คู่มือปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์

32 บทที่ 2 การเกบ็ สงิ่ ตรวจเพื่อวนิ จิ ฉยั โรคติดเช้อื แบคทีเรยี และเชือ้ ราชนิดสง่ิ ตรวจ/ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุวิธเี กบ็เวลาและอณุ หภมู ิของข้อแนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวัง
คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและราตำ� แหนง่ ที่เก็บ1. ภาชนะปราศจากเชือ้ การน�ำสง่ การเก็บรักษา
2. ภาชนะบรรจุ Stuart’s
Ear medium 1. ลา้ งช่องหูใหส้ ะอาด ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 24 ชม.
1. inner โดยใช้สบแู่ ละน้ำ� ท่อี ณุ หภูมิหอ้ ง ท่ีอุณหภมู หิ อ้ ง
2. ใช้เข็มและ syringe ดดู น้�ำ
ในชอ่ งหูออกมาใสภ่ าชนะ
ปราศจากเชือ้
3. ในกรณที ่ี ear drum แตก
ให้เกบ็ โดยใช้ sterile swab
ป้ายนำ้� ในชอ่ งหู จ่มุ swab
ลงใน Stuart’s medium

2. outer ภาชนะบรรจุ Stuart’s 1. ใช้ sterile swab จุ่ม ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กนิ 24 ชม.
medium น้ำ� เกลอื หมาดๆ เช็ดรอบๆ ที่อุณหภูมิห้อง ทอ่ี ณุ หภมู ิห้อง
ช่องหูเพื่อขจดั เศษเซลล์
ต่างๆ ออก
2. แลว้ ใช้ swab อันใหม่
ปา้ ยโดยกดใหแ้ รงและ
หมนุ ให้ทั่วช่องหู (outer canal)
3. จุ่ม swab ลงใน
Stuart’s medium

ชนิดสงิ่ ตรวจ/ ปริมาณ/ภาชนะบรรจุ วธิ เี กบ็ เวลาและอุณหภมู ิของ ข้อแนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวงั
ตำ� แหน่งท่เี กบ็ ถ่ายอุจจาระใส่ในภาชนะ การน�ำสง่ การเก็บรักษา ควรใช้ภาชนะปากกว้าง
ปราศจากเชื้อ ภายใน 1 ชม. ไม่เกิน 24 ชม.
Feces 1. > 2 กรัม/ภาชนะ ทอี่ ณุ หภมู ิหอ้ ง ท่ี 4 OC
ปราศจากเชอื้

2. ภาชนะบรรจุ 1. ถ่ายอุจจาระลงในภาชนะ ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 48 ชม.
Carry Blair medium ท่ีแหง้ และสะอาด ที่อุณหภูมหิ อ้ ง ที่อณุ หภูมิหอ้ ง
ไมป่ นเป้อื นปัสสาวะ
2. ใช้ sterile swab ปา้ ย
อุจจาระทถี่ ่ายออกมา
โดยเลอื กป้ายบริเวณ
ท่มี มี ูกหรือเลือดปน
จุ่ม swab ลงใน
Carry Blair medium
บทท่ี 2 การเก็บส่งิ ตรวจเพ่อื วินจิ ฉัยโรคติดเชื้อแบคทีเรยี และเช้อื รา 33
Rectal swab ภาชนะบรรจุ 1. ใช้ sterile swab ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 48 ชม.
2บทท่ีCarry Blair medium สอดเขา้ ช่องทวารหนักที่อุณหภมู ิหอ้ ง ที่อุณหภูมหิ อ้ ง
ให้ลกึ ประมาณ 1-2 นว้ิ
คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา 2. หมนุ swab 2-3 รอบ
3. ดึงออกจ่มุ swab ลงใน
Cary Blair medium

ชนิดสงิ่ ตรวจ/ 34 บทที่ 2 การเกบ็ สงิ่ ตรวจเพื่อวนิ จิ ฉยั โรคติดเช้อื แบคทีเรยี และเชือ้ ราปริมาณ/ภาชนะบรรจุวิธีเก็บเวลาและอุณหภมู ิของข้อแนะน�ำหรือข้อควรระวัง
ตำ� แหนง่ ท่ีเกบ็คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและราภาชนะบรรจุ Stuart’sการน�ำสง่ การเกบ็ รกั ษา
Genital tract medium 1. ท�ำความสะอาดบรเิ วณ
1. female รอบๆ ชอ่ งคลอด ดว้ ย ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม.
1.1 vagina นำ้� เกลือปราศจากเช้อื ท่อี ุณหภมู ิหอ้ ง ท่อี ุณหภมู ิหอ้ ง
2. เชด็ ใหแ้ หง้ ดว้ ยส�ำลี
3. ใช้ sterile swab สอด หา้ มเก็บในตเู้ ยน็
เขา้ ไปในชอ่ งคลอด
1.2 urethra ภาชนะบรรจุ Stuart’s 4. ป้าย secretion หรอื ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม. ในกรณีท่ไี มม่ ี discharge ใหป้ ฏบิ ัติดังน้ี
medium discharge ท่อี ุณหภูมิหอ้ ง ทอ่ี ุณหภมู หิ ้อง 1. ทำ� ความสะอาดรอบๆ urethra ด้วยสบู่
5. จ่มุ swab ลงใน
Stuart’s medium หา้ มเก็บในต้เู ยน็ และน�ำ้ สะอาด
1. ท�ำความสะอาดบริเวณ 2. ใช้ sterile swab สอดเขา้ ไปใน urethra
รอบๆ urethra ลกึ ประมาณ 2-4 cm
2. นวดรอบๆ urethra 3. หมนุ swab ประมาณ 2 วินาที
หัวเหนา่ ไปจนถึง 4. ดงึ ออกแลว้ จ่มุ swab ลงใน Stuart’s medium
ชอ่ งคลอด
3. ใช้ sterile swab ป้าย
discharge ท่ีไหลออกมา

ชนิดสงิ่ ตรวจ/ ปริมาณ/ภาชนะบรรจุ วิธีเกบ็ เวลาและอณุ หภูมิของ ข้อแนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวงั
ต�ำแหน่งที่เก็บ การน�ำสง่ การเกบ็ รกั ษา
1. ใช้ speculum ในการตรวจ
Genital tract ภาชนะบรรจุ Stuart’s cervix โดยไม่ใช้สารหล่อลน่ื ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กนิ 24 ชม.
1. female medium 2. ใช้ sterile swab เช็ดพวก ที่อณุ หภูมิหอ้ ง ที่อณุ หภมู ิห้อง
1.3 cervix mucus และ secretion
บริเวณ cervix แลว้ ทง้ิ ไป หา้ มเกบ็ ในตเู้ ยน็
3. ใช้ sterile swab อนั ใหม่
ป้ายบริเวณ endocervical
canal
4. จุ่ม swab ลงใน
Stuart’s medium
นำ� อปุ กรณท์ ัง้ หมดใสล่ ง
ในภาชนะปราศจากเช้อื
บทท่ี 2 การเก็บส่งิ ตรวจเพ่อื วินจิ ฉัยโรคติดเชื้อแบคทีเรยี และเช้อื รา 35 1.4 intrauterine ภาชนะปราศจากเชอ้ืภายใน 2 ชม.-
devices ท่อี ณุ หภมู หิ อ้ ง
2บทท่ี

คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา

36 บทที่ 2 การเกบ็ สงิ่ ตรวจเพื่อวนิ จิ ฉยั โรคติดเช้อื แบคทีเรยี และเชือ้ ราชนดิ สง่ิ ตรวจ/ปริมาณ/ภาชนะบรรจุวธิ ีเก็บเวลาและอุณหภมู ขิ องขอ้ แนะนำ� หรือข้อควรระวงั
คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและราต�ำแหนง่ ทีเ่ กบ็ การน�ำส่ง การเกบ็ รกั ษา
1. ทำ� ความสะอาด prostate
Genital tract ภาชนะบรรจุ Stuart’s gland โดยใชส้ บู่และน้ำ� ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 24 ชม. ถ้าเกบ็ ปสั สาวะโดยเกบ็ ทนั ทีกอ่ นและหลัง
2. male medium 2. นวด prostate gland ไล่ไป ท่อี ณุ หภมู ิหอ้ ง ทอ่ี ณุ หภมู ิห้อง นวด prostate gland จะให้ผลการเพาะเชือ้
2.1 prostate จนถงึ ทวารหนัก
3. ใช้ sterile swab ปา้ ย ท่ีดกี วา่
ของเหลวทไ่ี หลออกมา
2.2 urethra ภาชนะบรรจุ Stuart’s แลว้ จุ่ม swab ลงใน ภายใน 2 ชม. ไม่เกิน 24 ชม. กรณที ีใ่ ช้ sterile loop ให้ streak ลงบนอาหาร
medium Stuart’s medium ทอ่ี ุณหภมู ิหอ้ ง ทอ่ี ุณหภูมหิ อ้ ง เลยี้ งเชอ้ื โดยตรงหรือจะป้ายลงบน slide
1. รน่ หนงั หุม้ gland penis
2. ทำ� ความสะอาดรอบๆ ห้ามเกบ็ ในตเู้ ยน็ เพอื่ ทำ� smear กไ็ ด้
ด้วยสบู่และนำ�้ แล้วเชด็
ให้แห้ง
3. ใช้ sterile swab ขนาดเลก็
หรือใช้ sterile loop สอด
เข้าไปในท่อปัสสาวะ
หมุนเบาๆ และคาไว้
ประมาณ 2 วินาที
4. น�ำ swab จมุ่ ลงใน
Stuart’s medium

ชนิดส่งิ ตรวจ/ ปริมาณ/ภาชนะบรรจุ วิธีเก็บ เวลาและอุณหภมู ขิ อง ข้อแนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวัง
ต�ำแหน่งที่เก็บ 1. ท�ำความสะอาดแผล การน�ำส่ง การเกบ็ รกั ษา
โดยใช้ sterile saline
Genital tract ภาชนะบรรจุ Stuart’s 2. ใชใ้ บมีดปราศจากเชือ้ ขูด ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม.
3. female ท่ีผิวบนของแผลทิง้ ไป ทีอ่ ุณหภมู ิหอ้ ง ที่อุณหภูมิห้อง
or male lesion medium 3. ใช้ sterile swab กดซับเอา
exudates ท่ีแผลออกมา
จมุ่ swab ลงใน
Stuart’s medium
บทท่ี 2 การเก็บส่งิ ตรวจเพ่อื วินจิ ฉัยโรคติดเชื้อแบคทีเรยี และเช้อื รา 37

2บทท่ี

คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา

ตารางที่ 2-4 การเก็บส่งิ ตรวจเพอื่ วนิ ิจฉัยโรคตดิ เช้อื รา 38 บทที่ 2 การเกบ็ สงิ่ ตรวจเพื่อวนิ จิ ฉยั โรคติดเช้อื แบคทีเรยี และเชือ้ รา
คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา
ชนิดสงิ่ ตรวจ/ ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุ วธิ เี ก็บ เวลาและอณุ หภูมิของ ข้อแนะนำ� หรอื ขอ้ ควรระวงั
ต�ำแหน่งทเี่ ก็บ 1. ใช้ 70% alcohol เชด็ lesion การนำ� ส่ง การเกบ็ รักษา
บรเิ วณที่สงสยั ภายใน 24 ชม. ไมเ่ กนิ 2 สปั ดาห์
ผวิ หนงั แผน่ slide สะอาด 2. ใช้ใบมีดขูดผิวหนงั ท่ีอณุ หภมู ิห้อง ทอี่ ณุ หภมู หิ อ้ ง
ปราศจากไขมนั บริเวณขอบของ lesion
ใสบ่ น slide สำ� หรบั
3. ใชใ้ บมีดเขี่ยผิวหนงั Dermatophytes
ทีข่ ูดไดใ้ ห้มารวมกนั และไมเ่ กนิ
ตรงกลาง slide 1 สปั ดาห์
4. นำ� slide อกี แผ่นปดิ ทับ ทอี่ ณุ หภมู หิ อ้ ง
แล้วใสซ่ องกระดาษหรือ สำ� หรบั Candida
ซองพลาสติกหรือหอ่ ดว้ ย
กระดาษ ภายใน 24 ชม. ไม่เกิน 2 สปั ดาห์
ทีอ่ ุณหภมู ิห้อง ทอี่ ุณหภูมิหอ้ ง
ผม แผ่น slide สะอาด 1. ดงึ ผมจากบรเิ วณศรี ษะ
ปราศจากไขมัน รอบๆ lesion ใสล่ งบน
หรอื petridish slide หรอื petridish
2. น�ำ slide อกี แผน่ ปดิ ทบั
แล้วใสซ่ องกระดาษหรอื
ซองพลาสตกิ หรอื ห่อด้วย
กระดาษ

ชนิดส่งิ ตรวจ/ ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุ วธิ ีเก็บ เวลาและอณุ หภมู ิของ ข้อแนะนำ� หรือข้อควรระวงั
ต�ำแหน่งท่ีเกบ็ 1. ขดู บริเวณรอยต่อระหว่าง การน�ำสง่ การเกบ็ รักษา
เลบ็ ส่วนที่ดีกบั สว่ นที่เสีย ภายใน 24 ชม. ไมเ่ กนิ 1 สปั ดาห์
เล็บ แผน่ slide สะอาด ใส่ slide ทอ่ี ณุ หภมู หิ ้อง ที่อณุ หภูมิหอ้ ง
ปราศจากไขมัน 2. ใช้ใบมีดเขย่ี เลบ็ ทีข่ ูดได้
ให้มารวมกนั ตรงกลาง slide
3. นำ� slide อกี แผ่นปดิ ทับ
แลว้ ใส่ซองกระดาษหรือ
ซองพลาสตกิ หรือห่อดว้ ย
กระดาษ
บทท่ี 2 การเก็บส่งิ ตรวจเพ่อื วินจิ ฉัยโรคติดเชื้อแบคทีเรยี และเช้อื รา 39
cornea - 1. ใช้ sterile swab จมุ่ น�ำ้ เกลือ สง่ ทนั ทภี ายใน - ถา้ ต้องการท�ำ KOH preparation ดว้ ย
2บทท่ี หมาดๆ ปา้ ยท่ี cornea 15 นาที ให้ทำ� swab อีกอัน และป้าย swab ลงบน slide
2. นำ� swab ปา้ ยลงบน ท่ีอณุ หภมู หิ ้อง
คู่มอื การปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรยี และรา mycobiotic agar

CSF 1 ml เกบ็ โดยใช้ sterile technique ส่งทันทภี ายใน -
ภาชนะปราศจากเชื้อ 15 นาที
ทอ่ี ณุ หภมู หิ ้อง

vaginal 1 ml swab จาก vagina ใสล่ งในน้�ำเกลอื สง่ ทันทภี ายใน - 1. ใชต้ รวจหาเชอื้ ราโดยทำ� saline wet mount
secretion ภาชนะสะอาดท่มี นี �ำ้ เกลือ 15 นาที 2. กรณีท่ตี ้องการเพาะหาเชอื้ ราใหท้ �ำ swab
ทอ่ี ณุ หภูมิหอ้ ง อีก 1 อนั ปา้ ยลงบนอาหารเลี้ยงเชือ้ รา
โดยตรง

40 บทที่ 2 การเกบ็ สงิ่ ตรวจเพื่อวนิ จิ ฉยั โรคติดเช้อื แบคทีเรยี และเชือ้ ราชนิดสิ่งตรวจ/ปรมิ าณ/ภาชนะบรรจุวธิ ีเกบ็เวลาและอณุ หภมู ิของข้อแนะน�ำหรอื ขอ้ ควรระวัง
คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและราตำ� แหนง่ ทเ่ี กบ็1. ทำ� biopsy โดยตัดช้นิ เน้ือการน�ำส่ง การเกบ็ รักษาควรหยด sterile saline ลงไปเพ่อื ป้องกนั
มาประมาณอย่างน้อย ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กนิ 8 ชม. ชน้ิ เนอื้ แห้ง
tissue > 1 cumm 1 cumm ที่อณุ หภูมหิ ้อง ที่ 4 OC
ภาชนะปราศจากเช้ือ 2. ใส่ในภาชนะปราศจากเช้ือ

urine 10-15 ml เก็บโดยใชว้ ิธสี วนใส่ภาชนะ ภายใน 2 ชม. ไมเ่ กิน 24 ชม.
ภาชนะปราศจากเชือ้ ปราศจากเชอ้ื ทอ่ี ุณหภูมหิ ้อง ท่ี 4 OC
ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม.
blood 5-10 ml ขวด hemoculture เหมอื นกบั การเจาะเกบ็ ที่อุณหภมู หิ ้อง ทอ่ี ุณหภมู หิ อ้ ง
ส�ำหรับเพาะเชอ้ื รา เพอื่ เพาะเชอ้ื แบคทเี รยี ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม. ควรท�ำ smear ดว้ ยถา้ ต้องการตรวจหา
ท่ีอณุ หภมู ิห้อง ทอี่ ณุ หภูมิหอ้ ง histoplasma หรอื Penicillium marneffei
bone marrow ขวด hemoculture สำ� หรบั แพทย์เปน็ ผู้เจาะโดยใช้ ภายใน 2 ชม. ไม่เกนิ 24 ชม.
เพาะเชอ้ื รา sterile technique ท่ีอณุ หภูมหิ อ้ ง ทอ่ี ณุ หภมู ิหอ้ ง

body fluids 10-15 ml แพทย์เปน็ ผูเ้ จาะโดยใช้
- pleural, ภาชนะปราศจากเชื้อ sterile technique
synovial
- ascitis, bile
- pericardial

บทท่ี 2 การเก็บส่ิงตรวจเพ่ือวนิ ิจฉยั โรคติดเชอื้ แบคทีเรียและเชื้อรา 41

เอกสารอา้ งอิง 2บทที่

1. Baron EJ, Thomson RB. Specimen Collection, Transport , and Processing : Bacteriology. In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual
of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.228-271.
2. Linscott AJ. Specimen Collection, Transport, and Acceptability. In : Garcia LS. Clinical
Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM Press; 2010. P 2.1.1-
2.1.26.
3. Miller JM, Holms HT. Specimen Collection, Transport and Storage. In: Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 6th ed. Washington,
DC: ASM Press; 1995. p. 33-63.
4. NCCLS. Quality control of Microbiological transports Systems; Approved standard. NCCLS
document M40-A. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayene, Pennsylvania 19087-
1898,USA 2003.
5. สุรางค์ เดชศิริเลิศ, สุวรรณา ตระกูลสมบูรณ์, กาญจนา คชินทร. แนวปฏิบัติ การเจาะเลือดเพ่ือ
เพาะเชอ้ื และการเพาะเชอื้ กอ่ โรคจากเลอื ด. กรงุ เทพฯ: โรงพมิ พแ์ หง่ จฬุ าลงกรณม์ หาวทิ ยาลยั ; 2553.
หน้า 1-10.

