คู่มือปฏิบัติการแบคทีเรียและเชื้อรา กรมวิทย์ 2561

ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniac ATCC 49619,
and E. coli ATCC 35218 (ส�ำหรบั ควบคมุ คณุ ภาพการทดสอบดว้ ยแผน่ ยา β-lactamase inhibitor combinations
containing clavulanic acid, sulbactam, or tazobactam) และ Enterococcus faecalis ATCC 29212 (ส�ำหรับควบคุม
การทดสอบการใช้แผน่ ยา trimethoprim หรอื sulfonamides a high concentration of gentamicin or streptomycin
(ดูรายชื่อเช้ืออ่ืนๆ ที่ทดสอบและเชื้ออ้างอิงท่ีใช้ควบคุมคุณภาพจากตารางท่ี 6-4 และ 6-5 และดูคุณลักษณะของ
เช้อื มาตรฐานจากตารางท่ี 6-6)
เชื้อส�ำหรับควบคุมคุณภาพจะต้องได้รับการทดสอบโดยวิธีมาตรฐานการทดสอบกับแผ่นยา โดยในอาหาร
ทดสอบและวธิ ีการเชน่ เดียวกับเช้ือทแ่ี ยกไดจ้ ากผ้ปู ่วย
ค่าควบคุมต่�ำสุดและสูงสุดที่ควรจะเป็นในการควบคุมคุณภาพ มีก�ำหนดอยู่ในเอกสารอ้างอิงของ CLSI
หากผลการควบคุมคณุ ภาพของห้องปฏิบตั ิการผดิ พลาดจากค่าควบคมุ 1 ครง้ั ใน 20 คร้ัง ถอื ว่ายอมรับได้ แต่ถา้
ความผิดพลาดมมี ากกว่านีจ้ ะต้องหาสาเหตุและทำ� การแก้ไขทันที

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 229

230 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา ตารางที่ 6-4 เชื้อท่ที ดสอบและเช้อื อ้างองิ ท่ใี ชค้ วบคมุ คุณภาพการทดสอบความไวของเชื้อต่อสารต้านจลุ ชีพ โดยวิธี disk diffusion test (M100-S23)

ควเชบือ้ คอุมา้ คงอณุ ิงภทาีใ่ พช้ E. coli E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa S. aureus S. aureus E. faecalis H. influenzae H. influenzae N. gonorrhoeae S. pneumoniae
ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 700603 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 29212 ATCC 49247 ATCC 49766 ATCC 49226 ATCC 49619
เชอื้ ท่ีทดสอบความไว
Enterobacteriaceae ✓ ✓* ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓
✓* ✓ ✓
Pseudomonas aeruginosa ✓ ✓* ✓ ✓
✓* ✓
Acinetobacter spp. ✓ ✓* ✓
✓*
Stenotrophomonas maltophilia ✓ ✓*
✓
Burkholderia cepacia ✓**
Other non- Enterobactericeae ✓
difdf✓uisskion dmile✓uthtioodn
Staphylococcus spp. difdf✓uisskion

Enterococcus spp. dmile✓utthioodn

Haemophilus influenzae and ✓
Heamophilus parainfluenzae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
β-hemolytic Group
Streptococcus spp. ✓

viridans Group
* For β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations
** When testing amoxicillin-clavulanic acid

ตารางท่ี 6-5 เชือ้ ท่ีทดสอบและเช้ืออา้ งอิงทใ่ี ชค้ วบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเชอ้ื ต่อสารต้านจลุ ชพี (M45-A2)

ควเชบอื้ คอมุ า้ คงอุณิงภทาีใ่ พช้ E. coli E. coli P. aeruginosa S. aureus S. aureus S. pneumoniae C. jejuni H. pylori
ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 49619 ATCC 33560 ATCC 43504
เชื้อท่ที ดสอบความไว disk d✓iffusion micmroe✓dthiloudtion
Abiotrophia spp. and Granulicatella spp. ✓ ✓** dilution✓method ✓
disk di✓ffusion
Asehriogmeloonidaess spp. and Plesiomonas ✓ ✓** disk d✓iffusion ✓
Bacillus spp. (not B. anthracis)
Campylobacter jejuni / coli ✓**
✓**
สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 231 CoCr.ydniepbhatchteerriiauem spp. including for gen✓tamicin ✓
Erysipelothrix rhusiopathiae ✓
HACEK Group**** for gen✓tamicin ✓
Helicobacter pylori for gen✓tamicin
Lactobacillus spp. ✓
dilution✓method ✓
Leuconostoc spp. ✓

Listeria monocytogenes ✓
Moraxella catarrhalis ✓

Pasteurella spp. for gen✓tamicin
Pediococcus spp.

232 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา ตารางท่ี 6-5 เชอ้ื ที่ทดสอบและเชือ้ อ้างอิงทใี่ ช้ควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเชือ้ ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี (M45-A2) (ตอ่ )

ควเชบ้ือคอมุ ้าคงอุณิงภทาี่ใพช้ E. coli E. coli P. aeruginosa S. aureus S. aureus S. pneumoniae C. jejuni H. pylori
ATCC 25922 ATCC 35218 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 49619 ATCC 33560 ATCC 43504
เช้อื ท่ีทดสอบความไว
✓
Vibrio spp. (including V. cholerae) ✓**

Burkholderia pseudomallei ✓ ✓** ✓

Burkholderia mallei ✓ ✓

Francisella tularensis ✓ ✓ ✓

Bacillus anthracis ✓ ✓

Brucella spp. ✓ ✓

Yersinia pestis ✓


* disk diffusion (amoxicillin-clavulinic acid and doxycycline)
** for β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations
*** when testing amoxicillin-clavulanic acid
**** HACEK group = Aggregatibacter spp. formerly Haemophilus aphrophilus, H. paraphrophilus, H. segnis, Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Cardiobacterium spp. Eikenella corrodens and Kingella spp.

ตารางที่ 6-6 คุณลักษณะของเชอ้ื มาตรฐานสำ� หรบั ใช้ในการควบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเช้ือแบคทเี รียตอ่ สารต้านจลุ ชพี

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Tests MIC Tests Screening Tests Other
Bacteroides fragilis
ATCC 25285 β-lactamase positive All anaerobes
Bacteroides thetaiotaomicron
ATCC 29148 β-lactamase positive All anaerobes
Clostridium difficile
ATCC 700057 β-lactamase negative Gram-positive antimicrobial
Enterococcus faecalis agents
ATCC 29212 Nonfastidious gram-positive Vancomycin agar AAssmbHscbttsseruaareeisieotmltssntifdctsssotohhei.onssunt/nmuuhlmacoiiomfoitttopcaafnioorrbbrdtoifriiedmelldMniiaoitttplyyMruuitnoeootIilmffCoelenayrc.c-hin
bacteria HLAR
Enterococcus faecalis High-level
ATCCa 51299 mupirocin resistance
Escherichia coli MIC test
ATCC 25922
Escherichia coli Resistant to vancomycin Vancomycin agar
ATCC 35218 (VanB) and high-level HLAR
Eubacterium lentum aminoglycosides
ATCC 43055 β-lactamase negative Nonfastidious gram-negative Nonfastidious gram-negative
สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 233 bacteria bacteria
Neisseria meningitidis N. meningitidis
Contains plasmid-encoded β-lactam/β-lactamase β-lactam/β-lactamase
TEM-1 inhibitor combinations inhibitor combinations
β-lactamase (non-ESBa,Lb),e,f

All anaerobes

234 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา ตารางท่ี 6-6 คณุ ลกั ษณะของเช้อื มาตรฐานสำ� หรบั ใช้ในการควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเช้อื แบคทเี รียตอ่ สารตา้ นจลุ ชีพ (ตอ่ )

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Tests MIC Tests Screening Tests Other
Haemophilus influenzae Haemophilus spp.
ATCC 49247 BLNAR Haemophilus spp.
Haemophilus influenzae
ATCC 49247 Ampicillin susceptible Haemophilus spp. Haemophilus spp.(more
Klebsiella pneumoniae (more reproducible with reproducible with selected
ATCC 700603 Contains SHV-18 ESBL selected β-lactams) β-lactams)
Neisseria gonorrhoeae CMRNG ESBL screen and ESBL screen and
ATCC 49226 confirmatory tests confirmatory tests
Pseudomonas aeruginosa N. gonorrhoeae N. gonorrhoeae
ATCC 27853
Contains inducible AmpC Nonfastidiousgram-negative Nonfastidious gram negative Assess suitability of cation
Staphylococcus aureus β-lactamase bacteria bacteria content in each batch/lot
ATCC 25923 of Mueller-Hinton for
β-Lactamase negative Nonfastidious gram-negative High-level mupirocin gentamicin MIC and disk
mecA negative bacteria resistance disk diffusion.
diffusion test
Little value in MIC testing
due to extreme Inducible
susceptibility to clindamycin
most drugs resistance disk
diffusion test
(D-zone test)

ตารางที่ 6-6 คณุ ลักษณะของเช้ือมาตรฐานสำ� หรับใช้ในการควบคมุ คุณภาพการทดสอบความไวของเช้ือแบคทีเรยี ต่อสารต้านจุลชพี (ตอ่ )

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Tests MIC Tests Screening Tests Other
Staphylococcus aureus Weak β-lactamase–
ATCC 29213 Nonfastidious gram-negative Oxacillin agar Assess suitability of cation
producing strain bacteria High-level content in each batch/lot
Staphylococcus aureus mecA negative mupirocin resistance of Mueller-Hinton for
ATCC 43300 MIC test gentamicin MIC and disk
Staphylococcus aureus Inducible diffusion.
ATCC BAA-1708 clindamycin
Streptococcus pneumoniae resistance MIC test
ATCC 49619 Oxacillin-resistant, Cefoxitin disk diffusion Cefoxitin MIC testing Oxacillin agar
Supplemental QC Strains mecA positive testing
High-level mupirocin High-level mupirocin
resistance mediated by resistance test
the mupA gene
Penicillin intermediate by S. pneumoniae S. pneumoniae Inducible clindamycin
altered penicillin binding Streptococcus spp. Streptococcus spp. resistance MIC test
protein N. meningitidis N. meningitidis

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป 235 Enterococcus faecalis Alternative to E. faecalis
ATCC 33186 ATCC 29212 to assess
Haemophilus influenzae suitability of medium for
ATCC 10211 sulfonamide or trimethoprim
MIC and disk diffusion
tests.d End points are the
same as for E. faecalis
ATCC 29212.
Assess each batch/lot for
growth capabilities of HTM.

236 คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา ตารางที่ 6-6 คุณลกั ษณะของเชอ้ื มาตรฐานสำ� หรบั ใช้ในการควบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเช้อื แบคทเี รยี ตอ่ สารตา้ นจลุ ชพี (ตอ่ )

Quality Control Strain Organism Characteristic Disk Diffusion Tests MIC Tests Screening Tests Other
Klebsiella pneumoniae Penicillin zone-edge test
ATCC BAA-1705 KPC-producing strain Phenotypic confirmatory
Klebsiella pneumoniae MHT positive test for carbapenemase
ATCC BAA-1706 production (MHT)

Supplemental QC Strainsg Resistant to carbapenems Phenotypic confirmatory
by mechanisms other than test for carbapenemase
Staphyloccus aureus carbapenemase production (MHT)
ATCC® 29213 MHT negative
Staphyloccus aureus
ATCC BAA-976 Weak -lactamase producing
strain · mecA negative
Staphyloccus aureus
ATCC BAA-977 Contains msrA-mediated Assess disk approximation
macrolide-only resistance testswitherythromycinand
clindamycin (D-zone test
negative)

Contains inducible ermA Assess disk approximation
mediated resistance tests with erythromycin and
clindamycin (D-zone test
positive)

การเกบ็ และการใช้เช้อื สำ� หรับควบคุมคณุ ภาพ
• เชอ้ื ทจี่ ะเกบ็ ไวเ้ ปน็ เวลานาน (stock culture) ควรเกบ็ เชอื้ ทอ่ี ณุ หภมู ิ –20 °C หรอื ตำ�่ กวา่ โดยใสใ่ นอาหารเหลว
ท่ีมี stabilizer ทีเ่ หมาะสม เชน่ TSB ทีใ่ ส่ 50% fetal calf serum หรอื ใส่ 10-15 % glycerol อาจใช้ skim milk หรอื
defibrinated blood แทน TSB ได้ เก็บในรปู แบบ freeze-dried โดยไมม่ ีความเส่ยี งตอ่ การเปล่ยี นแปลงความไวต่อ
สารตา้ นจลุ ชพี
• เชอื้ ส�ำหรบั ควบคมุ คุณภาพทใ่ี ชง้ าน (working culture) ควรเกบ็ บน TSA Slant (สำ� หรบั เชื้อเจริญงา่ ย) หรือ
บน enriched CA slant /BA slant (สำ� หรบั เชอ้ื เจรญิ ยาก) ทอี่ ณุ หภูมิ 2-8 °C และน�ำมาเพาะใหมท่ กุ สัปดาห์เปน็
เวลาไม่เกนิ 4 สัปดาหต์ ิดต่อกนั แล้วเตรยี มเชื้อใหมจ่ าก stock culture
• กอ่ นการทดสอบให้เพาะเชือ้ บนจานอาหารเพ่ือให้ได้โคโลนีเดยี่ ว ส�ำหรบั stock culture ควรนำ� มาเพาะซ�ำ้ 2
ครั้งกอ่ นนำ� ไปทดสอบ
• น�ำเชื้อที่ใช้ในการควบคุณภาพไปท�ำการทดสอบตามขั้นตอน เช่นเดียวกับเช้ือตัวอย่างที่ต้องการทดสอบ
ความไวต่อสารต้านจุลชพี
• ผลการทดสอบเชอื้ ควบคมุ คณุ ภาพจะตอ้ งอยใู่ นเกณฑท์ ยี่ อมรบั ได้ หากไมอ่ ยใู่ นเกณฑ์ อาจเพราะวธิ กี ารทไี่ ม่
ถกู ตอ้ ง หรอื เชอ้ื มาตรฐานที่ใช้ทดสอบไม่ไดม้ าตรฐาน ควรเปลยี่ นเช้อื มาตรฐานสำ� หรับควบคมุ คุณภาพใหม่
• เชอื้ E. coli ATCC 35218 และ K. pneumoniae ATCC 700603 ทใี่ ชใ้ นการควบคมุ มาตรฐานของการทดสอบ
มรี ายงานพบการสญู เสยี plasmid สำ� หรับการควบคมุ β-lactamase เมื่อมกี าร subculture หลายครั้ง ทำ� ให้ผลการ
ควบคุมคณุ ภาพอยนู่ อกขอบเขตที่ยอมรับได้
การใชเ้ ชอ้ื ควบคุมคณุ ภาพ
1. นำ� เชอื้ ท่ีเกบ็ รักษาในตูแ้ ช่แขง็ หรือเช้อื ที่ subculture ใหม่จากที่เกบ็ รกั ษา (stock culture) ไว้

2. Subculture เชื้อบนอาหารเล้ียงเชื้อทเี่ หมาะสมและอบให้เชอ้ื เจริญ (primary subculture)

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 237

3. Subculture ในหลอดอาหาร (slant) หรอื จานอาหารเล้ยี งเชื้อ อบ และเกบ็ ในสภาวะท่ีเหมาะสมกบั ชนิดเชอ้ื
และนำ� มา subculture ใชใ้ นสัปดาหท์ ีห่ น่งึ ไดเ้ ป็นเวลา 7 วนั จากวันที่ 1 ถงึ วันที่ 7 สำ� หรับเปน็ working culture
4. ทกุ สปั ดาห์ subculture เช้อื จาก slant หรอื จานอาหาร working culture วันที่ 1 (ในขอ้ 3) เกบ็ ในอณุ หภูมิ
ทีเ่ หมาะสมสำ� หรบั ใชใ้ นสัปดาหท์ ่ี 2

5. ด�ำเนินการซ้�ำได้จนถึงสัปดาห์ท่ี 3 และ 4 หลังจากน้ันทิ้งเชื้อนี้ และน�ำเช้ือจาก stock ในข้อ 1 ด�ำเนินการ
ตามข้อ 2-5 ต่อไป

คา่ ยอมรบั ของ zone ยบั ย้งั
ผลการทดสอบความไวของเช้ือมาตรฐานทีใ่ ชค้ วบคมุ คุณภาพตอ่ ยาแตล่ ะชนดิ ต้องไดค้ ่าเสน้ ผา่ นศูนย์กลาง
zone ยับย้ังอยู่ในชว่ งท่ียอมรบั ได้ ดังแสดงในตาราง CLSI : M100-S24

ความถข่ี องการทดสอบเพือ่ ควบคมุ คุณภาพ
ควบคมุ คณุ ภาพทง้ั ระบบโดยใชเ้ ชอื้ มาตรฐานทเ่ี หมาะสมทดสอบกบั ยาแตล่ ะชนดิ ทกุ วนั 20-30 วนั ตดิ ตอ่ กนั
ผลการทดสอบผดิ พลาดได้ไม่เกนิ 1 ใน 20 หรอื 3 ใน 30 ครงั้ กรณที ี่ผลไมอ่ ยใู่ นเกณฑ์ ตอ้ งหาสาเหตแุ ละปฏบิ ตั กิ าร
แก้ไขทันที และท�ำการทดสอบใหม่ต่อเนื่องกันเป็นเวลา 5 วัน เมื่อผลอยู่ในค่าท่ียอมรับได้ จึงเริ่มท�ำการทดสอบ
ประจำ� วันได้

