium sordellii แกรมบวก แท่งตรง เซลล์เดีย่ วหรือ สเี ทาขาวขนาดใหญ่ขอบหยกั ใหผ้ ล
คู่ สปอร์รูปไขอ่ ย่ใู ต้ส่วนปลายเซลล์ indole, lecithinase และ urease บวก
พบ free สปอร์จ�ำนวนมาก อยู่เป็น
สาย

Clostridium ramosum อาจติดสีแกรมบวกหรือแกรมลบ กลม หรือ โคโลนีอาจไม่สม่�ำเสมอ
แท่งกลมตรง อยูเ่ ป็นเซลลเ์ ด่ียวหรือ โค้งนูนเล็กน้อย สีขาวเทา บางทีโค
คู่ มีสปอรก์ ลมอยูส่ ่วนปลายเซลล์ โลนหี ยักปลายแหลม mannitol บวก

ไมเ่ คลือ่ นไหว

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium septicum แกรมบวก แต่ถ้าอายุมากอาจติดสี กลม หรือยกข้ึนเล็กน้อย แผ่โคโลนี
Clostridium tetani แกรมลบ แทง่ กลมตรง หรอื โคง้ อยู่ อาจไม่สม�่ำเสมอบางที โคโลนีแตก
เปน็ เซลลเ์ ดยี่ วหรอื คู่ สปอรร์ ปู ไขอ่ ยู่ แขนงคลา้ ยรากสเี ทาลกั ษณะโคโลนี
ใต้สว่ นปลายเซลล์ คล้าย Medusa heads

แกรมบวก แต่ถ้าอายุมากเกิน 24 แผ่แบนผิวด้าน โคโลนีอาจไม่
ชม.จะติดสีแกรมลบอยู่เป็นเซลล์ สม�่ำเสมอ บางทีโคโลนีแตกแขนง
เดี่ยวหรือคู่ สปอร์รูปกลมอยู่ส่วน คลา้ ยราก สเี ทา ให้ β-hemolysis zone
ปลายคลา้ ยไมต้ กี ลองหรอื ไมเ้ ทนนสิ แคบ ๆ

การรายงานผล
กรณีพบ anaerobic bacteria ให้รายงานว่า
“พบแอนแอโรบคิ แบคทเี รยี มคี ณุ สมบตั กิ ารตดิ สแี กรมบวก/ลบ รปู รา่ งลกั ษณะของเซลล์ และลกั ษณะของโคโลน”ี

กรณีไม่พบแบคทเี รียใหร้ ายงานว่า
“ไม่พบเช้ือ anaerobic bacteria”

194 คมู่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รยี และรา

เอกสารอา้ งอิง
1. Dowell VR Jr, Hawkins TM. Laboratory methods in anaerobic bacteriology. In: CDC Laboratory
Manual. US Dept of HEW, PHS, Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. DHEW Publication No
(CDC) 87-8272;1990.
2. Holdeman LV, Cato EP, and Moore WEC Editors. Anaerobe laboratory manual. 4thed. Blacksburg,
Virginia : Virginia Polytechnic Institute and State University; 1977.
3. ศิริพรรณ วงศว์ านิช. การตรวจวินิจฉยั เช้ือบกั เตรีไร้อากาศในห้องปฏิบตั ิการ. กรุงเทพมหานครฯ: Text and
Journal Publication; 2538. หนา้ 1-52.

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลท่ัวไป 195

5.10 การวินิจฉยั เชอ้ื วัณโรคและเช้อื มัยโคแบคทเี รยี อ่ืนๆ สมศักด์ิ เหรียญทอง

เช้อื วัณโรคและเช้อื มยั โคแบคทเี รยี อ่ืนๆจดั อยู่ใน genus Mycobacterium ซ่งึ มีคณุ สมบัติท่สี ำ� คัญร่วมกันคือ acid
fastness ทท่ี �ำใหแ้ ยกความแตกตา่ งไปจากแบคทเี รียอ่ืนๆคือ เปน็ เชื้อท่ตี ดิ สยี าก แตเ่ ม่อื ตดิ สแี ลว้ กล็ ้างออกยากหรือ
ลา้ งไม่ออกด้วยน้�ำยาที่เป็นกรดหรอื กรดผสมแอลกอฮอล์ จงึ เรยี กวา่ เชอื้ ทนกรด (Acid Fast Bacilli หรือ AFB) เช้ือ
วัณโรค (Mycobacterium tuberculosis) ที่เป็นสาเหตุของวัณโรคปอดในคนมีลักษณะที่ดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์
เมอ่ื ทำ� การยอ้ มเชอ้ื ดว้ ยสี carbol fuchsin โดยวธิ ี Ziehl-Neelsen จะเหน็ ตวั เชอ้ื ตดิ สแี ดง รปู รา่ งเปน็ แทง่ เรยี วตรงหรอื
โคง้ เลก็ นอ้ ย ปลายมน มกั อยเู่ ดยี่ วๆหรอื เปน็ คู่ และถา้ นำ� สว่ นหนง่ึ ของโคโลนบี นอาหารเลย้ี งเชอื้ มา smear และยอ้ ม
สจี ะเห็นเช้ือรวมเกาะกล่มุ กันเป็นมดั เหมือนฟอ่ นหญา้ เรียกลักษณะนว้ี า่ cord formation ซ่ึงเป็นลกั ษณะท่พี บใน
เช้ือวัณโรคเท่านั้น ส่วนเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆที่ไม่ใช่เช้ือวัณโรคมีชื่อเรียกว่า Non-Tuberculous Mycobacteria
(NTM) ซงึ่ ลกั ษณะทด่ี ภู ายใตก้ ลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ มอื่ ยอ้ มสี Ziehl-Neelsen จะเหน็ ตวั เชอื้ ตดิ สแี ดง แตร่ ปู รา่ งจะมหี ลาย
แบบทัง้ ทเ่ี ป็นแท่งสน้ั ๆ หรอื แทง่ ยาว หรอื ยาวเปน็ เสน้ สาย
สง่ิ สง่ ตรวจทส่ี ำ� คญั สำ� หรบั การวนิ จิ ฉยั วณั โรคปอดคอื เสมหะ แตก่ ารกระจายของเชอื้ ในเสมหะไมส่ มำ�่ เสมอ ดงั
นั้นการเลอื กเขีย่ เสมหะป้ายบนกระจกสไลดจ์ งึ ส�ำคญั มาก จ�ำเป็นตอ้ งเลอื กเข่ยี ส่วนที่น่าจะมเี ชือ้ มากท่สี ดุ มาตรวจ
คอื สว่ นทเี่ ปน็ กอ้ นเมอื กเหนยี ว สขี นุ่ เขม้ คลา้ ยหนองการวนิ จิ ฉยั วา่ ผปู้ ว่ ยเปน็ วณั โรคนนั้ ตอ้ งพบเชอ้ื จากสงิ่ สง่ ตรวจ
ของผู้ป่วย ซึ่งเช้ือมัยโคแบคทีเรียท่ีพบในเสมหะประมาณ 99% จะเป็นเชื้อวัณโรค ดังน้ันการเก็บเสมหะอย่างถูก
ต้องจึงมคี วามสำ� คญั การตรวจทางหอ้ งปฏิบตั กิ ารทำ� ไดด้ งั น้ี
1. การตรวจหาเชื้อโดยวิธีย้อมสแี ละตรวจดดู ้วยกล้องจลุ ทรรศน์ (direct microscopy)
2. การตรวจหาเชอื้ โดยการเพาะเลีย้ งเชอ้ื (culture)

การตรวจหาเชื้อโดยวิธียอ้ มสีและตรวจดดู ว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ (direct microscopy)
การตรวจหาเช้อื ทนกรด (AFB) ดว้ ยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา (light microscope) โดยวิธี direct smear ในผู้ท่ีมี
อาการสงสัยวณั โรคปอด คือการไอเร้ือรงั เกนิ 2 สัปดาห์ และ/หรือมภี าพเอกซเรย์ปอดผดิ ปกติ ซง่ึ นอกจากเพอ่ื การ
วนิ จิ ฉยั โรคแลว้ กเ็ พอื่ ตรวจหาผปู้ ว่ ยทอ่ี ยใู่ นระยะแพรเ่ ชอื้ ดว้ ย การตรวจหาเชอื้ ทนกรด (AFB) ดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์
นยี้ งั เปน็ วธิ หี ลกั ของการควบคมุ วณั โรค ซง่ึ สถานบรกิ ารสาธารณสขุ ทกุ ระดบั ทงั้ โรงพยาบาลศนู ย์ โรงพยาบาลทว่ั ไป
รวมถึงโรงพยาบาลชุมชน สามารถให้บริการตรวจเสมหะด้วยกล้องจุลทรรศน์ให้กับประชาชนผู้มีอาการสงสัย
วณั โรคได้ท่วั ประเทศ

เหตผุ ลการสง่ เสมหะตรวจ
การควบคมุ วณั โรคตามแนวทางขององคก์ ารอนามยั โลกไดก้ ำ� หนดเหตผุ ลหรอื วัตถปุ ระสงคข์ องการสง่ เสมหะ
ตรวจทางหอ้ งปฏิบัติการไว้ 2 ประการคือ
1. เพือ่ การวนิ จิ ฉยั โรคและแบง่ ประเภทของคนไข้
2. เพื่อการตดิ ตามผลการรกั ษา

196 คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

1. เพื่อการวนิ จิ ฉยั โรคและแบง่ ประเภทของคนไข้
โดยก�ำหนดให้ใช้กบั ผูป้ ่วยใหม่ทยี่ งั ไม่ข้นึ ทะเบยี นสง่ รกั ษาตรวจเสมหะ 3 ตวั อยา่ งตดิ ตอ่ กัน ซง่ึ ประกอบ
ด้วย spot sputum และ collection sputum นำ� ผลการตรวจท่ไี ด้มาพิจารณาดังนี้
1.1 ผปู้ ่วยใหม่เสมหะบวก หมายถึง ผปู้ ว่ ยที่มีผลการตรวจเสมหะพบเช้ืออย่างน้อย 2 ใน 3 ตัวอยา่ ง
หรอื พบเชอ้ื เพยี ง 1 ตวั อยา่ ง แตม่ ภี าพเอกซเรยป์ อดทแ่ี พทยว์ นิ จิ ฉยั วา่ เปน็ วณั โรคและมอี าการรนุ แรง
1.2 ผู้ปว่ ยใหมเ่ สมหะลบ หมายถงึ ผปู้ ่วยที่มผี ลการตรวจเสมหะไมพ่ บเชอื้ ทง้ั 3 ตวั อยา่ ง แตม่ ีภาพ
เอกซเรย์ปอดทแ่ี พทยว์ นิ ิจฉัยว่าเปน็ วัณโรค
2. เพือ่ การติดตามผลการรกั ษา
โดยก�ำหนดใหใ้ ช้กับผูป้ ว่ ยทขี่ น้ึ ทะเบียนรักษาแล้วส่งเสมหะตรวจซึง่ จะเป็น spot sputum หรอื collection
sputum ก็ไดต้ ามระยะเวลาดงั นี้ คอื
2.1 เม่อื สิ้นสุดระยะ intensive phase หรอื ส้ินสุดเดอื นที่ 2 หรือเดอื นท่ี 3 เพอ่ื ดู conversion rate

(อตั ราการเปล่ียนแปลงของเสมหะจากพบเชอื้ เปน็ ไมพ่ บเช้ือ)
2.2 เม่ือขนึ้ เดือนท่ี 5 หรือสิน้ สดุ เดือนที่ 5 ของการรักษา เพื่อดวู ่าการรกั ษาล้มเหลวหรือไม่ หาก

ตรวจพบเช้อื แสดงวา่ การรกั ษาลม้ เหลวตอ้ งเปลี่ยนยาใหม่
2.3 เม่ือสน้ิ สดุ การรักษา เพ่อื ดูว่าผูป้ ว่ ยหายหรือไม่ โดยเสมหะจะต้องตรวจไมพ่ บเชื้อในครง้ั น้ี
ชนิดของเสมหะและจ�ำนวนคร้งั ท่ีสง่ ตรวจ
เสมหะที่เก็บจากผปู้ ่วยมี 2 ชนดิ คือ spot และ collection sputum
spot sputum คือเสมหะท่เี กบ็ ทันที เมอื่ ผู้ปว่ ยมาพบแพทย์ท่ีสถานพยาบาล และ collection sputum คอื เสมหะที่
เกบ็ หลังต่นื นอนตอนเชา้ ก่อนลา้ งหนา้ แปรงฟนั จะเปน็ เสมหะที่ดีในการใชต้ รวจหาเชื้อ เนอื่ งจากมีการสะสมของ
เชื้อในหลอดลมตลอดทั้งคืน ผู้ป่วย 1 รายควรเก็บเสมหะส่งตรวจ 3 ตัวอย่างต่างวันกัน และอย่างน้อยต้องมี
collection sputum 1 ตวั อยา่ งดงั นี้คือ
ตวั อย่างท่ี 1 เป็นตัวอยา่ งทใ่ี ห้ผ้ปู ว่ ยเก็บเสมหะทนั ที (spot sputum) เมื่อมาพบแพทย์ครัง้ แรก
ตัวอย่างท่ี 2 เป็นตัวอยา่ งทผ่ี ้ปู ่วยเกบ็ เสมหะตอนเช้าหลังตื่นนอนตอนเชา้ (collection sputum)
ตวั อยา่ งที่ 3 เป็นตัวอย่างทใ่ี ห้ผู้ปว่ ยเกบ็ เสมหะทันที (spot sputum) เม่ือน�ำเสมหะตวั อยา่ งที่ 2 มาสง่ หน่วยตรวจ
การป้ายเสมหะบนกระจกสไลด์
ใชไ้ มเ้ ขย่ี เสมหะสว่ นท่ีเปน็ กอ้ นเมอื กเหนยี วสีขุ่นเข้มใหต้ ดิ ปลายไมข้ น้ึ มา ปา้ ยลงตรงกลางแผน่ กระจกสไลด์ที่
ใหมแ่ ละสะอาด ละเลงเกลยี่ เสมหะใหเ้ ปน็ แผน่ บางๆสมำ่� เสมอ ไมบ่ างหรอื หนาเกนิ ไปใหไ้ ดข้ นาดประมาณ 2x3 cm
แลว้ ทิ้งไวใ้ หแ้ ห้ง จากน้นั น�ำไปผา่ นเปลวไฟ 3-4 ครั้ง โดยให้ดา้ นทลี่ ะเลงเสมหะอยู่ด้านบน เพื่อตรึงใหเ้ สมหะตดิ
แนน่ กับกระจกสไลด์ เพื่อเวลายอ้ มสจี ะไดไ้ ม่หลดุ ออก นำ� สไลด์ท่ีตรึงแล้วนี้ไปยอ้ มสีตามวธิ ีต่อไปนี้
- วางเรียงกระจกสไลดบ์ นคานยอ้ ม เวน้ ระยะห่างกัน 0.5 - 1 cm
- ราดสี 1% carbol fuchsin ใหท้ ว่ มแผน่ กระจกสไลด์
- ลนไฟใต้สไลดใ์ หส้ รี อ้ น จนกระทั่งสังเกตเหน็ มีไอเกดิ ขนึ้ บนแผน่ สไลด์ (ระวังอย่าใหเ้ ดือด) แลว้
ปลอ่ ยท้ิงไวใ้ หเ้ ยน็ ประมาณ 5 นาที

