OOBioquimica.Pratt

Cuando Watson y Crick describieron la naturaleza bicatenaria y complemen- (a) (b)

taria del DNA en 1953, reconocieron que el DNA podría replicar en un

proceso que implicara la separación de las cadenas seguida por el ensamblaje

de dos nuevas cadenas complementarias. Este mecanismo de copiado, o re-

plicación, fue demostrado por Matthew Meselson y Franklin Stahl en 1958.

Estos investigadores cultivaron bacterias en medios que contenían el isótopo DNA original

pesado 15N a fin de marcar el DNA de las células. Las bacterias se transfirie-

ron entonces a un medio de cultivo nuevo que sólo contenía 14N, y el DNA

recién sintetizado se aisló y sedimentó conforme a su densidad en una ultra-

centrífuga. Meselson y Stahl observaron que la primera generación de DNA

duplicado tenía menor densidad que el DNA original, pero mayor densidad

que el DNA que sólo contenía 14N. Así concluyeron que el DNA recién sin-

tetizado era un híbrido que contenía una cadena paterna (pesada) y una ca-

dena nueva (ligera). En otras palabras, el DNA se replica de manera

semiconservativa. Dado que Meselson y Stahl no observaron ningún DNA

con las dos cadenas pesadas en la primera generación, pudieron descartar la Primera
posibilidad de que el DNA se copiara de una manera que dejara intacta –o generación
conservada– la molécula bicatenaria original (figura 20-1).

Aunque simple en principio, la replicación del DNA es un proceso de

muchos pasos en el que intervienen muchas enzimas y factores accesorios los

cuales también pueden ser requeridos para restaurar DNA dañado. La com- Replicación Replicación
plejidad de los mecanismos de replicación y reparación del DNA refleja el semiconservativa conservativa
tamaño relativamente grande de las moléculas de

DNA, la necesidad de copiarlas de manera rápida y Figura 20-1. Replicación semiconservativa y conservativa. a) Los
precisa, y la importancia de mantener la integridad experimentos realizados por Meselson y Stahl demostraron que las nuevas

del genoma. Además, la misma estructura del DNA moléculas de DNA contienen una cadena polinucleotídica original (trazo

–su arrollamiento helicoidal y su extraordinaria lon- grueso) y una cadena polinucleotídica nueva (trazo delgado). De este
gitud– plantean desafíos a la maquinaria celular para modo, la replicación del DNA es semiconservativa. b) Si la replicación del
la replicación y otros procesos. En este capítulo se DNA fuera conservativa, el DNA original (ambas cadenas en trazo
examinan la topología del DNA, las enzimas que re- grueso) persistirían, mientras que el nuevo DNA consistiría en dos
plican el DNA y lo reparan cuando se daña, y el em- cadenas de trazo delgado.

paque de las moléculas de DNA en las células eucarióticas. Véase figura animada. Experimento de

Meselson y Stahl.

20-1. Superenrrollamiento del DNA

Antes de que el DNA se replique, sus dos cadenas, que están enrrolladas una alrededor de CONCEPTOS CLAVE
la otra en la forma de una doble hélice, deben separarse. Dentro de las células, la hélice de • La hélice de DNA es ligeramente
DNA ya está un tanto desenrrollada. Sin embargo, para mantener una conformación
cercana a la forma B estable, la molécula de DNA se enrrolla en sí misma, de modo muy floja, de modo que tiene
parecido a los antiguos cables de teléfono. Este fenómeno, llamado superenrrollamiento, superenrrollamiento negativo.
es visible con facilidad en las moléculas de DNA circular pequeño (figura 20-2). • Las topoisomerasas modifican
el superenrrollamiento de DNA
La geometría de una molécula de DNA puede ser descrita por una rama de la cortando de manera transitoria
matemática llamada topología. Por ejemplo, considérese una tira de papel. Cuando una o ambas cadenas.
la tira se enrrolla una vez, se dice que tiene una vuelta. Si se tira con suavidad del
papel por los extremos, la tira se deforma hasta adquirir una forma llamada giro.

Vuelta Giro

Si se sigue enrrollando se inducen más vueltas; enrrollar en el sentido opuesto elimi-
na vueltas, o induce vueltas negativas. Los mismos términos topológicos se aplican al
DNA: Cada vuelta o superenrrollamiento en el DNA es el resultado de sobreenrrollar

20-1. Superenrrollamiento del DNA | 521

o subenrrollar la hélice de DNA. La molécula enrrollada, como el trozo de papel,
prefiere formar vueltas, dado que esto es más favorable en cuanto a energía.

Para demostrar el superenrrollamiento por sí mismo, el lector puede cortar una banda
elástica plana para obtener una pieza de algunos centímetros. Manteniendo los extremos
separados, gire uno de ellos y luego acerque ambos extremos entre sí, se verá que los
giros se colapsan en vueltas (superespiras). Lo mismo ocurre si se deja que la banda elásti-
ca se relaje y luego se tuerza en el sentido opuesto. Nótese que la banda elástica con el giro
(que representa una molécula de DNA de doble cadena) adopta una forma más compac-
ta. De hecho, el superenrrollamiento es esencial para el empaque eficiente del DNA en un
espacio reducido dentro de una célula bacteriana o un núcleo eucariótico.

Las moléculas de DNA naturales tienen superenrrollamiento negativo. Esto signi-
fica que si el DNA se estirara (esto es, si las vueltas se convirtieran en giros), las dos
cadenas se desarrollarían, en efecto aflojando la doble hélice. En consecuencia, el
superenrrollamiento negativo del DNA ayuda a la maquinaria de replicación a acce-
der a las dos cadenas plantilla durante la síntesis de dos nuevas cadenas de DNA
complementarias. En ausencia de superespiras negativas, la separación de las cadenas
forzaría giros adicionales adelante del punto de separación:

Figura 20-2. Moléculas de DNA
superenrrolladas. Una molécula de
DNA circular ligeramente desenrrollada
se tuerce sobre sí misma, formando
superespiras. (Gopal Murti/Visuals

Unlimited.)

Las topoisomerasas modifican el superenrrollamiento
del DNA

La replicación y transcripción normales requieren que las células mantengan de ma-
nera activa el estado de superenrrollamiento del DNA agregando o retirando supe-
respiras. Es difícil imaginar cómo una molécula tan grande podría adquirir tensión
si sus extremos se torcieran o destorcieran. En cambio, las modificaciones topológi-
cas en las moléculas de DNA ocurren cuando una enzima llamada topoisomerasa
corta una o ambas cadenas del DNA superenrrollado, modifica la estructura, y reco-
necta las cadenas cortadas. Las topoisomerasas tipo I cortan una cadena de DNA; las
enzimas tipo II cortan ambas cadenas de DNA y requieren ATP.

Las topoisomerasas tipo I se encuentran en todas las células y modifican el supe-
renrrollamiento modificando el torcimiento helicoidal del DNA. Las enzimas tipo
IA mellan el DNA (cortan el esqueleto de una cadena), pasan la cadena intacta por
la separación, y sellan la cadena rota a fin de desenrrollar el DNA en una vuelta (fi-
gura 20-3). Las enzimas tipo IB también cortan una cadena pero mantienen el DNA

La cadena La hélice La rotura
se rompe se destuerce se sella

Figura 20-3. Acción de una

topoisomerasa tipo I. En este
esquema, el superenrrollamiento de un
segmento de DNA disminuye cuando
una cadena se rompe; la hélice se
destuerce pasando la otra cadena por la
rotura, y luego se sella.

522 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Figura 20-4. Topoisomerasa I
humana. La proteína (en azul) rodea
una molécula de DNA (mostrada desde
un extremo en este modelo). (Estructura

[pdb 1A36] determinada por L. Stewart, M.R.
Redinbo, X. Qiu, J.J. Champoux y W.G.J. Hol.)

en un lado de la mella al tiempo que permiten que el DNA en el otro lado de la
mella gire una o más vueltas antes de que la cadena cortada se selle. En ambos casos,
el desenrrollamiento es impulsado por la tensión en el DNA superenrrollado, de
modo que una topoisomerasa tipo II puede “relajar” tanto DNA con superenrrolla-
miento negativo como DNA con superenrrollamiento positivo.

La topoisomerasa I humana, una enzima tipo IB, tiene cuatro dominios que ro-
dean el DNA (figura 20-4). La superficie de la proteína que hace contacto con el
DNA es rica en grupos con carga positiva los cuales pueden interactuar con los gru-
pos fosfato del esqueleto de unos 10 pares de bases. Cuando una topoisomerasa tipo
I escinde una cadena del DNA, un residuo Tyr del sitio activo forma un enlace co-
valente con el fosfato del esqueleto a un lado de la mella, por ejemplo:

CH2

Tyr

OϪ
O P O CH2 O Base

O HH
HH

OH
ϪO P O

O DNA

La formación de este enlace diéster conserva la energía libre del enlace fosfodiéster
roto de la cadena de DNA, de modo que la rotura de la cadena y el posterior sellado
no requieren de otra fuente de energía libre.

Las topoisomerasas tipo II modifican de manera directa el número de giros en
una molécula de DNA superenrrollada haciendo pasar un segmento de DNA delan-
te del otro, un proceso que requiere el corte de la doble cadena (figura 20-5). Las
enzimas tipo II son diméricas, con dos residuos Tyr del sitio activo que forman en-
laces covalentes con los grupos fosfato 5´ de las cadenas de DNA cortadas. La hidró-
lisis de ATP impulsa el reordenamiento mecánico del DNA, más probablemente
al impulsar los cambios conformacionales de la proteína necesarios para escindir una
molécula de DNA y mantener los extremos separados mientras otra porción del
segmento de DNA pasa por la separación. Las topoisomerasas tipo II pueden aliviar
tanto superenrrollamiento negativo como positivo.

20-1. Superenrrollamiento del DNA | 523

Figura 20-5. Acción de una

topoisomerasa tipo II. La forma de
gusano enrrollado representa una
molécula bicatenaria de DNA
superenrrollada. Una topoisomerasa
tipo II rompe ambas cadenas del DNA,
pasa otro segmento de DNA por la
rotura, y luego sella ésta. En el
diagrama, el grado de
superenrrollamiento disminuye.

Las bacterias contienen una topoisomerasa tipo II llamada DNA girasa, la cual
puede introducir superespiras negativas adicionales en el DNA, de modo que su
efecto neto es desenrrollar más la hélice de DNA. (Las células eucarióticas carecen de
DNA girasa pero mantienen el superenrrollamiento negativo formando nucleoso-
mas con el DNA; sección 20-5.) Varios antibióticos inhiben la DNA girasa sin afec-
tar las topoisomerasas tipo II eucarióticas. Fármacos como la ciprofloxacina

O

F COOH

NN

HN

Ciprofloxacina

actúan en la DNA girasa para elevar la rapidez de escisión del DNA o reducir la ve-
locidad de sellado del DNA separado. El resultado es un gran número de roturas del
DNA que interfieren en la transcripción y replicación necesarias para la prolifera-
ción y división celulares normales. La ciprofloxacina se prescribe como un antibióti-
co para una amplia variedad de infecciones bacterianas.

REPASO DE CONCEPTOS
• ¿Cuál es la relación entre un asa (superespira) y un giro? ¿De qué manera el

torcimiento de la hélice modifica el superenrrollamiento?
• Explique por qué el superenrrollamiento negativo del DNA ayuda en procesos

como la replicación.
• Describa el modo en que operan las topoisomerasas tipo I y II. ¿Cuándo se

requiere una fuente de energía libre?

20-2. Maquinaria de replicación del DNA

CONCEPTOS CLAVE La DNA polimerasa, la enzima que cataliza la polimerización de desoxinucleótidos,
• La replicación del DNA es realizada es sólo una de las proteínas implicadas en replicar DNA de doble cadena. El proceso
completo –separación de las dos cadenas plantilla, inicio de nuevas cadenas polinu-
por complejos proteínicos cleotídicas y extensión de éstas– es realizado por un complejo de enzimas y otras
estacionarios. proteínas. En esta sección se examinan las estructuras y funciones de los principales
• Las proteínas requeridas para participantes en la replicación del DNA.
la replicación del DNA incluyen
helicasa, proteína de unión a La replicación ocurre en “fábricas”
una sola cadena, primasa, DNA
polimerasa, una pinza deslizante, En los cromosomas circulares de las bacterias, la replicación del DNA comienza en
RNasa y DNA ligasa. un sitio específico llamado origen. Aquí, las proteínas se unen al DNA y lo rompen
• La DNA polimerasa sintetiza la de un modo dependiente de ATP. La polimerización procede entonces en ambos
cadena adelantada de manera sentidos a partir de este punto hasta que se ha duplicado todo el cromosoma (4.6 ϫ
continua, y la cadena atrasada 106 pb en E. coli). El punto en que las cadenas originales se separan y las nuevas ca-
como una serie de fragmentos de denas se sintetizan se conoce como horquilla de replicación.
Okazaki.

524 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Cadenas originales • La precisión de la DNA polimerasa
es potenciada por su capacidad
Nuevas cadenas de detectar nucleótidos pareados
de modo correcto y escindir
por hidrólisis nucleótidos mal
pareados.

Horquilla de replicación

La replicación comienza en numerosos sitios de los 46 cromosomas (3.2 ϫ 109 pb
del DNA) en el núcleo de cada célula humana. Al parecer estos sitios no tienen una
secuencia definida, como en los orígenes procarióticos, pero en cambio tienen una
estructura que es localizada por un complejo de reconocimiento de origen.

Alguna vez se pensó que los complejos de DNA polimerasa y otras proteínas de repli-
cación se movían a lo largo del DNA como un tren sobre rieles. Este modelo de “loco-
motora” de la replicación del DNA requiere que las grandes proteínas de replicación
avancen sobre la cadena plantilla relativamente delgada, y giren a su alrededor mientras
generan un producto helicoidal de doble cadena. De hecho, los estudios citológicos
indican que la replicación del DNA (así como la transcripción) ocurre en “fábricas” en
sitios bien definidos. Por ejemplo, en las bacterias, al parecer la DNA polimerasa y
factores asociados se inmovilizan en 1 o 2 complejos cerca de la membrana plasmática.
En el núcleo eucariótico, el DNA recién sintetizado aparece en 100 a 150 puntos, cada
uno de los cuales representa varios cientos de horquillas de replicación. Conforme al
modelo de replicación en fábricas, la maquinaria proteínica es estacionaria y el DNA
se hace pasar por ella. En las eucariotas, se supone que esta organización facilita el
alargamiento sincrónico de muchos segmentos de DNA, lo cual permite la replicación
eficiente de enormes genomas de eucariotas.

Las helicasas convierten DNA bicatenario en DNA Figura 20-6. Estructura de una
helicasa hexamérica. Esta helicasa, del
monocatenario bacteriófago T7, forma un anillo
hexamérico alrededor de una cadena
Una de las tareas del complejo de reconocimiento de origen en las eucariotas es con- individual de DNA y separa la doble
vocar una enzima llamada helicasa, la cual cataliza el desenrrollamiento de la hélice cadena. (Estructura [pdb 1E0J] determinada
de DNA. La helicasa no se activa todavía, pero que espera una señal (a través de la
fosforilación catalizada por cinasa) de que la célula está lista para copiar su DNA. por M.R. Singleton, M.R. Sawaya, T.
Luego, en un proceso dependiente de ATP, la helicasa separa las cadenas de DNA
originales de modo que cada una sirva como plantilla para la DNA polimerasa. Este Ellenberger y D.B. Wigley.)
desenrrollamiento es auxiliado por el superenrrollamiento negativo del DNA. La
replicación del DNA procariótico también depende de la actividad de helicasas.