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา



บทที่ 3
การวินจิ ฉยั โรคตดิ เชอ้ื จากสิง่ ตรวจด้วยกลอ้ งจุลทรรศน์

มาลัย วรจิตร
ณัฏฐีวรรณ ปุน่ วนั

หลักการ บทที่
การตรวจสง่ิ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ ปน็ วธิ กี ารวนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชอื้ อยา่ งรวดเรว็ จดั เปน็ point ofcare test
3การตรวจทางกล้องจุลทรรศนอ์ าจดูสด หรือทำ� การย้อมสีต่างๆตามความเหมาะสม เชน่ ยอ้ มแกรมเพอ่ื วินิจฉยั
การตดิ เช้อื แบคทีเรยี ย้อม acid fast bacilli (AFB) เพื่อวินจิ ฉยั การตดิ เช้อื มัยโคแบคทีเรีย ยอ้ ม modified acid

fast bacilli เพ่อื วนิ จิ ฉัยการตดิ เชื้อ Nocardia กับ Rhodococcus การใช้ india ink เพอ่ื ดู yeast cells ท่มี ี capsule

หนาๆ และการใช้ KOH ชว่ ยย่อย keratin จะช่วยให้เหน็ เสน้ ใยเช้ือราได้ชดั ขึ้น

การย้อมแกรมเม่ือย้อมแบคทีเรียด้วย crystal violet สีจะซึมเข้าภายในเซลล์ของแบคทีเรียและเมื่อ

ย้อมทับด้วย gram iodine ซึ่งจะซึมเข้าภายในเซลล์ของแบคทีเรียเช่นกัน สี crystal violet และ iodine จะ

รวมกนั เปน็ crystal iodine complex ซง่ึ มโี มเลกลุ ทใ่ี หญข่ น้ึ จงึ ไมส่ ามารถหลดุ ออกจากเซลลไ์ ดเ้ มอื่ ลา้ งนำ้� แตเ่ มอื่

ลา้ งดว้ ย alcohol/acetone ซ่ึงเป็นสารท่ลี ะลายไขมนั ไดจ้ งึ ไปลา้ งไขมนั ทผ่ี นงั เซลล์ของแบคทีเรยี แบคทีเรียทมี่ ี

ไขมนั ทผี่ นงั เซลลม์ ากจะเกดิ รขู นาดใหญท่ ผ่ี นงั เซลลท์ ำ� ให้ crystal iodine complex หลดุ ออกจากเซลลแ์ บคทเี รยี

ได้ จงึ ย้อมตดิ สี safranin เปน็ สีแดงเรียกแบคทีเรียแกรมลบ แบคทเี รยี ทีม่ ีไขมันทผ่ี นังเซลล์น้อยกว่าขนาดของรู

ทเ่ี กดิ ขน้ึ เมอ่ื ลา้ งดว้ ย alcohol/acetone ในลกั ษณะเดยี วกนั จะมขี นาดเลก็ กวา่ crystal iodine complex จงึ ไมห่ ลดุ

ออกจากเซลล์และไม่ตดิ สี safranin จงึ ย้อมตดิ สีม่วงเรียกแบคทเี รยี แกรมบวก การตดิ สแี กรมจะผิดพลาดไดถ้ า้

ลา้ งด้วย alcohol/acetone มากหรือนอ้ ยเกนิ ไป

การย้อมแกรมเป็นวิธีการที่ใช้แยกแบคทีเรียทางห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา โดยอาศัยรูปร่าง ขนาด

ลักษณะเซลล์และการติดสีแกรม ใช้ในการวินิจฉัยสาเหตุการติดเช้ือเบ้ืองต้นอย่างรวดเร็วและช่วยในการ

ประเมินคณุ ภาพของส่ิงตรวจ การยอ้ มแกรมเป็นวิธที ี่ Christian Gram เป็นผู้คิดขึน้ ในปี ค.ศ. 1884 วิธที ่ีใชใ้ น

ปัจจุบันเป็นวิธีที่ Hucker ได้ปรับปรุงจากวิธีเดิมให้น�้ำยามีความคงที่มากขึ้นและแยกเชื้อได้ดีกว่าเดิม (ปีค.ศ.

1921) นอกจากน้ียังมีวิธีท่ีพัฒนาให้เหมาะสมกับการย้อมแบคทีเรียชนิดต่างๆ เช่น anaerobic bacteria เช้ือ

Legionella spp., Campylobacter spp., Brucella spp. เป็นตน้ การแปลผลการยอ้ มแกรมต้องคำ� นงึ ถงึ การตดิ สี

ขนาด รูปร่างของเซลล์และการเรียงตัว ปัจจัยที่มีผลต่อคุณสมบัติเหล่าน้ีได้แก่ อาหารเล้ียงเชื้อ การอบเชื้อ

วธิ กี ารยอ้ มสแี ละสารยบั ยง้ั เชอื้ ทม่ี ี ในการแปลผลการยอ้ มแกรมจากสงิ่ ตรวจนอกจากจะใชค้ ณุ สมบตั ดิ งั กลา่ ว

มาใช้ในการแปลผลยังต้องนำ� การตรวจพบเซลล์ชนดิ ต่างๆของรา่ งกายมาพจิ ารณาประกอบด้วย

44 บทท่ี 3 การวินิจฉัยโรคตดิ เชือ้ จากส่งิ ตรวจดว้ ยกล้องจุลทรรศน์

AFB stain เช้ือมัยโคแบคทีเรียทนต่อการล้างด้วยสารละลายกรด + แอลกอฮอล์ เมื่อย้อมด้วย carbol
fuchsin เนอื่ งจากมสี ว่ นประกอบไขมนั (mycolic acid) ทผ่ี นงั เซลลม์ าก การยอ้ มสี acid fast เปน็ วธิ กี ารตรวจหา
เชอ้ื มยั โคแบคทเี รยี ทเี่ รว็ ทสี่ ดุ สามารถใชใ้ นการดผู ลการรกั ษาผปู้ ว่ ยโดยเจอื จาง sediments ทท่ี ดสอบความไวและ
ย้อมหาเชอ้ื ท่ีติดสี acid fast ใน culture วธิ ี acid fast ที่ใชก้ วา้ งขวางทีส่ ดุ คือวิธีของ Kinyoun และ fluorochrome
วิธี fluorochrome เป็นวิธีท่ีแนะน�ำให้ใช้ตรวจในส่ิงตรวจเพราะมีความไวสูงและท�ำได้รวดเร็ว เพราะสามารถ
ตรวจดดู ว้ ยก�ำลงั ขยายต่ำ� เม่ือไดผ้ ลบวกจงึ ทำ� การตรวจยืนยันด้วยวิธี Kinyoun ในการยอ้ ม AFB ต้องใช้สไลด์
ใหมแ่ ละสะอาดเสมอ

ภาพท่ี 3-1 การย้อมสี acid-fast ในการตรวจหาเชือ้ มยั โคแบคทเี รยี
Modified acid fast stain เปน็ เทคนิคทใ่ี ชต้ รวจหาเชอ้ื partially acid fast เช่น Nocardia, Rhodococcus
เป็นตน้ โดยเปลีย่ นสลี ้างจากกรด HCl ในแอลกอฮอล์เป็น H2SO4 ในแอลกอฮอล์
India ink จะไม่ถูก absorbed โดยเซลล์หรือแคปซูลของยีสต์ เมื่อน�ำยีสต์ที่มีแคปซูลมาผสมกับ
india ink จะเห็นแคปซูลเป็นสีใสวาวๆ รอบเซลล์ของยีสต์และมีพ้ืนหลังสีด�ำของ india ink ส�ำหรับยีสต์
ที่มีแคปซูลท่ีพบในส่ิงตรวจส่วนใหญ่เป็น Cryptococcus neoformans จึงใช้วิธีน้ีในการวินิจฉัยผู้ป่วยติดเช้ือ
C. neoformans ในระบบประสาทส่วนกลาง
การตรวจทางกลอ้ งจลุ ทรรศนโ์ ดยไมค่ ำ� นงึ ถงึ วา่ จะใชส้ ยี อ้ มใดโดยทวั่ ไปมวี ตั ถปุ ระสงคข์ องการตรวจคอื
เพอื่ ตรวจคณุ ภาพของสง่ิ ตรวจ ชว่ ยในการวนิ จิ ฉยั โรคตดิ เชอื้ เปน็ แนวทางสำ� หรบั แปลผลการเพาะเชอื้ เพอ่ื เปน็
ตวั บ่งช้วี า่ ควรทำ� การทดสอบใดเพิม่ เติม และใชเ้ ปน็ ตวั ควบคุมคณุ ภาพการเพาะเช้ือ

คมู่ อื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา

บทท่ี 3 การวินจิ ฉยั โรคตดิ เชอ้ื จากส่ิงตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ 45

การวินิจฉยั โรคตดิ เช้ือโดยการตรวจสิง่ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ 3บทที่
เป็นการด�ำเนินการในขั้นแรกเพื่อวินิจฉัยโรคติดเช้ือนับว่าเป็นส่ิงส�ำคัญมาก โดยเฉพาะอย่างย่ิง
โรคติดเช้ือรา เชื้อเจริญเติบโตช้าบนอาหารเพาะเล้ียงเชื้อ ควรรายงานผลเบ้ืองต้นให้แพทย์ทราบก่อน
แพทย์อาจจะใช้ข้อมูลในข้ันตอนนี้เตรียมท�ำการรักษาผู้ป่วยได้ การวินิจฉัยโรคติดเชื้อราจากส่ิงตรวจด้วย
กล้องจุลทรรศน์ ได้แก่ การตรวจสดในสารละลาย 10-30% potassium hydroxide การตรวจสดใน india ink
preparation การยอ้ มแกรม การย้อมสี modified acid-fast และวธิ ียอ้ มสพี เิ ศษต่างๆ
วิธีการที่ใช้วินิจฉัยโรคติดเช้ือราจากสิ่งตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ ขึ้นกับชนิดของส่ิงตรวจ และ
ชนิดของโรคที่สงสัย ส่ิงตรวจส่วนมากจะท�ำการตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide สิ่งตรวจท่ี
เหมาะสมกับการตรวจวิธนี ้ี ไดแ้ ก่ ผิวหนัง ผม เล็บ และมิวคัสเมมเบรนทส่ี งสัยโรคเกล้อื น (tinea versicolor)
โรคกลาก (dermatophytosis) และ candidiasis นอกจากน้ียังเหมาะสมกับการตรวจหา dematiaceous fungi
ในสะเก็ดแผลแห้งท่ีผิวหนังที่สงสัยโรคติดเชื้อราที่มีสาเหตุจากราด�ำ (chromomycosis) สารละลายผสม
potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide เหมาะกับการตรวจสด สิ่งตรวจเล็บ ส่ิงตรวจหนองจากแผล
หรือชิ้นเนื้อจากแผลที่สงสัยโรค eumycotic mycetoma สารละลายผสมน้ีจะย่อย keratin ได้ดี ไม่ต้องลนไฟ
นำ� ไปดูใต้กลอ้ งจลุ ทรรศน์ไดท้ นั ท ี

การวนิ จิ ฉัยโรคติดเชือ้ แบคทีเรียโดยการย้อมแกรมส่งิ ตรวจผู้ป่วย

สงิ่ ตรวจผปู้ ่วยที่เกบ็ มาใหมๆ่ จะไดผ้ ลถูกตอ้ งทีส่ ดุ

วธิ ีปฏบิ ตั งิ าน

1. สยี ้อม Hucker’s modification

1.1 stock crystal violet ประกอบด้วย

crystal violet 20 g

ethanol 95% 200 ml

1.2 stock oxalate solution ประกอบด้วย

ammonium oxalate 8 g

นำ�้ กล่ัน 800 ml

ผสมสารละลาย 1.1 และ 1.2 เข้าดว้ ยกนั ตั้งไว้อย่างน้อย 24 ชั่วโมง กอ่ นกรองและน�ำไปใชเ้ ป็น working

solution

1.3 Gram iodine solution ประกอบด้วย

iodine crystals 1 g

potassium iodide 2 ml

น�ำ้ กลน่ั 240 ml คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา

46 บทท่ี 3 การวินิจฉัยโรคติดเชอ้ื จากส่ิงตรวจด้วยกล้องจลุ ทรรศน์

บด iodine และ potassium iodide ในโกร่ง เติมน�้ำ 2 - 3 ml บดจนละลายหมดแล้ว เติมน้�ำกล่ันจน

ครบ 240 ml แลว้ เติม sodium bicarbonate 5% aqueous solution 60 ml (sodium bicarbonate 3 g ในน�ำ้ กลัน่

60 ml) ผสมให้เขา้ กัน และเก็บในขวดสีน�้ำตาล

ข้อควรระวัง iodine เป็นสารกัดกร่อน (corrosive) จึงต้องระวังไม่หายใจเข้าไป ห้ามรับประทาน

หรอื ถกู กบั ผวิ หนงั

1.4 decolorizer ท่ีล้างไดช้ า้ คือ ethanol 95% ทีล่ า้ งได้ปานกลางคือ สารผสมของ acetone-

alcohol (ethanol 95% : reagent grade acetone = 1:1) สารท่ลี า้ งได้เรว็ ทส่ี ุดคือ acetone (reagent grade)

ข้อควรระวัง ethanol และ acetone เป็นสารไวไฟ

decolorizer ทใี่ ชใ้ นการยอ้ มแกรมแบบรวดเรว็ คอื acetone-iodine solution ประกอบดว้ ย

strong iodine solution

iodine 10 g

potassium iodide 6 g

น�ำ้ กลั่น 10 ml

บด iodine, potassium iodide ในน้�ำกล่ันให้ละลายแล้วเติม 10% ethanol ให้ครบ 100 ml

ผสมให้เข้ากัน

working solution :

strong iodine solution 3.5 ml

acetone 96.5 ml

1.5 counterstain ประกอบดว้ ย

stock solution :

safranin O 2.5 ml

ethanol 95% 100 ml

working solution :

stock solution 10 ml

น้ำ� กลั่น 100 ml

2. การเตรียมตัวอย่าง
การ smear ท่ีดีควรได้เป็นช้ันเดี่ยว (monolayer) ของเชื้อและเซลล์ มีการกระจายสม่�ำเสมอและ
สามารถดูลักษณะการเรียงตัวของเชื้อได้ชัดเจน ควรใช้สไลด์ท่ีสะอาด ปราศจากไข การย้อมจากสิ่งตรวจที่
ต้องท�ำการเพาะเชื้อด้วย ถ้าใช้ไปเปตหรือไม้พันส�ำลี (swab) อันเดียวกันต้องท�ำการเพาะเชื้อก่อนเสมอ การ

คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

บทที่ 3 การวินิจฉยั โรคตดิ เชอื้ จากสิง่ ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ 47

ทำ� smear สิง่ ตรวจผ้ปู ่วยตอ้ งสวมถงุ มอื และเครื่องป้องกนั อ่นื ที่เหมาะสมตามหลักของ universal precaution 3บทที่
2.1 ส่ิงตรวจที่เป็น swab ควรแยก swab ส�ำหรับเพาะเชื้อและย้อมแกรม ให้หมุน swab ไป
ตามยาวของสไลด์ ไม่ต้องกดแรงๆเพราะจะท�ำให้เซลล์แตกและการเรียงตัวของเชื้อเสียไป
ในกรณีที่ได้รับ swab เพยี งอันเดียว ให้ใส่ swab ในน�้ำเกลอื ปราศจากเชือ้ เลก็ น้อย แลว้ นำ� ไป
vortex บิด swab กับผนังด้านในหลอด และน�ำไป smear บนสไลด์ ปล่อยให้แห้งในอากาศ
ส่วนทเ่ี หลือในหลอดใชใ้ นการเพาะเชอ้ื
2.2 สิ่งตรวจที่ไม่ได้เป็น swab เช่น หนอง เสมหะ อุจจาระ ถ้าเป็นหนองที่เจาะใส่ syringe มา
ให้ถ่ายหนองท้ังหมดลงในหลอดปราศจากเชื้อ vortex สิ่งตรวจให้เชื้อกระจายสม่�ำเสมอ
ไม่รับสิ่งตรวจที่อยู่ใน syringe ท่ีมีเข็มติดมาด้วย ควรให้ปลดเข็มออกจาก syringe ก่อนส่ง
สง่ิ ตรวจ ใช้ swab ไปเปตหรือ loop ปราศจากเชื้อเขีย่ ส่วนของสงิ่ ตรวจทีม่ ีหนองหรือเลอื ด
ถ้าสิ่งตรวจเหนียวมากอาจหยดน้�ำเกลือปราศจากเชื้อ 1 หยดบนสไลด์เพื่อเจือจางจะท�ำให้
smear ได้ง่ายข้นึ เกลี่ยสิ่งตรวจให้กระจายเปน็ ฟลิ ม์ บางๆ ปลอ่ ยให้แห้งในอากาศ
2.3 น�้ำไขสันหลัง และส่ิงคัดหลั่งอ่ืนๆ การใช้เคร่ือง cytospin slide centrifuge จะช่วย
concentrate สิง่ คัดหล่งั ท่ี smear ซ่ึงจะชว่ ยเพิม่ ความไวของการย้อมแกรมและลดเวลาทใ่ี ช้ใน
การป่นั ให้หาบรเิ วณท่มี สี ิ่งตรวจได้ง่ายข้ึน ในกรณที ไ่ี มไ่ ด้ใชเ้ คร่อื ง cytospin slide centrifuge
ให้ปั่นน้�ำไขสันหลัง/ส่ิงคัดหลั่งด้วย centrifuge ใช้ไปเปตปราศจากเชื้อดูดส่วนข้างบนออก
ใหเ้ หลอื ประมาณ 0.5 ml แลว้ vortex เพอ่ื ใหต้ ะกอนแตกออก จากนน้ั ใชไ้ ปเปตปราศจากเชอื้ ดดู
มาหยดบนสไลด์สะอาดปราศจากไข 1 หยด ไม่ต้องเกล่ียส่ิงตรวจให้กระจาย ปล่อยให้แห้ง
ในอากาศ