การทดสอบความไวของเช้ือตอ่ ยาที่เปน็ งานบรกิ ารประจ�ำวนั ตอ้ งท�ำการควบคุมคณุ ภาพอยา่ งนอ้ ยสปั ดาห์
ละ 1 ครง้ั กรณีห้องปฏบิ ัติการทท่ี �ำการทดสอบไม่เปน็ ประจำ� จะตอ้ งท�ำการควบคุมคุณภาพทกุ ครั้ง

238 คมู่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทีเรยี และรา

การแก้ไขข้อผดิ พลาด
ข้อผิดพลาดทเี่ ป็นสาเหตใุ ห้ผลการทดสอบอย่นู อกเกณฑ์ยอมรบั ไดแ้ ก่
• เชือ้ ทใี่ ช้สำ� หรบั ควบคมุ คุณภาพ
• วสั ดแุ ละสารท่ีใช้
• ขบวนการทดสอบ
• เคร่ืองมือ
การรายงานผลของผู้ปว่ ยในกรณผี ลการควบคุมคุณภาพอยู่นอกเกณฑท์ ่ียอมรบั
ไม่รายงานผลการทดสอบ ตรวจสอบทบทวนรูปแบบความไวของเชื้อต่อยาของผู้ป่วยแต่ละคนท่ีเคยท�ำมา
ก่อน หรือทบทวน antibiogram ทเ่ี คยรวบรวมไว้ และใช้วธิ ีการทดสอบอน่ื หรอื ส่งตอ่ ไปทดสอบทหี่ อ้ งปฏิบตั ิการ
อ้างอิงจนกว่าปัญหาจะไดร้ ับการแกไ้ ข
ขบวนการควบคมุ อ่นื ๆ
• การควบคมุ คณุ ภาพความเขม้ ข้นของเชอ้ื ทดสอบ
• ควบคุมการอา่ นคา่ สำ� หรับแปลผล
ข้อจำ� กัดของวิธที ดสอบความไวโดยใชแ้ ผน่ ยา (Disk diffusion methods)
การศึกษาในขณะนี้การทดสอบโดยวิธี Disk diffusion ยังไม่เพียงพอที่จะสร้างมาตรฐาน ที่ให้ผลถูกต้อง
แมน่ ยำ� สำ� หรบั การแปลผล เชอ้ื บางชนดิ อาจตอ้ งทดสอบโดยวธิ หี าคา่ MIC (dilution method) ถา้ มคี วามจำ� เปน็ การ
ใชว้ ธิ ี dilution method อาจเปน็ วธิ ีทดสอบที่เหมาะสมทีส่ ดุ ซึ่งอาจตอ้ งส่งเช้อื ไปยังห้องปฏบิ ตั กิ ารอา้ งองิ
ผลทีท่ �ำให้เกิดการเขา้ ใจผิด
ผลการทดสอบความไวของยาบางกลุม่ ต่อเชอ้ื บางชนิด อาจรายงานว่ายาไวต่อเช้อื ทง้ั ๆทเี่ ช้อื น้นั ดือ้ ยา ทำ� ให้
เขา้ ใจผิดซึ่งกอ่ ใหเ้ กดิ อันตรายต่อผปู้ ่วย ได้แก่ การทดสอบยาต่อเช้ือดงั ตอ่ ไปนี้
• 1st และ 2nd -generation cephalosporins, cephamycins และ aminoglycosides ตอ่ เช้ือ Samonella และ
Shigella spp.
• Penicillins, β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations, cephems (ยกเวน้ cephalosporins with
anti-MRSA activity), และ carbapenems ตอ่ เช้ือ oxacillin-resistant Staphylococcus spp. (MRSA)
• Aminoglycosides (ยกเวน้ high concentrations), cephalosporins, clindamycin และ
trimethoprim-sulfamethoxazole ต่อเชอ้ื Enterococcus spp.
ปรากฏการณ์ดือ้ ยาระหว่างการรักษาและการทดสอบซ�้ำ
เชน่ เชเชอื้ ื้อจลุ Eชnพี teบroางbชacนteดิ rอsาpจpก.,ลCายitจrาoกbไaวcเtปerน็ sดpอ้ืpห. แรลอื ดะอ้ื Sปeาrrนaกtiaลาsงppเม. อ่ืกผับปู้ ยว่ากยไลดมุ่ ร้ บั3rกdาร-gรeกั nษeาrดatว้ioยnยาcเeดpมิ hภoาloยsใpนo3rin–s4เวชนัอ้ื
P. aeruginosa กับสารต้านจุลชีพทุกชนิด และเชื้อ staphylococci กับ quinolones ส�ำหรับ S. aureus ที่ไว

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทว่ั ไป 239

vancomycin อาจกลายเป็นดื้อหลังใช้รักษาผู้ป่วยเป็นระยะเวลานาน จึงต้องท�ำการทดสอบความไวของเช้ือชนิด
เดยี วกันซ้ำ� ทกุ ครั้ง ทีแ่ ยกได้ในระหว่างการรกั ษา
การตรวจคดั กรองการดื้อยา
ผลที่ได้จากการทดสอบคัดกรองบางวิธีนี้อาจมีความไวและความจ�ำเพาะเพียงพอ สามารถออกผลและ
พิจารณารกั ษาผูป้ ่วยไดโ้ ดยไม่ตอ้ งทดสอบด้วยวิธอี นื่ อกี บางวธิ ีจะตอ้ งทดสอบดว้ ยวธิ ีอ่ืนเพิ่มเพอื่ ยนื ยนั
ตารางท่ี 6-7 รายการตรวจคดั กรองการดอ้ื ยาตามชนดิ การดอื้ ยาทแ่ี สดงออก (Phenotype) หรอื ตามกลไกการดอ้ื ยา

เชอ้ื Resistance วิธตี รวจคดั กรอง การทดสอบยืนยันเพมิ่
Enterobacteriaceae Phenotype หรือ
กลไกการด้อื ยา
Staphylococcus
aureus ESBL production Broth microdilution และ ทำ� การทดสอบเพิ่มหากให้ผลบวก
disk diffusion ต่อยากลุม่
cephalosporins และ aztreonam

Carbapenemase Broth microdilution และ disk ท�ำการทดสอบเพิ่มหากใหผ้ ลบวก
production diffusion ต่อยากลมุ่
carbapenems

β-lactamase Penicillin disk diffusion Yes, if screen test negative, repeat penicillin MIC
production zone-edge test หรือวิธีอน่ื และ β-lactamase test(s) (eg, penicillin disk

diffusion zone-edge test or induced β-lactamase
test) on subsequent isolates from same patient
(if penicillin MIC ≤ 0.12 μg/ml or zone ≥ 29
mm); PCR for blaZ may be considered.

Oxacillin resistance Agar dilution; MHA ทีม่ ี 4% ไมต่ อ้ งทำ� การทดสอบเพิม่
NaCl และ 6 mg/ml oxacillin

mecA-mediated Broth microdilution และ disk ไม่ต้องทำ� การทดสอบเพิ่ม
oxacillin resistance diffusion ต่อยา cefoxitin

Vancomycin MIC Agar dilution; BHI ทำ� การทดสอบเพ่ิมหากใหผ้ ลบวก
≥ 8 mg/ml ท่มี ี 6 mg/ml
vancomycin

Inducible Broth microdilution และ disk ไมต่ อ้ งทำ� การทดสอบเพ่ิม
clindamycin diffusion ต่อยา clindamycin
resistance และ erythromycin

High-level Broth microdilution และ disk ไม่ต้องท�ำการทดสอบเพมิ่
mupirocin resistance diffusion ตอ่ ยา mupirocin

240 คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

ตารางที่ 6-7 รายการตรวจคดั กรองการดอื้ ยาตามชนดิ การดอ้ื ยาทแี่ สดงออก (Phenotype) หรอื ตามกลไกการดอ้ื ยา (ตอ่ )

เช้อื Resistance วธิ ตี รวจคดั กรอง การทดสอบยนื ยนั เพ่มิ
Coagulase-negative Phenotype
หรือ กลไกการดื้อยา
staphylococci
β –lactamase Chromogenic cephalosporin Yes, if screen test negative, repeat penicillin MIC
Enterococci production หรือวธิ อี ืน่ and induced β-lactamase test on subsequent
isolates from same patient (if penicillin MIC ≤
Streptococcus 0.12 µg/ml or zone ≥ 29 mm); PCR for blaZ
pneumoniae may be considered

Streptococcus spp. mecA-Mediated Disk diffusion ตอ่ ยา cefoxitin ไม่ตอ้ งทำ� การทดสอบเพิม่
β -hemolytic Group oxacillin resistance

Inducible Broth microdilution และ disk ไม่ตอ้ งทำ� การทดสอบเพ่มิ
clindamycin diffusion ต่อยา clindamycin
resistance และ erythromycin

Vancomycin Agar dilution; BHI with ทำ� การทดสอบเพ่มิ หากให้ผลบวก
resistance 6 μg/ml vancomycin
ตอ่ ยา vancomycin

HLAR Broth microdilution, หากหา MIC ไมต่ อ้ งทำ� การทดสอบเพ่ิม
agar dilution และ หากท�ำ disk ถา้ สรุปผลไม่ได้ ใหท้ �ำเพิม่
disk diffusion ต่อยา
gentamicin และ streptomycin

Penicillin Disk diffusion ตอ่ ยา oxacillin ทำ� การทดสอบเพม่ิ หากเชอ้ื ใหผ้ ล nonsusceptible
resistance

Inducible Broth microdilution และ disk ไมต่ อ้ งทำ� การทดสอบเพ่มิ
clindamycin diffusion ตอ่ ยา clindamycin
resistance และ erythromycin

Inducible Broth microdilution และ disk ไม่ตอ้ งทำ� การทดสอบเพม่ิ
clindamycin diffusion ต่อยา clindamycin
resistance และ erythromycin

ค�ำย่อ: ESBL, extended-spectrum β-lactamase; FDA, US Food and Drug Administration; HLAR, high-level
aminoglycoside resistance; MIC, minimal inhibitory concentration; PCR, polymerase chain reaction.
* If the current cephalosporin, aztreonam, and carbapenem breakpoints are used, ESBL and/or modified Hodge
testing is not required, but may be used to determine the presence of a resistance mechanism that may be of
epidemiological significance. However, if the ESBL and/or carbapenemase screen is performed and positive,
the confirmatory test must be performed to establish the presence of an ESBL or a carbapenemase.

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 241

สาเหตขุ องความผิดพลาดทีพ่ บบอ่ ยในการทดสอบความไวของเชือ้ ตอ่ สารตา้ นจุลชีพ ได้แก่
- การบนั ทกึ ผลผดิ พลาดหรอื ใช้ยาไม่ถูกตอ้ ง
- การวนิ จิ ฉยั เช้ือตัวอย่างผดิ พลาด
- วธิ กี ารทดสอบไม่ถกู ต้องตามเกณฑม์ าตรฐาน
การเตรยี ม inoculum ขุน่ มากหรอื น้อยเกนิ ไป
ความขุ่นมาตรฐานหมดอายหุ รอื เปล่ียนสภาพ
อณุ หภูมิในการอบเช้ือไมถ่ ูกตอ้ ง
คา่ ความเปน็ กรด-ด่าง (pH) ของอาหารเลย้ี งเชื้อ สงู หรือต่ำ� เกินไป
- ยาทีใ่ ชท้ ดสอบเสอื่ มคุณภาพหรอื หมดอายุ
- เช้อื ทใี่ ช้ทดสอบมีการปนเปือ้ น
- การอ่านผลผิดพลาด

- inhibition zone เล็กเกินไปหรือมีเชื้อเจริญอยู่ภายใน zone (โดยเฉพาะยา sulfonamide, trimethoprim
และ co-trimoxazole) กรณีน้ีอาจเกิดจากสารยับย้ังในอาหารเล้ียงเช้ือจึงควรทดสอบด้วย E. faecalis
ดังกลา่ วแล้วขา้ งตน้
การตรวจสอบผลการทดสอบ
ตรวจสอบวา่ แบบแผนความไวของเชอื้ ตอ่ ยาสอดคลอ้ งกนั หรอื ไม่ หรอื ตรวจสอบจากผลการทดสอบความไว
ของเชอ้ื ชนดิ เดยี วกนั ทแ่ี ยกไดจ้ ากผปู้ ว่ ยกอ่ นหนา้ นี้ และใหห้ าสาเหตขุ องความผดิ พลาดทก่ี ลา่ วแลว้ ขา้ งตน้
นอกจากนี้ เชอ้ื บางสปีชสี ์จะให้แบบแผนการดอ้ื ยาที่แน่นอนอยแู่ ลว้ เชน่
- Proteus spp. โดยท่ัวไปจะดอ้ื ต่อยา nitrofurantoin และ tetracyclines
- Streptococcus pyogenes จะไวตอ่ ยา penicillin เสมอ
- Serratia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp. และ Klebsiella pneumoniae จะดื้อยา ampicillin
- staphylococci และ streptococci จะไวต่อ vancomycin (หากพบเชื้อท้ังสองดือ้ ตอ่ ยา vancomycin ใหต้ รวจ
สอบยืนยันการแยกชนิดเช้ืออีกคร้ังเนื่องจากเชือ้ Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. และ Pediococcus
spp. ดื้อ vancomycin)
- Shigella spp. จะไวตอ่ ยา norfloxacin
หากพบเชือ้ ทีใ่ ห้ผล antibiogram ต่างไปจากปกตแิ ละมีความส�ำคัญทางระบาดวิทยา เช่น พบ norfloxacin-
resistantShigella, vancomycin-resistant Staphylococcus ควรสง่ เชอื้ ดงั กลา่ วตรวจยนื ยนั ทส่ี ถาบนั วจิ ยั วทิ ยาศาสตร์
สาธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ เจา้ หนา้ ทห่ี อ้ งปฏบิ ตั กิ ารควรมขี อ้ มลู และตดิ ตามขา่ วสารเกย่ี วกบั typical,
atypical, unusual หรอื impossible antibiogram อยา่ งสมำ่� เสมอ
เชอื้ ที่ควรทำ� การแยกชนดิ และทดสอบความไวตอ่ ยาซ�้ำใหม่
ผลการทดสอบความไวของจลุ ชพี ตอ่ ยาตา้ นจลุ ชพี ทมี่ ขี อ้ ชบ้ี ง่ ตอ่ ไปน้ี ตอ้ งทำ� การทดสอบซำ้� ใหมท่ งั้ การแยก
และพสิ จู นช์ นดิ ของเชอ้ื และการทดสอบความไวดว้ ยวธิ เี ดมิ อกี ครงั้ เมอื่ ทำ� ซำ้� แลว้ ไดผ้ ลดอื้ เหมอื เดมิ ใหท้ ำ� การยนื ยนั
ดว้ ยวธิ อี ่นื และหรอื สง่ ใหห้ ้องปฏิบตั กิ ารอา้ งองิ ตรวจยืนยันการดือ้ ยา

242 คมู่ ือการปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

ข้อบ่งช้ีเช้อื ทีค่ วรทำ� การแยกชนดิ และทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชพี ซำ้� ใหม่
1) เช้ือทไ่ี มเ่ คยมกี ารรายงานมากอ่ น
2) เชอ้ื ที่พบไม่บ่อยในพื้นท่ีทีแ่ ยกเชอ้ื ได้แต่เคยมรี ายงานในพืน้ ที่อ่นื หรือพืน้ ทใี่ กล้เคยี ง
3) เชอื้ ทใ่ี หผ้ ลการทดสอบทส่ี ามารถเกดิ ความผดิ พลาดดา้ นเทคนคิ ไดง้ า่ ยและการดอ้ื ยานมี้ ผี ลกระทบทางคลนิ กิ
ทีส่ ำ� คัญ