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 197

- ล้างด้วยน�้ำสะอาด เทน�้ำทค่ี ้างบนสไลด์ออกใหห้ มด
- ฟอกสดี ้วยนำ้� ยา 3% acid alcohol จนกระทงั่ สแี ดงของ carbol fuchsin หลุดออกหมด โดยการราดนำ้� ยา
3% acid alcohol ให้ทว่ มสไลด์ท้ิงไว้ 2 นาที ลา้ งด้วยนำ�้ หากสแี ดงยงั ออกไมห่ มดใหท้ ำ� ซำ�้ อกี คร้ังหนึ่ง
- ล้างดว้ ยนำ้� สะอาด เทน้ำ� ทค่ี ้างบนสไลด์ออกใหห้ มด
- ย้อมทับโดยการราดดว้ ยสี 0.3% methylene blue ใหท้ ว่ มสไลด์ แชท่ ้ิงไว้ 10 วนิ าที
- ล้างน�ำ้ ใหส้ ะอาดทั้งด้านหน้าและดา้ นหลงั กระจกสไลด์
- น�ำมาตั้งผ่ึงลมใหแ้ ห้ง และตรวจดูดว้ ยกล้องจุลทรรศนใ์ ชห้ ัว oil immersion objective lens (x 100)

จะเหน็ ตัวเชอื้ ติดสแี ดงบนพื้นสนี ้�ำเงิน
การตรวจสไลดท์ ี่ยอ้ มสีแลว้ ด้วยกลอ้ งจุลทรรศน์
การตรวจสไลดท์ ีย่ อ้ มสีแลว้ ดว้ ยกล้องจุลทรรศน์ มขี ้นั ตอนดงั ต่อไปนี้
- ใช้ก�ำลงั ขยาย x10 ตรวจดูบรเิ วณที่มีเซลล์เมด็ เลือดขาว ไม่ใช่บรเิ วณทม่ี ี epitherial cell
- หยด oil immersion ลงบนแผ่นสไลด์ ระวังอย่าให้ส่วนหนึ่งส่วนใดของอุปกรณ์แตะหรือสัมผัส โดน
แผน่ สไลด์
- หมุนหัวเลนซ์กก�ำลงั ขยาย x100 เข้าแทนท่ี
- ปรบั ความคมชดั ของภาพ โดยการเลื่อนแผ่นสไลด์ออกห่างจากเลนซ์วตั ถเุ สมอ
- อ่านโดยเริ่มจากตรงกลางริมสุดของวงเสมียร์จากซ้ายไปขวา หรือขวาไปซ้าย ภาพเช้ือท่ีเห็นผ่านเลนซ์
กำ� ลงั ขยาย x100 จะติดสีแดง ลักษณะเปน็ แท่งยาวเดี่ยวๆ หรอื อยเู่ ป็นคู่ หรอื เป็นกลมุ่
หลักเกณฑ์การอา่ นและรายงานผลสไลด์ทยี่ อ้ มสีด้วยวิธี Ziehl-Neelsen
- สไลด์ที่ตรวจพบเชื้อจ�ำนวนมาก (>10 AFB/วงกล้อง) การรายงานผล “AFB 3+” จะต้องอ่านสไลด์ให้ได้
อยา่ งน้อย 20 วงกลอ้ ง จงึ จะรายงานผลได้
- สไลด์ท่ตี รวจพบเชอื้ จำ� นวนปานกลาง (1-10 AFB/วงกลอ้ ง) การรายงานผล “AFB 2+” จะต้องอา่ นสไลดใ์ ห้
ไดอ้ ยา่ งน้อย 50 วงกล้อง จงึ จะรายงานผลได้
- สไลด์ทีต่ รวจพบเชอ้ื จำ� นวนนอ้ ย (10-99 AFB/100 วงกล้อง) การรายงานผล “AFB 1+” จะต้องอา่ นสไลดใ์ ห้
ได้อยา่ งน้อย 100 วงกล้อง จึงจะรายงานผลได้
- สไลด์ท่ตี รวจพบเชื้อจำ� นวนนอ้ ยมาก (1-9 AFB/100 วงกลอ้ ง) การรายงานผล “นบั จำ� นวนเชอื้ AFB ท่พี บ”
จะต้องอา่ นสไลด์ใหไ้ ด้อยา่ งน้อย 100 วงกลอ้ ง จงึ จะรายงานผลได้
- สไลด์ท่ีตรวจไม่พบเช้ือ การรายงานผล “Negative” จะต้องอ่านสไลด์ให้ได้อย่างน้อย 100 วงกล้อง จึงจะ
รายงานผลได้ ซง่ึ หมายถงึ negative เฉพาะทอ่ี า่ นดใู น 100 วงกลอ้ งนเี้ ทา่ นน้ั ไมไ่ ดห้ มายรวมถงึ ตวั อยา่ งเสมหะ
ทนี่ ำ� มาตรวจท้ังหมด
การพบเช้ือต้ังแต่ 1 ตัวขน้ึ ไป กส็ ามารถรายงานว่า “Positive” ไดโ้ ดยยึดหลกั การอ่านผลข้างต้น และรายงานผล
ตามตารางขา้ งลา่ งนี้

198 ค่มู ือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

ตารางที่ 5.10-1 แสดงวิธรี ายงานผลการตรวจสไลดด์ ว้ ยกล้องจลุ ทรรศน์แบบ Grading วิธี Ziehl – Neelsen

จ�ำนวนเชอ้ื AFB การรายงานผล

0 AFB / 100 วงกลอ้ ง Negative
1 - 9 AFB / 100 วงกลอ้ ง นับจ�ำนวน AFB ทพ่ี บ
10 – 99 AFB / 100 วงกล้อง
1 - 10 AFB / วงกลอ้ ง 1+
2+
>10 AFB / วงกลอ้ ง 3+

วิธีการยอ้ มสเี รืองแสงดว้ ย Auramine O ตามวธิ ี Fluorescent Acid-Fast Staining
- วางเรยี งสไลดบ์ นคานย้อมสี เวน้ ระยะห่างระหว่างแผ่นสไลด์ 0.5–1 cm
- ราดสี auramine O solution จนท่วมทงั้ แผ่นสไลด์ ท้ิงไว้ 10 นาที
- ลา้ งดว้ ยนำ้� สะอาด เทน�้ำทคี่ ้างบนแผ่นสไลดอ์ อกให้หมด
- ฟอกสดี ้วย 1 % acid alcohol นาน 2 นาที จนกระทั่งสี auramine O หลุดออกหมด
- ล้างออกด้วยน้ำ� สะอาด เทนำ้� ทีค่ ้างบนแผน่ สไลดอ์ อกใหห้ มด
- ย้อมทับดว้ ยน้ำ� ยา 0.5 % potassium permanganate นาน 2 นาที
- ลา้ งดว้ ยนำ้� สะอาด ผงึ่ ให้แห้ง
- นำ� ไปตรวจดว้ ยกล้องจุลทรรศน์ชนิดเรืองแสง (fluorescence microscope) โดยใช้ low power objective lens
(x20) จะเหน็ ตัวเชอ้ื ติดสีเรืองแสงสเี หลอื งทองบนพื้นสีดำ�

ตารางที่ 5.10-2 แสดงวธิ ีรายงานผลการตรวจสไลดด์ ว้ ยกล้องจลุ ทรรศนแ์ บบ Grading วิธี Fluorescent
acid- fast staining ด้วย objective lens x20

จ�ำนวนเชือ้ AFB การรายงานผล

0 AFB / 30 วงกลอ้ ง Negative

1 - 29 AFB / 30 วงกลอ้ ง นับจ�ำนวน AFB ท่ีพบ

>29 AFB / 30 วงกล้อง 1+

1 - 10 AFB / วงกลอ้ ง 2+

>10 AFB / วงกล้อง 3+


การรายงานผลการตรวจด้วยกลอ้ งจุลทรรศน์จะรายงานได้เพยี งว่าพบเชอื้ AFB เทา่ นน้ั และหอ้ งชันสตู ร ควร
จดั ทำ� สมดุ ทะเบยี นการตรวจเสมหะหาเชือ้ วณั โรค โดยเฉพาะแยกจากการตรวจสง่ิ ส่งตรวจอ่นื ๆ เพื่อเปน็ หลกั ฐาน
การตรวจ สะดวกในการตรวจสอบ และทำ� รายงาน การจะรายงานวา่ เปน็ เชอื้ วณั โรค หรอื เชอื้ มยั โคแบคทเี รยี อน่ื ๆ

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทั่วไป 199

ตอ้ งนำ� ไปเพาะเลย้ี งเชอื้ และทำ� การทดสอบเพอ่ื พสิ จู นย์ นื ยนั ชนดิ ตอ่ ไป ในหอ้ ง ปฏบิ ตั กิ ารทไ่ี มส่ ามารถทำ� เพาะเลยี้ ง
เชอ้ื ได้ การตรวจพบเชอ้ื ทนกรด (AFB) ดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ พยี งอยา่ งเดยี ว กส็ ามารถชว่ ยในการวนิ จิ ฉยั โรคได้ แต่
จะตอ้ งมีจำ� นวนเชือ้ มากพอถงึ 10,000 ตัว/เสมหะ 1 ml จึงจะพบไดโ้ ดยวธิ นี ี้ ความแม่นยำ� ของการตรวจขนึ้ อยู่กับ
ความชำ� นาญของผตู้ รวจ การพบเชอื้ ใน smear แสดงวา่ ผปู้ ว่ ยเปน็ วณั โรคและอยใู่ นระยะแพรเ่ ชอ้ื ทตี่ อ้ งใหก้ ารรกั ษา
ทนั ที เพอื่ ตดั วงจรการแพรก่ ระจายเชอื้ จำ� นวนเชอื้ AFB ทพี่ บแสดงถงึ ความรนุ แรงของการตดิ เชอื้ ในผปู้ ว่ ย จงึ เปน็
ความส�ำคัญอยา่ งยิง่ ท่ีจะต้องอ่านและรายงานสงิ่ ท่ีตรวจพบใหถ้ ูกตอ้ งมากท่สี ดุ
การวินิจฉยั โดยวิธีการเพาะเล้ยี งเชอ้ื
วตั ถุประสงค์ของการทำ� เพาะเลี้ยงเชอ้ื
1. เพื่อการค้นหาผปู้ ว่ ยจากส่งิ สง่ ตรวจทไ่ี มส่ ามารถตรวจหาด้วยวธิ กี ลอ้ งจลุ ทรรศน์ได้
2. เพื่อยืนยนั ความมชี วี ติ ของเชอื้ วณั โรค
3. เพ่ือเพ่ิมปริมาณและพสิ ูจนช์ นดิ โดยการทดสอบคุณสมบตั ทิ างกายภาพ และทางชวี เคมี
4. เพือ่ ทดสอบความไวของเช้ือวณั โรคต่อยาเพ่อื ใช้เป็นแนวทางในการรกั ษาอยา่ งมปี ระสิทธิภาพ
5. เพอ่ื เฝา้ ระวงั การดอื้ ยาวณั โรคในชมุ ชน หรอื ในพน้ื ทพ่ี เิ ศษเฉพาะ เชน่ ในเรอื นจำ� และบรเิ วณชายแดน เปน็ ตน้
การสง่ สงิ่ ส่งตรวจเพาะเชอ้ื ใหส้ ง่ ในรายตอ่ ไปน้ี
1. ในรายทเี่ ป็นผปู้ ่วยใหม่
1.1 เมอ่ื ตรวจเสมหะด้วยกล้องจุลทรรศน์ไม่พบเช้ืออย่างนอ้ ย 3 คร้งั ข้นึ ไป
1.2 เมื่อสงสยั เช้ือดือ้ ยา
1.3 เม่อื มปี ระวัติสัมผสั หรอื ใกล้ชิดกบั ผปู้ ว่ ยดอ้ื ยาหลายขนาน หรือติดเชอ้ื HIV
1.4 เม่อื มีการเฝ้าระวังการดื้อยารกั ษาวณั โรค
2. ในรายท่ีก�ำลังตดิ ตามการรกั ษา
2.1 เมอ่ื ส้นิ สุดระยะเข้มขน้ (เดอื นที่ 2) ตรวจเสมหะดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศนพ์ บเช้ือ AFB

2.2 เมอ่ื สนิ้ เดอื นที่ 5 หรอื ในเดอื นสดุ ทา้ ยของการรกั ษา เสมหะยงั ตรวจพบเชอื้ AFB ดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์
2.3 เมอ่ื จะประเมินว่าผปู้ ว่ ยหายจากการเปน็ วณั โรค
อาหารเล้ียงเชือ้ ทนี่ ยิ มใช้ประกอบด้วย
1. อาหารแข็งท่มี สี ่วนประกอบของไข่
1.1 Lowenstein Jensen media
1.2 2% Ogawa media
2. อาหารแขง็ ท่มี สี ว่ นประกอบของวุน้ เชน่ Middlebrook 7H11
3. อาหารเหลว
3.1 Middlebrook 7H9
3.2 BBL MGIT

200 ค่มู อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา

การเพาะเชื้อวัณโรคจ�ำเป็นอย่างยิ่งท่ีจะต้องปฏิบัติในตู้ปลอดเช้ือ BSC class II ท่ีมีระบบการดูแลบ�ำรุงรักษา
อยา่ งดี และตอ้ งกำ� จดั เชอ้ื แบคทเี รยี อน่ื ๆทป่ี นเปอ้ื นมากบั สงิ่ สง่ ตรวจกอ่ นทจ่ี ะนำ� ไปเพาะเลยี้ งเชอ้ื เรยี กวา่ ขบวนการ
decontamination procedure โดยมากมักจะใช้กบั เสมหะ หนอง และอ่ืนๆ แตถ่ า้ เปน็ ตัวอย่างที่เก็บมาดว้ ยวธิ ี aseptic
technique เช่น CSF ก็สามารถเพาะลงบนอาหารเลี้ยงเช้ือ Lowenstein Jensen ได้โดยตรง การเพาะเล้ียงเชื้อยังมี
ประโยชน์ในการจ�ำแนกชนิดของเชอ้ื วณั โรคออกจากเช้อื มยั โคแบคทเี รียอนื่ ๆได้ และสามารถนำ� เชอ้ื ทเี่ พาะเล้ียงได้
ไปท�ำทดสอบความไวต่อยาได้ อาหารเลี้ยงเชอื้ ที่นิยมใชก้ ันมากคือ Lowenstein-Jensen และ 2% Ogawa medium
ซึ่งอาหารทั้งสองชนิดนี้จะมีไข่เป็นส่วนประกอบท่ีส�ำคัญ แต่ในปัจจุบันมีการเพาะเล้ียงเชื้อในอาหารเหลว BBL
MGIT ท่ีใช้กับเคร่ืองเพาะเล้ียงเช้ืออัตโนมัติ Bactec MGIT 960 ที่ตรวจหาการเจริญของเชื้อโดยใช้หลักการของ
Oxygen consuming ทสี่ ามารถตอบผลที่รวดเร็วกวา่ การเพาะเลย้ี งเช้อื บนอาหารแข็ง แตม่ ีราคาแพงกวา่
น้�ำยาท่ใี ช้ในการกำ� จดั เชือ้ ปนเป้ือน (digestion - decontamination solution)
1. 4% NaOH
2. NALC-2% NaOH (N-Acetyl-L-cysteine-2% sodium hydroxide)
วธิ ีเพาะเลีย้ งเช้อื วณั โรคแบบงา่ ย (TB simple culture method)
วธิ นี ใ้ี ชไ้ ดผ้ ลดเี ฉพาะกบั สงิ่ สง่ ตรวจทตี่ รวจพบเชอื้ ดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ ทา่ นน้ั และไมต่ อ้ งใชเ้ ครอื่ งปน่ั ตกตะกอน
สามารถปฏบิ ตั ไิ ด้ดังนี้
1. ถ่ายเสมหะจากถ้วยเกบ็ เสมหะใส่ในขวดแกว้ McCartney
2. เตมิ น�้ำยา 4% NaOH ลงในขวดบรรจุเสมหะ ในอัตราส่วน 1:1 ของปริมาณเสมหะ ถา้ ตวั อยา่ งเสมหะมี
ความหนดื เหนียว และความสกปรกมาก ก็ให้เพ่ิมสดั สว่ นของน�ำ้ ยา 4% NaOH เป็น 1:2 ได้
3. ปิดฝาขวดให้แน่น ผสมใหเ้ ขา้ กันดีด้วยเครอ่ื ง vortex mixer และตั้งท้ิงไว้ 15 นาที
4. เมือ่ ครบก�ำหนดใช้ pasteur pipette ทผ่ี า่ นการฆา่ เช้อื แล้วดดู สารแขวนลอยที่เตรียมไดห้ ยดลงบนอาหาร
เลย้ี งเชือ้ 2% Ogawa 2 ขวดๆละ 100 µlหรอื ประมาณ 4 หยด
5. นำ� เขา้ ตู้อบเชอื้ อุณหภมู ิ 35-37 °C นาน 8 สปั ดาห์ และนำ� ออกมาอา่ นผลทกุ สัปดาหจ์ นมกี ารเจรญิ ของ
เชื้อเกดิ ข้นึ มีลักษณะแหง้ ขรขุ ระ ขนาด 2-3 mm คล้ายดอกกระหล�่ำ เรยี กลักษณะแบบนี้ว่า eugonic type
แตถ่ ้าโคโลนีมีลักษณะกลม แบน เรยี บ และขนาด 1-2 mm จะเรยี กว่า dysgonic type ซึ่งจะเปน็ ลกั ษณะ
ของเช้ือมยั โคแบคทีเรียอ่ืนๆทไ่ี มใ่ ชเ่ ชอ้ื วณั โรค