Algunas helicasas son proteínas hexaméricas que rodean una cadena individual de
DNA (figura 20-6). Conforme la helicasa tira de la cadena a través de su anillo,
desenrrolla el DNA bicatenario adelante. Por cada ATP que se hidroliza, se separan
hasta cinco pares de bases de la hélice. La helicasa puede operar de manera giratoria,
con cambios conformacionales inducidos por la hidrólisis del ATP. Este proceso re-
cuerda el mecanismo de cambio de unión del componente F1 de la ATP sintasa, otra
proteína de unión a ATP hexamérica (véase sección 15-4).

A medida que procede la replicación, las cadenas de DNA originales se separan
de manera continua por la acción de la helicasa, la cual trabaja de modo concertado
con las DNA polimerasas. Una segunda helicasa, que suele ser un dímero en lugar
de un hexámero, puede unirse a la otra cadena de DNA para ayudar a abrir la hor-
quilla de replicación. Una topoisomerasa que trabaja delante de la horquilla de repli-
cación alivia la tensión de la hélice que se desenrrolla. Aunque los genomas
eucarióticos incluyen numerosos orígenes, cada porción de DNA se replica sólo una
vez, porque después de que la síntesis de DNA comienza, no pueden cargarse heli-
casas adicionales en los orígenes.

20-2. Maquinaria de replicación del DNA | 525

(a) (b)

Figura 20-7. Dominios de unión a Conforme el DNA monocatenario se expone en la horquilla de replicación, se
DNA de la proteína de replicación A. asocia con una proteína conocida como proteína de unión a una sola cadena (SSB,
Dos de los cuatro dominios de unión a por sus siglas en inglés). La SSB cubre las cadenas de DNA para protegerlas de las
DNA se muestran en amarillo y verde nucleasas e impedir que se reúnan o formen estructuras secundarias que pudieran
en este modelo, con un octanucleótido impedir la replicación. La SSB de E. coli es un tetrámero con una hendidura que
unido (polidesoxicitidina, en púrpura). tiene carga positiva y da cabida a asas de DNA monocatenario, pero no bicatenario.
a) Vista frontal. b) Vista lateral. La SSB eucariótica, llamada proteína de replicación A, es una proteína más grande
que incluye cuatro dominios de unión a DNA separados por regiones flexibles (figu-
(Estructura [pdb 1JMC] determinada por A. ra 20-7). Tanto la SSB procariótica como la eucariótica pueden adoptar diferentes
conformaciones y unirse a DNA de varias maneras. Los estudios sobre la proteína de
Bochkarev, R. Pfuetzner, A. Edwards y L. replicación A sugieren que la unión a DNA ocurre en etapas, de modo que la prime-
ra interacción proteína-DNA es relativamente débil (con Kd en el intervalo de los
Frappier.) μM) pero permite que los otros dominios “se desenrrollen” junto con el DNA para
formar un complejo estable que protege unos 30 nucleótidos y tiene constante de
disociación global de alrededor de 10–9 M. Conforme el DNA plantilla pasa a través
de la polimerasa, la SSB se desplaza y se supone que vuelve a colocarse a medida que
la helicasa expone más DNA monocatenario.

La DNA polimerasa enfrenta dos problemas

El mecanismo de la DNA polimerasa y la estructura bicatenaria del DNA plantean
dos obstáculos potenciales para la replicación eficiente del DNA. Primero, la DNA
polimerasa sólo puede extender una cadena preexistente; no puede iniciar la síntesis
de polinucleótidos. Sin embargo, la RNA polimerasa sí puede hacerlo, de modo que
in vivo las cadenas de DNA comienzan con un corto tramo de RNA que luego se
elimina y sustituye por DNA.

Cadena de
DNA plantilla

3’ 5’
5’

Sentido del crecimiento
de la cadena

RNA DNA recién
cebador sintetizado

Este tramo de RNA, de hasta 60 nucleótidos de largo, se conoce como cebador
(iniciador o imprimador), y la enzima que lo produce durante la replicación del
DNA se conoce como primasa. Como se verá, se requiere primasa durante toda la
replicación del DNA, no sólo al principio. El sitio activo de la primasa es estrecho

526 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Cadena de DNA

OO

ϪO P O 5CЈ H2 O Base ϪO P O 5CЈ H2 O Base

O HH PPi O HH
HH HH

3Ј 3Ј

OH H OH

ϪO ϪO ϪO O 5CЈ H2 O Base ϪO P O 5CЈ H2 O Base
ϪO P OP OP
H H O HH
O O O H H HH

3Ј H 3Ј

OH OH H

dNTP

Figura 20-8. Mecanismo de la DNA polimerasa. El grupo OH 3´ (en el extremo 3´
de una cadena polinucleotídica en crecimiento) es un nucleófilo que ataca el grupo
fosfato de un trifosfato de desoxinucleósido entrante (dNTP) el cual forma un par de
bases con la cadena de DNA plantilla. La formación de un nuevo enlace fosfodiéster
elimina PPi. Los reactivos y productos de esta reacción tienen energía libre similar, de
modo que la reacción de polimerización es reversible. Sin embargo, la posterior
hidrólisis de PPi hace a la reacción irreversible in vivo. La RNA polimerasa sigue el
mismo mecanismo.

(unos 9 Å de diámetro) en un extremo, donde la plantilla de DNA monocatenario
se enhebra. El otro extremo del sitio activo es lo suficientemente amplio para dar
cabida a una hélice híbrida de DNA-RNA (que tiene conformación similar a la del
DNA A; véase figura 3-7).

El segundo problema que enfrenta la DNA polimerasa es que las cadenas de
DNA plantilla, antiparalelas, se duplican de modo simultáneo por la acción de un
par de polimerasas. Pero cada DNA polimerasa cataliza una reacción en la cual el
grupo OH 3´ en el extremo de la cadena de DNA en crecimiento ataca el grupo
fosfato de un nucleótido libre que parea sus bases con la cadena plantilla de DNA
(figura 20-8). Por esta razón se dice que una cadena de polinucleótido se sintetiza en
el sentido 5´ 3´. Dado que las dos cadenas plantilla de DNA son antiparalelas, la
síntesis de dos cadenas de DNA nuevas requeriría que se jalara en sentidos opuestos
de las cadenas plantilla a través de la maquinaria de replicación, de modo que las
DNA polimerasas pudieran agregar nucleótidos de manera continua al extremo 3´
de cada nueva cadena.

Cadenas plantilla

3’ 5’
5’ 3’

Nuevas cadenas 20-2. Maquinaria de replicación del DNA | 527

Figura 20-9. Modelo para la 3’ 5’ 5’ Nuevo
cebador
replicación del DNA. Dos DNA Fragmentos
polimerasas (verde) se colocan en la 5’ de Okazaki
horquilla de replicación para hacer dos 3’ 5’
cadenas complementarias de DNA. Las de la
cadenas adelantada y atrasada 3’ 5’ 3’ 5’ cadena
comienzan ambas con cebadores de atrasada
RNA (rojo) y son extendidas por DNA
polimerasa en el sentido 5´ 3´. La
maquinaria de replicación es
estacionaria, y el DNA plantilla avanza a
través de ella. Dado que las dos cadenas
plantilla son antiparalelas, la plantilla
para la cadena atrasada forma un asa (el
DNA monocatenario se cubre de SSB).
Por tanto, la cadena adelantada se
sintetiza de manera continua, mientras
que la cadena atrasada se sintetiza como
una serie de fragmentos de Okazaki.

Cadena
adelantada

3’ 5’ 3’ 5’

Esta incómoda situación no se presenta en las células. Más bien, las dos polime-
rasas trabajan lado a lado, y una cadena plantilla de DNA de manera periódica for-
ma un asa. De esta manera, una cadena de DNA, llamada cadena adelantada,
puede sintetizarse en una pieza continua. Es iniciada por la acción de una primasa,
y luego extendida en el sentido 5´ 3´ por la acción de una enzima DNA polimera-
sa. La otra cadena, llamada cadena atrasada, se sintetiza por tramos, o de manera
discontinua. Su plantilla forma asas una y otra vez, por lo que su polimerasa tam-
bién puede operar en el sentido 5´ 3´. Así, la cadena atrasada consiste en una serie
de segmentos polinucleotídicos, que se denominan fragmentos de Okazaki en ho-
nor de su descubridor (figura 20-9).

Los fragmentos de Okazaki bacterianos tienen unos 500 a 2 000 nucleótidos de
largo; en las eucariotas, miden unos 100 a 200 nucleótidos. Cada fragmento de
Okazaki tiene un tramo corto de RNA en su extremo 5´, dado que cada segmento
es iniciado por un proceso cebador separado. Esto explica por qué se requiere prima-
sa durante toda la replicación: Aunque en teoría la cadena adelantada sólo requiere
un solo cebador, la cadena atrasada, que se sintetiza de manera discontinua, necesita
de múltiples cebadores.

El mecanismo de síntesis continua de la cadena adelantada y síntesis discontinua de la
cadena atrasada significa que la plantilla para la cadena atrasada debe recolocarse de mane-
ra periódica. Cada vez que se completa un fragmento de Okazaki, la polimerasa comienza
a extender el RNA cebador del siguiente fragmento de Okazaki. Otros componentes
proteínicos del complejo de replicación ayudan en esta recolocación a fin de coordinar las
actividades de las dos DNA polimerasas en la horquilla de replicación.

Las DNA polimerasas comparten una estructura y un
mecanismo en común

La mayoría de las DNA polimerasas están moldeadas de modo parecido a una mano,
con dominios correspondientes a palma, pulgar y resto de los dedos. Es probable que
estas estructuras sean el resultado de evolución convergente, ya que sólo los dominios

528 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

de la palma exhiben fuerte homología. La primera de las polimerasas que se caracte- Dedos Pulgar
rizó y una de las mejor conocidas es la DNA polimerasa I de E. coli, (figura 20-10; Palma
ésta es la enzima que se usa para secuenciar el DNA; véase sección 3-4). La cadena
plantilla y la cadena de DNA recién sintetizada, que forman una doble hélice, yacen
sobre la palma, en una hendidura recubierta de residuos básicos.

El sitio activo de la polimerasa, en la parte inferior de la hendidura, contiene dos
iones Mg2+ separados 3.6 Å. Estos iones metálicos son coordinados por cadenas laterales
de Asp de la enzima y por los grupos fosfato del sustrato trifosfato de nucleósido. Uno de
los iones Mg2+ interactúa con el átomo de O 3´ en el extremo del cebador o la cadena
de DNA creciente para potenciar su nucleofilicidad al atacar el nucleótido entrante.

Base

O

Base C O O Figura 20-10. DNA polimerasa de E.
O P O coli. Este modelo muestra el llamado
O OϪ fragmento de Klenow de la DNA
O OP O P polimerasa I (residuos 324 a 928). Se
OϪ OϪ indican los dominios de palma, dedos y
OϪ pulgar. En este modelo se omite un asa
en el extremo de los dedos. (Estructura
Cebador H [pdb 1KFD] determinada por L.S.
Beese, J.M. Friedman y T.A. Steitz.)
Mg2+ C Mg2+
Véase ejercicio interactivo. DNA
Ϫ polimerasa de E. coli.
OO

OO

Ϫ

C

El carbono desoxi en la posición 2´ del nucleótido yace en un bolsillo hidrófobo.
Este sitio de unión permite a la polimerasa discriminar contra los ribonucleótidos,
que portan un grupo OH 2´.

Después de cada proceso de polimerización, la enzima debe avanzar la cadena
plantilla un nucleótido. La mayoría de las DNA polimerasas son enzimas procesivas,
lo cual significa que realizan varios ciclos catalíticos (unos 10 a 15 en el caso de la
DNA polimerasa de E. coli in vitro) antes de disociarse de sus sustratos. La DNA
plimerasa de E. coli es aún más procesiva in vivo, ya que polimeriza hasta 5 000 nu-
cleótidos antes de liberar el DNA. Esta procesividad potenciada se debe a una proteí-
na accesoria que forma una pinza deslizante alrededor del DNA y ayuda a mantener
en su lugar la DNA polimerasa. En E. coli la pinza es una proteína dimérica, y en las
eucariotas es un trímero. Ambos tipos de proteína tienen una estructura de anillo
hexagonal y dimensiones similares, lo cual apoya una función común (figura 20-11).
Proteínas adicionales ayudan a ensamblar la pinza alrededor del DNA. Para la poli-
merasa de la cadena atrasada, la pinza debe recargarse al principio de cada fragmento
de Okazaki. Esto ocurre de manera aproximada cada segundo en E. coli.
E. coli tiene cinco DNA polimerasas distintas (I a V), y hay al menos una docena de
DNA polimerasas eucarióticas distintas (designadas con letras griegas), sin incluir las
que se encuentran en mitocondrias y cloroplastos. ¿Por qué tantas? En las eucariotas
y por lo menos algunas procariotas, dos tipos de polimerasas trabajan de manera
concertada para sintetizar las cadenas adelantada y atrasada, y otras polimerasas rea-
lizan funciones especializadas. Por ejemplo, en las eucariotas la DNA polimerasa α
inicia la síntesis de fragmentos de Okazaki, pero pronto es sustituida por la polime-
rasa δ, que es responsable de sintetizar la mayor parte de la cadena atrasada, mientras
que la DNA polimerasa ε sintetiza la cadena adelantada. Al parecer, muchas polime-
rasas –como las polimerasas II, IV y V de E. coli y la mayoría de las polimerasas eu-
cariotas– actúan principalmente en vías de reparación del DNA, algunas de las
cuales implican la escisión y sustitución de DNA dañado (sección 20-4).

20-2. Maquinaria de replicación del DNA | 529

Véase ejercicio interactivo. ANCP. (a) (b)

Figura 20-11. Pinzas asociadas a DNA polimerasa. En E. coli, la subunidad β de la
DNA polimerasa III forma una pinza dimérica. B) En levaduras, la pinza es un
trímero, llamado antígeno nuclear de célula en proliferación (ANCP). La superficie
interna de cada pinza tiene carga positiva y encierra un espacio con diámetro
aproximado de 35 Å, más que suficiente para dar cabida a una doble hélice de DNA o
una hélice híbrida DNA-RNA, con diámetro de 26 Å. Ambas estructuras potencian la
procesividad de sus respectivas DNA polimerasas, con lo cual incrementan la eficiencia
de la replicación de DNA. (Estructura de la pinza b [pdb 2POL] determinada por X.-P. Kong y J.

Kuriyan; estructura del ANCP de levadura [pdb 1AXC] determinada por J.M. Gulbis y J. Kuriyan.)

