OOBioquimica.Pratt

Algunas proteasas bacterianas con una Ser esencial para la activi- CUADRO 6-3 | Porcentaje de identidad
dad catalítica se relacionan estructuralmente con las serinproteasas de secuencia entre tres
digestivas de los mamíferos. Sin embargo, la serinproteasa bacteriana serinproteasas
subtilisina (figura 6-16) no guarda semejanza de secuencia con la qui-

motripsina ni semejanza estructural general, pese a que tiene la misma Tripsina bovina 100%

tríada catalítica Asp–His–Ser y un agujero oxianiónico en su sitio Quimotripsinógeno bovino 53%

activo. La subtilisia es un ejemplo de evolución convergente, un Elastasa porcina 48%

fenómeno por el cual proteínas no emparentadas desarrollan caracte-

rísticas similares en el transcurso de la evolución.

Hasta cinco grupos de serinproteasas, cada uno con diferente conformación ge-

neral del esqueleto, han experimentado evolución convergente para llegar a los mis-

mos grupos catalíticos con Asp, His y Ser. En algunas otras hidrolasas, el sustrato es

atacado por un residuo nucleofílico Ser o Thr que se localiza en una tríada catalítica

como His–His–Ser o Asp–Lys–Thr. Parecería que la selección natural favorece esta

clase de disposición de los residuos catalíticos.

Enzimas con mecanismos similares exhiben diferente Figura 6-16. Estructura de la
subtilisina de Bacillus
especificidad de sustrato amyoliquefaciens. Los residuos de la
tríada catalítica se destacan en rojo.
A pesar de las semejanzas en sus mecanismos catalíticos, quimotripsina, tripsina y Compárese la estructura de esta enzima
elastasa difieren mucho entre sí en su especificidad de sustrato. La quimotripsina con la propia de las tres serinproteasas
escinde de manera preferente enlaces peptídicos situados después de residuos hidró- mostradas en la figura 6-15. (Estructura [pdb
fobos grandes. La tripsina prefiere los residuos básicos Arg y Lys, y la elastasa rompe
los enlaces peptídicos que siguen a residuos hidrófobos pequeños como Ala, Gly y 1CSE] determinada por W. Bode).
Val (estos residuos predominan en la elastina, una proteína animal responsable de la
elasticidad de algunos tejidos). Las especificidades variadas de estas enzimas se deben Figura 6-17. Bolsillos de
en gran medida al carácter químico del llamado bolsillo de especificidad, un agu- especificidad de tres serinproteasas.
jero en la superficie de la enzima en el sitio activo, que da cabida al residuo en el lado Se muestran las cadenas laterales de los
N terminal del enlace peptídico escindible (figura 6-17). En la quimotripsina, el residuos clave que determinan el
bolsillo de especificidad tiene unos 10 Å de profundidad y 5 Å de ancho, lo cual tamaño y la naturaleza del bolsillo de
ofrece un ajuste apretado para un anillo aromático (cuyas dimensiones son de 6 ϫ especificidad junto con un sustrato
3.5 Å). El bolsillo de especificidad de la tripsina tiene dimensiones similares pero representativo para cada enzima. La
posee un residuo Asp en vez de Ser en el fondo. En consecuencia, el bolsillo de espe- quimotripsina prefiere cadenas laterales
cificidad de la tripsina se une a la cadena lateral de Arg o Lys, con diámetro aproxi- hidrófobas grandes; la tripsina prefiere
mado de 4 Å y un grupo catiónico en el extremo. En la elastasa, el bolsillo de Lys o Arg; y la elastasa prefiere Ala, Gly
especificidad es sólo una pequeña depresión debido al reemplazo de dos residuos Gly o Val. Por conveniencia, los residuos de
en las paredes del bolsillo de especificidad (residuos 216 y 226 en la quimotripsina) las tres enzimas se enumeran para
por Val y Thr, más voluminosas. De este modo, la elastasa se une de preferencia a hacerlos coincidir con la secuencia de
cadenas laterales no polares pequeñas. Aunque estas mismas cadenas laterales po- residuos en la quimotripsina.
drían entrar con facilidad en los bolsillos de especificidad de quimotripsina y trip-
sina, no ajustan lo suficientemente bien para inmovilizar el sustrato en el sitio activo,
como se requiere para una catálisis eficiente. Otras serinproteasas, como las que
participan en la coagulación sanguínea, exhiben minuciosa especificidad de sustrato,
de conformidad con sus funciones fisiológicas en extremo especializadas.

Enlace
escindible

Lys Ala
Phe

Gly 2162 Gly 216 Thr 216110
Gly 226 Val 226
Gly 226 +
−

Ser 189 Asp 189

Quimotripsina Tripsina Elastasa

6-4 Otras características de las enzimas | 171

La quimotripsina es activada por proteólisis

Las proteasas relativamente inespecíficas podrían causar daño considerable a las cé-
lulas en que se sintetizan si su actividad no fuera controlada de manera meticulosa.
En muchos organismos, la actividad de las proteasas es limitada por la acción de
inhibidores de proteasa (algunos de los cuales se consideran con mayor detalle más
adelante) y mediante la síntesis de las proteasas como precursores inactivos (llama-
dos zimógenos) que son activados más tarde cuando y donde se requiere.

El precursor inactivo de la quimotripsina se llama quimotripsinógeno, y es sinteti-
zado por el páncreas junto con los zimógenos tripsina (tripsinógeno), elastasa (proelas-
tasa) y otras enzimas hidrolíticas. Todos los zimógenos son activados por proteólisis
después de que se secretan en el intestino delgado. Una proteasa intestinal conocida
como enteropeptidasa activa el tripsinógeno catalizando la hidrólisis de su enlace Lys
6–Ile 7. La endopeptidasa cataliza una reacción altamente específica; al parecer reco-
noce una cadena de residuos Asp cerca del extremo N terminal de su sustrato:

ϩ

H3N Val Asp Asp Asp Asp Lys Ile

H2O Enteropeptidasa

ϩ Val Asp Asp Asp Asp Lys COOϪ ϩ ϩ Ile

H3N H3N

La tripsina, ahora activa, escinde el péptido N terminal de los otros zimógenos pan-
creáticos, incluido el tripsinógeno. La activación del tripsinógeno por tripsina es un
ejemplo de autoactivación.

El enlace Arg 15–Ile 16 del quimotripsinógeno es susceptible de hidrólisis catali-
zada por tripsina. La ruptura de este enlace genera una especie de quimotripsina acti-
va (llamada π-quimotripsina), que entonces experimenta dos pasos de autoactivación
para generar quimotripsina con actividad plena (también llamada α-quimotripsina;
figura 6-18). Un proceso similar, en el cual los zimógenos son activados en secuencia
mediante proteólisis, ocurre durante la coagulación sanguínea (recuadro 6-B).

1 245 Quimotripsinógeno
(inactivo)

Tripsina

1 15 16 245 π quimotripsina
Arg Ile (activa)
14 15
Ser Arg Quimotripsina 245 δ Quimotripsina
(activa)
1 13 16 Quimotripsina
Leu Ile 146 149 245 α quimotripsina
Tyr Ala (activa)
147 148
Thr Asn

1 13 16
Leu Ile

Figura 6-18. Activación del quimotripsinógeno. La tripsina activa
el quimotripsinógeno al catalizar la hidrólisis del enlace Arg 15–Ile 16 del cimógeno.
La quimotripsina activa resultante escinde entonces el dipéptido Ser 14–Arg 15 (al
romper el enlace Leu 13–Ser 14) y el dipéptido Thr 147–Asn 148 (al romper los
enlaces Tyr 146–Thr 147 y Asn 148–Ala 149). Las tres especies de quimotripsina (π, δ
y α tienen actividad proteolítica.

172 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

RECUADRO 6-B NOTAS CLÍNICAS

La coagulación sanguínea requiere
una cascada de proteasas

Cuando un vaso sanguíneo se lesiona por efecto de una fuerza La conversión de fibrinógeno en fibrina es el paso final de la
mecánica, una infección o algún otro proceso patológico, es posible coagulación, una serie de reacciones proteolíticas en que intervienen
que escapen glóbulos rojos y blancos y el plasma (líquido) que los varias proteínas y factores adicionales de las plaquetas y tejido dañado.
rodea. Excepto en los traumatismos más graves, la pérdida de La enzima responsable de escindir el fibrinógeno a fibrina se conoce
sangre (hemorragia) puede detenerse a través de la formación de un como trombina. Es similar a la tripsina en su secuencia (38% de sus
coágulo en el sitio lesionado. El coágulo consiste en plaquetas residuos son idénticos) y en su estructura y mecanismo catalítico.
agregadas (las plaquetas son diminutas células sin núcleo que se
adhieren con rapidez a la pared del vaso dañado y entre sí) y una
malla de la proteína fibrina, que refuerza el tapón de plaquetas y
captura partículas más grandes, como eritrocitos.

(P. Motta/Dept. of Anatomy, University La Sapienza, Roma/Science (Estructura de la trombina (pdb 1PPB) determinada
Photo Library/Photo Researchers.) por W. Bode).

Los polímeros de fibrina pueden formarse con rapidez porque Compárese la estructura de la trombina que se muestra aquí
se generan en el sitio de lesión a partir de la proteína soluble con la de la quimotripsina (figura 6-1). Los residuos catalíticos de
fibrinógeno, que circula en el plasma sanguíneo. El fibrinógeno es la trombina (Asp, His y Ser) se resaltan en rojo.
una molécula alargada con masa molecular de 340 000 y consta de
tres pares de cadenas polipeptídicas. La eliminación proteolítica de Como la tripsina, la trombina rompe enlaces peptídicos que
péptidos cortos (14 o 16 residuos) desde los extremos N terminales siguen a residuos Arg, pero es altamente específica para los dos sitios
de 4 de las 6 cadenas hace que la proteína se polimerice extremo de ruptura en la secuencia del fibrinógeno. La trombina, como el
con extremo y lado a lado para producir una fibra gruesa. fibrinógeno, circula en la forma de un precursor inactivo. Su
zimógeno, llamado protrombina, contiene un dominio serinproteasa
Fibrinógeno junto con otros motivos estructurales. Estos elementos interactúan
con otros factores de la coagulación para ayudar a asegurar que la
Trombina trombina –y por tanto la fibrina– se produzca sólo cuando se necesita.

Monómero de fibrina Una serinproteasa conocida como factor Xa cataliza la hidrólisis
específica de protrombina para generar trombina. El factor Xa
Polímero de fibrina (donde a significa activo) es la forma proteasa del zimógeno factor
X. Para iniciar la coagulación, el factor X es activado por una
proteasa conocida como factor VIIa, que trabaja en conjunto con
una proteína accesoria llamada factor tisular, que se expone cuando
se rompe un vaso sanguíneo. Durante las últimas fases de la
coagulación, el factor Xa se genera por la actividad del factor IXa,
que a su vez se genera a partir de su zimógeno por la actividad del
factor XIa o VIIa-factor tisular. El factor XIa se produce por la
proteólisis de su zimógeno mediante cantidades vestigiales de
trombina producidas antes en el proceso de coagulación. La

6-4 Otras características de las enzimas | 173

NOTAS CLÍNICAS Continúa

cascada de reacciones de activación se ilustra enseguida. Muchas de Un proceso complejo como la coagulación está regulado en
estas reacciones enzimáticas requieren de factores accesorios que no varios puntos, incluidas la activación y la inhibición de las diversas
se muestran en este diagrama simplificado. proteasas. Los inhibidores de proteasa representan alrededor de
10% de la proteína que circula en el plasma. Un inhibidor,
Trombina conocido como antitrombina, bloquea las actividades proteolíticas
de factor IXa, Xa y trombina, con lo que limita la magnitud y
XI duración de la formación del coágulo. Los residuos 377 a 400 de la
antitrombina, con 432 residuos, forman un asa (amarilla en la
XIa figura siguiente) que se extiende desde el resto de la proteína, y un
o VIIa-factor tisular residuo Arg (en rojo) en la posición 393 sirve como “señuelo” para
las proteasas de la coagulación específicas para Arg. La proteasa
IX reconoce el inhibidor como un sustrato, pero es incapaz de
completar la reacción de hidrólisis. Proteasa e inhibidor forman un
IXa intermediario acilo-enzima estable que es eliminado de la circula-
o VIIa-factor tisular ción en unos pocos minutos.

X*

Xa

Protrombina

Trombina

Fibrinógeno

Fibrina

Cascada de la coagulación. El paso desencadenante se indica con
un asterisco.

Debe hacerse notar que las proteasas de la coagulación se nombran (Estructura de la antitrombina (pdb 2ANT) determinada por R.
según el orden en que se descubrieron, no por el orden en que Skinner, J.P. Abrahams, J.C. Whisstock, A.M. Lesk, R.W. Carrell y
actúan (la trombina también se conoce como factor II). Al parecer, M.R. Wardell).
todas las proteasas de la coagulación surgieron de una enzima tipo
tripsina pero han adquirido especificidad de sustrato estrecha y en La heparina, un polisacárido sulfatado (véase sección 11-3)
consecuencia un intervalo reducido de actividades fisiológicas. purificado por primera vez del hígado, incrementa la actividad de
la antitrombina por dos mecanismos: un segmento corto (5
Las reacciones de la coagulación tienen un efecto amplificador, residuos monosacárido) actúa como activador alostérico de la
porque cada proteasa es un catalizador para la activación de otro antitrombina; y un polímero de heparina más largo (que contiene
catalizador. Así, una cantidad muy pequeña de factor IXa puede al menos 18 residuos) puede unirse de manera simultánea a
activar una cantidad más grande de factor Xa, que entonces puede antitrombina y su proteasa objetivo, de modo que su colocalización
activar una cantidad aún mayor de trombina. Este efecto de aumenta de manera impresionante la velocidad de su reacción. La
amplificación se refleja en las concentraciones plasmáticas de los heparina natural o una versión sintética de ella se usan en clínica
factores de la coagulación. como anticoagulante después de cirugía.

Concentraciones plasmáticas de algunos factores Los defectos en muchas de las proteínas implicadas en la
de la coagulación humana coagulación sanguínea o su regulación se han vinculado con
trastornos hemorrágicos (o de la coagulación). Por ejemplo, una
Factor Concentración (μM)a forma de hemofilia, que es una tendencia a sangrar después de
XI 0.06 traumatismos menores, se debe a una deficiencia genética del factor
IX 0.09 IX. La carencia de antitrombina da por resultado un mayor riesgo
VII 0.01 de formación de coágulos en las venas. Si se desprenden, los
X 0.18 coágulos pueden terminar bloqueando una arteria en los pulmones
o el encéfalo, con consecuencias funestas.
Protrombina 1.39

Fibrinógeno 8.82

a Concentraciones calculadas a partir de datos de High, K.A., y Roberts, H.R., eds.,
Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, Marcel Dekker (1995).

174 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

NOTAS CLÍNICAS Continuación

PREGUNTAS 4. Después de traumatismo grave, cirugía o infección, un paciente
puede presentar coagulación intravascular diseminada (CID), en
1. Los hemofílicos con deficiencia de factor IX pueden tratarse con la cual se forman numerosos coágulos pequeños en todo el
inyecciones de factor IX puro. En ocasiones, un paciente aparato circulatorio. Explique por qué los pacientes con CID
produce anticuerpos contra este material, que se torna ineficaz. presentan después sangrado excesivo (hemorragia).
En dichos casos, el paciente puede recibir factor VII. Explique
por qué las inyecciones de factor VII serían un tratamiento útil 5. En una trombina variante, una mutación puntual produce una
para una deficiencia de factor IX. proteasa con actividad normal hacia el fibrinógeno, pero
actividad reducida hacia la antitrombina. ¿Incrementará este
2. Un defecto genético en el factor IX causa hemofilia, una defecto genético el riesgo de hemorragia o de coagulación?
enfermedad grave. Sin embargo, un defecto genético en el factor
XI a menudo no provoca signos y síntomas clínicos. Explique 6. ¿Por qué no es posible administrar la heparina por vía oral?
esta discrepancia en términos del mecanismo en cascada para la 7. Los investigadores han desarrollado fármacos basados en la
activación de proteasas de la coagulación.
hirudina, un inhibidor de la trombosis derivado de la sanguijue-
3. De todas las proteasas incluidas en el diagrama en cascada de la la Hirudo medicinalis. ¿Por qué la sanguijuela podría ser una
coagulación, ¿cuál es la más antigua en términos evolutivos? buena fuente de anticoagulante?

Los dos dipéptidos que se escinden durante la activación del quimotripsinógeno
son llevados muy lejos del sitio activo (figura 6-19). ¿De qué manera este alejamien-
to fomenta la actividad catalítica? Una comparación de las estructuras cristalográfi-
cas de quimotripsina y quimotripsinógeno revela que las conformaciones de sus
residuos Asp, His y Ser del sitio activo son virtualmente idénticas (de hecho, el zi-
mógeno cataliza la hidrólisis con extrema lentitud). Sin embargo, el bolsillo de espe-
cificidad de sustrato y el agujero oxianiónico aún no están formados por completo
en el zimógeno. La proteólisis del zimógeno induce pequeños cambios conformacio-
nales que abren el bolsillo de especificidad de sustrato y el agujero oxianiónico. Así,
la enzima adquiere su actividad máxima sólo cuando puede unirse de modo eficien-
te a sus sustratos y estabilizar el estado de transición.

Los inhibidores de proteasa limitan la actividad Figura 6-19. Ubicación del dipéptido
de proteasa
que se elimina durante la activación
El páncreas, además de sintetizar los zimógenos de las proteasas digestivas, sintetiza del quimotripsinógeno. El dipéptido
pequeñas proteínas que actúan como inhibidores de proteasa. El hígado también Ser 14–Arg 15 (abajo a la derecha,
produce una variedad de proteínas inhibidoras de proteasa que circulan en el to- verde) y el dipéptido Thr 147–Asn 148
rrente sanguíneo. Si las enzimas pancreáticas se activaran de manera prematura o (derecha, azul) se localizan a alguna
escaparan del páncreas por algún traumatismo, serían desactivadas con rapidez por distancia de los residuos del sitio activo
inhibidores de proteasa. Los inhibidores actúan como sustratos de proteasa, pero no (rojo) en el quimotripsinógeno.
son hidrolizados por completo. Por ejemplo, cuando la tripsina ataca un residuo Lys
del inhibidor de tripsina pancreática bovina, la reacción se detiene durante la forma- (Estructura de la quimotripsina [pdb 2CGA]
ción del intermediario tetraédrico. El inhibidor permanece en el sitio activo, impi-
diendo cualquier actividad catalítica ulterior (figura 6-20). El complejo no covalente determinada por D. Wang, W. Bode y R. Huber).

Figura 6-20. Complejo de tripsina e
inhibidor de tripsina pancreática
bovino. Ser 195 de la tripsina (dorado)
ataca el enlace peptídico de Lys 15
(verde) en el inhibidor, pero la reacción
se detiene en el camino hacia la etapa de
intermediario tetraédrico. (Estructura (odb

2PTC) determinada por R. Huber y J.
Deisenhofer).

6-4 Otras características de las enzimas | 175

entre tripsina e inhibidor de tripsina pancreática bovina es una de las interacciones
proteína-proteína más fuertes conocidas, con constante de disociación de 10–14 M.
Un desequilibrio entre las actividades de proteasas y las de inhibidores de proteasa
podría contribuir a enfermedades (recuadro 6-B).

REPASO DE CONCEPTOS
• ¿En qué son similares quimotripsina, tripsina y elastasa?
• ¿Cuál es la base química de su diferente especificidad de sustrato?
• ¿Cómo se activa la quimotripsina y por qué es necesario ese paso?
• ¿Por qué son necesarios los inhibidores de proteasa?

RESUMEN • En la quimotripsina, una tríada Asp-His-Ser cataliza la
hidrólisis de enlaces peptídicos a través de catálisis ácido-
6-1. ¿Qué es una enzima? base y covalente, estabilizando el estado de transición me-
diante el agujero oxianiónico y los enlaces de hidrógeno
• Las enzimas aceleran reacciones químicas con alta especifici- de barrera baja.
dad en condiciones suaves.
6-3. Propiedades únicas de los catalizadores
6-2. Química catalítica enzimáticos

• Un diagrama de coordenada de reacción ilustra el cambio • Además de estabilizar el estado de transición, las enzimas
de energía libre entre los reactivos y productos así como la utilizan los efectos de proximidad y orientación, el ajuste
energía de activación necesaria para alcanzar el estado de inducido y catálisis electrostática para facilitar las reacciones.
transición. A mayor energía de activación, menos molécu-
las de reactivo podrán alcanzar el estado de transición y la 6-4. Otras características de las enzimas
reacción será más lenta .
• Las serinproteasas que surgieron de un ancestro común
• Una enzima proporciona una vía desde los reactivos (sus- comparten su estructura global y su mecanismo catalítico,
tratos) hasta los productos, la cual tiene menor energía de pero difieren en su especificidad de sustrato.
activación que la reacción no catalizada. Las enzimas, a ve-
ces con la ayuda de un cofactor, utilizan mecanismos de ca- • Las actividades de algunas proteasas son limitadas por su
tálisis química como catálisis ácido-base, catálisis covalente síntesis en la forma de zimógenos que son activados más
o catálisis pos ion metálico. tarde y por su interacción con inhibidores de proteasa.