การควบคมุ คุณภาพภายนอก
หอ้ งปฏิบตั กิ ารควรไดร้ ับการทดสอบจากหน่วยงานภายนอก
2. การทดสอบความไวของเชอ้ื ต่อสารตา้ นจลุ ชพี โดยการหาค่า MIC
2.1 หลักการ เป็นการทดสอบความไวของเช้ือต่อสารต้านจุลชีพแบบปริมาณวิเคราะห์ โดยการผสมสารต้าน
จลุ ชีพทม่ี คี วามเขม้ ขน้ จากสงู ไปหาต่ำ� กับอาหารเลยี้ งเช้ือแลว้ ใส่เช้ือลงไป นำ� ไปอบเพาะเชือ้ ข้ามคืนในตู้อบ 35 °C
ทำ� การตรวจหาความเขม้ ขน้ ตำ่� สดุ ของสารตา้ นจลุ ชพี ทส่ี ามารถยบั ยง้ั การเจรญิ ของเชอื้ ทท่ี ดสอบ เรยี กวา่ minimum
inhibitory concentration หรือ MIC การหาคา่ MIC ท�ำได้ 3 วธิ ี คือ วิธีที่ใชอ้ าหารเล้ยี งเชือ้ ชนดิ วนุ้ ผสมกับยาตา้ น
จุลชีพ เรียกว่า agar dilution method วธิ ที ่ีผสมยาต้านจุลชีพด้วยอาหารเหลว เรยี กว่า broth dilution method และวิธี
E-test สำ� หรบั วิธี broth dilution สามารถกระท�ำได้ 2 วธิ ี ได้แก่ macrodilution และ microdilution broth method
ซึง่ วิธีหลังเปน็ วธิ ที ่ีนยิ มมากกวา่ เพราะสน้ิ เปลอื งสารนอ้ ยกว่า จึงขอน�ำมากล่าวไวใ้ นที่นโี้ ดยจะกล่าวถึงวธิ ที ่เี หมาะ
ส�ำหรับเช้ือเจริญง่ายใน Mueller-Hinton Broth (MHB) ส�ำหรับเช้ือที่เจริญยากหรือพบน้อย (Bacillus spp.,
Brucella spp., Burkholderia pseudomallei, Corynebacterium diphtheriae,Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria
monocytogenes, Yersinia pestis เป็นต้น) สามารถอา่ นเพม่ิ เตมิ ใน CLSI M45-A2 และสำ� หรับเช้ือกลุ่ม anaerobe
อา่ นเพมิ่ เตมิ ใน CLSI M11-A7 ซ่งึ ใช้ broth แตกตา่ งกนั ตามชนิดของเช้อื แบคทีเรีย
2.2 วธิ ีปฏิบัติ
2.2.1 วิธกี ารทดสอบความไวของเชือ้ ต่อสารตา้ นจลุ ชีพโดยการหาคา่ MIC ดว้ ยวิธี Agar dilution
การเตรียมสารต้านจลุ ชพี
1. เตรียมสารตา้ นจลุ ชีพใหเ้ ปน็ 10 เท่าของปรมิ าณยาที่ตอ้ งการใหม้ ีในอาหารจานเพาะเชอ้ื แตล่ ะ plateโดย
เจอื จางยาตา้ นจุลชีพให้เป็น 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 … เช่นเตรียมยา 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10 และ
5 µg/ml
2. ใส่ยาท่ีเตรียมไว้แต่ละความเข้มข้น plate ละ 1 ml แล้ว ผสมกับ MHA ที่มีความร้อนประมาณ 56 °C
ปริมาณ 9 ml จะได้ความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพใน agar dilution plate เรียงจากมากไปหาน้อย ดังน้ี
128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, และ 0.5 µg/ml
3. รอให้ agar dilution plate เยน็ และแขง็ ทอ่ี ุณหภมู หิ ้อง อาหารเลย้ี งเชือ้ ทีม่ ยี าตา้ นจุลชีพผสมอย่สู ามารถ
เกบ็ ท่ี 4 °C ไดไ้ มเ่ กนิ 5 วนั ยกเวน้ ยากลมุ่ β-lactamases ตอ้ งใชภ้ ายใน 48 ชว่ั โมง เนอื่ งจากยาสลายตวั งา่ ย
4. ท�ำหน้า plate ให้แห้งก่อนน�ำไปใช้โดยใส่ในตู้อบเพาะเช้ือหรือวางแบบเปิดฝาใน laminar flow
หรือ BSC ประมาณ 15 นาที

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 243

การเตรียมเชือ้ แบคทเี รยี
เตรยี มเช้อื โดยวธิ ี direct colony หรอื growth method เชน่ เดียวกับทกี่ ลา่ วไว้ในวธิ ีทดสอบความไวของเชือ้
ต่อยาด้วยวิธี disk diffusion ให้ได้เชือ้ ที่ความขนุ่ เท่ากบั 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน TSB แล้วเจือจาง
เชอื้ ลงอกี 1: 10 เทา่ จะไดค้ วามเขม้ ขน้ ของเชอ้ื 5x107 CFU/ml ปรมิ าณเชอ้ื สดุ ทา้ ยทอี่ ยบู่ น agar dilution plate เทา่ กบั
104 CFU ต่อหยด เมอื่ ใช้ replicators ทม่ี เี ขม็ ขนาด 1 mm ซึง่ สามารถปล่อยเช้ือได้ 0.1-0.2 µl ไม่ควรเตรยี มเช้ือนาน
เกนิ 15 นาที กอ่ นใสเ่ ชือ้ บน plate
การใสเ่ ชื้อบน Agar dilution plates
1. จัดเรยี งเช้อื ทีเ่ ตรยี มไวใ้ หเ้ ป็นลำ� ดับ โดยสามารถทำ� เชือ้ ได้ 30-32 สายพันธ์ุ
2. ท�ำเคร่ืองหมายท่ี plate เพือ่ ให้รตู้ �ำแหนง่ และทศิ ทางการเรยี งหมายเลขเช้ือแตล่ ะตวั บน agar plate
3. ดดู เชอื้ ท่ีเตรยี มไวแ้ ตล่ ะตัว ประมาณ 0.5 ml ใส่ในแตล่ ะหลุมของ inoculator ตามล�ำดับ
4. นำ� inoculator-replicator ไปวางในหลมุ ของ inoculator แลว้ นำ� ไปวางบน agar plate เพอ่ื ปลอ่ ยใหเ้ ชอื้ หยด
บนผิว plate ควรหยดเชอ้ื บนผิว agar ทีเ่ ปน็ control plate ซงึ่ ไม่มียาต้านจุลชีพก่อน plate ที่มียาโดยเรยี ง
จากยาน้อยไปหามาก
5. รอจนหยดเชอ้ื แห้งสนิทจงึ นำ� plate อบที่ 35+ 2 °C เปน็ เวลา 18-24 ช่ัวโมง
การอ่านค่า MIC
อ่านค่า MIC ของเชื้อแต่ละตัวโดยเรียงจาก plate ที่มียาน้อยที่สุดไปหายามากเพื่อหาว่าเช้ือมี completely
inhibit growth (ไมม่ ีการเจรญิ ของเชอื้ หรอื มีเพยี งรอยเชื้อทจี่ างๆ) บน plate ทีม่ ียาต้านจุลชพี ปรมิ าณเทา่ ใดค่าของ
MIC ของเชื้อแต่ละตัวคอื ปริมาณยานอ้ ยท่สี ดุ ทีส่ ามารถยบั ยั้งการเจรญิ ของเช้อื ได้
ข้อควรระวงั กรณีมเี ชือ้ ข้ึน ≥ 2 โคโลนี ก่อนจดุ ทเ่ี ป็น end point ของเช้ือ หรือกรณเี ชื้อไมข่ ้นึ บน plate ที่มยี าน้อย
แต่มเี ชอื้ เจรญิ บน plate ทม่ี ียามากกวา่ ใหต้ รวจสอบการปนเปื้อนของเช้ืออืน่ และตอ้ งทำ� การทดสอบใหม่
การควบคุมคณุ ภาพ
Control plate: ใช้อาหารเพาะเล้ยี งเชือ้ ท่ไี มเ่ ตมิ ยาต้านจุลชพี เพื่อควบคมุ การเจริญเตบิ โตของเช้ือทีท่ ดสอบ
Drug control: ใช้เชอ้ื มาตรฐานท่ที ราบค่า MIC ทดสอบควบค่กู บั เชื้อทดสอบใน agar dilution plate เดียวกัน

244 คูม่ อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางที่ 6-8 แสดงการหาคา่ MIC ของเชอื้ โดยวธิ ี agar dilution

Strain No. Antimicrobial concentration in agar dilution plate (µg/ml) MIC (µg/ml)

1 0.5 1 24 8 8
2 4
3 +++ +++ +++ +++ NG 2
4 2
5 +++ +++ +++ NG NG 1
6 1
7 +++ +++ NG NG NG 1
8 1
9 +++ +++ NG NG NG 1
10 1
Control strain +++ NG NG NG NG 1
Negative control NG
+++ NG NG NG NG

+++ NG NG NG NG

+++ NG NG NG NG

+++ NG NG NG NG

+++ NG NG NG NG

+++ NG NG NG NG

NG NG NG NG NG

+++ คือมีการเจริญของเช้อื ; NG คือไมม่ ีเช้ือเจรญิ

2.2.2 วธิ ีการทดสอบความไวของเช้อื ตอ่ สารต้านจลุ ชีพโดยการหาคา่ MIC ดว้ ยวธิ ี Broth dilution
1. เตรียม Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth (CAMHB มีชนดิ สำ� เร็จรูปขาย) เป็นอาหารเลย้ี งเช้อื
ส�ำหรับผสมยา (กรณีท่ีต้องทดสอบหาความไวของเชื้อกลุ่ม staphylococci ต่อยา oxacillin, methicillin หรือ
nafcillin ใหเ้ ตมิ 2 % NaCl ลงกอ่ นนำ� ไปน่ึง)
2. ทดสอบคา่ pH ซ่ึงควรอยู่ในช่วง 7.2-7.4

การเตรียมสารละลายสารต้านจลุ ชีพ
1. ค�ำนวณหา potency ของยาจากคา่ ทก่ี ำ� หนดมาในใบ certifcate ทแี่ นบมากับยา ดังตัวอย่าง
Assay purity (by HPLC): 99.8%, water content: 12.1% (w/w), Active fraction: 100%
Potency = (assay purity) x (active fraction) x (1- water content)

= 998 x 1 x (1- 0.121)
= 877 µg/mg or 87.7%
ยาบางชนิดแสดงคา่ potency เปน็ IU/mg เขยี นอยู่บนฉลากปดิ ขวด ให้คำ� นวณเป็น µg/mg
ดังตัวอยา่ ง amphotericin 100 mg potency = 5,000 IU/mg = 5,000 IU/1,000 µg

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทั่วไป 245

ใ ชส้ ตู ร 1 I U = 1,000 μg = 0.2 μg
5,000 IU

Amphotericin มี potency = 5,000 IU x 0.2 µg = 1,000 μg /mg

2. ค�ำนวณหาน้�ำหนักยาท่ีต้องชงั่ ซง่ึ ควรมากกวา่ 100 mg เพอื่ เตรยี ม stock solution
ตัวอย่าง ตอ้ งการเตรียม stock solution 100 ml ท่ีมีความเขม้ ข้นของยา 1280 g/ml
ยามี potency 750 g/mg

ใชส้ ตู ร weight = volume (ml) x concentration (μg /ml)
potency (μg /mg)

= 100 ml x 1,280 μg/ml = 170.67 mg
750 μg/mg

เพือ่ ความถูกต้องควรชั่งยามากกว่าค่าท่ีค�ำนวณได้ หากเลือกช่ังยา 182.6 mg จะใชต้ วั ทำ� ละลาย
ปริมาตรเทา่ ใด

ใชส้ ูตร volume = weight (mg) x potency (μg/mg)
stock concentration (μg/ml)

= 182.6 mg x 750 μg/mg = 107.0 ml
1,280 μg/ml

นน่ั คอื ช่ังยา 182.6 mg ละลายในน้ำ� กลัน่ ปราศจากเชอ้ื 107.0 ml เพ่อื เตรยี ม stock solution
ท่ีมคี วามเข้มข้นของยา 1280 µg /ml

3. สำ� หรบั ยาที่ละลายไดง้ า่ ยในนำ้� กล่ันปราศจากเชื้อ เตรียม stock solution ของยาให้มคี วามเขม้ ขน้ ไมน่ อ้ ย
กวา่ 1,000 μg/ml (ยาทีไ่ มล่ ะลายในน้�ำ ใหล้ ะลายยาด้วยตัวท�ำละลายในปริมาตรน้อยทส่ี ดุ ทส่ี ามารถท�ำใหย้ าละลาย
จนหมด) เตรียมยาให้มีระดับความเข้มข้นมากพอท่ีจะครอบคลุมช่วงความเข้มข้นท่ียอมรับได้ของเชื้อควบคุม
คณุ ภาพการทดสอบอยา่ งนอ้ ย 1 ชนดิ stock solution ทเ่ี ตรยี มดว้ ยวธิ ปี ลอดเชอ้ื ไมจ่ ำ� เปน็ ตอ้ งกรอง และสามารถเกบ็
ท่ีอณุ หภูมนิ อ้ ยกว่าหรอื เท่ากับ -20 °C ได้นาน 6 เดอื น
4. ท�ำการเจือจาง stock solution ด้วย CAMHB ให้มีความเข้มขน้ ลดลง 10 เท่า เป็น working solution จาก
นั้นเจือจาง working solution ที่ไดใ้ ห้มีความเขม้ ขน้ สุดท้ายของยาลดลง 2 เทา่ (ดงั ตารางที่ 6-9) โดยเปล่ียน pipette
ทุกครงั้ หลงั การเจอื จางแต่ละความเข้มข้น

246 คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

ตารางท่ี 6-9 ตัวอยา่ งแสดงการเตรียม working solution

ความเขม้ ขน้ ของยา ปริมาตรของยา (ml) ปริมาตรของ CAMHB ความเข้มขน้ สุดท้ายของยา
(µg /ml) (ml) (µg /ml)
1 512
5120 (stock solution) 1 9 256
512 1 1 128
512 1 3 64
512 7
32
64 11 16
64 13 8
64 17 4
8 11 2
8 13 1
8 17

11 1 0.5
11 3 0.25
11 7 0.125

ดดู CAMHB ทผี่ สมยา ใสล่ งถาด 96 หลุม (กน้ หลมุ แบบตัว U หรือ V) หลมุ ละ 0.1 ml โดยเริม่ จากความเข้มขน้
ของยาตำ�่ สดุ ไปหาสงู สดุ แตล่ ะความเขม้ ขน้ จะมี 8 หลมุ (แถว A-H) ดงั รปู และดดู CAMHB ทไี่ มผ่ สมยาลงในหลมุ
ที่ A12-H12 หลุมละ 0.1 ml

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทัว่ ไป 247

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ภาพที่ 6-1 ตวั อยา่ งการทดสอบหาคา่ MIC ด้วยวิธี Broth microdilution
การเตรยี มเชอ้ื แบคทีเรีย
1. เตรียมเช้ือโดยวิธี direct colony หรอื growth method เชน่ เดียวกับทีก่ ลา่ วไว้ในวธิ ที ดสอบความไวของเชือ้ ต่อ
ยาดว้ ยวธิ ี disk diffusion ใหไ้ ดเ้ ชอื้ ที่ความขนุ่ เทา่ กับ 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน CAMHB แล้วเจอื จาง
เช้ือลงอกี 20 เทา่ จะไดค้ วามเข้มขน้ ของเช้ือ 5 x106 CFU/ml
2. ดูดเช้ือแตล่ ะสายพนั ธใ์ุ ส่หลมุ 1-12 ของแต่และแถว (A-F) หลมุ ละ 0.01 ml ภายใน 15 นาที (ความเขม้ ขน้
สุดทา้ ยของเชื้อจะลดลงเปน็ 5 x105 CFU/ml) ดงั รูป โดยหลมุ G1-G12 ใชเ้ ป็นหลุมท่ีใสเ่ ช้อื ควบคุม และหลุมท่ี
H1-H12 ใช้เป็นหลมุ ควบคุมทไ่ี ม่ใส่เชอ้ื แบคทีเรยี
3. อบถาดหลุมข้ามคืนท่ีอณุ หภูมิ 35±2 °C ในกลอ่ งพลาสติกโดยไมซ่ ้อนถาดมากกวา่ 4 ถาด
การอา่ นผล
1. ตรวจดูหลุมแรกท่ีไม่พบการเจริญของเชื้อแต่ละตัวที่ท�ำการทดสอบ อ่านค่าความเข้มข้นของยาในหลุม
น้นั เป็นค่า MIC
2. หากพบหลมุ ทไี่ มม่ กี ารเจรญิ ของเชอื้ อยรู่ ะหวา่ งกลาง ใหอ้ า่ นคา่ MIC ทสี่ งู สดุ แตห่ ากพบหลมุ ดงั กลา่ วมากกวา่
1 หลุมให้ท�ำการทดสอบใหม่

248 คู่มือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

การควบคุมคณุ ภาพ
1.ทดสอบกบั เชอื้ ควบคมุ ตามทกี่ ำ� หนดใน CLSI M100-S24ควบคกู่ บั เชอ้ื แบคทเี รยี ตวั อยา่ งทกุ ครงั้ ทที่ ำ� การทดสอบ
2. ต้องไมพ่ บการเจรญิ ของเช้อื ในหลมุ ของแถว H1-H12 และตอ้ งพบการเจริญท่ดี ขี องเชอ้ื ในหลมุ A12-G12

ตารางที่ 6-10 แสดงเช้อื แบคทีเรียทค่ี วรทดสอบความไวด้วยวธิ ี broth microdilution

Organisms Medium Inoculum Incubation QC Primary testing
penicillin
Abiotrophia spp. CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae cefotaxime หรือ
Granulicatella spp. + LHB 2.5-5% suspension 20-24 ชม. ATCC 49619 ceftriaxone
+pyridoxal in MHB vancomycin
hydrochloride vancomycin
fluoroquinolones
Bacillus spp. ยกเวน้ CAMHB direct colony 35 °C S. aureus clindamycin
B. anthracis suspension 16-20 ชม. ATCC 29213 erythromycin
in MHB ciprofloxacin

Campylobacter CAMHB direct colony 36-37 °C C. jejuni penicillin
jejuni/coli + LHB 2.5-5% suspension 48 ชม. ATCC 33560 vancomycin
gentamicin
in MHB หรือ 42 °C erythromycin
24 ชม. penicillin หรือ
microaerobic ampicillin
ampicillin
Corynebacterium spp. CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae amoxicillin-
(รวม C. diphtheriae) + LHB 2.5-5% suspension 24-48 ชม. ATCC 49619 clavulanic acid
E. coli ATCC cefotaxime หรอื
in MHB 25922 กบั ยา ceftriaxone
gentamicin imipenem

Erysipelothrix CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae
rhusiopathiae + LHB 2.5-5% suspension 20-24 ชม. ATCC 49619

in MHB

กลุ่ม HACEK CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae
+ LHB 2.5-5% suspension 24-48 ชม. ATCC 49619
E. coli ATCC
in MHB 5% CO2 35218 กับยาทีม่ ี
β-lactamase
inhibitor