ภาพท่ี 3-2 เครอื่ ง cytospin slide centrifuge

คมู่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

48 บทที่ 3 การวินิจฉัยโรคติดเช้อื จากสง่ิ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์

2.4 ปัสสาวะที่จะย้อมแกรม ห้ามปั่น เขย่าขวดให้ปัสสาวะกับตะกอนเข้ากันดี ใช้ไปเปต
ปราศจากเช้ือดูดปัสสาวะมาหยดลงบนสไลด์สะอาดปราศจาก ไม่ต้องเกลี่ยให้กระจาย
ปลอ่ ยใหแ้ หง้ ในอากาศ
2.5 ส่ิงตรวจท่ีแห้งหรือส่ิงตรวจที่มีขนาดเล็กมาก ให้ละลายส่ิงตรวจในน้�ำเกลือปราศจากเช้ือ
0.5 ml ใช้ไปเปตปราศจากเช้อื ดดู มาหยดบนสไลด์สะอาดปราศจากไข 1 หยด ใชป้ ลายไปเปต
เกลีย่ สงิ่ ตรวจใหก้ ระจายเปน็ ฟลิ ม์ บางๆ ปล่อยให้แห้งในอากาศ
2.6 ชนิ้ เนอ้ื (biopsy) อาจท�ำแบบ touch หรอื ground specimen preparation ก็ได้ โดยใชก้ รรไกร
หรือใบมีดที่ปราศจากเชื้อตัดช้ินเนื้อให้เป็นช้ินเล็กๆ ใช้ forceps หยิบชิ้นเนื้อมากดบนสไลด์
สะอาดปราศจากไข ให้ท�ำหลายๆคร้ังโดยให้อยู่ใกล้ๆกันเพ่ือจะได้อ่านสไลด์ได้ง่ายหรือบด
ช้ินเนื้อให้ละเอียด ใชไ้ ปเปตปราศจากเช้อื ดดู มาหยดบนสไลด์สะอาดปราศจากไข 1 หยด ใช้
ปลายไปเปตเกลี่ยสิ่งตรวจให้กระจายเป็นฟิล์มบางๆมีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 cm
ปล่อยใหแ้ ห้งในอากาศ

3. การ fix smear (อาจใชค้ วามร้อนหรือ methanol ก็ได)้
3.1 การใช้ความร้อน น�ำสไลด์มาวางบน electric slide warmer 60 OC จนแห้งหรือผ่านสไลด์ท่ี
แห้งในเปลวไฟ 2-3 คร้ัง หรือเอาสไลด์มาอังไว้หน้า เครื่องเผา loop 5 ถึง 10 วินาที อย่าใช้
ความร้อนมากไปหรอื fix สไลด์ขณะท่ียังไม่แหง้ และปล่อยให้สไลดเ์ ย็นกอ่ นนำ� ไปยอ้ มสี
3.2 การใช้ methanol จะช่วยป้องกันไม่ให้เม็ดเลือดแดงและเซลล์อ่ืนๆของร่างกายแตก และ
ท�ำใหม้ ีพ้ืนหลงั (background) ทด่ี ูสะอาด การ fix ด้วย methanol เป็นวิธที ่ีใช้ได้ดีกบั ส่ิงตรวจ
ผปู้ ่วยโดยเฉพาะปัสสาวะเพราะจะชว่ ยปอ้ งกนั ไม่ให้หลุด วธิ ีท�ำปล่อยให้สไลด์ที่ smear แหง้
ในอากาศ แล้วหยด methanol 2-3 หยดบนสไลด์ ปล่อยไว้นาน 1 นาที เท methanol ออก
โดยไมต่ อ้ งลา้ งน้ำ� ปลอ่ ยใหส้ ไลดแ์ ห้ง ไมต่ อ้ งใช้ความร้อน

4. วิธกี ารยอ้ มสี
4.1 หยด working crystal violet solution ลงบนสไลด์ทง้ิ ไวป้ ระมาณ 1 นาที แลว้ ลา้ งน้�ำสะอาด
4.2 หยด Gram iodine บน slide ท้ิงไว้ประมาณ 1 นาที แลว้ ลา้ งน้�ำสะอาด
4.3 Decolorize ดว้ ย acetone iodine แล้วลา้ งนำ้� สะอาดทันที
4.4 ย้อมทับด้วย Safranin 30 วินาที ล้างน้�ำสะอาด แล้วผ่ึงให้แห้ง น�ำไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์
โดยตรวจดว้ ยก�ำลังขยาย 10 x 10 เทา่ จากน้นั ดรู ายละเอียดดว้ ยกำ� ลังขยาย 10 x 100 เท่า

คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 3 การวนิ ิจฉยั โรคตดิ เช้อื จากส่งิ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ 49

การรายงานผลและแปลผลการย้อมแกรมสิง่ ตรวจต่างๆ 3บทที่

1. ผลและการแปลผลใหด้ คู ณุ ภาพทว่ั ๆไปกอ่ นดว้ ยกำ� ลงั ขยาย 10 x 10 เทา่ โดยดวู า่ decolorized ดหี รอื ไม่
ถา้ ยอ้ มไดด้ พี น้ื หลงั ตอ้ งสะอาด ถา้ มเี มด็ เลอื ดขาวตอ้ งยอ้ มตดิ สแี กรมลบ ระวงั ไมอ่ า่ นตะกอนสเี ปน็ เชอื้ แบคทเี รยี
ดูความหนาของ smear วา่ เซลลไ์ ม่ทบั ซอ้ นกนั และจะไมท่ �ำให้แปลผลผิด
2. การตรวจดูด้วยกำ� ลังขยาย 10 X 10 เพือ่ ดูวา่ มกี ารอักเสบหรอื ไม่ โดยดู
- จำ� นวนของ PMNs, mononuclear cells
- จ�ำนวนของ squamous epithelial cells แบคทเี รียทเี่ ปน็ เชื้อประจ�ำถิ่น
- ต�ำแหนง่ และการเรยี งตวั ของแบคทเี รีย
3. ตรวจด้วยกำ� ลงั ขยาย 10 x 100 โดยดหู ลายๆ fields เพ่ือดูว่ามีเชื้อหรือไม่
- ถา้ ไมเ่ ห็นเชอ้ื ให้รายงานว่า “No organism seen”
- ถา้ พบเชอ้ื ให้รายงานคร่าวๆ และบอกลักษณะของเช้อื ทีพ่ บ ในกรณที ี่แบคทีเรยี ตดิ สีม่วง
อ่านผลเป็นแกรมบวก ในกรณีที่แบคทีเรียติดสีแดงอ่านผลเป็นแกรมลบ บอกรูปร่าง
ลักษณะ เช่น cocci, bacilli หรือ coccobacilli และการเรียงตัว เช่น เป็น chain หรือ
clusters เป็นตน้
4. ดรู ปู รา่ งของแบคทเี รียทพ่ี บเป็นส่วนใหญ่
- รูปร่างโดยรวมเป็น coccus, coccoid, coccobacilli, bacilli, fragment, yeast-like
- ลักษณะปลายเซลล์ กลม แบน ป่องออก เว้าเข้า การบวมออกข้างๆแสดงว่าอาจมี
สปอรแ์ ต่อาจเกิดจาก vacuole กไ็ ด้ มีรปู ร่างไม่แนน่ อน หรือตดิ สไี ม่แนน่ อนเปน็ ต้น
- ลักษณะดา้ นข้าง เป็นลกั ษณะขนาน ทรงรี เว้า หรอื ไมแ่ นน่ อน
- รูปรา่ งไมแ่ น่นอน (pleomorphism) ซึ่งอาจใช้คำ� ว่า diphtheroid หรือ coryneform ในการ
บรรยายลักษณะของแบคทีเรียแกรมบวก รูปแท่งที่มีรูปร่างไม่แน่นอน หรือติดสีไม่
สมำ�่ เสมอ เรียงตัวเปน็ ซรี่ ว้ั (palisade) หรือเป็นมมุ (V และ L shape)
5. การรายงานผล ควรรายงานให้ผู้ท่ีอ่านรายงานเกิดความสนใจ หรือถ้าผลท่ีได้มีความส�ำคัญควร
รายงานให้แพทย์ทราบทางโทรศัพท์
- การรายงานผลจากสิ่งตรวจผู้ป่วย ปัสสาวะให้ตรวจอย่างน้อย 20 fields ให้รายงานผลว่า
พบเชื้อเม่ือเห็นเช้ือเฉล่ีย 1 เซลล์หรือมากกว่า per oil immersion field ซ่ึงแสดงว่ามีเชื้อ

> 105 CFU/ml
- รายงานจ�ำนวนเชือ้ ท่ีพบครา่ วๆ โดยรายงานเปน็ ตวั เลข (numerical) หรอื บรรยายว่ามาก
นอ้ ย (descriptive) ก็ได้โดยใชเ้ กณฑ์ดังน้ี
5.1 การรายงานเปน็ ตวั เลข
1+ (<1 per oil immersion field)

คูม่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

50 บทที่ 3 การวินิจฉยั โรคตดิ เชื้อจากสิ่งตรวจด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์

2+ (1 per oil immersion field)
3+ (2 ถงึ 10 per oil immersion field)
4+ (predominant หรอื >10 per oil immersion field)
5.2 การบรรยายวา่ มากหรือน้อย
rare (< 1 per oil immersion field)
few (1 ถงึ 5 per oil immersion field)
moderate (5 ถงึ 10 per oil immersion field)
many (>10 per oil immersion field)
6. การตรวจสอบการย้อมแกรม หลังจากรายงานผลแล้วให้เก็บสไลด์ไว้นานพอที่จะน�ำกลับมาดู
ใหม่ได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่ผลการเพาะเช้ือหรือผลการทดสอบอ่ืนๆไม่ไปด้วยกัน การเก็บสไลด์ให้
ท�ำดังน้ี
- ซับ oil ออก ในกรณีท่ีต้องการเก็บเป็นสไลด์ท่ีใช้ในการสอน อาจใช้ xylene ล้าง oil ออก
และปิดสไลด์ด้วย permount และ cover slip เพื่อป้องกันไม่ให้สีซีด สไลด์ท่ีไม่ใช้แล้ว
ให้ทิ้งเป็นมูลฝอยติดเช้ือและมคี ม
- ถ้าเห็นว่าควรจะท�ำการย้อมสีอ่ืน เมื่อดูผลการย้อมแกรมแล้วแต่ไม่มีส่ิงตรวจที่จะน�ำมา
ย้อมได้ อาจท�ำการย้อมสไลด์ท่ีท�ำการย้อมแกรมแล้วนี้ได้ โดยล้าง oil ออกด้วย xylene
ล้างสไลด์ด้วย acetone-alcohol จนไมม่ สี ี แลว้ ด�ำเนินการยอ้ มสใี หม่
การควบคมุ คุณภาพ
1. ตรวจดสู ที ี่ใช้ย้อมทกุ วันวา่ ไม่มีตะกอนสี ถ้ามคี วรกรองก่อนใช้ การระเหยจะมผี ลตอ่ คุณภาพของสี
ท่ีใชจ้ งึ ไมค่ วรเทสใี ส่ขวดครง้ั ละมากๆ
2. ท�ำการย้อมเชื้อที่ใช้ควบคุมคุณภาพ คือ Escherichia coli ATCC 25922 และ Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 หรือ Staphylococcus aureus ATCC 25923 ทุกวันและทุกครั้งที่เปลี่ยนสีใหม่
ผลที่ควรไดค้ อื Escherichia coli เป็นแกรมลบรูปแท่ง
Staphylococcus epidermidis เปน็ แกรมบวกรูปกลม
Staphylococcus aureus เปน็ แกรมบวกรูปกลม
หรอื อาจใชส้ งิ่ ทขี่ ดู มาจากซอกฟนั มายอ้ มเพอื่ ควบคมุ คณุ ภาพกไ็ ด้เพราะจะไดท้ งั้ แบคทเี รยี แกรมลบและ
แกรมบวก
3. ปัจจัยทที่ �ำใหผ้ ลการยอ้ มแกรมไม่ดี
ก. ใช้สไลด์ทีไ่ ม่ไดท้ ำ� ความสะอาดก่อน การแชส่ ไลด์ใน 95% ethanol จะท�ำให้สไลด์สะอาด
ปราศจากไข เวลาใช้ให้หยบิ สไลดม์ าเชด็ หรือลนไฟก่อน
ข. smear หนาเกนิ ไป

คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทเี รียและรา

บทที่ 3 การวินจิ ฉยั โรคตดิ เชอ้ื จากสงิ่ ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ 51

ค. ใช้ความร้อนมากไปขณะที่ fix สไลด์
ง. ลา้ งน้�ำมากเกินไปขณะที่ยอ้ มสี
จ. เพ่ือควบคุมคุณภาพของการย้อมแกรมจึงควรมีระบบการตรวจสอบการรายงานผลการ
ย้อมแกรม โดยหัวหน้าห้องปฏิบัติการท�ำการสุ่มสไลด์ท่ีรายงานแล้วมาตรวจซ้�ำ หรือ
เปรียบเทียบผลการเพาะเชื้อกับผลการย้อมแกรมที่รายงานว่ามีความขัดแย้งกันหรือไม่
และควรจัดเกบ็ ตัวอยา่ งสไลดท์ ี่สวยๆไวเ้ พ่อื ใชใ้ นการสอน

3บทที่

Escherichia coli

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus

ภาพท่ี 3-3 ลักษณะการตดิ สีและการเรยี งตวั ของเช้ือทใี่ ชค้ วบคมุ คุณภาพการย้อมแกรม

ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

52 บทที่ 3 การวินจิ ฉัยโรคตดิ เชอื้ จากสงิ่ ตรวจด้วยกลอ้ งจุลทรรศน์

ตารางที่ 3-1 ลักษณะของเช้ือที่พบในส่ิงตรวจต่างๆและการรายงานผล
ก. แบคทเี รียแกรมบวกทพี่ บในส่ิงตรวจผปู้ ว่ ย

เชือ้ การรายงานผล สง่ิ ตรวจ ขอ้ เสนอแนะ

Actinomyces spp. Thin, beaded, branched Cervicofacial, ถ้ามี sulfur granules ล้าง

gram-positive filaments; ทรวงอก ชอ่ งท้องและ และบดบนสไลดแ์ ละยอ้ ม

may be within sulfur อุ้งเชิงกราน นำ้� จากปอด modified AFB stain

granules with peripheral หรอื นำ้� ลา้ งปอด

clubs

Nocardia spp. Long, thin, branching, เสมหะ น�้ำลา้ งปอด ย้อม modified AFB stain

beaded, gram-positive or ชนิ้ เนอ้ื หนอง เลือด การเพาะเชอ้ื ท่ี 45 OC จะ

irregularly staining และน�ำ้ ไขสนั หลัง ชว่ ยใหเ้ ชอื้ เจรญิ ได้เร็วขน้ึ

bacilli

Mycobacterium spp. Gram-positive beaded or ทางเดินหายใจ ยอ้ ม AFB stain

gram-neutral bacilli; found ปัสสาวะ ชิน้ เน้ือ

inside macrophage; bacilli น�้ำไขสนั หลัง

may be short to long, banded

or beaded, and/or slightly

curved; some species appear

pleomorphic and coccoid

Corynebacterium spp. Gram-positive pleomorphic, เลอื ด ช้ินเนอ้ื แผลที่ หากสงสัยว่าตดิ เชือ้

club-shaped, irregularly ผวิ หนงั indwelling C. diphtheriae ใน

staining bacilli or catheters ลิน้ หวั ใจเทยี ม การเพาะเชื้อให้เพม่ิ

coccobacilli with palisading ทางเดินหายใจส่วนบน อาหารพเิ ศษ

and/or angular arrangements และสว่ นลา่ ง

C. jeikeium Small coccobacilli

resembling streptococci

Propionibacterium Gram-positive, very เลือด นำ้� ไขสนั หลงั การหา propionic acid

spp. pleomorphic “diphtheroid” สิ่งคัดหลง่ั อื่นๆ โดย GLC มกั พบเปน็ เช้อื

forms that may branch แผลจากผวิ หนัง ปนเป้ือนจากผิวหนังใน

ขณะเกบ็ สิ่งตรวจ

คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

บทที่ 3 การวนิ ิจฉัยโรคตดิ เชอ้ื จากสง่ิ ตรวจด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ 53

เช้อื การรายงานผล ส่ิงตรวจ ขอ้ เสนอแนะ
Listeria
monocytogenes Gram-positive small to น�ำ้ ไขสนั หลงั เลอื ด ดู wet mount จาก

Erysipelothrix medium coccobacilli that นำ้� คร่ำ� รก ชิ้นเนื้อ ส่งิ ตรวจโดยตรงเพอ่ื ดู
rhusiopathiae
Lactobacillus spp. may be pleomorphic; occur จาก fetal tumbling motility; ถา้ มี

Bacillus spp. in short chains or palisades; เชือ้ หลายชนดิ ปนกนั

Clostridium อาจสับสนกบั เชอ้ื การใชว้ ธิ ี cold enrichment
perfringens
Corynebacterium หรือ อาจชว่ ยใหแ้ ยกเช้อื นี้ได้ 3บทที่

enterococci

ในช้ินเน้อื รายงานเป็น long, ชน้ิ เนอ้ื จากผวิ หนัง เลือด เกยี่ วข้องกบั อาชีพท่ี

slender, gram-positive bacilli สมั ผัสสตั ว์

ในเลอื ดรายงานเปน็ small

“coryneforms”

Medium, straight, uniform มกั พบเปน็ mixed การเพาะเชอ้ื ในสภาวะไร้

gram-positive bacilli with infection ไม่ค่อยพบจาก ออกซเิ จนจะชว่ ยให้เช้ือ

rounded ends; may form เลอื ดหรือน้ำ� ไขสนั หลงั เจรญิ ได้ดียิง่ ขึน้

chains or spirals; sometimes

short and coccobacillary

Medium to large square-ended อาจพบในสง่ิ ตรวจ มักพบปนเปอ้ื นในการ

gram-positive bacilli with หลายชนิด ในผู้ปว่ ยท่มี ี เพาะเช้อื อาจพบเปน็

parallel sides with or without ภูมคิ มุ้ กันบกพร่อง สาเหตกุ ารตดิ เช้อื ท่ตี า

spores; some species have หรือผ้ทู ฉ่ี ดี ยาเสพติด

spores that swell sides; may และพบเป็นสาเหตุ

stain gram variable or gram การตดิ เช้ือท่ตี า

negative with age

Gram-positive large เลอื ด แผล หนองจาก ทำ� การเพาะเช้อื บน EY

“boxcars” with no spore; ช่องท้อง และอบในภาวะทีไ่ ร้ O2
may stain gram-negative การไมพ่ บ PMNs อาจ

ใช้เปน็ เครื่อง บ่งชว้ี า่ เปน็

clostridial myonecrosis;

เปน็ เชอื้ ประจำ� ถนิ่ ในลำ� ไส้

คู่มือการปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

54 บทที่ 3 การวนิ ิจฉัยโรคติดเชือ้ จากส่งิ ตรวจด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์

เชอื้ การรายงานผล ส่งิ ตรวจ ข้อเสนอแนะ
Clostridium spp.
Gram-positive, gram- เลือด แผลในช่องทอ้ ง ฝี เปน็ เช้อื ประจ�ำถิน่ ของ
Streptococcus variable, or gram-negative ทางเดนิ อาหารและระบบ
pneumoniae bacilli, with or without สืบพันธุ์
Enterococcus spp. spores; bacilli may be large,
slender and short, or long;
Streptococcus sometimes form coils; often
viridans small than Bacillus spp.