GLOSARIO coenzima hidrólisis
cofactor imina
agujero oxianiónico coordenada de reacción inhibidor de proteasa
ajuste inducido ΔG‡ isoenzimas
autoactivación ΔGreacción marcado químico
base de Schiff efectos de proximidad y modelo de cerradura y llave
bolsillo de especificidad nucleófilo
carbanión orientación reactivo
catálisis ácida electrófilo ribozima
catálisis acidobásicaácido-base enlace de hidrógeno de barrera serinproteasa
catálisis básica sitio activo
catálisis covalente baja sustrato
catálisis electrostática enlace escindible tautómero
catálisis por ion metálico enzima tríada catalítica
catalizador especificidad de reacción
zimógeno estado de transición
coagulación evolución convergente

176 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

PROBLEMAS COOϪ

6-1. ¿Qué es una enzima? H C H Succinato deshidrogenasa

1. ¿Por qué la mayoría de las enzimas son globulares y no fibrosas? HCH

2. Explique por qué las proteínas motoras miosina y cinesina (des- COOϪ
critas en la sección 5-3) son enzimas, y escriba la reacción que cada
una cataliza. Succinato

3. Compare el incremento de la velocidad de reacción inducido 8. La malato deshidrogenasa cataliza una reacción en la cual se
por adenosina desaminasa y triosa fosfato isomerasa (cuadro 6-1). oxida el C2 del malato. ¿A qué clase de enzimas pertenece la malato
deshidrogenasa?
4. ¿Cuál es la relación entre la velocidad de una reacción cataliza-
da por enzima y la velocidad de la reacción no catalizada correspon- CH2 COOϪ
diente? ¿Incrementan las enzimas las velocidades de reacciones no Malato deshidrogenasa
catalizadas lentas tanto como incrementan las velocidades de reac-
ciones no catalizadas rápidas? CH OH

5. En este capítulo se presentan las reacciones catalizadas por las COOϪ
enzimas que se enumeran a continuación. ¿A qué clase pertenece
cada enzima? Explique sus respuestas. Malato

a) Piruvato descarboxilasa. 9. Examine la reacción catalizada por hexocinasa en la página
b) Alanina aminotransferasa. 169. Escriba el producto de la reacción catalizada por creatina cina-
c) Deshidrogenasa alcohólica. sa, que actúa en la creatina de modo similar. ¿Cuál predeciría usted
d) Hexocinasa. que es la función habitual de una cinasa?
e) Quimotripsina
NH2
6. ¿A qué clase pertenecen las enzimas que catalizan las siguientes C NHϩ2
reacciones?
N CH3
(a) O CH2OH CH2COOϪ
CH CO
CH OH CH2 O Creatina
CH2 O PO32Ϫ
PO32Ϫ 10. Proponga un nombre para las enzimas que catalizan las si-
guientes reacciones (es posible que no estén balanceadas):

(a) CH2OPO32Ϫ CH2OPO23Ϫ
H O
(b) COOϪ COOϪ HH O
CH O C O PO32Ϫ HO H OH
CH2OH PO32Ϫ CH2 OH H O
OH H HO
H

(c) COOϪ COOϪ H OH H OH
CO HO C H
CH3 Glucosa 6-fosfato 6-fosfoglucono-d-lactona
CH3
(b) CH2 COOϪ CH2 COOϪ O
CH COOϪ ϩ
CH2 COOϪ H C COOϪ
(d) CH2OH HO CH COOϪ
O HPO42Ϫ Succinato Glioxilato
Isocitrato
HH

HO OH H O PO32Ϫ (c) O ATP O
C OPO32Ϫ ADP C OϪ
H OH CH2OH
O HC OH HC OH
CH2OPO23Ϫ CH2OPO32Ϫ
HH
1,3-bisfosfoglicerato 3-fosfoglicerato
OH H
HO OH

H OH (d) CH3 CH2 COOϪ

7. Escriba el producto oxidado de la reacción catalizada por succi- CO CO
nato deshidrogenasa. ¿A qué clase de enzimas pertenece la succinato COOϪ CO2 COOϪ
deshidrogenasa?
Piruvato Oxalacetato

6-4 Otras características de las enzimas | 177

11. Utilice la base de datos de nomenclatura enzimática de www. Cys y Ser Forma Posible Posible
expasy.org/enzyme/ para determinar cuál reacción es catalizada por Tyr enlaces donador en aceptor en
la enzima catalasa. covalentes enlaces de
Asp y Glu con grupos enlaces hidrógeno
12. ¿Cuál es el nombre común de la enzima cuyo número EC es His acilo hidrógeno
4.3.2.1? Lys y Arg
Cys y Ser
6-2. Química catalítica Tyr

13. Diga aproximadamente en cuánto la nucleasa estafilocócica
(cuadro 6-1) reduce la energía de activación (ΔG‡) de su reacción (la
hidrólisis de un enlace fosfodiéster).

14. La velocidad de una reacción catalizada por enzima se mide a
varias temperaturas, lo que genera la curva que se ilustra. Explique
por qué la actividad enzimática aumenta con la temperatura y luego
desciende de manera abrupta.

Actividad 20. Las ribozimas son moléculas de RNA que catalizan reacciones
enzimática químicas.

20 40 60 80 a) ¿Cuáles características de un ácido nucleico serían importantes
Temperatura (°C) para que éste actuara como enzima?
b) ¿Por qué el RNA, pero no el DNA, puede actuar como
15. Trace pares de diagramas de energía libre que muestren las catalizador?
diferencias entre las siguientes reacciones:
21. Utilice lo que sabe sobre el mecanismo de la quimotripsina
a) Reacción rápida y reacción lenta. para explicar por qué el DIPF desactiva la enzima.
b) Reacción en un paso y reacción en dos pasos.
c) Reacción endergónica y reacción exergónica. 22. Las soluciones de quimotripsina preparadas con fines experi-
mentales se almacenan en una solución diluida de ácido clorhídrico
16. En determinadas condiciones, la formación de enlaces peptí- como “conservador”. Explique.
dicos es favorable desde el punto de vista termodinámico que su hi-
drólisis. ¿Esperaría usted que la quimotripsina catalizara la forma- 23. El sarín es un compuesto organofosforado similar al DIPF. En
ción de enlaces peptídicos? 1995, un grupo terrorista liberó sarín en el metro de Japón. Se pro-
dujeron lesiones a consecuencia de la reacción del sarín con una se-
17. ¿Cuál es la relación entre la nucleofilicidad y la acidez de una rinesterasa implicada en la transmisión nerviosa llamada acetilcoli-
cadena lateral de aminoácido? nesterasa. Trace la estructura del residuo catalítico de la enzima
modificado por el sarín.
18. No se sabe qué aminoácidos como Gly, Ala y Val participen
de manera directa en catálisis ácido-base o covalente. H3C CH O O
H3C PF
a) Explique por qué. Sarín CH3
b) Aún así, la mutación (cambio) de un residuo Gly, Ala o Val
en el sitio activo de una enzima puede tener efectos notables en 24. Los grupos sulfhidrilo pueden reaccionar con el reactivo al-
la catálisis. ¿Por qué? quilante N-etilmaleimida (NEM). Cuando el NEM se agrega a una
solución de creatincinasa se alquila Cys 278, pero no se modifican
19. Utilizando lo que sabe sobre las estructuras de las cadenas la- otros residuos Cys de la proteína. ¿Puede usted inferir algo sobre la
terales de los aminoácidos y los mecanismos que se presentaron en función del residuo Cys 278 con base en esta información?
este capítulo, asigne funciones a las cadenas laterales de los siguien-
tes aminoácidos en los mecanismos enzimáticos que se indican. 25. A menudo, las enzimas con residuos Cys en sus sitios activos
pueden ser desactivadas por yodoacetato (ICH2COO–). Muestre la
Enlace Enlace Transferencia reacción química de la modificación de la cadena lateral de Cys por
catiónico aniónico de protones yodoacetato. ¿Por qué tal modificación desactivaría una enzima que
requiere la cadena lateral de Cys para su actividad?
Asp y Glu
His 26. La angiogenina, una enzima que participa en la formación de
vasos sanguíneos, se trató con bromoacetato (BrCH2COO–). Se
Lys y Arg modificó una histidina esencial, y la actividad de la enzima se redu-
jo en 95%. Muestre la reacción química para la modificación de la
cadena lateral de la histidina con bromoacetato. ¿Por qué tal modi-

178 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

ficación desactivaría una enzima que requiere la cadena lateral de Glu 35 Asp 52
His para su actividad? COOH O ϪOOC

27. En un estudio de marcado químico de una enzima, un reacti- Glu 35 HO Asp 52
vo que modifica de modo covalente residuos Lys también anula la COOϪ ϪOOC
actividad enzimática. ¿Por qué esta observación no demuestra que el
sitio activo incluye un residuo Lys? ϩ

28. El tratamiento de la enzima d-aminoácido oxidasa con a) Asigne los valores de pK dados a Glu 35 y Asp 52.
1-fluoro-2,4-dinitrofenol (FDNP, abajo) desactiva la enzima. El b) La lisozima es inactiva a pH 2.0 y 8.0. Explique.
análisis de la enzima derivatizada reveló que una de las tirosinas en la
enzima tenía actividad inusual. En un segundo experimento, cuan- 32. La RNAsa es una enzima digestiva secretada por el páncreas
do se agregó benzoato (un compuesto con estructura parecida a la en el intestino delgado, donde hidroliza el RNA en sus nucleótidos
del sustrato de la enzima) antes de la adición del FDNP, la tirosina componentes. El pH óptimo para la RNAsa es de alrededor de 6, y
no reaccionó. los valores de pK de las dos histidinas que sirven como residuos ca-
talíticos son de 5.4 y 6.4. Se muestra el primer paso del mecanismo.
a) Muestre la reacción química entre FNDP y el residuo tirosina.
b) ¿Por qué el benzoato impide la reacción? ¿Qué indica esto a) Asigne los valores de pK apropiados a His 12 y 119.
acerca de la función de la tirosina en esta enzima? b) Explique por qué el pH óptimo de la ribonucleasa es de 6.
c) La ribonucleasa cataliza la hidrólisis de RNA pero no de
F DNA. Explique por qué.

NO2

NO2

29. Trace un diagrama de las interacciones mediante enlaces de O
hidrógeno de la tríada catalítica His–Lys–Ser durante la catálisis en
una enzima hidrolítica hipotética. ϪO P O CH2 O Base CH2

30. La ribonucleasa de E. coli HI es una enzima que cataliza la O NH
hidrólisis de enlaces fosfodiéster en RNA. Su mecanismo propuesto HH
implica una “transmisión de carboxilato”. N
HH His 12
a) Utilizando como guía las estructuras que se muestran, trace
flechas que indiquen el modo en que podría iniciarse la reacción 3Ј 2Ј
de hidrólisis.

His 124 Asp 70 RNA Sustrato

O O O

HN CH C HN CH C OP O O OH

CH2 CH2 OϪ His 119 ϪO P O CH2 O Base
CH2

HN CO O HH
NO OO HH
HH HN
HH
H Nϩ

H O OH

b) Se determinaron los valores de pK de todas las histidinas de ϪO P O
la ribonucleasa HI, e incluyen valores de 7.1, 5.5 y <5.0. ¿Cuál
valor es más probable que corresponda a His 124? Explique. O
c) La sustitución de His 124 por un residuo alanina causó un
drástico decremento de la actividad enzimática. Explique. 33. La quimotripsina hidroliza el sustrato artificial p-nitrofenila-
cetato (página 157) por un mecanismo similar al de la hidrólisis de
31. La lisozima cataliza la hidrólisis de un polisacárido de las pa- enlaces peptídicos. El producto p-nitrofenolato es amarillo intenso y
redes celulares bacterianas. Las bacterias dañadas sufren lisis (desin- absorbe luz a 410 nm; por tanto la reacción puede vigilarse por es-
tegración) posterior. Se muestra parte del mecanismo de la lisozima. pectrofotometría. Cuando el p-nitrofenilacetato se mezcla con qui-
La enzima cataliza la ruptura de un enlace entre dos residuos azúcar motripsina, al principio se forma p-nitrofenolato de manera extre-
(representados por hexágonos). En la catálisis intervienen las cade- madamente rápida. Esto es seguido por una fase de estado estable en
nas laterales de Glu 35 y Asp 52. Uno de los residuos tiene pK de la cual el producto se forma a un ritmo uniforme.
4.5; el otro tiene pK de 5.9.

6-4 Otras características de las enzimas | 179

Absorbancia a 410 nm las cercanías y participa en la catálisis). Una cuarta posición de coor-
dinación está ocupada por una molécula de agua. Escriba el meca-
nismo de reacción (se muestra el primer paso) de la hidratación del
dióxido de carbono y muestre la regeneración de la enzima.

O

HN CH C

CH2 H Im Im
O Zn2ϩ
Tiempo HN Im
N H

a) Utilizando lo que sabe acerca del mecanismo de la quimotrip- 37. Los residuos Asn y Gln de las proteínas a veces son desamidados
sina, explique estos resultados. por hidrólisis no enzimática a Asp y Glu, en ese orden. Se ha sugerido
b) Trace un diagrama de la coordenada de reacción. que la desamidación podría actuar como un reloj molecular para el
c) ¿Sería útil el p-nitrofenilacetato para vigilar la actividad de la recambio proteínico, dado que la desamidación de algunas proteínas
tripsina in vitro? incrementa su susceptibilidad a la degradación por proteasas celulares.
Un estudio exhaustivo de proteínas que se sabe sufren desamidación
34. La proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana I (VIH ha revelado que los residuos Asn desamidados tienen mayor probabi-
I), el blanco del “coctel” de fármacos inhibidores de proteasa actual- lidad de ir precedidos por Ser, Thr o Lys y seguidos por Gly, Ser o Thr.
mente en el mercado, posee una díada catalítica de dos residuos aspar-
tato (un residuo en cada una de dos subunidades idénticas: Asp 25 y a) Escriba la ecuación química balanceada para la desamidación
Asp 25´). La proteasa tiene un mecanismo similar al de la quimotrip- hidrolítica de Asn a Asp.
sina, excepto que el intermediario tetraédrico no está unido de mane- b) En el mecanismo de desamidación de la cadena lateral de la
ra covalente a la enzima. Utilizando el diagrama que se dio como pun- amida interviene un catalizador ácido (HA). Se muestra el primer
to de partida, escriba un mecanismo para la proteasa del VIH I. paso de la reacción. Escriba el resto del mecanismo de reacción.

O H R2 O

C OϪ O C O HO C

Asp 25 H NHR1 Asp 25Ј CH2
CH2
35. Quimitripsina, tripsina y elastasa son miembros de una fami- CO HA
lia de enzimas llamadas serinproteasas. La enzima papaína (presente NH2
en la papaya) también es una proteasa pero es miembro de una fami-
lia de enzimas llamadas cisteinproteasas. Los aminoácidos del sitio c) Dado que se sabe que la desamidación de residuos Asn es no
activo de la papaína que resultan cruciales para la hidrólisis de enla- enzimática, el catalizador ácido HA no puede ser proporcionado
ces peptídicos son una histidina protonada y cisteína desprotonada. por una enzima. En cambio, se piensa que los grupos catalíti-
cos son aportados por aminoácidos vecinos en la proteína que
a) Utilizando lo que sabe sobre el mecanismo de la quimotrip- sufre la desamidación. Remítase a su respuesta de la parte b) y
sina, escriba un mecanismo de reacción para la hidrólisis de un examine el mecanismo que escribió. Describa el modo en que
enlace peptídico por la papaína. las cadenas laterales de aminoácidos que preceden o siguen al
b) Diga si el mecanismo que escribió emplea catálisis ácido-base, Asn lábil podrían servir como grupos catalíticos en el proceso de
covalente o ambas. desamidación.
c) Trace un diagrama de coordenada de reacción que sea consis- d) Los residuos Gln N terminales experimentan desamidación
tente con el mecanismo de la papaína. más rápido que los residuos Gln internos. Escriba un mecanismo
d) Los nativos de países tropicales que cocinaban carne envuelta para este proceso de desamidación, que incluya la formación de
en hojas de papayo notaron que la carne era más suave. Dé una un anillo pirrolidona de cinco miembros. Los residuos Asn N
explicación bioquímica para esta observación. terminales no experimentan desamidación. Explique por qué.
e) Los valores de pK para Cys e His del sitio activo de la papaína e) Se ha observado que los residuos Asn y Gln en el interior de
son de 4.2 y 8.2. El pH óptimo para la reacción es de 6.0. una proteína se desamidan a un ritmo menor que los residuos
Asigne los valores de pK a las cadenas laterales apropiadas de los Asn y Gln en la superficie de la proteína. Explique por qué.
aminoácidos y explique su razonamiento.
38. Enzimas de la familia de las amidasas catalizan la hidrólisis de
36. La enzima anhidrasa carbónica es una de las más rápidas co- enlaces amida empleando un mecanismo similar al de las serinpro-
nocidas. Cataliza la hidratación del dióxido de carbono para formar teasas. Sin embargo, la tríada catalítica contiene los residuos Ser–
bicarbonato y un ion hidrógeno: Ser–Lys en vez de la tríada Asp–His–Ser presente en las serinprotea-
sas. Se muestra la tríada Ser–Ser–Lys. Proponga un mecanismo para
CO2 ϩ H2O Hϩϩ HCO Ϫ la enzima amidasa.
3

El sitio activo de la enzima contiene un ion cinc que se coordina

con los anillos imidazol (que se abrevian “Im” en la figura) de

tres residuos histidina. (Un cuarto residuo histidina se localiza en

180 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

CH2 CH2 (CH2)4 O NO2
OϪ HO NHϩ3 CO

H N
R2 C N R1
NH
O
b) El compuesto descrito en la parte a) reacciona 24 veces más
6-3. Propiedades únicas de los catalizadores rápido que el imidazol. Explique por qué.
enzimáticos c) ¿Qué pueden indicar los resultados de este experimento acerca
del modo en que las enzimas elevan las velocidades de reacción?

39. Cuando los sustratos se unen a una enzima, es posible que su 6-4. Otras características de las enzimas
energía libre disminuya. ¿Por qué esta unión no pone en riesgo la
catálisis? 43. Varias mutaciones genéticas impiden la síntesis de una proteí-
na o dan origen a una enzima con menor actividad catalítica. ¿Es
40. Los sustratos y grupos reactivos en el sitio activo de una enzi- posible que una mutación incremente la actividad catalítica de una
ma deben alinearse de manera precisa a fin de que ocurra una reac- enzima?
ción productiva. Entonces, ¿por qué también se requiere alguna fle-
xibilidad conformacional para la catálisis? 44. Si el sitio activo de la quimotripsina excluye agua cuando su
sustrato se une, ¿cómo es posible que una molécula de agua participe
41. La enzima adenosina desaminasa cataliza la conversión de en la segunda etapa de la catálisis (como se muestra en la figura 6-10)?
adenosina en inosina. El compuesto ribonucleósido 1,6-dihidropu-
rina se une a la enzima con mucho mayor afinidad que el sustrato 45. El aminoácido Asp 189 se encuentra en la base del bolsillo de
adenosina. ¿Qué indica esto acerca del mecanismo de la adenosina especificidad de sustrato de la enzima tripsina.
desaminasa?
a) ¿Cómo se relaciona esto con la especificidad de sustrato de la
NH2 O tripsina? ¿Qué tipos de interacciones ocurren entre Asp 189 y
HN la cadena lateral de aminoácido en el lado carboxilo del enlace
N6 N Adenosina N escindible?
desaminasa b) En estudios de mutagénesis dirigida al sitio, Asp 189 se susti-
1 tuyó por lisina. ¿Cómo piensa que esto afectaría la especificidad
H2O NH3 de sustrato?
NN NN c) Los investigadores que realizaron el experimento descrito en la
Ribosa parte b) analizaron la estructura tridimensional de la enzima mu-
Ribosa tante y descubrieron que en realidad Lys 189 no se localiza en el
Inosina bolsillo de especificidad de sustrato. En cambio, la cadena lateral
Adenosina de Lys sale de la base del bolsillo, haciendo el bolsillo de especifi-
cidad no polar. Con esta información adicional, ¿cómo diferiría la
HH especificidad de sustrato en la enzima mutante con Lys 189?
HN N
46. Una enzima implicada en la regulación de la presión arterial se
NN purificó y caracterizó en fecha reciente. Se trata de una aspartilamino-
Ribosa peptidasa, que hidroliza enlaces peptídicos en el lado carboxilo de re-
siduos aspartato. Los investigadores que purificaron la enzima desea-
Nucleósido 1,6-dihidropurina ban aprender sobre el sitio de unión al sustrato, de modo que
sintetizaron una serie de péptidos artificiales y estudiaron la capacidad
42. El imidazol reacciona con p-nitrofenilacetato para producir de la enzima de hidrolizarlos. Los péptidos y sus velocidades de reac-
los iones N-acetilimidazolio y p-nitrofenolato. ción se presentan en el cuadro que sigue. Los residuos se nombran
P1–P1´–P2´–P3´, y el enlace hidrolizado se encuentra entre P1 y P1´.
O
a) Es probable que tanto el residuo P1´ como P2´ ajusten en
H3C C O NO2 “bolsillos” adyacentes de la enzima aspartilaminopeptidasa. Des-
criba las características de estos bolsillos en la enzima utilizando
N p -nitrofenilacetato los datos de cinética del cuadro.
b) Los autores han propuesto que el sustrato “natural” o endó-
N O geno para la aspartilaminopeptidasa es la angiotensina II, que
H participa en la regulación de la presión arterial. Sin embargo,
H3C C también mencionan que un potencial sustrato exógeno po-
Imidazol dría ser el edulcorante artificial aspartame, que es el dipéptido
metilado aspartilfenilalanina (Asp–Phe–OCH3). Con base en los
Nϩ ϩ ϪO NO resultados que se presentan, ¿considera que el aspartame sería un
buen sustrato para la enzima?
N-acetilimidazolio c) Trace la estructura del aspartame y los productos de su hidró-
lisis por aspartilaminopeptidasa.
N p -nitrofenolato
H

a) El compuesto que sigue reacciona para formar p-nitrofenolato.
Trace el mecanismo de reacción.