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 249

ตารางที่ 6-10 แสดงเชื้อแบคทเี รยี ทคี่ วรทดสอบความไวด้วยวิธี broth microdilution (ตอ่ )

Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Leuconostoc spp. CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae penicillin หรอื
+ LHB 2.5-5% suspension 20-24 ชม. ATCC 49619 ampicillin
Listeria E. coli ATCC
monocytogenes in MHB 25922 กับยา penicillin หรอื
CAMHB direct colony 35 °C gentamicin ampicillin
Moraxella + LHB 2.5-5% suspension 20-24 ชม. S. pneumoniae trimethoprim-
catarrhalis ATCC 49619 sulfamethoxazole
in MHB amoxicillin-
Pasteurella spp. clavulanic acid
CAMHB direct colony 35 °C S. aureus cefaclor หรือ
Pediococcus spp. suspension 20-24 ชม. ATCC 29213 cefuroxime
in MHB ยากล่มุ
penicillins,
CAMHB direct colony 35 °C S. pneumoniae cephalosporins,
+ LHB 2.5-5% suspension 18-24 ชม. ATCC 49619 tetracyclines,
E. coli ATCC fluoroquinolones
in MHB 35218 กบั ยาทีม่ ี penicillin
β-lactamase cefotaxime
CAMHB direct colony 35 °C inhibitor หรอื
+ LHB suspension 20-24 ชม. S. pneumoniae ceftriaxone
2.5-5% in MHB ATCC 49619 vancomycin
E. coli ATCC
25922 กับยา
gentamicin

Acinetobacter spp. CAMHB direct colony 35±2 °C E. coli colistin
suspension 20-24 ชม. ATCC 25922
in MHB P. aeruginosa
ATCC 27853

Bacillus anthracis CAMHB direct colony 35 °C E. coli penicillin
suspension 16-20 ชม. ATCC 25922 doxycycline
in CAMHB S. aureus ciprofloxacin
ATCC 29213

250 คู่มือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

ตารางท่ี 6-10 แสดงเช้ือแบคทเี รยี ท่คี วรทดสอบความไวดว้ ยวิธี broth microdilution (ตอ่ )

Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing
Brucella spp. Brucella broth gentamicin
pH 7.1 ± 0.1 direct colony 35 °C E. coli streptomycin
Burkholderia mallei suspension 48 ชม. ATCC 25922 tetracycline
CAMHB in CAMHB S. pneumoniae
ATCC 49619 ceftazidime
imipenem
direct colony 35 °C E. coli tetracycline
suspension 16-20 ชม. ATCC 25922
in CAMHB P. aeruginosa
ATCC 27853

Burkholderia CAMHB direct colony 35 °C E. coli ceftazidime
pseudomallei suspension 16-20 ชม. ATCC 25922 imipenem
in CAMHB P. aeruginosa tetracycline
Franciscella ATCC 27853 amoxicillin-
tularensis clavulanic acid
CAMHB direct colony 35 °C E. coli gentamicin
Yersinia pestis + 2% suspension in 48 ชม. ATCC 25922 streptomycin
defined growth CAMHB S. aureus tetracycline
supplement ATCC 29213 ciprofloxacin
P. aeruginosa chloramphenicol
ATCC 27853
gentamicin
direct colony 35±2 °C E. coli streptomycin
suspension in 24-48 ชม. ATCC 25922 tetracycline
CAMHB ciprofloxacin
trimethoprom-
sulfamethoxazole

LHB: Lysed Horse Blood
HACEK : Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter paraphrophilus, Aggregatibacter segnis,

Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium spp., Eikenella corrodens,
Kingella spp.
Microaerobic: 10% CO2, 5% O2, 85% N2

สำ� หรับโรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 251

3. β-lactamase test
3.1 หลกั การ β-lactamase เป็นเอนไซม์ทแี่ บคทีเรียหลายชนดิ สรา้ งขน้ึ เพ่อื ทำ� ลายยากลุ่ม β-lactam ดงั นน้ั การ
ตรวจหาการสรา้ งเอนไซม์ β-lactamase ซง่ึ สามารถกระท�ำได้อยา่ งรวดเรว็ ในแบคทเี รยี กลมุ่ Haemophilus spp., N.
gonorrhoeae, staphylococci, enterococci และ M. catarrhalis จะชว่ ยใหก้ ารรกั ษาดว้ ยสารตา้ นจลุ ชพี มปี ระสทิ ธภิ าพ
มากข้นึ วธิ ที ดสอบมี 3 วิธีไดแ้ ก่ acidometric, iodometric และ nitrocefin-based (cefinase) method ซง่ึ วิธสี ุดทา้ ย
เปน็ วธิ ที สี่ ามารถใช้ทดสอบกับเชอื้ ทุกกลุ่มดงั กล่าวข้างต้น จงึ เป็นวิธีทนี่ ยิ มมากที่สดุ และจะน�ำมากลา่ วไว้ในทนี่ ี้
3.2 วธิ ีปฏิบัติ
3.2.1 วาง cefinase disk บนแผน่ สไลด์ที่สะอาด หยดนำ้� กล่นั ปราศจากเช้ือ 1 หยดลงบน disk
3.2.2 ใช้ loop หรือ swab เข่ยี เชอ้ื ทตี่ ้องการทดสอบน�ำมาป้ายลงบน cefinase disk
3.2.3 ตรวจดูการเปลย่ี นสขี อง disk ผลบวกคือเชือ้ สร้าง β-lactamase ไปเปล่ยี น substrate ใน disk เปน็ สี
แดงภายใน 15 วนิ าที ถึง 5 นาที แต่ถา้ ทดสอบเช้ือ staphylococci ตอ้ งอ่านผลหลังป้ายเช้อื 1 ชม. และ
ถา้ ทดสอบเชือ้ enterococci ตอ้ งอา่ นผลหลังป้ายเช้อื 30 นาที ผลลบคือเชอื้ ไมส่ รา้ ง β-lactamase จะ
ไม่เหน็ การเปล่ยี นแปลงสขี อง disk
หมายเหตุ การทดสอบกบั เชื้อ staphylococci ควรทดสอบกบั เชอ้ื ท่ถี ูกเหนย่ี วน�ำให้สรา้ งเอนไซม์เพิม่ ขน้ึ (ตามวิธี
ข้างลา่ ง) เนือ่ งจากบางสายพันธุ์สรา้ ง β-lactamase ในปรมิ าณนอ้ ยมากจนไมส่ ามารถตรวจสอบได้
3.3 วิธีเหนี่ยวนำ� การสร้างเอนไซม์ β-lactamase ใน staphylococci
3.3.1 Streak เชื้อบน BA เป็น 3 ระนาบ แล้ววาง oxacillin disk (1 μg) ลงบนระนาบเชื้อ
3.3.2 อบเช้ือที่ 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.
3.3.3 เข่ยี เชือ้ ท่เี จริญตรงขอบของ inhibition zone ไปทดสอบการสร้าง β-lactamase ข้างต้น
3.4 การรายงานผล
ผลบวก หมายถงึ เชื้อด้ือตอ่ ยากลุ่ม penicillinase-labile penicillins (amoxicillin, ampicillin, penicillin) กรณี
staphylococci จะรวมถงึ carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin, และ piperacillin) หากได้ผลลบยังไมส่ ามารถสรปุ
วา่ เชอื้ ไมด่ อ้ื ยา ต้องท�ำการทดสอบความไวตามวธิ มี าตรฐานก่อน
3.5 การควบคมุ คุณภาพ
ทดสอบการสรา้ ง β-lactamase กับ reference strains ดงั นี้
Staphylococcus aureus ATCC 29213 ใหผ้ ลบวก
Haemophilus influenzae ATCC 10211 ให้ผลลบ

252 คู่มือการปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา

4. ESBLs
4.1 หลกั การ ESBLs เปน็ เอนไซม์ β-lactamase ทเ่ี ชื้อสรา้ งขนึ้ จากการ mutation ของยีนส์ ทำ� ใหส้ ามารถทำ� ลาย
ยากลุม่ penicillins, third generation cephalosporins (ceftazidime, cefotaxime, และ ceftriaxone), และ aztreonam
พบมากใน Enterobacteriaceae โดยเฉพาะ Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Escherichia coli และ Proteus
mirabilis ท่ีเป็นสาเหตุการติดเชื้อในโรงพยาบาล วิธีท่ีตรวจดูการสร้างเอนไซม์ ESBLs มีทั้งวิธี screening และ
confirmation
4.2 วิธปี ฏิบตั ิ
4.2.1 วธิ ี Screening
4.2.1.1 เตรยี ม inoculums และเพาะเช้ือบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชือ้ ต่อยา
ดว้ ยวธิ ี disk diffusion
4.2.1.2 ทดสอบความไวของเช้อื K. pneumoniae, K. oxytoca และ E. coli ตอ่ ยา cefpodoxime (10 μg)
หรือ ceftazidime (30 μg) หรือ aztreonam (30 μg) หรือ cefotaxime (30 μg) หรอื ceftriaxone
(30 μg) หากเปน็ เชือ้ P. mirabilis ให้ทดสอบกบั ยา cefpodoxime (10 μg) หรือ ceftazidime
(30 μg) หรอื cefotaxime (30 μg) อบเชอื้ ที่ 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.
4.2.1.3 วัดขนาด inhibition zone ของเชอื้ ถา้ ไดต้ ามตารางที่ 6-11 แสดงวา่ เช้ืออาจสรา้ งเอนไซม์
ESBL ควรท�ำวิธี confirmation เพ่อื ยนื ยันต่อไป
ตารางที่ 6-11 ตาราง inhibition zone ของเช้อื ในการทดสอบ ESBL

สารต้านจลุ ชพี ขนาด inhibition zone (mm)
E. coli K. pneumoniae K. oxytoca P. mirabilis
Cepodoxime (10 µg)
Ceftazidime (30 µg) ≤17 ≤17 ≤ 17 ≤ 22
Aztreonam (30 µg)
Cefotaxime (30 µg) ≤ 22 ≤ 22 ≤ 22 ≤ 22
Ceftriaxone (30 µg)
≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 -

≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27

≤ 25 ≤ 25 ≤ 25 -

4.2.2 วธิ ี confirmation
4.2.2.1 เตรียม inoculums และเพาะเชื้อบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเช้ือต่อ
ยาด้วยวธิ ี disk diffusion จำ� นวน 2 plate ตอ่ เช้ือ 1 ตัวตามมาตรฐานการทดสอบความไว
ของเช้อื ตอ่ ยาดว้ ยวิธี disk diffusion
4.2.2.2 ทดสอบความไวของเชื้อต่อยา ceftazidime (30 μg) และยา ceftazidime-clavulanic acid
(30/10 μg) ใน plate ท่ี 1 และวาง disk ยา cefotaxime (30 μg) และยา cefotaxime-
clavulanic acid (30/10 μg) ใน plate ที่ 2 อบเชอ้ื ที่ 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 253

4.2.2.3 วัดเส้นผา่ นศนู ยก์ ลางของ inhibition zone ของยาแตล่ ะคู่ ถ้า inhibition zone ของ disk ยา
ทม่ี สี ว่ นผสมของ clavulanic acid มขี นาดใหญก่ วา่ inhibition zone ของ disk ยาชนดิ เดยี วกนั
ที่ไม่มสี ว่ นผสมของ clavulanic acid ≥ 5 mm. แสดงว่าเช้อื สร้างเอนไซม์ ESBL
4.3 การรายงานผล
รายงานว่าเชือ้ สรา้ งเอนไซม์ ESBL
4.4 การควบคุมคุณภาพ
4.4.1 วธิ ี screening : ทดสอบความไวของเชือ้ E. coli ATCC 25922 (ไม่สร้าง ESBLs) ต่อยาดังกลา่ ว
ข้างตน้ สัปดาห์ละคร้งั
4.4.2 วิธี confirmation: ทดสอบความไวของเชือ้ E. coli ATCC 25922 (ไมส่ ร้างESBLs) และ เชอ้ื
K. pneumoniae ATCC 700603 (สร้าง ESBLs) ต่อยา ceftazidime (30 μg) คู่กับยา
ceftazidime-clavulanic และยา cefotaxime (30 μg) คู่กับยา cefotaxime-clavulanic acid
(30/10 μg) สัปดาหล์ ะครง้ั โดย inhibition zone ของเช้อื E. coli ATCC 25922 ตอ่ ยาท้ัง 2 ค่จู ะ
ตา่ งกนั ≤ 2 mm และ inhibition zone ของเชอื้ K. pneumoniae ATCC 700603 ตอ่ ยา ceftazidime
(30 μg) และยา ceftazidime-clavulanic จะตา่ งกนั ≥ 5 mm แตส่ �ำหรบั ยา cefotaxime (30 μg)
คกู่ บั ยา cefotaxime-clavulanic acid (30/10 μg) จะตา่ งกัน ≥ 3 mm

5. Carbapenemases detection
5.1. หลกั การ carbapenemases activity ในเชื้อ Enterobacteriaceae ที่แยกไดจ้ ากส่งิ สง่ ตรวจของผปู้ ว่ ย เกดิ จาก
การสรา้ งเอนไซม์ β-lactamase หลายชนิดมที ้ังใน classes A, B และ D เชน่ เอนไซม์ KPC ทอ่ี ยใู่ น class A เอนไซม์
NDM ที่อยู่ใน class B และเอนไซม์ OXA ทีอ่ ยู่ใน class D ซึง่ เปน็ เอนไซม์หลกั ท่ีมีความส�ำคญั ทางคลินิกดงั แสดง
ในตารางท่ี 6-12

ตารางท่ี 6-12 β-lactamases และ carbapenemase activity

β-lactamase class เชอื้ ท่พี บ ตัวอยา่ งเอนไซม์
A K. pneumoniae และ KPC, SME
B Enterobacteriaceae อ่นื ๆ
Enterobacteriaceae Metallo- ß-lactamases
C P. aeruginosa ท่ถี ูกยับย้ังโดย EDTA
Acinetobacter baumannii เชน่ IMP, VIM, NDM
Acinetobacter baumannii OXA
Enterobacteriaceae

Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases เปน็ กลไกการดอ้ื ยา carbapenems ทสี่ ำ� คญั carbapenemases มรี ายงาน
พบทวั่ โลกในเชอ้ื Enterobacteriaceae เอนไซน์ carbapenemases ชนดิ KPC type มรี ายงานครงั้ แรกในสหรฐั อเมรกิ า
และมีระบาดมากใน อิสราเอล และกรีก metallo-enzymes (VIM, IMP...) พบมากในทางใต้ของยุโรปและเอเชีย
OXA-48 เปน็ carbapenemases ทรี่ ายงานล่าสดุ จากกล่มุ ประเทศเมดิเตอร์เรเนียน และมโี ครงสรา้ งท่แี ตกตา่ งจาก

254 คู่มอื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

carbapenemases อ่นื carbapenemase genes สว่ นใหญอ่ ย่ทู ี่ plasmid ของเช้อื K. pneumoniae ทแ่ี ยกไดจ้ ากโรคติด
เชอ้ื ในโรงพยาบาลแต่มีรายงานการติดเช้อื ในชุมชนด้วย
การตรวจยนื ยันการสร้างเอนไซม์ KPC สามารถท�ำโดย modified Hodge Test แตย่ งั ไม่มี phenotypic test ท่เี ชือ่
ถือได้ส�ำหรับการตรวจยืนยันหาเอนไซม์ NDM และ metallo-β-lactamases อย่างไรก็ตาม breakpoints ของการ
ทดสอบความไวโดย disk diffusion method หรอื การท�ำ MIC ส�ำหรับยาในกลุม่ carbapenem ที่กำ� หนดโดย CLSI
ใน M100-S20-U (June 2010 Update) สามารถใชแ้ ปลผลการทดสอบความไวของเชอื้ Enterobacteriaceae ท่สี ร้าง
เอนไซมช์ นดิ NDM และ other metallo-β-lactamase เพอื่ ใชเ้ ปน็ แนวทางในการเลอื กสารตา้ นจุลชีพสำ� หรบั การติด
เชอื้ ดังกล่าว
การตรวจคดั กรองและการยนื ยนั การสรา้ ง carbapenemase ของเชือ้ Enterobacteriaceae โดยใชเ้ กณฑก์ ารแปล
ผล CLSI June 2010 (M100-S20-U) การตรวจคัดกรองเบ้ืองต้นส�ำหรับการสร้าง carbapenemase ของเช้ือ
Enterobacteriaceae ให้ทำ� ตามวิธีท่ีแสดงใน Table 3C ของ M100-S24; CLSI 2014 การทดสอบความไวตอ่ สารตา้ น
จุลชีพในงานบริการประจ�ำวัน การตรวจยืนยันการสร้าง carbapenemase ของเชื้อ Enterobacteriaceae โดยวิธี
Modified- Hodge Test ทำ� เฉพาะกรณตี ้องการศึกษาระบาดวทิ ยาเพ่ือใช้ประโยชน์ในการควบคมุ การแพร่กระจาย
ไมจ่ �ำเป็นตอ้ งท�ำในงานบรกิ ารประจ�ำวัน การแปลผลของการทดสอบความไวของยากลมุ่ carbapenem สำ� หรบั เชอื้
Enterobacteriaceae โดยวิธี disk diffusion และการหาคา่ MIC ให้อิงตาม break point ท่กี ำ� หนด โดยไม่ตอ้ งคำ� นึง
ถึงผลของ Modified-Hodge test
เชอ้ื Enterobacteriaceae ทส่ี รา้ ง carbapenemase มกั จะใหผ้ ล intermediate หรอื resistant ตอ่ ยาในกลมุ่ carbapenem
อยา่ งนอ้ ยหนงึ่ ชนดิ ertapenemnon-susceptibilityเปน็ ตวั ชวี้ ดั ทไ่ี วดสี ำ� หรบั การตรวจหาการสรา้ งเอนไซม์carbapenemase
และเชอ้ื กลุ่มนม้ี ักด้อื ตอ่ ยาตัวใดตวั หนงึ่ ในกลุ่ม cephalosporin subclass III ดว้ ย เชน่ cefoperazone, cefotaxime,
ceftriazone, ceftazidime ดังนนั้ การตรวจหาการสร้างเอนไซม์ carbapenemases สำ� หรับ Enterobacteriaceae ต้อง
ทำ� การทดสอบความไวของเชือ้ ตอ่ ยาทั้ง ertapenem, imipenem, และ meropenem รวมทง้ั ยาในกลุ่ม cephalosporin
subclass III เสมอ
5.2 การตรวจคัดกรอง carbapenemase production ของเชื้อ Enterobacteriaceae
5.2.1 วิธปี ฏบิ ัติ
5.2.1.1 ทำ� การทดสอบตามวธิ ี disk diffusion ด้วยแผ่นยาทดสอบ ertapenem 10 μg หรอื

meropenem 10 μg หรอื วิธี broth dilution โดยใชย้ า ertapenem 1 μg หรือ meropenem
1 μg หรอื imepenem 1 μg
5.2.1.2 อบจานเพาะเชอ้ื ที่ 35 + 2°C เปน็ เวลา 16-18 ชม. สำ� หรบั วิธี disk diffusion หรอื 16-20
ชม. สำ� หรับ broth dilution
5.2.1.3 การตรวจคัดกรองถา้ inhibition zone ของ ertapenem = 19-21 mm หรอื meropenem
= 16-21 mm แสดงวา่ เชือ้ ทีท่ ดสอบอาจมกี ารสร้างเอนไซม์ carbapenemase
5.2.1.4 MICs ของ ertapenem = 2 μg/ml หรอื imepenem = 2-4 μg/ml หรอื meropenem = 2-4
μg /ml แสดงวา่ เช้ือทท่ี ดสอบอาจมกี ารสร้างเอนไซม์ carbapenemase
5.2.1.5 กรณีได้ผลตรวจคัดกรองบวกต้องตรวจยืนยนั โดยวิธี modified-Hodge test
หมายเหตุ ไมใ่ ช้ imepenem disk ในการตรวจคดั กรองหา carbapenemases เพราะให้ผลไมด่ ี