Figura 20-12. Conformaciones La DNA polimerasa realiza la lectura de pruebas del

abierta y cerrada de una DNA DNA recién sintetizado
polimerasa. La estructura de la
polimerasa de Thermus aquaticus se Durante la polimerización, la base nucleotídica entrante se aparea con el DNA plan-
determinó en ausencia (trazo magenta) tilla, de modo que la nueva cadena será complementaria a la original. La polimerasa
y presencia (trazo verde) de un análogo coloca pares de bases en estrecha aposición: Recuérdese que todos los pareamientos
de sustrato nucleótido (mostrado en posibles (A:T, T:A, C:G y G:C) tienen la misma geometría global (página 57). El
forma de espacio lleno, en púrpura). Los ajuste estrecho minimiza la probabilidad de pareamiento incorrecto. De hecho, es-
modelos incluyen un segmento de DNA tudios estructurales indican que la DNA polimerasa puede cambiar entre una con-
que representa las cadenas plantilla y formación “abierta” y otra “cerrada”, de manera análoga a como los dedos se acercan
cebadora (púrpura). (Estructuras de la al pulgar, cuando se une un nucleótido sustrato (figura 20-12). Este cambio confor-
macional puede facilitar la polimerización de un nucleótido fuertemente unido (pa-
conformación abierta [pdb 2KTQ] y cerrada reado de modo correcto), o podría reflejar un mecanismo para liberar con rapidez un
nucleótido no correspondiente antes de que ocurra la catálisis.
[pdb 3KTQ] determinada por Y. Li y G.
Si el nucleótido incorrecto llega a unirse de manera covalente a la cadena en cre-
Waksman.) cimiento, la polimerasa puede detectar la distorsión que esto crea en la doble hélice
recién generada. Muchas DNA polimerasas contienen un segundo sitio activo que
cataliza la hidrólisis del nucleótido en el extremo 3´ de la cadena de DNA en creci-
miento. Esta exonucleasa 3´ 5´ escinde nucleótidos incorporados de manera inco-
rrecta, por lo que actúa como un lector de pruebas para la DNA polimerasa (figura
20-13). En la DNA polimerasa de E. coli, el sitio con actividad de exonucleasa 3´
5´ se localiza a unos 25 Å del sitio con actividad de polimerasa, lo cual indica que el
complejo enzima-DNA debe experimentar un gran cambio conformacional para
pasar de la polimerización a la hidrólisis de nucleótidos.

La lectura de pruebas (o lectura y corrección) durante la polimerización limita la
tasa de errores de la DNA polimerasa a alrededor de uno por cada 106 bases. Tam-
bién es posible retirar las bases mal incorporadas después de la replicación por diver-
sos mecanismos de reparación del DNA, lo que reduce aún más la tasa de error de la
replicación. Este alto grado de fidelidad es absolutamente esencial para la transmi-
sión precisa de la información biológica de una generación a la siguiente.

530 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Se requieren una RNasa y una ligasa para completar la Cadena plantilla

cadena atrasada 3’ 5’

La replicación no está completa sino hasta que se concluye la cadena atrasada –la 5’
cual se sintetiza un fragmento de Okazaki a la vez. Conforme la polimerasa termina Nucleótido
cada fragmento de Okazaki, su RNA cebador, junto con algo del DNA adyacente,
se elimina por hidrólisis y se sustituye por DNA; entonces el esqueleto se sella para mal incorporado
generar una cadena de DNA continua. Este proceso también incrementa la exacti-
tud de la replicación del DNA: la primasa tiene baja fidelidad, así que los RNA ce- 3’ 5’ exonucleasa
badores tienden a contener errores, al igual que los primeros desoxinucleótidos
agregados al cebador por acción de la DNA polimerasa. Por ejemplo, en las eucario- 3’
tas, la DNA polimerasa α carece de actividad de exonucleasa y por tanto no puede
realizar la lectura de pruebas de su trabajo. 5’

En muchas células, una exonucleasa conocida como RNasa H (H significa “híbri- Polimerasa
da”) opera en el sentido 5´ 3´ para escindir nucleótidos en el extremo cebador de
un fragmento de Okazaki. La hidrólisis de nucleótidos puede continuar hasta que la 3’
DNA polimerasa, ahora en el proceso de completar otro fragmento de Okazaki,
“alcanza” a la RNasa H (la polimerasa es más rápida que la exonucleasa). Al extender 5’
el nuevo fragmento de Okazaki, la polimerasa sustituye los ribonucleótidos escindi-
dos por desoxirribonucleótidos, dejando una mella monocatenaria entre los dos seg- Figura 20-13. Lectura de pruebas
mentos de cadena atrasada (figura 20-14). durante la polimerización. La DNA
polimerasa detecta una distorsión en el
Si la DNA polimerasa alcanza el fragmento de Okazaki anterior antes de que un DNA bicatenario debida a la
cebador se haya separado por completo, la polimerasa desplaza el cebador, creando incorporación de un nucleótido
una “pestaña” monocatenaria. La RNasa H u otra proteína actúa entonces como una disconforme. La actividad de 3´ 5´
endonucleasa para cortar el cebador (figura 20-15). Al parecer, esta endonucleasa de exonucleasa hidroliza el nucleótido en el
pestaña reconoce la unión entre porciones de RNA y DNA de una misma cadena extremo 3´ de la nueva cadena
polinucleotídica. (recuérdese que una exonucleasa retira
residuos del extremo de un polímero;
El polipéptido de la DNA polimerasa I de E. coli en realidad incluye actividad de una endonucleasa los escinde del
5´ 3´ exonucleasa (además de la endonucleasa de lectura de pruebas 3´ 5´), de interior del polímero). La polimerasa
modo que, al menos in vitro, una sola proteína puede retirar ribonucleótidos del reanuda entonces su actividad,
fragmento de Okazaki previo al tiempo que extiende el siguiente fragmento de Oka- generando un DNA con las bases
zaki. Las actividades combinadas de retirar y sustituir nucleótidos tienen el efecto pareadas de manera precisa.
neto de desplazar la mella en el sentido 5´ 3´. Este fenómeno se conoce como
traslación de mella. La DNA polimerasa no puede sellar la mella; ésta es la función
de otra enzima.

Cadena plantilla DNA polimerasa 3’
5’
3’ Nuevo fragmento
de Okazaki
Fragmento de Okazaki previo

RNasa H

Mella

Figura 20-14. Escisión del cebador. La RNasa H elimina el RNA cebador y algo del
DNA adyacente, lo cual permite a la DNA polimerasa sustituir de manera precisa esos
nucleótidos. Entonces puede sellarse la mella.

20-2. Maquinaria de replicación del DNA | 531

Figura 20-15. Función de la 5’ 3’
3’ 5’
endonucleasa de pestaña. Si la DNA DNA polimerasa
polimerasa desplaza el RNA cebador del Cebador del primer
fragmento de Okazaki previo, una fragmento de Okazaki
endonucleasa puede retirar la pestaña
monocatenaria. Endonucleasa
de pestaña

Los segmentos discontinuos de la cadena atrasada se unen por la acción de la
DNA ligasa. La reacción, que da por resultado la formación de un enlace fosfodiés-
ter, consume la energía libre de un enlace similar en un cofactor nucleotídico. Las
procariotas usan NAD+ para la reacción, lo que genera los productos AMP y mono-
nucleótido de nicotinamida; las eucariotas usan ATP y producen AMP y PPi.

OOO

Adenina Ribosa O P O P O P OϪ

ATP OϪ OϪ OϪ

O
Adenina Ribosa O P OϪ ϩ PPi

AMP OϪ

OO
Adenina Ribosa O P O P O Ribosa Nicotinamida

OϪ OϪ

Dinucleótido de nicotinamida adenina (NADϩ)

Adenina Ribosa OO

AMP O P OϪ ϩ ϪO P O Ribosa Nicotinamida

OϪ OϪ

Mononucleótido
de nicotinamida

La unión de fragmentos de Okazaki da por resultado una cadena atrasada continua,
lo que completa el proceso de replicación del DNA.

REPASO DE CONCEPTOS
• Explique por qué el modelo de fábrica para la replicación del DNA es superior al

modelo de locomotora.
• Resuma las funciones de helicasa y SSB durante la replicación.
• Explique por qué la polimerización del DNA debe ser cebada por RNA.
• Explique el modo en que dos DNA polimerasas, operando en el sentido 5´ 3´,

duplican las dos cadenas plantilla antiparalelas.
• ¿Qué proteína potencia la procesividad de la DNA polimerasa?
• ¿De qué manera la polimerasa realiza la lectura de pruebas de sus errores?
• Explique por qué se requieren una RNasa, una polimerasa y una ligasa para

completar la síntesis de la cadena atrasada.

532 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

20-3. Telómeros

En una molécula de DNA circular bacteriano la replicación termina cuando las dos CONCEPTO CLAVE
horquillas de replicación se encuentran, en un punto más o menos opuesto al origen • Los extremos de los cromosomas
de replicación. En un cromosoma eucariótico lineal, la replicación debe proceder
hasta el extremo mismo del cromosoma. El copiado de los extremos 5´ de las dos eucarióticos son extendidos por
cadenas de DNA originales es un proceso directo, dado que la DNA polimerasa telomerasa para formar telómeros.
extiende una nueva cadena complementaria en el sentido 5´ 3´.

Cadena plantilla 5’
Nueva cadena 3’

Sin embargo, la replicación de los extremos 3´ de las cadenas de DNA originales
representa un problema por la misma razón. Incluso si un RNA cebador se apareara
con el extremo 3´ de una cadena plantilla, la DNA polimerasa no podría sustituir los
ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos.

Cadena plantilla
3’
5’

Cebador Eliminación
del cebador

3’
5’

El extremo 3´ de cada cadena de DNA original (plantilla) se extendería más allá del
extremo de cada nueva cadena y sería susceptible a las nucleasas. En consecuencia,
cada ronda de replicación de DNA causaría el acortamiento del cromosoma.

5′ 3′

3′ 5′

+

Las células eucarióticas contrarrestan la pérdida potencial de información genéti-
ca extendiendo de manera activa los extremos de los cromosomas. La estructura re-
sultante, que consiste en repeticiones en tándem (lado a lado) cortas, se denomina
telómero. Las proteínas asociadas al DNA telomérico protegen el extremo del cro-
mosoma contra la degradación nucleolítica e impiden la unión de dos cromosomas
mediante enlace extremo a extremo (una reacción que ocurre de manera normal para
reparar moléculas de DNA rotas).

La telomerasa extiende los cromosomas

Las proteínas teloméricas tienen entre otras una actividad enzimática conocida como
telomerasa, que fue descrita originalmente por Elizabeth Blackburn. La telomerasa
agrega de manera repetitiva una secuencia de seis nucleótidos al extremo 3´ de una
cadena de DNA, usando como plantilla una molécula de RNA asociada a enzima.
La subunidad catalítica de la telomerasa es una transcriptasa inversa, homóloga de
una enzima viral que copia en DNA el genoma de RNA viral (recuadro 20-A).

Aunque el centro catalítico de la telomerasa es altamente conservado entre las
eucariotas, su subunidad RNA varía cerca de 150 a 1 300 nucleótidos entre las dis-
tintas especies. En el humano, el RNA es una secuencia de 451 bases, incluidas las
seis que sirven como plantilla para adición de repeticiones de DNA con la secuencia

20-3. Telómeros | 533

RECUADRO 20-A UN VISTAZO MÁS DE CERCA

VIH y transcriptasa inversa

Cuando el VIH, causante del SIDA, se descubrió en 1983, ya se El proceso completo de transcripción inversa ocurre como
conocía mucho acerca de su biología. El VIH es uno de los retrovi- sigue: la enzima se une a la plantilla de RNA y genera una cadena
rus, originalmente llamados virus tumorales de RNA debido a su de cDNA. En una célula hospera, la síntesis de DNA es iniciada
capacidad de causar tumores en determinados animales. En realidad por una molécula de RNA de transferencia (tRNA). Cuando
el VIH destruye células del sistema inmunitario en vez de causar ocurre la polimerización, el sitio con actividad de RNasa degrada la
cáncer, pero su genoma de RNA recuerda al de los virus tumorales. cadena de RNA de la molécula híbrida RNA-DNA, dejando una
sola cadena de DNA que luego sirve como plantilla para que el
Los estudios de los retrovirus han redefinido el significado de la sitio con actividad de polimerasa de la transcriptasa inversa lo
información genética y redefinido el dogma central, que sostenía utilice en la síntesis de una segunda cadena de DNA. El resultado
que la información biológica fluye en un solo sentido de DNA a es una molécula de DNA bicatenaria.
RNA a proteína. Los retrovirus copian sus genes a DNA por un
proceso de “transcripción inversa” (de ahí su nombre, retrovi- tRNA
rus) usando transcriptasa inversa, una enzima que sintetiza
DNA usando una plantilla de RNA. RNA

La transcriptasa inversa viral ha resultado ser más que una DNA
curiosidad biológica. Se ha convertido en una valiosa herramienta
de laboratorio, que permite a los investigadores extraer de las
células transcritos de RNA mensajero y purificarlos, transformarlos
en DNA (llamado DNA complementario cDNA), y luego clonar
el DNA o expresar su producto proteínico.

La estructura de la transcriptasa inversa incluye dominios
correspondientes a las regiones de dedos, pulgar y palma de otras poli-
merasas. Esas partes de la proteína (en rojo en la figura) comprenden
un sitio con actividad de polimerasa que en realidad puede usar su
DNA o RNA como plantilla (ninguna otra enzima tiene esta doble
especificidad). Un dominio separado (en verde) contiene un sitio con
actividad de RNasa que degrada la plantilla de RNA.

(Estructura de la transcriptasa inversa del VIH [pdb 1BQN] determinado Entre los inhibidores químicos de la transcriptasa inversa se
por Y. Hsiou, K. Das y E. Arnold.) incluyen los didesoxinucleótidos dirigidos contra el sitio activo
derivados de nucleósidos como AZT (3´-azido-2´,3´-
didesoxitimidina; véase recuadro 7-B). Estos compuestos se
desarrollaron originalmente como agentes anticancerosos (aunque
no fueron muy eficaces), pero ya estaban a la venta cuando se
descubrió el VIH. Los inhibidores no nucleosídicos de la transcrip-
tasa inversa del VIH se unen a la enzima cerca de la base del
dominio pulgar. Esto no interfiere en la unión de RNA o nucleó-
tido, pero inhibe la actividad de polimerasa, tal vez al restringir el
movimiento del pulgar.

Véase ejercicio interactivo. Transcriptasa inversa del VIH.

TTAGGG. Secuencias ricas en G similares extienden los extremos 3´ de los cromo-
somas en todas las eucariotas. A fin de sintetizar DNA telomérico, la plantilla de
RNA debe realinearse de manera repetitiva con el extremo de la extensión hexanu-
cleotídica previa. La alineación precisa depende del pareamiento de bases entre
DNA telomérico y una porción no plantilla del RNA que actúa como telomerasa.

534 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

TTAGGG Figura 20-16. Síntesis de DNA

3’ telomérico. La telomerasa extiende el
5’ extremo 3´ de una cadena de DNA
añadiendo repeticiones TTAGGG
Telomerasa (segmentos amarillos). La DNA
polimerasa puede entonces extender la
3’ cadena complementaria por el
mecanismo normal para la síntesis de
5’ cadena atrasada (segmentos
DNA polimerasa anaranjados). Nótese que este proceso
aún deja una saliente 3´ (hasta 300
nucleótidos en el humano), pero el
cromosoma se ha alargado.

3’
5’

Cuando el extremo 3´ de una cadena de DNA ha sido extendido por telomerasa,
puede actuar como plantilla para la síntesis ordinaria de una extensión rica en C de
la cadena de DNA complementaria (figura 20-16).