Gram-positive cocci in pairs, ทางเดินหายใจสว่ นลา่ ง อาจใช้ Quellung test
lancet shapes, short chains เลือด นำ้� ไขสนั หลัง หรอื การตรวจหา antigen
สารคัดหลงั่ อ่ืนๆ ในส่ิงตรวจบางชนดิ

Gram-positive cocci in pairs, ปสั สาวะ แผลติดเชื้อ เช้อื ประจำ� ถน่ิ ของทาง
short chains; อาจมีลกั ษณะท่ี เลือด ฝใี นชอ่ งท้อง เดนิ อาหาร พบเปน็
คล้ายกบั S. pneumoniae สาเหตุการตดิ เชือ้ ใน
ผปู้ ว่ ยท่ไี ดร้ ับการรกั ษา
ดว้ ย expanded-spectrum
cephalosporins

Gram-positive cocci in pairs เลอื ด นำ�้ ไขสันหลัง อาจแยกได้ยากกับ
tetrads, clusters Corynebacterium และ
lactobacilli อาจใช้
antigen detection ส�ำหรับ
Streptococcus group A
และ B
การพบ S. bovis ในเลอื ด
มีความสมั พนั ธก์ บั มะเรง็
ของ colon (ลำ� ไส้) การ
เพาะเชื้อ nutritionally
variant streptococci
อาจเพาะบน BA
และทำ� cross streak
ด้วย S. aureus

ค่มู อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รียและรา

บทที่ 3 การวินิจฉัยโรคติดเช้ือจากสง่ิ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ 55

เชื้อ การรายงานผล สิ่งตรวจ ขอ้ เสนอแนะ
เชอ้ื ประจำ� ถน่ิ ของผวิ หนงั
Staphylococcus spp. Gram-positive cocci in pairs, ฝี แผลตดิ เชอื้ ทางเดิน และโพรงจมกู
tetrads, clusters หายใจ ชนิ้ เนอ้ื
สารคัดหล่งั ต่างๆ เชือ้ ประจ�ำถิน่ ในช่องปาก
indwelling catheters

Stomatococcus Large gram-positive cocci in เลอื ด (ผ้ปู ่วยภมู คิ ุ้มกนั
mucilaginosus pairs, tetrad บกพรอ่ ง) peritoneal
dialysates 3บทท่ี

ข. แบคทีเรยี แกรมลบทีพ่ บในส่งิ ตรวจผู้ปว่ ย

เชอื้ การรายงานผล สิ่งตรวจ ข้อเสนอแนะ
Enterobacteriaceae
Straight thick bacilli; short to ทางเดนิ ปสั สาวะ เชือ้ ที่เป็นสาเหตุของการ
Haemophilus spp., medium length with rounded แหลง่ อื่นๆ ติดเชื้อในโรงพยาบาล
Pasteurella spp., ends; antimicrobial-agent- มกั ดอื้ สารตา้ นจลุ ชีพ
fastidious gram- affected microorganisms หลายชนดิ
negative bacilli may be pleomorphic,
Legionella spp. filamentous, and/or irregular
staining
Vibrio spp.
Small coccoid to bacillary เลอื ด น�้ำไขสนั หลัง อาจใช้วธิ ี direct antigen
forms; pleomorphic; often ทางเดนิ หายใจส่วนล่าง detection เพ่อื หา
with filamentous forms ฝี แผลติดเชือ้ ตา Haemophilus type b จาก
อาจติดสีซดี ระบบสืบพันธุ์ ส่งิ ตรวจผปู้ ่วยโดยตรง

Pleomorphic slender bacilli ทางเดินหายใจสว่ นลา่ ง ในการเพาะเชือ้ ต้องใช้
of variable lengths that may อาหารพิเศษ การย้อม
stain pale ในสิง่ ตรวจผปู้ ว่ ย จากสิง่ ตรวจทม่ี เี ชอื้ หลาย
เชื้ออาจยอ้ มสไี ม่ติด ชนดิ อาจใช้ Gimenez
stain จะพบเชือ้ ได้ดขี นึ้

Slightly curved to straight อุจจาระ แผลตดิ เชือ้ ถ้ามีเชอ้ื หลายชนิดปน
bacilli กัน การใช้อาหารเลี้ยงเชอ้ื
เชน่ TCBS จะแยกเชอื้ ได้
ดีขนึ้

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

56 บทท่ี 3 การวนิ ิจฉยั โรคติดเชอ้ื จากส่งิ ตรวจด้วยกลอ้ งจุลทรรศน์

เชื้อ การรายงานผล ส่งิ ตรวจ ขอ้ เสนอแนะ

Pseudomonas spp. Thin bacilli; medium length ปัสสาวะ ทางเดินหายใจ ถ้าเป็น mixed infection
to long with rounded to สว่ นล่าง แผลตดิ เชอ้ื ใช้อาหารจำ� เพาะสำ� หรับ
pointy ends; often in pairs; ตา แหลง่ อน่ื ๆในผปู้ ว่ ย เชอื้ น้ี เชอื้ ทเ่ี ป็นสาเหตุ
antimicrobial-agent-affected ภมู คิ ุ้มกันบกพร่อง การติดเชอื้ ในโรงพยาบาล
microorganisms may appear มกั ดอื้ สารตา้ นจุลชีพ
filamentous, coiled, and/or หลายชนิด
pleomorphic

Fusobacterium Long slender bacilli, with ทางเดินหายใจ เป็นเชอ้ื ทอี่ ยู่ในรา่ งกาย
nucleatum, tapered to pointed ends; แผลติดเชอื้ เลอื ด ฝี
Capnocytophaga spp. “needle-like”; may be in
pairs, end to end, or
filamentous

Fusobacterium Highly pleomorphic bacilli แผล เลอื ด ฝี เปน็ เชอ้ื ทอี่ ยู่ในร่างกาย
necrophorum, with rounded to tapered
F. mortiferum, ends; pale and irregularly
or F. varium staining, with bizarre forms
and round bodies

Bacteroides spp. Pleomorphic straight bacilli แผล เลือด ฝี อาจใช้วิธี direct fluores-
with possible irregular to cent-antibody stain
bipolar staining เปน็ เชอ้ื ท่อี ยใู่ นรา่ งกาย

Neisseria spp., Medium to large cocci in ระบบสืบพนั ธุ์ ปัสสาวะ การหา N. meningitidis
Moraxella catarrhalis, pairs and tetrads, coffee bean ทางเดนิ หายใจสว่ นลา่ ง บาง serotype อาจใช้วธิ ี
Veillonella spp. shaped; no bacilli seen เลอื ด สารคัดหลงั่ direct antigen detection
แผลตดิ เช้ือ ฝี ได ้ ใช ้ selective medium
ในการเพาะเช้ือท่อี ยูป่ น
กนั หลายชนิด

Campylobacter spp. Thin, curved bacilli included อุจจาระ เลือด การเพาะเชอื้ ในภาวะทมี่ ี
Helicobacter spp. S shapes, gull wings, long ช้นิ เนอื้ จากกระเพาะ CO2 เพ่ิมขน้ึ และการใช้
spiral forms 42 OC จะแยกเชอ้ื ได้ดขี ้นึ

คู่มือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

บทที่ 3 การวินจิ ฉัยโรคติดเช้อื จากส่ิงตรวจด้วยกล้องจลุ ทรรศน์ 57

เช้อื การรายงานผล สิง่ ตรวจ ข้อเสนอแนะ
Acinetobacter spp.
Medium to large cocci in ปัสสาวะ ทางเดินหายใจ

pairs; occasionally coccoid, ส่วนลา่ ง เลอื ด สาร

bacillary, and filamentous คดั หลงั่ แผลติดเช้ือ ฝ ี

forms ติดสคี อ่ นไปทางแกรม ชิ้นเนอ้ื อุจจาระ

บวก แหล่งอืน่ ในผปู้ ่วย 3บทที่

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

ค. จลุ ชีพอ่ืนๆทตี่ รวจได้จากการทำ� direct smears ส่งิ ตรวจผู้ป่วย

เชอื้ การรายงานผล สง่ิ ตรวจ ขอ้ เสนอแนะ

Pneumocystis carinii Gram-negative spherical ปอด และ transtracheal ยนื ยนั ดว้ ยการย้อมสี

cysts (5-7 µm) often biopsies, bronchial Grocott metenamine-

containing rosette of eight washings and lavage silver, toluidine blue O,

gram-negative intracystic sputum Gram-Weigert, หรือการ

bodies; or cluster of gram- ยอ้ ม fluorescent stain

negative cysts surrounded

by halos in background of

amorphous gram-negative

material

Candida spp. Gram-positive budding เสมหะ ปสั สาวะ เลือด เปน็ เช้อื ที่อยู่ในรา่ งกาย

yeast cell with or without ชนิ้ เน้ือ ส่ิงคัดหลัง่ จาก

pseudohyphae; may appear ชอ่ งคลอด ทางเดนิ

stippled or gram neutral หายใจส่วนบน

Cryptococcus Partially or completely นำ้� ไขสนั หลัง เลอื ด ช้ิน ยนื ยันโดยการท�ำ india

neoformans gram-positive round yeast เนื้อ เสมหะ bronchial ink; direct antigen

cell with clear or red-orange washings แผลทีผ่ วิ หนัง detection กบั สงิ่ ตรวจ

halo; yeast cells may appear โดยตรง

stippled or gram neutral

ค่มู ือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

58 บทที่ 3 การวนิ ิจฉัยโรคตดิ เชอื้ จากสง่ิ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์

เชอื้ การรายงานผล ส่ิงตรวจ ขอ้ เสนอแนะ
Blastomyces เพาะในอาหาร
dermatitidis Gram-variable, broad-based, Bronchial washings, lipid-riched medium
thick-walled yeast cell with เสมหะ หนอง
Malassezia furfur figure-eight appearance แผลท่ีผิวหนงั

Bottle-shaped yeast cells in ขูดจากผวิ หนงั
compact clusters, usually เลอื ดทเ่ี จาะผ่าน
with short hyphal elements catheter lines

ข้อจ�ำกดั ของการย้อมแกรมเพ่อื วินิจฉัยโรคตดิ เชอื้

1. ควรใช้ผลการตรวจร่างกายและผลการตรวจอน่ื ๆเพ่ือชว่ ยสนบั สนุนสง่ิ ท่ีได้จากการย้อมแกรม
2. ผลการทดสอบจะถูกต้องมากน้อยเพียงใดขึ้นกับความแม่นย�ำในการทดสอบ และประสบการณ์
ของผูท้ ท่ี �ำการทดสอบและอา่ นผล
3. ควรท�ำการย้อมวธิ อี น่ื ร่วมดว้ ยในกรณีท่สี ิ่งตรวจเห็นเปน็ หนองแตย่ ้อมแกรมแลว้ ไม่พบเชือ้
4. ส่ิงตรวจท่ีย้อมแกรมแล้วพบเช้ือแต่เพาะเชื้อไม่ขึ้น อาจเนื่องจากมีเช้ือปนเปื้อนในน�้ำยาท่ีใช้ มี
สารต้านจุลชีพในส่ิงตรวจ หรือวิธีการเพาะเชื้อที่ใช้ไม่เหมาะสม เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้
บรรยากาศทใ่ี ช้ในการเพาะเช้อื เปน็ ตน้
5. ส่งิ ตรวจน้อยเกินไปอาจทำ� ให้ผลการยอ้ มแกรมไม่ถกู ต้อง

ขอ้ จำ� กัดของการย้อมแกรม

1. ผลการย้อมแกรมควรใช้ร่วมกับผลการทดสอบอ่ืน เช่น การย้อมพิเศษ การเพาะเช้ือ การหา
antigen
2. ทำ� การทดสอบอยา่ งถกู ต้องและทำ� ตามข้อกำ� หนดของการแปลผลเพอื่ ให้ผลทีไ่ ดถ้ ูกต้อง
3. ท�ำการยอ้ มสีอื่นๆเพ่มิ เตมิ ในกรณที ี่ไมพ่ บเช้ือจากการยอ้ มแกรม
4. การพบเช้ือจากการย้อมแกรมแต่เพาะเช้ือไม่ข้ึนอาจเกิดจากมีการปนเปื้อนเชื้อในสีย้อม หรือ
เชอื้ ไมส่ ามารถขนึ้ บนอาหารและบรรยากาศทีใ่ ชใ้ นการเพาะเชอ้ื
5. ผลการย้อมแกรมท่ีผิดพลาดอาจเกิดจากการเกบ็ สิ่งตรวจมานอ้ ยเกินไป

การวนิ จิ ฉัยการติดเชื้อราโดยการตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide

การตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide ไม่เหมาะกับการตรวจหา histoplasma yeast cells
เน่ืองจากเชื้อมีขนาดเล็กดูได้ยาก ดังนั้นถ้าแพทย์สงสัยโรค histoplasmosis ให้ตรวจสิ่งตรวจโดยการย้อม

คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทท่ี 3 การวนิ ิจฉัยโรคติดเชื้อจากสิง่ ตรวจดว้ ยกลอ้ งจุลทรรศน์ 59

แกรมหรือย้อมสี Giemsa หรือย้อมสี Wright ถ้ามีสีย้อมท้ัง 2 ชนิดน้ีพร้อมใช้อยู่ในห้องปฏิบัติการ ในกรณี 3บทที่
ท่ีสงสัย cryptococcosis ในสิ่งตรวจน้�ำไขสันหลัง ให้ท�ำการตรวจสดใน india ink การย้อมแกรมมีประโยชน์
ในการตรวจหาแกรมบวก aerobic actinomycetes แกรมบวกยีสต์ในสกุล Candida และยังช่วยให้เห็นการ
ปนเปอ้ื นของแบคทเี รยี ในสงิ่ ตรวจไดช้ ดั เจนขน้ึ การยอ้ มสีmodifiedKinyounacidfastมปี ระโยชนใ์ นการตรวจหา
acid-fast aerobic actinomycetes
วิธปี ฏบิ ัตงิ าน
1. การตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide
การวินจิ ฉยั ราในกลุม่ Dermatophytes ทีก่ อ่ โรคกลาก
ส่ิงตรวจ ผิวหนงั ผม
สารละลาย potassium hydroxide (KOH) ใช้ความเข้มข้น 10-30 % โดยชั่ง KOH ละลายใน
น้�ำกลั่น 100 ml ใช้กับผิวหนงั และผม
การปฏิบัติ หยดสารละลาย KOH 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์แก้ว ใช้เข็มเข่ียแตะสิ่งตรวจ (ส�ำหรับ
เส้นผมใช้คีมคีบ) จุ่มลงในหยดสารละลาย KOH บนแผ่นสไลด์แก้วที่เตรียมไว้ ปิดทับด้วย
cover glass ลนผ่านเปลวไฟ 3 คร้ัง ซับน้�ำยาส่วนเกินออก ท้ิงไว้ 5-30 นาที น�ำไปดูด้วย
กลอ้ งจลุ ทรรศน์เรมิ่ จากกำ� ลงั ขยาย 10 X และตามดว้ ยกำ� ลงั ขยาย 40 X
2. การตรวจสดในสารละลายผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide
สิง่ ตรวจ เล็บ
สารละลาย dimethyl sulfoxide 40 ml ผสมกับน�้ำกลั่น 60 ml เติม KOH 20 g คนให้เข้ากันจน
KOH ละลายหมด บรรจใุ ส่ขวดท่มี จี กุ หยด
การปฏิบัติ ใช้กรรไกรตัดตัวอย่างเล็บเป็นชิ้นเล็กและบางเท่าท่ีจะท�ำได้ ใช้คีมคีบชิ้นส่วนของเล็บ
จุ่มลงในหยดสารละลายผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide ท่ีหยดไว้ก่อนแล้ว
1 หยดบนแผน่ สไลด์แก้ว ปิดทบั ด้วย cover glass ไม่ตอ้ งลนไฟ นำ� ไปดูใตก้ ลอ้ งจลุ ทรรศน์เรมิ่ จาก
กำ� ลังขยาย 10 X และตามด้วยกำ� ลงั ขยาย 40 X

การอา่ นผลและรายงานผล
การตรวจสดโดยสารละลาย potassium hydroxide ส�ำหรบั สิ่งตรวจผวิ หนังและเลบ็ จะเห็นลักษณะ
ของราในกลมุ่ Dermatophytesเปน็ แบบเสน้ ใยใสมผี นงั กน้ั แตกกง่ิ กา้ น(hyalinebranchingseptatehyphae)
หรอื พบลักษณะ arthroconidia บนอพี ิทเี ลียลเซลล ์
รายงานผล “hyaline branching septate hyphae, arthroconidia suggesting dermatophytosis”

คมู่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา

60 บทท่ี 3 การวินจิ ฉยั โรคติดเช้ือจากสิง่ ตรวจด้วยกล้องจลุ ทรรศน์

สิง่ ตรวจ เส้นผมจะพบลกั ษณะท่แี ตกตา่ งกัน 3 แบบคือ
1. เช้ือสร้างโคนิเดีย รูปร่างกลมเกาะอยู่ภายนอกเส้นผม (ectothrix) เป็นลักษณะการก่อโรคของ รา
ในกลุ่ม Dermatophytes สกุล Microsporum
รายงานผล “ectothrix infection suggesting dermatophytosis”
2. เชื้อสร้างโคนิเดีย รูปร่างกลมเจริญอยู่ภายในเส้นผม (endothrix) เป็นลักษณะการก่อโรคของ รา
ในกล่มุ Dermatophytes สกุล Trichophyton
รายงานผล “endothrix infection suggesting dermatophytosis”
3. เช้อื สรา้ งเสน้ ใยเปน็ ท่อนยาวเรยี งตัวอย่ใู นเส้นผมเปน็ ลกั ษณะเฉพาะของรากลมุ่ Dermatophytes
เชือ้ Trichophyton schuenleinii.
รายงานผล “favic infection suggesting dermatophytosis”