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทัว่ ไป 255

5.3 การตรวจยนื ยนั การสรา้ ง Carbapenemase ของเชอ้ื Enterobacteriaceae โดย modified- Hodge test (MHT)
5.3.1 วิธปี ฏิบัติ
5.3.1.1 เตรยี ม E.coli ATCC 25922 ใหไ้ ด้ความขนุ่ 0.5 McFarland standard โดยวิธี direct colony
suspension หรือ growth method ใน broth หรอื นำ�้ เกลอื แล้วเจือจางให้เปน็ 1:10 ใน broth
หรือน�้ำเกลอื
5.3.1.2 ใช้ cotton swab ป้ายเชอ้ื ในขอ้ 1 ลงบน MHA แบบเดยี วกับการท�ำ disk diffusion test
5.3.1.3 หลังปล่อย plate ไว้ 3-10 นาทใี ห้แหง้ วางแผน่ ยาทดสอบ ertapenem ขนาด 10 μg หรือ

meropenem 10 μg ทก่ี ลาง plate
5.3.1.4 ใช้ loop ขนาด 10 μl เข่ยี เชื้อทจ่ี ะทดสอบ 3-5 โคโลนที ่ีเพาะบน BA นาน 18-24 ชม. ปา้ ยเปน็
เสน้ ตรงลากจากแผน่ ยาทดสอบมาจนสดุ ขอบ plate ยาวอยา่ งนอ้ ย 20-25 mm
5.3.1.5 ท�ำการทดสอบในข้อที่ 4 กับเชื้อมาตรฐานทีใ่ ช้ควบคุมคุณภาพทงั้ สายพนั ธุ์ MHT positive
และ MHT negative
5.3.1.6 อบเชือ้ ที่อณุ หภูมิ 35±2 °C เปน็ เวลา 16-20 ชม.
5.3.2 การอ่านผล
อ่านผลโดยดกู ารเหน่ยี วนำ� การเติบโต (enhanced growth) ของเชือ้ E. coli ATCC 25922 ท่ีตำ� แหน่งท่ีตดั
กับเชอ้ื ที่ทดสอบ ถ้าพบ enhanced growth แสดงว่าเชอ้ื ทท่ี ดสอบมกี ารสรา้ ง carbapenemase หรือ carbapenemase
production บวก ถ้าไมพ่ บ enhanced growth คือ carbapenemase production ลบ
5.3.3 การรายงานผล
5.3.3.1 เช้ือที่ใหผ้ ล MHT positive และการตรวจคัดกรองโดย ertapenem หรอื meropenem disk
diffusion บวก (inhibition zone; ertapenem 19-21 mm meropenem 16-21 mm) ต้องหาค่า
MIC กอ่ น รายงานผลการสร้าง carbapenemase
5.3.3.2 เช้ือทีใ่ ห้ MHT positive และ ertapenem MIC 2 μg/ml, imipenem MIC 2-4 μg/ml, หรอื
meropenem MIC 2-4 μg/ml รายงาน carbapenem ทกุ ตัวว่าด้ือ
5.3.3.3 เชอื้ ท่ใี ห้ MHT negative แปลผล carbapenem MICs ตาม CLSI interpretive criteria ตาราง
2A ใน M100-S24 (January 2014)
5.3.3.4 เชือ้ Enterobacteriaceae ท่ีสร้าง carbapenemase ไม่ได้ให้ผล MHT บวกทกุ ตัว และผล MHT
ทบ่ี วกอาจพบในเชอื้ สายพนั ธท์ุ ดี่ อ้ื carbapenem ดว้ ยกลไกอนื่ ทไ่ี มใ่ ชก่ ารสรา้ ง carbapenemase
5.3.3.5 MIC ของ imipenem ส�ำหรับ Proteus spp., Providencia spp. และ Morganella

morganii มักจะสงู กวา่ MIC ของ meropenem หรอื doripenem เชื้อเหล่าน้ีมี MIC ต่อ
ยา carbapenem สงู อาจเน่อื งจากกลไกอ่ืนๆ ท่ีไม่ใชก่ ารสรา้ ง carbapenemases
5.3.4 การควบคุมคณุ ภาพ
เช้ือควบคุมคุณภาพต้องท�ำการทดสอบบนจานเพาะเล้ียงเดียวกับเชื้อที่ทดสอบ และต้องท�ำการควบคุม
คณุ ภาพทุกวนั ที่ท�ำการทดสอบ ใช้เชื้อ K. pneumoniae ATCC BAA-1705 เปน็ MHT positive control และ K.
pneumoniae ATCC BAA-1706 เปน็ MHT negative control

256 คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

MAC ที่ supplemented ดว้ ย imipenem 1 μg/ml สามารถใช้ตรวจคัดกรองหาเชือ้ carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae (CRE) ที่ colonize ในทางเดินอาหารได้ดว้ ยความไวมากกว่า 80% และความจ�ำเพาะมากกว่า
90% และสามารถใชต้ รวจหาเชอ้ื carbapenem-resistant Enterobacteriaceae สายพันธ์ุทมี่ คี า่ carbapenem MIC ตำ�่ ๆ
ไดด้ ้วย
6. การตรวจคัดกรองการดือ้ ยา aminoglycoside ระดับสงู ของเชอ้ื Enterococcus spp.
6.1. หลักการ การด้อื ยา gentamicin และ/หรอื streptomycin ระดับสูง ช้บี ง่ วา่ เชอ้ื enterococcal isolate นั้น
จะไม่ถกู ทำ� ลายโดยการเสริมฤทธขิ์ อง penicillin หรอื glycopeptides รวมกับ aminoglycoside agar หรือ broth ทีม่ ี
gentamicin (500 µg/ml) หรือ streptomycin (1,000 μg/ml ในวุน้ หรอื 2,000 μg/ml ในอาหารเหลว) ความเข้มขน้
สูง สามารถใช้ในการตรวจคัดกรองการด้ือยาดังกล่าวได้ (ตาราง Screening test for Detection of High-Level
Aminoglycoside Resistance (HLAR) in Entrococcus species ใน M100) aminoglycosides อ่นื ๆ นอกเหนือจาก
gentamicin และ streptomycin ไม่ตอ้ งนำ� มาตรวจคัดกรองเพราะไมไ่ ดผ้ ลท่ดี กี วา่
Enterococci อาจด้อื ยา penicillin และ ampicillin เนอื่ งจากมกี ารผลิต low affinity PBPs และอาจเกดิ จาก
กลไกทพี่ บได้นอ้ ย คือ การผลติ β-lactamase ทงั้ agar และ broth dilition test สามารถตรวจหาเช้ือทีม่ ี altered PBPs
ไดเ้ ม่นย�ำ แต่ไมส่ ามารถตรวจการผลิต β-lactamase ได้ เชื้อ β-lactamase-producing strains of enterococci สามารถ
ตรวจหาได้โดย nitrocefin-based β-lactamase test ผลบวกของ β-lactamase test ใช้ในการช้ีบ่งว่าด้ือต่อยา
penicillin. เช้อื enterococci ท่มี ี ampicillin และ penicillin MICs > 16 mg/ml จดั ว่าดอื้ ยา
เชื้อ Enterococci ทด่ี อ้ื penicillin (MICs ≤ 64 µg/ml) หรือ ampicillin (MICs ≤ 32 mg/ml) ในระดับตำ�่ อาจ
ถูกท�ำลายโดยการเสริมฤทธ์ิของ penicillin ร่วมกับ gentamicin หรือ streptomycin ในกรณีที่เช้ือไม่ได้ดื้อยา
gentamicin หรือ streptomycin ในระดับสูง และผู้ป่วยได้รับ high dose of penicillin เช้ือท่ีด้ือในระดับสูงต่อยา
penicillin (MICs ≥ 128 µg/ml) หรอื ampicillin (MICs ≥ 64 µg/ml) อาจไมไ่ ด้ผลดใี นการเสรมิ ฤทธ์ิท่กี ลา่ วมา
6.2 Disk diffusion test
6.2.1 วิธีปฏบิ ัติ
6.2.1.1 ป้ายเชื้อท่ีมีความเข้มข้นเท่ากับ 0.5 McFarland ลงบน MHA ตามวิธีการ Standard disk
diffusion test
6.2.1.2 วางแผ่นยาทดสอบ gentamicin 120 μg หรือ streptomycin 300 μg ลงบนจานเลย้ี งเชอ้ื

ในขอ้ 6.2.1.1
6.2.1.3 อบเชอื้ ท่ี 35+2 °C เป็นเวลา 16-18 ชม. ส�ำหรบั gentamicin และ 24-28 ชม. ส�ำหรับ

streptomycin
6.2.2 การอ่านและการแปลผล
6.2.2.1 Inhibition zone ขนาด 6 mm รายงานวา่ ด้อื ยาท่ีทดสอบ ซึ่งหมายความวา่ ไม่มีการเสริม
ฤทธ์ิ (synergist) ของ aminoglycoside ที่ใช้ทดสอบกบั ยาท่ีออกฤทธิ์ทผี่ นังเซลล์ เชน่
penicillin, ampicillin และ vancomycin

6.2.2.2 Inhibition zone ขนาด 7-9 mm ยงั รายงานผลไม่ได้ ต้องทำ� การตรวจยืนยนั ด้วย agar
dilution test หรือ broth micro-dilution test

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลท่ัวไป 257

6.2.2.3 Inhibition zone ขนาด ≥ 10 mm รายงานวา่ ไวตอ่ ยาทใี่ ชท้ ดสอบ ซงึ่ หมายความวา่ มกี ารเสรมิ
ฤทธ์ิ (synergist) ของ aminoglycoside ทใ่ี ช้ทดสอบกับยาที่ออกฤทธท์ิ ่ีผนงั เซลล์ เช่น
penicillin, ampicillin และ vancomycin

6.2.3 การรายงานผล
รายงานผลด้ือหรือไวต่อยา aminoglycoside ที่ใช้ทดสอบ และควรระบุขนาดของยาที่ใช้ทดสอบ
เช่น รายงาน
6.2.3.1 Susceptible to gentamicin (120 μg) หรอื streptomycin (1,000 μg)
6.2.3.2 Resistant to gentamicin (120 μg) หรอื streptomycin (1,000 μg)
6.2.3.3 ไม่มกี ารรายงานผล intermediate

6.2.4 การควบคุมคณุ ภาพ
6.2.4.1 ใช้เช้อื E. faecalis ATCC 29212 ส�ำหรับการควบคุมความไวต่อยา aminoglycoside
ของเช้ือ Enterococcus spp.
6.2.4.2 ใชเ้ ชอ้ื E. faecalis ATCC 51299 สำ� หรับการควบคุมการดอ้ื ยา aminoglycoside ของ
เช้ือ Enterococcus spp.
6.3 Broth microdilution test

6.3.1 วธิ ีปฏิบตั ิ
6.3.1.1 เตรยี มเช้ือตามวิธีการ Standard broth dilution method ส�ำหรบั การท�ำ susceptibility test
6.3.1.2 ใช้ BHI broth ทม่ี ยี า gentamicin 500 μg/ml หรือ streptomycin 1,000 μg/ml
6.3.1.3 อบเชอ้ื ท่ี 35± 2 °C เป็นเวลา 24 ชม. สำ� หรับ gentamicin และ 24-28 ชม. ส�ำหรับ
streptomycin ถ้าไวต่อยาตอ้ งอบจนครบ 48 ชม.

6.3.2 การอา่ นและการแปลผล
6.3.2.1 ถ้าพบมเี ชอ้ื ขึน้ แสดงวา่ มีการด้อื ยา aminoglycoside ตวั ทีใ่ ช้ทดสอบในระดับสูงซ่งึ
หมายความว่า ไม่มีการเสริมฤทธ์ิ (synergist) ของ aminoglycoside ท่ใี ชท้ ดสอบกับสาร
ต้านจลุ ชพี ที่ออกฤทธทิ์ ี่ผนังเซลล์ เช่น penicillin, ampicillin และ vancomycin
6.3.2.2 ถ้าพบไม่มีเช้ือข้ึนแสดงว่าไวต่อยา aminoglycoside ท่ีใช้ทดสอบ ซ่ึงหมายความว่า มีการ
เสริมฤทธ์ิ (synergist) ของ aminoglycoside ทใี่ ชท้ ดสอบกบั สารตา้ นจลุ ชพี ทอี่ อกฤทธท์ิ ผี่ นงั
เซลล์ เชน่ penicillin, ampicillin และ vancomycin

6.3.3 การรายงานผล
รายงานผลดอื้ หรอื ไวตอ่ ยา aminoglycoside ทใี่ ชท้ ดสอบ และควรระบขุ นาดของสารตา้ นจลุ ชพี ทใ่ี ชท้ ดสอบ
เช่น รายงาน
6.3.3.1 Susceptible to gentamicin (500 µg/ml) หรือ streptomycin (1,000 µg/ml)
6.3.3.2 Resistant to gentamicin (120 µg/ml) หรอื streptomycin (1,000 µg/ml)
6.3.4 การควบคุมคณุ ภาพ
6.3.4.1 ใชเ้ ชอ้ื E. faecalis ATCC 29212 สำ� หรบั การควบคุมความไวต่อยา aminoglycoside ของ

เชื้อ Enterococcus spp.
6.3.4.2 ใชเ้ ชือ้ E. faecalis ATCC 51299 สำ� หรบั การควบคมุ การดอ้ื ยา aminoglycoside ของเชื้อ

Enterococcus spp.