En el humano, el DNA telomérico tiene 2 a 10 kb de largo, dependiendo del
tejido y edad del individuo, e incluye una saliente monocatenaria de 100 a 300 nu-
cleótidos. Esta cadena sencilla de DNA puede plegarse sobre sí misma para formar
una estructura llamada asa en T. El DNA rico en G también puede plegarse de tal
manera que cuatro bases guanina forman enlaces de hidrógeno entre sí (un “cuarteto
G”). De manera alterna, el DNA puede unirse a una proteína llamada POT1 (abre-
viatura de protection of telomeres). Esta proteína, que incluye dos dominios de unión
a DNA, puede interactuar con unos 12 nucleótidos (2 repeticiones teloméricas; fi-
gura 20-17). Múltiples proteínas POT1 podrían cubrir el DNA, de modo muy pa-
recido a como la SSB lo hace durante la replicación del DNA. En experimentos con
células cultivadas se ha demostrado que POT1 y otras proteínas asociadas a telóme-
ro tienen una función crítica en la regulación de la longitud del telómero, la cual
puede ser un indicador de la longevidad de las células.

¿Está vinculada la actividad de la telomerasa con la Figura 20-17. Proteína de unión a
inmortalidad celular? telómero POT1. Los dos dominios de
unión a nucleótido de la proteína de la
Parece ser que las células que de manera normal experimentan un número limitado levadura Schizosaccharomyces pombe se
de divisiones celulares no contienen telomerasa activa. En consecuencia, el tamaño muestran en verde y azul. Un
de los telómeros disminuye con cada ciclo de replicación hasta que las células entran oligonucleótido de 10 nucleótidos se
en una fase de senescencia y dejan de dividirse. Para la mayoría de las células huma- muestra en púrpura. (Estructura [pdb
nas, este punto se alcanza después de unas 35 a 50 divisiones celulares. En contraste,
al parecer las células que son “inmortales”, como los organismos unicelulares y las 1XJV] determinada por M. Lei, E.R. Podell y
células reproductivas de los organismos multicelulares, tienen telomerasa activa. Es- T.R. Cech.)
tas observaciones concuerdan con la función de la telomerasa de mantener los extre-
mos de los cromosomas durante muchas rondas de división. 20-3. Telómeros | 535

Al parecer la telomerasa se activa en células cancerosas derivadas de tejidos que de
manera normal son senescentes. Esto sugiere que suprimir la actividad de telomera-
sa podría ser un tratamiento eficaz para el cáncer. Sin embargo, para muchas células,
la actividad de telomerasa por sí misma no es un indicador del potencial de la célula
para la inmortalidad. Más bien, la capacidad de las células de experimentar divisio-
nes repetidas sin acortamiento cromosómico podría ser una función más compleja
de la actividad de telomerasa y la longitud e integridad del telómero, el cual, como
otras porciones del DNA, es susceptible de daño.

REPASO DE CONCEPTOS
• ¿Por qué la replicación del DNA acorta el cromosoma?
• Describa la estructura del DNA telomérico.
• ¿Cuál es la función del componente RNA de la telomerasa?
• Explique la relación entre telómeros e inmortalidad celular.

20-4. Daño y reparación del DNA

CONCEPTOS CLAVE Una alteración en el DNA de una célula, ya sea por un error de polimerización u
• Una mutación en el DNA puede otra causa, se hace permanente –esto es, constituye una mutación– a menos que se
repare. En un organismo unicelular, el DNA alterado se duplica y pasa a las células
deberse a errores de la replicación hijas cuando la célula original se replica. En un organismo multicelular, una muta-
del DNA, procesos celulares ción pasa a la descendencia sólo si el DNA alterado se encuentra en las células repro-
no enzimáticos y factores ductivas. Las mutaciones que ocurren en otros tipos de células sólo afectan a la
ambientales. progenie de esas células en el organismo original.
• Diversas enzimas, incluidas
nucleasas, polimerasas y Un cambio genético puede afectar la expresión de los genes de manera positiva o
ligasas, participan en las vías de negativa (o puede no tener un efecto cuantificable en el organismo). La acumulación
reparación del DNA. de cambios genéticos durante el tiempo de vida de un individuo puede contribuir a
la pérdida gradual de funcionalidad asociada al envejecimiento. Las células con DNA
muy dañado tienden a resultar tan afectadas que sufren apoptosis, o muerte celular
programada, lo que deja espacio para que sean sustituidas por células sanas. Pero en
algunos casos, las células con el DNA dañado no mueren sino que escapan a los me-
canismos de control de la proliferación normales y proliferan en exceso, de lo que
resulta cáncer. Por esta razón, el cáncer puede considerarse una enfermedad de los
genes (recuadro 20-B). En esta sección se examinan diferentes tipos de daño del DNA

y los mecanismos que las células emplean para restablecer la integridad del DNA.

RECUADRO 20-B NOTAS CLÍNICAS

El cáncer es una enfermedad genética

El cáncer es una de las enfermedades más comunes, que afecta una pueden producir receptores y cinasas con actividad constitutiva, de
de cada tres personas y causa la muerte de una de cada cuatro. El modo que la célula crece y se divide incluso en ausencia de una
cuadro clínico del cáncer varía mucho, dependiendo del tejido señal de crecimiento (véase recuadro 10-B).
afectado, pero todas las células cancerosas comparten la capacidad
de proliferar de manera incontrolable y pasar por alto las señales Los procesos de desactivación genética también contribuyen al
habituales para diferenciarse o experimentar apoptosis. Con el cáncer. Por ejemplo, el cáncer infantil conocido como retinoblas-
tiempo, el cáncer puede causar la muerte al invadir y erosionar el toma (que se caracteriza por tumores retinianos) ocurre de maneras
tejido normal circundante. hereditaria o esporádica (no hereditaria). La edad de inicio del
tumor varía mucho, y concuerda con un escenario en el que ambas
Al parecer, muchos cánceres resultan de predisposición copias (alelos) de un gen deben ser desactivadas para que la
genética, factores ambientales o infecciones. Sólo alrededor de 1% enfermedad se desarrolle. Los niños con la forma hereditaria del
de los cánceres se clasifican como hereditarios, pero hay más de 20 retinoblastoma sucumben a corta edad porque ya portan un alelo
tipos diferentes de ellos, y arrojan considerable información sobre defectuoso (heredado de uno de los progenitores). La desactivación
mecanismos moleculares específicos de la carcinogénesis (el del segundo alelo causa transformación. El gen del retinoblastoma
desarrollo del cáncer). El conocimiento del vínculo entre factores se conoce como gen supresor tumoral, dado que su pérdida
ambientales y cáncer proviene en mayor medida de estudios conduce al desarrollo de cáncer.
epidemiológicos, los cuales han mostrado por ejemplo que la
radiación solar incrementa el riesgo de melanoma cutáneo (cáncer Los cambios genéticos –ya sea que activen un oncogén
de piel), y que el tabaquismo y la exposición a asbesto promueven promotor del crecimiento o desactiven un gen supresor tumoral–
el desarrollo de cáncer pulmonar. Las infecciones virales contribu- pueden asumir la forma de mutaciones puntuales, deleciones
yen a determinados tipos de cáncer, por ejemplo cáncer hepático grandes o pequeñas, reordenamientos cromosómicos o metilación
por virus de la hepatitis B y cáncer cervicouterino por virus del inapropiada que conduce al silenciamiento génico (sección 20-5).
papiloma humano. Las infecciones bacterianas crónicas también Dado que el crecimiento y la división celulares son regulados de
pueden causar cáncer. manera estrecha, es poco probable que un cambio genético
individual lleva a una célula a un patrón de proliferación descon-
Todas las causas conocidas de cáncer se relacionan de alguna trolada que desemboque en cáncer. La capacidad de una célula de
manera con daño del DNA de la célula. Así, el cáncer es crecer y dividirse depende de muchos factores, incluido el equili-
fundamentalmente una enfermedad de los genes. Se observó que brio entre señales promotoras del crecimiento y señales apoptósi-
las mutaciones oncogénicas en vías de señalización del crecimiento cas, el estado de los telómeros, los contactos con células vecinas y el

536 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

NOTAS CLÍNICAS Continuación

suministro de oxígeno y nutrimentos para sostener la expansión. ganancias de cromosomas completos, y partes de un cromosoma
En general, varias vías regulatorias deben ser rebasadas por pueden transponerse a otro. El estado del DNA, que parece ir de
acontecimientos genéticos separados. Esto se conoce como teoría mal en peor, al parecer refleja la falla de los mecanismos que
de los golpes múltiples para la carcinogénesis. detectan DNA dañado y promueven su restauración. Estos pasos
requieren muchas proteínas, incluidas cinasas y otros componentes
No existe una secuencia de acontecimientos definida para la de señalización intracelular que reaccionan con rapidez (por lo
transformación de células normales en tumorales, así que el cáncer común en minutos) al daño del DNA. Aquí se exponen algunas de
no es una sola enfermedad. Los esfuerzos por identificar mutacio- estas proteínas.
nes comunes en los cánceres del humano, prometen extender la
comprensión del cáncer y descubrir nuevos blancos terapéuticos. Un participante clave en la vía de respuesta al daño es la
Las técnicas para perfilar las características únicas de un tumor proteincinasa conocida como ATM, la cual es defectuosa en la
usando micromatrices de DNA (véase recuadro 3-B) ya se usan ataxia telangiectasia. Esta enfermedad se caracteriza por neurodege-
para predecir su potencial de crecimiento y seleccionar el régimen neración, envejecimiento prematuro y propensión al cáncer. La
más apropiado para detenerlo. Se ilustra parte de un perfil de ATM es una proteína grande (350 000 D) que incluye un dominio
expresión génica de tumores mamarios. Cada banda horizontal de unión a DNA. Se activa en respuesta a daño del DNA, como
corresponde a un gen distinto usado en la micromatriz, y las roturas de la doble cadena. Entre los sustratos para la actividad de
columnas representan diferentes tumores. Los cuadros verdes cinasa ATM se encuentran proteínas implicadas en el inicio de la
indican niveles de expresión génica por abajo de la media, los división celular, la proteína BRCA1 (cuyo gen suele estar mutado
cuadros rojos representan niveles por arriba de la media, y los tonos en el cáncer mamario) y el supresor tumoral conocido como p53.
intermedios reflejan niveles más cercanos a la media (los cuadros
grises indican ausencia de datos). El cáncer mamario afecta a 1 de cada 9 mujeres en los países
desarrollados. Del cancer mamario 10% tiene forma familiar, y más
(Cortesía de David Botstein y Therese Sorlie, Stanford University. De Nature o menos la mitad exhiben mutaciones en los genes BRCA1 o
406, 747-752 [2000].) BRCA2. Una mujer que porte uno de estos genes mutados tendrá
probabilidad de 70% de desarrollar cáncer de mama. BRCA1 y
En ausencia de información específica acerca de un tumor, la BRCA2 son proteínas multidominio grandes que funcionan en
terapia del cáncer sólo puede abordar las características comunes a parte como proteínas de andamiaje para conectar proteínas que
todas las formas de la enfermedad. En la actualidad, esto significa detectan daño del DNA con proteínas que reparan el daño o
principalmente suprimir la proliferación celular. La mayoría de los interrumpen el ciclo celular. Por ejemplo, BRCA2 se une a Rad51,
fármacos que interfieren en la mitosis y división celular son útiles una proteína necesaria para la vía de reparación por recombinación.
pero no específicos para células cancerosas; también destruyen La pérdida de BRCA1 o BRCA2 incrementa la probabilidad de que
tejidos que experimentan renovación regular de manera normal. La una célula intente dividirse sin antes reparar el DNA dañado.
radiación es eficaz para destruir células cancerosas, aunque puede
actuar de manera indirecta destruyendo las células endoteliales El gen supresor tumoral p53 se encuentra mutado al menos en
radiosensibles de los vasos sanguíneos que llevan nutrimentos a las la mitad de todos los tumores humanos. El nivel de p53 en la
células cancerosas en rápida proliferación. Los fármacos que célula es controlado por su velocidad de degradación (es ubiqui-
inhiben la angiogénesis (el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos) nado y dirigido a un proteasoma para su destrucción; véase sección
también pueden frenar el crecimiento tumoral. 12-1). La concentración de p53 aumenta cuando su degradación se
frena. Esto puede ocurrir con un decremento en la velocidad a la
Dado que el cáncer es difícil de curar, también deben considerarse cual la ubiquitina se une a ella o cuando es fosforilada por la acción
esfuerzos preventivos. Los estudios epidemiológicos sugieren que las de una cinasa como ATM. Así, el daño del DNA, que activa ATM,
muertes por cáncer podrían reducirse en grado significativo (hasta en la causa un incremento en la concentración celular de p53.
mitad) eliminando factores de riesgo conocidos, como tabaquismo y
exposición a determinados agentes químicos y microorganismos. En un DNA Proteína sensora
futuro los casos restantes de cáncer podrían tratarse con agentes dañado de daño al DNA
diseñados para rectificar defectos específicos a nivel molecular.
ATM p53 p53
Las vías de reparación del DNA están vinculadas con el activa activa inactiva
cáncer
Identificar lesiones genéticas específicas en células cancerosas es Apoptosis
complicado, en parte porque los cánceres son genéticamente inesta-
bles. Además de mutaciones pequeñas, son posibles pérdidas o Interrupción Ensamblaje
del ciclo celular de la maquinaria
de reparación del DNA

20-4. Daño y reparación del DNA | 537

NOTAS CLÍNICAS Continuación

Otras modificaciones, como acetilación y glucosilación,
también incrementan la actividad de p53, que reacciona no sólo al
daño del DNA sino también a otras formas de estrés celular como
concentración de oxígeno baja y altas temperaturas. La modifica-
ción covalente de p53 induce un cambio conformacional que
permite a la proteína unirse a secuencias específicas de DNA a fin
de promover la transcripción de varias docenas de genes distintos.
La proteína p53 se une como un tetrámero (un dímero de dímeros)
al DNA, rodeándolo.