3. การตรวจสดส่ิงตรวจท่ีสงสัยโรค cryptococcosis ใน india ink preparation
สงิ่ ตรวจ น้�ำไขสนั หลัง
การปฏิบัติ หยด india ink 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์แก้วและตามด้วย 1 loop เต็มของส่ิงตรวจ
ผสมเข้าด้วยกันและปิดทับด้วย cover glass กดทับเบาๆให้เป็นแผ่นบาง ไล่ฟองอากาศออก
นำ� ไปดูดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์เร่ิมจากกำ� ลงั ขยาย 10 X และตามดว้ ยกำ� ลงั ขยาย 40 X
การอา่ นผลและรายงานผล
พบเซลล์ยีสต์รูปร่างกลม ผนังเซลล์หนา มีขนาดแตกต่างกันไปตั้งแต่ 3-20 µm และพบ
เซลล์ยีสต์แตกหน่อ (budding yeasts) รอยต่อของเซลล์เป็นฐานแคบ พ้ืนสีด�ำที่เห็นใน
กล้องจุลทรรศน์เป็นสีด�ำของ india ink ซึ่งไม่สามารถซึมผ่านเข้าส่วนของแคปซูลได้ จึงเห็น
แคปซูลเป็นส่วนใส วาว อยู่รอบนอกของเซลล์ ความหนาแน่นของเช้ือมีมากขึ้น ความแตกต่าง
ของขนาดของเซลล์ และความหนาของแคปซูลก็มีมากขึ้น encapsulated cryptococci สามารถ
แยกความแตกตา่ งไดช้ ดั เจนกบั oval blastospores ของ Candida
การรายงานผลการตรวจสดส่ิงตรวจท่ีสงสัยโรคคริปโตคอกโคซีสในอินเดียอิงค์ และตรวจพบ
encapsulated yeast cells
รายงานผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”
หรอื “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บทที่ 3 การวนิ ิจฉัยโรคตดิ เชือ้ จากสิ่งตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ 61

เอกสารอา้ งอิง 3บทที่

1. Ayers LW. Microscopic Examination of Infected Materials. In: Mahon CR, Manuselis
G editors. Textbook of Diagnostic Microbiology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders
Company; 2000. p. 261-310.
2. Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, 9th ed.
St. Louis: C.V. Mosby Co.; 1994.
3. Bartholomew JW. Variables influencing results, and the precise definition of steps in gram
staining as a means of standardizing the results obtained. Stain Technol. 1962; 37:139-155.
4. Clarridge JE, Mullins JM. Microscopy and staining. In: Howard BJ editor. Clinical and
Pathogenic Microbiology. St. Louis: C.V. Mosby Co.; 1987. p. 87-103.
5. Engelkirk PG, Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections.
In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology.
Baltimore: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p. 507-540.
6. Hazen KC, Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing (Microscopic Clinical
Specimen Examination). In: Garcia LS editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook,
3rd ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007. p.8.3.1.1-8.3.1.9.
7. Howell SA, Hazen KC. Candida, Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance. In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of
Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.1793-1821.
8. Isenberg HI. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press;
1998. p.39-50.
9. Mangels JI, Cox ME, Lindberg LH. Methanol fixation. An alternative to heat fixation of smears
before staining. Diagn Microbiol Infect Dis. 1984; 2:129-137.
10. Murray PR, Washington JA. Microscopic and bacteriologic analysis of sputum. Mayo Clin.
Proc. 1975; 50:339-344.
11. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Gram stain. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for
Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 39-50.
12. Preston NW, Morrell A. Reproducible results with the Gram stain. J Path Bact. 1962;84:241-243.
13. Shanholtzer CJ, Schaper P, Peterson L. Concentrated Gram stain smears prepared with a
cytospin centrifuge. J Clin Microbiol. 1982; 16:1052-1056.
14. Washington JA. Rapid diagnosis by microscopy. Clin Microbiol Newls. 1986; 8:135-137.

ค่มู ือการปฏบิ ัติงานแบคทเี รียและรา



บทที่ 4
ข้ันตอนการเพาะเชอื้ จากสิง่ ตรวจ

4.1 การเพาะเช้ือจากเลอื ด

สวุ รรณา ตระกูลสมบรู ณ์
วภิ า ตรรี ัตน์วรี พงษ์
ฉนั ทนา อรญั ญะ

หลักการ 4บทที่

การตดิ เชื้อแบคทีเรียในกระแสเลอื ด (bacteremia) ถอื เป็นภาวะวิกฤติทอี่ าจทำ� ให้ผ้ปู ว่ ยเกิดภาวะ septic
shock และเสยี ชวี ิตได้ค่อนขา้ งสูง การตดิ เชอ้ื อาจมาจากการทเ่ี ช้ือเขา้ สเู่ ลือดโดยตรงหรือมาจากตำ� แหน่งตา่ งๆ
ของรา่ งกายทมี่ กี ารตดิ เชอ้ื ชนดิ นนั้ ๆอยแู่ ลว้ เชน่ การตดิ เชอ้ื จากแผลผา่ ตดั ระบบทางเดนิ หายใจ ระบบปสั สาวะ
ระบบสืบพันธ ุ์ เปน็ ต้น
เชื้อท่ีเป็นสาเหตุก่อโรคท่ีพบบ่อย ได้แก่ เช้ือในกลุ่ม Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas spp., Streptococcus group A และ group อ่ืนๆ, Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Enterococcus spp., Neisseria meningitidis และ Vibrio spp. เป็นต้น
เช้ือประจ�ำถิ่นเช่น coagulase negative staphylococci อาจเป็นสาเหตุท่ีท�ำให้เกิดการติดเชื้อในผู้ป่วยท่ีใส่
สายตา่ งๆเขา้ ไปในรา่ งกายผปู้ ว่ ยมะเรง็ เบาหวานผปู้ ว่ ยทมี่ ภี าวะภมู คิ มุ้ กนั บกพรอ่ งภาวะเมด็ เลอื ดขาวตำ่� เปน็ ตน้
การพิจารณาว่าเป็นเช้ือก่อโรคหรือปนเปื้อน จะพิจารณาร่วมกับอาการทางคลินิกของคนไข้ ระยะ
เวลาการเจริญเติบโตของเช้ือท่ีให้ผลบวกในแต่ละขวด จ�ำนวนขวดที่ให้ผลบวก และแบบแผนความไวของ
สารตา้ นจลุ ชพี ของแตล่ ะขวด การเพาะเชอื้ จากเลอื ดจงึ เปน็ การวนิ จิ ฉยั ทต่ี อ้ งคำ� นงึ ถงึ ความถกู ตอ้ ง การรายงาน
ผลทรี่ วดเรว็ เปน็ แนวทางส�ำหรับแพทย์ในการเลือกใชส้ ารตา้ นจลุ ชีพทเ่ี หมาะสมสำ� หรับผู้ปว่ ย

ขอบเขต

การเจาะเลือดเพื่อเพาะเชื้อ การตรวจรับส่ิงตรวจ การเพาะเช้ือจากเลือดด้วยวิธีทั่วไป (conventional
method) หลักการเพาะเชื้อจากเลือดด้วยระบบก่ึงอัตโนมัติ การอ่านผลการเพาะเชื้อ การรายงานผลเม่ือพบ
เช้ือจากการย้อมแกรม การรายงานผลเมื่อเสร็จสมบูรณ์ การแปลผลและการควบคุมคุณภาพการเพาะเช้ือ
จากเลอื ด

64 บทท่ี 4 ขั้นตอนการเพาะเช้อื จากสิ่งตรวจ

วธิ กี ารปฏิบตั ิงาน
ข้นั ตอนการเจาะเลือดเพอื่ เพาะเช้อื
1. ก่อนเจาะเลือดควรท�ำความสะอาดมือโดยการล้างมือด้วยน�้ำยาท�ำลายเชื้อเช่น 4% Chlorhexidine
gluconate หรือใช้ alcohol hand rub และสวมถุงมือสะอาด
2. ทำ� ความสะอาดผิวหนงั ต�ำแหน่งทจี่ ะเจาะเลือดดว้ ย 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol
ซึ่งมีประสิทธิภาพการฆ่าเช้ือดีเทียบเท่า povidone-iodine แต่แห้งเร็วกว่าและมีระยะเวลาในการ
รอคอยให้มปี ระสทิ ธภิ าพฆ่าเชอื้ สูงสุดสน้ั กวา่ ใชเ้ วลารอใหแ้ ห้งและออกฤทธ์ิสงู สดุ เพียง 30 วินาท ี
ขณะท่ี povidone-iodine ใช้เวลานานถึง 2 นาที ผู้ปฏิบัติงานมักไม่รอถึง 2 นาที นอกจากนี้
Chlorhexidine gluconate มีฤทธิ์คงเหลือหลังทาน้�ำยาด้วย จึงเป็นน�้ำยาท่ีควรใช้เพ่ือลดการ
ปนเปื้อนในการเจาะเลือดเพื่อเพาะเช้อื
3. การเช็ดผิวหนังให้วนจากด้านในออกด้านนอกอย่างน้อย 5 cm เช็ดด้วยความแรงนาน
30 วนิ าที และรอแห้งไม่นอ้ ยกว่า 30 วินาที เด็กแรกเกดิ ใช้ 70% alcohol หรือ povidone-iodine
4. เจาะเลือดเพื่อเพาะเชื้อเมื่อผู้ป่วยมีข้อบ่งชี้สงสัยการติดเช้ือแบคทีเรียหรือเชื้อราในเลือด ควรเจาะ
ช่วงทีม่ ีการแบง่ ตวั ของเช้อื ในเลือดจำ� นวนมาก ระยะเริ่มมีไข้
5. ควรเจาะเลือดก่อนรับยาปฏิชีวนะ กรณีได้รับยาปฏิชีวนะมาก่อนควรเจาะเร็วท่ีสุดหลังรับยา
หรือเจาะที่ 15 นาทีก่อนรับยาปฏิชีวนะคร้ังต่อไป กรณีไม่เร่งด่วน เจาะเลือดสองครั้งห่างกัน
15-30 นาที กรณตี อ้ งรีบให้ยาปฏชิ ีวนะสามารถเจาะเลอื ดพรอ้ มกันจากตำ� แหนง่ ท่ีต่างกนั ถา้ สงสัย
การตดิ เช้ือลนิ้ หวั ใจเจาะอยา่ งนอ้ ยสองขวดห่างกัน 12 ชม.
6. เจาะจากเส้นเลือดด�ำบริเวณท่ีไม่มีแผลหรือรอยโรค ปริมาณเลือดต้องให้ได้ตามก�ำหนดของขวด
เพาะเชอ้ื กรณีไมส่ ามารถเจาะเลอื ดได้ตามก�ำหนดต้องบันทกึ ในใบส่งตรวจ
7. ท�ำความสะอาดจุกของขวดเพาะเช้ือด้วย 70% alcohol หรือ 2% Chlorhexidine gluconate ใน
70% alcohol
8. ใส่เลือดลงขวดเพาะเชื้อโดยไม่จ�ำเป็นต้องเปล่ียนเข็ม หมุนขวดเบาๆเพื่อให้เลือดผสมกับน�้ำยา
เพาะเชอื้
9. นำ� สง่ ห้องปฏบิ ัติการทนั ที ถ้าไม่สามารถส่งไดท้ นั ทหี ลงั เจาะเลอื ดควรเก็บท่ีอุณหภูมิหอ้ ง และต้อง
บันทึกระยะเวลาที่รอคอยก่อนส่งตรวจเป็นข้อมูลเพิ่มเติมของส่ิงตรวจในใบน�ำส่ง และควร
ค�ำนึงถึงผลกระทบที่ท�ำให้เพิ่มระยะเวลารอคอยผลและมีผลต่อความปลอดภัยของผู้ป่วยเนื่องจาก
ตอ้ งรายงานผลเป็นค่าวกิ ฤติ

คู่มอื การปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทที่ 4 ขั้นตอนการเพาะเชอื้ จากส่งิ ตรวจ 65

ขัน้ ตอนการตรวจรับส่งิ ตรวจ ใหต้ รวจสอบสงิ่ ตอ่ ไปนี้

1. ชื่อ นามสกุลผปู้ ว่ ยกับใบน�ำส่งถูกตอ้ งครบถ้วนสมบูรณ์

2. สภาพขวดหากพบมีรอยแตกรา้ ว ตอ้ งปฏิเสธตัวอยา่ ง
3. ปริมาตรของเลอื ดทเ่ี จาะ ถา้ ไม่เหมาะสมต้องระบุในใบรายงานผล
4. การเก็บขวดเลือดหลังจากการเจาะ ต้องมีวิธีการเก็บท่ีถูกต้องเหมาะสมก่อนท�ำการเพาะเช้ือ เช่น
เก็บในอณุ หภูมทิ ี่ถูกต้องเหมาะสม ห้ามนำ� เขา้ ตู้เยน็
5. ไมม่ ีสำ� ลีปิดทับบนจุกยาง หรอื มสี ขี อง iodine บนจกุ ยาง ถ้ามีควรแจ้งผใู้ ชบ้ รกิ ารให้แกไ้ ข
6. ระยะเวลาน�ำส่งหลังเจาะเลือด ถา้ นานเกนิ กำ� หนดควรบันทกึ ในใบรายงานผล

การเพาะเชอ้ื จากเลือดดว้ ยวธิ ที ่วั ไป (conventional method) 4บทท่ี

การเตรยี มอาหารเล้ยี งเช้อื อาจใช้ BHI broth, TSB ทีเ่ ตมิ สารป้องกันการแขง็ ตัวของเลือด 0.05% sodium
polyanethol sulfonate (SPS) ปรมิ าณเลือดที่เก็บส�ำหรับผู้ปว่ ยผใู้ หญ่ 5-10 ml ตอ่ อาหาร 45 ml ส�ำหรบั ผปู้ ่วย
เด็กปริมาณเลือด 1-2 ml ต่ออาหาร 9 ml โดยอัตราส่วนระหว่างเลือดและปริมาณอาหารประมาณ 1:5 ถึง
1:10  น�ำขวด hemoculture อบที่ 35-37 OC นาน 7 วัน ท�ำการเพาะเชื้อหลังอบขวดข้ามคืน และรายงานผล
เบ้อื งตน้ หากเช้อื ยงั ไม่ข้นึ ใหส้ งั เกตดกู ารเจริญของเชือ้ ทุกวนั ขวดที่มีการเจริญของเช้ือจะมลี ักษณะตอ่ ไปนี้คอื
อาหารเลี้ยงเชื้อมคี วามขนุ่ บรเิ วณผวิ หนา้ หรอื ขุ่นทั้งขวด มกี ารแตกทำ� ลายของเม็ดเลือดแดง มีเม็ดสขี าวเลก็ ๆ
อยู่บนผิวหน้า หรืออยู่เหนือชั้นเม็ดเลือด ขวดอาหารเลี้ยงเช้ือมีฟองก๊าซ หรือก้อน clot หรือมีก้อนคล้ายส�ำลี
ในกรณที ่พี บลักษณะดงั กล่าวให้เพาะเช้ือทันทีบน CA, BA และ MAC อบ plate CA ในบรรยากาศ  5-10% CO2
ท ่ี 35-37OC น าน 2 -3 ว นั สำ� หรบั B A แ ละ M AC อ บท ่ี3 5-37OC น าน 2 -3 ว นั พ รอ้ มกบั ปา้ ยลงสไลดท์ ำ� การยอ้ มแกรม

การเพาะเชอ้ื จากเลอื ดด้วยระบบกง่ึ อัตโนมตั ิ (continuously monitored automated blood culture system)

ปริมาณเลือดต่อขวดประมาณ 5-8 ml ปริมาณที่เหมาะสมจะมีค�ำแนะน�ำจากบริษัทผู้ผลิตบ่งชี้ไว้ข้าง
ขวด น�ำขวดใส่เครอื่ งเพาะเช้ือที่อุณหภูมิ 35-37 OC เครอ่ื งจะท�ำการตรวจอตั โนมัตอิ ยา่ งต่อเน่อื งตามหลกั การ
ท่ีแตกต่างกันไปของแต่ละบริษัท ระยะเวลาในการอบขวดเพาะเช้ือภายใน 5 วัน ไม่มีความจ�ำเป็นท่ีต้องอบ
เพาะเช้ือเกิน 5 วัน ส�ำหรับเช้ือท่ีสงสัยในกลุ่ม HACEK, Brucella, Capnocytophaga และ Campylobacter
และไม่มีความจ�ำเป็นในการท�ำ blind subculture เมื่อพบการเจริญของเชื้อระบบจะมีการแจ้งเตือน (alarm)
ผ่านหน้าจอ monitor น�ำขวดท่ีให้ผลบวกออกมาท�ำการ subculture และย้อมแกรม พร้อมท้ังโทรแจ้งผล
เบอื้ งตน้ และออกใบรายงานผลเปน็ ลายลักษณอ์ กั ษรตามไปด้วยทุกครัง้

หมายเหตุ เพอ่ื ลดอัตราการปนเปือ้ นควรใช้ 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol ทำ� ความสะอาด
บริเวณจุกยาง หรืออาจใช้ 70% alcohol ในการเช็ดจุกขวดเพาะเช้ือ ไม่แนะน�ำให้ใช้สารท่ีมี
iodine เป็นส่วนประกอบเชด็ จกุ ยางเพราะอาจท�ำใหจ้ ุกยางเปลย่ี นสภาพได้

คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

66 บทที่ 4 ขั้นตอนการเพาะเชือ้ จากสิง่ ตรวจ

การอา่ นผล
อา่ นผลการเพาะเชอ้ื ทำ� การแยกชนดิ เชอ้ื ทขี่ น้ึ บนอาหารเพาะเชอื้ ท่ี subculture ไว้ พรอ้ มทงั้ ทดสอบความ
ไวของเชอ้ื ต่อสารตา้ นจลุ ชีพ