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่ัวไป 201

วิธีเพาะเล้ยี งเชื้อวัณโรคแบบมาตรฐานบนอาหารแข็ง (TB conventional culture method)
วธิ นี ใ้ี ชไ้ ดก้ บั เสมหะทงั้ ชนดิ พบเชอ้ื และไม่พบเชอ้ื รวมทงั้ ตัวอยา่ งอน่ื ๆ เชน่ pus, plural effusion, tissue biopsy,
gastric lavage เปน็ ตน้ สำ� หรบั สง่ิ ส่งตรวจท่เี ปน็ เสมหะสามารถปฏิบัติได้ดังนี้
1. ถา่ ยเสมหะจากภาชนะบรรจุใสใ่ นหลอดป่ัน (sterile centrifuge tube) ขนาด 50 ml ปริมาณของเสมหะ
ตอ้ งไมเ่ กิน 10 ml
2. เตมิ นำ�้ ยา NALC- 2% NaOH ลงในขวดบรรจเุ สมหะ ในอัตราส่วน 1:1 ของปรมิ าณ เสมหะ ปดิ ฝาหลอด
ให้แน่น น�ำไปเขยา่ ผสมใหเ้ ข้ากันด้วยเครอ่ื ง vortex mixer นานไมเ่ กิน 30 วินาที
3. ต้งั ทิ้งไว้ 15 นาที
4. เปดิ ฝาหลอด เติมน�้ำยา phosphate buffer saline pH 6.8 ให้ถงึ ระดบั 50 ml
5. น�ำเข้าเคร่ืองปั่นตกตะกอนความเร็วสูงปรับอุณหภูมิ (high speed refrigerate centrifuge) ปั่นท่ี
ความเรว็ 3,000 x g นาน 20 นาที เทสว่ นใสทงิ้ ลงในภาชนะเฉพาะดว้ ยความระมดั ระวงั
6. เติม 1 หยดของน้ำ� ยา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกบั ตะกอนทไี่ ด้
7. ใช้ pasture pipette ทผี่ า่ นการฆ่าเชอ้ื แล้วดูดสารแขวนลอยทเ่ี ตรยี มไดห้ ยดลงบนอาหารเลย้ี งเชือ้

Lowenstein-Jensen (LJ) 2 ขวดๆละ 100 µl หรอื ประมาณ 4 หยด
8. น�ำเขา้ ตูอ้ บเชอ้ื อณุ หภมู ิ 35-37 °C นาน 8 สปั ดาห์ และน�ำออกมาอ่านผลทกุ สปั ดาห์จนพบการเจริญ
ของเชอ้ื
9. บันทกึ ระยะเวลาทตี่ รวจพบการเจริญ จ�ำนวน และลักษณะของโคโลนี
การเพาะเล้ยี งในอาหารเหลว BBL MGIT
1. ถ่ายเสมหะจากถว้ ยเกบ็ เสมหะใสใ่ นหลอดปั่น (sterile centrifuge tube) ขนาด 50 ml ปรมิ าณของเสมหะ
ต้องไมเ่ กิน 10 ml
2. เติมน�ำ้ ยา NALC- 2% NaOH ลงในขวดบรรจเุ สมหะ ในอตั ราสว่ น 1:1 ของปรมิ าณเสมหะ ปดิ ฝาหลอด
ให้แนน่ น�ำไปเขย่าผสมใหเ้ ขา้ กันดว้ ยเครอื่ ง vortex mixer นานไมเ่ กิน 30 วนิ าที
3. ตงั้ ทง้ิ ไว้ 15 นาที
4. เปิดฝาหลอด เตมิ น�้ำยา phosphate buffer saline pH 6.8 ให้ถึงระดบั 50 ml
5. น�ำเข้าเครื่องปั่นตกตะกอนความเร็วสูงปรับอุณหภูมิ (high speed refrigerate centrifuge) ปั่นท่ีความเร็ว
3,000 x g นาน 20 นาที ในภาชนะป่ันชนดิ aerosol free protection
6. ระหวา่ งทรี่ อเวลาใหเ้ ตรยี มเขยี นหมายเลขขา้ งหลอด BBL MGIT tube และเตรยี มสารละลาย supplement
PANTA โดยดูดสารละลาย supplement ปรมิ าตร 15 ml ละลายผง PANTA lyophilized เขยา่ ให้เข้ากัน
7. เม่อื ครบเวลา 20 นาที นำ� หลอดป่นั มาเทส่วนใสทิ้งลงในภาชนะเฉพาะด้วยความระมัดระวงั
8. เตมิ 1 ml ของน้�ำยา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกับตะกอนทไี่ ด้
9. เติม dissolved supplement PANTA ลงใน BBL MGIT ปรมิ าตร 0.8 ml แลว้ เตมิ 0.5 ml ของตะกอนท่ีได้
ปดิ ฝาหลอดใหแ้ น่น คว่�ำหลอดไปมา 2–3 ครั้ง เชด็ หลอดดว้ ยน้ำ� ยาฆา่ เชือ้

10. น�ำเข้าเครอื่ ง Bactec MGIT 960 โดยดึงล้ินชักต้อู อก แลว้ ปฏบิ ัติตามวธิ ที รี่ ะบใุ นค่มู ือ โดยกดปุ่ม icon
บนหน้าจอที่เปน็ รูปสญั ญาลกั ษณห์ ลอดทม่ี ลี กู ศรชลี้ ง นำ� หลอดทดสอบไปผ่านเคร่อื งสแกน barcode

202 ค่มู อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

สงั เกตชอ่ งในล้ินชกั ทใ่ี ส่หลอดทดสอบ คว�่ำหลอด 2–3 ครงั้ แลว้ ใสห่ ลอดทดสอบในชอ่ งทมี่ ไี ฟกระพริบ
สีเขยี ว ทำ� แบบนจ้ี นครบจำ� นวนตัวอย่างทเ่ี ตรียมไว้
11. ปดิ ลิ้นชกั ให้สนิท เคร่อื ง Bactec MGIT 960 จะตรวจเชค็ การเจริญของเชือ้ มยั โคแบคทเี รีย บนั ทกึ
และจัดพิมพร์ ายงาน

การพสิ ูจนช์ นดิ ของเชอื้ มัยโคแบคทเี รยี

ตารางที่ 5.10-3 ลกั ษณะต่างๆท่ใี ชส้ ำ� หรบั แยกเชื้อวัณโรคออกจากเช้ือมยั โคแบคทีเรียอืน่ ๆ (NTM)

ลกั ษณะ M. tuberculosis NTM

1. อัตราการเจรญิ เตบิ โต > 7 วนั นอ้ ยกว่า หรือมากกวา่ 7 วัน
2. อุณหภมู ิ 35-37 °C 25- 45 °C
3. ลักษณะโคโลนีบนอาหารแขง็ แหง้ ขรุขระคล้ายดอกกระหล�ำ่
4. สีของโคโลนี แบบ Eugonic มที ง้ั แหง้ ขรุขระ และเรยี บ
5. Niacin test คลา้ ยสีฟางหญ้าแหง้ แบบ Dysgonic
6. Nitrate reduction test
7. Catalase 68 °C test + ครีม เหลือง ส้ม หรือ ชมพู
8. Cord formation + -
9. การเจริญบนอาหาร L-J ท่ผี สม - +/ -
+ +
PNB ความเขม้ ข้น 500 µg/ml - -
10. Immunochromatography Assay + +
-
(SD-Bioline)

เมือ่ แยกเช้ือวัณโรคออกจากเชื้อ NTM ไดแ้ ล้ว ขัน้ ตอนต่อไปตอ้ งพสิ ูจน์ชนิดของเชอื้ NTM โดยท�ำการทดสอบ
คณุ ลกั ษณะตา่ งๆ เชน่ growth rate, growth at different temperature (25 °C , 37 °C, 42 °C, 45 °C), pigment in the
dark, photoreactivity, nitrate reduction test, catalase 68 °C, 20 min test, semi-quantitative catalase test,
arylsulfatase 3 and 14 days test, Tween 80 hydrolysis 3 and 14 days test, tellurite reduction 3 and 14 days test,
iron uptake, growth on L-J contain 5% NaCl เป็นต้น ซ่ึงการทดสอบลักษณะต่างๆเหลา่ นี้สามารถท�ำได้ในหอ้ ง
ปฏบิ ตั กิ ารอา้ งอิงของกลุ่มปฏบิ ัตกิ ารอา้ งองิ ชันสูตรวณั โรคแห่งชาติ หอ้ งปฏิบตั ิการของสมาคมปราบวณั โรคแห่ง
ประเทศไทยในพระบรมราชูปถัมภ์ ห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยต่างๆ และห้องปฏิบัติการของ
สถาบันโรคทรวงอก เป็นตน้

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทั่วไป 203

การเพาะเลี้ยงเชื้อวัณโรคจากสงิ่ สง่ ตรวจท่ีไม่ใชเ่ สมหะ
gastric lavage และชิ้นเน้ือ gastric lavage ต้องด�ำเนินการตรวจภายใน 4 ชม. นับต้ังแต่เก็บตัวอย่าง ชิ้นเนื้อ
(biopsy tissue) กรณเี ป็นชน้ิ เนื้อขนาดใหญ่ ให้ใช้กรรไกร (sterile scissor) ตัดออกเปน็ ช้นิ เล็กๆใชท้ ่บี ดเชือ้ (sterile
tissue grinder) บดเนอ้ื เยอ่ื ทส่ี ง่ ตรวจในนำ้� เกลอื ปราศจาก เชอ้ื 2 - 5 ml แลว้ ดำ� เนนิ การตรวจสงิ่ สง่ ตรวจทงั้ สองชนดิ
ดงั น้ี
1. เกบ็ ส่วนใสในหลอดปนั่ (centrifuge tube) ขนาด 50 ml ในปรมิ าตรไมเ่ กิน 10 ml

2. ป่ันตกตะกอนที่ความเรว็ 3000 x g นาน 15 นาที ในภาชนะปน่ั ชนิด aerosol free protection
3. หลังจากนนั้ เทสว่ นใสท้ิงและละลายตะกอนด้วยนำ้� กล่นั ฆ่าเชอ้ื ปรมิ าตร 2-5 ml
4. เตมิ สารละลาย NALC - 2% NaOH ในอัตราส่วน 1:1 ผสมใหเ้ ขา้ กัน และเอียงหลอดไปมาเพอ่ื ให้
สารละลาย NALC - 2% NaOH สมั ผัสภายในหลอดและฝาหลอดใหม้ ากทส่ี ุด
5. ต้ังทิง้ ไว้ 15 นาที
6. เติมสารละลาย phosphate buffer salime pH 6.8 ให้ถงึ ระดับ 50 ml
7. ปิดฝาหลอดใหแ้ น่น น�ำไปปนั่ ตกตะกอนทค่ี วามเรว็ 3000 x g นาน 15 นาที ในภาชนะปน่ั ชนิด aerosol
free protection อีกครง้ั หนงึ่
8. เทส่วนใสทิง้ และละลายตะกอนดว้ ยน�้ำกลน่ั ฆา่ เชอ้ื ปรมิ าตร 1-2 ml ผสมใหเ้ ขา้ กันดีดว้ ย pasture

pipette 1 ml แล้วเจอื จาง 1:10 เพอ่ื ลดความเปน็ พษิ ของสารละลาย NALC-2% NaOH
9. Inoculate 0.1 ml ของสารละลายทเี่ จอื จางและไมเ่ จอื จางลงบนอาหารเลย้ี งเชอื้ Lowenstein -Jensen media

และ Middlebrook 7H11
10. น�ำไปเกบ็ ในต้อู บเชอื้ ท่ีอณุ หภูมิ 35-37 °C
11. อา่ นผลทุกสปั ดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์ถ้าพบการเจรญิ ของเชือ้ ใหท้ �ำการ/ส่งตอ่ เพือ่ วินจิ ฉัยเช้ือและ
ทดสอบความไวตอ่ ไป
เลอื ด (blood)
1. นำ� เลือด 20 ml ใส่ลงในอาหารเหลวชนิด Middlebrook 7H9 20 ml
2. นำ� ไปเก็บในตู้อบเพาะเช้ือทอ่ี ณุ หภมู ิ 35-37 °C เขย่าด้วยมือทกุ วันๆละครง้ั
3. ทำ� smear ย้อมสที ุกสปั ดาห์
4. ถา้ พบเชื้อ AFB นำ� อาหารเหลวนัน้ มา inoculate ลงบนอาหารแขง็ L-J 2 ขวด

5. น�ำไป อบที่อณุ หภูมิ 35-37 °C
6. อ่านผลทุกสัปดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์

204 คู่มือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

การเตรียมสยี ้อมและอาหารเลี้ยงเชอื้
1. วิธเี ตรียมน�ำ้ ยาสีย้อมแบบ Ziehl-Neelsen
ก. นำ้� ยา 1% Carbol fuchsin
- Basic fuchsin powder 1.0 g
- Ethanol 95% 10.0 ml
(ละลายส่วนผสมทง้ั สองเข้าดว้ ยกัน).....................(A)
- Phenol crystals 5.0 g
- Distilled water 95.0 ml
(ละลายผลึก phenol ก่อนเติมน้ำ� กลั่น)...................(B)
ผสม 90 ml ของสารละลาย (B) ในสารละลาย (A)
นำ�้ ยาสยี อ้ ม carbol fuchsin ทไี่ ดน้ ี้ตอ้ งกรองหลงั จากเตรียมเสร็จ และเกบ็ ในท่มี ดื ซ่งึ สียอ้ มท่เี ตรียมแต่ละ
ครงั้ ควรใช้ใหห้ มดภายใน 6 เดือน
ข. น�้ำยาฟอกสี 3% Acid alcohol
- Hydrochloric acid (conc.) 97.0 ml
- Ethanol 95% 3.0 ml
(ผสมสารทงั้ สองส่วนเขา้ ดว้ ยกัน)
ค. สียอ้ มทบั 0.3% Methylene blue
- Methylene blue 0.3 g
- Distilled water 100.0 ml
(ผสมสารทั้งสองจนละลายเขา้ กันด)ี

ตารางที่ 5.10-4 วธิ ีเตรยี มอาหารไข่ทง้ั ชนดิ Lowenstein-Jensen (LJ) และ 2% Ogawa medium

ส่วนประกอบ Lowenstein-Jensen (LJ) 2% Ogawa medium

1. Monopotassium dihydrogen phosphate 0.4 g 2g
2. Magnesium sulfate 0.04 g -
3. Magnesium citrate 0.1 g 0.1 g
4. Asparagine 0.6 g -
5. Sodium glutamate 0.5 g
6. Glycerol - 4 ml
7. Distilled water 2 ml 100 ml
8. 2% Malachite green solution 100 ml 4 ml
9. Homogenized whole eggs 3.3 ml 200 ml
167 ml