Un dímero de p53 (gris) unido a DNA (azul). Los seis residuos que más a Una célula en el proceso de apoptosis. (Dr. Andrejs Liepins/Science
menudo están mutados en p53 de células cancerosas se muestran en rojo. Photo Library/Photo Researchers.)
Estos residuos interactúan directamente con el DNA o participan en la
estabilización de la estructura de p53. (Estructura [pdb 2GEQ] determinada Es posible que los efectos definitivos de p53 dependan de la dosis,
por W.C. Ho, M.X. Fitzgerald y R. Marmorstein.) donde las dosis más bajas (que reflejan daño leve del DNA) detienen
el ciclo celular y las dosis mayores (que reflejan daño grave e irrepara-
La p53 estimula la producción de una proteína que bloquea el ble del DNA) conducen a la muerte celular. La posición de p53 en el
desarrollo de la célula hacia la división celular. Este mecanismo cruce de vías relacionadas con reparación del DNA, control del ciclo
regulatorio da a la célula tiempo para reparar el DNA usando celular y apoptosis indica por qué la pérdida del gen que codifica p53
enzimas cuya síntesis también es estimulada por p53. Además, la tiene un vínculo tan fuerte con el desarrollo de cáncer.
p53 activada a su vez activa el gen que codifica una subunidad de la
ribonucleótido reductasa (véase sección 18-3), que promueve la PREGUNTAS
síntesis de los desoxinucleótidos necesarios para la reparación
del DNA. 1. Con base en lo que sabe sobre las causas del cáncer, explique por
qué el riesgo de desarrollarlo aumenta con la edad.
Algunos genes blanco de p53 codifican proteínas que realizan
la apoptosis. Éste es un proceso de múltiples pasos en el cual las 2. El producto del gen del retinoblastoma es una proteína que se
estructuras internas de la célula se colapsan y el contenido celular une e inhibe el factor de transcripción que induce la expresión
se distribuye en vesículas rodeadas por membrana que luego son de genes necesarios para que la célula sintetice DNA. Explique
engullidas por macrófagos. Las células que mueren por otras causas el modo en que una mutación en el gen del retinoblastoma
–lesión mecánica, infección bacteriana o falta de oxígeno– suelen promueve el cáncer.
derramar su contenido e inducen inflamación. En contraste, la
muerte apoptósica es un suceso ordenado que minimiza las 3. Explique por qué heredar un gen defectuoso para la proteína de
perturbaciones para las células vecinas. Para los organismos retinoblastoma BRCA1 o para la proteína p53 no asegura que
multicelulares, la apoptosis a menudo es una mejor opción que un individuo desarrollará cáncer.
permitir que una célula disfuncional subsista.
4. El sistema inmunitario humano es capaz de reconocer marcado-
res en la superficie de células cancerosas, de modo que estas
células puedan ser destruidas de manera selectiva. ¿Qué caracte-
rística de una célula transformada cambiaría su apariencia?

5. Una de las proteínas que perciben DNA dañado puede guardar
semejanza estructural con PCNA, la proteína pinza deslizante
eucariótica que favorece la procesividad de la DNA polimerasa
(figura 20-12). Explique por qué tal proteína es apta para vigilar
la integridad química del DNA.

6. La vía de señalización por Ras (véase sección 10-3) activa un
factor de transcripción llamado Myc, el cual a su vez activa un
gen para una proteína que bloquea la actividad de la proteína
que agrega ubiquitina a p53. ¿Es este mecanismo consistente
con la capacidad de la señalización excesiva por Ras de promo-
ver el crecimiento celular?

7. En 1931, Otto Warburg notó que las células cancerosas usan en
mayor medida la glucólisis en vez de la respiración aeróbica para
producir ATP, una adaptación que da a las células cancerosas una
ventaja selectiva en ambientes con bajo oxígeno. En 2006, los
investigadores descubrieron que p53 estimula la expresión de la
citocromo c oxidasa. Indique el modo en que la conexión entre
p53 y citocromo c oxidasa explica la observación de Warburg.

8. ¿Por qué los organismos unicelulares no necesitan la apoptosis?

538 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

El daño del DNA es inevitable

El daño del DNA, aún si no desemboca en cáncer, es una realidad de la vida. Incluso
con su actividad de lectura de pruebas, la DNA polimerasa comete errores al intro-
ducir bases no correspondientes o incorporar uracilo en vez de timina. En ocasiones
la DNA polimerasa agrega o elimina nucleótidos, lo que produce protuberancias u
otras irregularidades en el DNA. Esos errores dan origen a mutaciones como inser-
ciones o deleciones.

El metabolismo celular expone al DNA a los efectos dañinos de especies reactivas
de oxígeno (p. ej., el anión superóxido •O2–, el radical hidroxilo •OH, o el compues-
to H2O2) que son subproductos normales del metabolismo oxidativo. Se han catalo-
gado más de 100 modificaciones oxidativas distintas del DNA. Por ejemplo, la
guanina puede oxidarse a 8-oxoguanina (oxoG):

O N O H
HN HN
H2N N 8 H2N N N
8O
N
N

Guanina 8-Oxoguanina
(oxoG)

Cuando la cadena de DNA modificada se duplica, la oxoG se puede parearse con
una base con cualquiera de las C o A. El par de bases G:C original puede conver-
tirse en un par de bases T:A. Una sustitución de nucleótidos como ésta se llama
mutación puntual. El cambio de una purina (o pirimidina) por otra purina se
conoce como mutación por transición; ocurre una transversión cuando una
purina sustituye una pirimidina o viceversa.

Otras reacciones no enzimáticas desintegran el DNA en condiciones fisiológicas.
Por ejemplo, la hidrólisis del enlace N-glucosídico que une una base con un grupo
desoxirribosa genera un sitio abásico (también llamado sitio AP, que puede ser apu-
rínico o apirimidínico).

Las identidades de las bases pueden ser alteradas por reacciones de desaminación.
Esto constituye un peligro especial en el caso de la citosina, dado que su desamina-
ción (en realidad una desaminación oxidativa) genera uracilo:

H O
NH

N N H

N N
O O

Citosina Uracilo

Recuérdese que el uracilo tiene las mismas tendencias de pareamiento de bases que
la timina, de modo que el par de bases C:G original podría dar origen a un par de
bases T:A después de la replicación del DNA. Dado que el DNA evolucionó de
modo que contiene timina en vez de uracilo, una base uracilo resultante de la desa-
minación de citosina puede ser reconocida y corregida antes de que el cambio se
haga permanente.

Además de los factores celulares descritos, agentes ambientales como radiación
ultravioleta (UV), radiación ionizante y determinados agentes químicos pueden da-
ñar físicamente el DNA. Por ejemplo, la radiación UV induce enlaces covalentes
entre bases timina adyacentes:

20-4. Daño y reparación del DNA | 539

O O O O
HN HN CH3
CH3 CH3 HN CH3
HN
Radiación UV

ON ON ON O
N

Esqueleto del DNA Dímero de timina
Residuos timina

Esto acerca las bases entre sí, lo cual distorsiona la estructura helicoidal del DNA.
Los dímeros de timina pueden entonces interferir en la replicación y la transcripción
normales.

La radiación ionizante también daña el DNA por su acción directa en la molécu-
la de DNA o de manera indirecta al inducir la formación de radicales libres, en
particular el radical hidroxilo, en el medio circundante. Esto puede ocasionar rotura
de la cadena. Muchos miles de agentes químicos, tanto naturales como sintéticos,
tienen el potencial de reaccionar con la molécula de DNA y ocasionar mutaciones.
Esos compuestos se conocen como mutágenos, o carcinógenos si la mutación con-
duce a cáncer.

La naturaleza inevitable de muchas lesiones del DNA ha impulsado la evolución
de mecanismos para detectar y remediar errores. Una célula que contiene una muta-
ción puntual o una pequeña inserción o deleción puede no sufrir efectos nocivos, en
particular si la mutación ocurre en una parte del genoma que no contiene un gen
específico. Sin embargo, lesiones más graves, como las roturas de una o ambas cade-
nas, suelen causar la replicación o traducción de una señal de detención, y la célula
debe enfrentar de inmediato estos supresores.

Las enzimas de reparación restauran algunos tipos de
DNA dañado

En algunos casos, la reparación del DNA dañado es un proceso simple en que interviene
una enzima. Por ejemplo, en bacterias y otros organismos (pero no en los mamíferos),
los dímeros de timina inducidos por radiación UV pueden restaurarse a su forma mo-
nomérica por la acción de una enzima activada por luz llamada DNA fotoliasa.

Los mamíferos pueden revertir otras formas simples de daño del DNA, como la
metilación de un residuo guanina, que genera O6-metilguanina (esta base modifica-

da puede parearse con citosina o timina):

CH3
O

N6 N

H2N N N

O 6-Metilguanina

Una metiltransferasa elimina el grupo metilo nocivo, transfiriéndolo a uno de sus
residuos Cys. Esto desactiva la proteína de modo permanente. Al parecer, el costo de
sacrificar la metiltransferasa es justificado por la naturaleza altamente mutágena de
la O6-metilguanina.

En bacterias y eucariotas, los pareamientos erróneos de bases se corrigen poco
después de la replicación del DNA por un sistema de reparación de incompatibi-
lidades. Una proteína, llamada MutS en bacterias, inspecciona el DNA recién sin-
tetizado y se une al pareamiento erróneo. Aunque se une con fuerza sólo 20 veces

540 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Figura 20-18. Proteína de reparación

de incompatibilidades MutS unida a

DNA. Dos subunidades de la proteína
MutS, en forma de coma, rodean el
DNA en el sitio de un nucleótido
pareado incorrectamente. La unión hace
que el DNA se doble en forma aguda,
comprimiendo el surco mayor y
ensanchando el surco menor. a) Vista
frontal. b) Vista lateral. [Cortesía de Wei

Yang/NIH. De Nature 407, 703-710 [2000].)

(a) (b)

mayor al pareamiento erróneo que a un par de bases normal, MutS experimenta un
cambio conformacional y hace que el DNA se flexione (figura 20-18). Al parecer
estos cambios inducen a una endonucleasa a escindir la cadena con la base incorrec-
ta en un sitio de hasta a 1 000 bases de distancia. Una tercera proteína desenrrolla
entonces la hélice de modo que el segmento defectuoso de DNA pueda ser destruido
y reemplazado con nucleótidos cuidadosamente pareados por DNA polimerasa.
¿Cómo sabe la endonucleasa cuál cadena contiene la base incorrecta? En condiciones
normales, el DNA celular se encuentra metilado (sección 20-5), y la endonucleasa
puede seleccionar la cadena recién sintetizada porque aún no experimenta metila-
ción. Un defecto en el homólogo humano de MutS incrementa la tasa de mutación
del DNA y predispone a los individuos con el defecto a una forma hereditaria de
cáncer de colon.

La reparación por escisión de bases corrige los daños Base dañada

más frecuentes del DNA DNA glucosilasa

Las bases modificadas que no pueden ser reparadas de modo directo se pueden reti- Sitio abásico
rar y sustituir en un proceso conocido como reparación por escisión de bases. Esta Endonucleasa
vía comienza con una glucosilasa, que extrae la base dañada. Una endonucleasa corta
entonces el esqueleto, y el hueco es llenado por DNA polimerasa (figura 20-19). DNA polimerasa
DNA ligasa
Se han descrito en detalle las estructuras y mecanismos de varias DNA glucosila-
sas. Por ejemplo, existe una glucosilasa que reconoce la oxoG. La uracilo-DNA glu- Figura 20-19. Reparación por
cosilasa reconoce y elimina las bases uracilo que se incorporan por error en el DNA escisión de bases.
durante la replicación o que se generan por desaminación de citosina. Cuando una
glucosilasa se une a DNA, la base dañada se desprende de la hélice de modo que
puede unirse a una cavidad en la superficie de la proteína, y diversas cadenas laterales
proteínicas toman el lugar de la base dañada y forman enlaces de hidrógeno con su
complemento en la otra cadena de DNA (figura 20-20).

Después de cortar la base anómala, parece ser que las DNA glucosilasas permane-
cen unidas al DNA en el sitio abásico, quizá para ayudar a convocar la siguiente
enzima en la vía de reparación. Esta enzima, más a menudo llamada AP endonuclea-
sa (APE1 en el humano), hace una mella en el esqueleto del DNA en el lado 5´ de
la ribosa abásica. La nucleasa inserta dos asas de proteína en los surcos mayor y me-
nor del DNA y flexiona el DNA en unos 35° para exponer el sitio abásico. El esque-
leto con una base unida no puede entrar en el sitio activo. Durante la reacción de
hidrólisis, un ion Mg2+ en el sitio activo estabiliza el grupo saliente aniónico (figura
20-21). Como las glucosilasas, la AP endonucleasa permanece con su producto. Para

20-4. Daño y reparación del DNA | 541

Figura 20-20. Uracilo-DNA glucosilasa unida a DNA. La enzima se muestra en gris, y
el DNA sustrato se muestra con bandas azules y púrpuras. El uracilo desprendido (cuyos
enlaces glucosídicos ya han sido hidrolizados) se muestra en rojo. Una cadena lateral de
Arg que toma el lugar del uracilo se muestra en anaranjado. [Estructura [pdb 4SKN]

determinada por G. Slupphaug, C.D. Mol, B. Kavil, A.S. Arvai, H.E. Krokan y J.A. Tainer.)

la mayoría de las enzimas, la regla es la disociación rápida del producto, pero en la
reparación del DNA, es posible que la asociación continua de la endonucleasa con
la cadena de DNA cortada sea favorecida porque previene reacciones secundarias
indeseables.

En el paso final de la reparación por escisión de bases, una DNA polimerasa
(como la DNA polimerasa β en las eucariotas) llena el hueco de un nucleótido, y
una DNA ligasa sella la mella. En algunos casos, la DNA polimerasa es capaz de
reemplazar hasta 10 nucleótidos. La cadena individual desplazada puede entonces
ser escindida por una endonucleasa de pestaña (sección 20-2).

Figura 20-21. Reacción de la AP CH2O Base 5Ј
endonucleasa.
CH2O Base
5Ј

CH2O Base

O Mg2ϩ O Mg2ϩ OϪ Mg2ϩ
O
O P O CH2O ϪO P O CH2O
OϪ HO OϪ HO P O CH2O
3Ј OϪ
3Ј OH OH 3Ј

HO O Sitio AP O O OH

H

OϪ O HO O HO O
C C C
Asp Asp Asp

542 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

La reparación por escisión de nucleótidos actúa en la Dinucleótido dañado Helicasa

segunda forma más común de daño del DNA Endonucleasa

La reparación por escisión de nucleótidos, como su nombre sugiere, es similar a la DNA polimerasa
reparación por escisión de bases pero actúa principalmente en el daño del DNA que DNA ligasa
resulta de factores como radiación UV u oxidación. En la reparación por escisión de
nucleótidos, un segmento que contiene el nucleótido dañado y al rededor de otros 30 Figura 20-22. Reparación por
nucleótidos vecinos más se elimina, y el hueco resultante es llenado por una DNA poli- escisión de nucleótidos.
merasa que usa la cadena complementaria intacta como plantilla (figura 20-22). Muchas
de las alrededor de 30 proteínas que intervienen en esta vía en el humano se han identi-
ficado a través de mutaciones que se manifiestan como dos enfermedades genéticas.

La enfermedad hereditaria poco frecuente llamada síndrome de Cockayne se carac-
teriza por desarrollo neural deficiente, falta de crecimiento y sensibilidad a la radiación
solar. Resulta de una mutación en cualquiera de los genes que codifican proteínas que
participan en una vía para el reconocimiento de una RNA polimerasa que se ha “tra-
bado” durante la transcripción de un gen en RNA mensajero. El trabamiento ocurre
cuando la plantilla de DNA está dañada y distorsionada de tal modo que bloquea el
avance de la RNA polimerasa. Ésta debe ser retirada para que el sistema de reparación
por escisión de nucleótidos pueda abordar el daño en el DNA. Los defectos génicos
que se presentan en el síndrome de Cockayne impiden que la célula reconozca y retire
la RNA polimerasa trabada. En consecuencia, el DNA nunca tiene la oportunidad de
ser reparado, y la célula sufre apoptosis. La muerte de células en actividad transcripcio-
nal podría explicar los efectos del síndrome de Cockayne en el desarrollo.