การรายงานผล
การรายงานผลเบอื้ งต้น
1. กรณีไมม่ เี ช้ือเจริญ (no growth) ให้รายงานระยะเวลาทอี่ บขวด (no growth at 24 hours, no growth
at 48 hours หรอื no growth after x days) ทัง้ น้จี ำ� นวนวนั (x) ขึน้ อยกู่ บั นโยบายของห้องปฏิบตั กิ าร
ที่ทำ� ความตกลงกบั แพทยใ์ นแต่ละโรงพยาบาล
2. กรณีมีเชื้อเจริญ (positive culture) ท�ำการรายงานผลแกรม การติดสี รูปร่าง และลักษณะการ
เรียงตัวเพื่อเป็นประโยชน์กับแพทย์ในการพิจารณาเลือกใช้สารต้านจุลชีพที่เหมาะสมต่อผู้ป่วย
การย้อมแกรมถือเป็นค่าวิกฤติท่ีต้องรีบรายงานทันที การรายงานผลทางโทรศัพท์ต้องบันทึกช่ือ
ผู้รับแจ้ง วัน-เวลา และผู้ท่ีท�ำการแจ้ง พร้อมออกใบรายงานผลตามหลังจากการแจ้งทางโทรศัพท์
ดว้ ยทุกครัง้

การรายงานผลทเ่ี สร็จสมบูรณ์
1. กรณีไม่มีเชื้อเจริญ (no growth) ให้ระบุระยะเวลาที่เพาะเช้ือด้วยเช่น no growth after 7 days
ส�ำหรับการเพาะเชื้อด้วยวิธี conventional method และ no growth after 5 days ส�ำหรับการ
เพาะเช้อื ด้วยวิธี continuously monitored automated blood culture system
2. กรณีมีเช้ือเจริญ (positive culture) รายงานผลการวินิจฉัยเช้ือ และผลความไวต่อสารต้านจุลชีพ
ระบุจ�ำนวนขวดท่ใี ห้ผลบวกในชดุ นนั้
3. กรณที เ่ี พาะเชอื้ โดยเครอื่ งตรวจอตั โนมตั ิ การรายงานเวลาขวดเลอื ดทใี่ หผ้ ลบวก (time to detection)
ในขวดที่เจาะจากเส้นเลือดด�ำ กับขวดท่ีเจาะจาก catheter ถ้าขวดที่เจาะผ่าน catheter ใช้เวลาท่ีให้
ผลบวกน้อยกว่าขวดท่ีเจาะจากเส้นเลือดด�ำ มากกว่าหรือเท่ากับ 2 ชม. และเช้ือที่แยกได้จาก
ทั้งสองขวดเป็นเชื้อชนิดเดียวกันแสดงว่าการติดเชื้อน้ันน่าจะมีความสัมพันธ์กับการใช้ catheter
(catheter-related bloodstream infections) ดูความสอดคล้องกับการติดเชื้อในต�ำแหน่งต่างๆ และ
ผลแกรมทรี่ ายงานเบอื้ งต้น
4. ในใบรายงานผลควรระบุส่ิงที่ไม่สอดคล้องกับข้อก�ำหนดท่ีอาจมีผลต่อการเพาะเช้ือด้วยทุกคร้ัง
เชน่ ได้ปริมาณเลือดน้อยกวา่ ก�ำหนด การส่งตัวอยา่ งล่าชา้ เป็นตน้

คู่มอื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 4 ขนั้ ตอนการเพาะเชอ้ื จากสิง่ ตรวจ 67

การแปลผลการเพาะเชื้อจากเลอื ด 4บทที่
เนื่องจากพบมีอุบัติการณ์ของการติดเชื้อในกระแสเลือด ท่ีเกิดจากเชื้อแบคทีเรียท่ีปรกติไม่ได้เป็น
เช้ือก่อโรค หรือก่อโรคไม่รุนแรง เช่น เช้ือประจ�ำถิ่น (normal flora bacteria) ท่ีพบในคนปรกติ การแปลผล
การเพาะเชื้อจากเลือดเพ่ือแยกความส�ำคัญของการพบเช้ือดังกล่าวออกจากการปนเปื้อนท�ำได้ยากมาก
เนื่องจากในอีกด้านหนึ่ง การพบการปนเปื้อนของเชื้อในกระแสเลือด อาจท�ำให้มีการใช้ยาต้านจุลชีพเกิน
ความจ�ำเป็น มีการตรวจวิเคราะห์มากข้ึนหรือมีการปรึกษาแพทย์เฉพาะทาง และเพ่ิมระยะเวลาการอยู่
โรงพยาบาลนานขึ้น ค่าใช้จ่ายท่ีเกี่ยวเน่ืองจากการพบผลบวกปลอมของการเพาะเช้ือของเลือด มีมากถึง 40%
ส�ำหรับการรับสารต้านจุลชีพและการทดสอบเพ่ือแยกชนิดของเช้ือในห้องปฏิบัติการ การที่ไม่สามารถแยก
contamination ออกจาก true infection จึงมีผลกระทบมาก ดงั น้ันตวั ช้ีบ่งทสี่ ามารถช่วยแยก probable pathogen
ออกจาก contamination จงึ มีความสำ� คญั สำ� หรบั การแปลผลการเพาะเชอ้ื จากเลอื ด

ตัวบ่งชที้ ี่ใช้ในการแปลผลของการเพาะเช้ือในเลอื ด
ตวั บง่ ชที้ ใ่ี ชใ้ นการแปลผล เพอื่ พจิ ารณาแยกการเพาะเชอ้ื ทพ่ี บเชอื้ กอ่ โรคในกระแสเลอื ด ออกจากการพบ
เชอื้ ปนเปือ้ นในเลอื ด ตัวชวี้ ดั เหลา่ นใ้ี ชแ้ สดงให้แพทย์และห้องปฏิบัตกิ ารทราบว่าตวั อยา่ งตรวจนา่ จะมีเช้อื ปน
เปอื้ นระหว่างการเก็บตัวอย่างหรือในขั้นตอนการวิเคราะห์ เชน่
- ความถ่ีของการพบมีเช้ือข้ึนในขวดจากจ�ำนวนขวดท่ีท�ำการเพาะเช้ือ (positive bottles among
collections) เช่น การเจาะเลอื ดสามขวดและมีเชอื้ ขน้ึ ท้งั สามขวด หรอื เจาะเลอื ดสองขวดเพาะเช้อื
ได้ท้ังสองขวด โอกาสที่ผู้ป่วยมีการติดเชื้อในกระแสเลือดเพียงขวดเดียวจากการเจาะเลือด
สามขวด เป็นต้น
- ผลการย้อมแกรมจากขวดเลือดเพาะเชื้อ พบเช้ือ gram-positive cocci in cluster แสดงว่าเป็นเช้ือ
staphylococci ซึง่ อาจจะเป็น เชอื้ กอ่ โรคคือ Staphylococcus aureus หรือ อาจจะเป็นเชอ้ื ประจ�ำถิน่
ที่ผิวหนังเป็น coagulase-negative Staphylococcus ซึ่งไม่ก่อโรค ถ้าย้อมได้ gram-positive rod
ตัวโต ชี้บ่งว่าเป็น Bacillus spp. ซึ่งเป็นเช้ือปนเปื้อนในส่ิงแวดล้อม แสดงว่ามีการปนเปื้อนที่
ต�ำแหน่งเจาะเลือดและท�ำความสะอาดผิวหนังไม่ดี การชี้บ่งการติดเช้ือด้วยการย้อมแกรม
อยา่ งเดยี วไมเ่ พียงพอ เน่ืองจากเชอื้ บางส่วนท่ีกล่าวมานี้อาจเป็นเชอ้ื กอ่ โรคไดด้ ้วย
- จำ� นวนและชนดิ ของเมด็ เลอื ดขาวในเลอื ด ขณะทมี่ กี ารตดิ เชอ้ื ในกระแสเลอื ดผปู้ ว่ ยทมี่ ภี มู ติ า้ นทาน
ปรกติ ถ้ามี left shift (>10 % bands) โดยจ�ำนวนเม็ดเลือดขาวไม่เพ่ิมข้ึนมักมีความสัมพันธ์กับ
positive blood culture
- จ�ำนวน species ทีแ่ ยกไดจ้ ากเลอื ดแตล่ ะขวด เชอ้ื ที่เพาะไดห้ ลายตัว (multiple organisms isolates)
มักสัมพันธ์กับการปนเปื้อน เน่ืองจากท�ำความสะอาดผิวหนังไม่ดี การติดเช้ือในเลือดมักพบเช้ือ
เพยี งชนิดเดยี ว

คูม่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รยี และรา

68 บทที่ 4 ขั้นตอนการเพาะเชื้อจากส่งิ ตรวจ

- อาการแสดงของผปู้ ว่ ย เช่น มไี ขส้ ูง หรือไขต้ �่ำๆ ผู้ป่วยที่ไมม่ ไี ขแ้ ตม่ ี positive blood culture มกั เกดิ
คำ� ถามวา่ ผลการเพาะเช้ือเช่อื ถอื ไดห้ รอื ไม่
- ระยะเวลาท่ีใช้ในการเจริญเติบโตจนตรวจพบเช้ือ ถ้าเจาะเลือดได้เพียงพอเวลาท่ีแบคทีเรียแบ่งตัว
จนตรวจพบเชือ้ ไดม้ ักไมเ่ กนิ 48 ชม. กรณีทีม่ ีเชอ้ื ปรมิ าณมาก จนตรวจพบ positive culture ไดเ้ รว็
ในทางกลับกันเช้ือท่ีโตช้าช้ีบ่งว่ามีเช้ือปริมาณน้อยมากท่ีเข้าไปในขวด ซึ่งมักมีความจ�ำเพาะคือ
ไม่มีเชอื้ ในเลือด แต่มีการปนเป้ือนในขวดเลือดจากเชือ้ ที่มีแหล่งจากภายนอก

เชื้อท่นี า่ จะเป็นเชือ้ ปนเป้อื น (probable contamination)
1. การเพาะได้เช้ือต่อไปน้ีจากเลือดเพียงขวดเดียว ในขณะท่ีท�ำการเพาะเช้ือมากกว่าหรือเท่ากับ
สองขวดได้แก่ Bacillus spp., Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes, coagulase-
negative staphylococci
2. การพบเชือ้ หลายชนดิ ในเลือดเพียงขวดเดยี วจากการเจาะเลือดอยา่ งนอ้ ยสองขวด
3. เชื้อที่แยกได้จากเลือดของคนไข้ท่ีไม่มีอาการติดเช้ือ หรือหลักฐานทางแพทย์ไม่สอดคล้องกับผล
การเพาะเชื้อ
4. เชื้อก่อโรคท่ีเป็นสาเหตุของการติดเช้ือในต�ำแหน่ง primary site เป็นคนละชนิดกับที่แยกได้จาก
เลอื ด

เช้อื ท่ีน่าจะเป็นเชื้อกอ่ โรค (probable pathogen)
1. เช้ือที่แยกได้เป็นชนิดเดียวกับที่แยกได้จากเลือดท่ีเจาะซ้�ำใหม่ ในเวลาที่ต่างกัน หรือเจาะจาก
ตำ� แหนง่ ทีต่ า่ งกัน
2. แยกเชื้อท่ีจ�ำเพาะบางตัวได้จากเลือดของผู้ป่วยที่มีการติดเช้ือ endocarditis เช่น Enterococcus
spp. หรอื เช้ือแกรมลบชนิดแทง่
3. เชื้อท่ีจ�ำเพาะ เช่น เช้ือในกลุ่ม Enterobacteriaceae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus

pyogenes, Streptococcus group B และเชื้อแกรมลบชนิดแอนเอโรบคิ เป็นต้น
4. เชื้อประจ�ำถ่ิน (normal microbial flora) ท่ีแยกได้จากเลือดของผู้ป่วยที่สงสัยมีการติดเชื้อใน
กระแสเลอื ดและมี prosthetic devices หรือมภี มู ิคมุ้ กันบกพร่อง หรอื ไดร้ ับสารกดภูมิต้านทาน
5. เชื้อท่ีพบได้ไม่บ่อยแต่แยกได้จากผู้ป่วยที่มีประวัติพิเศษ เช่น เดินทางไปต่างประเทศ หรือเชื้อท่ีใช้
อาวุธชีวภาพ เช่น Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Yersinia pestis,
Burkholderia pseudomallei
6. เชอ้ื บางชนดิ ทไ่ี มส่ ามารถเจรญิ บนอาหารสงั เคราะห์ วนิ จิ ฉยั ไดโ้ ดย serological test หรอื molecular
method เชน่ Coxiella, Chlamydia spp., Rickettsia spp.

ค่มู ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทที่ 4 ข้ันตอนการเพาะเชื้อจากสง่ิ ตรวจ 69

ตารางที่ 4.1-1 แสดงแบคทีเรียท่แี ยกไดจ้ ากเลือดและโอกาสของการปนเปอื้ น (false positive) หรอื โอกาสของ
การกอ่ โรค (true positive)

Organism % False positive % True positive 4บทท่ี

Bacillus spp. > 90 < 10
Coagulase-negative staphylococci > 90 < 10
Propionibacterium spp. > 90 < 10
Corynebacterium spp. 80 20
Viridans streptococci 50 50
Clostridium spp. 40 60
Staphylococcus aureus 25 75
Enterococcus spp. 15 85

การควบคุมคณุ ภาพการเพาะเชอ้ื จากเลือดในห้องปฏิบัติการ

ห้องปฏิบัติการควรท�ำการควบคุมคุณภาพในทุกข้ันตอนของการเพาะเช้ือจากเลือด โดยมีข้ันตอนการ
ควบคมุ คุณภาพ ดงั นี้
1. การประกนั คณุ ภาพการวิเคราะห์
ทำ� การควบคมุ คณุ ภาพภายใน (internal quality control; IQC) และบันทกึ ผล ตลอดจนเข้ารว่ มโครงการ
ทดสอบความสามารถระหว่างห้องปฏิบัติการท่ีจัดข้ึนโดยองค์กรภายนอกในระดับประเทศหรือระดับสากล
(external quality assessment; EQA) ห้องปฏิบัติการท�ำการประกันคุณภาพการเพาะเช้ือจากเลือดได้ดังนี้
- การควบคุมคุณภาพอาหารเลี้ยงเช้ือในด้านการส่งเสริมการเจริญเติบโตของจุลชีพได้ครอบคลุม
จลุ ชีพท่เี ป็นสาเหตกุ ารตดิ เช้อื ในเลอื ด
- ควบคุมการปนเปือ้ นของเชือ้ ในอาหารทใี่ ชเ้ พาะเช้ือ
- ควบคุมคุณภาพการย้อมสีให้ครอบคลุมท้ังเชื้อที่เป็น positive control และ negative control
ท�ำการวิเคราะหแ์ ละบนั ทกึ ผลแบบเดยี วกบั การย้อมเลือดของผู้ปว่ ย
- ควบคุมคณุ ภาพการเพาะเชอื้ จากเลอื ดในขวด ทำ� ทง้ั positive control โดยใสเ่ ช้ือมาตรฐานทีเ่ จอื จาง
ดว้ ยเลือดของคนปรกติ ให้มีปรมิ าณเชอื้ แตกตา่ งกนั ลงในขวดเพาะเช้ือ และทำ� negative control ที่
ใส่นำ้� เกลอื แทนเชอ้ื ทำ� การวเิ คราะห์และบนั ทึกผลการเพาะเช้อื แบบเดียวกับเลอื ดของผูป้ ่วย
- ท�ำการควบคุมคุณภาพทดสอบความไวของเช้ือมาตรฐานต่อสารต้านจุลชีพ ท�ำการวิเคราะห์และ
บันทกึ ผลแบบเดียวกบั เชือ้ ที่แยกไดจ้ ากผู้ปว่ ย

คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

70 บทท่ี 4 ขน้ั ตอนการเพาะเชอ้ื จากส่งิ ตรวจ

- ก�ำหนดเกณฑก์ ารตดั สินการควบคมุ คุณภาพกรณีผล IQC ไม่อย่ใู นเกณฑ์ และท�ำบันทกึ ปฏิบตั กิ าร
แก้ไข
- มีการจดั เก็บรักษาคุณภาพของเชอ้ื มาตรฐานที่ไดม้ าจากแหล่งทเี่ ช่อื ถือได้ และเป็นสากลที่อ้างอิงได้
เพื่อน�ำผลมาใช้ควบคุมคุณภาพของการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ คุณภาพอาหารที่ใช้
เพาะเชอ้ื จากเลือดและอาหารท่ใี ช้ทำ� subculture หรอื การวนิ จิ ฉัยเช้อื
- มีระบบการวิเคราะห์ที่สอบกลับได้ (traceable) ถึงค่ามาตรฐานสากล (SI unit) มีการบันทึก
รายละเอยี ดเกีย่ วกับวธิ ีการวเิ คราะห์ สารมาตรฐาน และเชอื้ มาตรฐาน
- วัสดุอ้างอิงและเช้ือมาตรฐาน (standard/calibrator) มีคุณลักษณะเหมาะสม มีใบรับรอง
คุณลกั ษณะหรอื ขอ้ มลู อ้างอิงจากผู้ผลติ (MT 5.2.4)
- กรณีทำ� การทดสอบเดยี วกันแต่ใช้เคร่ืองมอื หลายเครอื่ งต้องมกี ารปรับเทียบผล มบี ันทึก
- ห้องปฏิบัติการต้องเข้าร่วมโครงการ EQA กับองค์กรที่มีคุณภาพ เพื่อเป็นดัชนีช้ีวัดความถูกต้อง
ของผลการทดสอบที่ท�ำ โดยปฏิบัติต่อตัวอย่างท่ีได้รับเช่นเดียวกับตัวอย่างทดสอบจากผู้ป่วย
กรณีทีม่ ีผลไมต่ รงกบั ผล EQA ต้องทำ� การวเิ คราะหห์ าสาเหตุและด�ำเนินการแกไ้ ข
- มกี ารสอบเทยี บเครอื่ งมอื ทม่ี ผี ลกระทบตอ่ คณุ ภาพ และมกี ารบำ� รงุ รกั ษาเชงิ ปอ้ งกนั และตรวจสอบ
ความพร้อมใช้งานของเคร่ืองตรวจวิเคราะห์อัตโนมัติส�ำหรับการเพาะเชื้อจากเลือด ทั้งส่วนท่ีเป็น
incubator และระบบ detection ตลอดจนตู้เยน็ เก็บแผ่นสารทดสอบและสารท่ีใชท้ ดสอบ