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 205

วธิ ีเตรียมอาหาร Lowenstein-Jensen (LJ) หรือ 2% Ogawa medium
ละลายสว่ นประกอบอนั ดบั ท่ี 1 - 7 (แลว้ แตช่ นดิ ของอาหารทจ่ี ะเตรยี ม) นำ� เขา้ autoclave ปลอ่ ยทงิ้ ไวใ้ หเ้ ยน็ แลว้
น�ำมาเติม 2% malachite green solution ตามส่วน น�ำสารละลายนม้ี าผสมกบั homogenized whole eggs เขยา่ ให้
เข้ากัน ตง้ั ท้ิงไว้ 30 นาที แบง่ ใสข่ วด McCartney ขวดละ 7 ml นำ� เขา้ ตู้นึง่ อาหารระบบไอนำ้� ร้อน (inspissator) ที่
อุณหภูมิ 85-90 °C ในสภาพเอียง (slant) เป็นเวลา 45 นาที เพอ่ื ทำ� ให้ไข่สุก อาหารจะแข็งตามต้องการ จากนัน้ น�ำ
เข้าตอู้ บ 35-37 °C นาน 48 ชม. เพอ่ื เช็ค sterility แล้วน�ำไปเก็บในถงุ พลาสตกิ มดั ปากถุงให้แนน่ เกบ็ ไว้ในตู้เย็น
จนกวา่ จะใชง้ าน
วิธีเตรยี ม Homogenized whole eggs
น�ำไข่ไกส่ ดประมาณ 10 ฟอง มาลา้ งน้ำ� และขัดผิวไขใ่ ห้สะอาดดว้ ย 70% alcohol ปลอ่ ยใหแ้ ห้ง แลว้ เชด็ ด้วย
นำ้� ยา 70% alcohol นำ� มาวางเรียงบนภาชนะที่สะอาด ตอกไขใ่ สภ่ าชนะเช่น plate หรือ beaker เพ่ือตรวจสอบ
คุณภาพของไข่ จากนน้ั น�ำไปเทลงในเคร่ืองป่ัน (Blender) ตไี ข่ใหเ้ ข้ากนั เทใสก่ ระบอกตวงโดยผา่ นผา้ กรองทผี่ า่ น
การฆ่าเชอ้ื แล้วใหไ้ ด้ปรมิ าณท่ีตอ้ งการ
วธิ ีเตรยี ม 2% Malachite green solution
ช่งั ผง malachite green 2 g ละลายในน�ำ้ กล่นั 100 ml

เอกสารอา้ งองิ

1. Kent PT and Kubica GP. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory Center for
Disease Control, Atlanta, Georgia. 1985.

2. Kudoh S and Kudoh T. Simple Technique for Culturing Tubercle Bacilli. Bull WHO. 1974; 51:7-12.
3. Smithwick RW. Laboratory Manual for Acid fast Microscopy. 2nd ed. Center for Disease Control,
Atlanta, Georgia. 1976.
4. The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National Laboratory
Network. IUATLD 1998, ISBN 2-9504238-7-6
5. Vestal AL. Procedure for the Isolation and Identification of Mycobacterium. Department of health
Education and welfare, UPH , Atlanta, Georgia. 1977.
6. ชยั เวชนชุ ประยรู .วณั โรคปฏบิ ตั กิ าร.สมาคมปราบวณั โรคแหง่ ประเทศไทยในพระบรมราชปู ถมั ภ์กรงุ เทพมหานครฯ:

โรงพมิ พ์แหง่ จฬุ าลงกรณ์มหาวิทยาลัย; 2529.

206 คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรยี และรา

5.11 การวินจิ ฉยั เช้ือราท่ีพบบอ่ ย ณัฎฐีวรรณ ปุ่นวนั

โรคติดเชื้อราส่วนใหญ่ มีสาเหตุมาจากราฉวยโอกาส ผู้ป่วยที่มีภูมิคุ้มกันต�่ำ ผู้ป่วยเบาหวาน ผู้ป่วยต่อม
พาราไทรอยด์ท�ำงานไดน้ ้อย ผู้ป่วยท่ไี ดร้ ับยาเป็นพษิ ต่อเซลล์ ยากดภูมิคมุ้ กัน สารต้านจุลชีพ ฮอรโ์ มน จะท�ำให้
ราฉวยโอกาสเพิ่มจ�ำนวนมากขี้น และเกิดโรครุนแรงข้ึน ตัวอย่างราฉวยโอกาสประเภทราสาย (molds) ได้แก่
Aspergillus, Mucor และ Rhizopus ซึ่งพบได้ไม่บ่อยนัก ประเภทยีสต์ ได้แก่ Cryptococcus neoformans และ
Candida albicans ราบางชนิดมีคุณสมบัติเป็นราสองรูป (dimorphic fungi) คือมีรูปร่างแบบราสาย เม่ือเจริญอยู่
ในสภาวะแวดล้อมท่ีอุณหภูมิไม่เกิน 35 ºC และเปลี่ยนรูปร่างเป็นยีสต์เมื่อเจริญอยู่ในสภาวะแวดล้อมที่อุณหภูมิ
ไม่ต่�ำกว่า 35 ºC ตัวอย่างรา 2 รูปที่พบบ่อยในประเทศไทยคือ Penicillium marneffei และ Histoplasma
capsulatum โรคติดเชื้อราที่พบบ่อยในผู้ป่วยเอดส์และผู้ป่วย immunocompromised อ่ืนๆ ได้แก่ candidiasis,
cryptococcosis, penicillosis marneffei, และ histoplasmosis

1. การวนิ ิจฉยั Candida albicans กอ่ โรค Candidiasis
หลักการ การตรวจสดส่งิ ส่งตรวจในสารละลาย potassium hydroxide (KOH )10-30% หรอื การยอ้ มแกรมจะ
ทำ� ให้เหน็ ลักษณะรูปร่างของ Candida albicans หรือ Candida spp. อืน่ ๆ ไดช้ ดั เจน และโคโลนที ่ีเพาะไดบ้ นอาหาร
เล้ียงเช้ือ น�ำมาทดสอบการสร้าง germ tube และการสร้างสีโคโลนีบน CHROMagar Candida เพื่อวินิจฉัยและ
รายงานผล Candida แบบ presumptive identification Candida species อนื่ ๆทกี่ อ่ โรคไดน้ อกจาก C. albicans ไดแ้ ก่
C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei และ C. glabrata เป็นตน้

สง่ิ ส่งตรวจ เยอ่ื บุจากชอ่ งปาก เยื่อบุจากหลอดอาหารหรือลำ� ไส้ เย่ือบจุ ากชอ่ งคลอด เยื่อบุหัวใจ ผวิ หนัง เล็บ
ปัสสาวะ สง่ิ สง่ ตรวจจากระบบหายใจ เลือด

วิธีปฏบิ ัตงิ าน
1. การตรวจสิง่ สง่ ตรวจโดยตรงทางกล้องจลุ ทรรศน์

1.1 การตรวจสดดว้ ยสารละลาย KOH
1.2 การยอ้ มสีแกรม (วิธีการเชน่ เดียวกับการย้อมสแี กรมแบคทีเรีย)
2 . การเพาะเช้อื
เพาะสง่ิ ส่งตรวจบน SDA หรือ BA สิง่ สง่ ตรวจจากต�ำแหน่งท่มี ีเช้ือประจำ� ถนิ่ (non sterile site) เพาะบน
SDA ทเ่ี ตมิ chloramphenicol อบเชือ้ ทอี่ ุณหภูมิ 25-30 °C ตรวจดกู ารเจรญิ ของเชือ้ 24-48 ชม. ตรวจดูลักษณะ
รปู รา่ งของเซลลท์ างกลอ้ งจุลทรรศน์โดยท�ำ mounting slide ด้วย lactophenol aniline blue
3. การสรา้ ง germ tube
ใช้ loop ตกั เช้ือจากโคโลนีเด่ยี วที่เจริญบน SDA 24 ชม. เพาะลงในซีรัมของคนปรกติปรมิ าตร 0.5 ml อบ
ท่ีอุณหภูมิ 37 °C เวลา 2.5-3 ชม. หยดเช้ือในซีรัมลงบนแผ่นสไลด์แก้วและปิดทับด้วย cover glass ตรวจด้วย
กล้องจลุ ทรรศน์

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 207

เชือ้ ควบคมุ คณุ ภาพ positive control Candida albicans DMST 15313
negative control Candida tropicalis DMST 15195

4. การสรา้ งสโี คโลนีบน CHROMagar Candida
ใช้ลปู ตักเช้อื จากโคโลนีเด่ียวท่เี จริญบน SDA 24 ชม. streak บน CHROMagar Candida plate และ streak
เชื้อควบคุมคณุ ภาพลงบน plate เดียวกนั อบเชอื้ ในท่ีมดื ที่อุณหภูมิ 35-37 °C นาน 24-48 ชม.
เช้อื ควบคมุ คณุ ภาพ Candida albicans DMST 15313…… โคโลนสี เี ขยี ว (bright green)

Candida tropicalis DMST15195………โคโลนีสนี �ำ้ เงนิ อมเขียว (dull greenish blue)
Candida krusei DMST 15317…… โคโลนสี ีชมพู (rose-colored)
การอ่านผล
1. การตรวจสดดว้ ยสารละลาย KOH พบเซลลย์ สี ต์เปน็ สใี สๆ ไมม่ สี ี เซลล์ยีสตร์ ูปไข่ budding yeast อย่รู ่วมกบั
pseudohyphae
2. การย้อมสีแกรม เซลล์ยีสต์ติดสีแกรมบวก ลักษณะรูปร่างเช่นเดียวกับการตรวจสดด้วสารละลาย KOH
การตรวจสดสิ่งส่งตรวจผิวหนังและเล็บทางกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจหาเชื้อ Candida ใช้การตรวจสด
ด้วยสารละลาย KOH เหมาะสมกวา่ การยอ้ มสีแกรม
3. การเพาะเชอื้ ลกั ษณะของโคโลนบี นอาหารเลย้ี งเชอ้ื SDA คลา้ ยครมี สขี าว ผวิ หนา้ เรยี บเปน็ มนั ตรงกลางนนู
ลักษณะทางกล้องจุลทรรศน์ พบเซลล์ยีสต์รูปไข่หรือรูปกลม และเซลล์ยีสต์ท่ีก�ำลังแตกหน่อ (budding
yeast cell) อาจพบลกั ษณะของ short pseudohyphae
4. การสร้าง germ tube ลักษณะของ germ tube เป็นสายรูปทรงกระบอกขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางสม่�ำเสมอ
ไม่มีรอยคอดตรงจุดที่งอกออกจากเซลล์ยีสต์ เช้ือที่ germ tube positive นอกจาก C. albicans แล้วยังมี
C. dubliniensis ระยะเวลาที่อ่านผลต้องอยู่ในช่วง 2.5-3 ชม. เน่ืองจาก Candida species อ่ืนๆ เช่น
C. tropicalis สามารถสรา้ ง germ tube ได้หลังจากอบเพาะเชอื้ ไว้ เกนิ 3 ชม. และ C. albicans ทุก isolate
ไม่ได้ สร้าง germ tube ได้ทั้งหมด ดังน้ันการรายงายผล germ tube positive ของ C. albicans จัดเป็น
presumptive identification
5. การสรา้ งสโี คโลนีบน CHROMagar Candida สีโคโลนีของยีสตแ์ ตล่ ะ species แสดงในตาราง 5.11-1
การสรา้ งสโี คโลนีบน CHROMagar จัดเปน็ presumptive identification

208 คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางท่ี 5.11-1 สโี คโลนขี อง Candida species บน CHROMagar Candida

Candida species สีโคโลนีบน CHROMagar Candida

Candida albicans bright green/ dark green
Candida dubliniensis dark green/ bright green
Candida tropicalis
Candida krusei dull greenish blue
Candida parapsilosis rose -colored
Candida glabrata
Candida guilliermondii pale purplish pink
Candida famata pale purplish pink

Light purple
dull greenish blue/ bright green

การรายงานผล
การตรวจสดด้วยสารละลาย KOH และการย้อมสแี กรม เมอื่ ไดผ้ ลการตรวจสดหรอื การย้อมสีแกรมรายงานให้
แพทยท์ ราบทนั ที
รายงานผลการตรวจสด “hyaline oval yeast cells , budding yeast cells with pseudohyphae suggestive for
candidiasis”
รายงานผลการย้อมสีแกรม “Gram positive oval yeast cells, budding yeast cells with pseudohyphae
suggestive for candidiasis”
การเพาะเช้อื รายงานผลจากการทดสอบ germ tube และ การสรา้ งสีโคโลนีบน CHROMagar Candida ซึ่งเปน็
presumptive identification
เช้ือ C. albicans สีโคโลนีเปน็ สเี ขียวบน CHROMagar Candida มีบาง isolate สโี คโลนีจะเปน็ สเี ขยี วเข้ม เชอ้ื
C. dubliniensis ส่วนใหญ่สีโคโลนีจะเป็นสีเขียวเข้ม เป็นส่ิงส่งตรวจจาก sterile site เช่น เลือด การพบเช้ือ
C. dubliniensis ในกระแสเลอื ดพบได้นอ้ ย (rare cases)
รายงานผล การเพาะเชอ้ื “Candida albicans, presumptive identification base on germ tube positive and bright
green colony on CHROMagar Candida.”

2. การวนิ จิ ฉยั Cryptococcus neoformans กอ่ โรค Cryptococcosis
หลักการ Cryptococcus neoformans เปน็ ยสี ตท์ สี่ ร้างแคปซูลล้อมรอบเซลล์ การตรวจสดสิง่ ส่งตรวจทส่ี งสัย
โรค cryptococcosis ในอนิ เดียองิ ค์ (india ink preparation) ท�ำใหเ้ ห็นเซลลย์ สี ตแ์ ละแคปซลู ท่ลี ้อมรอบไดช้ ดั เจน
เชื้อที่เพาะได้บนอาหารเล้ียงเชื้อตรวจดูแคปซูลด้วยอินเดียอิงค์แล้วท�ำการทดสอบ urease เชื้อมีคุณสมบัติในการ
hydrolyse urea เปน็ ammonia ได้ และนำ� ผลการทดสอบมาประกอบในการวินจิ ฉัย
สิง่ ส่งตรวจ น�้ำไขสันหลงั เลือด ไขกระดกู เสมหะ นำ้� ลา้ งปอด ผวิ หนงั ปัสสาวะ ตอ่ มน�้ำเหลอื ง มา้ ม ตับ ไต
ตอ่ มหมวกไต ต่อมลกู หมาก และตอ่ มไทรอยด์ เปน็ ตน้