6-4 Otras características de las enzimasw | 181

d) En condiciones no desnaturalizantes, parece ser que la enzi- 48. Describa el modo en que la activación de la enzima digestiva
ma tiene el mismo tamaño que la proteína ferritina, con masa quimotripsina sigue un mecanismo en cascada. Trace un diagrama
molecular de 440 kD. En condiciones desnaturalizantes, la de su cascada.
enzima purificada se comporta como un solo polipéptido de 55
kD. ¿Qué puede concluir acerca de la estructura de la enzima a 49. Supóngase que es médico y atiende a un paciente que padece
partir de estos datos? de activación prematura del zimógeno pancreático, lo cual significa
que las enzimas pancreáticas se activan en el páncreas (y no en el
Péptido (P1–P1´–P2´–P3´) Velocidad con catálisis (s–1) intestino delgado) y en consecuencia resulta dañado el tejido pan-
creático. ¿Qué sería más eficaz, un inhibidor de quimotripsina, de
Asp–Ala–Ala–Leu 5.3 tripsina o de elastasa? Explique su respuesta.
Asp–Phe–Ala–Leu 9.9
Asp–Lys–Ala–Leu 2.8 50. Un inhibidor de tripsina se encuentra en el páncreas de los
Asp–Asp–Ala–Leu 9.8 mamíferos. ¿Cuál es el motivo de su presencia ahí?
Asp–Ala–Phe–Leu 17.2
Asp–Ala–Lys–Leu 5.0 51. Algunas plantas contienen compuestos que inhiben serinpro-
Asp–Ala–Asp–Leu 2.3 teasas. Se ha sugerido que estos compuestos protegen la planta contra
enzimas proteolíticas de insectos y microorganismos que la dañarían.
47. La quimotripsina suele describirse como una enzima que ca- El tofu, o queso de soya, presenta esos compuestos, que los fabrican-
taliza la hidrólisis de enlaces peptídicos que siguen a residuos Phe, tes tratan de eliminar. ¿Por qué es necesario este tratamiento?
Thr o Tyr. ¿Es esta información consistente con lo que se describe
para los enlaces que se escinden cuando se activa la quimotripsina 52. No todas las proteasas se sintetizan como zimógenos o tienen
(figura 6-18)? ¿Qué indica acerca de la especificidad de sustrato de la inhibidores que bloquean su actividad. ¿Qué limita el poder poten-
quimotripsina? cialmente destructivo de estas proteasas?

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Radisky ES, Lee JM, Lu C-JK, Koshland DE: Insights into
the serine protease mechanism from atomic resolution struc-
Fersht A: Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide tures of trypsin reaction intermediates, Proc. Nat. Acad. Sci.
to Enzyme Catalysis and Protein Folding, W.H. Freeman (1999). 2006;103:6835-6840.
[Incluye mecanismos de reacción detallados de la quimotripsina
y otras enzimas.] Ringe D, Petsko GA: How enzymes work, Science
2008;320:1428-1429. [Resume brevemente algunas caracterís-
Gutteridge A, Thornton JM: Understanding nature’s catalytic ticas generales del funcionamiento de las enzimas.]
toolkit, Trends Biochem. Sci. 2005;30:622-629. [Describe el
modo en que ciertos grupos de cadenas laterales de aminoácidos
forman unidades catalíticas que se encuentran en muchas enzi-
mas distintas.]

182 | CAPÍTULO 6 Cómo funcionan las enzimas

CINÉTICA E INHIBICIÓN capítulo
ENZIMÁTICAS
7

Uno de los compuestos farmacéuticos más vendidos es la
atorvastatina. Como otros fármacos, la atorvastatina inhibe
la actividad catalítica de una enzima, en este caso la HMG-CoA
reductasa, que cataliza un paso crítico en la biosíntesis de
colesterol. En consecuencia, la atorvastatina puede reducir la
concentración de colesterol circulante, y disminuir de este modo el
riesgo de enfermedad cardiovascular.

ESTE CAPÍTULO EN CONTEXTO

EEn el capítulo anterior se examinaron las características básicas de la actividad cata-
lítica de las enzimas, principalmente al explorar los diversos mecanismos empleados
por la quimotripsina. Este capítulo amplía el estudio de las enzimas al introducir la
cinética enzimática, el análisis matemático de la actividad enzimática. Veremos el
modo en que pueden cuantificarse la velocidad de reacción y especificidad de una
enzima, y cómo puede usarse esta información para evaluar la actividad fisiológica
de la enzima. También se analiza la regulación de la actividad enzimática por inhibi-
dores que se unen a la enzima y modifican su funcionamiento. Se aborda asimismo
la regulación alostérica, un mecanismo para inhibir y activar enzimas. La regulación
de la actividad enzimática es un tema que se tratará en varios los capítulos sobre
señalización biológica y reacciones metabólicas. ■

| 183

7-1. Introducción a la cinética enzimática

CONCEPTO CLAVE La estructura y mecanismo químico de una enzima (p. ej., quimotripsina, véase capí-

• La actividad de una enzima, tulo 6) a menudo revelan mucho sobre el modo en que una enzima funciona in vivo.
medida como la velocidad de Sin embargo, la información estructural por sí sola no explica de manera completa la
formación de los productos, varía función fisiológica de una enzima. Por ejemplo, tal vez se requiera conocer la rapidez
con la concentración de sustrato. exacta con que una enzima cataliza una reacción o cuán bien reconoce diferentes sus-

tratos o cómo es afectada su actividad por otras sustancias. Estas interrogantes no son

triviales; considérese que una célula individual contiene miles de enzimas distintas, las

cuales actúan al mismo tiempo y en presencia de los sustratos y

productos de las demás. Para describir de manera completa la

actividad enzimática, los enzimólogos aplican herramientas ma-

Gliceraldehído 3-Fosfato temáticas a fin de cuantificar el poder catalítico de una enzima y
(sustrato) su afinidad sustrato así como su respuesta a los inhibidores. Este
análisis es parte de un área de estudio conocida como cinética

Concentración (del griego kinetos, “movimiento”).
Mucho antes de que se purificaran las primeras enzimas, los

científicos examinaban las reacciones enzimáticas de prepara-

dos crudos de células de levadura y otros organismos. El análi-

Dihidroxiacetona fosfato sis matemático de estas enzimas impuras era posible porque los
(producto) investigadores podían medir las concentraciones de sustratos y

productos de la reacción y observar el modo en que esas canti-

dades cambiaban con el tiempo. Por ejemplo, considérese la

Tiempo reacción simple catalizada por triosa fosfato isomerasa, que in-

Figura 7-1. Avance de la reacción de terconvierte dos azúcares de tres carbonos (triosas):

la triosa fosfato isomerasa. Con el OH H
tiempo, la concentración del sustrato C H C OH
gliceraldehído 3-fosfato disminuye y la

concentración del producto H C OH Triosa fosfato isomerasa CO
dihidroacetona fosfato aumenta.

CH2OPO32Ϫ CH2OPO32Ϫ

Gliceraldehído 3-Fosfato Dihidroxiacetona fosfato

Durante el transcurso de la reacción, la concentración del sustrato gliceraldehído
3-fostato disminuye y la concentración del producto dihidroxiacetona fosfato
aumenta (figura 7-1). El avance de esta reacción o cualquier otra puede expresarse
como una velocidad (v), ya sea la velocidad de desaparición del sustrato (S) o la
velocidad de aparición del producto (P):

v ϭ Ϫ d [S] ϭ d [P]
dt dt

donde [S] y [P] representan las concentraciones del sustrato y producto, en ese or-

den. No debe causar sorpresa que a mayor cantidad de catalizador (enzima) pre-

sente, más rápida sea la reacción (figura 7-2).

Cuando la concentración de la enzima se mantiene constante, la velocidad de

Velocidad de reacción varía con la concentración de sustrato, pero de manera no lineal (figura
reacción, v
7-3). La forma de esta curva de velocidad contra sustrato es una clave importante
Concentración de enzima, [E]
para entender el modo en que las enzimas interactúan con los sustratos. La forma
Figura 7-2. Relación entre
concentración de enzima y velocidad hiperbólica, no lineal de la curva, sugiere que una enzima se combina físicamente
de reacción. Mientras más enzima
rápida será la reacción de la enzima. con su sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES). Por tanto, la con-

versión catalizada por enzima de S en P:

puede escribirse de manera más exacta como: SEP

E ϩ S ES E ϩ P

184 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

Conforme se agregan pequeñas cantidades de sustrato al preparado de

la enzima, la actividad enzimática (medida como la velocidad de reac-

ción) parece aumentar de manera casi lineal. Sin embargo, la actividad

enzimática se incrementa de manera menos impresionante conforme se

agrega más sustrato. A concentraciones de sustrato muy altas, la activi-

dad enzimática tiende a nivelarse al aproximarse a un valor máximo. Velocidad
Este comportamiento muestra que a bajas concentraciones de sustrato, de

la enzima convierte con rapidez todo el sustrato en producto, pero con- reacción, v

forme se agrega más sustrato, la enzima se satura de éste; es decir, hay

más moléculas de sustrato que moléculas de enzima, por lo que no todo

el sustrato puede ser convertido en producto en un momento dado. La

llamada cinética de saturación es una característica de muchos fenóme-

nos de enlace, incluida la unión de O2 a mioglobina (véase figura 5-3). Concentración de sustrato, [S]
La curva mostrada en la figura 7-3 revela considerable información
Figura 7-3. Gráfica de velocidad de
acerca de una enzima y su sustrato en un conjunto dado de condiciones
reacción contra concentración de
de reacción. Todas las reacciones simples catalizadas por enzima tienen sustrato. Se agregan cantidades
variables de sustrato a una cantidad fija
curva de velocidad contra concentración de sustrato hiperbólica, pero la forma exac- de enzima. Se mide y grafica la
velocidad de reacción para cada
ta de la curva depende de la enzima, concentración, concentraciones de inhibidores concentración de sustrato. La curva
resultante asume la forma de una
enzimáticos, pH, temperatura, etcétera. Analizando estas curvas es posible abordar hipérbola, una función matemática en la
cual los valores primero aumentan de
algunas cuestiones básicas, por ejemplo, manera abrupta, pero con el tiempo
tienden a un máximo.
• ¿Qué tan rápido actúa la enzima?
• ¿Con cuánta eficiencia convierte la enzima diferentes sustratos en productos?
• ¿Qué tan susceptible es la enzima a diversos inhibidores y de qué manera estos

inhibidores afectan la actividad enzimática?

A su vez, las respuestas a estas preguntas pueden revelar:

• Si es probable que una enzima catalice una reacción específica in vivo.
• Cuáles sustancias es probable que actúen como reguladores fisiológicos de la

actividad de la enzima.
• Cuáles inhibidores enzimáticos podrían ser fármacos eficaces.

REPASO DE CONCEPTOS
• Describa dos modos de expresar la velocidad de una reacción enzimática.
• ¿Por qué una gráfica de velocidad contra concentración del sustrato genera una

curva?

7-2. Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten

El análisis matemático del comportamiento enzimático se centra en la ecuación que des- CONCEPTOS CLAVE
cribe la forma hiperbólica de la gráfica de velocidad contra concentración de sustrato (fi-
gura 7-3). Es posible analizar una reacción catalizada por enzima, como la catalizada por • Las reacciones químicas sencillas
triosa fosfato isomerasa, descomponiéndola de manera conceptual en pasos más pe-
queños y usando los términos que se aplican a los procesos químicos sencillos. se describen en términos de

Las ecuaciones de velocidad describen procesos constantes de velocidad.
químicos
• La ecuación de Michaelis-Menten
Considérese una reacción unimolecular (una que implica un solo reactivo), como
la conversión del compuesto A en B: describe reacciones catalizadas por

AB enzima en términos de KM y Vmáx.
El avance de esta reacción puede describirse matemáticamente por medio de una • Los parámetros cinéticos KM, kcat y
ecuación de velocidad en la cual la velocidad de reacción se expresa en términos de
una constante (constante de velocidad) y la concentración de reactivo [A]: kcat/KM se determinan de manera
experimental.

• Es posible deducir los valores de

KM y Vmáx para enzimas que no
siguen el modelo de Michaelis-

Menten.

v ϭ Ϫ d [A] ϭ k[A]
dt

7-2 Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten | 185

Aquí, k es la constante de velocidad y tiene unidades de segundos recíprocos (s–1).
Esta ecuación muestra que la velocidad de reacción es directamente proporcional a
la concentración del reactivo A. Se dice que tal reacción es de primer orden porque
su velocidad depende de la concentración de una sustancia.

Una reacción de segundo orden o bimolecular, en la que intervienen dos reac-
tivos, puede escribirse:

AϩB C
Su ecuación de velocidad es:

v ϭ Ϫ d [A] ϭ Ϫ d [B] ϭ k[A][B]
dt dt

Aquí, k es una constante de velocidad de segundo orden y tiene unidades de M–1 ·
s–1. Por tanto, la velocidad de una reacción de segundo orden es proporcional al

producto de las concentraciones de los dos reactivos (ejemplo de cálculo 7-1).

EJEMPLO DE CÁLCULO 7-1 Determinar la velocidad de la reacción X + Y Z cuando la muestra contiene
PROBLEMA X 3 μM y Y 5 μM, y k para la reacción es de 400 M–1 · s–1.

SOLUCIÓN Se utiliza la ecuación 7-3 y se asegura que todas las unidades sean consistentes:

v ϭ k [X][Y]
ϭ (400 MϪ1 и sϪ1)( 3 μM)(5 μM)
ϭ (400 MϪ1 и sϪ1)(3 ϫ 10Ϫ6 M)(5 ϫ 10Ϫ6 M)
ϭ 6 ϫ 10Ϫ9 M и sϪ1
ϭ 6 nM и sϪ1

La ecuación de Michaelis-Menten es una ecuación
de velocidad para una reacción catalizada por enzima

En el caso más simple, una enzima se une a su sustrato (en un complejo enzima-
sustrato) antes de convertirlo en producto, por lo que la reacción global en realidad
consiste en procesos de primer y segundo órdenes, cada uno con una constante de
velocidad característica:

E ϩ S yzk1 ES zzk2 E ϩ P
k–1

La colisión inicial de E y S es una reacción bimolecular con la constante de velo-
cidad de segundo orden k1. El complejo ES puede experimentar entonces una de
dos reacciones unimoleculares posibles: k2 es la constante de velocidad de primer
orden para la conversión de ES en E y P, y k–1 es la constante de velocidad de pri-
mer orden para la conversión de ES de vuelta en E y S. La reacción bimolecular
que representaría la formación de ES a partir de E y P no se muestra porque se
supone que la formación de producto a partir de ES (el paso descrito por k2) no
ocurre en sentido inverso.

La ecuación de velocidad para la formación del producto es:

v ϭ d [P] ϭ k2[ES]
dt

186 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

S P Figura 7-4. Cambios de
concentración para una reacción
Concentración simple catalizada por enzima. Para la
mayor parte del transcurso de la
ES reacción, [ES] permanece constante
E mientras S se convierte en P. En esta
reacción idealizada, todo el sustrato se
convierte en producto.

Véase figura animada. Curva de avance
para una reacción catalizada por enzima.

Tiempo

A fin de calcular la constante de velocidad, k2, para la reacción, se necesitaría conocer
la velocidad de reacción y la concentración de ES. La velocidad puede medirse con
relativa facilidad, por ejemplo usando un sustrato sintético que se convierte en un
producto que absorbe luz o fluorescente. (La velocidad de reacción es sólo la rapidez
con que aparece el producto, según se monitorea con un espectrofotómetro o fluo-
rómetro). Sin embargo, medir [ES] es difícil porque la concentración del complejo
enzima-sustrato depende de su velocidad de formación a partir de E y S y su rapidez
de descomposición en E + S y E + P:

d [ES] ϭ k1[E][S] Ϫ kϪ1[ES] Ϫ k2[ES]
dt

A fin de simplificar el análisis, aquí se eligen condiciones experimentales dado
que la concentración de sustrato sea mucho mayor que la concentración de enzima
([S] [E]). En estas condiciones, después de que se han mezclado E y S la concen-
tración de ES permanece constante hasta que casi todo el sustrato se ha convertido
en producto. Esto se muestra de manera gráfica en la figura 7-4. Se dice que [ES]
mantiene un estado estable (tiene valor constante) y:

d [ES] ϭ 0
dt

Conforme a la suposición de estado estable, la velocidad de formación de ES debe
ser igual a la velocidad de consumo de ES:

k1[E][S] ϭ kϪ1[ES] ϩ k2[ES] [7-8]

En cualquier punto durante la reacción, [E] –al igual que [ES]– es difícil de deter-

minar, pero la concentración total de enzima, [E]T, suele conocerse:

[E]T ϭ [E] ϩ [ES] [7-9]

Así, [E] = [E]T – [ES]. Esta expresión para [E] puede sustituirse en la ecuación 7-8
para obtener:

k1([E]T Ϫ [ES])[S] ϭ kϪ1[ES] ϩ k2[ES] [7-10]

Reagrupando (dividiendo ambos miembros entre [ES] y k1) se obtiene una expre-
sión en la cual las tres constantes de velocidad están juntas:

([E]T Ϫ [ES])[S] ϭ kϪ1 ϩ k2
[ES] k1

En este punto, es posible definir la constante de Michaelis (KM) como un conjunto
de constantes de velocidad:

KM ϭ kϪ1 ϩ k2
k1

7-2 Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten | 187

En consecuencia, la ecuación 7-11 pasa a ser:

([E]T Ϫ [ES])[S] ϭ KM
[ES]

o bien

K M[ES] ϭ ([E]T Ϫ [ES])[S]

Dividiendo ambos miembros entre [ES] se obtiene:

KM ϭ [E]T[S] Ϫ [S]
[ES]

o bien

[E]T[S] ϭ KM ϩ [S]
[ES]

Despejando [ES] se tiene:

[ES] ϭ [E]T[S]
K M ϩ [S]

La ecuación de velocidad para la formación de producto (ecuación 7-5) es v =
k2[ES], de modo que la velocidad de reacción puede expresarse como:

v ϭ k2[ES] ϭ k2[E]T[S]
K M ϩ [S]

Se tiene entonces una ecuación con dos cantidades: [E]T y [S]. Aunque se consume algo
de S en la formación del complejo ES, se puede pasar por alto porque [S]T [E]T.

Las mediciones cinéticas suelen hacerse poco después de que se mezclan enzima
y sustrato, antes de que alrededor de 10% de las moléculas del sustrato se hayan
convertido en moléculas de producto (ésta también es la causa de que sea posible
ignorar la reacción inversa, E + P ES). Por tanto, la velocidad al comienzo de la
reacción (en el tiempo cero) se expresa como v0 (velocidad inicial):

v0 ϭ k2[E]T[S]
K M ϩ [S]

Es posible hacer una simplificación adicional: Cuando [S] es muy alta, toda la enzi-
ma está en su forma ES (está saturada de sustrato) y por tanto tiende a su punto de
actividad máxima (figura 7-3). La velocidad de reacción máxima, designada Vmáx,
puede expresarse como:

Se emplea la ecuación de Michaelis- Vmáx ϭ k2[E]T
Menten para deducir Vmáx y KM a
partir de mediciones de la velocidad que es similar a la ecuación 7-5. Sustituyendo la ecuación 7-20 en la ecuación 7-19
de reacción a diferentes concentra- se obtiene:
ciones de sustrato.
v0 ϭ Vmáx[S]
K M ϩ [S]

188 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

Esta relación se denomina ecuación de Michaelis-Menten en honor de Leonor
Michaelis y Maude Menten, quienes la dedujeron en 1913. Es la ecuación de velo-
cidad para una reacción catalizada por enzima y es la descripción matemática de la
curva hiperbólica de la figura 7-3. (Ejemplo de cálculo 7-2).

EJEMPLO DE CÁLCULO 7-2 PROBLEMA
SOLUCIÓN
Una reacción catalizada por enzima tiene KM de 1 mM y Vmáx de 5 nM · s–1. ¿Cuál
es la velocidad de reacción cuando la concentración de sustrato es a) 0.25 mM, b)
1.5 mM y c) 10 mM?