Como el síndrome de Cockayne, la enfermedad xerodermia pigmentosa se caracte-
riza por alta sensibilidad a la radiación solar, las personas afectadas tienen unas 1 000
veces mayor probabilidad de sufrir cáncer cutáneo y no presentan problemas del desa-
rrollo (figura 20-23). La xerodermia pigmentosa es causada por una mutación en uno
de los genes que participan de modo directo en la reparación por escisión de nucleóti-
dos. Mientras que al parecer los productos génicos del síndrome de Cockayne detectan
daño del DNA que impide la transcripción, las proteínas de la xerodermia pigmentaria
son responsables de reparar el daño. Así, en la xerodermia pigmentosa no se induce la
apoptosis, pero el DNA dañado no puede repararse. La incapacidad de reparar lesiones
inducidas por radiación UV explica la alta incidencia de cáncer cutáneo.

Cuando la célula intenta duplicar el DNA dañado que no se ha reparado, puede recu-
rrir a una de sus DNA polimerasas no estándares. Por ejemplo, la DNA polimerasa η
eucariótica puede eludir lesiones del DNA como los dímeros de timina inducidos por
radiación UV incorporando dos bases adenina en la nueva cadena. Aunque es útil como
polimerasa translesional, la DNA polimerasa η es relativamente imprecisa y carece de ac-
tividad de exonucleasa lectora de pruebas. En promedio, inserta una base incorrecta cada
30 nucleótidos. Esto no suele ser problemático, ya que los errores se pueden detectar y
corregir por medio del sistema de reparación de incompatibilidades descrito antes.

La existencia de polimerasas propensas a errores proporciona un mecanismo a prueba
de fallas para replicar tramos de DNA que no pueden ser recorridos por la maquina-
ria de replicación estándar. De hecho, la síntesis de estas polimerasas alternas aumenta
cuando las células bacterianas sufren daño del DNA. Se acepta la posibilidad de introducir

pequeños errores durante la replicación cuando la única opción es la muerte celular.

Las roturas de la doble cadena pueden repararse Figura 20-23. Xerodermia
mediante unión de los extremos
pigmentosa. Un defecto en uno de los
Los segmentos de la doble hélice de DNA que se han cortado por completo debido genes responsable de la reparación por
a los efectos de radiación o radicales libres se pueden volver a unir mediante recom- escisión de nucleótidos (la cual
binación (un proceso que requiere otra molécula de DNA con secuencia similar; constituye una vía para restaurar DNA
véase más adelante) o por unión de extremos no homólogos, un proceso que no dañado por radiación UV) permite el
requiere la presencia de una molécula de DNA homóloga. En los mamíferos, casi desarrollo de numerosos cánceres de
todas las roturas de doble cadena son reparadas por este mecanismo. piel. (Ken Gree/Visuals Unlimited.)

El primer paso de reparación en esta vía es el reconocimiento de los extremos
rotos del DNA por una proteína dimérica llamada Ku (figura 20-24). Cuando Ku se
une al DNA cortado, sufre un cambio conformacional de modo que puede reclutar

20-4. Daño y reparación del DNA | 543

Figura 20-24. Ku unida a DNA. Las
dos subunidades del heterodímero Ku se
muestran en verde claro y oscuro, y las
cadenas de DNA se muestran en azul y
púrpura. (Estructura [pdb 1JEY] determinada

por J.R. Walker, R.A. Corpina y J. Goldberg.)

Alineación Ku una nucleasa, la cual corta hasta 10 residuos de los extremos de la molécula de DNA.
Al complejo proteína-DNA puede entonces unirse una DNA polimerasa como la
polimerasa μ, la cual puede extender los extremos del DNA con o sin una plantilla.
La polimerización sin plantilla, junto con la tendencia de la polimerasa μ a deslizar-
se, significa que el sitio de la rotura puede terminar con nucleótidos adicionales que
no estaban presentes en el DNA antes de que se rompiera. Una DNA ligasa termina
la reparación uniendo los dos esqueletos de los segmentos de DNA (figura 20-25).

Dos complejos Ku-DNA se asocian entre sí de modo que las dos mitades de una
molécula de DNA rota se vuelven a unir. Sin embargo, la unión de extremos no
homólogos también es responsable de combinar segmentos de DNA que no corres-
ponden entre sí, lo que ocasiona reordenamientos cromosómicos. Además, el com-
plejo Ku-DNA puede interactuar con la nucleasa, polimerasa y ligasa en cualquier
orden, por lo que una rotura de DNA tiene el potencial de ser reparada de modos
Ku distintos, con o sin adición o eliminación de nucleótidos. En consecuencia, la unión
de extremos no homólogos es inherentemente mutagénica, pero, como en otras for-
mas de reparación, éste puede ser el precio por la restauración de una doble cadena
de DNA continua.

Cadenas recortadas Nucleasa, polimerasa La recombinación también restaura moléculas
y extendidas
de DNA rotas

Ligadura Ligasa En algunos organismos, las roturas de doble cadena se reparan por recombinación,
un proceso que también ocurre en ausencia de daño del DNA como un mecanismo
Figura 20-25. Unión de extremos no para reordenar (“barajar”) genes entre cromosomas homólogos. La reparación por
recombinación de un cromosoma roto puede ocurrir en cualquier momento en un
homólogos. Ku reconoce los extremos organismo diploide (que tiene dos juegos de cromosomas homólogos), pero sólo
de DNA roto y los alinea. Las después de la replicación del DNA en un organismo con sólo un cromosoma. La
actividades de una nucleasa, polimerasa recombinación requiere otra molécula bicatenaria homóloga intacta así como nu-
y ligasa generan una molécula de DNA cleasas, polimerasas, ligasas y otras proteínas (figura 20-26).
continua que puede diferir en secuencia
de la original. En la reparación por recombinación, una cadena individual de la molédula
de DNA dañada intercambia su lugar con una cadena homóloga en otra molécula de
DNA. Para que una cadena individual de DNA “invada” una molécula bicatenaria
de DNA (paso 2 en la figura 20-26), la cadena individual debe ser cubierta por una
proteína de unión a ATP, llamada RecA en E. coli y Rad51 en el humano. RecA se
une a una cadena de DNA de manera cooperativa, comenzando en el punto de ro-
tura. Esta unión desenrrolla y estira el DNA en alrededor de 50%, pero no de ma-
nera uniforme: series de tres nucleótidos retienen una conformación cercana a la

544 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

3’ 1. Una exonucleasa recorta los
3’ extremos 5 ’ en la rotura.

DNA homólogo 2. Uno de los extremos 3 ’ libres
invade un segmento homólogo
de DNA bicatenario.

3. La DNA polimerasa extiende
los extremos 3 ’.

4. La resolución de la estructura
entrecruzada genera dos
segmentos de DNA sin roturas.

Figura 20-26. Recombinación homóloga para reparar una rotura de
la doble cadena.

estándar (con 3.4 Å entre bases) pero están separadas del triplete siguiente por 7.8 Å Figura 20-27. Conformación del
(figura 20-27). Durante la recombinación, el filamento de RecA-DNA se alinea con
el DNA bicatenario que contiene una cadena complementaria. La estructura elonga- DNA unido a RecA. La cadena simple
da del filamento de RecA puede inducir un cambio de forma similar en el DNA de de DNA se muestra en un modelo de
doble cadena, de modo que los pares de bases en el DNA de doble cadena se separan espacio lleno con color: C, gris; N ,azul;
y las bases se desapilan. Estos cambios facilitarían el cambio de cadena que ocurre O, rojo y P, anaranjado. Los corchetes
durante la recombinación. En este punto, la hidrólisis del ATP unido a RecA permi- indican series de tres nucleótidos que
te a la proteína liberar la cadena individual desplazada y un nuevo DNA bicatenario. retienen una conformación cercana a la
del DNA B. El esqueleto de DNA se
El mecanismo de recombinación es muy conservado entre las procariotas y euca- estira entre esos tripletes, de modo que
riotas, lo cual apoya su cometido esencial en el mantenimiento de la integridad del la cadena se extiende unas 1.5 veces su
DNA como un vehículo de información genética. Al parecer, las proteínas que rea- longitud original. No se muestran las
lizan la recombinación funcionan de manera constitutiva (es decir, los genes siem- subunidades de la proteína RecA.
pre se expresan), lo cual concuerda con las propuestas de que las roturas de la cadena
de DNA son inevitables. Sin embargo, muchos mecanismos de reparación de DNA (Estructura [pdb 3CMW] determinada por N.P.
sólo se inducen cuando se detecta la forma correspondiente de daño del DNA; dado
que de otro modo las enzimas de reparación podrían interferir en la replicación Pavletich.)

20-4. Daño y reparación del DNA | 545

normal. De hecho, la activación de las vías de reparación suele interrumpir la síntesis
de DNA, lo que constituye una ventaja cuando están activas las polimeraras de DNA,
propensas a cometer errores y que serían perjudiciales en la replicación normal.

REPASO DE CONCEPTOS
• Dé ejemplos del modo en que determinados agentes intracelulares y ambientales

pueden dañar el DNA.
• ¿Pueden atribuirse a uno de estos agentes todas las formas de daño del DNA?
• ¿Cómo surge una mutación puntual?
• Describa las vías generales y enzimas requeridas para reparación de

incompatibilidades, de escisión de bases, de escisión de nucleótidos; unión de
extremos y recombinación.
• Describa las ventajas y desventajas de las polimerasas de DNA, propensas a
cometer errores.

20-5. Empaque del DNA

CONCEPTOS CLAVE Después de su replicación, el DNA eucariótico asume una forma muy condensada.
• El DNA eucariótico está empacado Esto es ventajoso para una célula a punto de dividirse, ya que las moléculas de DNA
elongado se confundirían sin remedio en vez de segregarse de manera limpia para
con histonas para formar formar dos juegos equivalentes de cromosomas (los cromosomas humanos total-
nucleosomas, los cuales pueden mente extendidos tienen en conjunto una longitud aproximada de 2 m). Aun
formar estructuras de orden cuando la célula no está dividida, gran parte del DNA se empaca en una forma que
superior. reduce su longitud en grado considerable. Este DNA se conoce como heterocroma-
• Tanto histonas como DNA pueden tina, que es silenciosa con respecto a la transcripción. La eucromatina está menos
experimentar modificación condensada y al parecer se transcribe con mayor rapidez. Las dos formas de croma-
química.
tina pueden distinguirse por microscopia electrónica (figura 20-28).

La unidad fundamental de empaque del DNA es el

nucleosoma

Tanto la heterocromatina como la eucromatina contienen unidades estructurales
conocidas como nucleosomas, que son complejos de DNA y proteína. El centro de
un nucleosoma consiste en ocho proteínas histona: un par de cada una de las clases
conocidas como H2A, H2B, H3 y H4. Aproximadamente 146 pares de bases de
DNA se enrrollan alrededor del octámero de la histona (figura 20-29). Un nucleo-
soma completo contiene la estructura central más la histona H1, una pequeña pro-
teína que al parecer se une fuera del centro. Los nucleosomas vecinos están separados
por tramos cortos de DNA de longitud variable.

Figura 20-28. Un núcleo eucariótico.
La heterocromatina es el material teñido
de oscuro (rojo en esta micrografía
electrónica con color superpuesto); la
eucromatina se tiñe de un color más
claro (amarillo). (Gopal Murti/Science Photo

Library/Photo Researchers.)

(a) (b)

Figura 20-29. Estructura del centro de un nucleosoma. a) Vista superior. b) Vista
lateral (modelo de espacio lleno). El DNA (azul oscuro) se arrolla fuera del octámero
de histona. (Estructura [pdb 1AOI] determinada por K. Luger, A.W. Maeder, R.K. Richmond, D.F.

Sargent y T.J. Richmond.)

546 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

Doble hélice Fibra de 30 nm
de DNA (2 nm)

Histonas

Nucleosoma
(10 nm)

Cromosoma completamente
condensado (1 ␮m)

Figura 20-30. Niveles de estructura de la cromatina. La hélice de DNA (azul) se
enrrolla alrededor de un octámero de histona (amarillo) para formar un nucleosoma;
los nucleosomas se agregan para formar una fibra de 30 nm; ésta se empaca en asas en
el cromosoma completamente condensado. El diámetro aproximado de cada estructura
se da entre paréntesis.

Las proteínas histona interactúan con DNA de modo independiente de la secuen-
cia, principalmente por enlaces de hidrógeno e interacciones iónicas con el esqueleto
de fosfato y azúcar. Aunque las procariotas carecen de histonas, otras proteínas de
unión a DNA pueden ayudar a empacar el DNA en las células bacterianas.

El enrrollamiento del DNA en el nucleosoma (unas 1.65 vueltas alrededor del
octámero de histona) genera superenrrollamientos negativos. En otras palabras, el
DNA está un tanto subenrrollado en los nucleosomas; éste es el motivo por el cual
las eucariotas no necesitan DNA girasa para introducir superespiras negativas en su
DNA. Durante la replicación del DNA, los nucleosomas se desensamblan conforme
el DNA pasa por la maquinaria de replicación. Un complejo proteínico llamado
factor de ensamblaje y acoplamiento a la replicación ayuda a reensamblar los nucleo-
somas en el DNA recién replicado, usando las histonas desplazadas así como otras
recién sintetizadas que se importan desde el citoplasma hasta el núcleo.

Los nucleosomas compactan el DNA sólo en un factor aproximado de 30 a 40,
pero la cadena de nucleosomas se arrolla en un solenoide (bobina) con diámetro de
unos 30 nm (figura 20-30). Se supone que el DNA en la fibra de 30 nm está bien
protegido del ataque de la nucleasa y es inaccesible a las proteínas que realizan la
replicación y transcripción. Inmediatamente antes de la división celular, la cro-
matina se condensa aún más, de modo que cada cromosoma tenga una longitud
promedio de alrededor de 10 μm y diámetro de 1 μm (con fines de comparación,
la hélice de DNA desnuda tiene diámetro aproximado de 20 Å, o 2 nm).

Las histonas sufren modificación covalente Figura 20-31. Interacción de
histonas. Cada histona contiene un
Las histonas se encuentran entre las proteínas más conservadas que se conocen, lo motivo estructural consistente en una
cual concuerda con su función esencial de empacar el material genético en todas larga hélice central flanqueada por dos
las células eucarióticas. Cada histona se parea con otra como en un apretón de hélices más cortas. Las hélices largas de
manos (figura 20-31), y el juego de ocho forma una estructura compacta. Sin em- dos histonas (en verde y amarillo) se
bargo, las colas de las histonas, que son flexibles y tienen carga, se extienden hacia superponen.
fuera desde el centro del nucleosoma (figura 20-29). Estas colas de histona están
sujetas a modificación covalente, incluidas acetilación de residuos Lys, fosforilación 20-5. Empaque del DNA | 547
de cadenas laterales Ser e His, y metilación de cadenas laterales Lys y Arg.

La adición o eliminación de los diversos grupos modificadores de histona tienen
el potencial de introducir considerable variación en la estructura fina de la cromati-
na, lo cual ofrece un mecanismo para promover o prevenir la expresión génica. Por
ejemplo, un residuo Lys de una histona tiene carga positiva y podría interactuar de
manera intensa con el esqueleto de DNA, con carga negativa. La acetilación de la
cadena lateral de Lys la neutralizaría, y debilitaría su interacción con el DNA, quizá
desestabilizando el nucleosoma o permitiendo a otras proteínas el acceso al DNA.
De hecho, la acetilación de histonas se asocia con cromatina transcripcionalmente
activa, y al parecer la desacetilación reprime la transcripción. La fosforilación de
histonas podría ser un preludio a la condensación de los cromosomas que ocurre
durante la división celular.