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 209

วธิ ีปฏบิ ตั ิงาน
1. การตรวจสดสง่ิ ส่งตรวจใน india ink ทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์
2. การเพาะเช้อื สงิ่ สง่ ตรวจท่ีเป็นของเหลวใช้ปรมิ าตรประมาณ 0.5 ml หยดบน SDA plate ถ้าเปน็ ชิ้นเน้ือ
ใช้กรรไกรปราศจากเชื้อตัดเป็นช้ินเล็กๆและใช้คีมคีบปราศจากเช้ือคีบช้ินเน้ือแตะลงบนผิวหน้าของอาหารเลี้ยง
เชอ้ื ลากเป็นแนวซิกแซกตดั กัน 2 ระนาบตลอดท่วั ผิวหน้าของอาหารเล้ียงเชอ้ื อบเชอื้ ทีอ่ ุณหภมู ิ 25-30 °C ตรวจ
ดูการเจริญของเชื้อเมื่อครบ 48 ชม. ถ้ายังไม่พบการเจริญของเช้ือ ให้เก็บไว้ 2 สัปดาห์จึงทิ้ง plate รายงานผล
“no fungal growth”
3. การทดสอบ urease ใชล้ ปู ตกั โคโลนขี องเชื้อยสี ตท์ ี่จะทดสอบ streak ลงบนผิวหนา้ ของ Christensen’s
urea agar slant อบเชือ้ ที่อณุ หภูมิ 25-30 °C. และ 37 °C. เวลา 24-48 ชม.
เช้อื ควบคมุ คุณภาพ positive control Cryptococcus neoformans DMST 15319

negative control Candida albicans DMST 15313
การอ่านผล
การตรวจสดสง่ิ สง่ ตรวจในอนิ เดยี อิงค์ทางกล้องจุลทรรศน์ (ดใู นบทท3ี่ )
การเพาะเชอื้ ลกั ษณะโคโลนีบน SDA มลี ักษณะเปียกเป็นมกู ผิวหน้าเรียบเปน็ มนั โคโลนีสขี าวและสเี ข้ม
ขนึ้ เปน็ สแี ทนเมอ่ื อายมุ ากขนึ้ บางครงั้ จะพบลกั ษณะโคโลนที แี่ หง้ แสดงวา่ เชอ้ื ไมส่ รา้ งแคปซลู หรอื สรา้ งไดบ้ างมาก
ลักษณะของเชื้อจากการตรวจสดในอินเดียอิงค์ทางกล้องจุลทรรศน์ จะเห็นรูปร่างยีสต์และแคปซูลแบบเดียวกัน
แตแ่ คปซูลบางกวา่ ทตี่ รวจพบในสง่ิ ส่งตรวจ
การทดสอบ urease สขี อง urea agar เปล่ยี นเป็นสชี มพูเข้มทัง้ 2 อณุ หภูมิ แสดงว่าเชอ้ื ทที่ ดสอบสามารถ
hydrolyse urea เปน็ ammonia ได้ อ่านผล urease บวก สีของ urea agar ไมเ่ ปลย่ี นสีอา่ นผล urease ลบ ทง้ั น้เี ปรยี บ
เทียบผลกับ positive และ negative control เชื้อยีสต์ท่ีสร้างแคปซูลและให้ผล urease บวกนอกเหนือจาก
Cryptococcus neoformans ได้แก่ Cryptococcus spp. และ Rhodotorula spp. แตม่ ีรายงานการก่อโรคในคนคอ่ น
ขา้ งต�ำ่ เมื่อเปรยี บเทียบกับ Cryptococcus neoformans
การรายงานผล
การตรวจสดสง่ิ สง่ ตรวจใน india ink ตรวจพบ encapsulated yeast cells
รายงานผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”
หรอื “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”
การเพาะเชื้อ รายงานผล “Cryptococcus neoformans, presumptive identification base on budding,
encapsulated yeast cells and urease positive of primary culture.”

210 คู่มอื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

ข้อเสนอแนะเพ่มิ เตมิ ส�ำหรับ rapid identification ของเช้อื Cryptococcus neoformans
การวินิจฉยั เช้อื Cryptococcus neoformans นน้ั อย่างนอ้ ยหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารของโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาล
ทวั่ ไปตอ้ งทำ� การเพาะเชอ้ื ทำ� India ink preparation และทดสอบ urease ของ primary culture แตถ่ า้ เพมิ่ การทดสอบ
phenoloxidase จะท�ำให้การรายงานผลมีความแมน่ ยำ� ถูกตอ้ งสูงขน้ึ ห้องปฏิบัตกิ ารแหง่ ใดสนใจทดสอบเพิม่ เติม
ขอให้ติดตอ่ สอบถามไดท้ ี่ ฝ่ายเชือ้ ราวิทยา สถาบนั วิจยั วทิ ยาศาสตร์สาธารณสขุ กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ โทร.
02 5899850 ตอ่ 99405 โทรสาร 02 5915449
การทดสอบ Phenoloxidase
Phenoloxidase activity เปน็ คณุ สมบตั เิ ฉพาะของ Cryptococcus neoformans ทแ่ี ตกตา่ งจาก Cryptococcus spp.
และยีสต์ก่อโรคอื่นๆ คือเชื้อสร้างเอนไซม์ phenoloxidase ได้ (Cryptococcus บาง species สร้างเอนไซม์
phenoloxidase ไดแ้ ตส่ รา้ งไดใ้ นปรมิ าณทนี่ อ้ ยกวา่ C. neoformans) เอนไซมช์ นดิ นเี้ ปน็ ตวั เรง่ ในการเปลยี่ น substrate
ท่ีเปน็ สารพวก phenolic compounds เช่น caffeic acid, DOPA (dihydroxyphenylalanine) ใหเ้ ปน็ melanin like
pigment การทดสอบ phenoloxidase สามารถทำ� การเพาะเชอ้ื ลงบนอาหารเลยี้ งเชอื้ ทเี่ ตมิ phenolic compounds เพอื่
ใช้ทดสอบ phenoloxidase activity ได้แก่ DOPA medium modified caffeic acid-cornmeal agar และ
sunflower seed agar โคโลนีของเชอื้ C. neoformans ทเี่ จริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อท่ีเติม phenolic compounds จะเปน็
โคโลนสี นี ำ�้ ตาลอ่านผลเป็น phenoloxidase บวก หรือท�ำการทดสอบโดยใช้แผน่ ทดสอบ phenol oxidase ฝา่ ยเชอื้
ราวิทยา สถาบนั วิจัยวทิ ยาศาสตร์สาธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ ทำ� การทดสอบ phenoloxidase โดยใช้
sunflower seed agar (ระยะเวลาทอ่ี า่ นผลภายใน 24 ชม.) และแผน่ ทดสอบ phenoloxidase โดย phenolic compounds
ทใ่ี ชค้ ือ สารสกดั จากเมล็ดทานตะวนั (ผลการทดสอบ เหน็ สีนำ้� ตาลถงึ สนี ำ้� ตาลเข้มท่ภี ายใน 4 ชม.) sunflower
seed agar ราคาถกู และหาไดง้ า่ ยในประเทศ ซง่ึ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารของโรงพยาบาลทว่ั ประเทศสามารถนำ� ไปใชท้ ดสอบ
เพิ่มได้โดยจะไม่กระทบกับราคาค่าตรวจเดิมแต่เพิ่มคุณค่าและคุณภาพของการบริการให้แก่แพทย์ผู้ให้การรักษา
รวมท้งั ผู้ป่วยด้วย
3. การวินิจฉยั Penicillium marneffei กอ่ โรค Penicillosis marneffei
หลกั การ
Penicillium marneffei เป็นรา 2 รูป (dimorphic fungi) ซง่ึ โดยปรกตเิ มอ่ื เจรญิ อยู่ในดนิ หรือในสง่ิ แวดล้อมอื่นๆ
ท่ีอณุ หภมู ิไม่เกิน 30 °C จะมีลกั ษณะรูปรา่ งเป็นโมลด์ (mold phase) เมือ่ ถกู สดู ดมเข้าไปในปอด อณุ หภมู เิ ปล่ียน
เปน็ 37 °C เช้ือจะปรับตวั เข้ากับสภาพแวดลอ้ มใหม่โดยเปล่ยี นรูปร่างเป็นยสี ตใ์ นภาวะท่กี อ่ โรค การตรวจสิง่ สง่
ตรวจโดยตรงโดยการย้อมสีแกรม ย้อมสี Giemsa หรือยอ้ มสี Wright และตรวจดดู ว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ท�ำใหเ้ ห็น
ยสี ต์เซลลข์ อง P. marneffei ได้ชดั เจนและแยกออกไดง้ ่ายขึ้น การทดสอบรา 2 รปู เชอื้ เปลีย่ นจาก mold phase ท่ี
25-30 °C เป็น yeast phase ที่ 37 °C ได้
ส่ิงส่งตรวจ
เลอื ด ไขกระดกู ผวิ หนงั นำ้� คดั หลงั่ จากระบบทางเดนิ หายใจ ตบั ตอ่ มนำ�้ เหลอื ง อจุ จาระ นำ้� ไขสนั หลงั กระเพาะ
อาหารหรือลำ� ไส้เลก็ และมา้ ม เป็นต้น

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 211

วิธปี ฎบิ ตั ิงาน
1. การตรวจสง่ิ สง่ ตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์ การยอ้ มสแี กรม การยอ้ มสี Giemsa การยอ้ มสี Wright
ตรวจดูดว้ ยกล้องจุลทรรศน์ กำ� ลงั ขยาย 10 X และ 100 X อยา่ งนอ้ ยท่สี ดุ ขอใหท้ ำ� การย้อมสีแกรม
2. การเพาะเชอ้ื อาหารเลย้ี งเชือ้ ใช้ SDA และ BHI agar อบเช้อื ท่ีอุณหภูมิ 25-30 °C ตรวจดกู ารเจริญของ
เชอื้ เมอื่ ครบ 48 ชม. และตรวจดกู ารเจริญทุก 2-3 วนั รอจนเช้ือเจรญิ สง่ ต่อตรวจวนิ ิจฉัย/ ยืนยัน (definitive
identification) ที่ สถาบนั วจิ ยั วทิ ยาศาสตรส์ าธารณสุข กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์
การอา่ นผล
การย้อมแกรมเซลล์ยีสต์ติดสีแกรมบวก การย้อมสี Giemsa และการย้อมสี Wright การติดสีไม่สม�่ำเสมอ
ส่วนของ Polar ติดสีน�้ำเงินเข้ม จะเห็นนิวเคลียส 2 นิวเคลียสชัดเจนในเซลล์ยีสต์ ส่วนของผนังตัดขวางเซลล์
ไมต่ ดิ สี
เซลล์ยีสตข์ อง P. marneffei ตรวจพบไดท้ ั้งภายในและภายนอก histiocytes รปู ร่างและขนาดของเซลลย์ ีสต์
มคี วามหลากหลาย ไดแ้ ก่ เซลลร์ ูปกลมหรอื รปู ไขข่ นาดประมาณ 2-3 µm เซลลร์ ปู ยาวรี (elongated cells) ขนาด
ประมาณ 2-3 X 2-6.5 µm ตรวจพบภายใน histiocytes เซลลย์ สี ตภ์ ายนอก histiocytes พบเซลลร์ ปู ยาวคลา้ ยไสก้ รอก
(sausage-shaped) ความยาว 8-13 µm อาจพบเซลล์ยีสต์ท่ีเป็นท่อนโค้งงอคล้ายกล้วยหอม เซลล์ยีสต์ของ
P. marneffei เพ่ิมจ�ำนวนโดยการสรา้ งผนังตดั ขวางเซลล์ (binary fission) ซ่งึ เป็นลักษณะเฉพาะของ P. marneffei
รูปร่างและขนาดของเซลล์ยีสต์ท่ีอยู่ภายใน histiocytes มีความแตกต่างกับเซลล์ยีสต์ที่อยู่ภายนอก
histiocytes ไซต์ เซลลย์ ีสตท์ อ่ี ยภู่ ายใน histiocytes จะมีรูปร่างทเ่ี หมือนกันทุกเซลลแ์ ละขนาดใกลเ้ คียงกันซึ่งอาจ
จะเป็นรปู กลม รปู ไข่ หรือรปู ยาวรี ซง่ึ จะใกล้เคียงกับเซลล์ยสี ต์ Histoplasma capsulatum ทำ� ให้เกดิ การสบั สนได้
ตอ้ งตรวจหาลักษณะเฉพาะ binary fission yeasts ของ P. marneffei และ budding yeasts ของ H. capsulatum ให้
พบ ในกรณที ตี่ รวจไม่พบลักษณะเฉพาะของเชือ้ ต้องดำ� เนนิ การเพาะเชอ้ื เพ่ือชว่ ยในการวินจิ ฉัย
การเพาะเชื้อ โคโลนมี ลี ักษณะเปน็ จดุ คลา้ ยข้ผี ึ้งสแี ดง จะปรากฏให้เห็นหลังจากเพาะเชือ้ ได้ 2 วนั ต่อมา
สร้างเส้นใยเป็นปุยสีขาวและสร้างสารสีแดงละลายในเน้ือวุ้น ผิวหน้าโคโลนีจะเปล่ียนเป็นผงละเอียดสีชมพูเม่ือ
เชอ้ื มอี ายุการเจริญได้ 7 วัน การสร้างสารสีแดงละลายในเนื้อวนุ้ ของ Penicillium marneffei บางครั้งอาจสรา้ งได้
น้อยมากหรอื ไมส่ ร้างเลยบน primary culture, SDA, Lowenstein Jensen medium หรือ CA ซงึ่ อาจทำ� ใหเ้ ขา้ ใจผดิ
ไดว้ ่าเป็น contaminated mold ได้
การรายงานผล
รายงานผลการตรวจส่ิงส่งตรวจทางกล้องจุลทรรศน์ “ Binary fission yeasts, Penicillium marneffei”
กรณีท่ีไม่พบลกั ษณะเฉพาะรายงานผล “ Round yeast cells, oval yeast cell suggesting Penicillium marneffei or
Histoplasma capsulatum”
4. การวินิจฉยั Histoplasma capsulatum กอ่ โรคฮีสโตพลาสโมสสี (Histoplasmosis)
หลักการ การย้อมแกรม การย้อมสี Giemsa และ การย้อมสี Wright จะท�ำให้เซลล์ยีสต์ของ Histoplasma
capsulatum มกี ารตดิ สที ่ีจ�ำเพาะ ทำ� ใหต้ รวจพบและแยกออกจากลักษณะอืน่ ๆในสงิ่ ส่งตรวจได้ง่ายขน้ึ การตรวจดู
ด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการเพาะเช้ือเพ่ือตรวจดูลักษณะโคโลนีท่ีมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า จะแสดงลักษณะของ

212 คูม่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

H. capsulatum ซึ่งคล้อยตามกับลักษณะรูปร่างของเซลล์ยีสต์ท่ีตรวจพบจากการย้อมสีสิ่งส่งตรวจโดยตรง
H. capsulatum เป็นรา 2 รปู เชน่ เดียวกับ P. marneffei เชอ้ื เปล่ียนจาก mold phase ที่ 25-30 °C เป็น yeast phase ที่
37 °C ได้
ส่ิงสง่ ตรวจ ไขกระดูก เลือด น�้ำคดั หล่ังจากระบบหายใจ ตอ่ มนำ้� เหลอื ง ตับ แผลท่ผี ิวหนัง น้ำ� ไขสันหลงั และ
สมอง
วิธปี ฎบิ ัตงิ าน
1. การตรวจสงิ่ สง่ ตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์ การยอ้ มแกรม การยอ้ มสี Giemsa และ การยอ้ มสี Wright
ตรวจดูดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ ก�ำลงั ขยาย 10 X และ 100 X อยา่ งนอ้ ยทส่ี ุดขอให้ท�ำการยอ้ มแกรม
2. การเพาะเชอื้ อาหารเล้ียงเชอื้ ใช้ SDA , BHA agar อบเพาะเช้อื ทอ่ี ุณหภมู ิ 25-30 °C ตรวจดูการเจรญิ ของ
เชอ้ื หลังจากเพาะเช้ือได้ 3 วัน และหลงั จากนัน้ ตรวจดูการเจรญิ ทุก 2-3 วัน รอจนเชื้อเจรญิ สง่ ต่อตรวจวนิ จิ ฉัย/
ยนื ยนั (definitive identification) ที่ สถาบนั วจิ ัยวทิ ยาศาสตรส์ าธารณสุข กรมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์
การอ่านผล
การย้อมแกรม เซลลย์ สี ตต์ ิดสแี กรมบวก การยอ้ มสี Giemsa และ การย้อมสี Wright การติดสีไมส่ ม่�ำเสมอ
สว่ นของ cytoplasm ตดิ สนี �้ำเงนิ ออ่ น และส่วนของ polar ตดิ สนี �ำ้ เงนิ เขม้
ตรวจพบเซลล์ยสี ตร์ ปู กลม รปู ไข่ มี budding cells ขนาดของเซลล์ประมาณ 3-5 µm เซลล์ยีสตม์ ขี นาดทีเ่ ทา่
กนั และรูปร่างสม่�ำเสมอเหมือนกันเจริญอยู่ภายใน macrophage ขนาดใหญ่หรอื giant cells
การเพาะเชือ้ H. capsulatum มกี ารเจริญเตบิ โตช้า หลังจากเพาะเชอื้ ได้ประมาณ 3 สปั ดาห์ จะพบลกั ษณะโค
โลนเี ป็นปยุ นนุ่ สขี าวและสเี ข้มข้นึ เปน็ สีนำ้� ตาลอ่อนเม่อื เชอื้ มอี ายุมากขนึ้ ทางดา้ นล่างของโคโลนเี ปน็ สีน�้ำตาล
การรายงานผล
รายงานผลการตรวจส่ิงส่งตรวจทางกล้องจุลทรรศน์ “Round or oval yeast cells, budding yeast cells
suggesting Histoplasma capsulatum.”