Se utiliza la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 7-21):
(5 nM ؒ sϪ1) (0.25 mM )

(a) v0 ϭ (1 mM) ϩ (0.25 mM)
ϭ 1.25 nM ؒ sϪ1
1.25
ϭ 1 nM ؒ sϪ1

(5 nM ؒ sϪ1) (1.5 mM )
(b) v0 ϭ (1 mM) ϩ (1.5 mM)

ϭ 7.5 nM ؒ sϪ1
2.5

ϭ 3 nM ؒ sϪ1

(5 nM ؒ sϪ1) (10 mM )
(c) v0 ϭ (1 mM) ϩ (10 mM)

ϭ 50 nM ؒ sϪ1
11

ϭ 4.5 nM ؒ sϪ1

KM es la concentración del sustrato a la cual la
velocidad es la mitad del valor máximo

Se mencionó que la constante de Michaelis (KM) es una combinación de tres cons-
tantes de velocidad (ecuación 7-12), pero puede determinarse con facilidad a partir
de datos experimentales. Las mediciones cinéticas suelen hacerse en un intervalo de
concentraciones de sustrato. Cuando [S] = KM, la velocidad de reacción (v0) es igual
a la mitad de su valor máximo (v0 = Vmáx/2), como se muestra en la figura 7-5. Puede
demostrarse que esto se cumple sustituyendo [S] por KM en la ecuación de Michae-
lis-Menten (ecuación 7-21). Dado que KM es la concentración de sustrato a la cual
la velocidad de reacción tiene la mitad de su valor máximo, indica la eficiencia con
que una enzima selecciona su sustrato y lo convierte en producto. A menor KM, más
eficaz es la enzima a bajas concentraciones de sustrato; a mayor KM, menos eficaz es
la enzima. KM es única para cada par enzima-sustrato. En consecuencia, los valores
de KM son útiles para comparar las actividades de dos enzimas que actúan en la
misma sustancia o para evaluar la capacidad de diferentes sustratos de ser reconoci-
dos por una misma enzima.

7-2 Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten | 189

Figura 7-5. Determinación gráfica V máx
de KM. KM corresponde a la
concentración de sustrato a la cual la v0
velocidad de reacción es la mitad de la V máx
máxima. Puede estimarse visualmente a 2
partir de una gráfica de v0 contra [S].

Véase figura animada. Gráfica de
velocidad inicial contra concentración de
sustrato.

KM

[S]

En la práctica, KM se usa a menudo como una medida de la afinidad de una en-
zima por un sustrato. En otras palabras, se aproxima a la constante de disociación del

complejo ES:

KM Ϸ [E][S]
[ES]

Nótese que esta relación es estrictamente cierta sólo cuando la velocidad de la reac-

ción ES E + P es menor que la velocidad de la reacción ES E + S (esto es,

cuando k2 k–1).

La constante catalítica describe la rapidez con que una
enzima puede actuar

También es útil saber qué tan rápido actúa una enzima después de que ha seleccio-
nado su sustrato y se ha unido a él. En otras palabras, ¿cuánto avanza el complejo ES
hacia E + P? Este parámetro se denomina constante catalítica y se simboliza kcat.
Para cualquier reacción catalizada por enzima,

kcat ϭ Vmáx
[E]T

Para una reacción simple, como la que se representa en la ecuación 7-4,

CUADRO 7-1 | Constantes kcat ϭ k2
catalíticas
de algunas Así, kcat es la constante de velocidad de la reacción cuando la enzima está saturada de
enzimas sustrato (cuando [ES] ≈ [E]T y v0 ≈ Vmáx). Se vio esta relación en la ecuación 7-20. kcat
también se conoce como número de recambio de la enzima porque es el número de
Enzima kcat (sϪ1) ciclos catalíticos que cada sitio activo experimenta por unidad de tiempo, o el número
de moléculas de sustrato transformadas en moléculas de producto por una misma en-
Nucleasa estafilocócica 95 zima en un lapso dado. El número de recambio es una constante de velocidad de pri-
Citidina desaminasa 299 mer orden y por tanto tiene unidades de s–1. Como se muestra en el cuadro 7-1, las
Triosa fosfato isomerasa 4300 constantes catalíticas de las enzimas varían en muchos órdenes de magnitud.
Ciclofilina 13 000
Cetosteroide isomerasa 66,000 Debe tenerse presente que la velocidad de una reacción enzimática depende del
Anhidrasa carbónica 1 000 000 número de moléculas de reactivo que pueden alcanzar el estado de transición de alta
energía por unidad de tiempo (véase sección 6-2). Si bien una enzima puede acelerar
una reacción química proporcionando un mecanismo de reacción con una barrera
de energía de activación más baja, la enzima no puede modificar la energía libre de
reactivos y productos. Esto significa que la enzima puede hacer que una reacción
ocurra más rápido, pero sólo cuando el cambio global de energía libre es menor de
cero (es decir, los productos tienen menor energía libre que los reactivos).

Datos de Radzicka, A., y Wolfenden, R., Science 267, kcat/KM indica la eficiencia catalítica
90-93 (1995).
La eficacia de una enzima como catalizador depende de la avidez con que se una a
sus sustratos y de la rapidez en que los convierta en productos. Así, una medida de

190 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

la eficiencia catalítica debe reflejar tanto procesos de enlace como catalíticos. La
cantidad kcat/KM satisface este requisito. A bajas concentraciones del sustrato ([S] <
KM), se forma muy poco ES y [E] ≈ [E]T. Entonces es posible simplificar la ecuación
7-18 (el término [S] en el denominador se torna insignificante):

v0 ϭ k2[E]T[S]
K M ϩ [S]

v0 Ϸ k2 [E][S]
KM

La ecuación 7-16 es la ecuación de velocidad para la reacción de segundo orden de
E y S. kcat/KM, que tiene unidades de M–1 · s–1, es la constante de velocidad de segundo
orden aparente. Como tal, indica cómo varía la velocidad de reacción dependiendo de

la frecuencia con que la enzima y el sustrato se combinen entre sí. El valor de kcat/KM,
más que KM o kcat por separado, representa la capacidad global de la enzima de con-
vertir sustrato en producto.

¿Qué limita el poder catalítico de las enzimas? Ocurre alrededor de un reordena-
miento electrónico cada 10–13 seg durante la formación del estado de transición; ése

es más o menos el tiempo de una vibración de un enlace. Pero el recambio enzimá-

tico es más lento que esto (cuadro 7-1). La velocidad global de una enzima es limi-

tada aún más por la frecuencia con que choca de manera productiva con su sustrato.

El límite superior para la velocidad de esta reacción de segundo orden (una reacción
bimolecular)es de alrededor de 108 a 109 M–1 · s–1, que es la velocidad máxima a la

cual dos moléculas en difusión libre pueden chocar entre sí en solución acuosa.

Este llamado límite controlado por difusión para la reacción de segundo orden entre

una enzima y su sustrato es alcanzado por varias enzimas, como la triosa fosfato isomerasa,
cuyo valor de kcat/KM es de 2.4 ϫ 108 M–1 · s–1. Por tanto, se dice que esta enzima ha al-
canzado la perfección catalítica porque su velocidad global es controlada por la difusión:

cataliza una reacción tan rápidamente como encuentra su sustrato. Sin embargo, muchas

enzimas realizan sus funciones fisiológicas con modestos valores de kcat/KM.

Km y Vmáx se determinan experimentalmente

Los datos cinéticos suelen colectarse agregando una pequeña cantidad de una enzima
a cantidades variables de sustrato y vigilando luego la mezcla de reacción en busca de
la aparición de producto durante algún tiempo. A fin de satisfacer las suposiciones del
modelo de Michaelis-Menten, las concentraciones del sustrato deben ser mayores que
la concentración de la enzima (de este modo, la concentración del complejo ES será
constante y la formación de dicho complejo será limitada por la afinidad de E por S,
no por la cantidad de S disponible), y lo que debe medirse es la velocidad inicial, antes
de que comience a acumularse producto y la reacción inversa se haga significativa.

Las gráficas de velocidad contra concentración de sustrato, como la figura 7-5,
pueden ser útiles para estimar visualmente los parámetros cinéticos KM y Vmáx (a
partir de los cuales puede deducirse kcat mediante la ecuación 7-23). Sin embargo, en
la práctica las curvas hiperbólicas son propensas a interpretaciones erróneas debido
a que es difícil estimar el límite superior de la curva (Vmáx). Con objeto de determi-
nar de manera más precisa Vmáx y KM (la concentración del sustrato a Vmáx/2), es
necesario uno de los pasos siguientes:

1. Analizar los datos mediante un programa de cómputo para ajuste de curvas que
calcule el límite superior de la velocidad de reacción.

2. Transformar los datos a una forma que pueda graficarse como una línea. La trans-
formación lineal mejor conocida de la curva de velocidad contra concentración de
sustrato se conoce como gráfica de Lineweaver-Burk, cuya ecuación es:

1 ϭ KM 1ϩ 1
v0 Vmáx [S] Vmáx

La pendiente y las coordenadas al origen de la curva de 1/v0 contra 1/[S] dan
valores para KM y Vmáx.

7-2 Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten | 191

La ecuación 7-27 tiene la conocida forma y = mx + b. Una

gráfica de 1/v0 contra 1/[S] da una línea recta cuya pendiente es
KM/Vmáx y cuya ordenada al origen es 1/Vmáx. La abscisa al origen
1 (extrapolada) es –1/KM (figura 7-6). Una comparación de las fi-
Vmáx guras 7-5 y 7-6, elaboradas con los mismos datos, ilustra el

1 modo en que puntos uniformemente espaciados en una gráfica
v0 de velocidad contra sustrato se comprimen en una gráfica de

Pendiente = KM Lineweaver-Burk (ejemplo de cálculo 7-3).
V máx Idealmente, las condiciones experimentales se eligen de modo

que las mediciones de velocidad puedan realizarse para concen-

traciones de sustrato que sean tanto más altas como más bajas

que KM. Esto da los valores más precisos para KM y Vmáx. Una
1 gráfica de Lineweaver-Burk, ya sea que se construya a mano o

[S] por computadora, ofrece la ventaja de que KM y Vmáx pueden
−1 estimarse a a simple vista con rapidez. Las gráficas lineales tam-
KM bién son más convenientes que las curvas para comparar series
de datos múltiples, como diferentes preparados enzimáticos o una misma enzima en
Figura 7-6. Gráfica de Lineweaver- presencia de diferentes concentraciones de un inhibidor.
Burk. Graficar los recíprocos de [S] y v0
produce una línea en la cual la

pendiente y las coordenadas al origen

proporcionan valores de KM y Vmáx. Los No todas las enzimas se ajustan al modelo simple de
puntos graficados corresponden a los Michaelis-Menten
puntos de la figura 7-5.

Véase figura animada. Gráfica de Hasta aquí, la exposición se ha concentrado en la más simple de las reacciones cata-
Lineweaver-Burk. lizadas por enzima, a saber, una reacción con un sustrato y producto. Estas reaccio-
nes representan sólo una pequeña porción de las reacciones enzimáticas conocidas,
muchas implican múltiples sustratos y productos, proceden a través de múltiples
pasos, o no cumplen las suposiciones del modelo cinético de Michaelis-Menten por
otras razones. Con todo, aún es posible evaluar la cinética de estas reacciones.

1. Reacciones con múltiples sustratos

Más de la mitad de todas las reacciones conocidas implican dos sustratos. La mayoría
de estas reacciones bisustrato son de oxidorreducción o de transferasa. En una re-
acción de oxidorreducción, se transfieren electrones entre sustratos:

Xoxidado ϩ Yreducido Xreducido ϩ Yoxidado

En la reacción de una transferasa, como la catalizada por transcetolasa, se transfiere
un grupo entre dos moléculas:

CH2OH OH OH CH2OH
CO C C CO

HO C H ϩ H C OH Transcetolasa H C OH ϩ HO C H
H C OH CH2OPO32Ϫ
H C OH
H C OH Gliceraldehído 3-fosfato H C OH CH2OPO32Ϫ

CH2OPO32Ϫ CH2OPO32Ϫ Xilulosa 5-fosfato

Fructosa 6-fosfato Eritrosa 4-fosfato

La reacción de la transcetolasa es de naturaleza ubicua; interviene en la síntesis y de-
gradación de carbohidratos. Como está escrita, transforma un azúcar de seis carbonos
y un azúcar de tres carbonos en uno de cuatro carbonos y otro de cinco carbonos.
Cada uno de los sustratos interactúa con la enzima con una KM característica. Para
determinar de manera experimental cada KM, la velocidad de reacción se mide a dife-
rentes concentraciones de un sustrato mientras el otro sustrato se encuentra a concen-
tración de saturación. Vmáx es la velocidad de reacción máxima cuando ambos sustratos
están presentes a concentraciones que saturan sus sitios de enlace en la enzima.

192 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

EJEMPLO DE CÁLCULO 7-3 PROBLEMA
SOLUCIÓN
La velocidad de una reacción catalizada por enzima se midió a varias concentracio-
nes del sustrato. Calcular KM y Vmáx para la reacción.

[S] (μM) v0 (mM и sϪ1)
0.25 0.75
0.5 1.20
1.0 1.71
2.0 2.18
4.0 2.53

Se calculan los recíprocos de la concentración de sustrato y velocidad, luego se
grafica 1/v0 contra 1/[S] (gráfica de Lineweaver-Burk).

1͞[S] (μMϪ1) 1͞v0 (mMϪ1 и s)
4.0 1.33
2.0 0.83
1.0 0.58
0.5 0.46
0.25 0.40

1.5

1.0

1 (mM−1.s)
v0

0.5

−1.33 0.33

−2 −1 12 3 4

1 (µM−1)
[S]

La abscisa al origen (que es igual a –1/KM) es –1.33 μM–1. Por tanto,

KM ϭ Ϫ 1 ϭ 0.75 ␮M
Ϫ1.33 ␮MϪ1

La ordenada al origen (que es igual a 1/Vmáx) es 0.33 mM–1 · s–1. Por tanto,

Vmáx ϭ 0.33 1 ϭ 3.0 mM • s Ϫ1
mMϪ1 •s

En algunas reacciones bisustrato, los sustratos pueden unirse en cualquier orden,
siempre que ambos terminen en el sitio activo al mismo tiempo. Se dice que estas reac-
ciones siguen un mecanismo aleatorio. Las enzimas en las cuales un sustrato debe
unirse antes que el otro siguen un mecanismo ordenado. En un mecanismo de
ping pong, un sustrato se une y un producto se libera antes de que el otro sustrato
se una y se libere el segundo producto. La transcetolasa cataliza una reacción de ping
pong: la fructosa 6-fosfato se une primero y cede un fragmento de dos carbonos a la
enzima, y el primer producto (eritrosa 4-fosfato) sale del sitio activo antes de que el

7-2 Deducción y significado de la ecuación de Michaelis-Menten | 193

segundo sustrato (gliceraldehído 3-fosfato) se una y reciba el fragmento de dos car-
bonos para formar el segundo producto (xilulosa 5-fosfato).

2. Reacciones de múltiples pasos

Como lo ilustra la reacción de la transcetolasa, una reacción catalizada por enzima
puede implicar muchos pasos. En este ejemplo, la reacción incluye un intermediario
en el cual el fragmento de dos carbonos extraído de la fructosa 6-fosfato permanece
unido a la enzima mientras espera la llegada del segundo sustrato. (De modo similar,
el mecanismo de reacción de la quimotripsina delineado en la figura 6-10 requiere
de varios pasos). La reacción de múltiples pasos de la transcetolasa puede dividirse
en una serie de pasos mecánicos más simples y esquematizarse como sigue:

Transcetolasa Eritrosa Gliceraldehído
4-fosfato 3-fosfato

++

Fructosa Xilulosa
6-fosfato 5-fosfato

Cada paso de este proceso tiene constantes de velocidad características hacia la dere-
cha e izquierda. En consecuencia, kcat para la reacción global:

Fructosa 6-fosfato ϩ Gliceraldehído 3-fosfato
Eritrosa 4-fosfato ϩ Xilulosa 5-fosfato

es una función complicada de muchas constantes de velocidad individuales (sólo
para una reacción muy simple, por ejemplo la ecuación 7-4, kcat = k2). Sin embargo,
el significado de kcat –el número de recambio de la enzima– es el mismo que para una
reacción de un paso.

Las constantes de velocidad de pasos individuales en una reacción de múltiples pasos
a veces pueden medirse durante las fases iniciales de la reacción, es decir, antes de que
se instaure un estado más estable. Esto requiere de instrumentos capaces de mezclar con
rapidez los reactivos y luego vigilar la mezcla en una escala temporal de 1 a 10–7 seg.

V máx 3. Reacciones no hiperbólicas
Velocidad, v0
Muchas enzimas, en particular enzimas oligoméricas con múltiples si-
KM tios activos, no obedecen la ecuación de velocidad de Michaelis-Men-
ten y por tanto su curva de velocidad contra concentración de sustrato
Concentración de sustrato, [S] no es hiperbólica. En estas enzimas alostéricas, la presencia de un
sustrato en un sitio activo puede afectar la actividad catalítica de los
Figura 7-7. Efecto de la unión otros sitios activos. Este comportamiento cooperativo se presenta
cooperativa del sustrato. La curva de cuando las subunidades de la enzima están vinculadas estructural-
velocidad contra sustrato es sigmoidea y mente entre sí, de modo que un cambio conformacional inducido por
no hiperbólica cuando la unión del sustrato en una subunidad impulse cambios conformacionales en las
sustrato a un sitio activo en una enzima subunidades restantes. (El comportamiento cooperativo también se
oligomérica modifica la actividad observa en la hemoglobina, cuando la unión de O2 al grupo hem de
catalítica de los otros sitios activos. La una subunidad modifica la afinidad por O2 de las otras subunidades;
velocidad de reacción máxima es Vmáx, y véase sección 5-1). Como la hemoglobina, una enzima alostérica tiene
KM es la concentración de sustrato dos estructuras cuaternarias posibles. El estado T (“tenso”) tiene menor
cuando la velocidad es la mitad de la actividad catalítica, y el estado R (“relajado”) tiene mayor actividad.
máxima. Debido a las interacciones entre subunidades individuales, la totalidad
de la enzima puede alternar entre las conformaciones T y R. El resul-
tado del comportamiento alostérico es una curva de velocidad contra
concentración de sustrato sigmoidea (figura 7-7). Aunque la ecuación
estándar de Michaelis-Menten no se aplica en este caso, KM y Vmáx se
pueden estimar y usar para caracterizar la actividad enzimática.

194 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

REPASO DE CONCEPTOS

• ¿Cuáles son las ecuaciones de velocidad para las reacciones de primero y segundo
órden?

• Describa las tres posibles reacciones de un complejo ES.
• Describa los cambios en las concentraciones de S, P, ET y ES durante el transcurso

de una reacción catalizada por enzima.
• Escriba la ecuación de velocidad para una reacción catalizada por enzima.
• ¿Cuál es la definición formal de KM?
• ¿Qué otro significado se le da a menudo?
• ¿Cuál es el significado de kcat?
• ¿Cómo puede usarse Vmáx para calcular kcat?
• ¿Por qué kcat/KM es un mejor indicador de la eficiencia enzimática que kcat o KM solas?
• ¿Por qué se considera que la triosa fosfato isomerasa es una enzima

catalíticamente perfecta?
• ¿Por qué a menudo se usa una gráfica de Lineweaver-Burk en vez de una de

velocidad contra concentración de sustrato para determinar KM y Vmáx?
• ¿Cuántos valores de KM corresponden a una reacción bisustrato? ¿Cuántos

valores de Vmáx?
• Explique por qué kcat no necesariamente es la constante de velocidad para una

reacción individual.
• Describa la forma de la curva de velocidad contra concentración de sustrato

cuando la enzima exhibe comportamiento cooperativo

7-3. Inhibición enzimática

Dentro de una célula, una enzima está sujeta a diversos factores que pueden influir CONCEPTOS CLAVE
en su comportamiento. Las sustancias que interactúan con la enzima pueden inter-
ferir en la unión al sustrato, la catálisis o ambos. Muchos antibióticos, plaguicidas y • Las sustancias que se unen de
otros venenos naturales son sustancias que inhiben la actividad de enzimas esencia- modo irreversible a una enzima
les. Desde un punto de vista estrictamente científico, estos inhibidores son sondas pueden inhibir su actividad.
útiles para estudiar la estructura del sitio activo de una enzima y su mecanismo cata-
lítico. Los inhibidores enzimáticos también tienen uso terapéutico como medica- • Un inhibidor competitivo parece
mentos. La búsqueda continua de fármacos más eficaces requiere del conocimiento incrementar KM sin afectar Vmáx.
de la forma en que los inhibidores enzimáticos actúan y en que pueden ser modifi-
cados para inhibir mejor sus enzimas blanco. El recuadro 7-A describe algunos de los • Los análogos del estado de
pasos que deben darse para convertir un inhibidor enzimático en un fármaco eficaz. transición pueden actuar como
inhibidores competitivos.
Algunos inhibidores actúan de manera irreversible
• Los inhibidores no competitivos,
Ciertos compuestos interactúan de manera tan estrecha con las enzimas que sus mixtos y acompetitivos reducen
efectos son en esencia irreversibles. Por ejemplo, el diisopropilfosfofluoridato kcat.
(DIPF), reactivo empleado para identificar el sitio activo residuo Ser de la quimo-
tripsina (véase sección 6-2), es un inhibidor irreversible de la enzima. Cuando el • Los reguladores alostéricos puede
inhibir o activar enzimas.