Algunas de las enzimas que modifican histonas actúan en muchos residuos en di-
ferentes proteínas histona; otras son muy específicas para un residuo en una histona.
Las modificaciones en sí mismas son interdependientes. Por ejemplo, en la histona
H3, la metilación de Lys inhibe la fosforilación de Ser 10, pero la fosforilación de Ser
10 promueve la acetilación de Lys 14. Se piensa que la correlación entre el patrón de
modificaciones de histonas y la aptitud del DNA para la transcripción actúa como un
código de histona que puede ser leído por diversas proteínas. Los cambios en los
contactos histona-histona e histona-DNA podrían modificar la estructura de los nu-
cleosomas además de proporcionar sitios de unión para proteínas como los factores
de transcripción (que se consideran con mayor detalle en la sección 21-1).

El DNA también experimenta modificación covalente

En muchos organismos, incluidos plantas y animales, las DNA metiltransferasas
agregan grupos metilo a residuos citosina:

NH2

N CH3

ON

Residuo 5-metilcitosina

El grupo metilo se proyecta en el surco principal del DNA y tiene el potencial de
modificar las interacciones con proteínas de unión a DNA.

En los mamíferos, las metiltransferasas atacan residuos adyacentes a residuos G, de
modo que alrededor de 80% de las secuencias CG (representadas de manera formal
como CpG) están metiladas. Las secuencias CpG tienen menor frecuencia de lo que
predice la estadística, pero a menudo se localizan agrupaciones de CpG (llamadas
islas de CpG) cerca de los puntos de partida de los genes. Resulta interesante el hecho
de que estas islas CpG suelen estar desmetiladas. Esto sugiere que la metilación puede
ser parte del mecanismo para marcar o “silenciar” DNA que no contiene genes.

Después de que el DNA se replica, las metiltransferasas pueden modificar la nue-
va cadena, usando como guía el patrón de metilación de la cadena de DNA original.
Las células también contienen enzimas que metilan DNA sin una plantilla así como
enzimas que desmetilan DNA.

Variaciones en la metilación del DNA pueden ser responsables de la impronta, en
la cual el nivel de expresión de un gen depende de su origen (el padre o madre).
Recuerde que un individuo recibe una copia de un gen de cada progenitor. Por lo
común ambas copias (alelos) se expresan, pero un gen metilado no suele expresarse.
El gen se comporta como si se hubiera “improntado” (como las aves que siguen a la
primera figura que ven luego de hacer eclosión y conociera su origen. La impronta
explica por qué algunos rasgos se transmiten de manera materna o paterna, en con-
tra de las leyes de la herencia mendeliana. Se dice que la metilación y otras modifi-
caciones del DNA (como la adición de telómeros) son epigenéticas (del griego epi,
“arriba”) porque representan información hereditaria que va más allá de la secuencia
de nucleótidos en el DNA.

548 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

REPASO DE CONCEPTOS
• ¿En qué difiere la heterocromatina de la eucromatina en estructura y función?
• ¿Cuál es la función de las histonas en el empaque del DNA?
• ¿Cómo podría la modificación covalente de las histonas o el DNA modificar la

expresión génica?

RESUMEN • Muchas DNA polimerasas contienen un segundo sitio ac-
tivo que escinde por hidrólisis un nucleótido discordante.
20-1. Superenrrollamiento del DNA
20-3. Telómeros
• Para poder replicarse, las dos cadenas de DNA deben sepa-
rarse, o desenrrollarse. Este desenrrollamiento es facilitado • En las eucariotas, el extremo 3´ de una cadena de DNA no
por el superenrrollamiento negativo (subenrrollamiento) de puede duplicarse, por lo cual la enzima telomerasa agrega
las moléculas de DNA. Enzimas llamadas topoisomerasas secuencias repetitivas al extremo 3´ para crear una estruc-
pueden agregar o eliminar superespiras introduciendo cor- tura conocida como telómero.
tes temporales en una o ambas cadenas de DNA.
20-4. Daño y reparación del DNA
20-2. Maquinaria de replicación del DNA
• Errores de replicación normales, desaminación espontánea,
• La replicación del DNA requiere muchas enzimas y otras radiación y daño químico pueden causar mutaciones en el
proteínas localizadas en una fábrica estacionaria. Las helicasas DNA.
separan las dos cadenas de DNA en una horquilla de replica-
ción, y la SSB se une a las cadenas individuales expuestas. • Entre los mecanismos para reparar DNA dañado se inclu-
yen reparación directa, de incompatibilidades, por escisión
• La DNA polimerasa sólo puede extender una cadena pre- de bases, por escisión de nucleótidos; unión de extremos y
existente, y por tanto requiere un RNA cebador sintetizado recombinación.
por una primasa. Dos polimerasas operan lado a lado para
duplicar el DNA, de modo que la cadena adelantada de 20-5. Empaque del DNA
DNA se sintetiza de manera continua mientras que la ca-
dena atrasada se sintetiza de manera discontinua como una • El DNA eucariótico está enrrollado alrededor de un centro
serie de fragmentos de Okazaki. Los RNA cebadores de los de ocho proteínas histona para formar un nucleosoma, el
fragmentos de Okazaki se retiran, los huecos son rellenados cual representa el primer nivel de compactación del DNA
por DNA polimerasa, y las mellas se sellan por acción de la en el núcleo.
DNA ligasa.
• Los componentes histona de los nucleosomas pueden mo-
• DNA polimerasa y otras polimerasas catalizan una reac- dificarse por acetilación, fosforilación y metilación como
ción en la cual el grupo OH 3´ de la cadena en crecimiento un mecanismo potencial para regular la expresión génica.
ejerce un ataque nucleofílico contra el grupo fosfato de un El DNA también puede modificarse de manera covalente,
nucleótido entrante, el cual parea su base con la cadena a menudo por metilación de residuos C en regiones “silen-
plantilla. Una pinza deslizante promueve la actividad pro- ciosas” del genoma.
cesiva de la DNA polimerasa.

GLOSARIO

Apoptosis Histona Recombinación
Cadena adelantada Horquilla de replicación Reparación de incompatibilidades
Cadena atrasada Impronta Reparación por escisión de bases
Carcinogénesis Isla de CpG Reparación por escisión de
Carcinógeno Lectura de pruebas
cDNA Mella nucleótidos
Cebador Modelo de fábrica para la Replicación
Código de histona Replicación semiconservativa
Constitutivo replicación Síntesis discontinua
Epigenética Mutación Sitio abásico
Eucromatina Mutación por transición Superenrrollamiento
Fragmento de Okazaki Mutación por transversión Telómero
Gen supresor tumoral Mutación puntual Topoisomerasa
Heterocromatina Mutágeno Transcriptasa inversa
Nucleosoma Traslación de mella
Procesividad Unión de extremos no homólogos

Resumen | 549

PROBLEMAS Es posible distinguir DNA superenrrollado, circular relajado
y lineal por sus diferentes velocidades de migración durante la
20-1. Superenrrollamiento del DNA electroforesis en gel de agarosa. En una serie de experimentos, el plás-
mido se incubó con DNasa y luego los productos se analizaron
1. Diversos compuestos inhiben las topoisomerasas. La novobio- por electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se muestran
cina es un antibiótico que, como la ciprofloxacina, inhibe la DNA enseguida. Describa los resultados correspondientes a cada
girasa. Doxorrubicina y etopósido son anticancerosos que inhiben carril. Compare las variantes seleccionadas con la DNasa de tipo
las topoisomerasas eucarióticas. ¿Qué propiedades distinguen los an- silvestre en cuanto a su capacidad de cortar o mellar el DNA. (T,
tibióticos de los anticancerosos? testigo; S, tipo silvestre.)

2. La desoxirribonucleasa (DNasa) mella de manera procesiva el DNA superenrrollado DNA lineal
esqueleto fosfodiéster del DNA de doble cadena para generar peque-
ños fragmentos de oligonucleótidos, y puede usarse de manera tera- Primer Segundo
péutica para tratar a pacientes con fibrosis quística (FQ). La enzima esqueleto esqueleto
se inhala hacia los pulmones, donde hidroliza el DNA contenido en mellado mellado
el esputo para reducir la viscosidad y mejorar el funcionamiento pul-
monar. Se han usado técnicas de ingeniería genética para sintetizar DNA circular relajado
variantes de DNasa hiperactivas que produzcan mellas en el DNA T S +3 +4 +6
con mayor rapidez que la enzima de tipo silvestre. Puede usarse una
DNasa más eficiente para lograr los mismos resultados a una menor Círculo relajado
concentración de enzima. Lineal
Superenrrollado
a) En el cuadro se indican las variantes de DNA hiperactiva
obtenidas por ingeniería genética. (Nota sobre nomenclatura:
Q9R significa que la Gln en la posición 9 en la DNasa I de tipo
silvestre se ha cambiado por Arg.) ¿Qué característica estructural
tienen en común todas las variantes de DNasa? ¿Por qué estos
cambios podrían mejorar la eficiencia catalítica de la DNasa?
b) Las actividades enzimáticas de las variantes de DNasa se
sometieron a prueba mediante un ensayo de hipercromicidad de
DNA en el cual la absorbancia de una solución de DNA intacto
se mide primero a 260 nm. Luego se agrega la enzima, y se vigila
la solución en busca de un aumento de la absorbancia cuando la
concentración de DNA monocatenario en la solución aumenta.
¿Por qué el ensayo de hipercromicidad es una herramienta útil
para evaluar la actividad de las variantes de DNasa?
c) Se empleó el ensayo de hipercromicidad de DNA para medir
los valores de KM y Vmáx de cada variante. Los resultados se mues-
tran en el cuadro. ¿De qué manera los cambios de aminoácidos
afectan la actividad de las variantes de la enzima en comparación
con el tipo silvestre? ¿Cuál o cuáles variantes son más eficientes?

Carga KM Vmáx

(respecto al (␮g/mL (unidades A260 • e) Las variantes se evaluaron en cuanto a su capacidad de actuar en el
Variante de DNasa tipo silvestre) DNA) min–1 • mg–1) DNA a alta y baja concentración de sustrato. Hay DNA de alto peso
molecular (PM) en las secreciones pulmonares de pacientes con FQ
Wild-type 1.0 1.0 en concentraciones bastante elevadas. La DNasa también podría ser
eficaz como agente terapéutico para tratar la enfermedad autoin-
N74K ϩ1 0.77 3.6 munitaria lupus eritematoso sistémico, en la cual hay DNA en el
suero en bajas concentraciones. ¿Cuál variante sería un buen fármaco
E13R/N74K ϩ2 0.20 5.3 candidato contra la FQ? ¿Contra el lupus? Explique.

E13R/N74K/T205 ϩ3 0.18 7.7

E13R/T14K/N74K/

T205K ϩ4 0.37 3.5

Q9R/E13R/H44K/ Actividad de mella (comparada con la del tipo silvestre)

N74K/T205K ϩ5 0.11 2.4

Q9R/E13R/T14K/ Baja concentración Alta concentración

H44R/N74K/T205K ϩ6 0.20 2.5 de DNA de DNA

d) Se evaluó la capacidad de las variantes de DNasa de cortar o Bajo PM Alto PM Bajo PM Alto PM
mellar DNA. Un corte se refiere a la hidrólisis de enlaces fosfo-
diéster en ambas cadenas, mientras que una mella es la hidrólisis Tipo silvestre 1 11 1
de una sola cadena. Esto se evaluó usando como sustrato un
plásmido circular, que es más estable en su forma superenrrolla- N74K 26 10.4
da. Si se mella una cadena, el plásmido forma un círculo relaja-
do, pero si se cortan los esqueletos de ambas cadenas, el círculo E13R/N74K 211 31 24.3 13
se linealiza, como se muestra en la figura.
E13R/N74K/

T205K 7 1.3

E13R/T14K/

N74K/T205K 7 0.7

550 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

20-2. Maquinaria de replicación del DNA 12. Las DNA polimerasas contienen dos iones Mg2+ en el si-
tio activo.
3. En la figura 20-1 se ilustra la replicación semiconservativa. Tra-
ce un diagrama que muestre la composición de las nuevas moléculas a) Describa el modo en que el Mg2+ podría fomentar el carácter
de DNA para la segunda, tercera y cuarta generaciones. nucleofílico del grupo OH 3´ que ataca el fosfato α de un nu-
cleótido entrante.
4. En bacterias, la replicación comienza en un solo sitio llamado b) El mecanismo de polimerización incluye la formación de un
origen. ¿Sería más probable que el origen fuera más abundante en fósforo pentacovalente. Dibuje esta estructura. ¿Cómo podría un
pares de bases G:C o A:T? ion Mg2+ contribuir a estabilizar el estado de transición durante
la polimerización del DNA?
5. Las DNA helicasas pueden considerarse motores moleculares
que convierten la energía química de la hidrólisis de NTP en la ener- 13. Una mezcla de reacción contiene DNA polimerasa purificada,
gía mecánica de separar cadenas de DNA. El genoma del bacteriófa- los cuatro dNTP y una de las moléculas de DNA cuyas estructuras
go T7 codifica una proteína que ensambla un anillo hexamérico con se representan. ¿Cuál mezcla de reacción produce PPi?
actividad de helicasa.
(a)
a) Para que la helicasa desenrrolle el DNA, requiere dos colas de
DNA monocatenario en un extremo de un segmento de DNA (b)
bicatenario. Sin embargo, parece ser que la helicasa sólo se une
a una de las cadenas sencillas, al parecer rodeándola. ¿Es esto (c)
consistente con su capacidad de desarrollar una doble hélice de
DNA? (d) 3Ј
b) Mediciones cinéticas indican que la helicasa T7 se desplaza a
lo largo del DNA a una velocidad de 132 bases por segundo. La 5Ј
proteína hidroliza 49 dTTP por segundo. ¿Cuál es la relación
entre hidrólisis de dTTP y desenrrollamiento de DNA? (e)
c) ¿Qué sugiere la estructura de la helicasa de T7 acerca de su
procesividad? (f )

6. En los orígenes de replicación eucarióticos, la helicasa no puede 14. La endonucleasa “de pestaña” reconoce la unión entre RNA y
activarse a menos que la polimerasa también se coloque en el DNA. DNA cerca del extremo 5´ de un fragmento de Okazaki. ¿Cuál o
Explique lo que ocurriría si la helicasa se activara en ausencia de la cuáles características de esta estructura podrían reconocer la enzima?
DNA polimerasa.
15. ¿Por qué no tendría sentido que la célula esperara hasta que
7. En el método de terminación de la cadena para secuenciar toda la molécula de DNA se hubiera replicado para combinar los
DNA (véase sección 3-4), el fragmento de Klenow de la DNA poli- fragmentos de Okazaki en una cadena atrasada continua?
merasa I (figura 20-10) se utiliza para sintetizar una cadena comple-
mentaria usando DNA monocatenario como plantilla. Junto con un 16. Explique cómo podrían utilizarse en el laboratorio DNasa (la
cebador y los cuatro sustratos dNTP, se agrega una pequeña canti- endonucleasa descrita en el problema 20-2 y que escinde el esquele-
dad de 2´,3´-didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP) a la mezcla de to de una cadena de una molécula de DNA), DNA polimerasa I de
reacción. Cuando el ddNTP se incorpora a la cadena nucleotídica E. coli (que incluye actividad de 5´ 3´ exonucleasa) y DNA ligasa
en crecimiento, la polimerización cesa. Explique. para incorporar nucleótidos radiactivos en una molécula de DNA.