2. ข้นั ตอนก่อนการวิเคราะห์
- มีคู่มือการเก็บตัวอย่างและแนวปฏิบัติในการเจาะเลือดเพ่ือเพาะเชื้อ ให้หน่วยงานท่ีมาส่งตัวอย่าง
วิเคราะห์ ท�ำการวิเคราะห์ทันทีเม่ือได้รับตัวอย่าง ห้องปฏิบัติการต้องก�ำหนดวิธีการเก็บรักษา
ตัวอย่างและช่วงเวลาที่เก็บตัวอย่างไว้โดยผลการทดสอบไม่เปลี่ยนไปและไม่ท�ำการทดสอบ
ส่ิงตรวจที่มคี ุณภาพไมด่ พี อ
- มกี ารควบคุมวิธกี ารน�ำสง่ ตวั อย่างภายในเวลาและอุณหภมู ิท่เี หมาะสม
- มีการก�ำหนดเกณฑ์รับและปฏิเสธตัวอย่าง และบันทึกรายละเอียดสภาพตัวอย่างท่ีไม่เหมาะสมใน
การรายงานผลดว้ ยทุกคร้งั เพือ่ แพทย์จะไดใ้ ช้ประโยชนใ์ นการแปลผล
- มกี ารชี้บ่งตัวอย่างและใบนำ� สง่ มีบนั ทกึ การรับตัวอยา่ งในสมุดหรือระบบคอมพวิ เตอร์

คูม่ ือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 4 ขนั้ ตอนการเพาะเช้อื จากสิง่ ตรวจ 71

3. ข้ันตอนการวิเคราะห์
- ใชว้ ธิ วี เิ คราะหท์ เี่ ปน็ มาตรฐานหรอื วธิ อี า้ งองิ ได้กรณใี ชว้ ธิ วี เิ คราะหท์ ก่ี ำ� หนดขนึ้ เองหรอื ดดั แปลง
วธิ ีวิเคราะห์ เชน่ ลดสว่ นนำ้� ยา หรอื อ่ืนๆ ต้องมขี อ้ มลู การ validate
- แจ้งวิธีวิเคราะห์ให้ผู้ใช้บริการทราบรวมท้ังชนิดและปริมาณของตัวอย่างท่ีต้องการ ถ้าเปล่ียน
แปลงวธิ ีการต้องแจ้งเปน็ ลายลกั ษณ์อกั ษรและมีบนั ทกึ การแจ้ง
- มีคู่มือวิธีปฏิบัติหรือระเบียบปฏิบัติการวิเคราะห์ ณ จุดท่ีปฏิบัติงาน เป็นเอกสารควบคุมใน
ระบบการควบคมุ เอกสาร วธิ ใี นคมู่ อื ตรงตามท่ใี ช้งานจริงและเปน็ ปจั จุบนั

4. ขั้นตอนหลงั การวเิ คราะห์ 4บทที่
- การรายงานผลขั้นตอนสดุ ท้ายประกอบด้วยผลต่อไปนี้ ผลจากการย้อมแกรม ผลการวินิจฉัยเช้อื
และผลความไวตอ่ สารต้านจลุ ชีพ
- มกี ารตรวจสอบผลการเพาะเชือ้ โดยผทู้ ีไ่ ด้รับมอบหมาย
- การย้อมแกรม เป็นวิธีการส�ำคัญที่ใช้บ่งช้ีว่ามีเชื้อข้ึนในขวดเลือด เม่ือย้อมพบเช้ือจากขวด
เพาะเช้ือจากเลือดต้องท�ำการรายงานผลให้แพทย์ทราบทันที ผลการเพาะเชื้อจากเลือดจัดเป็น
ค่าวิกฤติที่ต้องรายงานเร่งด่วน ต้องให้แพทย์ดูแลผู้ป่วยได้รับผลที่รายงานโดยเร็ว ผู้ที่รับผลทาง
โทรศัพท์ต้องบันทึกผลเพ่ือไว้ยืนยันความถูกต้อง และผู้โทรแจ้งผลต้องบันทึกชื่อผู้รับการ
แจ้งผล
- เมอ่ื เพาะเชอื้ ขนึ้ (positive blood culture) ตอ้ งรายงานผลทนั ทที ไ่ี ดผ้ ลเปน็ คา่ วกิ ฤติ การรายงานผล
ต้องรายงานท้ังผลจากการย้อมแกรม ผลการวินิจฉัยเชื้อและผลการทดสอบความไวต่อสารต้าน
จลุ ชพี ข้อมูลทอ่ี าจจะเปน็ ประโยชนต์ ่อการแปลผล เช่น สารตา้ นจลุ ชีพทีผ่ ูป้ ว่ ยไดก้ ่อนเจาะเลือด
เพาะเชอ้ื ปรมิ าตรของเลอื ดทใ่ี ชเ้ พาะเชอ้ื นอ้ ยกวา่ มาตรฐานทกี่ ำ� หนด การสง่ ตวั อยา่ งลา่ ชา้ เปน็ ตน้
การบริหารจัดการระบบคุณภาพของงานห้องปฏิบัติการให้งานขับเคล่ือนตามล�ำดับของ
การท�ำงานต้องท�ำให้ครอบคลุมท้ังสามขั้นตอน คือ ข้ันตอนก่อนการวิเคราะห์ ได้แก่ การสั่งตรวจ การเก็บ
สิ่งตรวจและน�ำส่งห้องปฏิบัติการ และการรับ การปฏิเสธส่ิงตรวจ โดยตรวจสอบคุณภาพของ
สง่ิ ตรวจในข้ันตอนการวิเคราะห์ เชน่ วธิ กี ารวิเคราะห์ การทบทวนและตดิ ตามผลการวเิ คราะห์ ส�ำหรบั ขนั้
ตอนหลังการวิเคราะห์ ได้แก่การรายงานผลและการรับรองผลการวิเคราะห์ และการเก็บรักษาและท�ำลายสิ่ง
ตรวจหลงั การวเิ คราะห์

คูม่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

72 บทที่ 4 ข้ันตอนการเพาะเช้ือจากส่งิ ตรวจ

รายงานผลการเพาะเชื้อจากเลือด ควรมีการควบคุมคุณภาพของการปฏิบัติงานท้ังสามขั้นตอน
ของการวิเคราะห์ การควบคุมคุณภาพท่ีท�ำอย่างจริงจังและต่อเนื่องเป็นปัจจัยหลักที่ใช้ในการประกันคุณภาพ
ของการเพาะเชื้อจากเลือดได้ ท�ำให้แพทย์มีความเช่ือม่ันต่อผลการวิเคราะห์ อันจะเป็นประโยชน์ในการรักษา
และควบคุมโรค การควบคุมคุณภาพของการวิเคราะห์เป็นวิธีการทางห้องปฏิบัติการท่ีมีประสิทธิภาพสูง
ในการลดการปนเปื้อนจากการเพาะเชื้อในเลือด เนื่องจากสามารถใช้แยกเชื้อท่ีเป็นสาเหตุของการติดเช้ือ
ในเลือดจริงออกจากเชื้อที่ปนเปื้อนหรือเชื้อท่ีไม่ใช้สาเหตุของการติดเชื้อได้ จึงควรใช้แนวทางปฏิบัติการ
แปลผลและการควบคมุ คณุ ภาพในการพัฒนาคุณภาพการเพาะเชือ้ จากเลอื ด

เอกสารอา้ งองิ
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Principles and Procedures for Blood Culture:
Approved Guideline. CLSI document M47-A. Pennsylvania: Wayne; 2007.
2. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation Blood Cultures. In: Isenberg
HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press;
1998. p. 58-62.
3. ก�ำพล สุวรรณพิมลกุล, คัคนางค์ นาคสวัสด์ิ. วิธีลดการปนเปื้อนในการเจาะเลือดเพ่ือส่งเพาะเชื้อ.
ใน: สรุ างค์ เดชศิรเิ ลศิ , สุวรรณา ตระกูลสมบรู ณ,์ กาญจนา คชนิ ทร บรรณาธกิ าร. แนวปฏิบตั กิ าร
เจาะเลือดเพ่ือเพาะเช้ือและการเพาะเช้ือก่อโรคจากเลือด. กรุงเทพฯ:โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์
มหาวิทยาลยั ; 2553. หน้า 7.
4. มาลัย วรจติ ร. การด�ำเนินการเพาะเช้อื และการรายงานผลการเพาะเชื้อจากเลอื ดทางห้องปฏบิ ตั กิ าร
หลักการเพาะเชื้อจากเลือดและการวินิจฉัยเชื้อก่อโรค. กรุงเทพฯ: คณะเทคนิคการแพทย์
มหาวทิ ยาลัยมหดิ ล; 2550. หน้า 79-86.
5. มาลยั วรจติ ร. กระบวนการทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารสำ� หรบั การเพาะเชอ้ื จากเลอื ด. ใน: สรุ างค์ เดชศริ เิ ลศิ ,
สวุ รรณา ตระกูลสมบรู ณ,์ กาญจนา คชินทร บรรณาธกิ าร. แนวปฏบิ ตั ิ การเจาะเลอื ดเพอ่ื เพาะเชอ้ื
และการเพาะเชื้อก่อโรคจากเลือด. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย; 2553.
หน้า 15-23.
6. วรรณา เพ่งเรืองโรจนชัย. การเพาะเช้ือจากเลือด. ใน: คู่มือการปฏิบัติงานแบคทีเรียส�ำหรับ
โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่ัวไป. นนทบุรี: กองโรงพยาบาลภมู ิภาค; 2540. หน้า 19-22.
7. สุวรรณา ตระกูลสมบรูณ์. การแปลผลและการควบคุมคุณภาพการเพาะเช้ือจากเลือด. ใน: สุรางค์
เดชศริ เิ ลศิ , สวุ รรณา ตระกลู สมบรู ณ,์ กาญจนา คชนิ ทร บรรณาธิการ. แนวปฏิบตั ิ การเจาะเลอื ด
เพ่ือเพาะเช้ือและการเพาะเชื้อก่อโรคจากเลือด. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย;
2553. หน้า 27-35.

ค่มู อื การปฏิบตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 4
ขนั้ ตอนการเพาะเชอื้ จากสง่ิ ตรวจ
4.2 การเพาะเชอื้ จากน�้ำไขสนั หลังและนำ้� จากสว่ นตา่ งๆของรา่ งกาย

ฉันทนา อรัญญะ
วรรณา เพ่งเรอื งโรจนชัย
สุวรรณา ตระกลู สมบูรณ์

การเพาะเชื้อจากนำ�้ ไขสนั หลัง

หลกั การ 4บทที่

น้�ำไขสันหลังเป็นของเหลวในร่างกายท่ีปราศจากเช้ือ มีหน้าท่ีหล่อเล้ียงสมองและไขสันหลัง ภาวะ
เยื่อหุ้มสมองอักเสบท่ีเกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียในน�้ำไขสันหลังถือเป็นภาวะวิกฤติท่ีก่อให้เกิดอันตราย
ถึงแก่ชีวิตได้ จึงมีความส�ำคัญท่ีต้องรีบท�ำการทดสอบและแจ้งผลให้แพทย์ทราบโดยทันที การทดสอบที่
รวดเร็วและถูกต้องสามารถช่วยรักษาชีวิตผู้ป่วยหรือลดความพิการได้ การติดเช้ือเพียงเล็กน้อยก็ถือว่ามี
ความสำ� คัญทางคลนิ กิ ทตี่ อ้ งวนิ ิจฉยั และทดสอบความไวต่อสารตา้ นจลุ ชีพในเชือ้ ทุกชนดิ

ขอบเขต

ขั้นตอนการตรวจรับสิ่งตรวจ การเพาะเชื้อจากน�้ำไขสันหลัง การอ่านผล การเพาะเช้ือ การรายงานผล
เม่ือพบเชือ้ จากการย้อมแกรม การรายงานผลเม่อื เสรจ็ สมบรู ณ์

เช้ือแบคทีเรียที่พบเป็นสาเหตุของการติดเชื้อในระบบประสาทส่วนกลางมีความสัมพันธ์กับอายุของ
ผ้ปู ว่ ย คือ
เดก็ แรกคลอด : Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes
เด็กอายตุ ำ�่ กวา่ 2 เดอื น : Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli
เด็กอายุตำ่� กวา่ 10 ป ี : Hemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae
เดก็ ที่มอี ายมุ ากกวา่ 10 ปีและผูใ้ หญ่
: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, gram negative bacilli
Listeria monocytogenes

74 บทท่ี 4 ข้นั ตอนการเพาะเชอ้ื จากสงิ่ ตรวจ

วธิ ปี ฏิบัติงาน
1. ตรวจดูลกั ษณะและปริมาณของ CSF
1.1 ถา้ มเี ลือดปะปนหรอื มคี วามขนุ่ ใหบ้ ันทึกไว้
1.2 ถ้ามปี รมิ าณมากกวา่ 1 ml และใส ให้นำ� ไปป่ันแยกโดยใช้ความเรว็ 2,500 rpm นาน 15 นาที
ใช้ pasteur pipette ปราศจากเชื้อ ดูดน�้ำใสส่วนบนทิ้ง เหลือ CSF และตะกอนก้นหลอด
ประมาณ 0.5 ml เขยา่ ผสมตะกอนด้วย vortex mixer เพื่อใชย้ อ้ มและเพาะเชื้อต่อไป
1.3 ถา้ CSF มีปริมาณนอ้ ยกว่า 1 ml หรือขุ่นมาก ไมต่ ้องปนั่ ทำ� การเพาะเชื้อไดเ้ ลย
2. ใช้ pasteur pipette ปราศจากเชอ้ื ดูดตะกอน CSF หยดลงบน BA, CA, MAC plate ละ 1 หยด สว่ น
ทีเ่ หลือใสใ่ น FTM และท�ำ smear บน slide เพอ่ื ยอ้ มแกรม โดยทำ� การตรวจใหเ้ รว็ ทส่ี ดุ
3. streak plate ทั้ง 3 ชนิด น�ำไปบม่ ท ี่ 35+2 OC นาน 3 วัน โดย BA และ CA บม่ ในบรรยากาศ
5-10% CO2 ส�ำหรบั FTM ให้บ่ม ท ่ี 35+2 OC นาน 7 วัน

ข้อควรระวงั
1. ควรท�ำการเพาะเชอื้ ทันทที ไ่ี ด้รับส่ิงตรวจ ถ้าทำ� ไม่ไดใ้ หเ้ ก็บในอณุ หภมู ิหอ้ ง ห้ามเก็บในตู้เย็น
2. กรณีท่ไี ด้ CSF ปรมิ าณนอ้ ยไมส่ ามารถแบง่ หลายขวดเพอ่ื ส่งตรวจจลุ ชวี วทิ ยา ตรวจทางชวี เคมีและการ
ตรวจนับและแยกชนิดของเซลล์ ให้เก็บ CSF ที่เจาะได้ท้ังหมดใส่ขวดเดียวแล้วน�ำส่งห้องปฏิบัติการ
จุลชีววิทยาก่อน ท�ำการปั่นเพื่อน�ำตะกอนไปเพาะเชื้อและท�ำ direct examination เช่น ย้อมแกรม
ทำ� india ink แลว้ จึงน�ำส่วนใสท่แี ยกไดไ้ ปตรวจทางชีววทิ ยา

การอา่ นผล
1. อา่ นผลการยอ้ มแกรมทนั ที ถา้ พบเชอ้ื ต้องรายงานผลแบบค่าวกิ ฤติ
2. ตรวจ plate ดูผลการเพาะเชื้อทุกวัน ถ้าไม่มีเช้ือข้ึนให้อบต่อจนครบ 3 วัน ถ้ามีเช้ือข้ึนให้ย้อม
แกรมและรายงานแพทยท์ ดี่ แู ลผปู้ ว่ ยทราบทางโทรศพั ทแ์ บบคา่ วกิ ฤติและทำ� การวนิ จิ ฉยั เชอ้ื ทกุ ตวั และทดสอบ
ความไวต่อสารต้านจลุ ชพี
3. ตรวจดู FTM ทุกวนั อบจนครบ 7 วัน ถ้ามีลกั ษณะขนุ่ สงสัยวา่ นา่ จะมีเช้ือข้ึน ให้ subculture บน
BA, CA, MAC และยอ้ มแกรม ถา้ เชอื้ ทข่ี นึ้ เปน็ ชนดิ เดยี วกบั ทขี่ น้ึ ใน primary plate ไมจ่ ำ� เปน็ ตอ้ งวนิ จิ ฉยั ซำ�้ แต่
ถา้ พบขน้ึ ใน FTM เทา่ นน้ั ให้ วินิจฉยั เชอื้ รวมท้ังทดสอบความไวตอ่ สารต้านจุลชพี โดยไม่ต้องระบุจ�ำนวนเช้อื
ถา้ FTM ขนุ่ เพาะเชอ้ื ไม่ขึน้ ในสภาวะปกติแตย่ ้อมสีแกรมพบเช้ือใหส้ งสยั ว่าอาจจะเป็น anaerobic bacteria ให้
รายงานผลการย้อมแกรมพรอ้ มรูปร่างและควรส่งไปวเิ คราะหต์ อ่

ค่มู อื การปฏิบตั งิ านแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 4 ขัน้ ตอนการเพาะเชอ้ื จากสิ่งตรวจ 75

การรายงานผล

1. ถา้ ไม่พบเชื้อให้รายงานวา่ “No growth after 3 days” (ตามแผนภมู ทิ ่ี 4.2-1)
2. ถ้าพบเชื้อจากการย้อมแกรมให้รายงานแพทย์ท่ีท�ำการรักษาผู้ป่วยทางโทรศัพท์ทันที โดยท�ำการ
บันทึกการรายงานและชอื่ ผรู้ ับแจ้งผลไว้
3. ถ้ามีเช้ือขึ้น รายงานจ�ำนวนเป็น numerous, moderate, few หรือ rare กรณีเชื้อขึ้นใน FTM
อย่างเดยี วใหร้ ายงานชนิดของเชื้อโดยไม่ต้องบอกจำ� นวน และถ้าเชอื้ ขนึ้ ใน FTM หลังจากวนั ท ่ี 3
ไปแล้ว ใหร้ ายงานผลเป็น additional report ตามไป