258 คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รยี และรา

6.4 Agar dilution test
6.4.1 วธิ ีปฏบิ ตั ิ

6.4.1.1 เตรียมเชือ้ ตามวิธีการ Standard agar dilution method สำ� หรบั การทำ� susceptibility test
6.4.1.2 ใช้ BHI agar ที่มียา gentamicin 500 μg/ml หรอื streptomycin 2,000 μg/ml
6.4.1.3 หยดเชอ้ื ทเี่ ทียบความขุน่ ได้เท่ากบั 0.5 McFarland ปรมิ าณ10 μl ลงบนอาหารเล้ียงเชอ้ื

ในขอ้ ที่ 6.4.1.2
6.4.1.4 อบเชอื้ ท่ี 35± 2 °C เป็นเวลา 24 ชม. ส�ำหรบั gentamicin และ 24-28 ชม. ส�ำหรบั

streptomycin ถา้ ไวตอ่ ยาต้องอบจนครบ 48 ชม.
6.4.2 การอ่านและการแปลผล
6.4.2.1 ถ้าพบมีเช้ือข้ึนมากกว่าหรือเท่ากับ 1 โคโลนี อ่านผลว่าเช้ือดื้อยา แสดงว่ามีการดื้อยา

aminoglycoside ทใี่ ชท้ ดสอบในระดบั สูง ซึง่ หมายความวา่ ไม่มีการเสรมิ ฤทธ์ิ (synergist)
ของ aminoglycoside ที่ใช้ทดสอบกับยาท่อี อกฤทธิ์ท่ีผนงั เซลล์ เชน่ penicillin, ampicillin
และ vancomycin

6.4.2.2 ถ้าพบไมม่ ีเชอ้ื ขน้ึ แสดงว่าไวต่อยา aminoglycoside ท่ใี ชท้ ดสอบ ซึง่ หมายความว่า มีการ
เสรมิ ฤทธ์ิ (synergist) ของ aminoglycoside ทใ่ี ช้ทดสอบกบั ยาที่ออกฤทธท์ิ ีผ่ นงั เซลล์ เชน่
penicillin, ampicillin และ vancomycin
6.4.3 การรายงานผล
รายงานผลด้อื หรอื ไวตอ่ ยา aminoglycosise ทใ่ี ช้ทดสอบ และควรระบขุ นาดของยาทใ่ี ช้ทดสอบ เชน่
รายงาน
6.4.3.1 Susceptible to gentamicin (500 µg/ml) หรือ streptomycin (2,000 µg/ml)
6.4.3.2 Resistant to gentamicin (500 µg/ml) หรือ streptomycin (2,000 µg/ml)
6.4.4 การควบคมุ คุณภาพ
6.4.4.1 ใช้เชอ้ื E. faecalis ATCC 29212 สำ� หรบั การควบคุมความไวต่อยา aminoglycoside

ของเชอ้ื Enterococcus spp.
6.4.4.2 ใช้เช้ือ E. faecalis ATCC 51299 สำ� หรับการควบคมุ การดอื้ ยา aminoglycoside ของเชื้อ

Enterococcus spp.
7. การตรวจคัดกรองการดื้อยา vancomycin ในเช้ือ Enterococcus spp.
7.1 หลักการ การตรวจหาเชื้อ vancomycin resistant enterococci (VRE) ใหไ้ ด้ผลแมน่ ยำ� สามารถทำ� โดยวธิ ี
agar หรือ broth dilution และยังสามารถทดสอบโดยการใช้ vancomycin screen plate ทมี่ ียา vancomycin 6 μg/ml

7.2 วิธีปฏบิ ตั ิ
7.2.1 เตรยี มเชอื้ โดยวธิ ี growth method หรอื direct colony suspension ใหไ้ ดค้ วามขนุ่ เทา่ กบั 0.5 McFarland
7.2.2 เตรียม BHI agar ท่มี ียา vancomycin 6 µg/ml
7.2.3 หยดเช้อื ในขอ้ 7.2.1 ปรมิ าณ 1-10 μl ลงบนอาหารเล้ียงเชือ้ ในข้อท่ี 7.3.2 หรือใช้ swab จมุ่ เช้อื และบดิ
ใหแ้ หง้ หมาดๆ ปา้ ยเปน็ วงใหไ้ ดเ้ สน้ ผา่ นศนู ยก์ ลางเทา่ กบั 10-15 mm. หรอื ปา้ ยเปน็ แถบสนั้ ๆบน plate
7.2.4 อบเชอื้ ท่ี 35± 2 °C เปน็ เวลา 24 ชม.

ส�ำหรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทวั่ ไป 259

7.3 การอา่ นและการแปลผล
ถา้ พบมีเชือ้ ขน้ึ มากกวา่ หรือเท่ากับ 1 โคโลนี (presumptive vancomycin resistance) ต้องท�ำการตรวจยืนยัน
การดอื้ ยาโดยหา MIC ของยา vancomycin เพ่อื แยกเชือ้ ทีด่ ้อื ยา vancomycin ชนิด acquired resistance (vanA หรอื
vanB) ออกจากเช้ือที่ด้ือยาชนิด intrinsic intermediate level resistance to vancomycin (vanC) เช่นเชื้อ
E. gallinarum และ E. casselifavus ซงึ่ มี MIC ต่อยา vancomycin 8-16 μg/ml
7.4 การรายงานผล
รายงานผลการตรวจคัดกรองวา่ ดือ้ หรอื ไวต่อยา vancomycin
Negative report: “Negative - No Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) isolated”
Positive report: “Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium isolated”
เมอื่ พบเชื้อ enterococci ดื้อ vancomycin ทำ� การวินิจฉยั ชนดิ ของ enterococci และรายงานให้ผใู้ ช้บริการทราบ
ควรรายงานเชอื้ vancomycin-resistant enterococci ทแี่ ยกไดจ้ ากผปู้ ว่ ยทกุ รายใหก้ ลมุ่ งานทเี่ กยี่ วขอ้ งกบั การควบคมุ
โรคตดิ เช้ือในโรงพยาบาลทราบทนั ทีทแ่ี ยกเชอ้ื ได้
7.5 การควบคุมคณุ ภาพ

7.5.1 ใช้เช้ือ E. faecalis ATCC 29212 ส�ำหรับการควบคุมความไวต่อยา aminoglycoside ของเชื้อ
Enterococcus spp.

7.5.2 ใช้เชอ้ื E. faecalis ATCC 51299 สำ� หรบั การควบคมุ การดอื้ ยา aminoglycoside ของเชอ้ื
Enterococcus spp.

8. การตรวจหาการดือ้ vancomycin ของเชอ้ื Staphylococcus coagulase positive โดยวธิ ี agar screen
8.1 หลักการ ประเทศสหรัฐอเมรกิ าไดร้ ายงานเช้อื Staphylococcus aureus ท่ีใหค้ ่า MIC ของ vancomycin ต้งั แต่
32 μg/ml-1024 μg/ml ในชว่ งปี 2545-2550 และกลไกของการดอื้ vancomycin ในเชอ้ื กลมุ่ นย้ี งั ไมท่ ราบสาเหตชุ ดั เจน
แตพ่ บยนี ส์ vanA ในทกุ สายพนั ธแ์ุ ละคาดวา่ นา่ จะมาจากการพฒั นาของเชอื้ สายพนั ธท์ุ เ่ี ปน็ MRSA การตรวจหา S.
aureus ทีใ่ หค้ า่ MIC ของ vancomycin ≥ 32 μg/ml สามารถใช้วิธี disk diffusion หรือ vancomycin screen agar และ
การหา MIC แต่หากค่า MIC < 32 μg/ml จะไมส่ ามารถใช้วิธี disk diffusion ได้ สำ� หรบั vancomycin screen agar
สามารถใช้ได้ดีในกรณีทค่ี ่า MIC ≥ 8 μg/ml แต่ไมส่ ามารถตรวจหาเช้ือ S. aureus ทีใ่ ห้ MIC 4 μg/ml (vancomycin
intermediate) ได้ และวธิ ีน้ยี งั ไมถ่ ูกรับรองให้ใชต้ รวจใน coagulase-negative staphylococci
8.2 วธิ ปี ฏิบัติ
8.2.1 เตรยี ม inoculums ของเช้อื ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเช้ือตอ่ ยาด้วยวิธี disk diffusion
8.2.2 ใช้ swab จุ่ม inoculum แลว้ แตะข้างหลอดเพือ่ บีบใหส้ ่วนเกนิ ไหลออก นำ� มาแตะและวนเป็น

วงเส้นผา่ นศูนยก์ ลาง 10-15 mm บน BHI agar ท่ผี สม 6 μg/ml vancomycin อบเชื้อท่ี 35± 2 °C
นาน 24 ชม.
8.2.3 ตรวจดโู คโลนเี ลก็ ๆของเช้ือ (> 1 โคโลนี) หรือฝ้าของเชือ้ บนผิว agar หากพบการเจริญดงั กล่าว
แสดงวา่ เชอื้ ไวต่อยา vancomycin นอ้ ยลง
8.3 การรายงานผล
ก่อนรายงานผลต้องท�ำการวินิจฉัยเชื้อซ้�ำ และหาค่า MIC ของ vancomycin เพ่ือยืนยันว่าเช้ือไวต่อยา
vancomycin นอ้ ยลง

260 ค่มู ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

8.4 การควบคมุ คณุ ภาพ
ทดสอบกับเชอ้ื E. faecalis ATCC 29212 หรือ S. aureus ATCC 29213 (vancomycin susceptible) ซงึ่ เป็น
negative control และ เชื้อ E. faecalis ATCC 51299 (vancomycin resistant) ซง่ึ เปน็ positive control
9. D-test
9.1 หลักการ เปน็ วธิ ที ใ่ี ชต้ รวจหา inducible clindamycin resistance ในเชอ้ื กลมุ่ staphylococci และ β-hemolytic
streptococci ทดี่ ้อื ต่อยากล่มุ macrolides วิธีการตรวจสามารถกระท�ำได้ 2 วิธี ได้แก่ disk diffusion และ single well
broth microdilution test แตว่ ธิ ีแรกเปน็ วิธที ่ที ำ� ได้งา่ ย จึงขอนำ� มากลา่ วไว้ในท่นี ้ี
9.2 วิธปี ฏิบตั ิ

9.2.1 เตรยี ม inoculum ของเช้อื ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชอ้ื ต่อยาด้วยวธิ ี disk diffusion
9.2.2 กรณเี ชอื้ staphylococci ให้ spread บน MHA แต่เชอื้ β-hemolytic streptococci ให้ spread บน
MHA ท่ี ผสม 5% sheep blood
9.2.3 วาง disk ยา erythromycin (15 μg) และ disk ยา clindamycin (2 μg) ให้ห่างกัน 15 -26 mm .
สำ� หรับเช้ือ staphylococci และห่างกนั 12 mm ส�ำหรับเชื้อ β-hemolytic streptococci
9.2.4 อบที่ 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.ส�ำหรับเชื้อ staphylococci และ อบท่ี 35± 2 °C, 5% CO2 นาน
20-24 ชม. สำ� หรบั เช้อื β-hemolytic streptococci
9.2.5 ตรวจดู inhibition zone ของเช้อื ตอ่ ยา clindamycin ด้านที่อย่ใู กลก้ บั erythromycin วา่ แบนเป็นรปู
อกั ษร D หรือพบการเจริญของเชื้อภายใน inhibition zone ของยา clindamycin แมจ้ ะไม่เหน็ D zone
แสดงวา่ เชื้อเป็น inducible clindamycin resistance

ภาพท่ี 6-2 ลักษณะของ D-test
9.3 การรายงานผล

หากพบลกั ษณะดงั กลา่ วข้างตน้ ให้รายงานวา่ เช้ือดือ้ ยา clindamycin และเพมิ่ เติมข้อความว่า inducible
clindamycin resistance
9.4 การควบคมุ คุณภาพ
ทดสอบกบั เชือ้ S. aureus ATCC BAA-976 ซึ่งเป็น D-zone test negative control และ เชือ้ S. aureus ATCC
BAA-977 ซงึ่ เป็น D-zone test positive control

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 261

10. E-test
10.1 หลักการ
Epsilometer test (E-test) เป็นวิธีการทางหอ้ งปฏิบัติการทใ่ี ช้ตรวจหาความไวของเชอ้ื แบคทีเรยี หรอื
เช้อื ราตอ่ สารต้านจุลชีพแบบปริมาณวิเคราะหโ์ ดยอาศยั หลักการของ agar diffusion method ใช้แถบทีเ่ ปน็
rectangularstripซง่ึ มสี ารตา้ นจลุ ชพี ทต่ี อ้ งการทดสอบเคลอื บอยใู่ นปรมิ าณทลี่ ดหลน่ั เปน็ สดั สว่ นกบั ตำ� แหนง่
บนแถบยา เมื่อวางแถบยาทดสอบบน agar plate ที่ป้ายเชื้อที่ทดสอบไว้ ยาในแถบทดสอบจะแผ่กระจาย
(diffuse out) ไปในเนื้อวุ้นเกิดเป็น exponential gradient ท่ีแถบยาทดสอบมีตัวเลข บอกปริมาณสารต้าน
จลุ ชีพในแต่ละต�ำแหน่ง หลังจากเพาะไว้ 24 ชม. จะเกดิ inhibition zone ลักษณะเป็นวงรี (elliptical zone of
inhibition) จุดตดั ของ inhibition zone กับขอบของแถบยาทดสอบ จะเป็นค่า MIC (minimum inhibitory
concentration) ที่อา่ นไดด้ งั แสดงในรูป
E-test เหมาะสำ� หรบั การทดสอบหาคา่ MIC ของเชอื้ ทตี่ อ้ งการทดสอบกบั สารตา้ นจลุ ชพี เพยี งชนดิ เดยี ว
หรอื ไมก่ ช่ี นดิ เนอื่ งจากทำ� ไดส้ ะดวกและมคี วามเมน่ ยำ� สงู แตแ่ ถบยาทดสอบทใ่ี ชม้ รี าคาสงู งานบรกิ ารประจำ� วนั
ทใ่ี ช้ E-test เช่น การหาคา่ MIC vancomycin ในเชอื้ Staphylococcus spp., MIC penicillin, cephalosporins,
vancomycin ในเชื้อ Streptococcus pneumoniae

ภาพที่ 6-3 Epsilometer test (E-test)
10.2 วธิ ปี ฏบิ ัติ
10.2.1 ปา้ ยเชอ้ื ทมี่ คี วามเขม้ ขน้ เทา่ กบั 0.5 McFarland ลงบน MHA ตามวธิ กี าร Standard disk diffusion test
10.2.2 วางแถบยาทดสอบ E-test ลงบนผวิ วนุ้ ทใ่ี ชเ้ พาะเลยี้ งเชอ้ื ตามขอ้ 10.2.1 โดยใหด้ า้ นทม่ี ตี วั เลขบอก
ปรมิ าณอยดู่ า้ นบนและใหผ้ วิ ของแถบยาทง้ั แถบแนบกบั ผวิ agar อาจใช้ forceps กดแถบยา เบาๆ
ไมใ่ หม้ ีฟองอากาศใตแ้ ถบยา
10.2.3 จานเพาะเลี้ยงเชื้อขนาด 100 mm วางแถบยา E-test ไดห้ นง่ึ แถบ จานขนาด 150 mm วางได้
6 แถบ

262 คมู่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

10.2.4 อบเชือ้ ตามอณุ หภมู ิและเวลาที่เหมาะสมส�ำหรับสารตา้ นจลุ ชีพและเช้อื แตล่ ะชนิดตามการ
ทดสอบ disk diffusion test
10.3 การอา่ นและการแปลผล
10.3.1 จุดตดั ของ inhibition zone ทเี่ ป็นวงรกี ับขอบของแถบยาทดสอบ E-test จะเป็นคา่ MIC
(minimum inhibitory concentration) โดยสามารถอ่านค่าตามตัวเลขทรี่ ะบบุ นแถบยาทดสอบ
ทีต่ ำ� แหน่งจดุ ตัดน้ี
10.3.2 กรณไี มม่ ี inhibition zone คือเช้ือขน้ึ ชดิ ขอบของแถบยาตลอดแนว รายงานคา่ MIC มากกวา่
คา่ สูงสดุ ของความเขม้ ข้นยาทรี่ ะบบุ นแถบยา E-test
10.3.3 กรณีท่ีจดุ ตัดของ inhibition zone อยู่ต่ำ� กว่าปรมิ าณยาทต่ี ำ่� สุดของ E-test รายงานคา่ MIC ต่�ำ
กวา่ คา่ ต�ำ่ สุดของยาที่ระบบุ นแถบยา E-test
10.3.4 กรณี MIC ที่อา่ นได้อยู่ระหวา่ งค่าท่รี ะบบุ นแถบยา ให้รายงาน MIC ตามคา่ ทีส่ ูงกวา่ จุดตัด
ของ inhibition zone กบั ขอบของแถบยา
10.4 การควบคมุ คุณภาพ
10.4.1 ใชเ้ ช้อื E. coli ATCC 25922 สำ� หรับการควบคุมคุณภาพการทดสอบความไวของเช้อื
แบคทเี รียแกรมลบ
10.4.2 ใชเ้ ชื้อ S. aureus ATCC 29213 ส�ำหรับการควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเช้อื
แบคทีเรยี แกรมบวก
10.4.3 ใชเ้ ชือ้ P. aeruginosa ATCC 27853 ส�ำหรับการควบคุมคณุ ภาพการทดสอบความไวของเช้อื
แบคทีเรียแกรมลบ Non-fermentative
10.4.4 ทำ� การควบคมุ คุณภาพตามความเหมาะสม ส�ำหรบั เชอ้ื และยาแต่ละชนดิ ตามทีใ่ ช้ในการทดสอบ
แบบ disk diffusion test

สำ� หรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 263

เอกสารอ้างองิ
1. Adler A, Navon-Venezia S, Moran-Gilad J, Marcos E, Schwartz D, Carmeli Y. Laboratory and Clinical
evaluation of screening agar plates for detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from sur
veillance rectal swabs. J Clin Microbiol 2011; 49: 2239-2242.
2. Hindler JF and Munro S. Beta-lactamase Test. In Garcia, L.S. editor in chief. Clinical Micro
biology Procedures Handbook, 3rd edn. ASM Press. Washington DC; 2010.p.5.1.3-5.1.6
3. Landman D, salamera J, Singh M, Quale J. Accuracy of carbapenem nonsusceptibility for identification
of KPC-possessing Enterobacteriaceae by use of the revised CLSI breakpoints. J Clin Microbiol
2011;49:3931-3933.
4. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved
Standard-Ninth Edition. CLSI M07-A49 January 2012.
5. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Tenth Edition.
CLSI M02-A10 January 2009.
6. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard Eleventh Edition.
Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M2-A11, Wayne, PA.
7. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for bacteria That Grow Aerobically; Approved
Standard-Ninth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M07-A9, Wayne, PA.
8. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty Informational Supplement (June
2010, Update). Clinical and Laboratory Standard Institute, 2010 M100-S20-U (June 2010, Update). Wayne, PA.
9. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Second Informational
Supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M100-S22, Wayne, PA.
10. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement.
CLSI M100-S24 January 2014.
11. Willey B. M., B. N. Kreiswirth, A. E. Simor, G. Willaims, S. R. Scriver, A. Phillips, D. E. Low Detection
of vancomycin resistance in Enterococcus species. J Clin Microbiol 1992; 30: 1621-1624.
12. Willey B. M., R. N. Jones, A. McGeer, W. Witte, G. French, R. B. Roberts, S. G. Jenkins, H. Nadler, D.
E. Low Practical Approach to the Identification of Clinically Relevant Enterococcus Species Diag
Microbiol Infect Dis 1999; 34: 165-171.