Base 17. El mecanismo de la DNA ligasa de E. coli implica la transfe-
P P P OCH2 O rencia del grupo adenililo (AMP) de NAD+ al grupo ε-amino de la
cadena lateral de un grupo lisina esencial en la enzima. El grupo
HH adenililo se transfiere después al grupo fosfato 5´ de la mella. El
HH primer paso se muestra enseguida. Trace el mecanismo de la DNA
ligasa de E. coli.
HH
Enzima (CH2)4 NH2
Trifosfato de 2´,3´
-didesoxinucleósido (ddNTP) OO

8. Acaba de descubrir un fármaco que inhibe la actividad de la Nicotinamida Ribosa O P O P O Ribosa Adenina
enzima pirofosfatasa inorgánica. ¿Qué efecto tendría este fármaco en OϪ OϪ
la síntesis de DNA?
18. ¿Por qué las enzimas ligasa que usaran NAD+ como cofactor
9. Con base en su conocimiento de las proteínas de replicación, serían blancos farmacológicos atractivos para tratar enfermedades
compare la DNA polimerasa y la proteína de unión a una sola cade- causadas por bacterias?
na (SSB) con respecto a a) afinidad por DNA y b) concentración
celular. Problemas | 551

10. ¿Cuál DNA polimerasa eucariótica esperaría usted que tuviera
mayor procesividad, la polimerasa α o la polimerasa ε? Explique.

11. Describa las vías en las cuales una célula minimiza la incorpo-
ración de nucleótidos pareados incorrectamente durante la replica-
ción del DNA.

20-3. Telómeros H2N NH2

19. Las secuencias teloméricas ricas en G de los cromosomas eu- Nϩ BrϪ
carióticos terminan en una saliente monocatenaria que puede ple- CH2CH3
garse sobre sí misma para formar una estructura tetracatenaria. En
ésta, cuatro residuos guanina asumen una disposición planar unida
por enlaces de hidrógeno cuya geometría global puede representarse
como sigue:

Bromuro de etidio

H2N N NH2
Hϩ

Proflavina

(H3C)2N N N(CH3)2
Hϩ

Anaranjado de acridina

a) Ésta se llama cuarteto G, y puede intervenir como regulador 27. El compuesto 5-bromouracilo es un análogo de timina y pue-
negativo de la actividad de telomerasa. Trace la estructura com- de incorporarse en el DNA en lugar de timina. El 5-bromouracilo se
pleta de este cuarteto G, incluyendo los enlaces de hidrógeno convierte con facilidad en un tautómero enol, que puede experi-
entre las bases purínicas. mentar pareamiento de bases con guanina. (Los tautómeros se inter-
b) Muestre de manera esquemática el modo en que una cadena convierten de manera libre a través del movimiento de un hidrógeno
individual de cuatro secuencias TTAGGG repetitivas puede ple- entre un nitrógeno y un oxígeno adyacentes.) Trace la estructura del
garse para generar una estructura con tres cuartetos G apilados par de bases generado por la forma enol del 5-bromouracilo y gua-
unidos por asas TTA. nina. ¿Qué tipo de mutación puede inducir el 5-bromouracilo?

20. ¿Por qué un fármaco que indujera la formación del cuarteto O
G (problema 10-19) podría ser eficaz como agente antitumoral?
Br NH
21. Se realiza un experimento en el cual la plantilla de RNA
AAUCCC de la telomerasa muta (figura 20-16). ¿Habrá un cambio NO
en la secuencia telomérica como resultado de esta mutación? H

22. Explique por qué no debe causar sorpresa el observar seme- 5-Bromouracilo
janzas estructurales entre la proteína de replicación A (figura 20-7) y
POT1 (figura 20-17). 28. Se realizan experimentos con células en una campana de cul-
tivo de tejidos, la cual filtra el aire para minimizar la posibilidad de
20-4. Daño y reparación del DNA contaminar las células con bacterias aéreas. Cuando los experimen-
tos se han completado, las células se extraen de la campana, y se
23. En las células eucarióticas, una trifosfatasa específica escinde enciende una fuente de radiación UV hasta que la campana vuelve a
desoxi-8-guanosina trifosfato (oxo-dGTP) a oxo-dGMP + PPi. utilizarse. ¿Cuál es el fundamento de este prodecimiento?
¿Cuál es la ventaja de la reacción?
29. Como se expone en el texto, la desaminación de la citosina
24. Trace la estructura de un par de bases oxoguanina:adenina. produce uracilo. También es posible la desaminación de otras bases
(Nota: la base oxoguanina gira sobre el enlace glucosídico para for- del DNA. Por ejemplo, la desaminación de la adenina produce hi-
mar dos enlaces de hidrógeno con la adenina.) poxantina.

25. ¿Qué cambio ocasiona la metilación de un residuo guanina en a) Trace la estructura de la hipoxantina.
las generaciones siguientes de DNA? b) La hipoxantina puede experimentar pareamiento de bases con
la citosina. Trace la estructura de este par de bases.
26. Compuestos como bromuro de etidio, proflavina y anaranja- c) ¿Cuál es la consecuencia para el DNA si esta desaminación no
do de acridina pueden usarse para teñir bandas de DNA en un gel. se repara?
Estos compuestos se conocen como agentes intercaladores, e interac-
túan con el DNA deslizándose entre pares de bases apilados. Esta 30. La desaminación de la guanina produce xantina.
interacción con el DNA incrementa la fluorescencia del agente in- a) Trace la estructura de la xantina.
tercalador y permite visualizar las bandas de DNA en un gel bajo b) La xantina experimenta pareamiento de bases con la citosina.
radiación UV. Sin embargo, debe tenerse cuidado cuando se trabaje ¿Causaría esto una mutación? Explique.
con estos compuestos, porque son potentes mutágenos. Explique
por qué. 31. El hecho de que el DNA evolucionó hasta contener las bases
A, C, G y T lo hace una molécula fácil de reparar. Por ejemplo, la
desaminación de la adenina produce hipoxantina, la desaminación

552 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA

de la guanina produce xantina y la desaminación de la citosina pro- entre las dos bases. Trace la estructura de este par de bases. ¿Se
duce uracilo. ¿Por qué es fácil reparar estas desaminaciones? produce una mutación?
b) A valores de pH más bajos, la citosina se protona
32. Estudios con bacterias y otros organismos indican que las mu- (problema 33b). Trace la estructura del par de bases O6-
taciones son más frecuentes en determinadas posiciones. Estos “pun- metilguanina:citosina protonada (se forman tres enlaces de
tos calientes” se deben a la presencia de 5-metilcitosina (página hidrógeno entre las dos bases). ¿Se produce una mutación?
548), que puede experimentar desaminación oxidativa.
35. ¿Cuál es la lesión más común del DNA en individuos con
a) Trace la estructura de la 5-metilcitosina desaminada. xerodermia pigmentosa?
b) ¿Con qué otro nombre se conoce esa base?
c) ¿Qué tipo de mutación resulta de la desaminación de 5-metil- 36. Los dímeros de timina (página 540) pueden restaurarse a su
citosina? forma original mediante DNA fotoliasas que escinden el dímero.
d) ¿Por qué la célula es incapaz de reparar la base alterada? Las fotoliasas se llaman así porque se activan al absorber luz. ¿Por
qué es ésta una buena estrategia bioquímica?
33. El análogo de adenina llamado 2-aminopurina es un potente
mutágeno en las bacterias. La 2-aminopurina sustituye la adenina 37. Una cepa de células bacterianas mutantes carece de la enzima
durante la replicación y causa mutaciones porque se parea con cito- uracilo-DNA glucosilasa. ¿Cuál es la consecuencia para el organismo?
sina en lugar de timina. Los estudios estructurales revelan que existe
un equilibrio entre un par de bases “con bamboleo neutro” (porque 38. En muchos casos, una mutación puntual en el DNA carece de
es la estructura dominante a pH neutro) y una estructura “de Wat- efecto en la secuencia de aminoácidos codificada. Explique.
son y Crick protonada”, que se forma a pH más bajo.
39. Durante la replicación en E. coli, determinados tipos de daño
a) Se forman dos enlaces de hidrógeno entre la citosina y la del DNA, como los dímeros de timina, pueden ser eludidos por la
2-aminopurina en el par “con balanceo neutro”. Trace la estruc- DNA polimerasa V. Esta polimerasa tiende a incorporar residuos
tura de este par de bases. guanina opuestos a los residuos timina dañados y tienen mayor fre-
b) A pH más bajo, la citosina o la 2-aminopurina pueden proto- cuencia de errores que otras polimerasas. Los dímeros de timina
narse. Las dos formas protonadas están en equilibrio en la estruc- pueden ser eludidos por otras polimerasas, como la DNA polimera-
tura del par de bases “de Watson y Crick protonadas”; el protón sa III (que realiza la mayor parte de la replicación en E. coli). La
esencialmente “viaja” de una base a la otra en el par, y el enlace DNA polimerasa III incorpora residuos adenina opuestos a los resi-
de hidrógeno se mantiene. Trace las dos posibles estructuras del duos timina dañados, pero de manera más lenta que la DNA poli-
par de bases, una con una 2-aminopurina protonada y la otra merasa V. La polimerasa III es una enzima muy procesiva, mientras
con una citosina protonada. que la polimerasa V agrega sólo 6 a 8 nucleótidos antes de disociarse
del DNA. Explique el modo en que las DNA polimerasas III y V
H juntas realizan la replicación eficiente con errores mínimos del DNA
dañado por radiación UV.
NH N
N N 40. Las células eucarióticas contienen varias DNA polimerasas. Se
N H
N estudió la capacidad de algunas de estas enzimas de escindir nucleó-
NN
O tidos desde el extremo 3´ de una cadena de DNA (actividad de exo-

Citosina H nucleasa 3´ 5´). También se analizó la exactitud de la polimeriza-

2-Aminopurina ción del DNA, expresada como la frecuencia de sustitución de bases.

Los resultados se resumen en el cuadro.

H Actividad exonucleasa Frecuencia de

NH Polimerasa de 3´ 5´ sustitución de
bases (ϫ 10–5)
Nϩ H H ϩ N
N N
N ␣ No 16
O
H ␤ No 67
Citosina protonada NN
␦ Sí 1

H ⑀ Sí 1

2-Aminopurina protonada ␩ No 3500

34. Los agentes químicos metiladores pueden reaccionar con resi- a) ¿Existe correlación entre la presencia de actividad de exonu-
duos guanina en el DNA para producir O6-metilguanina, que causa cleasa 3´ 5´ y la frecuencia de errores (sustituciones de bases)
mutaciones porque se parea con timina. La estructura de la O6-metil- durante la polimerización del DNA?
b) Exprese la frecuencia de errores de cada polimerasa en térmi-
guanina se muestra en la página 540. Este tipo de daño químico es nos de la frecuencia con que se incorpora una base errónea.
difícil de reparar porque el par de bases O6-metilguanina:T es estruc- c) Los errores de polimerización pueden ser resultado de la
capacidad de insertar una base incorrecta (mal pareada) o de
turalmente similar a un par de bases G:C normal y el sistema de repa- la incapacidad de insertar de manera eficiente la base correcta
(correspondiente a la plantilla). Para determinar cuál mecanismo
ración de incompatibilidades tiene dificultades para reconocerlo. Las explica la alta frecuencia de errores de la polimerasa η, se midió
la eficiencia catalítica (kcat/KM) de la reacción de polimerización
mutaciones que resultan de este tipo de daño pueden generar oncoge- para bases correspondientes y no correspondientes. Los resulta-
nes. La O6-metilguanina puede formar un par de bases con “bamboleo dos se compararon con la eficiencia catalítica de otra polimerasa,
la transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana
neutro” con timina (similar al par de bases 2-aminopurina:C del pro- (HIV-RT). Los datos se resumen en el cuadro.

blema 33). La guanina metilada también puede formar un par de ba-

ses con citosina protonada a valores de pH más bajos.
a) A pH fisiológico, el par de bases con bamboleo neutro O6-
metilguanina:T predomina. Se forman dos enlaces de hidrógeno

Problemas | 553

Polimerasa Base Base kcat /K M 44. Las proteínas histonas H4 de la vaca y H4 del chícharo o
Polimerasa ␩ plantilla entrante (␮M и minϪ1 ϫ 103) guisante, que representan grupos que divergieron entre sí hace más
de mil millones de años, sólo difieren en dos residuos del total de
HIV RT T A 420 102. Los cambios son conservativos: Val 60 en la H4 del timo de
T G 22 becerro es sustituida por Ile en el chícharo; Lys 77 en la H4 del be-
T C cerro es reemplazada por Arg en el chícharo. Proponga una hipótesis
G C 1.6 que explique por qué la proteína histona H4 se ha conservado tanto
G G 760 en el transcurso de la evolución.

T A 8.7 45. La metilación del DNA requiere del donador de grupos meti-
T G lo S-adenosilmetionina, que se produce por la condensación de me-
800 tionina con ATP. El grupo metilo del ion sulfonio se emplea en re-
0.07 acciones de transferencia de grupos metilo.

Compare la eficiencia de la DNA polimerasa η y la HIV-RT CH3 ϩ H
para incorporar bases correctas e incorrectas. ¿Qué revelan estos CH2 C COOϪ
resultados acerca de la causa de los errores durante la polimeriza- S CH2
ción por la polimerasa η? CH2 NHϩ3
d) Se ha observado en bacterias la sobreexpresión de genes que co- Adenina
difican DNA polimerasas similares a la polimerasa η. ¿Qué efectos O
tendría esto en la frecuencia de mutación en estas bacterias?

20-5. Empaque del DNA

41. En el cuadro siguiente se muestran los porcentajes de residuos HH
arginina y lisina en las histonas del DNA de timo de becerro. ¿Por HH
qué las histonas tienen un mayor número de residuos Lys y Arg?
HO OH
% Arg % Lys
S-Adenosilmetionina

H1 1 29 a) La S-adenosilmetionina desmetilada se hidroliza para producir
H2A 9 11 adenosina y un aminoácido no estándar. Trace la estructura de
H2B 6 16 este aminoácido. ¿Cómo reconvierte la célula este compuesto en
H3 13 10 metionina para regenerar S-adenosilmetionina?
H4 14 11 b) La regulación correcta de la expresión génica requiere me-
tilación y desmetilación de los residuos citosina en el DNA. Si
42. ¿Por qué el NaCl 0.5 M es eficaz para disociar histonas del una desmetilasa realiza una reacción hidrolítica para restablecer
DNA en una muestra de cromatina? residuos citosina, ¿cuál es el otro producto de reacción?

43. Trace las estructuras de las cadenas laterales que corresponden 46. Los ratones homocigóticos para una mutación que desactiva
a las siguientes modificaciones de histonas: a) acetilación de Lys, b) la enzima DNA metiltransferasa suelen morir in utero. ¿Por qué esta
fosforilación de Ser, c) fosforilación de His, d) metilación de Lys, y mutación tiene consecuencias tan graves?
e) metilación de Arg. ¿De qué manera estas modificaciones cambian
el carácter de sus respectivas cadenas laterales de aminoácido?

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

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554 | CAPÍTULO 20 Duplicación y Reparación del DNA