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 213

เอกสารอ้างอิง

1. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Introduction to Medical Mycology. In: Laboratory Diagnosis of
Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia, PA: Lippincott Williams
& Wilkins; 2008. p.489-506.
2. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In : Laboratory
Diagnosis of Infectious Diseases : Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia, PA: Lippincott
Williams & Wilkins;2008. p. 507-540.
3. Hazen KC and Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing. In: Garcia LS. editor in
chief. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007
Update. p. 8.3.1.1- 8.6.10.
4. Howell SA, and Hazen KC. Candida , Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance.
In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual
of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 1793- 821.

5. Peng CF, Lee KM, Lee SH. Characterization of Two Chromogenic Media of Candida ID2 and
CHROMagar Candida for Preliminary Identification of Yeasts. J Biomed Lab Sci 2007;19(2):
63-69.

214 คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บ6ทท่ี

การทดสอบความไวของ
แบคทีเรยี ตอ่ สารต้านจุลชพี

การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารต้านจุลชพี
สุวรรณา ตระกูลสมบูรณ์
วนั ทนา ปวณี กิตติพร
สรุ างค์ เดชศริ ิเลศิ
หลักการ
การทดสอบความไวของแบคทเี รียตอ่ สารต้านจุลชพี เปน็ การทดสอบทางห้องปฏิบัตกิ ารเพือ่ บ่งชว้ี า่ แบคทีเรีย
ก่อโรคท่ีแยกได้จากส่ิงส่งตรวจไวหรือดื้อต่อสารต้านจุลชีพใด เพ่ือเป็นแนวทางส�ำหรับแพทย์ในการเลือกใช้สาร
ตา้ นจลุ ชพี ในการรกั ษาผูป้ ว่ ยอย่างมปี ระสิทธภิ าพ วธิ กี ารทดสอบมีหลายรูปแบบท้ังการวเิ คราะหเ์ ชิงคณุ ภาพและ
การวิเคราะห์เชิงปริมาณ นอกจากน้ียังมีการตรวจหาเอนไซม์ท่ีท�ำลายสารต้านจุลชีพซ่ึงผู้ปฏิบัติงานควรพิจารณา
เลือกใช้การทดสอบที่เหมาะสม ให้ท�ำการทดสอบกับเชื้อก่อโรคที่ไม่สามารถคาดได้ว่าไวหรือดื้อต่อยา ในกรณี
ติดเชื้อแบคทีเรียที่ทราบแน่ชัดว่าไวต่อยาที่ใช้รักษาเสมอ ก็ไม่จ�ำเป็นต้องท�ำการทดสอบกับยาชนิดนั้น ได้แก่
Streptococcus pyogenes ไวต่อ penicillin เปน็ ตน้ ยกเวน้ ทดสอบเพ่อื ตดิ ตามเฝา้ ระวงั การดอื้ ยา หรือกรณที ี่สงสัย
ว่าเปน็ เชอ้ื ดอ้ื ยาทีอ่ บุ ตั ใิ หม่
วธิ ีการทดสอบ
การทดสอบและการแปลผลของวธิ ีในบทน้ี ดำ� เนนิ ตามมาตรฐานของ Clinical Laboratory Standard Institute
(CLSI) ส�ำหรับเช้ือแบคทีเรียเจริญเร็ว (rapid growing bacteria) เชื้อแบคทีเรียเจริญยากและช้า (fastidious
bacteria) และแบคทเี รยี ไรอ้ ากาศ (anaerobes) หาก CLSI มหี ลกั ฐานทางวชิ าการใหมท่ จี่ ะตอ้ งปรบั ปรงุ วธิ กี ารหรอื
การแปลผลจะมีการแจง้ การปรับปรงุ ในเอกสารที่พิมพ์ใหม่ทกุ ปี ดังนั้นเป็นความรับผิดชอบของผูป้ ฏบิ ัตงิ านทีจ่ ะ
ต้องตดิ ตามเอกสารของ CLSI ท่ีเป็นฉบบั ปจั จบุ ันเสมอ วธิ กี ารทดสอบท่ีทำ� ในหอ้ งปฏบิ ัติการมดี ังนี้
1 Disk diffusion หรอื Kirby Bauer’s method
2 MIC determination by broth dilution
3 β-lactamase tests
4 Extended-spectrum β-lactamases (esbl) detection
5 Carbapenemases (carbapenem-resistant Enterobacteriaceae) detection
6 Screen test to detect high-level aminoglycoside resistance in enterococci
7 Agar screening to detect vancomycin resistance in enterococci
8 Agar screening to detect vancomycin resistance in staphylococci
9 D-test
10 E-test
1. วิธกี ารทดสอบความไวโดยใชแ้ ผ่นยา (วิธี Disk diffusion หรอื Kirby Bauer’s)
1.1. หลกั การ วธิ ี Disk Susceptibility เปน็ การทดสอบเชิงคุณภาพ รายงานผลไว ค่อยข้างไว หรอื ดื้อต่อสารต้าน
จุลชพี เปน็ วธิ ที ดสอบความไวตอ่ สารตา้ นจุลชีพของแบคทเี รยี กอ่ โรคชนิดเจรญิ ไว (rapidly-growing aerobic path-
ogens) และชนิดเจริญยากบางชนิด (fastidious bacteria) โดยใช้วิธีมาตรฐานของ CLSI ฉบับ M02-A10 และ
M45-A2 ตามล�ำดับ ทดสอบโดยป้ายเชื้อแบคทีเรียบนผิวของวุ้นอาหารเลี้ยงเชื้อ วางแผ่นยาทดสอบ อบเชื้อตาม
เวลาทก่ี ำ� หนด วดั เสน้ ผา่ นศนู ยก์ ลางของบรเิ วณทไี่ มม่ เี ชอื้ เจรญิ รอบแผน่ สารตา้ นจลุ ชพี เทยี บกบั ตารางแปลผลตาม
มาตรฐานของ CLSI (M100-S24)

216 คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรยี และรา

1.2. วธิ ปี ฏิบตั ิ
เลือกโคโลนีของเชื้อท่ีจะทดสอบ และเขี่ยเชื้อท่ีขึ้นบนอาหารที่ไม่ใช่ selective media เพื่อท�ำการทดสอบ
ความไวต่อสารต้านจลุ ชีพ
1.2.1. ชนิดของแบคทเี รียที่ทดสอบได้ดว้ ยวิธี Disk diffusion
แบคทีเรียก่อโรคชนิดเจริญไว (rapidly-growing aerobic pathogens) ดังน้ี แบคทีเรียในวงศ์
Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Burkholderia cepacia, Enterococcus spp.,
Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus spp., Aeromonas spp. (A. caviae complex, A. hydrophila
complex และ A. veronii complex), Plesiomonas shigelloides, Moraxella catarrhalis, Pasteurella spp. และ
Vibrio spp.
แบคทีเรียก่อโรคชนิดเจริญช้าหรือเจริญยากบางชนิด (fastidious bacteria) ดังน้ี Haemophilus
influenzae, H. parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis (ยกเว้นทดสอบต่อยาต่อไปนี้ด้วยวิธี
dilution test: penicillin, ampicillin, cefotaxime หรือ ceftriaxone, meropenem และ azithromycin), Campylobacter
jejuni/coli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. β-hemolytic group (ยกเว้นทดสอบยาตอ่ ไปน้ดี ว้ ยวธิ ี
dilution test: penicillin หรือ ampicillin, cefepime หรอื cefotaxime หรือ cetriaxone, doripenem, ertapenem, mer-
openem และ daptomycin), Streptococcus spp. viridans group (ยกเว้นทดสอบยาต่อไปนี้ด้วยวิธี dilution test:
penicillin หรือ ampicillin, doripenem, ertapenem, meropenem และ daptomycin)
1.2.2 การเลอื กชนดิ ของแผน่ สารตา้ นจลุ ชพี เพือ่ ใช้ในการทดสอบประจ�ำวันและการรายงาน
การเลอื กชนดิ ของสารตา้ นจลุ ชพี ทเ่ี หมาะสม ตอ้ งเกดิ จากการพจิ ารณารว่ มกนั ระหวา่ งหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร
องค์กรแพทย์ และเภสัชกรรม ตารางท่ี 6-1 เปน็ ยาทดสอบทแี่ นะน�ำส�ำหรบั เชอ้ื แตล่ ะกลมุ่
- ยากลมุ่ Primary เปน็ ยาทใ่ี ชท้ ดสอบในงานประจำ� วนั เปน็ ลำ� ดบั แรก และรายงานทกุ ยาทที่ ดสอบ
- ยากลมุ่ Supplement 1 เปน็ ยาทท่ี ดสอบเป็นล�ำดบั แรกและเลือกรายงานเฉพาะกรณีเชือ้ ท่ีดื้อยา
primary ที่เป็นยา class เดียวกัน หรือในกรณีผู้ป่วยแพ้ยาในกลุ่ม Primary หรือรายงานเพื่อ
ชว่ ยในการควบคมุ การระบาด
- ยากลมุ่ Supplement 2 เป็นยาที่ควรทดสอบเพมิ่ เติมส�ำหรับเชื้อท่ไี วตอ่ ยาใน primary/
supplement 1 น้อยลง (reduce susceptibility) หรอื เชื้อทีด่ อื้ ยาหลายชนิดพร้อมกนั
(multidrug resistance)
- ยากลุ่ม Urine ประกอบดว้ ยสารต้านจุลชพี ทใี่ ชท้ ดสอบเบื้องตน้ สำ� หรบั เช้อื ก่อโรคที่แยก
ได้จากทางเดนิ ปัสสาวะ

ส�ำหรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 217

ตารางที่ 6-1 การเลอื กสารต้านจุลชีพที่ทดสอบกบั เช้ือแบคทเี รยี แต่ละชนิด

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Staphylococcus spp. Cefoxitin 1-1 Norfloxacin
Erythromycin 1-2 Teicoplanin Linezolid Nitrofurantoin
S. pneumoniae Clindamycin 1-2, 1-3 Ciprofloxacin Moxifloxacin
Gentamicin Norfloxacin
β-haemolytic Trimethoprim- or Levofloxacin or Ciprofloxacin
Streptococcus 3-1 sulfamethoxazole Fosfomycin or Levofloxacin
Streptococcus spp. Penicillin 2-1 Fusidic acid
viridans group4-1 (Oxacillin disk) MIC of Nitrofurantoin
Enterococcus spp.5-1 Erythromycin Norfloxacin
Clindamycin 1-3 Vancomycin 1-4
Enterobacteriaceae6-1 Trimethoprim- Ofloxacin
Vancomycin Linezolid Nitrofurantoin
sulfamethoxazole Levofloxacin Rifampin
Penicillin 3-2 MIC of Penicillin2-1, 2-2 Tigecycline
Erythromycin 1-2 MIC of Cefotaxime2-1,2-2
Clindamycin 1.2, 1-3 or Ceftriaxone 2-1, 2-2
MIC of Penicillin 4-2 or Meropenem 2-1, 2-2

Penicillin 5.2 Levofloxacin
or Ampicillin Cefotaxime
or Ceftriaxone
Gentamicin 5-3
(120 μg) Cefotaxime
Ceftriaxone
β-lactamase test Erythromycin
Ampicillin Clindamycin 1-2, 1-3
Amoxicillin- Vancomycin
clavulanic acid
Ampicillin-sulbactam Vancomycin 5-4 Linezolid
Cefoxitin or Teicoplanin Tigecycline
Gentamicin
Trimethoprim- Streptomycin 5-3
sulfamethoxazole (300 μg)
Ciprofloxacin
Cefuroxime
Cefotaxime 6-2
or Ceftriaxone 6-2
Cefoperazone
Cefepime
Amikacin
Ertapenem6-3
Imipenem 6-3
Meropenem 6-3
Doripenem

218 คู่มือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรยี และรา

ตารางที่ 6-1 การเลือกสารตา้ นจุลชีพทีท่ ดสอบกับเชอ้ื แบคทีเรยี แต่ละชนิด (ตอ่ )

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Shigella spp.7 Norfloxacin
Ampicillin
Salmonella spp. 7 Trimethoprim- Ofloxacin

Vibrio cholerae sulfamethoxazole
Ciprofloxacin
Vibrio spp.*
Aeromonas spp.* or Norfloxacin

Campylobacter Ampicillin Cefotaxime or
jejuni/coli* Trimethoprim- Ceftriaxone 8-2
Levofloxacin 8-1
Pasteurella spp.* sulfamethoxazole MIC of Ciprofloxacin
Nalidixic acid 8-1
Ciprofloxacin

or Norfloxacin 8-1

Ampicillin
Tetracycline
Trimethoprim-

sulfamethoxazole
Ciprofloxacin

Cefotaxime
Ceftazidime
Tetracycline
Fluoroquinolone

Amoxicillin-clavulanic
acid

3rd or 4th generation
cephalosporins

Fluoroquinolones
Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Erythromycin
Ciprofloxacin

Penicillins Piperacillin- Netilmicin
β-lactam/ β-lactamase tazobactam
inhibitor combinations Cefoperazone-
Cephalosporins sulbactam9
Tetracyclines Cefepime
Macrolides or Cefpirome
Fluoroquinolones Imipenem
Trimethoprim- Meropenem
Sulfamethoxazole Doripenem

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 219

ตารางท่ี 6-1 การเลือกสารต้านจลุ ชพี ทีท่ ดสอบกับเช้ือแบคทเี รยี แตล่ ะชนิด (ต่อ)

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Pseudomonas Ceftazidime Doxycycline
aeruginosa Gentamicin Piperacillin- Tigecycline
Acinetobacter spp. Ciprofloxacin tazobactam MIC of Netilmicin
Amikacin
Stenotrophomonas Cefotaxime or Trimethoprim-
maltophilia Ceftriaxone sulfamethoxazole
Ceftazidime
Burkholderia Gentamicin Cefoperazone-
pseudomallei Ciprofloxacin sulbactam9
Ampicillin-
Burkholderia Cefepime or
cepacia Sulbactam Cefpirome

Haemophilus Trimethoprim- Imipenem
influenzae 11-1 sulfamethoxazole Meropenem
Amikacin
(CSF isolate) MIC of Trimethoprim- MIC of Colistin10
sulfamethoxazole Levofloxacin
MIC of Amoxicillin-
clavulanic acid Ceftazidime
MIC of Ceftazidime Meropenem
MIC of Imipenem Cefotaxime
MIC of Tetracycline or Cefriaxone
or Doxycycline Meropenem
Trimethoprim-

sulfamethoxazole
Ampicillin
(β-lactamase test)11-2

220 คมู่ อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางท่ี 6-1 การเลือกสารตา้ นจุลชีพท่ที ดสอบกับเชอ้ื แบคทีเรียแต่ละชนดิ (ตอ่ )

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine
Haemophilus Ampicillin Azithromycin Meropenem

influenzae11-1 (β-lactamase test)11-2 or Clarithromycin
(respiratory isolate) Amoxicillin- Ciprofloxacin
and
H. parainfluenzae11-1 clavulanic acid or Levofloxacin
(respiratory isolate) or Ampicillin- or Moxifloxacin
Neisseria meningitidis sulbactam
Trimethoprim- (Only for prophylaxis: Nalidixic acid 12
Moraxella catarrhalis sulfamethoxazole Azithromycin
Cefotaxime Trimethoprim-
or Ceftriaxone sulfamethoxazole
Meropenem Rifampin
MIC of Penicillin Ciprofloxacin)