RECUADRO 7-A UN VISTAZO MÁS DE CERCA

Desarrollo de fármacos

El camino de un fármaco desde el laboratorio de un bioquímico La mayoría de los medicamentos en uso actual bloquean la
hasta el botiquín de un paciente suele ser largo, arduo y costoso. Ya actividad de proteínas que participan en vías de señalización
sea que un nuevo medicamento resulte de un descubrimiento celular, pero tienen mucho en común con sustancias que actúan
sorpresivo o de los esfuerzos dedicados de un científico farmacéutico, como inhibidores enzimáticos. Cada fármaco potencial comienza
un fármaco candidato recién identificado casi nunca es exactamente como un compuesto sintético o natural que luego se modifica y
el mismo compuesto que llega hasta los estantes de una farmacia. El prueba en cuanto a su efecto biológico deseado. En el caso de los
desarrollo de fármacos es un proceso de refinamiento y prueba que inhibidores enzimáticos, los métodos modernos aprovechan el
puede tardar años y costar miles de millones de dólares, pero suele conocimiento acerca de la estructura y mecanismo del sitio activo
generar una sustancia segura y con utilidad terapéutica. de una enzima para diseñar un compuesto que bloqueará la

7-3 Inhibición enzimática | 195

UN VISTAZO MÁS DE CERCA Continuación

catálisis de manera precisa. Este proceso algunas veces se llama En consecuencia, las mejores predicciones basadas en datos de

diseño racional de fármacos. Un fármaco candidato, o compuesto laboratorio –o incluso en pruebas con animales– no garantizan un

inicial, puede modificarse de manera sistemática por adición o resultado exitoso en el cuerpo humano. A fin de cuentas, la eficacia

eliminación de diversos grupos químicos y luego volver a probarse y seguridad de un fármaco deben valorarse en ensayos clínicos.

en cuanto a su actividad inhibitoria. Los procedimientos robóticos Este tipo de prueba se organiza en tres fases consecutivas, cada una

para síntesis y prueba química permiten analizar miles de sustancias. implica gran número de sujetos. En los ensayos clínicos de fase I, el
De manera alternativa, mediante simulaciones en computadora
basadas en la estructura de la enzima es posible predecir si una fármaco candidato se administra a un pequeño grupo de volunta-
estructura modificada podría ser un mejor inhibidor.
rios sanos a concentraciones hasta de la dosis terapéutica esperada.
El objetivo durante todo el proceso de desarrollo de fármacos es
crear un compuesto con las siguientes características: debe ser un inhibi- El objetivo de los ensayos de fase I es constatar que el fármaco sea
dor que se una con fuerza, debe ser altamente selectivo para su enzima
blanco (de modo que no interfiera en la actividad de otras enzimas) y seguro y bien tolerado para los humanos. Los investigadores
no debe ser tóxico. Además, debe evaluarse la farmacocinética del
fármaco, o sea su comportamiento en el organismo. Por ejemplo, el también pueden examinar la farmacocinética del fármaco y
fármaco debe ser hidrosoluble, de modo que pueda ser transportado
por el torrente sanguíneo; al mismo tiempo, debe ser liposoluble, de seleccionar una versión de él y un régimen de dosificación que sean
modo que pueda atravesar las paredes del intestino para ser absorbido a
través de las paredes de los vasos sanguíneos y de este modo llegar a los adecuados para pruebas a gran escala.
tejidos. Asimismo el fármaco debe ser estable y no excretarse con
rapidez por los riñones. Por último, los creadores de medicamentos Después de que se ha verificado la seguridad del fármaco, se prueba
deben tener presentes consideraciones prácticas como el costo de
sintetizar el fármaco. Los compuestos iniciales que satisfacen todos estos su eficacia en ensayos de fase II, en los que suelen participar cientos de
criterios tienden a ser moléculas pequeñas (20 a 70 átomos) y contener
sólo un puñado de grupos formadores de enlaces de hidrógeno (de sujetos que padecen la enfermedad contra la cual se dirige el medica-
modo que no sean demasiado hidrófobos ni hidrófilos).
mento. Las valoraciones de seguridad y dosificación óptima continúan
Gran parte de la investigación relacionada con el desarrollo de
fármacos se concentra en el modo en que el organismo metaboliza durante la fase II. Los pacientes suelen asignarse de manera aleatoria a
compuestos ajenos. La clase de enzimas del citocromo P450 es
responsable de destoxificar diversos compuestos de origen natural los grupos de prueba o testigo. Dado que en muchos ensayos clínicos se
que ingresan en el cuerpo; los fármacos también son sustratos
potenciales. El citocromo P450 contiene un grupo prostético hemo investiga si un nuevo fármaco funciona mejor que otro ya existente, el
(véase sección 5-1) que participa en una reacción de oxidorreduc-
grupo testigo recibe el fármaco antiguo en vez de dejarse sin trata-

miento. Para evitar el efecto placebo, en el cual las expectativas del

paciente o médico pueden alterar el resultado, el ensayo es “ciego”, de

modo que los pacientes no saben cuál tratamiento reciben (ensayo

ciego simple) o, mejor aún, ni los pacientes ni los médicos lo saben

(ensayo doble ciego). Es fácil “cegar” los ensayos con fármacos, dado

que es posible hacer que las sustancias de prueba y testigo luzcan

idénticas, pero resulta difícil si no imposible realizar ensayos ciegos en

otras condiciones, por ejemplo al comparar un fármaco con una

intervención quirúrgica. En estos casos, puede maximizarse la

objetividad al no decir a quienes realizarán el análisis estadístico, cuál

grupo de pacientes recibió cuál tratamiento.

Los ensayos clínicos de fase III se realizan con grand cantidad

de pacientes (cientos a miles). Se requieren esas cifras para obtener

una evidencia estadística sustentable de que el nuevo fármaco

O O O funciona como se esperaba y
es seguro para su uso
HC HO C
N CH3 N CH3 C difundido. Como los ensayos
N CH3 clínicos de fase II, los de fase
Citocromo P450
III son aleatorizados y ciegos

Espontánea de ser posible. La conclusión

exitosa de la fase III, la más

O2 H2O H2O larga del proceso de prueba,
suele llevar a la aprobación del

OH OH OH fármaco por la Food and Drug

Acetaminofén Acetimidoquinona Administration de EUA,
(tóxica) aunque el fármaco puede

ción la cual agrega un grupo hidroxilo al sustrato para hacerlo más comercializarse de manera
hidrosoluble y por tanto más fácil de excretar. En consecuencia, la
actividad de una enzima del citocromo P450 puede reducir la limitada antes de que se conceda la aprobación plena. Aún después
eficacia de un fármaco. En algunos casos, la reacción de hidroxila-
ción puede convertir un fármaco en una toxina. Esto ocurre de que un medicamento se ha aprobado, comercializado y
cuando el acetaminofén, un antipirético (agente contra la fiebre) de
uso común, se consume en grandes dosis: adoptado de manera amplia, la población de pacientes continúa

Los individuos varían en la cantidad y tipo de enzimas del sometiéndolo a escrutinio en busca de efectos secundarios raros o
citocromo P450 que expresan, de modo que es difícil predecir
cómo podría metabolizarse un fármaco. que pudieron no haberse presentado durante el breve periodo de

ensayos de fase II o III. Este periodo de vigilancia a menudo recibe

el nombre de fase IV. Su importancia es puesta de relieve por el

caso de dos analgésicos muy populares, rofecoxib y celecoxib, que

habían sido aprobados pero se retiraron del mercado cuando se

descubrió que incrementaban el riesgo de ataques cardiacos.

196 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

DIPF reacciona con quimotripsina, dejando el grupo DIP unido de manera covalente al
grupo hidroxilo de Ser (página 165), la enzima pierde su actividad catalítica. En general,
cualquier reactivo que modifique de modo covalente la cadena lateral de un aminoácido
en una proteína tiene el potencial de actuar como inhibidor enzimático irreversible.

Algunos inhibidores enzimáticos irreversibles se denominan sustratos suicidas
porque entran en el sitio activo de la enzima y comienzan a reaccionar, exactamente
del mismo modo en que lo haría un sustrato normal. Sin embargo, son incapaces de
experimentar la reacción completa y por tanto quedan “trabados” en el sitio activo.
Por ejemplo, la timidilato sintasa es la enzima que convierte el nucleótido desoxiuri-
dilato (dUMP) en desoxitimidilato (dTMP) por adición de un grupo metilo a C5:

O O

H H H CH3
N N
5 5

ONH timidilato sintasa ONH

Desoxirribosa 5-fosfato Desoxirribosa 5-fosfato

dUMP dTMP

Cuando el compuesto sintético 5-flurouracilo (derecha) es captado por las células, se O
convierte con facilidad en el nucleótido 5-fluorodesoxiuridilato. Este compuesto,
como el dUMP, entra en el sitio activo de la timidilato sintasa, donde un grupo –SH H F
de Cys se añade a C6. Normalmente esto fomenta la nucleofilicidad (riqueza de N
electrones) de C5 de modo que puede aceptar un grupo metilo, pobre en electrones. 5
Sin embargo, la presencia del átomo de F, que atrae electrones, impide la metilación.
Por tanto el inhibidor permanece en el sitio activo, unido a la cadena lateral de Cys, O N 6H
lo cual hace inactiva a la timidilato sintasa. Debido a ello el 5-fluorouracilo se em-
plea para interrumpir la síntesis de DNA en células cancerosas en rápida división. H

5-fluorouracilo

La inhibición competitiva es la forma más común de
inhibición enzimática reversible

Como su nombre indica, la inhibición enzimática reversible ocurre cuando una sus-
tancia se une de manera reversible (esto es, no covalente) a una enzima de modo que
altere sus propiedades catalíticas. Un inhibidor reversible puede afectar la KM, kcat o
ambas, de una enzima. La forma más común de inhibición enzimática reversible se
conoce como inhibición competitiva. En ésta, el inhibidor es una sustancia que
compite de manera directa con un sustrato por la unión al sitio activo de la enzima
(figura 7-8). Como es de esperarse, el inhibidor suele guardar parecido con el sus-
trato en tamaño y propiedades químicas generales de modo que pueda unirse a la
enzima, pero carece de la estructura electrónica exacta que le permita reaccionar.

S Enzima I
Sustrato Inhibidor
Figura 7-8. Inhibición enzimática
S I competitiva. En su forma más simple,
Enzima-sustrato Enzima-inhibidor la inhibición competitiva de una enzima
ocurre cuando el inhibidor y sustrato
compiten por la unión al sitio activo de
la enzima. Un inhibidor competitivo a
menudo semeja al sustrato en tamaño y
forma, pero no puede experimentar una
reacción. En todo caso, la unión del
inhibidor y sustrato es mutuamente
excluyente.

7-3 Inhibición enzimática | 197

Un inhibidor competitivo bien conocido afecta la actividad de la succinato des-
hidrogenasa, que cataliza la oxidación (deshidrogenación) del succinato para produ-
cir fumarato:

COOϪ COOϪ

CH2 CH
CH2 Succinato deshidrogenasa
HC
COOϪ COOϪ

Succinato Fumarato

El compuesto malonato

COOϪ

CH2
COOϪ

Malonato

inhibe la reacción porque se une al sitio activo de la deshidrogenasa, pero no puede

deshidrogenarse. Es claro que el sitio activo puede dar cabida al sustrato succinato o

al inhibidor competitivo malonato, aunque ambos difieren un tanto en tamaño.

La figura 7-9 es una gráfica de la velocidad de reacción de la enzima en presencia

de un inhibidor competitivo, como función de la concentración de sustrato. Dado

que el inhibidor impide que parte del sustrato llegue al sitio activo, la KM parece
aumentar (la afinidad de la enzima por el sustrato parece disminuir).

Pero dado que el inhibidor se une reversiblemente, se disocia de ma-

V máx nera constante de la enzima y se reasocia a ella, esto permite que de

v0 inhibidor modo ocasional una molécula de sustrato entre en el sitio activo. Las
V máx/2
Sin Con inhibidor altas concentraciones de sustrato pueden contrarrestar el efecto del
inhibidor, porque cuando [S] [I], es más probable que la enzima se

una a S que I. La presencia de un inhibidor competitivo no afecta la

kcat de la enzima, de modo que cuando [S] tiende a infinito, v0 tiende
a Vmáx. Para resumir, un inhibidor competitivo incrementa la KM
aparente de la enzima pero no afecta kcat ni Vmáx.

La ecuación de Michaelis-Menten para una reacción inhibida de

[S] manera competitiva tiene la forma:

KM KM v0 ϭ Vmáx[S ]
sin con ␣K M ϩ [S ]

inhibidor inhibidor

Figura 7-9. Efecto de un inhibidor donde α es un factor que hace que KM parezca más grande. El valor de α –el grado de
inhibición– depende de la concentración del inhibidor y su afinidad por la enzima:
competitivo sobre la velocidad de
␣ ϭ 1 ϩ [I]
reacción. En una gráfica de velocidad KI
contra concentración de sustrato, el
inhibidor aumenta la KM aparente KI es la constante de inhibición; es la constante de disociación para el complejo
porque compite con el sustrato por la enzima-inhibidor (EI):
unión a la enzima. El inhibidor no
afecta kcat, de modo que a [S] alta, v0 [E][I]
tiende a Vmáx. [EI]

KI ϭ

A menor KI, mayor la fuerza con que el inhibidor se une a la enzima. Es posible
deducir α (y por tanto KI) graficando la velocidad de reacción contra la concentra-
ción de sustrato en presencia de una concentración conocida de inhibidor. Cuando
los mismos datos se grafican en la forma de Lineweaver-Burk, la abscisa al origen es
–1/αKM (figura 7-10; ejemplo de cálculo 7-4).

198 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

EJEMPLO DE CÁLCULO 7-4 PROBLEMA
Una enzima tiene KM de 8 μM en ausencia de un inhibidor competitivo y KM
aparente de 12 μM en presencia de 3 μM del inhibidor. Calcule KI.

El inhibidor incrementa KM en un factor α (ecuación 7-28). Dado que el valor de SOLUCIÓN
KM con el inhibidor es 1.5 veces más grande que el valor de KM sin el inhibidor (12
μM ¸ 8 μM), α = 1.5. La ecuación 7-29, que da la relación entre α, [I] y KI, puede
reagrupase para despejar KI:

KI ϭ [I] 1
␣Ϫ

ϭ 3 ␮M
1.5 Ϫ 1

3 ␮M
ϭ

0.5

ϭ 6 ␮M

Los valores de KI son útiles para evaluar el poder inhibitorio de diferentes sustan-
cias, por ejemplo una serie de compuestos que se estudian por su potencial utilidad
como medicamentos. Debe tenerse presente que un compuesto eficaz no es necesa-
riamente el compuesto con la K1 más baja (el que se une con más fuerza); también
deben considerarse otros factores, como solubilidad y estabilidad del fármaco.

La inhibición por producto ocurre cuando el producto de una reacción ocupa el
sitio activo de la enzima, lo cual impide la unión de más moléculas de sustrato. Ésta
es una causa de que las mediciones de actividad enzimática se realicen al principio de
la reacción, antes de que se haya acumulado una cantidad significativa de producto.

Los análogos de estado de transición inhiben enzimas

Los estudios de inhibidores enzimáticos pueden revelar datos acerca de la química de
la reacción y el sitio activo de la enzima. Por ejemplo, la inhibición de la succinato
deshidrogenasa por malonato, recién considerada, sugiere que el sitio activo de la
deshidrogenasa reconoce sustancias con dos grupos carboxilato y se une a ellas. De
modo similar, la capacidad de un inhibidor de unirse al sitio activo de una enzima
puede confirmar un mecanismo de reacción propuesto. Se cree que la reacción de la
triosa fosfato isomerasa (página 184) procede a través de un estado de transición
enediolato (entre corchetes):

Con inhibidor αK M
V máx
Pendiente =

1
v0

Sin inhibidor Figura 7-10. Gráfica de Lineweaver-
Burk para la inhibición competitiva.

La presencia de un inhibidor competitivo

Pendiente = KM modifica el valor aparente de –1/KM, la
V máx abscisa al origen, en un factor de α.
1 Nótese que el inhibidor no afecta el valor
V máx de 1/Vmáx, la ordenada al origen.

1

[S] Véase figura animada. Gráfica de
−1 −1 Lineweaver-Burk de la inhibición
K M αK M

competitiva.

7-3 Inhibición enzimática | 199

HO H OH H
C C H C OH
C OϪ
H C OH CH2OPO32Ϫ CO
CH2OPO32Ϫ CH2OPO32Ϫ
Enediolato
Gliceraldehído 3-fosfato Dihidroxiacetona fosfato

Recuérdese de la sección 6-2 que el estado de transición corresponde a una estructu-
ra de alta energía en la cual los enlaces están en el proceso de romperse y formarse.
El compuesto fosfoglicohidroxamato

OH

N

C OϪ

CH2OPO32Ϫ

Fosfoglucohidroxamato

se parece al estado de transición propuesto y, de hecho, se une a la triosa fosfato
isomerasa unas 300 veces más fuerte de lo que el gliceraldehído 3-fosfato o dihidroxia-
cetona fosfato se unen a la enzima.

Numerosos estudios demuestran que si bien los análogos del sustrato constitu-
yen buenos inhibidores competitivos, los análogos del estado de transición
constituyen inhibidores aún mejores. Esto se debe a que, para catalizar una reac-
ción, la enzima debe unirse al estado de transición de la reacción (estabilizarlo o
reducir su energía). Un compuesto que imita el estado de transición puede apro-
vechar las características del sitio activo de una manera en que no puede hacerlo
un análogo del sustrato. Por ejemplo, el nucleósido adenosina se convierte en ino-
sina como sigue:

H2N N H2N OH O N
N HN N HN

NN NN NN
Ribosa
Ribosa Ribosa

Adenosina Inosina

La KM de la enzima para el sustrato adenosina es de 3 ϫ 10–5 M. El producto, ino-
sina, actúa como un inhibidor de la reacción, con KI de 3 ϫ 10–4 M. Un análogo del
estado de transición

H OH
HN N

NN

Ribosa

1,6-dihidroinosina

inhibe la reacción con KI de 1.5 ϫ 10–13 M.
Tales inhibidores no sólo arrojan luz sobre la probable estructura del estado de

transición de la reacción, sino que además pueden constituir un punto de partida
para el diseño de inhibidores aún mejores. Algunos de los fármacos empleados para
tratar la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se diseñaron
originalmente considerando el modo en que los análogos del estado de transición
inhiben enzimas virales (recuadro 7-B).

200 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

RECUADRO 7-B UN VISTAZO MÁS DE CERCA

Inhibidores de enzimas del VIH

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causal desarrollo de fármacos, en parte debido a que enzimas con
del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), consta de un actividades similares ya se estudiaban de manera extensa antes de
genoma de RNA de 8 kb integrado en un centro de proteína que a que se identificara el VIH a principios del decenio de 1980-89.
su vez está rodeado por una envoltura externa de proteína y lípido. Estos estudios facilitaron la comprensión de las estructuras y funcio-
nes de las enzimas virales. Otros aspectos de la fisiología del VIH,
Micrografía electrónica y diagrama de una partícula de VIH. como los pasos necesarios para regular la expresión y el procesa-
(Micrografía de Cavallini James/Photo Researchers; Frankel, A.D., and Young, miento de los productos génicos del VIH, no se comprenden tan
J.A.T., Annu. Rev. Biochem. 67, 3 [1998]). bien como las actividades de la transcriptasa inversa y la proteasa.

El centro del virus incluye unas pocas enzimas virales y otras Los primeros fármacos anti-VIH se dirigieron contra la transcrip-
proteínas necesarias para la infectividad. Después de que tasa inversa, una enzima con dos sitios activos. Un sitio activo cataliza
las proteínas de la cubierta viral hacen contacto con determinadas la polimerización del DNA para sintetizar primero una cadena de
proteínas de superficie de la célula hospedadora, el virus ingresa DNA complementaria al RNA viral y luego una segunda cadena
en la célula y descubre su RNA. El RNA viral se transcribe de DNA complementaria a la primera. El otro sitio activo es una
entonces en DNA por acción de la enzima viral transcriptasa RNAsa (una enzima que degrada RNA) la cual elimina la plantilla
inversa. Otra enzima viral, una integrasa, incorpora el DNA de RNA viral original después de la primera ronda de síntesis de
resultante en el genoma del hospedador. La expresión del DNA. Estas reacciones se resumen en la figura. Sin transcriptasa
genoma viral produce 15 proteínas diferentes, algunas deben ser inversa el genoma viral no podría incorporarse en el DNA del
procesadas por una proteasa viral para darles sus formas hospedador y por tanto los genes virales no podrían ser expresados
maduras. Con el tiempo, nuevas partículas virales se ensamblan por la maquinaria de transcripción y traducción del hospedador.
y se desprenden de la membrana de la célula hospedadora.
Síntesis de DNA RNA
El ciclo vital complejo del VIH ofrece varios puntos potenciales RNAsa
para intervención terapéutica. Dos de las tres enzimas del VIH, la Síntesis de DNA RNA
transcriptasa inversa y la proteasa, fueron los blancos previos del DNA

DNA

DNA
DNA

Acción de la transcriptasa inversa de VIH.