การตรวจหาแอนติเจนของเชอื้ ในน้�ำไขสนั หลังดว้ ยวิธี latex agglutination 4บทที่

การตรวจหาแอนติเจนของเช้ือท่ีเป็น capsular antigen ในน้�ำไขสันหลังด้วยวิธี latex agglutination
เป็นการทดสอบทางห้องปฏิบัติการท่ีใช้น�้ำเจาะไขสันหลังเพ่ือช่วยการวินิจฉัยการติดเชื้อในระบบประสาท
ได้รวดเร็วกว่าการเพาะเช้ือ สามารถได้ผลภายในคร่ึงช่ัวโมง และการทดสอบน้ีสามารถตรวจหาเช้ือท่ี
จ�ำเพาะชนิดได้ด้วย ชุดน้�ำยา latex agglutination ใช้ตรวจหาแอนติเจนของเช้ือแบคทีเรียได้หลายชนิด
ได้แก่ Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae type b, Neisseria meningitidis, E. coli K-1
และ Streptococcus agalactiae (Group B streptocoocci) สามารถใช้ตรวจหาแอนติเจนของเช้ือแบคทีเรีย
ในน�้ำไขสันหลังและน�้ำจากส่วนต่างๆของร่างกายได้ด้วย ข้อดีของวิธีน้ีคือได้ผลรวดเร็ว มีความจ�ำเพาะ
ความไวสูง สามารถใหผ้ ลดกี ว่าการเพาะเช้อื โดยเฉพาะในรายที่ไดย้ าปฏชิ วี นะมาก่อนเกบ็ ส่ิงตรวจ

การรายงานผล รายงาน latex agglutination negative หรือ positive ตามผลท่ไี ดแ้ ละตอ้ งระบชุ นิดของเชอ้ื ดว้ ย
เม่ือไดผ้ ลต้องรายงานแบบคา่ วกิ ฤต ิ

คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รียและรา

76 บทที่ 4 ข้ันตอนการเพาะเชอ้ื จากส่ิงตรวจ

การเพาะเชอ้ื จากน�ำ้ ในส่วนต่างๆของร่างกาย

หลกั การ
น�้ำจากส่วนต่างๆจากร่างกาย เช่น น้�ำจากข้อ (joint/synovial fluid) น�้ำจากปอด (pleural fluid)
น�้ำจากช่องทอ้ ง (peritoneal fluid) น้ำ� จากถุงห้มุ หวั ใจ (pericardial fluid) ในภาวะปกติจะปราศจากเชอ้ื การติด
เชื้อในต�ำแหน่งดังกล่าวมีความส�ำคัญท่ีท�ำให้ผู้ป่วยเสียชีวิตได้ ดังนั้นการตรวจวินิจฉัยท่ีรวดเร็วและถูกต้อง
มีความส�ำคัญอย่างย่ิงเพ่ือใช้เป็นแนวทางส�ำหรับดูแลผู้ป่วย การเพาะเชื้อในต�ำแหน่งเหล่าน้ีอาจท�ำได้ยาก
บางครั้งเชื้ออาจมีจ�ำนวนน้อย ในผู้ป่วยที่ใส่สายต่างๆเข้าไปในร่างกาย ผู้ป่วยที่ได้รับยากดภูมิคุ้มกัน การเก็บ
ส่ิงตรวจจึงต้องระมัดระวังการปนเปื้อนเช้ืออื่นที่ไม่ได้เป็นเชื้อก่อโรคที่แท้จริง เชื้อทุกชนิดท่ีพบในสารน้�ำ
ที่ภาวะปกตปิ ราศจากเช้อื ถอื ว่ามคี วามส�ำคัญและต้องรายงานเชอ้ื ทุกชนดิ ที่พบ

ขอบเขต
ข้นั ตอนการตรวจรับส่ิงตรวจ การเพาะเช้อื จากน้ำ� จากส่วนตา่ งๆของรา่ งกาย การอา่ นผล การเพาะเช้ือ
การรายงานผลเมอื่ พบเชื้อจากการยอ้ มแกรม การรายงานผลเมื่อเสรจ็ สมบูรณ์

แบคทีเรียทีพ่ บเปน็ สาเหตขุ องการติดเชอ้ื แบง่ ตามประเภทของนำ้� จากสว่ นตา่ งๆของร่างกายดังน้ี
แบคทเี รยี ท่เี ปน็ สาเหตุของการตดิ เชื้อท่พี บใน joint/synovial fluid ไดแ้ ก่
Staphylococcus aureus, β-hemolytic streptococci group A และ B (GAS, GBS), Streptococcus
pneumoniae, Enterococcus spp., Other streptococci, Haemophilus influenzae,
Enterobacteriaceae, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella osloensis, Corynebacterium spp. และ
Mycobacterium spp.
แบคทีเรยี ที่เปน็ สาเหตุของการติดเชอื้ ทีพ่ บใน pleural fluid ไดแ้ ก่
S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, Enterobacteriaceae, nonfermentative gram-negative
bacilli, other streptococci, M. tuberculosis และ Nocardia spp.
แบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของการติดเช้ือทีพ่ บใน pericardial fluid ได้แก่
S. aureus, S. pneumoniae, group A Streptococcus, Enterobacteriaceae, other gram-negative bacilli
และ M. tuberculosis

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 4 ข้นั ตอนการเพาะเช้อื จากสิ่งตรวจ 77

แบคทีเรียทีเ่ ปน็ สาเหตขุ องการติดเช้อื ทพี่ บใน peritoneal fluid ได้แก่ 4บทท่ี
Enterobacteriaceae, Enterococcus, S. aureus, group A Streptococcus, coagulase negative
Staphylococcus (CNS) และ Streptococcus pneumoniae, Haemophilus spp., anaerobic bacteria,
และ nonfermentative gram-negative bacilli
สงิ่ ตรวจ
1. น้�ำจากขอ้ (joint/synovial fluid)
2. นำ้� จากเยื่อหุ้มปอด (pleural fluid)
3. น�ำ้ จากถุงหุม้ หวั ใจ (pericardial fluid)
4. น�้ำจากเย่อื บชุ ่องทอ้ ง (peritoneal fluid)

ข้อควรระวัง ควรทำ� การเพาะเช้อื ทนั ทีทไ่ี ด้รับสิ่งตรวจ ถ้ายงั ทำ� ไมไ่ ดใ้ หเ้ ก็บในอุณหภมู ิห้อง หา้ มเก็บในตเู้ ย็น

วิธีปฏิบตั ิงาน

ใช้หลักการและวิธีการตรวจเช่นเดียวกับการเพาะเช้ือในน�้ำไขสันหลัง โดยมีรายละเอียดเพิ่มเติม
ในกรณีเก็บส่ิงตรวจไม่สามารถส่งห้องปฏิบัติการได้ทันที สามารถฉีด sterile body fluid 5 ml ใส่ในขวด
hemoculture ได้
การตรวจวินิจฉัย peritoneal dialysis fluid (PDF) ในผู้ป่วยไตวาย ซ่ึงล้างไตโดยการท�ำ peritoneal
dialysis ทั้งในกรณี acute dialysis และในกรณีท่ีท�ำ CAPD (continuous ambulatory peritoneal dialysis)
ผู้ป่วยจะได้รับการใส่น�้ำยาล้างไตเข้าไปในช่องท้อง การตรวจ PDF ในผู้ป่วยเหล่านี้มีวัตถุประสงค์เพื่อ
ตรวจหาภาวะการติดเช้ือในช่องท้อง (peritonitis) อันเป็นภาวะแทรกซ้อนที่พบได้บ่อย เชื้อท่ีเป็นสาเหตุ
ส่วนใหญ่เกิดจากแบคทีเรีย มีส่วนน้อยท่ีเกิดจากเช้ือรา เชื้อท่ีพบเป็นสาเหตุได้บ่อย ได้แก่ Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Acinotobacter spp.,
Enterobacteriaceae
เน่ืองจากปริมาณเชื้อท่ีพบในน้�ำ PDF โดยทั่วไปจะมีน้อยมาก (น้อยกว่า 1 ตัว/10 ml ของ PDF)
ดังน้ันแม้จะปั่นแล้วมาตรวจโดยการย้อมแกรมมักจะไม่พบเช้ือ การเพาะหาเชื้ออาจท�ำโดยน�ำ PDF มา
ไมน่ อ้ ยกวา่ 10 ml ใสข่ วด hemoculture อยา่ งนอ้ ย 5 ml และทำ� ตามขนั้ ตอนการวนิ จิ ฉยั เชน่ เดยี วกบั hemoculture
แต่มีขอ้ เสีย คอื เช้อื ทตี่ ้องการเลือดในการเจริญเติบโตอาจไม่ขนึ้ ในขวดสำ� หรับเพาะเช้อื จากเลือด และตอ้ งใช้
เวลาในการรอคอยผลเพม่ิ ขน้ึ อยา่ งนอ้ ยอกี หนงึ่ วนั เนอื่ งจากตอ้ ง subculture เชอื้ จากขวดเพาะเชอ้ื เพอื่ นำ� โคโลนี
ของเชอ้ื มาทำ� การวินจิ ฉัยแยกชนดิ เชอื้ และทดสอบความไวตอ่ สารต้านจลุ ชพี

คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

78 บทที่ 4 ข้ันตอนการเพาะเช้ือจากสิ่งตรวจ

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเพาะเช้ือจากน้�ำ PDF ควรเก็บตัวอย่างน�้ำ PDF 50 ml น�ำไปปั่นแยกโดยใช้
ความเร็ว 2,500 rpm นาน 30 นาที ดูดน้�ำใสส่วนบนท้ิง เหลือตะกอนก้นหลอดประมาณ 0.5 ml เขย่าผสม
ตะกอนด้วย vortex mixer เพอ่ื ใช้ยอ้ มและเพาะเช้อื
แผนภูมิท่ี 4.2-1 ข้ันตอนการตรวจวินิจฉยั น�้ำไขสันหลงั และนำ�้ จากส่วนตา่ งๆของรา่ งกาย

MAC

หมายเหตุ
1. FTM ควรอบจนครบ 7 วัน ดูการเจริญทุกวนั ถ้ามคี วามขนุ่ ในสว่ นลา่ ง อาจเป็น anaerobic bacteria
ใหน้ �ำมายอ้ มแกรม และเพาะบน BA ในบรรยากาศ CO2 35 + 2 OC นาน 2 วนั ถา้ ไม่มเี ชอ้ื ขึ้น ใหร้ ายงานผลการ
ย้อมแกรมพร้อมรปู รา่ งและส่งเพาะเช้ือ anaerobic bacteria ต่อไป

คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 4 ขนั้ ตอนการเพาะเช้ือจากสิ่งตรวจ 79

2. ควรดคู วามสอดคล้องของผลเพาะเช้อื ทไ่ี ดส้ มั พันธ์กับการยอ้ มแกรมหรือไม่
3. ในรายทส่ี งสัยเชือ้ ราใหอ้ บเพาะตอ่ จนครบ 1 สัปดาห์
4. ควรเก็บสไลด์ที่ย้อมแกรมเพื่อใช้ในการทวนสอบผลและส่ิงตรวจไว้ระยะหนึ่งในกรณีท่ีแพทย์
อาจขอเพม่ิ รายการทดสอบ เกบ็ CSF ที่อุณหภมู ิ 4 OC เพ่อื ใชใ้ นกรณีทีแ่ พทย์ส่ังตรวจ PCR เพ่มิ

เอกสารอา้ งอิง 4บทท่ี

1. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Sterile Body Fluids,
Dialysate, and Urine. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology.
Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 63-66.
2. York MK, Church DL. Cerebrospinal Fluid Culture. In: Isenberg HD editor. Essential
Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 3.7.1-8.
3. มาลยั วรจิตร. แบคทีเรียกอ่ โรค: Pathogenic Bacteria. กรุงเทพฯ: สยามศลิ ปะการพมิ พ;์ 2545.
4. วรรณา เพ่งเรืองโรจนชัย. การเพาะเช้ือจากเลือด. ในคู่มือการปฏิบัติงานแบคทีเรียส�ำหรับ
โรงพยาบาลศนู ย์และโรงพยาบาลท่วั ไป. นนทบรุ ี: กองโรงพยาบาลภมู ิภาค; 2540. หน้า 19-22.

คมู่ อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

บทที่ 4
ข้นั ตอนการเพาะเชอ้ื จากสงิ่ ตรวจ
4.3 การเพาะเช้ือจากปสั สาวะ

สวุ รรณา ตระกลู สมบูรณ์

หลกั การ
ปัสสาวะ เป็นส่ิงตรวจท่ีส่งเพาะเชื้อในผู้ป่วยท่ีมีอาการติดเชื้อในทางเดินปัสสาวะและผู้ป่วยที่ไม่มี
อาการแตม่ คี วามเสยี่ งสงู วา่ อาจตดิ เชอ้ื ในทางเดนิ ปสั สาวะ เชอ้ื ทเี่ ปน็ สาเหตขุ องการตดิ เชอ้ื ในทางเดนิ ปสั สาวะ
ส่วนใหญ่เป็นเช้ือเจริญเร็วเพียงไม่ก่ีชนิด เช่น Escherichia coli, Enterococcus spp., Klebsiella spp.,
Enterobacter spp., Proteus spp., และ Pseudomonas spp. ซึ่งพบในผู้ป่วยท่ีติดเช้ือจากชุมชนและติดเช้ือใน
โรงพยาบาล
การตรวจหาแบคทีเรียก่อโรคจากปัสสาวะ สามารถใช้วินิจฉัยการติดเชื้อแบคทีเรียในระบบทางเดิน
ปัสสาวะ ซึ่งต้องทราบชนิดและปริมาณของเชื้อแบคทีเรียท่ีเป็นสาเหตุของการติดเช้ือ การตรวจทางห้อง
ปฏิบัติการส�ำหรับการวินิจฉัยโรคติดเช้ือในทางเดินปัสสาวะจึงต้องท�ำการเพาะเช้ือ เพ่ือหาชนิดของเช้ือ
แบคทเี รียทเี่ ป็นสาเหตุของการตดิ เชือ้ และตรวจนับจ�ำนวนเชือ้ แบคทเี รียทีพ่ บในส่งิ ตรวจนนั้ ด้วย
ในภาวะปกติปัสสาวะเป็นน�้ำจากร่างกายท่ีปราศจากเช้ือถ้าเก็บอย่างถูกต้อง แต่อาจปนเปื้อนเช้ือ
จากบริเวณท่ีปัสสาวะผ่านออกมาหรือท่ีอยู่ข้างเคียง เช่น perineum, prostate, urethra หรือ vagina จึงควรมี
รายละเอียดในการเก็บปัสสาวะให้ผู้รับบริการ (ดูวิธีการเก็บจากบทที่ 2) ตัวอย่างท่ีใช้ในการเพาะเช้ือ
สว่ นใหญใ่ ช ้ midstream urine

วธิ ปี ฏบิ ตั งิ าน
1. การทำ� colony count โดยใช้ standard calibrated loop
1.1 น�ำขวดทบ่ี รรจสุ ่ิงตรวจมาเขย่าเบาๆให้ปัสสาวะเปน็ เนือ้ เดยี วกนั
1.2 ใช้ calibrated loop ขนาด 0.001 ml หรอื 0.01 ml จุ่มในแนวด่ิงลงในสง่ิ ตรวจแล้วยก loop ขน้ึ
ตรงๆจะไดส้ ่ิงตรวจตดิ เต็ม loop พอดี
1.3 นำ� ไปเพาะบนอาหารเลีย้ งเช้อื BA โดย streak เปน็ เส้นตรงบรเิ วณกลางจานเพาะเชอ้ื จากดา้ น
บนจนถึงด้านล่าง จากน้ันให้น�ำ loop เดิมขีดเป็นเส้นตรงให้ตั้งฉากกับแนวเดิม ขีดไปมาถี่ๆ
หลายๆ ขดี คลา้ ยกา้ งปลา ดังภาพที่ 4.3-1

บทที่ 4 ขัน้ ตอนการเพาะเชอื้ จากส่งิ ตรวจ 81

ภาพท่ี 4.3-1 วิธีการเพาะปสั สาวะบน BA

1.4 ท�ำการเพาะเชอื้ ลงบน MAC โดย streak ด้วย loop ปราศจากเช้ือให้โคโลนีแยกกนั 4บทท่ี
1.5 อบจานเพาะเช้ือที่ 35 OC นาน 24 ชม. แล้วน�ำมาตรวจดูและนับจ�ำนวนโคโลนีของแบคทีเรีย
ใหอ้ บจานเพาะท่สี งสัยยสี ตห์ รือเชอ้ื ราจนครบ 48 ชม. จึงนับจ�ำนวนโคโลนี
1.6 อบจานเพาะเช้ือครบ 24 ชม. แล้วไม่พบเชื้อแบคทีเรีย หรือครบ 48 ชม. แล้วไม่พบยีสต์หรือ
เชอ้ื รา รายงาน “No growth after 1 (or 2) day”
1.7 อบจานเพาะเชือ้ ครบ 24 ชม. แลว้ พบเช้อื แบคทเี รีย หรือครบ 48 ชม. แลว้ พบยสี ต์หรือเช้ือรา
ท�ำการนับชนิดและจ�ำนวนโคโลนีของเช้ือท่ีเจริญบน BA แล้วรายงานผลเป็นจ�ำนวน colony
forming unit ในปัสสาวะ 1 ml (CFU/ml)
การนบั จำ� นวนเชอ้ื แบคทเี รยี ในปสั สาวะทำ� การนบั จำ� นวนโคโลนที เี่ จรญิ บนBA โดยถา้ ใช้calibrated loop
ปริมาตร 0.001 ml ใหค้ ณู จำ� นวนโคโลนที ่นี ับไดด้ ว้ ย 1,000 แตถ่ ้าใช้ calibrated loop ปริมาตร 0.01 ml ให้คูณ
จำ� นวนแบคทีเรยี ทน่ี ับไดด้ ว้ ย 100 จะได้จำ� นวนแบคทเี รยี มหี น่วยเป็น CFU/ml เชน่ ใช ้ calibrated loop ขนาด
0.001 ml นบั เชื้อได้ 1 โคโลนี ให้รายงานเชื้อ = 103 CFU/ml

ตารางท่ี 4.3-1 การค�ำนวณจำ� นวนโคโลนีที่นบั ได้เม่ือใช้ loop เทยี บมาตรฐาน 0.001 ml

จ�ำนวน โคโลนที ่นี ับได้ จำ� นวนเช้ือทร่ี ายงานเป็น CFU/ml

1 103
10 104
100 105
>100 >105

1.8 น�ำเชื้อท่ีเพาะได้ colony count ตามเกณฑ์ในตารางที่ 4.3-1 ไปตรวจวินิจฉัยชนิดของเช้ือและ
ทดสอบความไวต่อสารตา้ นจุลชีพ

คู่มอื การปฏบิ ัติงานแบคทีเรยี และรา