β-lactamase test
Amoxicillin-clavulanic

acid
MIC of Cefaclor

or Cefuroxime
Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Primary = ยาทีค่ วรทดสอบเปน็ ลำ� ดบั แรก และ รายงานทุกยาท่ีทดสอบ
Supplement 1 = ยาที่ควรทดสอบเป็นลำ� ดบั แรกและเลือกรายงาน เฉพาะกรณเี ช้อื ทดี่ อ้ื ยา primary ทเ่ี ปน็ ยา

class เดยี วกนั
Supplement 2 = ยาทีค่ วรทดสอบเพิม่ เติมส�ำหรบั เช้อื ท่ี reduce susceptibility ตอ่ ยาใน primary/supplement 1

หรือ เชอื้ ทด่ี ้ือยาหลายชนิดพร้อมกนั (multidrug resistance)
คำ� อธบิ ายตารางที่ 6-1 :
1-1. การทดสอบ oxacillin หรือ methicillin resistance ของ Staphylococcus spp. ให้ทดสอบด้วยแผ่นยา
cefoxitin (หา้ มใชแ้ ผ่นยา oxacillin)
1-2. การทดสอบหาการดอ้ื ยา clindamycin ท่ีเกิดจากการเหนย่ี วนำ� ของยา erythromycin สามารถทำ� โดยการ
วางแผน่ ยา erythromycin ใกลก้ ับแผน่ ยา clindamycin (ระยะหา่ งจากขอบถงึ ขอบ 15-20 mm ส�ำหรับ
การทดสอบเชื้อ staphylococci และ 12 mm ส�ำหรบั β-haemolytic streptococci ) เชือ้ ท่ีให้ inhibition
zone ของ clindamycin ด้านทีต่ ิดกบั erythromycin แบนแคบลง มองเหน็ เป็นตวั อกั ษร D คอื เชอ้ื ทเ่ี กิด
การดือ้ clindamycin แบบเหนีย่ วน�ำ (inducible clindamycin resistance) ใหร้ ายงานว่าดอ้ื clindamycin
ถึงแมว้ า่ ผลการทดสอบไวตอ่ แผน่ ยา clindamycin
1-3. ไมร่ ายงานผลการทดสอบ clindamycin ต่อเช้ือ staphylococci, β-haemolytic streptococci และ

Streptococcus spp. viridans group ที่พบในระบบทางเดนิ ปัสสาวะ

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 221

1-4. ควรทดสอบหา MIC ของยา vancomycin ต่อเชื้อ MRSA ที่แยกไดจ้ าก sterile site หากต้องการทดสอบ
จาก specimen อนื่ อาจพจิ ารณาเปน็ รายๆ ไป
2-1. หากเชอื้ S. pneumoniae จาก sterile site ท่ใี ห้ inhibition zone ต่อ oxacillin (1 μg) < 19 mm ให้ทดสอบ
และรายงานผล MIC ตอ่ penicillin และ cefotaxime หรอื ceftriaxone เสมอ
2-2. เชื้อ S. pneumoniae ทแ่ี ยกไดจ้ าก CSF ใหท้ ดสอบและรายงานผล MIC ตอ่ penicillin และ cefotaxime
หรือ ceftriaxone หรือ meropenem รวมท้ังทดสอบและรายงานผล MIC หรือ disk diffusion ต่อยา
vancomycin ด้วย
3-1. β-haemolytic Streptococcus spp. ในท่ีนี้หมายถึง β-haemolytic Streptococcus group B (S. agalactiae)
และ β-haemolytic Streptococcus ท่ีมีโคโลนีขนาดใหญ่ ใน group A (S. pyogenes), C, G
3-2. ในตา่ งประเทศยังไมม่ ีรายงานการดอ้ื penicillin ของเช้ือ β-haemolytic Streptococcus หากพบว่าเชอ้ื น้ี
มกี ารดือ้ penicillin จากการทดสอบโดยวธิ ี disk diffusion ให้ทำ� การทดสอบชนิดเช้อื ซ้ำ� และทดสอบ
ความไวโดยหา MIC หรอื ส่งเชอื้ ทดสอบยืนยนั ไปยงั กรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์
4-1. Streptococcus spp. viridans group ในทนี่ ี้หมายถึงเชอ้ื Streptococcus spp.ท่ีอยู่ในกลมุ่ S. mutans group,
S. salivarius group, S. bovis group, S. anginosus group (ช่อื เดิม “S. milleri” group) และ S. mitis group
รวมถึง β-haemolytic Streptococcus spp. ที่มีโคโลนขี นาดเล็กไดแ้ ก่ group A, C, F หรอื G
4-2. ทดสอบหา MIC ของ penicillin ตอ่ Streptococcus spp. viridans group ทแี่ ยกไดจ้ าก sterile site
5-1. Enterococcus spp. ไม่ควรทดสอบความไวตอ่ ยาในกลมุ่ cephalosporins, aminoglycosides (ยกเวน้ high-
level), clindamycin และ trimethoprim-sulfamethoxazole เพราะผลในหลอดทดลองไมส่ อดคลอ้ งกบั ผล
การรกั ษา
5-2. ผลการทดสอบความไวของเช้ือ Enterococcus spp. ต่อ penicillin สามารถพยากรณ์ความไวของเช้ือน้ี
ต่อยา ampicillin ได้ดว้ ย
5-3. การทดสอบความไวของ Enterococcus ตอ่ ยากลุ่ม aminoglycosides ใหใ้ ช้ยาชนิดท่ีมีความเข้มขน้ สงู
(high level) ไดแ้ ก่ gentamicin (120 µg) และ streptomycin (300 µg) หากแปลผลด้อื ยา หมายถงึ ยา
ที่ทดสอบไมเ่ สริมฤทธกิ์ ับยากลมุ่ cell wall-active ไดแ้ ก่ ampicillin, penicilin, vancomycin หากแปลผล
ไวตอ่ ยา หมายถงึ ยาที่ทดสอบเสริมฤทธกิ์ ับยากลุม่ cell wall-active และหากแปลผลเปน็ intermediate
ไม่สามารถสรุปได้ ต้องท�ำการทดสอบด้วยวธิ ี MIC
5-4. Enterococcus spp. ที่ให้ผล vancomycin intermediate หรือ resistant ให้ทดสอบยืนยันด้วยการท�ำ
vancomycin agar screen plate โดยใช้ BHI agar ทเ่ี ตมิ vancomycin 6 µg/ml หรอื หา MIC ตอ่ vancomycin
6-1. CLSI ได้ปรับมาตรฐานการแปลผลของ inhibition zone และ MIC breakpoints ของ cefazolin,
ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime และ aztreonam ตามผลการรักษาด้วยยาขนาด 2 g ทุก 8 ชม. 1 g
ทุก 24 ชม. 1 gทุก 8 ชม. 1 gทกุ 8 ชม. 1 gทุก 8 ชม.ตามลำ� ดบั

การอ่าน การแปล และรายงานผลการทดสอบความไวของยากลุม่ cephalosporins (cefazolin, ceftriaxone,
cefotaxime, ceftazidime) และ aztreonam ต่อเชื้อ Enterobacteriaceae กรณีใช้ตามข้อก�ำหนดของ CLSI ฉบับ
M100-S21 ปี 2011 รายงานผลตามทไ่ี ดจ้ รงิ ควรทดสอบและรายงานการสรา้ ง ESBL เพอ่ื ประโยชนใ์ นการเฝา้ ระวงั
โรคตดิ เช้ือในโรงพยาบาล

222 คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทีเรยี และรา

6-2. Enterobacter spp., Citrobacter spp. และ Serratia spp. อาจเปล่ียนจากไวต่อยา 3rd Generation
cephalosporins เปน็ ดอ้ื ภายใน 3 หรือ 4 วนั หลังการรกั ษา ดังนั้นจึงควรทำ� การทดสอบความไวของเช้อื
กลุ่มนี้ตอ่ ยาดังกลา่ วซำ�้
6-3. ควรทดสอบความไวของเช้ือกลุ่ม Enterobacteriaceae ต่อยา ertapenem, imipenem และ meropenem
พร้อมกันเสมอเพอ่ื เฝา้ ระวงั เชื้อดอื้ ยากล่มุ carbapenem resistance Enterobacteriaceae (CRE)
7. หา้ มทดสอบความไวของเชือ้ Shigella spp. และ Salmonella spp. ตอ่ ยากลุ่ม 1stและ 2nd cephalosporins,

cephamycins และ aminoglycosides เน่ืองจากผลการทดสอบไม่สอดคลอ้ งกบั ผลการรกั ษา
8-1. ทดสอบ nalidixic acid เฉพาะตอ่ เช้ือ Salmonella spp. ท่ีแยกได้จากตัวอยา่ งนอกลำ� ไส้ (extraintestinal
Salmonella) เท่านั้น หากพบว่าด้ือยา nalidixic acid แต่ไวต่อยากลุ่ม fluoroquinolone ต้องรายงานว่า
“Extraintestinal isolates of Salmonella may not be eradicated by fluoroquinolone treatment”
8-2. ทดสอบความไวและรายงานผล 3rd generation cephalosporins เฉพาะ Salmonella spp. ทพ่ี บนอกล�ำไส้

เท่านั้น
9. เน่ืองจาก CLSI มไิ ด้ก�ำหนด interpretation break point ส�ำหรบั ยา cefoperazone-sulbactam ตอ่
Pseudomonas aeruginosa และ Acinetobacter spp. จงึ ให้ใช้ break point ของยาดงั กลา่ วส�ำหรบั เช้ือ

Enterobacteriaceae
10. การหา MIC of colistin สำ� หรับ Acinetobacter spp. ควรทดสอบดว้ ยวิธี agar หรือ broth dilution การ

ทดสอบดว้ ยวธิ ี E-test อาจใหผ้ ลทีไ่ มส่ อดคล้องกับการรกั ษา
11-1. Haemophilus spp. ตอ้ งใช้ Haemophilus test medium (HTM) ในการทดสอบความไวของเช้อื ตอ่ ยา
11-2. การทดสอบ β-lactamase เป็นวิธีท่ีรวดเร็วและถูกต้องส�ำหรับการตรวจหา TEM-type β-lactamase
ของเชื้อ Haemophilus spp. เมื่อพบว่า β-lactamase บวกให้รายงานด้ือ ampicillin และ amoxicillin
(พบ H. influenzae ทไี่ ม่สร้าง β-lactamase แตด่ ้ือ ampicillin จ�ำนวนนอ้ ยมาก)
12. ทดสอบ nalidixic acid ต่อ N. meningitidis เพื่อบ่งชี้ว่าเช้ือมีความไวตอ่ fluoroquinolone ลดลงหาก

พบว่า inhibition zone ≤ 25 mm
หมายเหตุ เชื้อแกรมลบรูปแท่งกลุ่ม non-fermentative ตัวอ่ืนๆ ท่ีไม่ใช่ Acinetobacter spp., P. aeruginosa,
S. maltophilia และ B. cepacia ตอ้ งใชว้ ธิ หี า MIC เทา่ นนั้ เนอ่ื งจากไมม่ คี า่ แปลผล การทดสอบโดยวธิ ี disk diffusion
1.2.3. แผน่ สารต้านจุลชีพ
ภาชนะที่บรรจุหลอดแผ่นยาต้องเป็นภาชนะที่มีฝาปิดสนิทกันความชื้นได้ และมีสารดูดความช้ืน ตรวจ
สอบคณุ สมบตั ิสารดูดความชน้ื และควรเปลย่ี นใหมเ่ ม่อื สเี ปลีย่ น เก็บในตู้เย็นท่ีอุณหภมู ิ 4- 8 °C เกบ็ แผน่ ยาท่ีเป็น
stock ในตู้แช่แขง็ –14 °C หรือต่ำ� กว่า สำ� หรบั แผ่นยาในกลมุ่ β-lactam ใหใ้ สใ่ นภาชนะทป่ี ิดผนกึ และเกบ็ ไว้ในตแู้ ช่
แขง็ โดยแบง่ จ�ำนวนน้อยเกบ็ ในตู้เยน็ ส�ำหรบั ใชไ้ ด้ไมเ่ กนิ 1 สปั ดาห์ ยาอ่นื ท่ไี มค่ งตวั (เช่น imipenem, cefaclor และ
ยาทมี่ ี clavulanic acid ผสมดว้ ย) จะต้องเกบ็ ในตเู้ ยน็ แชแ่ ขง็ จนกว่าจะนำ� มาใช้ และแผน่ ยาทใี่ ช้ทดสอบ ตอ้ งเป็น
แผน่ ยาท่ยี งั ไมห่ มดอายุเท่านน้ั
กอ่ นทำ� การทดสอบควรนำ� ภาชนะทบ่ี รรจแุ ผน่ ยาออกจากตเู้ ยน็ หรอื ตแู้ ชแ่ ขง็ วางทอ่ี ณุ หภมู หิ อ้ งนาน1–2ชม.
กอ่ นเปดิ ใชง้ าน เพอ่ื ปรบั อณุ หภมู ภิ ายในภาชนะใหเ้ ทา่ กบั อณุ หภมู หิ อ้ งกอ่ นเปดิ เปน็ การปอ้ งกนั ความชน้ื ทจ่ี ะเกดิ
จากการควบแน่นเมอ่ื อากาศอนุ่ กระทบแผน่ ยาเย็นทอ่ี ย่ใู นภาชนะ

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทวั่ ไป 223

1.2.4. อาหารเพาะเชอ้ื
การเตรยี ม Mueller-Hinton agar (MHA) ดรู ายละเอยี ดทภี่ าคผนวก สำ� หรบั เชอ้ื ชนดิ aerobic และ facultative
anaerobic ที่ไมส่ ามารถเจรญิ เติบโตดีบน MHA ไดแ้ ก่ Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus
pneumoniae, viridans streptococci และ β-hemolytic streptococci ตอ้ งการ supplement หรอื อาหารเล้ียงเชือ้ ชนดิ
อน่ื และจะต้องใชว้ ิธีการทดสอบดังตาราง 6-3
1.2.5. การเตรียมเชอื้ ให้ได้ความขนุ่ มาตรฐาน
การเตรียมเชือ้ ทดสอบมี 2 วิธคี ือ วิธีเตรยี มเชอื้ จากการเพาะ (growth method) และวธิ ีเตรยี มเช้อื จากโคโลนี
โดยตรง (direct colony suspension method)
1.2.5.1. วิธเี ตรียมเช้ือจากการเพาะ (growth method) วธิ นี ี้เป็นทางเลอื กอกี วิธีหนึ่ง สำ� หรับเช้อื เจริญงา่ ย
(ยกเวน้ staphylococci) โดยเฉพาะในกรณีที่เช้ือทีต่ ้องการทดสอบมีอายมุ ากเกนิ ไป (>24 ชม.) นอกจากนนั้ เป็นวธิ ี
ทเ่ี หมาะส�ำหรบั เชือ้ ทล่ี ะลายในอาหารเหลวแล้วได้ความขนุ่ ไม่สมำ�่ เสมอ
(1) เขี่ยส่วนบนของโคโลนีเดี่ยว ทีม่ ีลกั ษณะเหมอื นกนั 3-5 โคโลนี ละลายในอาหารเลย้ี งเชอื้ เหลว เช่น
TSB 4 –5 ml
(2) อบท่ี 35 ± 2 °C 2-6 ชม. ปรบั ความขนุ่ ใหเ้ ทา่ กบั ความขนุ่ มาตรฐาน 0.5 McFarland (1-2 x 108 CFU/ml)
โดยใชน้ ำ�้ เกลอื ทปี่ ราศจากเชอ้ื หรอื อาหารเลย้ี งเชอื้ เหลว วดั ความขนุ่ ดว้ ยเครอื่ งมอื วดั แสง หรอื ดดู ว้ ย
ตาในที่ท่ีมแี สงสวา่ งเพียงพอ โดยมแี ผน่ กระดาษซงึ่ มพี ้ืนเปน็ สขี าวและมีเสน้ สีด�ำวางไวด้ ้านหลงั
1.2.5.2 วธิ ีเตรยี มเชื้อจากโคโลนโี ดยตรง (direct colony suspension method) เป็นวธิ ที ีส่ ะดวกใช้ได้กบั
เชอ้ื เกอื บทกุ ชนดิ เปน็ วธิ ที แี่ นะนำ� สำ� หรบั เชอื้ เจรญิ ยาก ไดแ้ ก่ Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis
และ streptococci รวมทั้ง staphylococci ท่ดี อื้ methicillin หรอื oxacillin

(1) เขยี่ ส่วนบนของโคโลนีเด่ียวอายุ 18-24 ชม.ใสใ่ นนำ�้ เกลือ หรืออาหารเลยี้ งเชื้อเหลว
(2) ปรับความขุ่นให้เท่ากับความขุ่นมาตรฐาน 0.5 McFarland (1-2 x 108 CFU/ml)โดยใช้น้�ำเกลือท่ี
ปราศจากเชอ้ื หรอื อาหารเลย้ี งเชอ้ื เหลว วดั ความขนุ่ ดว้ ยเครอื่ งมอื วดั แสง หรอื ดดู ว้ ยตาในทที่ ม่ี แี สง
สวา่ งเพียงพอ โดยมีแผน่ กระดาษซึง่ มพี ้ืนเปน็ สขี าวและมเี ส้นสดี �ำวางไว้ด้านหลงั
1.2.6 ข้ันตอนการทดสอบความไวของเช้อื ชนดิ เจรญิ ไวตอ่ ยาโดยวิธี Disk diffusion test
1.2.6.1. การเพาะเชือ้ ลงบนจานทดสอบ
(1) ภายใน 15 นาที ใชไ้ มพ้ นั สำ� ลปี ราศจากเชอื้ จมุ่ เชอื้ ทปี่ รบั ความขนุ่ แลว้ กดดา้ นขา้ งของ หลอดเหนอื
ระดับนำ�้ ให้หมาดๆ
(2) ป้ายเชือ้ ลงบน MHA ที่ผิวหน้าแห้งแล้ว 3 ระนาบ โดยหมุนจานไป 60 องศา ขั้นสดุ ท้าย ให้วนไม้
พันสำ� ลีรอบขอบวุ้น
(3) อาจเปิดฝาจานไว้ได้ 3-5 นาที แต่ไมเ่ กนิ 15 นาที เพอื่ ลดความชน้ื ทม่ี ีมากเกินไป
1.2.6.2 การวางแผ่นยาลงบนจานท่ปี า้ ยเชือ้ แลว้
(1) วางแผน่ ยาลงบนอาหารหลังปา้ ยเชือ้ ไมเ่ กิน 15 นาที ควรใหจ้ ุดกลางของแผ่นยาแต่ละแผ่นอยูห่ า่ งกนั
อยา่ งนอ้ ย 24 mm กดแผน่ ยาใหแ้ นบกบั ผิวหนา้ วางแผ่นยาไม่เกิน 12 แผน่ บนจานขนาดเส้นผ่า

224 คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

ศนู ย์กลาง 150 mm หรอื ไมเ่ กิน 5 แผน่ บนจานขนาด 100 mm หา้ มยา้ ยทแี่ ผ่นยาหลังวางลงบนอาหาร
แล้วเน่ืองจากยากระจายลงในอาหารได้ทันที ไม่ควรวางแผ่นยาใกล้ขอบจานอาหารจนเกินไปเพราะ
inhibition zone ของยาจะไมค่ รบวง
(2) หลังจากวางแผ่นยา น�ำไปใส่ในตู้อบเช้ืออุณหภูมิ 35 ± 2 °C ภายใน 15 นาที (ทอี่ ณุ หภมู มิ ากกวา่
35 °C จะไมส่ ามารถตรวจหา MRSA ได้) กรณีเช้ือเจริญยากอบในบรรยากาศ CO2
1.2.6.3 การอ่านและการแปลผล
(1) อ่านผลหลังจากอบเช้ือ 16-18 ชม. ส�ำหรับเชื้อเจริญไว ยกเว้น Burkholderia cepacia,
Acinetobacter spp. และ Stenotrophomonas maltophilia ตอ้ งอบ 20-24 ชม. สำ� หรบั เชอื้ เจรญิ ยากตอ้ ง
อบใหค้ รบ 24 ชม. ยกเวน้ Haemophilus spp. อบเชื้อ 16-18 ชม. ใหว้ ดั เสน้ ผ่านศูนยก์ ลางของ zone ท่ี
มีการยับยง้ั เชอื้ อยา่ งสมบรู ณ์ (โดยดูดว้ ยตาเปลา่ )
(2) การวดั zone ให้วดั เป็น mm โดยใช้ calipers หรอื ไมบ้ รรทัดวางบนดา้ นหลงั ของจานทดสอบ โดยถือ
จานในระยะเหนอื พ้ืน 2-3 นิ้ว นอกจากนมี้ ีข้อยกเว้นดงั นี้
- อาหารเลยี้ งเชื้อทผี่ สมเลอื ด ให้เปิดฝาจานทดสอบไว้และวัด zone จากด้านบนของ
อาหารโดยมีแสงส่องด้านหนา้ (reflected light)
- การตรวจหา methicillin resistance ของเช้อื Staphylococcus spp. ใหอ้ บเช้ือไวน้ าน 24 ชม.
- การตรวจหา vancomycin ของเชื้อ Enterococcus spp. ใหอ้ บเช้อื ไว้นาน 24 ชม.
- ถ้าใชแ้ ผ่นยา linezolid ทดสอบเช้อื Staphylococcus spp. ใหอ้ ่าน inhibition zone ดว้ ย
ไฟส่องหลงั จาน (transmitted light)
(3) ขอบของ zone จะกำ� หนดจากบริเวณทไี่ มม่ ีเชอ้ื โดยดดู ว้ ยตาเปลา่ ถา้ ใช้แว่นขยายเหน็ มเี ชือ้ ขึน้ เปน็
โคโลนีเลก็ ทรี่ มิ zone ถือว่าไม่มีเชอ้ื อย่างไรก็ตาม
- ถ้ามโี คโลนเี กดิ ข้ึนอย่างชดั เจนใน inhibition zone ควรท�ำการทดสอบใหม่ ถา้ ยงั มีโคโลนขี ึน้
อยา่ งชดั เจนใน zone อกี ใหว้ ดั ความกว้างของ zone ด้านในตรงบรเิ วณท่ีไมม่ ีเชือ้ ข้นึ
- เช้ือในกลมุ่ Proteus spp. อาจจะแผ่ปกคลุมบรเิ วณท่ีเชื้อถูกยบั ย้ังรอบแผน่ ยา ใหว้ ัด inhibition
zone ทเี่ หน็ ขอบชดั โดยไมส่ นใจเชื้อที่แผบ่ าง ๆ (swarm) ภายใน inhibition zone
- ในการทดสอบเชอ้ื streptococci ทใ่ี ห้ hemolysis ให้วดั zone ตรงท่เี ชื้อเร่มิ ไม่ข้ึน ไม่ใช่ zone ทีม่ ี
การแตกของเม็ดเลอื ดแดง
- ในการทดสอบ trimethoprim และ sulfonamides ให้วัด inhibition zone ที่เห็นขอบคอ่ นข้างชดั
โดยไมส่ นใจเช้ือท่ีข้นึ เล็กนอ้ ย (≤ 20%) ภายใน inhibition zone
(4) การแปลผลความกว้างของ zone ยบั ยง้ั เชือ้ ให้ ดใู นตารางที่ 2A ถึงตารางท่ี 2I ใน CLSI M100-S24
ให้รายงานเปน็ S (susceptible), I (intermedite) หรอื R (resistant) ต่อยาทใี่ ชท้ ดสอบ ยาบางชนดิ
รายงานได้เพยี ง susceptible หรอื nonsusceptible เน่อื งจากมขี อ้ มูลค่า break point เฉพาะsusceptible
เท่านั้นเพราะยังไม่มีการด้ือยามาก่อนหรือมีเชื้อที่ดื้อยาน้อยมาก ในการบันทึกผลการทดสอบควร
บนั ทกึ ขนาด inhibition zone ด้วยเพ่อื เป็นขอ้ มูลใชว้ ิเคราะห์แนวโน้มการด้ือยา

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 225

ตารางที่ 6-2 สรุปยอ่ การทดสอบความไวของเชื้อชนิดเจรญิ ไวตอ่ สารตา้ นจุลชีพโดยวธิ ี disk diffusion test

Organisms Medium 0.5IMnoccFualurmland Incubation Incubation Time Comments/Modifications

Enterobacteriaceae MHA DCS ใน MHB 35±2 °C; 16 - 18 ชม. ESBL production
หรอื saline, ambient air Carbapenemase production
GM: TSB,
2-6 ชม.

Pseudomonas MHA DCS ใน MHB 35± 2 °C; 16 - 18 ชม.
aeruginosa หรือ saline, ambient air
GM: TSB,
2-6 ชม.

Acinetobacter spp. MHA DCS ใน MHB 35± 2 °C; 20 - 24 ชม.
หรือ saline, ambient air
GM: TSB,
2-6 ชม.

Burkholderia MHA DCS ใน MHB 35± 2 °C; 20 - 24 ชม.
cepacia หรอื saline, ambient air
GM: TSB,
2-6 ชม.

Stenotrophomonas MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม.
maltophilia หรอื saline, ambient air
GM: TSB,
2-6 ชม.

Staphylococcus spp. MHA DCS ใน MHB 35 ± 2 °C; 16-18 ชม. ; β –lactamase test
หรอื ใน saline ambient air 24 ชม.สำ� หรบั D-test (Inducible clindamycin resistance)
(การทดสอบ S. aureus ต่อยา
ที่อุณหภมู ิ > oxacillin;
35 °C 24 ชม. สำ� หรบั Examine oxacillin, vancomycin, and
อาจตรวจไม่ staphylococci ทกุ linezolid zones carefully with
พบ MRSA) species ตอ่ ยา transmitted light for small colonies or
vancomycin; haze inside the zone of inhibition; any
24 ชม.ส�ำหรบั growth = resistance. Vancomycin disk
coagulase-negative diffusion testing is not recommended
staphylococci for coagulase-negative staphylococci.
ต่อยา cefoxitin

226 คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

ตารางที่ 6-2 สรุปย่อการทดสอบความไวของเชอ้ื ชนดิ เจรญิ ไวต่อสารต้านจุลชพี โดยวิธี disk diffusion test (ต่อ)

Organisms Medium 0.5IMnoccFualurmland Incubation Incubation Time Comments/Modifications

Aeromonas spp. & MHA DCS ใน MHB 35 °C 16-18 ชม.
Plesiomonas หรือ saline จาก
shigelloides เ ช้ื อ ท่ี ข้ึ น บ น
nonselective
medium eg. BA
นาน 18-24 ชม.

Moraxella MHA DCS 5% CO2 20-24 ชม. β –lactamase test
catarrhalis

Pasteurella spp. MHA DCS 16-18 ชม.
*DCS = direct colony suspension ใน MHB หรอื saline จากเชือ้ ทขี่ ึ้นบน nonselective medium eg. BA
GM = growth method MRS = methicillin-resistant staphylococci.

ตารางที่ 6-3 สรปุ ยอ่ การทดสอบความไวของเชอื้ fastidious แบคทเี รยี ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี โดยวธิ ี disk diffusion test

Organism Medium 0.5 McFarland Incubation Incubation Time Comments/Modifications
Inoculum

Enterococcus spp. MHA Direct colony 35 ± 2 °C; 16 – 18 ชม. Examine vancomycin zones
suspension ใน MHB ambient air 24 ชม. สำ� หรับ carefully with transmitted light for
หรือใน saline, หรือ vancomycin small colonies or haze inside the
วธิ ี growth method 16 – 18 ชม. zone of inhibition; any growth
= resistance.
Haemophilus Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม. β–lactamase test,
influenzae, suspension ใน MHB Test a maximum of 9 disks
หรอื ใน saline (โดยใช้ 5% CO2 on a 150 mm plate and 4 disks
Haemophilus on a 100 mm plate
parainfluenzae เชื้อที่อบนาน 20-24
ชม.บน CA) Test a maximum of 9 disks on a 150
Neisseria GC agar Direct colony 36 ± 1 °C mm plate and 4 disks on a
gonorrhoeae base with suspension ใน MHB (ห้ามเกนิ 100 mm plate
1% defined or 0.9% phosphate 37 °C); For some agents, eg, fluoroquinolones
supplement buffered saline, pH or cpholosporins, only 2 to 3 disks
7.0, (โดยใช้เช้ือท่ีอบ 5% CO2 may be tests pre plate

ไวน้ าน 20-24 ชม.บน
CA อบท่ี 5% CO2)

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 227

ตารางที่ 6-3 สรปุ ยอ่ การทดสอบความไวของเชอื้ fastidious แบคทเี รยี ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี โดยวธิ ี disk diffusion test (ตอ่ )

Organisms Medium 0.5 McFarland Incubation Incubation Time Comments/Modifications
Inoculum

Streptococcus MHA with Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม. Test a maximum of 9 disks on a 150
pneumoniae BA suspension ใน MHB 5% CO2 mm plate and 4 disks on a 100 mm
หรอื ใน saline (โดยใช้ plate.
เชื้อท่ีอบไว้นาน 18- Measure the zone of growth
20 ชม. บน BA) inhibition, not the zone of
inhibition of hemolysis.

Streptococcus spp. MHA with Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม. D-test (β-streptococci)
BA suspension 5% CO2 Test a maximum of 9 disks
ใน MHB หรอื ใน on a 150 mm plate and 4 disks
saline on a 100 mm plate
Measure the zone of growth
inhibition, not the zone of
inhibition of hemolysis.

Neisseria MHA with Direct colony 35 ± 2 °C; 20 - 24 ชม. Test a maximum of 5 disks on a 150
meningitidis BA suspension ใน MHB 5% CO2 48 ชม. mm. plate and 2 disks on a 100 mm.
หรือใน saline 24 ชม. plate.
Campylobacter (โดยใช้เชื้อท่ีอบไว้ Caution: Perform all testing in a
jejuni/ coli นาน 20- 24-ชม. CA BSC.
plate อบ ที่ 5% CO2)
BMHA DCS 36-37 °C
or
42 °C
18055%%%CONO2,22,

1.3 การควบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเช้อื ตอ่ สารตา้ นจุลชีพ
จดุ มงุ่ หมายของการควบคมุ คณุ ภาพเพอ่ื ตดิ ตามความแมน่ ยำ� ถกู ตอ้ งของวธิ กี าร นำ�้ ยาทดสอบอาหารเลยี้ งเชอื้
แผน่ ยาและสมรรถนะของผปู้ ฎิบัติการทดสอบ อา่ น และแปลผล ดงั นั้นวธิ ีทดี่ ีท่ีสดุ ในการควบคุมคุณภาพ คือการ
เลอื กใชเ้ ชอื้ มาตรฐานอา้ งองิ เพอื่ นำ� มาทดสอบตามวธิ ที ด่ี ำ� เนนิ การอยแู่ ละตรวจสอบผลวา่ ตรงตามทคี่ วรจะเปน็ หรอื ไม่
1.3.1. การควบคมุ คุณภาพภายในส�ำหรับเชอ้ื กอ่ โรคทีเ่ จริญเร็ว (rapid-growing aerobic pathogens)
หอ้ งปฎบิ ตั กิ ารทกุ แหง่ ทท่ี ำ� การทดสอบความไวของยาตอ่ เชอ้ื เจรญิ งา่ ย (nonfastidious bacteria) อยา่ ง
น้อยตอ้ งมีเชื้อมาตรฐาน 6 เช้ือ (จากแหล่งทเี่ ช่อื ถือและสามารถสอบกลับได)้ สำ� หรับควบคุมคุณภาพ ดงั น้ี E. coli

228 คูม่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รยี และรา