La actividad de la transcriptasa inversa puede ser bloqueada por
dos tipos distintos de fármacos. Análogos de nucleósidos como
AZT y ddC

HOCH2 O Timina

HH
HH

Ϫϩ

NNN H

AZT
(3´-azido-2´,3´-didesoxitimidina, zidovudina)

HOCH2 O Citosina

HH
HH

HH

ddC

(2´,3´-didesoxicitidina, zalcitabina)

7-3 Inhibición enzimática | 201

UN VISTAZO MÁS DE CERCA Continúa

ingresan con facilidad en las células y se fosforilan. Los nucleótidos
resultantes se unen al sitio activo de la transcriptasa inversa y se unen,
mediante su grupo fosfato 5´, a la cadena de DNA en crecimiento.
Sin embargo, dado que carecen de un grupo OH 3´, la adición
ulterior de nucleótidos es imposible. Estos inhibidores se denominan
por tanto terminadores de cadena. (La terminación de la cadena es
la base de la reacción de secuenciación de DNA descrita en la sección
3-4). La AZT se identificó originalmente como un anticanceroso y
más tarde se descubrió que era eficaz contra el VIH, lo cual puso las
bases para el rápido desarrollo de más agentes anti-VIH.

La transcriptasa inversa también puede ser inhibida por
análogos no nucleósidos como la nevirapina:

NNN Proteasa del VIH. (Estructura (pdb 1hxw) determinada por C.H. Park, V.
Nienaber y X.P. Kong).
N CH3
OH Los inhibidores de proteasa del VIH son el resultado de un diseño
racional de fármacos basado en el conocimiento detallado de la
Nevirapina estructura de la enzima. Por ejemplo, los estudios de complejos
inhibidor-proteasa revelaron que los inhibidores fuertes deben ser
Este inhibidor no competitivo se una a una placa hidrófoba en la cuando menos del tamaño de un tetrapéptido, pero no deben
superficie de la transcriptasa inversa cerca del sitio activo de la ser simétricos (aunque la enzima misma es simétrica). El sequinavir
polimerasa y bloquea su actividad. fue el primer inhibidor de proteasa del VIH ampliamente usado.
Es un análogo de estado de transición con cadenas laterales
El RNA de 9 kb del VIH codifica un total de
15 proteínas, incluidas seis proteínas estructurales O
(verde), tres enzimas (rosa) y seis proteínas N
accesorias (azul) necesarias para la expresión génica N
viral y el ensamblaje de nuevas partículas virales. HO
Varios genes se superponen, y dos genes están Phe Pro
formados por segmentos no contiguos de RNA.

O NH

Genoma del VIH. HO N
N OH
Las proteínas estructurales del VIH y sus tres NN
enzimas se sintetizan inicialmente como polipro- OH
teínas cuyos miembros individuales se separan
después por proteólisis (en los sitios indicados con H2N C O
flechas). La proteasa del VIH, que a su vez es un
producto de una poliproteína, realiza la reacción Saquinavir
de proteólisis hidrolizando enlaces peptídicos
Tyr–Pro o Phe–Pro en las poliproteínas. La S H O OH H O N
actividad catalítica se centra en dos residuos Asp N NN N N S
(que se muestran en verde en el modelo que H
sigue), cada uno aportado por una subunidad de O O
la enzima homodimérica. La estructura en dorado Ritonavir
representa un análogo de sustrato peptídico. Las
cadenas laterales de los sustratos peptídicos se
unen en bolsillos hidrófobos cerca del sitio activo.

202 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

UN VISTAZO MÁS DE CERCA Continuación

voluminosas que imitan los sustratos Phe–Pro naturales de la ejemplo, los inhibidores de proteasa del VIH son antivirales
proteasa (los enlaces escindibles se muestran en rojo). eficaces porque las proteasas de mamífero no reconocen compues-
tos que contengan enlaces amida con Pro o análogos de Pro. Los
El saquinavir actúa como un inhibidor competitivo con KI de inhibidores análogos de nucleósido de la transcriptasa inversa se
0.15 nM (con fines de comparación, los sustratos peptídicos unen a las polimerasas del DNA de las células del hospedero,
sintéticos tienen valores de KM de alrededor de 35 μM). Los pero con menor afinidad que con la transcriptasa inversa del
esfuerzos por desarrollar otros fármacos se han concentrado en VIH. Aún así, los antivirales causan efectos secundarios que van
desde náusea y exantema hasta cálculos renales y deterioro
mejorar la solubilidad (y por tanto la biodisponibilidad) de los neurológico. Estos problemas pueden ser graves porque el
tratamiento eficaz de la infección por VIH requiere un enfoque
inhibidores de proteasa agregando grupos polares sin disminuir la de polifarmacia a fin de que las partículas virales puedan
eliminarse antes de que tengan la oportunidad de desarrollar
unión a la proteasa. Estos esfuerzos han generado, por ejemplo, el resistencia farmacológica mediante mutación.

ritonavir, con KI de 0.17 nM.
Uno de los desafíos para el desarrollo de antivirales es seleccio-

nar un blanco que sea exclusivo del virus, de modo que el fármaco

no altere las reacciones metabólicas normales del hospedero. Por

Otros tipos de inhibidores afectan Vmáx

Algunos inhibidores enzimáticos reversibles reducen la actividad de una enzima no
sólo interfiriendo en la unión al sustrato (como lo determina de manera aproximada
KM) sino también afectando kcat de manera directa. Esta situación suele presentarse
cuando el inhibidor se une a un sitio de la enzima distinto del sitio activo e induce un
cambio conformacional que afecta la estructura o las propiedades químicas del sitio
activo. Como resultado, la kcat y Vmáx aparente disminuyen pero KM no cambia. Esto
se llama inhibición no competitiva (figura 7-11). Sin embargo, a menudo la unión
del inhibidor a la enzima modifica su conformación de manera que tanto Vmáx como
KM se ven afectadas, aunque no necesariamente del mismo modo. Este fenómeno se
denomina inhibición mixta, y la KM aparente puede aumentar o disminuir. En la
figura 7-12 se presenta una gráfica de Lineweaver-Burk para la inhibición mixta.

S S
Enzima-sustrato
Enzima
I I

S

I IS

Enzima-inhibidor Enzima-sustrato-inhibidor

Figura 7-11. Inhibición enzimática no competitiva. El inhibidor y sustrato se unen
a sitios separados. La unión del inhibidor no impide la unión del sustrato, pero
modifica la actividad catalítica de la enzima (con lo que reduce la Vmáx aparente). En la
inhibición mixta, el inhibidor también afecta la unión del sustrato de modo que la KM
parece aumentar o disminuir.

7-3 Inhibición enzimática | 203

Figura 7-12. Efecto de un inhibidor V máx Sin inhibidor
sin Con inhibidor
mixto en la velocidad de reacción. El
inhibidor afecta tanto la unión del inhibidor
sustrato (representada por KM) como
kcat, de modo que la KM aparente se v0 V máx
eleva y la Vmáx disminuye. En algunos con
casos, la KM aparente puede aumentar o
permanecer sin cambio (inhibición no inhibidor
competitiva).

[S]

KM KM
sin con

inhibidor inhibidor

Los iones metálicos pueden actuar como inhibidores enzimáticos no competiti-
vos. Por ejemplo, iones trivalentes como el aluminio (Al3+) inhiben la actividad de la
acetilcolinesterasa, que cataliza la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina:

O

ϩ

H3C C O CH2 CH2 N(CH3)3 ϩ H2O Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

O OϪ ϩ HO CH2 CH2 ϩ ϩ Hϩ

H3C C Colina N(CH3)3

Acetato

Esta reacción limita la duración de determinados impulsos nerviosos (véase sección
9-4). El Al3+ inhibe la acetilcolinesterasa de manera no competitiva al unirse a la
enzima en un sitio distinto del sitio activo. En consecuencia, el Al3+ puede unirse a
la enzima libre o al complejo enzima-sustrato.

En una reacción multisustrato un inhibidor puede unirse a la enzima después de
que se ha unido un sustrato, de manera que impide que la reacción continúe y gene-
re producto (figura 7-13). En presencia de tal sustancia, llamada inhibidor acom-
petitivo, kcat es afectada de modo que la Vmáx aparente se reduce, y la KM aparente
disminuye en el mismo grado.

La inhibición competitiva puede distinguirse de la inhibición mixta, no compe-
titiva y acompetitiva porque el aumento de la concentración del sustrato revierte los
efectos de un inhibidor competitivo. Incrementar la concentración del sustrato no re-
vierte la inhibición mixta, no competitiva o acompetitiva porque el inhibidor no im-
pide la unión del sustrato al sitio activo.

SI

S
S

I

Enzima Enzima-sustrato Enzima-sustrato-inhibidor

Figura 7-13. Inhibición enzimática acompetitiva. El inhibidor se une a la enzima
después de que lo hace el sustrato. Como resultado, Vmáx y KM parecen reducirse en la
misma cantidad.

204 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

La regulación enzimática alostérica incluye inhibición
y activación

Las enzimas oligoméricas –las que tienen múltiples sitios activos en una proteína
multisubunitaria– suelen estar sujetas a regulación alostérica, que incluye inhibi-
ción así como activación. Del mismo modo en que la unión del ligando a una subu-
nidad de una enzima oligomérica puede modificar la actividad de los otros sitios
activos (como ocurre en el caso de la hemoglobina; sección 5-1), la unión del inhi-
bidor (o activador) a una subunidad de una enzima puede reducir (o incrementar) la
actividad catalítica de todas las subunidades.

Los efectos alostéricos son parte de la regulación fisiológica de la enzima fosfo-

fructocinasa, que cataliza la reacción

Ϫ2O3PO6 CH2 O 1 Ϫ2O3POC6 H2 O C1 H2OPO32Ϫ

CH2OH

H HO ϩ ATP Fosfofructocinasa H HO ϩ ADP
H OH H OH

HO H HO H

Fructosa 6-fosfato Fructosa 1,6-bisfosfato

Esta reacción de fosforilación es el paso 3 de la glucólisis, la vía de degradación de
glucosa que es una fuente importante de ATP en virtualmente todas las células (véa-
se sección 13-1). La reacción de la fosfofructocinasa es inhibida por fosfoenolpiru-
vato, el producto de la reacción 9 de la glucólisis:

O OϪ
C

C OPO32Ϫ

CH2

Fosfoenolpiruvato

El fosfoenolpiruvato es un ejemplo de retroinhibidor: cuando su concentración en
la célula es suficientemente alta, desactiva su propia síntesis bloqueando un paso
anterior en su vía biosintética:

Glucosa Fosfofructocinasa Fosfoenolpiruvato

La fosfofructocinasa de la bacteria Bacillus stearothermophilus es un
tetrámero con cuatro sitios activos. Las subunidades están dispuestas
como un dímero de dímeros (figura 7-14). Cada uno de los cuatro si-
tios de unión a fructosa 6-fosfato está formado por residuos de ambos
dímeros. La fosfofructocinasa de B. stearothermophilus se une a fructosa
6-fosfato con cinética hiperbólica y KM de 23 μM. En presencia de 300
μM del inhibidor fosfoenolpiruvato, la unión de fructosa 6-fosfato se
hace sigmoidea y la KM aumenta a alrededor de 200 μM (figura 7-15).
El inhibidor no afecta la Vmáx, pero la fosfofructocinasa se hace menos
activa porque su afinidad aparente por fructosa 6-fosfato disminuye.

Figura 7-14. Estructura de la fosfofructocinasa de B.
stearothermophilus. Las cuatro subunidades idénticas se disponen como
un dímero de dímeros (se muestra un dímero con subunidades azules y el
otro con subunidades púrpuras. (Estructura (pdb 6PKF) determinada por P.R. Evans,

T. Schirmer y M. Auer).

7-3 Inhibición enzimática | 205

Figura 7-15. Efecto del 1.0 Sin fosfoenolpiruvato
Con fosfoenolpiruvato
fosfoenolpiruvato en la 0.8
fosfofructocinasa. En ausencia de
inhibidor (línea verde), la v 0 0.6
fosfofructocinasa de B. V máx
stearothermophilus se une al sustrato
fructosa 6-fosfato con KM de 23 μM. En 0.4
presencia de fosfoenolpiruvato
300 μM (línea roja), KM aumenta a 0.2
alrededor de 200 μM. (Datos de Zhu, X.,

Byrnes, N., Nelson, J.W., y Chang, S.H.,

Biochemistry 34, 2560-2565 [1995]).

100 200 300 400 500 600 700
[6-fosfato de fructosa] (μM)

Figura 7-16. Cambio conformacional ¿Cómo ejerce sus efectos inhibitorios el fosfoenolpiruvato? La curva de velocidad
contra concentración de sustrato, sigmoidea (figura 7-15), indica que los sitios activos
que ocurre por la unión de de la fosfofructocinasa se comportan de manera cooperativa en presencia de fos-
foenolpiruvato. En cada subunidad, el inhibidor se une a un bolsillo que está separa-
fosfoenolpiruvato a fosfofructocinasa. do del sitio de unión a fructosa 6-fosfato del dímero vecino por un asa de proteína.
Cuando el fosfoenolpiruvato ocupa su sitio de unión, la proteína se cierra a su alre-
La estructura verde representa la dedor. Esto causa un cambio de conformación en el que dos residuos del asa cam-
conformación de la enzima que se une bian de posiciones: Arg 162 se aleja del sitio de unión a glucosa 6-fosfato de la
con facilidad al sustrato fructosa subunidad vecina y es sustituida por Glu 161 (figura 7-16). Este cambio conforma-
6-fosfato (F6P). La estructura roja cional aminora la unión de fructosa 6-fosfato porque la cadena lateral con carga po-
representa la enzima con un inhibidor sitiva de Arg 162, que ayuda a estabilizar el grupo fosfato (con carga negativa) del
alostérico unido (un análogo fructosa 6-fosfato, es reemplazado por la cadena lateral (con carga negativa) de Glu
fosfoenolpiruvato, PEP). La unión de 161, que repele al grupo fosfato. El efecto del fosfoenolpiruvato se transmite a toda la
fosfoenolpiruvato a la enzima causa un proteína (lo cual explica el efecto cooperativo) porque la unión del fosfoenolpiruvato
cambio conformacional en el que Arg a una subunidad de la fosfofructocinasa afecta la unión de fructosa 6-fosfato a la subu-
162 (que forma parte del sitio de unión nidad vecina en el otro dímero. Usando la terminología para las proteínas alostéricas,
a fructosa 6-fosfato de la subunidad la unión del fosfoenolpiruvato hace que todo el tetrámero cambie a la conformación T
vecina) cambia de lugar con Glu 161. (baja actividad), según se mide por la afinidad de unión a fructosa 6-fosfato. Por tanto
Dado que las subunidades actúan de el fosfoenolpiruvato se considera un efector negativo de la enzima.
manera cooperativa, el inhibidor
disminuye la unión de sustrato a la La fosfofructocinasa es inhibida alostéricamente por el fosfoenolpiruvato, pero
enzima completa, haciendo que la KM también puede ser activada de modo alostérico por ADP, un efector positivo de la
aumente. (Según Schirmer, T., y Evans, P.R., enzima. Aunque el ADP es un producto de la reacción de la fosfofructocinasa, también

Nature 343, 142 [1990]). F6P Glu PEP
Glu − Arg

− +
−+

Arg

206 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

es una señal general que indica la necesidad de la célula de más ATP, dado que el Vesícula 2
consumo metabólico de ATP genera ADP:
Retículo 3
ATP ϩ H2O ADP ϩ Pi endioplásmico

En virtud de que la fosfofructocinasa cataliza el paso 3 de la vía glucolítica de 10
pasos (uno de cuyos últimos productos es ATP), incrementar la actividad de la fos-
fofructocinasa podría elevar la tasa de producción de ATP por la vía en su conjunto.

Resulta interesante el hecho de que el ADP activador no se une al sitio activo
(que da cabida al sustrato ATP y al producto de la reacción ADP) sino al mismo
sitio en que se une el inhibidor fosfoenolpiruvato. Pero dado que el ADP es más
grande que el fosfoenolpiruvato, la enzima no puede cerrarse a su alrededor, y el
cambio conformacional al estado T de baja actividad no puede ocurrir. En cambio,
la unión del ADP fuerza a Arg 162 a permanecer donde pueda estabilizar la
unión de fructosa 6-fosfato (en otras palabras, ayuda a mantener la enzima en el
estado R de alta actividad). El resultado global es que el ADP contrarresta el efecto
inhibitrio del fosfoenolpiruvato y fomenta la actividad de la fosfofructocinasa.

Varios factores pueden influir en la actividad Núcleo 1
4
enzimática PO32−

Se ha examinado el modo en que moléculas pequeñas que se unen a una enzima
inhiben (o a veces activan) esa enzima. Estos fenómenos relativamente simples
no son el único medio para regular la actividad enzimática in vivo. Enseguida y
en la figura 7-17 se enumeran algunos mecanismos adicionales. Debe tenerse
presente que varios de estos mecanismos, junto con la inhibición o activación
enzimáticas, pueden operar de manera concertada para ajustar de manera precisa
la actividad de una enzima dada.

1. Un cambio en la velocidad de síntesis o degradación de una enzima puede al- Figura 7-17. Algunos mecanismos
terar la cantidad de enzima disponible para catalizar una reacción (dado que Vmáx
= kcat[E]T; ecuación 7-23). para regular la actividad enzimática.

2. Un cambio en la localización subcelular, por ejemplo desde una membrana intra- En este diagrama las enzimas se
celular hasta la superficie celular, puede colocar la enzima en proximidad con su muestran como formas circulares, los
sustrato y de este modo incrementar la velocidad de reacción. El efecto opuesto – sustratos como triángulos y los
secuestrar una enzima respecto de su sustrato– amortigua la velocidad de reacción. productos como cuadrados. La cantidad
de enzima puede depender de sus
3. Una “señal” iónica, como un cambio de pH o la liberación de iones Ca2+ alma- velocidades de síntesis y degradación
cenados, puede activar o desactivar una enzima modificando su conformación. (1). La velocidad de reacción puede
depender de la localización de la enzima
4. La modificación covalente de una enzima puede afectar la KM o kcat de la enzima, (2). Una señal como una oleada de iones
del mismo modo en que ocurre con un activador o inhibidor alostérico. Con mayor Ca2+ liberados desde el retículo
frecuencia, un grupo fosforilo (–PO32–) o un grupo grasoacilo (lípido) se agrega a endoplásmico puede afectar la actividad
una enzima para modificar su actividad catalítica. Se considera que los efectos de la enzimática (3). La modificación
modificación covalente en realidad son reversibles, dado que las células contienen covalente, como la fosforilación, puede
enzimas que catalizan la eliminación del grupo modificador así como su adición. activar una enzima; la enzima puede ser
Como se verá en el capítulo 10, sobre señalización, la fosforilación y desfosforilación inactiva cuando se desfosforila (4).
pueden modificar de manera impresionante las actividades de ciertas proteínas.

REPASO DE CONCEPTOS

• ¿Por qué un agente que modifica químicamente un residuo aminoácido a veces
actúa como un inhibidor enzimático irreversible?

• ¿Cuál es el significado de la KI y cómo se determina ésta?
• ¿De qué manera un inhibidor competitivo afecta la KM y Vmáx?
• ¿Por qué algunos productos de reacción y análogos del estado de transición

actúan como inhibidores enzimáticos competitivos?
• ¿De qué manera los inhibidores no competitivos, mixtos y acompetitivos afectan

la KM y Vmáx?
• ¿Cómo pueden distinguirse las inhibiciones no competitiva, mixta y acompetitiva

de la inhibición competitiva?
• ¿Cómo se inhibe y activa alostéricamente la fosfofructocinasa?
• Enumere todas las maneras en que una célula podría regular la actividad de una

enzima.

7-3 Inhibición enzimática | 207

RESUMEN

7-1. Introducción a la cinética enzimática de una enzima porque explica tanto el enlace como las acti-

• Las ecuaciones de velocidad describen la rapidez con que vidades catalíticas de la enzima.
ocurren las reacciones unimoleculares (de primer orden) o • Los valores para la KM y Vmáx (a partir de las cuales puede
bimoleculares (de segundo orden) en términos de una cons-
tante de velocidad. calcularse la kcat) a menudo se deducen mediante gráfi-
cas de Lineweaver-Burk o dobles recíprocas. No todas
7-2. Deducción y significado de la ecuación las reacciones enzimáticas obedecen el modelo simple de
de Michaelis-Menten Michaelis-Menten, pero aún así pueden estimarse sus pa-
rámetros enzimáticos.
• Una reacción catalizada por enzima puede describirse me-
diante la ecuación de Michaelis-Menten. La velocidad glo- 7-3 Inhibición enzimática
bal de la reacción depende de las velocidades de formación
y degradación de un complejo enzima-sustrato (ES). • Algunas sustancias reaccionan de manera irreversible con
enzimas para bloquear de modo permanente la actividad
• La constante de Michaelis (KM) es una combinación de catalítica.
las tres constantes de velocidad aplicables al complejo ES.
También equivale a la concentración del sustrato a la cual la • Los inhibidores enzimáticos reversibles más comunes, que
enzima funciona a la mitad de la velocidad máxima. La ve- pueden ser análogos del estado de transición, compiten con
locidad máxima se alcanza cuando la enzima está saturada el sustrato para unirse al sitio activo, con lo cual incremen-
por completo con sustrato. tan la KM aparente.

• La constante catalítica (kcat) de una reacción es la constante • Los inhibidores enzimáticos reversibles que afectan la Vmáx
de velocidad de primer orden para la conversión del com- de una enzima pueden ser no competitivos, mixtos o acom-
plejo enzima-sustrato en producto. El cociente kcat/KM, una petitivos.
constante de velocidad de segundo orden para la conversión
global de sustrato en producto, indica la eficiencia catalítica • Las enzimas oligoméricas como la fosfofructocinasa bacte-
riana son reguladas por inhibidores y activadores alostéricos.

• Las actividades de las enzimas también pueden ser regula-
das por concentración de la enzima, ubicación, concentra-
ciones iónicas y modificación covalente.

GLOSARIO Enzima alostérica Número de recambio
Estado estable Perfección catalítica
Análogo del estado de transición Farmacocinética Poliproteína
Cinética Gráfica de Lineweaver-Burk Reacción bimolecular
Complejo EI Inhibición acompetitiva Reacción bisustrato
Complejo ES Inhibición competitiva Reacción de primer orden
Constante catalítica (kcat) Inhibición mixta Reacción de segundo orden
Constante de inhibición (KI) Inhibición no competitiva Reacción unimolecular
Constante de Michaelis (KM) Inhibición por producto Regulación alostérica
Constante de velocidad (k) Inhibidor irreversible Retroinhibidor
Cooperatividad kcat/KM Saturación
Diseño racional de fármacos Límite controlado por difusión Sustrato suicida
Ecuación de Michaelis-Menten Mecanismo aleatorio Terminador de cadena
Ecuación de velocidad Mecanismo de ping pong v
Efector negativo Mecanismo ordenado v0
Efector positivo Vmáx
Ensayo clínico

208 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

PROBLEMAS

7-1. Introducción a la cinética enzimática ecuación de velocidad para la reacción que sea consistente con estas
observaciones. ¿Cuál es el orden de la reacción?
1. Cuando los científicos comenzaron a analizar la curva de velo-
cidad contra concentración de sustrato hiperbólica (figura 7-3), 9. Remítase a la ecuación de velocidad que escribió para el proble-
Emil Fischer formulaba su hipótesis de cerradura y llave de la acción ma 8 y al ejemplo de cálculo 7-1 para determinar la velocidad de la
enzimática (véase sección 6-3). Explique por qué los datos cinéticos reacción no catalizada cuando la concentración de sacarosa es de
son consistentes con el modelo de Fischer de acción enzimática. 0.050 M. La constante de velocidad k para la reacción no catalizada
es de 5.0 ϫ 10–11 s–1.
2. Explique por qué suele ser más fácil calcular la velocidad de
reacción de una enzima a partir de la rapidez de aparición del pro- 10. Repita el cálculo que realizó en el problema 9 para la hidrólisis
ducto que a partir de la rapidez de desaparición del sustrato. catalizada por enzima de la sacarosa. La constante de velocidad k
para la reacción catalizada es de 1.0 ϫ 104 s–1.
3. La hidrólisis de sacarosa a glucosa y fructosa es muy lenta en
ausencia de un catalizador. 11. ¿Cuáles porciones de la curva de velocidad contra concentra-
ción de sustrato (figura 7-3) corresponden a procesos de primero y
Sacarosa ϩ H2O Glucosa ϩ Fructuosa segundo orden?

Si la concentración inicial de sacarosa es de 0.050 M, se re- 12. Trace curvas que muestren las relaciones apropiadas entre las
quieren 440 años para que la concentración de la sacarosa dis- variables de cada gráfica.
minuya a la mitad a 0.025 M. ¿Cuál es la velocidad de desaparición
de la sacarosa en ausencia de un catalizador? (a) (b)

4. Si está presente un catalizador, la hidrólisis de sacarosa (proble- [P] [S]
ma 3) es mucho más rápida. Si la concentración inicial de sacarosa
es de 0.050 M, se requieren 6.9 ϫ 10–5 s para que la concentración Tiempo Tiempo
disminuya a la mitad, a 0.025 M. ¿Cuál es la velocidad de desapari-
ción de la sacarosa en presencia de un catalizador? (c) (d)
v0
5. Una enzima bacteriana cataliza la hidrólisis de maltosa como se [ES]
muestra en la ecuación.
[E] Tiempo
Maltosa ϩ H2O 2 Glucosa

Durante el intervalo de un minuto, la concentración de maltosa
disminuye en 65 mM. ¿Cuál es la velocidad de desaparición de la
maltosa en la reacción catalizada por enzima?

6. En la reacción que se muestra en el problema 5, ¿cuál es la ra-
pidez de aparición de la glucosa?

7-2. Deducción y significado de la ecuación (e)
de Michaelis-Menten v0

7. Complete el cuadro para las siguientes reacciones de un paso:

Reacción Ecuación [S]
Molecularidad de velocidad Unidades de k
13. Usted intenta determinar la KM midiendo la velocidad de re-
A BϩC acción a diferentes concentraciones, pero no advierte que el sustrato
AϩB C tiende a precipitarse bajo las condiciones experimentales que usted
2A B eligió. ¿Cómo afectaría esto su medición de la KM?
2A BϩC
14. Usted está construyendo una curva de velocidad contra con-
Reacción Velocidad de Orden centración de sustrato para una enzima cuya KM se piensa que es de
reacción proporcional a: alrededor de 2 μM. La concentración de la enzima es de 200 nM y
las concentraciones de sustrato varían de 0.1 μM a 10 μM. ¿Qué es
A BϩC incorrecto en el diseño experimental y cómo podría corregirse?

AϩB C 15. ¿Es necesario que las mediciones de velocidad de reacción se
expresen en unidades de concentración por unidad de tiempo (p. ej.,
2A B M/seg) a fin de calcular la KM de una enzima?

2A BϩC 16. La reacción catalizada por enzima descrita en el problema 5
8. La velocidad de la reacción descrita en el problema 3 se duplica tiene KM de 0.135 mM y Vmáx de 65 μmol · min–1. ¿Cuál es la veloci-
dad de reacción cuando la concentración de maltosa es de 1.0 mM?
cuando la concentración de sacarosa se duplica. La velocidad de re-
acción no es afectada por la concentración de agua. Escriba una Problemas | 209

17. Utilice la gráfica siguiente a fin de estimar valores de KM y 24. La formación de un complejo enzima-sustrato para una reac-
Vmáx para una reacción catalizada por enzima. ción de un sustrato puede expresarse como E + S ES. Para una
reacción enzimática con dos sustratos (A y B) la expresión sería E +
40 A + B EAB. Explique por qué este proceso se aborda como dos
reacciones bimoleculares y no como una sola reacción termolecular
v 0 (µM/s) (de tres reactivos).
20
25. Se muestran los valores de la KM para la reacción de quimo-
tripsina con dos diferentes sustratos.

Sustrato K M (M)

N-acetilvalinato de etilo 8.8 ϫ 10Ϫ2
N-acetiltirosinato de etilo 6.6 ϫ 10Ϫ4

5 10 15 20 a) ¿Cuál sustrato tiene la mayor afinidad aparente por la enzima?
[S] (µM) Aplique lo que aprendió sobre la quimotripsina en el capítulo 6
para explicarlo.
18. Estime la KM para cada enzima a partir de la gráfica mostrada. b) ¿Cuál sustrato es probable que dé un valor más alto para Vmáx?
¿Cuál enzima generaría producto más rápido cuando a) [S] = 1 μM
y b) [S] = 10 μM? 26. La enzima hexocinasa actúa tanto en la glucosa como en la
fructosa. En el cuadro se dan los valores de KM y Vmáx. Usando esos
Enzima B datos, compare y contraste la interacción de la hexocinasa con am-
5.0 bos sustratos.

Enzima A Sustrato K M (M) Vmáx (relative)

Glucosa 1.0 ϫ 10–4 1.0
Fructosa 7.0 ϫ 10–4 1.8

v 0 (nM/s) 27. Considere los siguientes datos de reacción para el sustrato S:
2.5

Reacción Enzima KM Vmáx
50 μM 100 nM/s
SP A 5 mM 120 nM/s
SQ B

246 8 Se realiza una reacción en la cual se agrega S 100 μM a una mez-
[S] (μM) cla que contiene cantidades equivalentes de las enzimas A y B.
Después de un minuto, cuál producto de reacción será más abun-
19. ¿Qué relación existe entre la KM y [S] cuando una reacción dante: ¿P o Q?
catalizada por enzima procede a a) 75% de Vmáx y b) 90% de Vmáx?
28. Utilice los datos que se proporcionan para determinar si las
20. Cuando [S] = 5 KM, ¿cuán cerca está v0 de Vmáx? Cuando [S] reacciones catalizadas por las enzimas A, B y C son controladas por
= 20 KM, ¿cuán cerca está v0 de Vmáx? ¿Qué indican estos resultados difusión.
acerca de la exactitud de estimar Vmáx a partir de una gráfica de v0
contra [S]? Enzima KM kcat

21. ¿Es necesario conocer [E]T a fin de determinar a) KM, b) Vmáx A 0.3 mM 5000 sϪ1
y c) kcat? B 1 nM 2 sϪ1
C 2 ␮M 850 sϪ1
22. La Vmáx de una reacción catalizada por enzima fue de 4.77
mM/seg en presencia de enzima 9.0 μM. ¿Cuál es el valor de la kcat? 29. La enzima γ-glutamilcisteína sintetasa (γ-GCS) del proto-
¿Cuál es el significado de la kcat? zoario Trypanosoma brucei, causante de la enfermedad del sueño afri-
cana, cataliza el primer paso de la biosíntesis de tripanotiona, un
23. Se muestra una gráfica de Lineweaver-Burk para tres diferen- compuesto que el parásito requiere para mantener un balance redox
tes reacciones catalizadas por enzima. apropiado.

a) ¿Cuál reacción tiene el valor más alto de KM? Acido aminobutírico ϩ glutamato ϩ ATP
b) ¿Cuál reacción tiene el valor más alto de Vmáx? γ-GC tripanotiona

1 Se han medido los valores de la KM para cada uno de los sustratos.
v0

E1 E2 Sustrato K M (mM)
AB CD
Glutamato 5.9
E3 Ácido aminobutírico 6.1
EF ATP 1.4

1 a) ¿Obedece esta reacción la cinética de Michaelis-Menten?
[S]

210 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

b) Describa cómo se determinaron los valores de la KM para cada e) ¿Sería la susbtilisina como aditivo de detergentes eficaz para
uno de los tres sustratos. eliminar de la ropa manchas a base de proteínas (como leche o
c) ¿Cómo se alcanzaría Vmáx para la reacción de la γ-GCS? sangre)?
30. En fecha reciente se purificó una galactosiltransferasa, β3-
GalT. La enzima β3-GalT cataliza la reacción que se muestra, un 32. La aspartato aminotransferasa (AspAT) cataliza la siguiente
paso temprano en la producción de glicoproteínas importantes reacción:
para el reconocimiento inmunitario.
NHϩ3 CH COOϪ ␣-A-aminoácido COOϪ
␤3–GalT Ser CH2 Asp-AT
UDP–Gal ϩ Ser CO

GalNac GalNac COOϪ ␣-Cetoácido CH2
Gal COOϪ
UDP
Oxalacetato
Se midió la velocidad enzimática en presencia de UDP-[3H] Aspartato
Gal y un sustrato donador parecido al sustrato que se muestra
en la figura. Utilice la gráfica de Lineweaver-Burk dada para deter- La enzima aspartato aminotransferasa tiene dos argininas en el si-
minar la KM y Vmáx para la enzima β3-GalT. tio activo, Arg 386 y Arg 292, que interactúan con los grupos α-
carboxilato y β-carboxilato del sustrato aspartato, en ese orden. Se
1/actividad de β3-GalT (μM−1 · h) 0.0060 construyeron enzimas AspAT mutantes en las cuales alguna o ambas
argininas esenciales se sustituyeron por lisina. En el cuadro se muestran
los parámetros cinéticos para las enzimas silvestre y mutantes.

y ϭ 0.26x ϩ 4.41 ϫ 10−4 K M Aspartate kcat (sϪ1)
(mM)
0.0040 Enzima 530
4 4.5
0.0020 AspAT silvestre (Arg 292 Arg 386) 326 9.6
AspAT mutante (Lys 292 Arg 386) 72 0.055
AspAT mutante (Arg 292 Lys 386) 300
AspAT mutante (Lys 292 Lys 386)

−0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 a) Compare la capacidad del aspartato de unirse a las enzimas
silvestre y mutante.
1/UDP–Gal (μM−1) b) ¿Por qué la sustitución de arginina por lisina afecta la unión
del sustrato a AspAT?
31. La subtilisina, una serinproteasa producida por bacterias Ba- c) Evalúe la eficiencia catalítica de las enzimas silvestre y mutante.
cillus, se emplea en las industrias de los detergentes y procesamiento d) ¿Por qué la sustitución de arginina por lisina afecta la activi-
de alimentos. Los ingenieros en proteínas construyeron una enzima dad catalítica de la enzima?
subtilisana mutante en un intento por mejorar su actividad catalíti-
ca. La isoleucina en la posición 31 (adyacente al residuo Asp en la 7-3. Inhibición enzimática
tríada catalítica Asp–His–Ser) se sustituyó por leucina. Tanto la en-
zima mutante como la silvestre se probaron en cuanto a su actividad 33. Con base en algunas mediciones preliminares, usted sospecha
catalítica usando el sustrato artificial N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe- que una muestra de enzima contiene un inhibidor irreversible. De-
p-nitroanilida (AAPF). Los resultados se muestran en el cuadro. cide diluir la muestra 100 veces y volver a medir la actividad enzimá-
tica. ¿Qué revelará su resultado si el inhibidor en la muestra es a)
Enzima K M (mM) k cat (sϪ1) k cat/K M (mMϪ1 и sϪ1) irreversible o b) reversible?

Subtilisina E 1.9 Ϯ 0.2 21 Ϯ 4 11 34. ¿De qué manera el diisopropilfosfofluoridato (DIPF) afecta la
KM y Vmáx aparentes de una muestra de quimotripsina?
silvestre (Ile 31)
35. Los inhibidores de la acetilcolinesterasa, como el edrofonio, se
Subtilisina E 2.0 Ϯ 0.3 120 Ϯ 15 60 emplean para tratar la enfermedad de Alzheimer. El sustrato de la
acetilcolinesterasa es la acetilcolina. Se muestra la estructura de am-
mutante (Leu 31) bas moléculas.

a) Explique cómo se mide la velocidad de reacción usando el H3C O CH3 H3C OH
sustrato AAPF. ϩN CH3 H3C Nϩ
b) ¿Qué efecto tiene el reemplazo de Ile por Leu en la posición O
31 sobre la actividad catalítica de la subtilisina E para la hidróli- CH3 H3C
sis de AAPF? Comente sobre los valores de la KM y Vmáx.
c) Se probó la capacidad de ambas enzimas de escindir enlaces Acetilcolina Edrofonio
peptídicos en un sustrato “natural”, la caseína de la leche. Los
resultados se muestran en el cuadro. Compare las actividades de
las dos enzimas para el sustrato caseína.

Enzima Actividad específica (unidades/mg) a) ¿A qué tipo de inhibidores pertenece el edrofonio? Explique.
b) ¿Es posible contrarrestar la inhibición por edrofonio in vitro
Subtilisina E silvestre (Ile 31) 109 Ϯ 9 incrementando la concentración de sustrato? Explique
Subtilisina E mutante (Leu 31) 297 Ϯ 30 c) ¿Se une este inhibidor de manera reversible o irreversible a la
enzima? Explique.
d) ¿Por qué la sustitución Ile Leu altera la eficiencia catalítica
de la enzima?

Problemas | 211

36. El compuesto indol es un inhibidor de la enzima quimotrip- H OH HH
sina. Aplicando lo que sabe sobre la especificidad de sustrato de la N N
quimotripsina e inhibición enzimática, conteste lo siguiente:
ON ON
a) ¿A qué tipo de inhibidores pertenece el indol? Explique.
b) Compare los valores de la KM y Vmáx en presencia y ausencia Ribosa Ribosa
del inhibidor, y explique su respuesta.
A B

HN Los compuestos tienen valores de KI de 3 ϫ 10–5 M y 1.2 ϫ
10–12 M. Asigne el valor de KI apropiado a cada inhibidor. ¿Cuál
Indol compuesto es el inhibidor más eficaz? Dé una base estructural para
su respuesta.
37. Explique por qué existen tan pocos ejemplos de inhibidores
que reducen la Vmáx pero no afectan la KM. 42. La enzima neuraminidasa del virus de la gripe hidroliza resi-
duos ácido siálico de glucoproteínas de la superficie celular. Esta ac-
38. Mediante estudios de modelado por computadora se ha de- tividad ayuda a los virus recién formados a escapar de la célula hos-
mostrado que los inhibidores acompetitivos y no competitivos son pederas. Los fármacos oseltamivir y zanamivir son análogos del
más eficaces que los inhibidores competitivos. Tales estudios tienen estado de transición que inhiben la neuraminidasa y de este modo
importantes implicaciones para el diseño de fármacos. Proponga bloquean la infección viral. Las cepas silvestre y mutante del virus de
una hipótesis que explique estos resultados. la gripe, en la cual el residuo 274 de la neuraminidasa cambia de His
a Tyr, exhiben los siguientes parámetros cinéticos:
39. La glucosa 6-fosfato deshidrogenasa cataliza la siguiente reac-
ción:

glucosa 6-fosfato ϩ NADPϩ K M del ácido siálico Vmáx
(μM) (unidades
6-fosfogluconolactona ϩ NADPH relativas)
Enzima silvestre 6.3
La KM para glucosa 6-fosfato en levadura es de 2.0 ϫ 10–5 M. La Enzima mutante His274Tyr 27.0 1.0
KM para el NADP+ es de 2.0 ϫ 10–6 M. La enzima glucosa 6-fosfato 0.8
deshidrogenasa puede ser inhibida por varios agentes celulares cuyos
valores de la KI se presentan en el cuadro siguiente.

Inhibidor K I (M) KI del oseltamivir KI del zanamivir
1.0 ϫ 10Ϫ1 (nM) (nM)
Fosfato inorgánico 7.2 ϫ 10Ϫ4
Glucosamina 6-fosfato 2.7 ϫ 10Ϫ5 Enzima silvestre 0.32 0.1
NADPH Enzima mutante His274Tyr 85 0.19

a) ¿Cuál es el inhibidor más eficaz? a) ¿Cuál fármaco funcionaría mejor para el virus silvestre?
b) ¿Cuál o cuáles inhibidores es probable que sean del todo inefi- b) ¿Parece afectar la mutación la unión al sustrato o el recambio?
caces en condiciones celulares normales? Explique. c) ¿De qué manera la mutación afecta la inhibición por oselta-
mivir o zanamavir? ¿Cuál fármaco sería más eficaz contra la cepa
40. La enzima bacteriana prolina racemasa cataliza la interconver- mutante del virus de la gripe?
sión de dos isómeros de la prolina:
43. Se realiza una reacción en presencia y ausencia de un inhibi-
COOϪ Ϫ COOϪ H dor, y las velocidades iniciales se grafican contra concentración de
NHϩ2 H NHϩ2 NHϩ2 COOϪ sustrato. Los resultados se muestran en la gráfica. ¿De qué tipo de
inhibidor se trata? Explique.
El compuesto que sigue es un inhibidor de la prolina racemasa.
Explique por qué.

COOϪ v 0 (μM/s) 50
NH Sin inhibidor
41. La citidina desaminasa cataliza la siguiente reacción:
Con inhibidor
25

NH2 NH2 OH O
N N NH

ON ON ON 10 20 30 40
[S] (mM)
Ribosa Ribosa Ribosa
44. La enzima tirosinasa cataliza reacciones que generan produc-
Citidina Uridina tos de color pardo. En los mamíferos, es responsable de la produc-
ción de melanina en la piel; en plantas, es la causa del color marrón
Los dos compuestos que siguen inhiben la reacción.