264 คมู่ อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รียและรา

บ7ทที่

การควบคมุ คณุ ภาพ
ในห้องปฏิบตั ิการ

แบคทเี รีย

การควบคมุ คุณภาพในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารแบคทเี รยี
ปทมุ พิศ วิมลวัตรเวที
การควบคมุ คณุ ภาพในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารแบคทเี รยี นบั วา่ มคี วามสำ� คญั อยา่ งยง่ิ ในการทจ่ี ะนำ� ผลการตรวจวเิ คราะห์
ไปใช้เป็นแนวทางในการรักษาผู้ป่วย ป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อโรคได้อย่างถูกต้องและเป็นไปอย่างมี
ประสทิ ธภิ าพ ซง่ึ ผปู้ ฏบิ ตั งิ านจะตอ้ งมคี วามรคู้ วามสามารถในการตรวจวเิ คราะหเ์ พอ่ื ใหท้ ราบถงึ สาเหตขุ องการกอ่
ให้เกิดโรค การควบคุมคุณภาพให้ได้ผลดีควรมีการปรับปรุงคุณภาพและแก้ไขข้อผิดพลาดท่ีเกิดขึ้นอย่างต่อเน่ือง
ในทกุ ขน้ั ตอนตงั้ แตก่ ระบวนการกอ่ นการตรวจวเิ คราะห์ เชน่ การเกบ็ สง่ิ สง่ ตรวจ การนำ� สงิ่ สง่ ตรวจสง่ หอ้ งปฏบิ ตั ิ
การ กระบวนการในการตรวจวเิ คราะห์ ซง่ึ รวมถงึ การเตรยี มอาหารเลยี้ งเชอื้ การแยกวนิ จิ ฉยั เชอ้ื การตรวจสอบทาง
น�้ำเหลืองวิทยา การทดสอบความไวของเชื้อต่อสารตา้ นจุลชีพ และกระบวนการหลงั การตรวจวิเคราะห์
แนวทางการควบคุมคุณภาพในหอ้ งปฏบิ ัติการแบคทเี รยี มดี งั นี้
1. กระบวนการกอ่ นการวิเคราะห์
1.1 คู่มอื คณุ ภาพการปฏบิ ตั ิงาน ห้องปฏบิ ตั ิการตอ้ งมีการจดั เตรียมเอกสารค่มู ือคุณภาพต่างๆ
1.1.1 คู่มือในการเก็บส่ิงส่งตรวจต่างๆ เพื่อใช้เป็นแนวทางในการเก็บส่ิงส่งตรวจ แจกจ่ายให้กับผู้ใช้
บรกิ าร และตามหอผูป้ ่วยต่างๆ โดยระบถุ ึงวธิ กี ารเกบ็ ทถี่ กู ต้อง ปริมาณของสงิ่ สง่ ตรวจชนิดและประเภทภาชนะท่ี
ใช้ในการเก็บสิ่งส่งตรวจ พร้อมทั้งระบุสภาวะและก�ำหนดระยะเวลาในการน�ำส่งยังห้องปฏิบัติการ เพ่ือป้องกัน
ไม่ใหส้ ิ่งสง่ ตรวจแปรสภาพหรอื แปรสภาพน้อยท่สี ดุ กอ่ นท�ำการวเิ คราะห์
1.1.2 คมู่ ือคณุ ภาพในการปฏบิ ัตงิ านทเี่ ปน็ ปัจจุบนั เชน่ คมู่ อื การตรวจวินิจฉยั ส่งิ ส่งตรวจชนิดตา่ งๆ ข้อ
ควรระมัดระวังและข้อพึงปฏิบัติในห้องปฏิบัติการ การใช้และการบ�ำรุงรักษาอุปกรณ์เครื่องมือต่างๆ รวมถึงการ
ติดต่อสือ่ สารกบั ผใู้ ชบ้ ริการ
1.2 การเกบ็ สง่ิ ส่งตรวจและการนำ� ส่งหอ้ งปฏบิ ัติการ
สิง่ ส่งตรวจที่นำ� สง่ ห้องปฏิบตั กิ ารนั้น จำ� เปน็ อย่างย่งิ ท่ีจะต้องมีการเก็บให้ถูกวิธแี ละเลือกเกบ็ จากบรเิ วณท่ี
เกดิ สภาวะของโรค ถา้ สงิ่ สง่ ตรวจมกี ารเกบ็ ไมถ่ กู ตอ้ งจะมผี ลถงึ การแยกวนิ จิ ฉยั เชอ้ื แบคทเี รยี ทเี่ ปน็ สาเหตขุ องการ
ก่อโรค นอกจากนั้นกระบวนการในการน�ำส่งยังห้องปฏิบัติการจะต้องเป็นไปตามข้อก�ำหนดของห้องปฏิบัติการ
ในขณะนำ� สง่ หอ้ งปฏิบัติการ
1.3 ใบน�ำส่งสง่ิ ส่งตรวจ
ตอ้ งมกี ารระบชุ ่ือ นามสกลุ อายุ เพศ HN ของผปู้ ่วย การวนิ ิจฉัยเบ้ืองต้นของแพทย์ท่ชี ัดเจน ซงึ่ เปน็ สว่ น
ประกอบท่มี คี วามส�ำคัญ ในการใชเ้ ป็นแนวทางในการตรวจวิเคราะห์
1.4 ภาชนะบรรจสุ ่งิ สง่ ตรวจ
ภาชนะที่บรรจุสิ่งส่งตรวจไปยังห้องปฏิบัติการต้องสะอาดมีฝาปิดให้เหมาะสม ต้องไม่มีสิ่งส่งตรวจร่ัวซึม
มขี นาดเหมาะสมกบั สงิ่ สง่ ตรวจทจ่ี ะเกบ็ ปา้ ยชอื่ และรายละเอยี ดของผปู้ ว่ ยทต่ี ดิ ไวข้ า้ งภาชนะจะตอ้ งเขยี นใหช้ ดั เจน
และตดิ แนน่ ไม่ลอกหรือหลดุ งา่ ย
1.5 การตรวจสอบส่ิงส่งตรวจ
ชนิดของสง่ิ ส่งตรวจท่ีจัดเกบ็ ส่งห้องปฏิบัตกิ าร ตอ้ งถูกตอ้ งตรงกบั ที่ระบุไวใ้ นใบนำ� ส่ง และมีปรมิ าณที่
พอเพยี งตามทหี่ อ้ งปฏบิ ตั กิ ารกำ� หนดไวแ้ ละตอ้ งนำ� สง่ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารตามระยะเวลาทก่ี ำ� หนด ในการรบั สงิ่ สง่ ตรวจ
หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารจะตอ้ งตรวจสอบดคู วามเรยี บรอ้ ยของภาชนะทบี่ รรจสุ งิ่ สง่ ตรวจโดยจะตอ้ งไมม่ กี ารแตก รวั่ ซมึ หรอื
มกี ารหกเลอะเทอะ ตอ้ งตรวจสอบชอ่ื นามสกุล อายุ เพศ HN ให้ตรงกับระบไุ วใ้ นใบน�ำสง่ สง่ิ ส่งตรวจ

266 คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

ห้องปฏิบัติการจะต้องมีการก�ำหนดเกณฑ์ในการรับหรือปฏิเสธสิ่งส่งตรวจ การส่งสิ่งส่งตรวจเพ่ือให้ห้อง
ปฏบิ ตั กิ ารตรวจวเิ คราะหน์ นั้ จำ� เปน็ ตอ้ งมใี บนำ� สง่ สง่ิ สง่ ตรวจมาพรอ้ มกบั สงิ่ สง่ ตรวจเสมอ และสง่ิ สง่ ตรวจจะตอ้ ง
มีคุณสมบตั ิถกู ต้องตามเกณฑ์ทีห่ อ้ งปฏิบตั กิ ารกำ� หนด
2. กระบวนการในการตรวจวิเคราะห์
2.1 บคุ ลากร

บุคลากรท่ีปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการแบคทีเรีย จะต้องเป็นผู้ท่ีมีความรู้ความสามารถ และมี
ประสบการณใ์ นการปฏบิ ตั งิ านในการตรวจวเิ คราะห์ ควรมกี ารจดั ทำ� บนั ทกึ การฝกึ อบรมและตอ้ งไดร้ บั การพฒั นา
เพอื่ เพ่มิ พูนทักษะอยู่เสมอ การปฏิบตั ิงานจะต้องปฏบิ ัตติ าม universal precaution
2.2 สถานที่และสง่ิ แวดลอ้ ม

พื้นท่ีในการปฏิบัติการตรวจวินิจฉัยเช้ือแบคทีเรียน้ัน จะต้องมีพื้นที่ท่ีเหมาะสมแยกเป็นสัดส่วนเพื่อ
ป้องกันไม่ให้เกิดการปนเปื้อนและแพร่กระจายของเชื้อโรค มีการถ่ายเทอากาศท่ีดีและมีอุณหภูมิท่ีเหมาะสม มี
แนวทางปฏิบัตทิ ไ่ี ม่ให้บุคลากรท่ไี ม่เกี่ยวข้องเข้าปฏิบตั ิการ
2.3 สิง่ ส่งตรวจ

ผู้ปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการแบคทีเรียก่อนปฏิบัติงานจะต้องตรวจสอบว่าสิ่งส่งตรวจนั้นเหมาะสม
เชน่ สงิ่ สง่ ตรวจทเ่ี ปน็ เสมหะจะตอ้ งไมใ่ ชน่ ำ้� ลายหรอื มนี ำ�้ ลายปนเปอ้ื นมาก ภาชนะทบี่ รรจสุ งิ่ สง่ ตรวจตอ้ งไมม่ กี าร
รว่ั ซมึ หรอื มสี ง่ิ สง่ ตรวจหกเลอะเทอะ ตรวจสอบ ชอื่ นามสกลุ HN และชนดิ สง่ิ สง่ ตรวจใหต้ รงกบั ใบนำ� สง่ อกี ครง้ั
กอ่ นด�ำเนินการตรวจวเิ คราะห์ ระยะเวลาในการน�ำส่งและสภาวะของสงิ่ ส่งตรวจต้องเป็นไปตามเกณฑท์ ่กี �ำหนด
2.4 การด�ำเนนิ การตรวจวเิ คราะห์

ห้องปฏิบัติการจะต้องมีการจัดท�ำนโยบายและระบบในการบริหารจัดการระเบียบในการปฏิบัติงาน มี
การเลือกวิธีการตรวจวินิจฉัยเช้ือแบคทีเรียที่เหมาะสม จัดท�ำเป็นคู่มือคุณภาพและสื่อสารให้บุคลากรทุกคนรับ
ทราบ
2.4.1 อาหารเลยี้ งเชือ้

ห้องปฏิบัติการจะต้องมีการตรวจสอบคุณสมบัติของอาหารเล้ียงเชื้อ มีการบันทึกวันท่ี ที่ได้รับจาก
บรษิ ทั ผแู้ ทนจำ� หนา่ ยบนั ทกึ วนั ทที่ ม่ี กี ารเปดิ ใชใ้ หมท่ กุ ครง้ั หลงั การใชง้ านตอ้ งปดิ ฝาใหส้ นทิ แนน่ เกบ็ ไวใ้ นอณุ หภมู ิ
ทเี่ หมาะสมตามชนิดของอาหารเล้ยี งเชือ้ ทีร่ ะบุไวข้ า้ งภาชนะทบ่ี รรจุ และจดั ทำ� stock ให้เพยี งพอต่อการใช้งาน ซ่งึ
ข้นึ กบั ปรมิ าณงานของแตล่ ะห้องปฏิบตั ิการ

ในการเตรียมอาหารเลี้ยงเช้ือให้ปฏิบัติตามท่ีระบุไว้ท่ีขวดของอาหารเล้ียงเชื้อแต่ละชนิดโดยเคร่งครัด
ต้องอ่านฉลากข้างขวดให้ละเอียด มีการตรวจสอบและค�ำนวณน้�ำหนักให้ถูกต้อง เน่ืองจากอาหารเล้ียงเชื้อของ
แต่ละบริษัทจะใช้ปริมาณไม่เท่ากัน อาหารเล้ียงเชื้อท่ีหมดอายุ หรือจับกันเป็นก้อนแข็งหรือมีสีเปลี่ยนไป ไม่ควร
นำ� มาใช้ เมอื่ ใชเ้ สรจ็ แลว้ ตอ้ งปดิ ฝาขวดอาหารเลย้ี งเชอ้ื ใหส้ นทิ หลงั จากชงั่ เสรจ็ เรยี บรอ้ ยแลว้ ควรใชน้ ำ�้ ลา้ งอาหาร
เลีย้ งเชอ้ื ทตี่ ดิ บนกระดาษชง่ั สารลงไปในภาชนะทีใ่ ชเ้ ตรยี มดว้ ย เพอ่ื จะไดป้ ริมาณของอาหารเล้ียงเช้ือที่ถกู ตอ้ ง

เมือ่ เตรยี มอาหารเล้ียงเชอ้ื เสร็จแลว้ ให้สังเกตสีวา่ ผิดปกติหรือไม่ ตรวจสอบ pH ค่า pH ทว่ี ัดได้ไมค่ วร
เกนิ ± 0.2 ของค่า pH ทก่ี �ำหนด โดยตรวจสอบหลงั จากท้ิงไว้ใหเ้ ย็นทอี่ ุณหภมู ิห้อง ต้องตรวจสอบดว้ ยว่าอาหาร
เลย้ี งเช้ือชนดิ ใดบ้างท่ีไมต่ อ้ งนำ� เขา้ autoclave หรอื บางชนดิ ต้องท�ำให้ปลอดเชอ้ื โดยการกรอง ส�ำหรบั อาหารเลี้ยง

สำ� หรับโรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทั่วไป 267

เชือ้ ทต่ี ้องเติมสาร enrichment ต้องท�ำให้อาหารเลย้ี งเชอ้ื เยน็ ลงประมาณ 50-55 °C กอ่ น เนือ่ งจากสาร enrichment
ส่วนใหญ่จะไม่ทนต่อความร้อน การตรวจสอบคุณสมบัติของอาหารเล้ียงเชื้อนั้นจะต้องใช้เช้ือมาตรฐานตามท่ี
ก�ำหนดไวด้ ังตารางที่ 7-1

ตารางที่ 7-1 เชื้อมาตรฐานทใ่ี ชใ้ นการควบคมุ คุณภาพอาหารเล้ยี งเช้อื

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
Acetamide agar incubation no.
1-4 days Pseudomonas aeruginosa 27853 Pink to red
Acetate agar 13637 No color change
Stenotrophomonas
maltophilia 25922 Growth; ( blue
1-2 days Escherichia coli 12022 No growth or color
Shigella flexneri change
6305 Growth; α-hemolysis
α-Hemolytic Streptococcus 1 day Streptococcus pneumoniae 19615 Growth; β-hemolysis
agar 1 day Streptococcus pyogenes 25923 Inhibition
Blood agar basee 1-7 days Staphylococcus aureus 25922 Inhibition
1-7 days E. coli 6305 Growth; α-hemolysis
Blood culturee S. pneumoniae 19615 Growth; β-hemolysis
aerobic (vented) bottle S. pyogenes 25923 Growth
S. aureus 25922 Growth
Anaerobic(unvented) E. coli 27853 Growth
bottle biphasic bottle P. aeruginosa 6305 Growth
S. pneumoniae 10211 Growth
Haemophilus
6305 Growth
influenzae 25285 Growth
S. pneumoniae 10231 Growth
B. fragilis 19615 Growth
Candida albicans
S. pyogenes

268 ค่มู อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางท่ี 7-1 เชอ้ื มาตรฐานทใี่ ชใ้ นการควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ยี งเช้ือ (ต่อ)

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
Bordet-Gengou agar incubation no.
1-4 days Bordetella bronchiseptica 10580 Growth
Growth
Bordetella pertussis 12742
S. aureus

Campylobacter agars 2-3 days Campylobacter jejuni 25923 Inhibition
Staphylococcus 33291 Growth
12228 Inhibition
epidermidis
E. coli 25922 Inhibition
P. mirabilis 12453 Inhibition
P. aeruginosa 27853 Inhibition on some

C. albicans selective media but
growth on Campy,
Cetrimide agar 1day P. aeruginosa BAP, Skirrow,
THIO
Chocolate agar E. coli 10231 Inhibition on some
S. maltophilia selective media but
1-3 days Neisseria gonorrhoeae growth on Campy,
Skirrow, Preston
Modified Thayer-Martin, H. influenzae 27853 Growth; fluorescein
Martin-Lewis, N. gonorrhoeae pigment
modified Martin-Lewis Neisseria meningitidis 25922 Inhibition
S. epidermidis 13637 Inhibition
E. coli 43069 or Growth
P. mirabilis 43070
C. albicans 10211 Growth
Neisseria sicca 43069 Growth
13090 Growth
12228 Inhibition
25922 Inhibition
43071 Inhibition
60193 Inhibition
9913 Inhibition