212 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

de alimentos como manzanas o setas que se cortan y exponen al aire. Lys NH2
Los bromatólogos interesados en impedir el proceso de oscureci- Ala Nle
miento en alimentos de origen vegetal han demostrado que el dode- Arg O Ala
cilgalato es un inhibidor de la tirosinasa. Utilizando la gráfica de Val Nle NH CH C NH Glu
Lineweaver-Burk que se muestra, calcule la Vmáx y KM para la enzima
en presencia y ausencia del inhibidor. ¿A qué tipo de inhibidores CH2
pertenece el dodecilgalato?
I/v (OD−1.min) Lys NO2 NH2
10 Nle
Ala H2O Proteasa del VIH-1 Ala
y ϭ 1.58x ϩ 4.27 Arg Glu
8
Val Nle NH CH COOϪ ϩ NHϩ3
6

4

2 y ϭ 1.52x ϩ 1.51

−3.0 −2.0 −1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 Absorbe luz a 295 nm CH2

1/[S] (mM−1)

Sin inhibidor Con dodecilgalato

45. La proteinfosfatasa 1 (PP1, por sus siglas en inglés) cataliza NO2
una reacción que genera productos los cuales regulan la división ce-
lular; en consecuencia, PP1 es un posible blanco de fármacos para Se realizaron ensayos cinéticos en presencia (10 μM) y ausen-
tratar determinados tipos de cáncer. La enzima PP1 cataliza la hidró- cia de p6*. Los datos se muestran en el cuadro.
lisis de un grupo fosfato a partir de la proteína básica de mielina
(MBP, por sus siglas en inglés). La reacción es: [FDP] (μM) v0 sin p6* v0 con p6*
(nmol · min–1) (nmol · min–1)
MBP-fosfato PP1 MBP ϩ Pi 10
15 4.63 2.70
Se midió la actividad de la PP1 en presencia y ausencia del 20 5.88 3.46
inhibidor ácido fosfatídico (PA, por sus siglas en inglés). La con- 25 6.94 4.74
centración de PA fue de 300 nM. 30 9.26 6.06
40 10.78 6.49
v0 sin PA v0 con PA 50 12.14 8.06
[MBP] (nmol de Pi liberados (nmol de Pi liberados 14.93 9.71
(mg/mL)
· mL–1 · min–1) · mL–1 · min–1) a) Construya una gráfica de Lineweaver-Burk y determine la KM
0.010 y Vmáx en presencia y ausencia del inhibidor.
0.015 0.0209 0.00381 b) ¿A qué tipo de inhibidores pertenece p6*? Explique.
0.025 0.0335 0.00620 c) Calcule la KI del inhibidor.
0.050 0.0419 0.00931
0.0838 0.0140 47. La enzima fosfatasa PTB1B cataliza la eliminación de grupos
fosfato de proteínas específicas e interviene en el mecanismo de ac-
a) Utilice los datos que se proporcionan para construir una ción de la insulina. Inhibidores de fosfatasa como el vanadato pue-
gráfica de Lineweaver-Burk para la enzima PP1 en presencia y den ser útiles en el tratamiento de la diabetes. La actividad de
ausencia de PA. ¿Qué tipo de inhibidor es PA? PTB1B se midió en presencia y ausencia de vanadato empleando un
b) Informe los valores de la KM y Vmáx para PP1 en presencia y sustrato artificial, difosfato de fluoresceína (FDP), el cual genera un
ausencia del inhibidor. producto que absorbe luz. La reacción se muestra enseguida; los da-

46. La proteasa del VIH-1, una enzima importante en el ciclo tos se presentan en el cuadro.
vital del virus de la inmunodeficiencia humana 1, es un buen blanco
farmacológico para el tratamiento de la infección por VIH y SIDA. difosfato de fluoresceína PTP1B
Una proteína producida por el virus, p6*, es un inhibidor de la pro-
teasa del VIH-1. La actividad de la proteasa se midió en presencia y Monofosfato de fluoresceína
ausencia de p6* mediante un ensayo con un sustrato artificial, como (absorbe luz a 450 nm) + HPO42–
se muestra.
[FDP] (mM) v0 sin vanadato v0 con vanadato
(nM и s–1) (nM и s–1)

6.67 5.7 0.71
10 8.3 1.06
20 12.5 2.04
40 16.7 3.70
100 22.2 8.00
200 25.4 12.5

Problemas | 213

a) Construya una gráfica de Lineweaver-Burk usando los datos a) Construya una gráfica de Lineweaver-Burk usando los datos
suministrados. Calcule la KM y Vmáx para PTB1B en ausencia y que se proporcionan. Calcule la KM y Vmáx para la enzima fosfa-
presencia de vanadato. tasa alcalina en ausencia y en presencia de homoarginina.
b) ¿A qué tipo de inhibidores pertenece el vanadato? Explique. b) ¿A qué tipo de inhibidores pertenece la homoarginina? Explique.
c) Una manera alternativa de calcular la KI para un inhibidor c) La homoarginina no inhibe la fosfatasa alcalina que se
consiste en medir la velocidad de la reacción catalizada por encuentra en el intestino. ¿Cuál podría ser la causa de que la ho-
enzima en presencia de cantidades crecientes de inhibidor y una moarginina inhiba la fosfatasa alcalina ósea pero no la intestinal?
cantidad constante de sustrato. Estos datos se muestran en el
cuadro que sigue para una concentración de sustrato de 6.67 49. La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la formación
μM. A fin de calcular la KI, se despeja α en la ecuación 7-28.
Luego se construye una gráfica de α contra [I]. Dado que α = 1 de N-carbamil aspartato a partir de carbamil fosfato y aspartato,
+ [I]/KI, la pendiente de la recta es igual a 1/KI. Determine la KI
para el vanadato por este método. un paso en el proceso multienzimático que sintetiza trifosfato de

citidina (CTP).

Carbamil fosfato ϩ aspartato ATCasa

N-carbamil aspartato UMP UTP CTP

[Vanadato] (␮M) v0 (nM и s–1) Los estudios cinéticos de la actividad de ATCasa como función
de la concentración de acetato generan los resultados que se
0.0 5.70 muestran en la gráfica.
0.2 3.83
0.4 3.07 Actividad relativa (%) 100 con ATP
0.7 2.35
1.0 2.04 sin CTP ni ATP
2.0 1.18
4.0 0.71

48. Se ha demostrado que la homoarginina inhibe la actividad de con CTP
una fosfatasa alcalina presente en el hueso. Las enzimas fosfatasas
alcalinas están ampliamente distribuidas en los tejidos, y a menudo 0
sus concentraciones séricas se emplean como herramienta diagnósti- [Aspartato] (mM)
ca en diversas enfermedades. El sustrato artificial fosfato de fenilo se
incubó con fosfatasa alcalina ósea en presencia de homoarginina 4 a) ¿Es la ATCasa una enzima alostérica? ¿Cómo lo sabe?
mM. Los datos se presentan en el cuadro. b) ¿A qué tipo de efectores pertenece el CTP? Explique. ¿Cuáles
son las implicaciones biológicas del efecto del CTP en la ATCasa?
[Fosfato de fenilo] v0, sin inhibidor v0, con inhibidor c) ¿A qué tipo de efectores pertenece el ATP? Explique. ¿Cuáles
(mM) (mM и min–1) (mM и min–1) son las implicaciones biológicas del efecto del ATP en la ATCasa?

4.00 1.176 0.476 50. Se piensa que el estado redox de la célula (la probabilidad de
2.00 0.909 0.435 que determinados grupos sean oxidados o reducidos) regula las acti-
1.00 0.667 0.385 vidades de algunas enzimas. Explique de qué manera la formación
0.67 0.556 0.333 reversible de un enlace disulfuro intramolecular (–S–S–) a partir de
0.50 0.455 0.286 dos grupos Cys–SH podría afectar la actividad de una enzima.
0.33 0.345 0.244

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Schramm VL, Enzymatic transition state theory and transition Wlodawer A, Vondrasek J: Inhibitors of HIV-1 protease: a
state analogue design, J. Biol. Chem. 2007;282:28297–28300. major success of structure-assisted drug design, Annu. Rev. Bio-
[Describe el funcionamiento de los inhibidores análogos del es- phys. Biomol. Struct. 1998;27, 249–284. [Revisa el desarrollo de
tado de transición, con ejemplos.] algunos inhibidores de proteasa del HIV-1.]

Segel IH: Enzyme Kinetics, Wiley, 1975. [Se concentra en las
ecuaciones que describen la actividad enzimática y diversas for-
mas de inhibición.]

214 | CAPÍTULO 7 Cinética e inhibición enzimáticas

LÍPIDOS Y MEMBRANAS capítulo

8

El aguijón de una abeja inflige relativamente poco daño; es
el veneno que inyecta lo que induce dolor e hinchazón en la
víctima del pinchazo de la abeja. Entre los compuestos irritantes
presentes en el veneno se encuentran melitina y fosfolipasa A2.
La melitina, un péptido de 26 residuos, se pliega en una hélice α
que interactúa con las membranas celulares y ocasiona fugas. Las
membranas celulares también son dañadas por la acción hidrolítica
de la enzima fosfolipasa. La degradación de los lípidos de
membrana a su vez libera moléculas señalizadoras que contribuyen
aún más al dolor y la inflamación asociados con el pinchazo de una
abeja.

ESTE CAPÍTULO EN CONTEXTO

EEl capítulo 8 es el primero de una serie de tres que se dedican a las membranas. En
este capítulo se presentan los lípidos y sus diversas funciones, incluida la formación
de bicapas lipídicas. Una comprensión de la estructura de las membranas facilitará
entender los procesos metabólicos que dependen de manera directa de la integri-
dad de las membranas de las mitocondrias (fosforilación oxidativa, véase capítulo
15) y los cloroplastos (fotosíntesis, véase capítulo 16). Junto con las proteínas, las
bicapas forman membranas biológicas. En los capítulos siguientes se examinará el
modo en que se transportan materiales a través de las membranas (véase capítulo 9) y
en que determinadas señales del exterior de la célula se transducen al interior (véase
capítulo 10). ■

| 215

Los diversos compartimentos en el interior de las células eucarióticas están rodeados
por membranas que son flexibles, dinámicas y absolutamente imprescindibles para la
vida de la célula. Se piensa que la formación de una membrana es un acontecimiento
definitorio en la historia evolutiva de la célula (véase sección 1-4); sin membranas, una
célula sería incapaz de retener recursos esenciales o protegerse contra sustancias exter-
nas nocivas. Para comenzar a entender cómo funcionan las membranas, se les exami-
nará como estructuras compuestas que contienen tanto lípidos como proteínas.

Los lípidos que constituyen la estructura física de la membrana – la bicapa lipídica–
se agregan para formar láminas impermeables a iones y otros solutos. La clave de este
comportamiento es la hidrofobicidad de las moléculas de lípido. La hidrofobicidad
también es una característica útil de lípidos que realizan otras funciones, como almace-
namiento de energía. Aunque los lípidos exhiben enorme variedad en forma y tamaño
y realizan todo tipo de tareas biológicas, están relacionados por su hidrofobicidad.

8-1. Lípidos

CONCEPTOS CLAVE Las moléculas que se ajustan a la definición de lípido no siguen un único patrón
• Los lípidos son moléculas estructural ni comparten un conjunto común de grupos funcionales, como hacen
los nucleótidos y aminoácidos. De hecho, los lípidos se definen principalmente por
predominantemente hidrófobas la ausencia de grupos funcionales. Dado que constan en mayor medida de átomos
que pueden esterificarse, pero no de C e H y tienen pocos o ningún grupo funcional con N u O, carecen de la capa-
forman polímeros. cidad de formar enlaces de hidrógeno y por tanto son en gran medida insolubles en
• Glicerofosfolípidos y esfingolípidos agua (la mayoría de los lípidos son solubles en solventes orgánicos no polares). Aun-
son moléculas anfipáticas. que algunos lípidos contienen grupos polares o con carga, el grueso de su estructura
• El colesterol y otros lípidos que es hidrocarburo.
no forman bicapas tienen varias
funciones.

Los ácidos grasos contienen largas cadenas
de hidrocarburo

Los lípidos más simples son los ácidos grasos, ácidos carboxílicos de cadena larga (a pH
fisiológico, se ionizan a la forma carboxilato). Estas moléculas pueden contener hasta
24 átomos de carbono, pero los ácidos grasos más comunes en plantas y animales
son especies con número par de carbonos (16 y 18), como palmitato y estearato:

O OϪ

O OϪ H2C C
H2C CH2
H2C C H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H3C CH2
H3C CH2

Palmitato Estearato

Tales moléculas se denominan ácidos grasos saturados porque todos los carbonos
de su cola están “saturados” de hidrógeno. Los ácidos grasos insaturados (que con-

216 | CAPÍTULO 8 Lípidos y membranas

tienen uno o más dobles enlaces), como oleato y linoleato, también son comunes en
sistemas biológicos:

O OϪ O OϪ

H2C C H2C C
H2C H2C
H2C CH2 H2C CH2
H2C CH2 H2C CH2
CH2 CH2
CH CH

H2C CH H2C C H
H2C CH2 C H
H2C CH2
H2C CH2 H2C CH
CH3 H2C CH2
H3C
CH2

Oleato Linoleato

En estas moléculas, el doble enlace suele tener la configuración cis (en la cual los dos
hidrógenos están en el mismo lado). En el cuadro 8-1 se presentan algunos ácidos grasos
saturados e insaturados comunes.

Los ácidos grasos libres son relativamente escasos en los sistemas biológicos. En
cambio, suelen estar esterificados, por ejemplo a glicerol:

CH2 CH CH2

OH OH OH

Glicerol

CUADRO 8-1 | Algunos ácidos grasos comunes

Número de átomos Nombre común Nombre sistemáticoa Estructura
de carbono

Ácidos grasos saturados Ácido láurico Ácido dodecanóico CH3(CH2)10COOH
12 Ácido mirístico Ácido tetradecanóico CH3(CH2)12COOH
14 Ácido palmítico Ácido hexadecanóico CH3(CH2)14COOH
16 Ácido esteárico Ácido octadecanóico CH3(CH2)16COOH
18 Ácido araquídico Ácido eicosanóico CH3(CH2)18COOH
20 Ácido behénico Ácido docosanóico CH3(CH2)20COOH
22 Ácido lignocérico Ácido tetracosanóico CH3(CH2)22COOH
24

Ácidos grasos insaturados Ácido palmitoleico Ácido 9-hexadecenóico CH3(CH2)5CH CH(CH2)7COOH
16 Ácido oleico Ácido 9-octadecenóico CH3(CH2)7CH CH(CH2)7COOH
18 Ácido linoleico Ácido 9,12-octadecadienóico CH3(CH2)4(CH CHCH2)2(CH2)6COOH
18 Ácido α-linolénico Ácido 9,12,15-octadecatrienóico CH3CH2(CH CHCH2)3(CH2)6COOH
18 Ácido γ-linolénico Ácido 6,9,12-octadecatrienóico CH3(CH2)4(CH CHCH2)3(CH2)3COOH
18 Ácido araquidónico Ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico CH3(CH2)4(CH CHCH2)4(CH2)2COOH
20 EPA Ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenóico CH3CH2(CH CHCH2)5(CH2)2COOH
20 Ácido nervónico Ácido 15-tetracosenóico CH3(CH2)7CH CH(CH2)13COOH
24

a Los números indican la posición de partida del doble enlace; el carbono carboxilato está en la posición 1.

8-1. Lípidos | 217

Las grasas y aceites presentes en animales y plantas son triacilgliceroles (a veces
llamados triglicéridos), en los cuales los grupos acilo o “grasoacilo” (grupos R–CO–)
de tres ácidos grasos se esterifican a los tres grupos hidroxilo del glicerol:

CH2 CH CH2

Glicerol

O OO

C O C OC O

CH2 CH2 CH2 Tres grupos
grasoacilo

CH3 CH3 CH3

El enlace éster que une cada grupo acilo es resultado de una reacción de condensación.
Esto es lo más cerca que los lípidos llegan a estar de formar polímeros: no pueden
unirse extremo con extremo para formar largas cadenas, como hacen otros tipos de
moléculas biológicas.

Los tres ácidos grasos de un triacilglicerol dado pueden ser iguales o diferentes. Por
razones que se describen más adelante, los triacilgliceroles no forman bicapas y por ello
no son componentes importantes de las membranas biológicas. Sin embargo, se agregan
en grandes glóbulos, que sirven como depósitos de almacenamiento para ácidos
grasos que pueden degradarse a fin de liberar energía biológica (véase sección 17-1).
La naturaleza hidrófoba de los triacilgliceroles y su tendencia a agregarse significan
que las células pueden almacenar gran cantidad de este material sin que interfiera
con otras actividades que se realizan en un ambiente acuoso.

Algunos lípidos contienen grupos con cabezas polares

Entre los principales lípidos de las membranas biológicas están los glicerofosfolípidos,
que contienen un esqueleto de glicerol con grupos grasoacilo esterificados en las posi-
ciones 1 y 2 y un derivado de fosfato, llamado grupo cabeza, esterificado en la posición
tres. Como en los triacilgliceroles, los componentes grasoacilo de los glicerofosfolípicos

OϪ CH3 OϪ
O P O CH2 CH2 Nϩ CH3
ϩ

O P O CH2 CH2 NH3

O CH3 O

CH2 CH CH2 CH2 CH CH2

OO OO

C OC O C OC O

RR RR

Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina

OϪ OϪ

O P O CH2 CH CH2OH O P O CH2 CH COOϪ
O OH O NHϩ3

CH2 CH CH2 CH2 CH CH2

OO OO

C OC O C OC O

RR RR

Fosfatidilglicerol Fosfatidilserina

218 | CAPÍTULO 8 Lípidos y membranas

varían de una molécula a otra. Estos lípidos suelen nombrarse con base en sus OϪ Fosfolipasa D
grupos cabeza, como se muestra en la figura de la página anterior por ejemplo:

Nótese que los glicerofosfolípidos no son del todo hidrófobos: son OPOX
anfipáticos, con colas hidrófobas unidas a grupos cabeza polares o con Fosfolipasa C

carga. Como se verá, su estructura es ideal para formar bicapas. O

Los enlaces que unen los diversos componentes de un glicerofosfolí- H2C CH CH2
pido pueden ser hidrolizados por fosfolipasas para liberar las cadenas

acilo o porciones del grupo cabeza (figura 8-1). Estas reacciones enzimá- Fosfolipasa A1 OO Fosfolipasa A2
ticas no son sólo para degradar lípidos. Algunos productos derivados de
lípidos de membrana actúan como moléculas señalizadoras dentro de las OC C O

células o entre células vecinas. RR

Las membranas también contienen lípidos anfipáticos conocidos Figura 8-1. Sitios de acción de las
como esfingolípidos. Las esfingomielinas, con grupos cabeza fosfocolina o fosfoe- fosfolipasas.
tanolamina, son similares desde el punto de vista estérico a sus contrapartes glicero-

fosfolípido. La principal diferencia es que las esfingomielinas no se construyen sobre

un esqueleto de glicerol. En cambio, su componente básico es esfingosina, un deri-

vado de la serina y ácido graso palmitato. En un esfingolípido, un segundo grupo

grasoacilo se une mediante un enlace amida al nitrógeno de la serina (figura 8-2).

Algunos esfingolípidos tienen grupos cabeza que constan de uno o más grupos car-

bohidrato. Estos glucolípidos se conocen como cerebrósidos y gangliósidos.

Los lípidos realizan diversas funciones fisiológicas

Además de glicerofosfolípidos y esfingolípidos, en las membranas y en otras partes
de la célula existen otros tipos de lípidos. Uno de éstos es el colesterol, una molécula de
cuatro anillos con 27 carbonos:

CH3 CH3
CH
CH CH2 CH2 CH2
H3C CH3

H3C

HO

Colesterol

El colesterol es un componente importante de las membranas y también es un pre-
cursor metabólico de hormonas esteroideas como estrógeno y testosterona.

El colesterol es uno de muchos tipos de terpenoides, o isoprenoides, lípidos
construidos a partir de unidades de cinco carbonos con el mismo esqueleto de car-
bono que el isopreno:

CH3

H2C CH C CH2

Isopreno

Por ejemplo, el isoprenoide ubiquinona es un compuesto que se reduce y oxida de
manera reversible en la membrana mitocondrial (véase sección 12-2):

O

H3CO CH3 CH3

H3CO (CH2 CH C CH2)10 H

O Unidades isoprenoides

Ubiquinona

8-1. Lípidos | 219

(a) OH (b) Esfingosina

HO CH CH CH2 De la OϪ CH3
serina O P O CH2 CH2 Nϩ CH3

CH ϩNH3 O CH3
HO CH CH CH2
Del CH
palmitato CH NH

(CH2)12 CH C O Grupo acilo

CH3

Fosfocolina

(H2C)12 R

CH3

Una esfingomielina

(c) HOCH2 (d) CH2OH

HO H O O H CHOH
O CH2 H3C C NH O

OH H CHOH COOϪ HOCH2
HH
O
H OH H H CH2OH HH O CH2
HO CH CH H H HO O
CH NH OH H
HO H H OH
CH C O
OH H H HO
HO CH CH
(H2C)12 R H HO CH NH
CH C O
CH3 Un gangliósido (H2C)12 R

Un cerebrósido

CH3

Figura 8-2. Esfingolípidos. a) El esqueleto de esfingosina deriva de serina y
palmitato. b) La unión de un segundo grupo acilo y un grupo cabeza fosfocolina
(o fosfoetanolamina) genera una esfingomielina. Compare esta estructura con las de los
glicerofosfolípidos mostrados en la página 218. c) Un cerebrósido tiene un
monosacárido como grupo cabeza en vez de un derivado fosfato. d) Un gangliósido
incluye un grupo cabeza oligosacárido.

Las moléculas conocidas como vitaminas A, D, E y K son todas isoprenoides que
realizan diversas funciones fisiológicas no relacionadas con la estructura de las mem-
branas (recuadro 8-A).

¿Qué otras funciones tienen los lípidos que no se emplean para construir bicapas?
Debido a su hidrofobicidad, algunos lípidos funcionan como agentes impermeables;
por ejemplo, las ceras producidas por las plantas protegen las superficies de hojas y
frutos contra la pérdida de agua. La cera de abeja contiene un éster de palmitato y un
alcohol de 30 carbonos que hace a esta sustancia extremadamente insoluble en agua.

O

H3C (CH2)14 C O (CH2)29 CH3

En el humano, algunos derivados del ácido graso C20 araquidonato son moléculas de
señalización que ayudan a regular presión arterial, dolor e inflamación (véase sección
10-4). Muchos lípidos vegetales funcionan como sustancias atrayentes para polini-
zadores y como repelentes de herbívoros. Por ejemplo, algunas plantas con flores

220 | CAPÍTULO 8 Lípidos y membranas