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทว่ั ไป 269

ตารางที่ 7-1 เช้ือมาตรฐานทใี่ ชใ้ นการควบคมุ คณุ ภาพอาหารเลี้ยงเชือ้ (ตอ่ )

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
Growth
Clostridium difficile agar 2 days Clostridium difficile 9689 Inhibition
C. perfringens 13124 Inhibition
B. fragilis 25285 Inhibition
E. coli 25922 Growth; β-hemolysis
19615 Growth; α-hemolysis
Columbia agar basee 1 day S. pyogenes 6305 Growth
5% Sheep blood S. pneumoniae 25923 Inhibition
Colistin-nalidixic acide S. aureus 12453 Growth; proteolysis
P. mirabilis 13124 Growth
25285 Growth;yellow
Cooked meat 2 days C. perfringens 25923 Growth;yellow
B. fragilis 25922 Growth;blue-green
8427 No color change or deep
Cystine lactose electrolyte 1 day S. aureus 43069
decient agar (CLEDagar) E. coli red
Proteus vulgaris 43069 Yellow
25240 No color or deep red
Control N. gonorrhoeae 23971 Yellow
(nocarbohydrate added) N. gonorrhoeae 43069 No color or deep red
Glucose Moraxella catarrhalis 13090 Yellow
43069 No color or deep red
Lactose Neisseria lactamica 29212 Yellow
N. gonorrhoeae 19615 No color or deep red
29212 Yellow
Maltose N. meningitidis 9808 No color or deep red
N. gonorrhoeae 9913 Yellow
43069 No color or deep red
Mannitol Enterococcus faecalis
S. pyogenes

Sorbitol E. faecalis
Streptococcus bovis

Sucrose Neisseria sicca
N. gonorrhoeae

Decarboxylase broth 4 days

Control K. pneumoniae 13883 Yellow or no change
(no amino acid added) Enterobacter cloacae 13047 Purple to yellow-purple

270 ค่มู อื การปฏิบัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางท่ี 7-1 เชือ้ มาตรฐานทใ่ี ช้ในการควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ยี งเชอ้ื (ต่อ)

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
Arginine incubation no.
Lysine Yellow or no change
Ornithine 1-2 days K. pneumoniae 13883 Purple to yellow-purple
Deoxycholate agar K. pneumoniae 13883 Yellow or no change
1-2 days Enterobacter cloacae 13047 Purple to yellow-purple
Egg yolk agar 1 day E. cloacae 13047 Yellow or no change
Eosin methylene bluee K. pneumoniae 13883 Growth; colorless
Salmonella enterica 14028
serotype Typhimurium
S. flexneri 12022 Growth; colorless
E. coli 25922 Growth; pink to red
E. faecalis 29212 inhibition
C. perfringens 13124 Lecithinase + lipase -
Clostridium sporogenes 3584 Lipase + lecithinase -
S. enterica serotype 14028 Growth; colorless

Typhimurium 29212 Inhibition (partial)
E. faecalis 25922 Growth; blue-black
E. coli
with metallicsheen

Esculin 1-3 days E. coli 25922 Inhibition
Bile esculin agare 1-2 days E. faecalis 29212 Growth; blackens agar
Bile esculin azide agar S. pyogenes 19615 Inhibition
1-3 days K. pneumoniae 13883 Growth; blackens agar
Esculin agar E. coli 25922 Growth
1-2 days Gardnerella vaginalis 14018 Growth;β-hemolysis
Gardnerella agar P. mirabilis 12453 Inhibition
2-14 days S. marcescens 43861 Medium liquefied
Gelatin E. coli 25922 Medium remains solid
2-8 days S. enterica serotype 14028 Growth on subculture
Gram-negative brothe Typhimurium
Shigella sonnei 9290 Growth on subculture
E. coli 25922 Inhibition

สำ� หรบั โรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทัว่ ไป 271

ตารางท่ี 7-1 เชอื้ มาตรฐานทใ่ี ช้ในการควบคมุ คุณภาพอาหารเลีย้ งเชอื้ (ต่อ)

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
No color change
Heart infusion fepmentation 3-5 days
base Yellow
Control K. pneumoniae 13883 No color change
(no carbohydrate added) Yellow
Adonitol E. aerogenes 13048 No color change
Arabinose E. coli 25922 Yellow; gas
Glucose E. aerogenes 13038 No color change; no gas
Inositol S. marcescens 43861 Yellow
Inulin E. coli 25922 No color change
Lactose M. osloensis 10973 Yellow
Maltose E. aerogenes 13048 No color change
Mannitol E. coli 25922 Yellow
Melibiose S. pneumoniae 6305 No color change
Raffinose S. bovis 9809 Yellow
Rhamnose E. coli 25922 No color change
Salicin P. mirabilis 12453 Yellow
Sorbitol E. coli 25922 No color change
P. mirabilis 12453 Yellow
E. coli 25922 No color change
P. mirabilis 12453 Yellow
E. aerogenes 13048 No color change
S. marcescens 43861 Yellow
E. aerogenes 13048 No color change
S. marcescens 43861 Yellow
E. aerogenes 13048 No color change
S. marcescens 43861 Yellow
E. aerogenes 13048 No color change
Salmonella spp. 35664
E. coli 25922
P. mirabilis 12453

272 คู่มือการปฏิบตั ิงานแบคทีเรียและรา

ตารางท่ี 7-1 เชือ้ มาตรฐานทใ่ี ชใ้ นการควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ียงเช้อื (ต่อ)

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
Yellow
Sucrose 1-2 days E. aerogenes 13048 No color change
Trehalose Salmonella sp. 35664 Yellow
Hektoen enteric agare E. coli 25922 No color change
Edwardsiella tarda 15947 Growth;blue-green
S. enterica serotype 14028 colonies ( black centers)
Growth; green with blue-
Typhimurium 12022 green centers)
S. flexneri Partial inhibition; yellow
colonies
E. coli 25922 Precipitate that does

Hippurate broth 2 days Streptococcus agalactiae 12386 notdissolvewith shaking
S. pyogenes 19615 Precipitate that dissolves

Loeffler 1 day Corynebacterium 13812 with shaking
Lysine iron agar 1 day diphtheriae Growth
MacConkey MACe 1-2 days 10700
Corynebacterium Growth
Malonate broth pseudodiphtheriticum 12453
14028 RAelakdlkaslaillnainnetes;lbHaun2tStt;;Hac2Sid; butt
P. mirabilis Alkaline slant; acid butt
S. enteric serotype 12022 Colorless colony;
Typhimurium 12453
S. flexneri inhibition of swarming
P. mirabilis 25922 Red colony
14028 Colorless colony
1–2days E.coli
S. enterica serotype 29212 Inhibition
25922 Green or yellow
Typhimurium 13883 Blue to Prussian blue
E. faecalis
E. coli
K. pneumoniae

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ยแ์ ละโรงพยาบาลทัว่ ไป 273

ตารางที่ 7-1 เชือ้ มาตรฐานทีใ่ ชใ้ นการควบคมุ คณุ ภาพอาหารเลีย้ งเชื้อ (ตอ่ )

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
Colonies have yellow
Mannitol salt agare 1- 2days S. aureus 25923 zones
Colonies have red zones
Methylred-VogesProskauer 1-5 days S. epidermidi 12228 Inhibition
(MR - VP) 1 day P. mirabilis 12453
1 day E. coli 25922 MR + ; VP –
Motility-indole-lysine 1 day K. pneumoniae 13883 MR - ; VP +
1-5 days E. coli 25922
Motility-indole-ornithine K. pneumoniae 13883 Mot+;Ind+;Lys-
1 day E. coli 25922 Mot-;Ind-;Lys+
Motility test K. pneumoniae 13883 Mot+;Ind+;Orn+
1 day E. coli 25922 Mot-;Ind-; Orn-
Nitrate reduction K. pneumoniae 13883 Positive
(agar or broth) P. mirabilis 12452 Negative
P. aeruginosa 27253 Positive + gas
Nutrient basee Acinetobacter baumannii 15308 Positive + gas
(agar or broth) S. aureus 25923 Negative
E. coli 25922 Growth
Phenol red Growth
(agar or broth) 13048
25922 13048
Adonitol E. aerogenes 25922
E. coli 13048 Yellow
43861 Red or no change
Arabinose E. aerogenes 13883 Yellow
Arabitol S. marcescens 25830 Red or no change
Dulcitol K. pneumoniae 8090 Yellow
Glucose M. morganii 43861 Red or no change
C. freundii 25922 Yellow
S. marcescens 10973 Red or no change
E. coli
M. osloensis

274 ค่มู ือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รียและรา

ตารางท่ี 7-1 เชอ้ื มาตรฐานทใ่ี ช้ในการควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ียงเช้อื

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
13048 Yellow
Inositol 1 day E. aerogenes 25922 Red or no change
Lactose 3-5 days E. coli 25922 Yellow
Raffinose E. coli 12453 Red or no change
Rhamnose P. mirabilis 13048 Yellow
Sorbitol E. aerogenes 43861 Red or no change
Trehalose S. marcescens 13048 Yellow
Phenylalanine agar E. aerogenes 43861 Red or no change
Pyruvate broth S. marcescens 25922 Yellow
E. coli 12453 Red or no change
P. mirabilis 13883 Yellow
K. pneumoniae 25830 Red or no change
M. morganii 12453 Positive
P. mirabilis 25922 Negative
E. coli 29212 Yellow
E. faecalis 9809 No change or
S. bovis
14028 yellow-green
Salmonella-shigella agare 1 day S. enterica serotype Colorless colonies +
Typhimurium 12022 black centers
25922 Colorless colonies
S. flexneri Inhibition or pink
E. coli 29212 colonies
29212 Inhibition
Salt tolerance (6.5% NaCl) 1 day E. faecalis 9809 Growth
Simmons citrate agar 1-2 days E. faecalis 13883 No growth
S. bovis 25922 Growth ± blue
K. pneumoniae No growth or color
E. coli change

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศูนยแ์ ละโรงพยาบาลท่วั ไป 275

ตารางท่ี 7-1 เชือ้ มาตรฐานทใี่ ชใ้ นการควบคุมคณุ ภาพอาหารเล้ยี งเชือ้ (ตอ่ )

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
Growth
Streptococcus group B 1 day S. agalactiae 12386 Inhibition
selective broth 1 day E. coli 25922 Growth; β-hemolysis
S. pneumoniae 6305 Growth; α-hemolysis
Streptococcus selective 1 day S. pyogenes 19615 Inhibition
(trypticsoy), sheep 3-7 days S. aureus 25923 Inhibition
blood + neomycin, P. mirabilis 12453
and sheep blood + 4 -18 h Yellow colony
trimethoprim 6-8 h Vibrio alginolyticus 17749 Green colony
sulfamethoxazole 1 day Vibrio parahaemolyticus 17802 Inhibition
1 day E. coli 25922 Growth
Thiosulfat ecitrate bile salts S. aureus 25923 Growth
agar (TCBS) Clostridium novyi A 7659 Growth
C. perfringens 13124 Growth
Thioglycolatee broth P. levii 29147 Growth
( ± Indicator) Bacteroides vulgatus 8482 Growth
S. pyogenes 19615 Growth
Todd-Hewitt broth E. faecalis 29212 Growth on subculture
Transport media S. pyogenes 19615 Growth on subculture
N. gonorrhoeae 43069
Amies or Stuarts Growth on subculture
± charcoal C. jejuni 33291 Growth on subculture
Cary-Blair or enteric S. flexneri 12022 Growth on subculture
pathogen Yersinia enterocolitica 9610 Alkaline slant; acid
Triple-sugar iron agar S. enteric serotype 14028 Acbidutst;laHnt2;Sa+ci;d+bugtats;
Typhimurium AlknaoliHn2eSs;lganast and
butt; no H2S; no gas
E coli 25922

P. aeruginosa 27853

276 ค่มู อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

ตารางที่ 7-1 เช้ือมาตรฐานทใ่ี ชใ้ นการควบคมุ คณุ ภาพอาหารเลี้ยงเชอ้ื (ต่อ)

Medium Length of Control organism b ATCCc Expected resultsd
incubation no.
Growth
Tryptic soy (aerobic) 1 day S. pyogenes 19615 Growth
Plain agar or brothe E. coli 25922 Growth; β-hemolysis
Sheep blood agare 6305 Growth; α-hemolysis
1 day S. pneumoniae 19615 Growth
Tryptone S. pyogenes 25923 Growth
Urea broth or agar S. aureus 25922 Positive for indole
E. coli 25922 Negative for indole
13883 Pink to red
1 day E. coli 12453 No change or pale
K. pneumoniae 25922 yellow
Red colony with
1 day P mirabilis black center
E. coli Red colony
Partial inhibition;
Xylose lysine 1-2 days S. enterica serotype 14928 yellow colony
deoxycholate agare (XLD) Typhimurium 12022 Inhibition
S. flexneri 25922
E. coli 29212

E. faecalis

aAbbreviations are as follows.
A, for testing nutritive properties. Dilute standardized cell suspension (0.5McFarland standard) 1:100 (0.1 ml
of suspension plus 9.9 ml of saline). Inoculate each medium with 10 μl of dilution. If isolated colonies are
not obtained, use 10-fold-lighter inoculum.
B, for testing elective properties. Dilute standardized cell suspension (0.5 McFarland standard) 1:10 (0.1 ml of
suspension plus 0.9 ml of saline). Inoculate each medium with 10 μl of dilution.
C, for testing tubed media. Inoculate medium with 10 μl of the standardized suspension (0.5 McFarland
standard). Adjust the inoculums if heavier or lighter growth is required.
D, for testing biochemical media. Inoculate each medium according to the procedure for the routine use of the
medium.
E, for testing transport media. Place a sterile swab in the standardized suspension (0.5 McFarland standard),
squeeze out excess fluid on the wall of the tube, and submerge the swab in the transport medium. Hold at
room temperature, and plate on the appropriate medium.

ส�ำหรบั โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลทั่วไป 277

bOrganisms recommended for QC testing of media (2,7–12, 14, 16, 17). Although American Type Culture
Collection strains are listed, any organism that will yield an identical result is acceptable.
cATCC, American Type Culture Collection.
dMR, methyl red; VP, Voges Proskauer; Mot, motility; Ind, indole; Lys, lysine; Orn, ornithine; +, positive; -,
negative; oxidation, color change in open tube; fermentation, color change in over laid tube.
eExempt from QC by user (14).Applie sonly to commercially prepared media.

การเก็บอาหารเลย้ี งเชื้อทเ่ี ตรียมแล้ว
อาหารเลย้ี งเชอื้ ชนดิ เหลวทเ่ี ตรยี มแลว้ นนั้ ถา้ เปน็ อาหารเลย้ี งเชอื้ ทไ่ี มค่ อ่ ยไดใ้ ชแ้ ละตอ้ งการเกบ็ ไวใ้ ชน้ านๆ
ควรจะใชห้ ลอดแก้วจกุ เกลียว เกบ็ ไวท้ ่ี 2-8 °C ยกเว้น Thioglycollate broth ให้เกบ็ ที่อณุ หภมู หิ อ้ งไม่ให้ถกู ความ
รอ้ นและแสงแดด สำ� หรบั อาหารเลยี้ งเชอ้ื ทเี่ ท plate ควรเกบ็ ไวใ้ นตเู้ ยน็ และถา้ จำ� เปน็ ตอ้ งเกบ็ ไวน้ านใหบ้ รรจใุ นถงุ
พลาสตกิ ปดิ สนทิ อายกุ ารใชง้ านของอาหารเลย้ี งเชอื้ ขน้ึ อยกู่ บั ชนดิ ของภาชนะทบี่ รรจแุ ละอณุ หภมู ิ ดงั ตารางที่ 7.2

ตารางที่ 7-2 อายกุ ารใช้งานของอาหารเลี้ยงเช้ือท่เี ตรียมแลว้

ประเภทอาหารเลย้ี งเช้ือ ไม่ไดบ้ รรจุ บรรจุ อุณหภมู ิ
ในถุงปดิ สนทิ ในถงุ ปิดสนทิ
Plate 2-8 °C
Tube จกุ ส�ำลหี รอื จกุ หลวมๆ 2 สัปดาห*์ 4 เดอื น* 2-8 °C
Tube screw capped 2 สปั ดาห์ 2 เดอื น 2-8 °C
CTA 2 เดอื น 4 เดือน อุณหภูมหิ อ้ ง
Indole, nitrate broth 2 สัปดาห์ อณุ หภมู ิห้อง
Thioglycollate - อณุ หภูมิห้อง
- 2 สัปดาห์
4 เดือน
-

* กรณที เ่ี ปน็ selective medium ทเ่ี ตรยี มเองมอี ายกุ ารใชง้ านนอ้ ยกวา่ เชน่ TCBS มอี ายกุ ารใชง้ านเพยี ง 1 สปั ดาห์
(ตามก�ำหนดของ Mindy J Perilla, et al. 2003. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Sus-
ceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. WHO.CDS/
CSR/RMD/2003.6) Mueller Hinton agar มอี ายุการใชง้ านเพยี ง 1 สปั ดาห์ (ตามกำ� หนดของ CLSI) รายละเอยี ดดู
ในภาคผนวก

การตรวจสอบ sterility
อาหารเลยี้ งเชอื้ ทเ่ี ตรยี มในแตล่ ะครงั้ ควรมกี ารสุ่มตวั อยา่ งอยา่ งน้อย 5-10% ถ้าพบเช้ือเจรญิ มากกว่า 2
colonies/plate ใหท้ ง้ิ ท้งั หมด

278 คูม่ อื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา