คู่มือปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์

182 บทที่ 5 การวนิ จิ ฉัยแบคทเี รียก่อโรคกล่มต่างๆและเช้อื ราทพี่ บบอ่ ย

ตารางท่ี 5.6-12 การจำ� แนกเช้ือกล่มุ oxidase บวก/ลบ, motility บวก, OF glucose บวก/ลบ, pink pigmented
nonfermenter

Species Oxidase
No. of flagella
Growth on MAC
Glucose
Fructose
Mannitol
Xylose
Arabinose
Urease
Nitrate
Esculin

Asaia spp. (2) 0 P1L-2/ ND 100 100 100 10 100 0 0 0

Azospirillum spp. (3) 100 P1-2 ND 0 (100) 0 100 100 100 100 100

Methylobacterium spp.* (4) 0 P1 - (25) 0 0 100 100 100 0 0

Roseomonas cervicalis** (2) 100 P1-2 + 0 50 0 (100) 100 100 0 0

RRoosseeoommoonnaass ggiillaarrddiiii ssuubbsspp.. rgoilsaerad*ii**(*5 ) 100w P1-2 + (20) 60/(40) (80) 0 100 100 0 0

Roseomonas mucosa** (8) 0 P1-2 + 100 100 100 0 100 100 0 0

Roseomonas genomospecies 4** (1) 100 P1-2 + (100) 100 0 0 0 100 100 0

V+GPNRuarapoalmnoumsdseebi’ostnesimruavssrmeoteainnfbipoanepers(rraG=9gcrN0reeeannnutmtotomahmg1enbes0oeees0sgrsp%aooeatfficfvoptipeeefoor)sss lio ta5t*rrri*aBvgfi*eanlaa;nsc(g3;itishle)-lmolilpsawoen;siaLitimnhti=v1peve0saaL0rcafaeuwortneoret rlh nea0euP,l s m 1fte*lo-sab*2g1eCreer0oslp%lcraoce;foos+NsefidtnDsrtatrriod=andeisnnlasto0eytsedtdeedtpe.or(sm1i0tiin0ve)itdy 0 0 0 100 0 0

คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

บทท่ี 5 การวนิ ิจฉัยแบคทเี รยี ก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเช้อื ราทีพ่ บบ่อย 183

ตารางที่ 5.6-13 Nomenclature of glucose nonfermentative gram-negative bacilli

Current names Former names/Synonyms 5บทท่ี
Achromobacter denitrificans
CAADllccCaalliigggreeonnueepss Vxdeycnloitsroifxicidaannssssuubbsspp..ddeennitirtirfiifcicaannss
Achromobacter incenata -
Achromobacter insolitus -
Achromobacter piechaudii Alcaligenes piechaudii
Achromobacter xylosoxidans ACDlcCaliggreonueps IxIyIalo, sCoDxiCdagnrsousupbIsIpIb. xylosoxidans
-
Achromobacter spanius Pseudomonas temperans
Acidovorax temperans Pseudomonas delafieldii
Acidovorax delafieldii PHsyedurdoogmenoonmasofnaacsilfiascilis
Acidovorax facilis AAAccciiinnneeetttooobbbaaacccttteeerrr cgDaeNlncoAosapgcereoctiiucepuss22var. anitratus
-
Acinetobacter baumannii Acinetobacter DNA group 10 (genospecies 10)
Acinetobacter DNA group 11 (genospecies 11)
Acinetobacter beijerinckii Acinetobacter phenon 3
Acinetobacter bereziniae AAcciinneettoobbaacctteerr gDeNnoAspgerociueps 44
Acinetobacter guillouiae AAcciinneettoobbaacctteerr DgeNnoAspgerociueps 77
Acinetobacter gyllenbergii AAAccciiinnneeetttooobbbaaacccttteeerrr ggDreNinmoAospngetriociiueps 55
Acinetobacter haemolyticus AAMAcccoiiirnnnaeeextttoooelbbblaaaacccltttweeerrrocDDffaiNNilcAAoaggcrreootiuucppus98v((aggree.nnloowssoppfeefcciiiieess 89))
(AgceinnoestopbecaicetserTDUN13A) group TU13
Acinetobacter johnsonii Acinetobacter phenon 4
Acinetobacter DNA group 3 (genospecies 3)
Acinetobacter junii Acinetobacter DNA group 12 (genospecies 12)
Acinetobacter phenon 2
Acinetobacter lwoffii -

Acinetobacter nosocomialis

Acinetobacter parvus
Acinetobacter pittii
Acinetobacter radioresistens
Acinetobacter schindleri
Acinetobacter soli

คมู่ อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

184 บทท่ี 5 การวนิ ิจฉัยแบคทีเรียก่อโรคกล่มต่างๆและเชื้อราที่พบบ่อย

Current names Former names/Synonyms
Acinetobacter ursingii
Acinetobacter DNA group 6 (genospecies 6) -
(AgceinnoestopbecaicetserBDJ1N3A/TgUr1o4u)p BJ13/TU14 -
Acinetobacter DNA group BJ14 (genospecies BJ14) -
Acinetobacter DNA group BJ15 (genospecies BJ15)
Acinetobacter DNA group TU15 (genospecies TU15) -
Acinetobacter DNA group 16 (genospecies 16) -
Acinetobacter DNA group 17 (genospecies 17) -
A(gceinnoestopbecaicetserbDetNwAeengr1ouapndbe3t)ween 1 and 3 -
A(gceinnoestopbecaicetsercDloNseAtogTroUu1p3c)lose to TU13 -
Acinetobacter septicus (=Acinetobacter ursingii) -
Alcaligenes faecalis
-
Alishewanella fetalis
Azospirillum brasilense Acinetobacter phenon 1
Balneatrix alpica
Bergeyella zoohelcum CADlcCaliVgeInes odorans

Bordetella bronchiseptica -

Bordetella parapertussis Roseomonas fauriae

Bordetella holmesii -
Bordetella hinzii
Bordetella trematum CWDeeCkgserolluapzoIIojhelcum
Bordetella ansorpii
Bordetella avium ABBHoraluceradcmleeiolgtlepaelnhlbaeirlsbuorsnborcbnohrcnioshcnpihcceihatsiniecsipaest,p,icAtAiucllsaccaalliiggeenneess bronchicanis
Bordetella petrii bronchicanis
Brevundimonas diminuta
AHBacaceinimlelutoospbhpaiaclurtaesprpeparatrruaasppseeirsrttuussssiiss
Brevundimonas vesicularis
CDC nonoxidizer group 2 ( NO-2)

Alcaligenes faecalis type II

-

-

-

-

PCsDeuCdgormouopnaIsadiminuta

CPsoeruydnoembaocntearsiuvmesivceusliacruislare

คู่มือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5 การวนิ จิ ฉัยแบคทเี รยี กอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชือ้ ราท่พี บบ่อย 185

Current names Former names/Synonyms 5บทท่ี
Burkholderia cepacia
PPEBssOueer-uuk1ddhooommldooennriaaassckmeipnuagltciiiivaocraonmsplex Genomovar I
Burkholderia multivorans Burkholderia cepacia complex Genomovar II
Burkholderia cenocepacia Burkholderia cepacia complex Genomovar III
Burkholderia stabilis Burkholderia cepacia complex Genomovar IV
Burkholderia vietnamiensis Burkholderia cepacia complex Genomovar V
Burkholderia dolosa Burkholderia cepacia complex Genomovar VI
Burkholderia ambifaria Burkholderia cepacia complex Genomovar VII
Burkholderia anthina Burkholderia cepacia complex Genomovar VIII
Burkholderia pyrrocinia PBsuerukdhoomldoenriaascpeyprarcoicaincioamplex Genomovar IX
Burkholderia cepacia complex Genomovar X
Burkholderia ubonensis -
Burkholderia latens -
Burkholderia diffusa -
Burkholderia arboris -
Burkholderia seminalis -
Burkholderia metallica -
Burkholderia contaminans -
Burkholderia lata BPPPsssueeeruuukdddhoooommmldoooennnriaaaassscgmaonlcaatordimgvioieinlcniaretonabaincsa
Burkholderia gladioli PBPMALAsfoacceaeectiiluinifflnlfedfeleoeoutororbmsmeeballmycaollaaiccnaltelammleuslsresaamimmllmllaeeaalaiilllllleeleieiii
LMBBPsoaaaececlutifllefedllrouoeimusmrempyollscnaweeaupsshdspipeotsmsumeedouuaordldimlooemiamlalaelllileeii
Burkholderia mallei -
Burkholderia pseudomallei strain Oklahoma
Burkholderia pseudomallei -

Burkholderia thailandensis
Burkholderia oklahomensis
Burkholderia fungorum

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

186 บทที่ 5 การวนิ ิจฉัยแบคทเี รียกอ่ โรคกล่มต่างๆและเชื้อราทีพ่ บบอ่ ย

Current names Former names/Synonyms
CDC Alcaligenes-group 1
Chryseobacterium anthropi -
Chryseobacterium hominis CDC group IIe
Chryseobacterium indologenes CDC group IIh, CDC group IIc
Chryseobacterium gleum Flavobacterium indologenes, Flavobacterium group IIb
Comamonas testosteroni Flavobacterium gleum
Comamonas terrigena Pseudomonas testosterone
CAoqmuaasmpiornilalusmterarqigueantiacuDmN,ACDgrCougpro1up EF-19
Comamonas aquatica ACoqmuaasmpiornilalusmterarqigueantiacuDmNA group 2
ECFomgraomuopn1a0s terrigena DNA group 3,
Comamonas kerstersii CRDalsCtognrioauppaIuVcuc-la2,, Wautersia paucula
Ralstonia gilardii, Wautersia gilardii
Cupriavidus pauculus Ralstonia respiraculi, Wautersia respiraculi
Ralstonia taiwanensis, Wautersia taiwanensis
Cupriavidus gilardii PCPPsssoeeemuuudddamooommmonoooannnsaaasssacdainiceddisodomvolooovxlroyairdtnaiasncn,ass,,
Cupriavidus respiraculi CFClDharvCyosbgearoocbutaepcritIueIrmaiummemnienngionsgeopsteicputimcu,m,
Cupriavidus taiwanensis PFFllsaaevvuoodbboaabccattceetrreiiuurimmumbbrrbeervveievsis
Delftia acidovorans CFSlpDahvCionbggaroocbutaepcritIueIrmiiummizmuitzauiitaii
Rhodobacter massiliensis
Elizabethkingia meningoseptica -
Alcaligenes venustus, Deleya venusta
Empedobacter brevis -
Alcaligenes faecalis-like organism
Flavobacterium mizutaii -
-
Haematobacter massiliensis VPPssieebuuriddoooemmxootonnraagssumeexnetssoorqpuheilnicsa, ,
Haematobacter missouriensis
Halomonas venusta
Inquilinus limosus
Kerstersia gyiorum
Laribacter hongkongensis
Massilia timonae
Methylobacterium mesophilicum

คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทเี รียก่อโรคกลม่ ต่างๆและเชือ้ ราทีพ่ บบอ่ ย 187

Current names Former names/Synonyms 5บทท่ี
Moraxella atlantae CDC group M-3
Moraxella catarrhalis Branhamella catarrhalis, Neisseria catarrhalis
Moraxella lacunata Moraxella liquefaciens
Myroides odoratus Flavobacterium odoratum, CDC group M4-f
Myroides odoratimimus Flavobacterium odoratum
Neisseria elongata subsp. nitroreducens CDC group M-6, Neisseria elongata
Neisseria weaveri CDC group M-5, Neisseria parelongata
Ochrobactrum anthropi ACADcchhCrroogmmroooubbpaaccVtteedrr-1gspraopnu.dpb i AoVt,dyC-p2easn1daDnd 2
-
Ochrobactrum intermedium -
Ochrobactrum pseudointermedium -
Ochrobactrum pseudogrignonense -
Ochrobactrum haematophilum CDC group IVe
Oligella ureolytica Moraxella urethralis, CDC group M-4
Oligella urethralis CDC group WO-2
Pandoraea sp. Achromobater group B and E
Pannonibacter phragmitetus CDC group EO-2
Paracoccus yeei SCFplyahtvoionpbghaoacbgtaaecrhitueermpiaurhmienphaaerpinaruimnum
Pedobacter heparinus Sphingobacterium piscium
CCDhrCysgeroomuopnVase-l1uteola
Pedobacter piscium CDC group Vb-2
Pseudomonas luteola -
-
Pseudomonas mendocina Flavimonas oryzihabitans CDC group Ve -2
Pseudomonas mosselii CDC group Vb-1
Pseudomonas monteilii CDC group Vb-3
Pseudomonas oryzihabitans -
Pseudomonas stutzeri CDC group IVd, CDC group EF-1
Pseudomonas stutzeri-like -
Pseudomonas veronii
Pseudomonas-like group 2
Psychrobacter immobilis

ค่มู อื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

188 บทท่ี 5 การวนิ ิจฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชอื้ ราท่พี บบ่อย

Current names Former names/Synonyms
Psychrobacter phenylpyruvicus
Raltonia pickettii Moraxella phenylpyruvica, CDC group M-2
CBuDrCkhgorloduepriaVpai-c1kaenttdii,VPas-e2udomonas pickettii
Ralstonia insidiosa Ralstonia pickettii-like isolates
Ralstonia mannitolilytica Ralstonia pickettii biovar 3, CDC group Va-3
Ralstonia solanacearum BPsuerukdhoomldoenriaasssoollaannaacceeaarruumm
AAggrroobbaacctteerriiuumm rtuadmioefbaacciteenrs, CDC group Vd-3,
Rhizobium radiobacter -
-
Roseomonas cervicalis -
Roseomonas gilardii subsp. gilardii -
Roseomonas gilardii subsp. rosea SChDeCwabnioetlylappeu2t,reCfDacCiengsrobuipovIabr-22,
Roseomonas mucosa APAscletheurrdooommmooobnnaaacsstpepruutprtueretfrafeacfciaeiceninsesns, CDC group Ib-1
Shewanella algae FPCslDaevuCodbgoarmocutoepnraiIosInkp-da1uevciomraonbsilis
-
Shewanella putrefaciens FClDavCobgarocutepriIuImk-2multivorum
SCFplDahvCionbggaroocbutaepcritIueIrmKiu-ym3a,bvFuelaursvcaohtbiialaiesc,terium spiritovorum
Sphingomonas paucimobilis Flavobacterium thalpophilum
PSXstaeennutodhtoorommpoohnnoaamssommnaaallsttooappfrhhiiicllaiiaan,aCDC group I
Sphingomonas parapaucimobilis CARaulclpsartlioiagnveiiandeuesusetnruoetpcroahtpaohrus
Sphingobacterium multivorum CphhernyosetyopbiaccatlelyriuremseamndblEinmgpmedemobbaecrtsero.f the genera
FClDavCobgarocutepriIuImf genitale
Sphingobacterium spiritovorum

Sphingobacterium thalpophilum
Stenotrophomonas maltophilia

Wautersia eutropha

Wautersiella falsenii

Weeksella virosa

คมู่ ือการปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 5 การวนิ ิจฉัยแบคทเี รยี ก่อโรคกล่มต่างๆและเชอ้ื ราท่ีพบบ่อย 189

เอกสารอ้างองิ 5บทท่ี

1. Deborah A. Henry and David P. Speert, Pseudomonas. p. 677-738. In James V. et al. (eds.)
Manaul of Clinical Microbiology. 10th Edition. ASM Press, Washington, DC 2011.
2. Gilardi GL. Identification of Glucose-Nonfermenting Gram-Negative rods. Department of
Laboratory. New York: North General Hospital, 1990.
3. James V,Henry DA, Speert DP. Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Ralstonia,
Cupriavidus, Pandoraea, Brevudimonas, Comamonas, Deftia, and Acidovorax, Acinetobacter,
Chryseobacterium, Moraxella, and Other Non-fermentative Gram-Negative Bacteria.In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of
Clinical Microbiology 10thed. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 677-738.
4. John J. Lipuma, Bart J. Currie, Sharon J. Peacock, and Peter A.R.Vandamme. Burkholderia,
Stenotrophomonas, Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Brevundimonas, Comamonas, Delftia,
and Acidovorax. In James V. et al. (eds.) Manaul of Clinical Microbiology. 10th Edition.
ASM Press, Washington, DC 2011. p. 692-713.
5. Lipuma JJ, Currie BJ, Peacock SJ, Vandamme PAR. Burkholderia, Stenotrophomonas,
Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Brevundimonas, Comamonas, Delftia and Acidovorax. In:
Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of
Clinical Microbiology 10thed. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 692-713.
6. Mario Vaneechoutte, Lenie Dijkshoorn, Alexandr Nemec, Peter Kampfer, and Georges
Wauters. Acinetobacter, Chryseobacterium, Moraxella and Other Nonfermentative
Gram-negative Rods. James V. et al. (eds.) Manaul of Clinical Microbiology. 10th Edition.
ASM Press, Washington, DC 2011. p. 714-738.
7. Vaneechoutte M, Dijkshoorn L, Nemec A, Kampfer P, Wauters G. Acinetobacter,
Chryseobacterium, Moraxella and Other Nonfermentative Gram-negative Rods. In: Versalovic J,
Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical
Microbiology 10thed. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 714-38.
8. Winn WC Jr, Allen SD, Janda WM, Koneman EW, Procop GW, Enberge S, Woods GL. The
Nonfermentative Gram-Negative Bacilli. In Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic
Microbiology 6th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006. p. 303-91.

คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

190 บทที่ 5 การวนิ ิจฉัยแบคทีเรียกอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเช้อื ราท่พี บบอ่ ย

9. ภัทรชัย กีรติสิน. ต�ำราแบคทีเรียทางการแพทย์.กรุงเทพมหานครฯ:ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะ
แพทยศาสตรศ์ ิริราชพยาบาล มหาวิทยาลยั มหิดล; 2549. หนา้ 439-62.
10. สุรางค์ เดชศิริเลิศ. การวินิจฉัยเช้ือกลุ่ม Non-fermentative Gram negative bacilli.ใน: คู่มือการ
ปฏิบัติงานแบคทีเรียส�ำหรับโรงพยาบาลศูนย์และโรงพยาบาลทั่วไปกองโรงพยาบาลภูมิภาค.
กรุงเทพมหานครฯ: สำ� นักงานปลดั กระทรวงสาธารณสขุ ; 2540.หน้า 85-110.
11. Appa.szu.cz [homepage on the Internet]. Bratislava: Species of the genus Acinetobacter, [cite 2014
Oct 27]. Available from: http://apps.szu.cz/anemec/Classification.pdf
12. Dsmz.de [homepage on the Internet]. Braunschweig: List of Prokaryotic Names Validly
Published updated Octber 2014, [cite 2014 Oct 27]. Available from: http://www.dsmz.de/
fileadmin/Bereiche/ChiefEditors/BacterialNomenclature/DSMZ_Bactnames.pdf

คูม่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

บทที่ 5
การวนิ ิจฉยั แบคทเี รยี กอ่ โรคกลมุ่ ตา่ งๆและเชือ้ ราท่พี บบอ่ ย

5.7 การวนิ ิจฉยั เชอ้ื แบคทเี รียกลมุ่ Higher Bacteria

ณฎั ฐวี รรณ ป่นุ วนั

หลักการ higher bacteria เป็นเช้ือในกลุ่ม actinomycetes จัดอยู่ใน Order Actinomycetales ซึ่งมี
การเจริญเป็นเส้นสายเล็กๆ แตกกิ่งก้าน ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.5-0.8 µm ขยายพันธุ์โดยการสร้างสปอร์
หรือแตกหกั เป็นทอ่ นของเสน้ สาย มที ง้ั เช้อื ทเี่ ป็น aerobic actinomycetes, facultative anaerobes และ obligate
anaerobes เชือ้ กอ่ โรคทีส่ ำ� คญั ในกลมุ่ aerobic actinomycetes ได้แก่ Nocardia, Actinomadura, Rhodococcus
และ Streptomyces

การวนิ ิจฉยั ทางห้องปฏิบตั กิ าร 5บทที่

1. ส่งิ ตรวจ เสมหะ ส่ิงตรวจจากระบบหายใจ หนองจากแผล เลือด น�้ำไขสันหลัง ชิ้นเนื้อจาก
ตอ่ มน้ำ� เหลือง ปอด เปน็ ตน้
2. การตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์

2.1 การเตรียมตวั อย่างเพือ่ ตรวจโดยตรงทางกลอ้ งจลุ ทรรศน์

ในกรณที สี่ ่งิ ตรวจเป็นหนองจากแผล (non-sterile site) ที่สงสัยโรค actinomycotic mycetoma
น�ำตัวอย่างหนองจากแผลถ่ายลงในจานเพาะเชื้อตรวจหา grains หรือ granules ซ่ึงเป็นกลุ่มของเชื้อก่อโรค
(microcolonies) ดสู ี รูปรา่ ง ขนาด ความนมุ่ หรอื ความแข็งของ grains หรอื granules ด้วยตาเปลา่ จากนัน้ ใช้
pasteur pipette ดูดแยก grains ออกมาหยดลงบนแผ่นสไลด์แก้วและใช้แผ่นสไลดแ์ ก้วอกี แผ่นหนึง่ ปดิ ทบั บด
ให้ grains แตก แลว้ เกลย่ี ใหเ้ ป็นแผน่ บาง ปลอ่ ยใหแ้ ห้งและลนผ่านเปลวไฟ 3 คร้งั
ช้ินเน้ือ ใช้กรรไกรท่ีปราศจากเชื้อตัดให้เป็นชิ้นเล็กๆ ใช้คีมคีบปราศจากเชื้อคีบช้ินเน้ือกดลง
บนแผน่ สไลด์แกว้ หลายๆครง้ั ปล่อยใหแ้ หง้ และลนผา่ นเปลวไฟ 3 ครัง้
Body fluids (เลือด น้�ำไขสันหลัง น้�ำจากต�ำแหน่งที่ไม่มีเชื้อประจ�ำถ่ิน) น�ำเข้าเคร่ืองปั่น
(centrifuge) โดยใชค้ วามเร็ว 2800 g เป็นเวลา 10 นาที นำ� สว่ นท่ีอยู่ก้นหลอดมา smear บนแผ่นสไลดแ์ ก้วปล่อย
ใหแ้ หง้ และลนผ่านเปลวไฟ 3 ครงั้

192 บทท่ี 5 การวินจิ ฉยั แบคทเี รยี ก่อโรคกลม่ ต่างๆและเชื้อราที่พบบอ่ ย

2.1.1 การย้อมแกรม โดยวิธกี ารย้อมเหมอื นกับการย้อมสีแกรมแบคทเี รีย
เชอ้ื ควบคุมคุณภาพ Gram-positive control Streptomyces flavus DMST 15342
Gram-negative control Escherichia coli DMST 4212
2.2.2 การย้อม modified Kinyoun acid-fast
วิธยี ้อม
1. หยดสารละลาย carbol fuchsin ลงบนแผน่ smear จนทวั่ ท้ิงไว้ 5 นาทที ่ีอณุ หภมู ิ
ห้อง ไม่ต้องอ่นุ
2. ล้างดว้ ยนำ้�
3. ล้างด้วย 50% ethyl alcohol ราดทับและเททิ้งสลับกันไปหลายๆคร้ังจนกว่า
สีแดงส่วนเกินจะจางลง
4. ล้างด้วยน�้ำ
5. ล้างด้วย 1% sulfuric acid ในนำ้� เปน็ เวลา 3 นาที
6. ย้อมทับดว้ ย methylene blue เปน็ เวลา 1 นาที
7. ลา้ งดว้ ยน้ำ� ปล่อยใหแ้ ห้ง ตรวจดูด้วยกล้องจลุ ทรรศน์
เชือ้ ควบคุมคณุ ภาพ
modifiied AFB positive control Nocardia asteroides DMST 15332
modifiied AFB negative control Streptomyces flavus DMST 15342

2.2 การเพาะเชือ้
การตรวจแยกเชื้อ aerobic actinomycetes จากสิ่งตรวจท่ีไม่มีเช้ือประจ�ำถิ่น (sterile sites)
หรือ concentrated sterile body fluid สามารถเพาะโดยตรงบนอาหารเลี้ยงเช้ือ BA, CA, BHA, SDA และ
Lowenstein-Jensen medium
ส่ิงตรวจจากต�ำแหน่งที่มีเช้ือประจ�ำถ่ิน (nonsterile sites) เช่น สิ่งตรวจจากทางเดินหายใจ
และ mycetoma ให้ pretreat ด้วย low-pH (2.2) HCl-KCl solution (46.8 ml 0.2M HCl และ 300 ml
0.2M KCL) ใช้ 1 ml low-pH (2.2) HCl-KCl solution ผสมกบั ตัวอยา่ ง 10 ml ตัง้ ท้ิงไว้ 4 นาที เพาะลงบน
selective media เช่น MTM, Buffered charcoal yeast extract (BCYE) เพาะเช้อื ทอ่ี ุณหภมู ิ 30 OC และ 35 OC นาน
1-3 สปั ดาห ์ ตรวจสอบการเจรญิ ของเชือ้ ทกุ วนั ในสัปดาหท์ ่หี นงึ่ และสปั ดาหล์ ะคร้ังของสัปดาห์ท่ี 2 และ 3
เมอื่ เชื้อเจรญิ สง่ ต่อฝา่ ยเช้อื ราวิทยา สถาบนั วจิ ยั วิทยาศาสตร์สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์
นำ� โคโลนที ี่ไดม้ าทำ� การทดสอบคณุ สมบัติการตดิ สี acid-fast ดกู ารสรา้ ง aerial mycelium ด้วย
กล้องจลุ ทรรศน์

คมู่ ือการปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรียและรา

บทท่ี 5 การวนิ จิ ฉยั แบคทีเรียก่อโรคกล่มต่างๆและเชอื้ ราทพ่ี บบอ่ ย 193

3. การอ่านผล
ตารางท่ี 5.7-1 ลักษณะของ grains หรอื granules ของเช้อื กอ่ โรค actinomycotic mycetoma

Organisms Grains

Nocardia asteroides rare; white, soft, irregular, 1 mm

Nocardia brasiliensis white to yellow, soft, lobe, 1 mm

Nocardia otitidiscaviarum white to yellow

Actinomadura madurae white, soft, oval to lobe, 5 mm

Actinomadura pelletieri red, hard, oval to lobe, 1 mm

Streptomyces somaliensis yellow, hard, round to oval, 2 mm



Actinomadura spp. ตดิ สแี กรมบวก ไมต่ ดิ ส ี modified acid-fast รปู รา่ งลกั ษณะเปน็ เสน้ สายสนั้ ๆ ขนาด

เสน้ ผา่ นศูนย์กลางนอ้ ยกว่า 1 µm 5บทท่ี

Nocardia spp. ตดิ สีแกรมบวกและติดสี modified acid-fast เป็นบางสว่ น รปู ร่างลกั ษณะเป็นเสน้ สาย

เส้นสายแตกหักเป็นรูปท่อน จนถงึ รูปกลม ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 0.5-1 µm

Rhodococcus spp. ติดสีแกรมบวกและติดสี modified acid-fast เป็นบางส่วน รูปร่างลักษณะเป็น

coccobacilli หรือมีลักษณะคลา้ ย diphtheroids

Streptomyces spp. ตดิ สแี กรมบวก ไมต่ ดิ สี modified acid-fast รูปร่างลกั ษณะเป็นเสน้ สาย ขนาดเส้น

ผ่านศูนยก์ ลางประมาณ 0.5-1 µm ไมม่ ีการแตกหักของเสน้ สายเปน็ ทอ่ น

ตารางที่ 5.7-2 Morphologic characteristics of aerobic actinomycetes

Genus Substrate Aerial Conidia Modified Microscopic Colonial morphology
hyphae hyphae acid-fast morphology Powdery aerial hyphae
may be blue, brown,
Actinomadura + V V - Thin, short cream, gray, green, pink,
branching white, violet, or yellow.
flament Colonies are wrinkled and
may have a leathery or
cartilaginous appearance
when aerial myceliumis
absent.

ค่มู อื การปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รยี และรา

194 บทท่ี 5 การวนิ จิ ฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชอ้ื ราที่พบบ่อย

Genus Substrate Aerial Conidia Modified Microscopic Colonial morphology
hyphae hyphae acid-fast morphology

Nocardia + + V W Thin, Chalky, matte or velvety,
filamentous powdery (usually),
branching rods, irregular, wrinkled,
0.5-1.0 µm in heaped, or smooth on
diam; beading surface; may be brown,
generally tan, pink, orange, red,
apparent. purple, gray, yellow,
peach, or white on
reverse; smooth or
granular; soluble brown
or yellow pigments may
be produced

Rhodococcus + - - W Coccoid to Rough, smooth, or
bacillary forms mucoid; buff, cream,
yellow, orange, or red;
colorless variants occur;
may become increasingly
pigmented and rough
with age.

Streptomyces + + + - Filamentous Colonies are discrete and
branching rods, lichenoid, leathery, or
0.5-2.0 µm in butyrous; variety of
diam; filaments pigments; aerial hyphae
may fragment may appear floccose,
into short rods; granular, powdery, or
may stain more velvety; may produce a
solidly gram- colored soluble pigment.
positive than
Nocardia; may
show beading.

คู่มือการปฏิบตั ิงานแบคทีเรียและรา

บทที่ 5 การวนิ ิจฉยั แบคทีเรยี กอ่ โรคกล่มต่างๆและเช้อื ราท่ีพบบอ่ ย 195

ตรวจดูการสร้าง aerial mycelium ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ส่วนขอบของโคโลนีจะเห็นลักษณะที่เป็น
เสน้ สายคลา้ ยกับเสน้ ซิกแซก

4. การรายงานผล 5บทที่
การตรวจโดยตรงทางกล้องจลุ ทรรศน์

รายงานผล Nocardia “Gram-positive, modified acid fast positive (partially acid fast),
branching filament, beading filament, fragment bacilli, suggesting Nocardia.”
รายงานผล Rhodococcus “Gram-positive, modified acid fast positive (partially acid fast),
coccoid to bacillary forms, suggesting Rhodococcus.”
รายงานผล Streptomyces “Gram-positive, modified acid fast negative, branching filament,
suggesting Streptomyces.”
รายงานผล Actinomadura “Gram-positive, modified acid fast negative, short branching
filament, suggesting Actinomadura.”
กรณที ่ีพบ grains หรอื granules ในส่ิงตรวจ ใหพ้ ิจารณาสี ขนาด ความนมุ่ หรอื แขง็ และขนาดของ
grains หรือ granules ตามท่แี สดงไวใ้ นตารางที่ 5.7.1 ลักษณะของ grains หรอื granules ของเช้อื กอ่ โรค
actinomycotic mycetoma มาประกอบในการรายงานผลด้วย
การรายงานผลเพาะเชื้อเบื้องต้น สามารถรายงานผลได้ในระดับ genus โดยพิจารณาจากลักษณะ
โคโลนบี นอาหารเลย้ี งเชอื้ การตดิ สี AFB และการสรา้ ง aerial mycelium โดยพจิ ารณาคณุ สมบตั ขิ องเชอ้ื ทท่ี ำ� การ
ทดสอบประกอบกบั คุณสมบตั ิของเช้อื แตล่ ะgenus ทแ่ี สดงไว้ในตารางที่ 5.7.2

เอกสารอ้างองิ

1. Conville PS and Witebsky FG. Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinimadura,
Streptomycetes, and Other Aerobic Actinomycetes. In: Versalovic J, editor in chief. Manual of

Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 443-471.
2. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In:
Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p. 507-540.
3. Hazen KC and Howell SA. Aerobic Actinomycetes. In: Garcia LS.editor in chief.Clinical
Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007.
p. 6.0.1-6.2.10.

คมู่ อื การปฏบิ ตั ิงานแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5
การวนิ จิ ฉยั แบคทีเรียกอ่ โรคกลมุ่ ต่างๆและเช้อื ราท่ีพบบ่อย
5.8 การวินจิ ฉยั เชื้อแบคทีเรียกล่มุ Miscellaneous Gram-Negative Bacteria

วรดา สโมสรสขุ
อนุศักดิ ์ เกิดสิน

Francisella spp.
เป็นแบคทเี รยี แกรมลบ ตดิ สีแดงของ safranin บางๆ รปู ร่าง coccobacilli ประกอบดว้ ย 3 species ดังนี้
F. tularensis, F. novicida และ F. philomiragia ส�ำหรับ F. tularensis สามารถจำ� แนกออกได้อกี 3 subspecies
คอื tularensis, holarctica และ mediasiatica โรคทเี่ กิดจากเชือ้ น้ีคอื โรคทลู ารเี มยี (tularemia) ซงึ่ เชื้อท่กี ่อโรคน้ี
คือ F. tularensis โดยเฉพาะ F. tularensis subsp. tularensis มีความรุนแรงในการก่อโรคสูงสุดและถือเป็น
อาวธุ ชวี ภาพอกี ดว้ ย เชือ้ น้ีมสี ตั วป์ า่ เป็นแหล่งรงั โรค เป็นทัง้ สัตว์ท่ีมีและไม่มีกระดกู สนั หลัง การตดิ ตอ่ ส่คู น
สามารถเกิดขึ้นโดยผ่านทางบาดแผลจากการสัมผัส การถูกกัดหรือข่วน การรับประทานเนื้อสัตว์ป่า
ท่ีปรุงไม่สุก หรือการหายใจเอาละอองหรือสารคัดหลั่งท่ีมีการปนเปื้อนเชื้อน้ีเข้าสู่ร่างกาย ในประเทศไทย
ยังไมม่ รี ายงานผ้ปู ว่ ยโรคทูลารเี มีย จากเชือ้ F. tularensis แตพ่ บรายงานการติดเชื้อ F. novicida ในกระแสโลหิต
ในผปู้ ว่ ย เมอื่ ปี พ.ศ. 2551
เชื้อ F. tularensis สามารถเพาะได้ด้วยอาหารเล้ียงเชื้อ BA หรือ CA ท่ีเสริมด้วยสารประกอบจ�ำพวก
sulhydryl ได้แก ่ cysteine, cystine, thiosulfate หรือ IsoVitaleX นอกจากนี้อาหารเลี้ยงเช้อื buffered charcoal-
yeast extract agar (BCYE) ทีใ่ ชใ้ นการเพาะเชอ้ื Legionella spp. สามารถใชไ้ ด้ อย่างไรก็ตาม F. novicida และ
F. philomiragia สามารถเจริญได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ BA หรือ CA ท่ีไม่ต้องเสริมด้วยสารประกอบจ�ำพวก
sulhydryl เช้ือน้ีเจริญได้ที่อุณหภูมิ 35-37 OC ไมต่ อ้ งการ CO2 ในการเจรญิ เติบโต ระยะเวลาในการเจรญิ เติบโต
จนเปน็ โคโลนโี ดยเฉลีย่ มากกวา่ 2 วนั โดยท่วั ไปโคโลนีมีขนาดประมาณ 1-2 mm สีเทาถงึ เทาขาว บนอาหาร
เลี้ยงเช้ือ CA การทดสอบเบ้ืองต้นเพื่อจ�ำแนก Francisella ออกจากเชื้ออื่นๆ ท่ีใกล้เคียง เช่น Brucella,
Haemophilus, Acinetobacter ได้แก่ การทดสอบ oxidase, X, V factor และ urease ซ่ึงใหผ้ ลลบทง้ั หมด

Brucella spp.
เปน็ แบคทเี รยี แกรมลบ รปู รา่ ง coccobacilli ขนาดเลก็ ตดิ สแี ดงของ safranin บางๆ ไมม่ ี capsule, flagella
และ endospore ไมส่ ามารถหมกั นำ้� ตาลได้ ประกอบดว้ ย 9 species มสี ัตว์ท่ีเป็นพาหะจำ� เพาะตามแต่ละ species

บทที่ 5 การวินจิ ฉัยแบคทเี รยี ก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเช้ือราท่ีพบบอ่ ย 197

ไดแ้ ก่ B. melitensis มแี พะหรอื แกะหรอื อูฐ เป็นสตั วร์ ังโรค B. abortus มสี ัตว์เคย้ี วเอื้อง เช่น โค กระบอื เป็น 5บทท่ี
สัตว์รังโรค B. suis มีสุกรเป็นสัตว์รังโรค B. ovis มีแกะเป็นสัตว์รังโรค B. canis มีสุนัขเป็นสัตว์รังโรค
B. neotomae มหี นูเปน็ สัตวร์ งั โรค B. delphini, B. pinnipediae, B. cetaceae มีสัตว์เล้ยี งลูกด้วยนมท่อี าศัยอยใู่ น
ทะเล อาทิ แมวน้ำ� ปลาวาฬ ปลาโลมา เปน็ สัตว์รังโรค
โรคท่ีเกิดจากเชื้อ Brucella เรียกว่า โรค brucellosis นอกจากนี้ยังมีชื่อเรียกอย่างอื่นแตกต่างกันไป
ตามสภาพภูมิศาสตร์ เช่น Malta fever, Mediterranean fever, Cyprus fever, Gibralta fever เป็นต้น การ
ติดต่อสู่คนสามารถเกิดข้ึนโดยผ่านทางบาดแผลจากการสัมผัส การรับประทานนมดิบ เนย ชีสที่ไม่ผ่าน
กระบวนการพาสเจอร์ไรซ์ และการหายใจเอาละอองหรือสารคัดหลั่งที่มีการปนเปื้อนเชื้อน้ีเข้าสู่ร่างกาย
เชอื้ นี้ยงั ถูกจดั ใหเ้ ป็นอาวธุ ชวี ภาพอีกดว้ ย
การเพาะเชือ้ Brucella สามารถเพาะลงอาหารเล้ียงเชอื้ BA, CA, Thayer-Martin, Martin-Lewis เชือ้
สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิ 35-37 OC ท่ีมีหรือไม่มี CO2 (5-10%) สามารถพบโคโลนีได้หลังจากอบแล้ว 1-2
วนั โคโลนมี ีขนาดเล็กประมาณ 1-2 mm ลกั ษณะกลมนนู ผิวเรยี บ นอกจากน้ี เครอื่ ง automated blood culture
เช่น Bactec, BacT Alert ให้ผลการเจริญของเช้ือดีกว่า วิธี nonautomated blood culture อย่าง biphasic
Ruiz-Castañeda bottle ซง่ึ ใชเ้ วลาประมาณ 7-35 วนั ในการเจรญิ ขณะทเี่ ครอ่ื ง automated blood culture จะใชเ้ วลา
ไม่เกิน 10-14 วนั ในการจำ� แนกเชือ้ Brucella เบ้อื งต้น ได้แก่ การทดสอบ oxidase, catalase และ urease ซง่ึ ให้
ผลบวกทงั้ หมด โดยเฉพาะการทดสอบ urease จะใหผ้ ลบวกท่คี ่อนข้างเร็ว ภายใน 5 นาท ี ส�ำหรบั species ที่
แยกได้จากคนอย่บู อ่ ยๆ เชน่ B. melitensis, B. abortus

Pasteurella spp.

เปน็ แบคทีเรยี แกรมลบ รูปร่างทรงแท่งหรอื coccobacilli ปจั จบุ ันมี 8 species โดย P. multocida เปน็
species ที่แยกได้จากผูป้ ่วยบอ่ ยที่สุด อย่างไรกต็ าม P. multocida สามารถจ�ำแนกออกไดอ้ ีก 3 subspecies ดังน้ี
multocida, septica และ gallicida เช้ือ Pasteurella พบได้ทว่ั ไปท้ังในสัตวป์ า่ และสัตว์บ้าน
การเพาะเชือ้ Pasteurella สามารถเพาะเลี้ยงไดง้ า่ ย โดยใชอ้ าหารเล้ียงเช้อื ทวั่ ไปทีม่ ีอยู่ในห้องปฏิบตั กิ าร
อย่าง BA หรือ CA ท่ีอุณหภูมิ 35-37 OC ไม่ต้องการ CO2 โคโลนีมีขนาดประมาณ 1-2 mm nonhemolysis
อย่างไรก็ตามบางสายพนั ธอุ์ าจพบโคโลนีทีม่ ลี กั ษณะเยิ้มได้ (mucoid) การทดสอบปฏิกิรยิ าทางชวี เคมเี บ้ืองตน้
ได้แก่ การทดสอบ catalase, oxidase, indole ซ่ึงให้ผลการทดสอบเป็นบวกทั้งหมด นอกจากนก้ี ารใช้ penicillin
disk ขนาด 10 U สามารถช่วยในการจ�ำแนกได้ เน่ืองจาก Pasteurella จะไวต่อยา penicillin โดยมีขนาดของ
inhibition zone > 15 mm

คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

198 บทท่ี 5 การวินจิ ฉยั แบคทีเรียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชื้อราที่พบบ่อย

Bartonella spp.
เป็นแบคทีเรียแกรมลบ ขนาดเล็ก รูปร่างทรงแท่งหรือ curve rod เล็กน้อย คล้ายกับ Helicobacter,
Campylobacter หรอื Haemophilus เช้ือติดสีแกรมไมค่ อ่ ยดี ไมว่ า่ จะใช้ safranin หรือ basic fuchsin เชอ้ื เป็น
facultative intracellular สามารถอาศยั อยใู่ นเซลล์ของคนและสัตว ์ มีมากกว่า 22 species มสี ัตว์บา้ น สัตวป์ า่
และแมลงเปน็ แหลง่ รงั โรค
Bartonella สามารถเพาะไดโ้ ดยใชอ้ าหารเลย้ี งเชอื้ ทมี่ อี ยใู่ นหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารอยา่ ง BA และ CA แตเ่ นอ่ื งจาก
เป็นเชื้อที่ fastidious ดังน้นั ระยะเวลาในการเพาะอาจนานต้ังแต่ 5 วัน จนถงึ 30 วนั ณ อุณหภมู ิ 35-37 OC ทม่ี ี
CO2 (5%) และความชื้นสูง (high humidity) ลักษณะโคโลนีมี 2 แบบ คือ (1) แบบขรุขระ ผิวไม่เรียบ แห้ง
ลกั ษณะคลา้ ยกบั ดอกกะหลำ�่ (cauliflower-like) (2) แบบกลมผวิ เรยี บขนาดเลก็ และอาจฝงั อยใู่ นเนอื้ ของอาหาร
เล้ียงเชื้อ เนื่องจากเชื้อ Bartonella ค่อนข้าง inert ต่อการทดสอบทางปฏิกิริยาชีวเคมี ซึ่งจะให้ผลลบต่อการ
ทดสอบท้ังหมด ดังนั้นวิธีในการตรวจยืนยันเช้ือดังกล่าวควรใช้วิธีทางอณูชีววิทยา เช่น DNA sequencing,
PCR ซึ่งเหมาะสมทีส่ ุด แตอ่ ย่างไรก็ตาม จากลกั ษณะที่กล่าวมาขา้ งต้น อาจสนั นิษฐานได้วา่ เป็นเชอ้ื ดังกล่าว
อาหารเลี้ยงเชื้ออีกชนิดหน่ึงที่ช่วยเสริมให้เชื้อ Bartonella เจริญเติบโตได้ดี คือ Bartonella
Alphaproteo bacteria growth medium (BAPGM) อย่างไรก็ตาม ในกรณีท่ีเลี้ยงเชื้อในเคร่ือง automated
blood culture system ท่ีอาศัยการตรวจจบั สัญญาณจาก CO2 มกั ลม้ เหลวในการตรวจหาเช้ือน้ี เพราะวา่ เชอื้ มี
ความ inert ในการย่อยสลายอาหาร และผลิต CO2 ได้น้อยมาก ดังน้ันการท�ำ blind subculture จากขวด
hemoculture จะมีประโยชนใ์ นกรณีทีส่ งสยั เชือ้ ดงั กล่าว

Chromobacterium spp.
เฉพาะ C. violaceum เท่านั้น ท่ีก่อโรคในคนเท่าน้ัน เช้ือน้ีติดสีแกรมลบ รูปแท่ง ส่วนใหญ่มากกว่า
ร้อยละ 90 มีรงควัตถุ violacein v ท�ำใหม้ โี คโลนีสีมว่ ง แต่อยา่ งไรก็ตามบางสายพนั ธทุ์ ี่ไม่มรี งควตั ถกุ ็สามารถ
พบได้
ในการเพาะเลีย้ งเช้ือแบคทเี รยี น้ี อาหารเล้ียงเช้อื ท่วั ไปทีม่ อี ยูใ่ นห้องปฏิบตั กิ าร เชน่ BA หรือ CA หรือ
TSA สามารถใช้เพาะได้ดี เชื้อโตง่ายคลา้ ยกับแบคทเี รียกลมุ่ enteric อาจพบ β-hemolysis บน BA ได้ในบางสาย
พนั ธ ุ์ เชอ้ื สามารถเจรญิ ไดท้ อ่ี ณุ หภมุ ิ 30-37 OC ไมต่ อ้ งการ CO2 โคโลนมี ขี นาด 1-2 mm หลงั จาก 24 ชม. ลกั ษณะ
กลมนูน ผวิ เรยี บ และส่วนใหญ่มีสมี ่วง เนอ่ื งจากรงควตั ถุ violacein ดังนั้นการจำ� แนกเบอื้ งตน้ คอ่ นข้างงา่ ย ถ้า
พบโคโลนมี สี มี ่วงดงั กลา่ ว oxidase ใหผ้ ลบวก อย่างไรกต็ ามถ้าพบเชือ้ ทไี่ ม่ให้โคโลนีสมี ่วง อาจทำ� ใหส้ บั สนกบั
Aeromonas แตส่ ามารถจำ� แนกออกจาก Aeromonas ได้โดยการทดสอบ lysine, maltose และ mannitol ใหผ้ ล
ลบท้ังหมด

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

ตารางท่ี 5.8-1 ลักษณะทางชวี เคมีของแบคทเี รยี ในกลุม่ miscellaneous gram negative และแบคทเี รียอ่ืนทใ่ี กลเ้ คียง

Test Francisella Brucella Pasteurella Bartonella Haemophilus Chromobacterium Bordetella Ochrobactrum
spp. spp. spp. spp. spp. violaceum bronchiseptica anthropi
+
Growth on BA v++ + - + + +
+ +
Growth on CA +++ + + + + +
+ +
Growth on MAC --v - - + + +
+ -
Oxidase -++ - V v -
-
Urease -+v - V ND -
-
Motility --- - - + -
บทท่ี 5 การวินจิ ฉัยแบคทีเรยี ก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเชื้อราที่พบบอ่ ย 199
Indole - - +** - V v
5บทท่ี
X and/or V factor --- - + -
requirementค่มู ือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา

Cysteine enhancement +* - - - - -

* F. philomiragia และ F. novicida ไมต่ ้องการ cysteine ในการเจริญ

** P. aerogenes และ P. caballi ให้ผลลบ

200 บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทีเรยี ก่อโรคกลม่ ต่างๆและเช้อื ราท่พี บบ่อย

Campylobacter spp.
เช้อื Campylobacter เป็นแบคทเี รียแกรมลบ จดั อยใู่ น family Campylobacteraceae รูปรา่ งเป็นทอ่ นโคง้
(curved) S-shaped หรือเป็นเกลียว (spiral) ขนาด 0.2-0.9 x 0.5-5.0 μm ติดสีแกรมลบ ไม่สร้างสปอร์
แต่อาจพบเป็นรูปร่างกลมหรือรี หากเพาะไว้นานหลายวัน เช้ือนี้สามารถเคล่ือนท่ีได้ โดยใช้ polar flagellum
สว่ นใหญเ่ ปน็ microaerobic bacteria เจรญิ ไดด้ ใี นสภาวะทมี่ ปี รมิ าณออกซเิ จนตำ่� เวลาเลยี้ งเชอื้ ตอ้ งใชบ้ รรยากาศ
ทม่ี ี 5% O2, 10% CO2, and 85% N2 บางสายพันธุ์เจริญไดใ้ นสภาวะ aerobic หรือ anaerobic ได้ เดิมจดั อยู่ใน
genus Vibrio เน่ืองจากมีรปู รา่ งคลา้ ยกนั เช้อื Campylobacter มี 21 species (ตารางที่ 5.8-2) ได้แก่ C. jejuni,
C. coli, C. fetus, C. upsaliensis, C. lari, C. hyointestinalis, C. helveticus, C. sputorum, C. concisus, C.curvus,
C. rectus, C. showae, C. gracilis, C. mucosalis, C. lanienae, C. insulaenigrae, C. canadensis, C. hominis,
C. avium, C. cuniculorum, และ C. subantarcticus
เชือ้ ใน genus Campylobacter มีทง้ั เปน็ สาเหตขุ องโรคและกล่มุ ท่ีไมก่ ่อโรคเช้อื ท่ีท�ำให้เกิดโรคที่ส�ำคัญ
C. jejuni และ C. coli เป็นสายพันธ์ุท่ีเป็นสาเหตุของการติดเช้ือมากที่สุด เช้ือสามารถอยู่ในอาหาร น้�ำ หรือ
ส่ิงแวดล้อมอ่ืน ๆ ทนตอ่ ความร้อน ความแหง้ แลง้ ดอ้ื ตอ่ สารต้านจุลชพี ในอัตราที่สูง นอกจากน้ี เชือ้ C. fetus,
C. lari, C. upsaliensis และ C. hyointestinalis เปน็ สายพนั ธุท์ ี่ก่อโรคได้ทัง้ ในมนุษย์และสตั ว์

การวนิ ิจฉยั ทางหอ้ งปฏิบตั กิ าร
การตรวจการติดเช้ือ C. jejuni สามารถตรวจโดยใช้อุจจาระผสมน�้ำเกลือหยดบนแผ่นแก้วตรวจ
ดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ชนิด dark field หรือ phase contrast โดยตรวจหาแบคทีเรียรูปร่างโค้งงอ ท่ีมีการ
เคล่ือนที่เร็ว ปัจจุบันใช้วิธีการเพาะแยกเชื้อจากตัวอย่างอุจจาระผู้ป่วย โดยเก็บใส่ขวดที่สะอาด หรือเก็บเป็น
rectal swab ใสใ่ น Cary-Blair transport medium น�ำส่งหอ้ งปฏิบัติการภายใน 2 ชม. หรือหากไม่สามารถ
เพาะเชอ้ื ไดใ้ หเ้ กบ็ ที่4 OCการเพาะเชอ้ื สามารถเลอื กใชอ้ าหารเลย้ี งเชอ้ื หลายชนดิ เชน่ 5%BAโดยใชแ้ ผน่ กระดาษ
กรอง ขนาด 0.45 µm วางลงบนอาหาร BA นำ� rectal swab ของผปู้ ว่ ย มาปา้ ยบนแผน่ กระดาษกรอง ตงั้ ทง้ิ ไวน้ าน
30 นาที จากนน้ั คบี เอาแผน่ กระดาษกรองทงิ้ ไปแลว้ นำ� ไปอบในสภาวะmicroaerobic (5% O2 10% CO2 85% N2)
หรือใช้ anaerobic jar ทใี่ ส่ Campy pak (BBL) 1 ซอง ท่อี ุณหภูมิ 37 OC นาน 48 ชม.
นอกจากนี้อาจปา้ ยอจุ จาระลงอาหารเลยี้ งเช้อื ชนิด selective medium ที่มีสว่ นผสมของสารตา้ นจลุ ชพี
เช่น Skirrow’s medium ท่ีมีส่วนผสมของ vancomycin, trimethoprim และ polymyxin B, Butzler’s medium
ที่มีส่วนผสมของ bacitracin, cycloheximide, colistin sulphate, cephazolin sodium และ novobiocin หรือ
Campy-BAP ที่มีส่วนผสมของ vancomycin, polymyxin B, cephalothin sodium และ amphotericin B
จากนั้นน�ำไปอบในสภาวะ microaerobic ท่ีอุณหภูมิ 37 OC ตรวจดูโคโลนีของเชื้อหลังจากอบเพาะเชื้อนาน

คู่มือการปฏบิ ัตงิ านแบคทีเรียและรา

บทท่ี 5 การวนิ ิจฉยั แบคทีเรยี ก่อโรคกล่มต่างๆและเชื้อราท่พี บบ่อย 201

2-3 วนั โคโลนขี องเชอ้ื จะมลี ักษณะมนั วาวคลา้ ยหยดนำ้� ค้าง ขนาด 1-2 mm สีเทาขาว เมอ่ื น�ำไปยอ้ มแกรมจะ
เหน็ เป็นรูปตวั S หรือ ปีกนก (Gull wing) ตดิ สีแกรมลบ แตเ่ ชอื้ ไม่ค่อยติดสี safranin ควรใช้ 0.05-0.1% carbol
fuchsin เป็น counter stain แทน

การทดสอบปฏกิ ริ ิยาทางชวี เคมเี บอ้ื งตน้ 5บทท่ี

เช้ือ Campylobacter ทดสอบ oxidase ให้ผลบวก ท�ำการเพาะโคโลนที ี่พบลงใน BA 3 จาน น�ำไปอบที่
สภาวะ microaerobic ทีอ่ ณุ หภูมติ ่างกนั ได้แก่ อุณหภมู ิ 25 OC, 37 OC และ 42 OC เป็นเวลานาน 24-48 ชม.
สังเกตผลดงั น้ี คือ ถ้าเปน็ เชอ้ื Campylobacter เชอื้ จะเจรญิ ได้ดใี นสภาวะ microaerobic อณุ หภูมิ 37 OC/42 OC
แตเ่ จรญิ ไดไ้ มด่ ีทีส่ ภาวะ microaerobic อุณหภูมิห้อง (25 OC) การแยกพสิ ูจน์เช้ือให้ไดแ้ ตล่ ะ species สามารถ
ดูไดจ้ ากตารางท่ี 5.8-2
C. jejuni แยกออกจาก Campylobacter สายพันธุอ์ ืน่ ๆ ดว้ ย hippurate hydrolysis ซึง่ C. jejuni ให้ผล
บวก ขณะที่สายพันธอุ์ ่ืนใหผ้ ลลบ วธิ กี ารทดสอบ hippurate hydrolysis ดงั ต่อไปนี้
1. เขี่ยเชื้อทดสอบ 2 loopful ลงใน 0.4 ml ของ 1% hippurate solution ใน หลอดขนาด
13 x 100 mm อบที่ 37 OC 2 ชม.
2. หยด 0.2 ml ninhydrin reagent เขย่า และอบท่ี 37 OC 10 นาที
ผลบวก: เกิดสมี ่วง
ผลลบ: ไมเ่ ปล่ยี นสี หรอื เกิดสีม่วงอ่อน

ค่มู ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รียและรา

202 บทที่ 5 การวินิจฉยั แบคทเี รยี ก่อโรคกล่มต่างๆและเชอ้ื ราทพ่ี บบ่อยตารางที่ 5.8-2 การแยกพสิ ูจนเ์ ชื้อ Campylobacter spp.Growth at/ in/on
คูม่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทีเรียและรา
Species
α-hemolysis
Oxidase
Catalase
Hippyrate hydrolysis
Urease production
Nitrate reduction
Alkaline phosphatase
H2S, TSI
Acid and H2S, TSI
Indoxyl acetate hydrolysis
25 OC (microaerobic)
30 OC (microaerobic)
37 OC (microaerobic)
42 OC (microaerobic)
37 OC (anaerobic)
Ambient O2
Nutrient agar
CCDA
MacConkey agar
1% glycine
3.5% NaCl
Resistance to nalidixic acid
Resistance to cephalothin
Requirement for H2
γ-Glutamyl transpeptidase
Flagella

C. upsaliensis + + - - - + - - - + - + + (+) - - + + - + - - (-) - - +

C. sputorum + + V - - + - + - - - (+) + + + - + (+) V + V (+) - + - +

C. showae + V + - - + - V - V - + V V + - V + + V - - - + NA +

C. rectus + + (-) - - + - - - + - V - (-) + - (-) - - + - (+) - + NA +

C. mucosalis - + - - - - (+) + - - - + + + + - + + (+) V - (+) - + NA +

C. lari V + + - V + - - - - - + + + - - + + - + - V + - - +

C. lanienae - + + - - + + - V - - NA + + + - NA NA + - - + + - - +

C. jejuni subsp. jejuni + + + + - + - - - + - + + + - - + + - + - - + - - +

C. jejuni subsp. doylei + + V + - - - - - + - + + - - - + + - (-) - - - - NA +

C. insulaenigrae NA + + - - + NA - NA - - NA NA - - - NA NA NA + - + + NA NA NA

C. hyointestinalis V + + - - + (-) + - - - + + + + - + + v v - + - V - +
subsp. lawsonii

C. hyointestinalis V + + - - + - + - - (-) + + + - - + +V+ - + (-) V - +
subsp. hyointestinalis

Growth at/ in/on
α-hemolysis
Species Oxidase
Catalase
Hippyrate hydrolysis
Urease production
Nitrate reduction
Alkaline phosphatase
H2S, TSI
Acid and H2S, TSI
Indoxyl acetate hydrolysis
25 OC (microaerobic)
30 OC (microaerobic)
37 OC (microaerobic)
42 OC (microaerobic)
37 OC (anaerobic)
Ambient O2
Nutrient agar
CCDA
MacConkey agar
1% glycine
3.5% NaCl
Resistance to nalidixic acid
Resistance to cephalothin
Requirement for H2
γ-Glutamyl transpeptidase
Flagella

C. avium - + w + - + - - - + - NA + + - - - - - - - - + V - +

C. hominis - + - - - V - - NA - - - - NA + - NA NA - + + V - NA NA -

C. helveticus + + - - - + - - - + - V + + - - (+) + - V - - - - - +

C. gracilis - - V - - (+) - - - V - V - V + - + V (+) + - V - NA NA -
บทท่ี 5 การวินจิ ฉัยแบคทีเรยี ก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเชื้อราที่พบบอ่ ย 203
C. fetus
subsp. venerealis 5บทท่ี

ค่มู ือการปฏิบัตงิ านแบคทเี รยี และรา
V + (+) - - + - - - - + + + - V - + + V - - V - - NA +

C. fetus subsp. fetus - + + - - + - - - - + + + (+) (-) - + + (+) + - + - - - +

C. curvus (-) + - (-) - + V (-) - V - + V V + - + (+) (+) + - + - + NA +

C. concisus (-) V - - - (-) V - - - - (+) + (+) + - (-) (-) - (-) - (+) - + - +

C. coli (-) + + - - + - V - + - + + + - - + + V + - - + - - +

C. canadensis - + V - V V - V (-) - - - + + + - - + + V - V - - (+) +

C. cuniculorum + + + - - + - - NA + - NA + (+) - - + (+) - - - V (+) - - +

C. subantarcticus + + + - NA NA NA - - - - NA + + + - + NA (-) (+) NA + - - NA +
w+R,o,9sws0e–ea1tk0al0ly. %p(2o0so0ift9isv)teraa,niNndsADp,eoNbsroiytidnvaeet;ae(ta+av)l,a.i7(l25a0b–1l8e09.)D%. aotaf fsotrrarienfsepreonsciteivsep;eVci,e2s6w–e7r4e%takoefnsftrraoimnsFpoosstietriveet;a(l–.)(,21010–42),5L%awosfosntreatinasl.p(o2s0i0ti1v)e,;L–o,g0a–n10et%al.o(f2s0tr0a0i)nsOpnoestitaivl.e(.1996),

204 บทท่ี 5 การวนิ จิ ฉยั แบคทเี รยี ก่อโรคกล่มตา่ งๆและเชอื้ ราท่ีพบบอ่ ย

เอกสารอ้างอิง
1. Debruyne L, Broman T, BergstrÖm S, Olsen B, On SL, Vandamme P. Campylobacter subantarcticus
sp. nov., isolated from birds in the sub-Antarctic region. Int J Syst Evol Microbiol. 2010;60:815-9.
2. Foster G, Holmes B, Steigerwalt AG, Lawson PA, Thorne P, Bryer DE, Ross HM, Xerry J,Thompson
PM, Collins MD. Campylobacter insulaenigrae sp. nov., isolated from marine mammals. Int J Syst
Evol Microbiol. 2004;54:2369-73.
3. Holmes B, Pickett J, Holis DG. Pasteurella, In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC,
Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 7th ed. Washington, DC: ASM Press;
1999. p. 632-7.
4. Lawson AJ, On SL, Logan JM, Stanley J. Campylobacter hominis sp. nov., isolated from the
human gastrointestinal tract. Int J Syst Evol Microbiol. 2001;51:651-60.
5. Leelaporn A, Yongyod S, Limsrivanichakorn , Yungyuen T, Kiratisin P. Francisella novicida
bacteremia, Thailand. Emerg Infect Dis. 2008; 14:1935-7.
6. Logan JM, Burnens A, Linton D, Lawson AJ, Stanley J. Campylobacter lanienae sp. nov., a new
species isolated from workers in an abattoir. Int J Syst Evol Microbiol. 2000;2:865-72.
7. Maggi RG, Kempf VAJ, Chomel BB, Breitschwerdt EB. Bartonella. In: Versalovic J, Carroll
KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology
10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 786-98.
8. On SL. Identification method for campylobacters, helicobacters and related organisms. Clin
Microbiol Rev. 1996;9:405-22.
9. Petersen JM, Schriefer ME, Araj GF. 2011. Francisella and Brucella. In: Versalovic J, Carroll
KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML,Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology
10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 751-69.
10. Rossi M, Debruyne, Zanoni RG, Manfreda G, Revez J, Vandamme P. Campylobacter avium sp.
nov., a hippurate-positive species isolated from poultry. Int J Syst Evol Microbiol. 2009;59:2364-9.
11. Zanoni RG, Debruyne L, Rossi M, Revez J, Vandamme P. Campylobacter cuniculorum sp. nov.,
from rabbits. Int J Syst Evol Microbiol. 2009;59:1666-71.
12. Zbinden R, Graevenitz AV. Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella,
and other fastidious or rarely encountered gram-negative rods. In: Versalovic J, Carroll KC,
Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology
10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 574-87.

ค่มู อื การปฏิบตั งิ านแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5
การวนิ ิจฉัยแบคทีเรยี กอ่ โรคกลุ่มตา่ งๆและเชือ้ ราท่พี บบ่อย

5.9 การวินจิ ฉยั เชือ้ กลมุ่ Anaerobic Bacteria

ปิยะดา หวังรงุ่ ทรัพย์

หลักการ 5บทที่
การตดิ เชอื้ anaerobic bacteria สว่ นใหญเ่ กดิ จากเชอื้ ประจำ� ถน่ิ ของรา่ งกาย ดงั นน้ั ตำ� แหนง่ การตดิ เชอื้ จงึ
อยู่ใกลก้ ับต�ำแหนง่ ท่ีมีเช้ือ anaerobe เปน็ เชื้อประจำ� ถ่นิ เช่น การตดิ เชือ้ ในลำ� ไส้ ชอ่ งท้อง อุ้งเชงิ กราน เปน็ ตน้
การก่อโรคมกั เกิดจาก aerobic bacteria และตามด้วย anaerobic bacteria จึงพบวา่ การตดิ เช้อื anaerobe มีเชอื้ กอ่
โรคหลายชนิด การตดิ เชอ้ื anaerobic bacteria ทเ่ี กิดจากเชือ้ นอกร่างกายกพ็ บได้เชน่ กนั เชน่ บาดทะยกั อาหาร
เป็นพิษจากเชอื้ Clostridium botulinum แผลตดิ เชื้อ (gas gangrene) จากเชือ้ C. perfringens เป็นต้น

ขอบเขต
การเพาะแยกเชื้อจากตัวอย่างผู้ป่วย เพื่อตรวจหาเชื้อ anaerobic bacteria ที่เป็นสาเหตุของโรค
ตลอดจนการตรวจสอบลกั ษณะตวั เชอ้ื ดว้ ยวธิ กี ารยอ้ มแกรมและการตรวจสอบลกั ษณะโคโลนเี พอื่ จำ� แนกชนดิ
ของเชอื้ anaerobic bacteria เบอ้ื งต้น

การเก็บตวั อยา่ งและการน�ำส่งตวั อยา่ งตรวจวนิ ิจฉัย anaerobic bacteria

1. การเลือกและเก็บส่ิงตรวจ การเลอื กสิ่งตรวจเพื่อตรวจวนิ ิจฉยั anaerobic bacteria นอกจากดูประวตั ิ
ผูป้ ว่ ย ผลการตรวจของแพทยห์ รอื ขอ้ มลู ทางห้องปฏิบัตกิ ารอ่ืนๆแล้ว ตอ้ งคำ� นึงถงึ เวลาทเ่ี หมาะสมในการเก็บ
วัตถุตัวอยา่ ง เกบ็ ตวั อย่างในบรเิ วณท่ีมกี ารติดเชือ้ โดยหลีกเลี่ยงการปนเป้อื นของเชือ้ ประจำ� ถน่ิ (normal flora)
บริเวณใกล้เคียงและจากสง่ิ แวดล้อมภายนอก
2. ส่งิ ตรวจทเี่ หมาะสมส�ำหรบั การตรวจหาเช้ือ anaerobic bacteria
2.1 หนองจากแผลลกึ หนองจากอวยั วะภายใน เช่น สมอง ปอด ตบั ช่องท้อง เป็นตน้
2.2 สารน�้ำในร่างกายท่ีได้มาจากการเจาะดูด (aspirate) จากต�ำแหน่งท่ีอยู่โดยตรง เช่น เลือด
น้�ำในช่องท้อง (peritoneal fluid) น้�ำในช่องเย่ือหุ้มปอด (pleural fluid) น�้ำจากข้อ
(synovial fluid) นำ�้ คร�่ำ (amniotic fluid) นำ้� ดี (bile) เปน็ ตน้
2.3 เนือ้ เยอื่ จากการเกบ็ ชิน้ เน้อื (biopsy)
2.4 สงิ่ ตรวจท่ีเก็บโดยวธิ ีพิเศษเช่นการเจาะผ่านหลอดคอ การเจาะดูดจากกระเพาะปสั สาวะ

206 บทท่ี 5 การวินิจฉัยแบคทเี รียก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเชือ้ ราทพ่ี บบอ่ ย

3. สิ่งตรวจทไี่ มเ่ หมาะสมสำ� หรบั การตรวจหาเชือ้ anaerobic bacteria
3.1 เสมหะ
3.2 swab ทีป่ ้ายจากในคอและในจมูก
3.3 อจุ จาระ และ rectal swab
3.4 ปสั สาวะจากการขบั ถ่ายหรอื การสวนปัสสาวะ (catheterized urine)
3.5 swab ทปี่ า้ ยจากปากมดลูกหรือบริเวณชอ่ งคลอด (cervical swab)
3.6 สงิ่ ตรวจท่ปี นเป้ือนเช้อื ประจำ� ถน่ิ (normal flora)
3.7 swab หนองจากปากแผลหรือแผลตื้น
4. การเกบ็ สงิ่ ตรวจและการนำ� สง่ หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารนอกจากการเลอื กสง่ิ ตรวจทเี่ หมาะสมสง่ ตรวจวนิ จิ ฉยั
anaerobic bacteria แลว้ ปัจจัยอน่ื ท่มี ผี ลต่อเชอ้ื ในสงิ่ ตรวจซงึ่ ควรกระท�ำใหเ้ หมาะสม ไดแ้ ก่ ปรมิ าณตวั อยา่ งท่ี
เพยี งพอ ขนาดและความสะอาดของภาชนะทใ่ี ชใ้ สต่ วั อยา่ ง ความชนื้ ปรมิ าณออกซเิ จน (Eh) อณุ หภมู ใิ นระหวา่ ง
การน�ำสง่ ระยะเวลาหลงั การเกบ็ ตวั อย่างจนสง่ ถึงห้องปฏิบัตกิ าร transport medium ท่ใี ชใ้ นการน�ำสง่ สารทมี่ ี
ผลยับย้ังการเจรญิ ของเชอ้ื สาร anticoagulant และการปนเปอ้ื นของสารต้านจุลชีพในตวั อย่าง
สิ่งตรวจท่ีเก็บมาแล้วควรน�ำส่งห้องปฏิบัติการทันที เพ่ือด�ำเนินการตรวจเพาะเช้ือโดยเร็วที่สุด
ท่ีอุณหภูมิห้อง ไม่ควรใส่ตู้เย็นหรือแช่น้�ำแข็งเพราะความเย็นมีผลต่อการเจริญของ anaerobic bacteria
บางชนิด
4.1 การเกบ็ สง่ิ ตรวจทเี่ ปน็ ของเหลว ใชเ้ ขม็ และกระบอกฉดี ยาเกบ็ ตวั อยา่ งแลว้ ไลอ่ ากาศในกระบอก
ฉดี ยาออกให้หมด ฉดี ตัวอย่างลงในขวดปราศจากเช้ือท่ีบรรจแุ ก๊ส CO2 หรอื แกส๊ ผสมและ indicator ท่ใี ช้บง่ ชี้
O2 ในขวด (ภาพท่ี 5.9-1) กรณีไม่มีขวดบรรจแุ ก๊ส CO2 เมอื่ ไล่อากาศออกจากกระบอกฉีดยาแล้วให้ปักเข็มลง
บนจุกยางท่ีปราศจากเชื้อและน�ำใส่หลอดทดลอง หรืออาจใช้วิธีเก็บตัวอย่างบรรจุลงหลอดทดลองหรือขวด
ขนาดเลก็ ทปี่ ราศจากเช้ือใหเ้ ต็มพอดีเพื่อแทนทีอ่ ากาศทง้ั หมด

ภาพที่ 5.9-1 Rubber-stoppered collection vial containing an agar indicator system

คูม่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรยี และรา

บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทเี รียก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเช้ือราทพ่ี บบอ่ ย 207

4.2 การเก็บสิ่งตรวจท่ีเป็นเน้ือเย่ือ เนื้อเย่ือเป็นส่ิงตรวจที่เหมาะสมเพราะเช้ือจะสามารถอยู่
ในเน้ือเยื่อได้นานหลายช่ัวโมง เก็บเนื้อเย่ือในหลอดทดลองปราศจากเชื้อที่บรรจุน้�ำเกลือปริมาณเล็กน้อย
เพ่ือรักษาความชื้น และน�ำสง่ ตรวจในสภาวะไรอ้ ากาศโดยบรรจุในถุง anaerobic pouch ใส่ anaerobic GasPak
(GasPak pouch) (ภาพที่ 5.9-2)

ภาพที่ 5.9.2 Anaerobic transport system ส�ำหรับสงิ่ ตรวจทเ่ี ปน็ เน้ือเยื่อ 5บทท่ี

4.3 การเก็บสิ่งตรวจท่ีเป็น swab ตัวอย่าง swab เป็นวัตถุตัวอย่างที่ไม่เหมาะสม เนื่องจากสัมผัส
อากาศมาก ได้ส่ิงตรวจน้อย มีการปนเปื้อนเช้ืออ่ืนได้ง่าย แห้งง่าย อาจมีเช้ือตกค้างในใยส�ำลี ส�ำลีบางชนิด
มีสารยับยั้งการเจริญของเช้ือ หากมีความจ�ำเป็นควรเก็บตัวอย่าง swab ใน anaerobic transport system
ซึ่งมี soft agar ทเ่ี ติม reducing agent (รปู ที่ 5.9-3)

ภาพท่ี 5.9-3 Anaerobic transport system สำ� หรบั ตัวอยา่ ง swab

คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทเี รียและรา

208 บทท่ี 5 การวินิจฉยั แบคทีเรยี ก่อโรคกล่มตา่ งๆและเชือ้ ราท่พี บบอ่ ย

4.4 ตัวอย่างเชอ้ื บริสทุ ธิ์ เชอ้ื แบคทเี รียทสี่ งสัยเป็น anaerobic bacteria ต้องการสง่ ตรวจยืนยันชนดิ
ของเช้ือ ให้น�ำสง่ ตัวอย่างเช้อื ในสภาวะไร้อากาศ โดยเพาะเลีย้ งเชอื้ ใน enrichment media เช่น BA, cooked meat
medium, enriched thioglycolate medium บรรจใุ น GasPak pouch น�ำสง่ ห้องปฏิบตั ิการอา้ งอิง
วิธปี ฏบิ ัตงิ าน
1. เม่ือสิ่งตรวจถึงห้องปฏิบัติการ เจ้าหน้าท่ีท�ำการตรวจสอบสภาพของตัวอย่างก่อนรับ และ
ด�ำเนินการตรวจวินิจฉัยทันที (แผนภูมิท่ี 5.9-1) ถ้ายังไม่สามารถท�ำได้ในขณะนั้นให้น�ำตัวอย่างเก็บที่
อุณหภมู ิหอ้ ง
2. สงั เกตลกั ษณะของตวั อย่างด้วยตาเปลา่ (macroscopic examination) โดยสงิ่ ตรวจจากผู้ป่วยตดิ เช้ือ
anaerobic bacteria มีลักษณะเด่นชัด เช่น มีกลิ่นเหม็น มีแก๊สเกิดขึ้นมาก มีสีด�ำคล�้ำ มีสีแดงอิฐ (brick-red
fluorescene) เมอ่ื ดภู ายใตแ้ สง ultraviolet เนือ่ งจากมี Porphyromonas spp. และ/หรอื Prevotella spp. มกี ้อน
สีขาวหรือเหลอื งในสิง่ ตรวจ (sulfur granules) ถ้าเปน็ การติดเช้ือ Actinomyces isaraelii
3. นำ� ตวั อย่างมาเพาะบนอาหารเลี้ยงเช้อื ต่อไปน้ี (primary plate) คือ Ana BA, BBE, EY, BA และ CA,
liquid enrichment media เชน่ enriched thioglycolate broth หรอื cooked meat medium และนำ� ไปอบที่ 35-37 OC
ในภาวะทีเ่ หมาะสม คือ Ana BA, BBE และ EY อบในภาวะไร้อากาศ ส�ำหรบั CA อบเชื้อในสภาวะ 5-10% CO2
อาหารท่เี หลืออบในต้อู บธรรมดา ดงั แผนภูมทิ ่ี 5.9-1

ค่มู อื การปฏิบตั ิงานแบคทเี รียและรา

บทท่ี 5 การวินิจฉยั แบคทีเรียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเช้ือราทพี่ บบอ่ ย 209

แผนภูมทิ ่ี 5.9-1 วธิ ีดำ� เนินการตรวจวนิ ิจฉยั anaerobic bacteria เบอ้ื งต้น

5บทที่

คู่มอื การปฏิบตั งิ านแบคทเี รียและรา

210 บทท่ี 5 การวนิ ิจฉัยแบคทีเรียก่อโรคกล่มต่างๆและเชือ้ ราทพี่ บบอ่ ย

4 การเตรียมสิ่งตรวจและเพาะเช้ือจากสงิ่ ตรวจ (inoculate) บนอาหารเลี้ยงเชื้อ หากดำ� เนนิ การบนโตะ๊
ปฏบิ ัติการปกติ กระบวนการทงั้ หมดควรเสร็จส้ินภายใน 15-20 นาที เพือ่ ให้ตวั อย่างสัมผัสกับอากาศนอ้ ยทส่ี ดุ
4.1 สิ่งตรวจท่ีเป็นของเหลว เช่น หนองจากแผลลึก สารน้�ำในร่างกาย ให้ผสมส่ิงตรวจโดยใช้
capillary pipette ดูดข้ึนดูดลงเบาๆ ไม่ให้เกิดฟองอากาศ จนแน่ใจว่ามีการกระจายตัวของเช้ือ
ท่ัวทั้งหลอด แล้วจึงดูดวัตถุตัวอย่างมา หยดบนอาหารเล้ียงเช้ือชนิดแข็ง จานละ 1-2 หยด
และหยดใสใ่ นอาหารเหลว (liquid enrichment media) ใกล้กับก้นหลอด 1-2 หยด หยดลงบน
สไลด์สำ� หรับย้อมแกรม 1 หยด smear สไลด์ และ streak plate
4.2 ส่ิงตรวจท่ีเป็นเนื้อเยื่อ เน้ือเย่ือหรือตัวอย่างท่ีค่อนข้างแข็ง ให้ใช้กรรไกรปราศจากเช้ือตัด
ส่งิ ตรวจใส่ liquid enrichment media ประมาณ 1 ml บดใหเ้ ข้ากันดดี ้วย tissue grinder หรอื
ผสมให้เข้ากันดีกับ liquid media จะได้เป็นวัตถุตัวอย่างเหลว เพาะเช้ือบนอาหารเล้ียงเชื้อ
โดยปฏบิ ตั เิ ช่นเดียวกบั ขอ้ 4.1
4.3 สิ่งตรวจท่ีเป็น swab หากมี swab 2 อัน ให้ใช้อันแรกป้ายในอาหารแข็ง โดยหมุนไปรอบๆ
ใหท้ ่วั ประมาณ 1 ใน 4 ของ plate อีกอันหนึง่ ใส่ลงในอาหารเหลว ถ้ามี swab เพียงอันเดียว
ให้ใส่ในอาหารเหลวปริมาตร 0.5-1 ml บิดไปมาแล้วใช้ส่วนน้ีเพาะเช้ือบนอาหารแข็งและ
อาหารเหลว ส่ิงตรวจท่เี ปน็ swab ไมเ่ หมาะทจ่ี ะย้อมแกรม
4.4 ในกรณตี วั อย่างท่ตี ้องการตรวจหาเช้ือ Clostridium spp. เชน่ ตัวอย่างอจุ จาระหรือตวั อยา่ งจาก
ส่งิ แวดลอ้ ม ควรใช้วิธี alcohol shock โดยน�ำตัวอยา่ งผสมกบั absolute ethanol ในอตั ราสว่ น
1:1 ตั้งไว้ท่ีอุณหภูมิห้องนาน 30 นาที จึงน�ำตัวอย่างถ่ายลงบนอาหารเล้ียงเชื้อ หรือวิธี heat
shock กใ็ ช้ไดด้ เี ชน่ กัน โดยน�ำตวั อยา่ งแชใ่ นอา่ งน�ำ้ ร้อนท่ีอณุ หภูมิ 70-80 OC นาน 10-15 นาที
ก่อนถ่ายตวั อยา่ งลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ
4.5 ย้อมสีแกรมจากส่ิงตรวจ (microscopic examination) ตรวจดูผลด้วยกล้องจุลทรรศน์ก�ำลัง
ขยาย 10X10 เพื่อดูลักษณะท่ัวไปก่อนจึงดูด้วยก�ำลังขยาย 10X100 โดยสังเกตลักษณะ
การติดสีของเช้ือ ขนาด รูปร่าง และจ�ำนวนของเช้ือแต่ละชนิดในสิ่งตรวจ รวมทั้ง
การสร้างสปอรท์ ่ีมีรปู ไขห่ รอื รปู กลม และต�ำแหนง่ ของสปอร์ เช่น กลางเซลล์ (central spore)
ปลายเซลล์ (terminal spore) หรือระหว่างกลางกับปลายเซลล์ (subterminal spore) เป็นต้น
ข้อมูลท่ีได้จากการย้อมแกรมมีความส�ำคัญอย่างมาก เป็นข้อมูลเบ้ืองต้นท่ีแพทย์สามารถ
น�ำไปใช้ประกอบการรักษาผู้ป่วยได้ และช่วยในการตัดสินใจเลือกใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ
ทเ่ี หมาะสม (แผนภูมิที่ 5.9-2)

คมู่ ือการปฏิบตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทที่ 5 การวินจิ ฉัยแบคทีเรียกอ่ โรคกลม่ ต่างๆและเชอ้ื ราทพ่ี บบอ่ ย 211

แผนภมู ทิ ี่ 5.9-2 แสดงการแบง่ กลมุ่ ของ anaerobic bacteria

5บทท่ี

4.6 น�ำอาหารเล้ียงเชื้อ Ana BA, BBE, EY และ liquid enrichment media ที่ท�ำการ inoculate
เรียบร้อยแล้ว อบเช้ือใน anaerobic jar ที่อุณหภูมิ 35 ± 2 OC นาน 48 ชม. ไม่ควรเปิด
anaerobic jar ก่อน 48 ชม. เพราะจะท�ำให้เชื้อที่ก�ำลังเจริญและเปล่ียนแปลงลักษณะโคโลนี
สัมผัสโดนอากาศและตายได้ เนื่องจาก anaerobic bacteria ส่วนใหญ่ไวต่อ O2 ในระหว่าง
ช่วง logarithmic phase ของการเจริญ หากอบเชื้อใน anaerobic chamber หรือ anaerobic
pouches สามารถตรวจสอบการเจริญของเชื้อได้หลังอบ 24 ชม. โดยไม่สัมผัสกับ O2
โดยเฉพาะโคโลนีของ Bacteroides fragilis group บน BBE หรือโคโลนีของ Clostridium
perfringens บน EY
4.7 อาหารเลย้ี งเชอ้ื BA ที่ inoculate เรยี บร้อยแลว้ อบเชื้อในสภาวะอากาศปกติ (ambient air) ที่
อุณหภูมิ 35 ± 2 OC นาน 24 ชม.
4.8 CA ท่ี inoculate เรียบร้อยแล้ว อบเชื้อในสภาวะ 5-10% CO2 (candle jar) หรือตู้อบ CO2
ทีอ่ ณุ หภูมิ 35±2 OC นาน 48 ชม.
4.9 อ่านผลการเจริญของเชื้อบน BA หลังจากอบเช้ือในสภาวะอากาศปกติครบ 24 ชม.
โดยสังเกตลักษณะของโคโลนี คุณสมบัติในการย่อยสลายเม็ดเลือดแดง (hemolysis) และ
ย้อมสีแกรม มี Clostridium หลาย species สามารถเจริญได้ในสภาวะอากาศปกติ แต่
ไม่สร้างสปอร์ เชน่ C. carnis, C. haemolyticum และ C. tertium

คู่มือการปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รียและรา

212 บทที่ 5 การวนิ จิ ฉัยแบคทีเรยี กอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชอ้ื ราทพ่ี บบอ่ ย

4.10 อ่านผลการเจริญของเช้ือบน CA หลังจากบ่มเพาะเช้ือในสภาวะ 5-10 % CO2 เป็นเวลา
48-72 ชม. สงั เกตลักษณะโคโลนีและย้อมสีแกรม
4.11 ตรวจสอบผลการเจริญของเช้ือบน Ana BA, BBE และ EY หลังจากอบเช้ือในสภาวะ
ไร้อากาศ เป็นเวลา 48-72 ชม. โดยใช้ stereoscopic microscope หรอื hand lens (X8) ชว่ ยใน
การดูลักษณะโคโลนีที่มีขนาดเล็ก อ่านลักษณะโคโลนีของเช้ือที่พบท้ังหมด ปริมาณของเชื้อ
แต่ละลกั ษณะโคโลนี โดยบันทึกรายละเอยี ดของโคโลนีคอื ขนาด รูปรา่ ง (circular, irregular,
molar-tooth, breadcrumb) ขอบ (entire, rhizoid, undulate) รปู ดา้ นขา้ ง (convex, umbonate,
pitting) ความทึบแสง (transparent, translucent, opaque) สี และอื่นๆ เช่น fluorescence,
hemolysis เปน็ ต้น
4.12 เลือกโคโลนีเดี่ยวของเช้ือทุกลักษณะที่พบบน Ana BA (primary plate) มา subculture
ใหไ้ ดเ้ ช้อื บริสทุ ธิบ์ น Ana BA (secondary plate) ทดสอบ aerotolerance บน Ana BA และ
ย้อมสแี กรม หากโคโลนีมีขนาดเลก็ ให้ inoculate บน Ana BA อย่างเดียวกอ่ น เมอ่ื เชือ้ เจรญิ
เพ่ิมปรมิ าณแลว้ จงึ ทำ� การทดสอบ aerotolerance และย้อมสแี กรม
4.12.1 การทดสอบ aerotolerance บน Ana BA แบ่ง plate เป็น 4 ช่อง ใช้ subculture
เช้ือได้ 4 ลักษณะโคโลนี อบเชื้อใน 5-10% CO2 ที่อุณหภูมิ 35 ± 2 OC เป็นเวลา
48-72 ชม. เพ่อื ตรวจหาเชื้อท่ตี ้องการ CO2 โดยเฉพาะเชอื้ ทเ่ี จริญชา้ (slow-growing
aerobic organisms) เช้ือเจริญยาก (fastidious), facultative หรือ microaerobic
species ซ่ึงไม่เจรญิ เพียงล�ำพงั บน BA เช่น Haemophilus spp. และควรค�ำนึงเสมอวา่
มีเช้ือ aerotolerant anaerobic bacteria แกรมบวก nonsporeforming rods หลายชนดิ
สามารถเจริญในภาวะ CO2 และอาจเจริญได้น้อยๆในภาวะอากาศปกติ
เช่น Actinomyces spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp. และ
Lactobacillus spp.
4.12.2 การย้อมแกรม น�ำ pure colony smear บนสไลด์และย้อมแกรม บันทึกลักษณะ
รูปรา่ ง, การติดสขี องเซลล์ รปู รา่ งและตำ� แหนง่ ของสปอร์
4.13 เลือกโคโลนีที่เจริญบน BBE มีขนาด >1 mm สังเกตปฏิกิริยา esculin hydrolysis (สีด�ำ =
บวก) นำ� เชอื้ แต่ละลกั ษณะโคโลนีไปทดสอบเอนไซม์ catalase โดยเข่ยี เช้ือลงบน glass slide
หยด 15% hydrogen dioxide (15% H2O2) ลงบนเช้อื ทดสอบ ถา้ มฟี องอากาศเกดิ ขนึ้ แสดงวา่
ให้ผลบวก ถ้าไม่เกิดฟองอากาศแสดงว่าให้ผลลบ และ subculture บน Ana BA ทดสอบ
aerotolerance ยอ้ มสีแกรม โดยกระทำ� เช่นเดยี วกับเชื้อท่ีแยกไดบ้ น Ana BA (primary plate)
ในข้อ 4.12

คู่มอื การปฏิบัติงานแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 5 การวินจิ ฉยั แบคทเี รยี กอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชื้อราทพี่ บบอ่ ย 213

4.14 อ่านผลการสร้างเอนไซม์ lipase และ lecithinase ของเชื้อทุกลักษณะโคโลนี บน EY ถ้า 5บทท่ี
เช้ือเจริญแล้วมีผิวหน้าโคโลนีเป็นสีรุ้งมันวาว แสดงว่ามีการสร้าง enzyme lipase (ให้ผล
lipase บวก) ถ้าเชื้อเจริญแล้วให้โซนสีขาวขุ่นรอบโคโลนี แสดงว่ามีการสร้าง enzyme
lecithinase (ให้ผล lecithinase เป็นบวก) subculture เช้ือทุกลักษณะท่ีพบลงบน Ana BA
อบเช้อื ในสภาวะไรอ้ ากาศ ที่ 35 ± 2 OC นาน 48 ชม. EY จะช่วยแยกเชื้อท่ี swarm ออกเปน็
โคโลนีเด่ียว ทำ� ให้แยกโคโลนีไดง้ ่ายข้ึน
4.15 เปรยี บเทยี บลักษณะโคโลนีบน Ana BA ที่ subculture จาก EY ท่เี ป็น primary plate กับเชอ้ื ท่ี
แยกไดจ้ าก Ana BA ท่ีเปน็ primary plate เลอื กโคโลนที ีแ่ ตกตา่ งกันไปทดสอบ aerotolerance
และย้อมแกรมต่อไป
4.16 อบ primary plates ซ้ำ� เพือ่ ทำ� การตรวจสอบในภายหลัง
4.16.1 Ana BA อบเชื้อในสภาวะไร้อากาศ 5-7 วัน โดยตรวจสอบผลทุก 48 ชม.
น�ำลักษณะโคโลนีใหมๆ่ ที่พบ มาแยกเชอ้ื ให้บริสุทธิ์และทดสอบ aerotolerance
4.16.2 Pigmented Prevotella spp., Porphyromonas spp. และ Actinomyces spp. โดยปกติ
จะมองเห็นหลังจากบ่มในสภาวะไร้อากาศ 2-3 วัน ตรวจสอบ fluorescent และ
pigmented organisms บน Ana BA ใช้ stereoscopic microscope ตรวจสอบ
ลกั ษณะโคโลน ี “molar tooth” ของ Actinomyces isaraelii
4.16.3 ท้ิง BBE plates หลังจากอบ 2-3 วัน เน่ืองจากอาหารเลี้ยงเช้ือชนิดนี้จะสูญเสีย
คุณสมบัติความ selective เพราะการระเหยและการเสอื่ มของยาปฏชิ ีวนะ
4.17 Liquid enrichment media
4.17.1 กรณเี ชอื้ เจรญิ บน Ana BA primary plate บม่ liquid enrichment media ท่ี 35 ± 2 OC
ในสภาวะไร้อากาศ นาน 7 วัน แล้วน�ำมาย้อมแกรม ดูว่ามีเชื้อที่ยังแยกไม่ได้ บน
plates จึงนำ� มา subculture แยกเชือ้ ให้บรสิ ุทธ์ติ ่อไป
4.17.2 กรณเี ช้ือไมเ่ จริญบน Ana BA primary plate
4.17.2.1 ตรวจสอบการเจริญของ broth culture ทุกวัน
4.17.2.2 ย้อมแกรม และ subculture ลงบน Ana BA และ CA เมื่อ broth ขุ่น
หรือเมอ่ื อบท่ี 35 ± 2 OC ในสภาวะไร้อากาศ ครบ 7 วนั
4.17.2.3 อบ broth culture ทีไ่ ม่พบการเจรญิ ของเช้ือจนครบ 14 วนั ตรวจสอบผล
การเจริญดว้ ยตาเปลา่ แล้วจงึ ทิง้

คมู่ อื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

214 บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทเี รียก่อโรคกลม่ ตา่ งๆและเชอ้ื ราทพ่ี บบ่อย

คณุ สมบัตเิ ฉพาะที่เปน็ ประโยชนใ์ นการตรวจวนิ จิ ฉัยเชอื้ เบื้องตน้ (presumptive identification)

1. ลกั ษณะเซลลข์ องเชอื้ ทตี่ รวจดไู ดจ้ ากกลอ้ งจลุ ทรรศน ์ ไดแ้ กร่ ปู รา่ ง ขนาด การเรยี งตวั การสรา้ งสปอร์
การติดสีแกรม
2. ลักษณะของเช้ือท่ีเจริญบนอาหารแข็ง ได้แก่ ลักษณะโคโลนี การย่อยสลายเม็ดเลือดแดง การดูด
กลนื แสง fluorescence และการสรา้ งเมด็ สี (pigment)
3. คณุ สมบัติในการสรา้ งเอนไซม์ lecithinase, lipase และ catalase
4. ความยากงา่ ยในการเจรญิ เติบโตในอาหารเหลว
5. ความทนทานต่อออกซเิ จน
6. ความสามารถในการเจรญิ ในอาหารเลย้ี งเชอื้ ทม่ี ี 20% bile

ตารางท่ี 5.9-1 การอา่ นผล anaerobic bacteria

ชนิดของแบคทเี รยี ลักษณะเมอ่ื ยอ้ มแกรม ลกั ษณะโคโลนี
Anaerobic แกรมลบ rods
Prevotella melaninogenica Coccobacilli กลม ผวิ โค้งขึ้นเล็กน้อย ขอบเรียบ
Bacteroides fragilis group ตรงกลางสนี ำ�้ ตาลดำ� ขอบสนี �้ำตาล
Fusobacterium mortiferum อ่อน สีย่ิงเข้มข้นึ เม่อื อบไวน้ านขึน้
Fusobacterium necrophorum
Pleomorphic rods ปลายเซลลม์ น กลม ผิวโคง้ ขึ้นเล็กน้อย ขอบเรียบ
Fusobacterium nucleatum ตดิ สีซีด อยเู่ ปน็ เซลลเ์ ดย่ี วหรอื คู่ สีขนุ่ มวั หรอื ขาว ดื้อ penicillin
มกั พบเหน็ vacuoles ภายในเซลล์ เจริญไดด้ ีในอาหารท่ีมนี ้ำ� ดี 20%
Peptococcus niger
สซี ดี ติดสีไม่สม�่ำเสมอ กลม ขอบโคโลนีมเี สน้ ใย ผิวโคง้ ข้นึ
pleomorphic rods เซลลบ์ วม เลก็ นอ้ ย หรือเป็นรอยนูน ตรงกลาง
หวั ทา้ ยแหลมเรียงตอ่ กนั เป็นเสน้ โคโลนอี ่อนนุ่ม non-hemolytic

Pleomorphic rods ปลายเซลล์มน กลม ขอบโคโลนหี ยกั ปลายแหลม
หรอื แบน อาจเรยี งต่อกันเปน็ เส้น ผิวโคง้ ข้ึนเลก็ น้อย หรือเป็นรอยนูน
ตรงกลางหรือเป็นสนั โคโลนี
ใสหรือขนุ่

ติดสซี ีด ผอมยาว คลา้ ยกระสวย กลม ขอบโคโลนไี มส่ ม่�ำเสมอ
ทอผ้า ปลายแหลม อย่เู ป็นเซลล์คู่ ผวิ โค้งข้นึ เล็กนอ้ ย หรือโคง้ ขนึ้ สงู
ลักษณะเหมือนเข็มหรือผลกึ ของ ข่นุ ดา้ นบนมีลาย หรือเหมอื นเศษ
safranin ขนมปงั ช้นิ เลก็ ๆ non-hemolytic

แกรมบวก เซลลก์ ลม อย่เู ปน็ เซลล์ กลม ขอบเรียบ ผิวโคง้ ขน้ึ เลก็ น้อย
เด่ยี ว คู่ สีเ่ ซลล์ หรอื ไมส่ มำ่� เสมอ สีดำ� ผิวเปน็ เงา ขนาดเลก็ มาก

คูม่ อื การปฏิบตั งิ านแบคทเี รียและรา

บทท่ี 5 การวนิ ิจฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชอ้ื ราท่ีพบบ่อย 215

ชนดิ ของแบคทีเรยี ลักษณะเม่อื ย้อมแกรม ลกั ษณะโคโลนี

Anaerobic Cocci

Peptostreptococcus spp. แกรมบวก เซลล์กลม อยู่เป็นคู่ ขอบเรียบ ผวิ โค้งขึน้ เล็กน้อย สเี ทา
และเปน็ เส้นสาย ขาวขุ่น

Veillonella parvula แกรมลบ เซลล์กลม อย่เู ป็นคู่สอง กลม ขอบเรียบ สขี าวเทา
หรอื เป็นสายสัน้ ๆ

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium botulinum แกรมบวก แทง่ กลมตรง อยู่เปน็ กลม โคโลนี อาจไมส่ ม่�ำเสมอ
เซลล์เดยี่ วหรอื คู่ สปอรอ์ ยใู่ ต้ สขี าวเทา ผวิ ด้าน ให้ β-hemolytic
สว่ นปลายเซลล์ (sub-terminal)

Clostridium difficile แกรมบวก แทง่ กลมตรง อาจเรียง กลม ผวิ ด้านหรอื อาจเปน็ เงา แบน 5บทท่ี

ตอ่ กนั เปน็ สายมี 2–6 เซลล ์ สปอร์ หรือโคง้ เลก็ นอ้ ย สคี รีม เหลืองหรือ

รปู ไข่อยู่ใตส้ ว่ นปลายเซลล์ (oval เทา แตกเปน็ แขนงคลา้ ยราก มีกลิ่น

sub-terminal) คล้ายคอกม้า (horse stable odor)

Clostridium perfringens แกรมบวก แทง่ ตรงปลายตดั กลม เปน็ เงา สเี ทาหรอื เทาเหลือง
(box car appearance) มักพบ ให้ double zone β hemolysis
แกรมลบ ปนอย่ดู ้วยอยูเ่ ปน็ บางครั้งพบโคโลนหี ยาบ
เซลล์เดี่ยวหรอื คู่ ไมพ่ บสปอร์ เปน็ เสน้ ฝอย lecithinase positive
ในอาหารเล้ียงเชื้อและส่งิ ตรวจ

Clostridium sordellii แกรมบวก แท่งตรง เซลลเ์ ดีย่ ว สีเทาขาว ขนาดใหญ่ ขอบหยกั
หรือคู่ สปอร์รปู ไข่อยู่ใต้ส่วน ให้ผล indole, lecithinase และ
ปลายเซลล์ พบ free สปอร์ urease บวก
จ�ำนวนมาก อยู่เปน็ สาย

Clostridium ramosum อาจติดสี แกรมบวก หรอื แกรมลบ กลม หรือ โคโลนีอาจไม่สมำ่� เสมอ
แทง่ กลมตรง อยเู่ ป็นเซลลเ์ ดย่ี วหรือ โคง้ นูนเล็กน้อย สขี าวเทา บางที
คู่ มสี ปอรก์ ลมอย่สู ว่ นปลายเซลล์ โคโลนหี ยักปลายแหลม

mannitol บวก ไมเ่ คลอื่ นไหว

คู่มอื การปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

216 บทที่ 5 การวินจิ ฉยั แบคทีเรยี ก่อโรคกล่มต่างๆและเชอ้ื ราที่พบบอ่ ย

ชนดิ ของแบคทเี รยี ลกั ษณะเมอ่ื ยอ้ มแกรม ลักษณะโคโลนี

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium septicum แกรมบวก แตถ่ ้าอายุมากอาจตดิ สี กลม หรือยกขึ้นเลก็ น้อย แผ่โคโลนี

แกรมลบ แท่งกลมตรง หรือโค้ง อาจไม่สม�ำ่ เสมอ บางทโี คโลนแี ตก

อย่เู ป็นเซลลเ์ ดย่ี วหรือคู่ สปอร์รูปไข่ แขนงคลา้ ยราก สเี ทา ลกั ษณะ

อยู่ใต้ส่วนปลายเซลล์ โคโลนีคลา้ ย Medusa heads

Clostridium tetani แกรมบวก แตถ่ า้ อายมุ ากเกนิ แผแ่ บนผวิ ดา้ น โคโลนอี าจไม่

24 ชม.จะติดสแี กรมลบอยเู่ ป็น สมำ�่ เสมอ บางทีโคโลนแี ตกแขนง

เซลลเ์ ด่ยี วหรือคู่ สปอร์รปู กลม คลา้ ยราก สเี ทา ให้ β-hemolysis

อยูส่ ว่ นปลาย คล้ายไมต้ กี ลอง zone แคบ ๆ

หรือไมเ้ ทนนสิ

การรายงานผล

กรณพี บ anaerobic bacteria ให้รายงานวา่
“พบ anaerobic bacteria มีคุณสมบัติการติดสีแกรมบวก/ลบ รูปร่างลักษณะของเซลล์
และลักษณะของโคโลน”ี
กรณไี มพ่ บแบคทเี รยี ใหร้ ายงานวา่
“ไมพ่ บเชอื้ anaerobic bacteria”

เอกสารอา้ งอิง

1. Dowell VR Jr, Hawkins TM. Laboratory methods in anaerobic bacteriology. In: CDC
Laboratory Manual. US Dept of HEW, PHS, Center for Disease Control, Atlanta, Georgia.
DHEW Publication No (CDC); 1990. p. 87-8272.
2. Holdeman LV, Cato EP, and Moore WEC Editors. Anaerobe laboratory manual. 4thed.
Blacksburg, Virginia : Virginia Polytechnic Institute and State University; 1977. p. 1-156.
3. ศิริพรรณ วงศ์วานิช. การตรวจวินิจฉัยเชื้อบักเตรีไร้อากาศในห้องปฏิบัติการ. กรุงเทพมหานครฯ:
Text and Journal Publication; 2538. หนา้ 1-52.

คู่มือการปฏบิ ตั งิ านแบคทีเรียและรา

บทท่ี 5
การวนิ ิจฉัยแบคทเี รยี ก่อโรคกลมุ่ ต่างๆและเช้อื ราท่พี บบ่อย
5.10 การวนิ ิจฉัยเชื้อวณั โรคและเชื้อมยั โคแบคทีเรยี อน่ื ๆ

สมศกั ด์ิ เหรียญทอง

เช้ือวัณโรคและเชื้อมัยโคแบคทีเรียอ่ืนๆจัดอยู่ใน genus Mycobacterium ซ่ึงมีคุณสมบัติท่ีส�ำคัญ 5บทที่
ร่วมกันคือ acid fastness ที่ท�ำให้แยกความแตกต่างไปจากแบคทีเรียอื่นๆคือ เป็นเชื้อที่ติดสียาก แต่เมื่อติด
สีแล้วก็ล้างออกยากหรือล้างไม่ออกด้วยน้�ำยาที่เป็นกรดหรือกรดผสมแอลกอฮอล์ จึงเรียกว่าเช้ือทนกรด
(acid fast bacilli หรือ AFB) เช้ือวัณโรค (Mycobacterium tuberculosis) ทีเ่ ปน็ สาเหตขุ องวณั โรคปอดในคน
มีลักษณะที่ดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์เม่ือท�ำการย้อมเช้ือด้วยสี carbol fuchsin โดยวิธี Ziehl-Neelsen จะเห็น
ตัวเชื้อติดสีแดง รูปร่างเป็นแท่งเรียวตรงหรือโค้งเล็กน้อย ปลายมน มักอยู่เดี่ยวๆหรือเป็นคู่ และถ้าน�ำส่วน
หน่ึงของโคโลนีบนอาหารเล้ียงเชือ้ มา smear และยอ้ มสีจะเหน็ เชือ้ รวมเกาะกลมุ่ กนั เปน็ มัดเหมอื นฟอ่ นหญ้า
เรียกลักษณะนี้ว่า cord formation ซึ่งเป็นลักษณะที่พบในเช้ือวัณโรคเท่าน้ัน ส่วนเช้ือมัยโคแบคทีเรียอื่นๆที่
ไม่ใชเ่ ชอื้ วณั โรคมชี ื่อเรียกว่า non-tuberculous mycobacteria (NTM) ซง่ึ ลกั ษณะทีด่ ภู ายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศนเ์ ม่อื
ย้อมสี Ziehl-Neelsen จะเห็นตัวเช้ือติดสีแดง แต่รูปร่างจะมีหลายแบบทั้งที่เป็นแท่งสั้นๆ หรือแท่งยาว หรือ
ยาวเปน็ เสน้ สาย
สิ่งตรวจท่ีส�ำคัญส�ำหรับการวินิจฉัยวัณโรคปอดคือเสมหะ แต่การกระจายของเช้ือในเสมหะไม่
สม่�ำเสมอ ดังน้ันการเลือกเข่ียเสมหะป้ายบนกระจกสไลด์จึงส�ำคัญมาก จ�ำเป็นต้องเลือกเข่ียส่วนท่ีน่าจะมีเชื้อ
มากที่สุดมาตรวจคือส่วนที่เป็นก้อนเมือกเหนียว สีขุ่นเข้มคล้ายหนอง การวินิจฉัยว่าผู้ป่วยเป็นวัณโรคน้ัน
ต้องพบเชื้อจากส่ิงตรวจของผู้ป่วย ซึ่งเช้ือมัยโคแบคทีเรียที่พบในเสมหะประมาณ 99% จะเป็นเช้ือวัณโรค
ดงั นั้นการเก็บเสมหะอยา่ งถกู ตอ้ งจงึ มีความส�ำคัญ การตรวจทางห้องปฏิบัตกิ ารทำ� ไดด้ งั นี้
1. การตรวจหาเชือ้ โดยวธิ ีย้อมสแี ละตรวจดดู ้วยกล้องจุลทรรศน์ (direct microscopy)
2. การตรวจหาเช้อื โดยการเพาะเล้ยี งเชือ้

การตรวจหาเชอื้ โดยวิธีย้อมสแี ละตรวจดดู ว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ (direct microscopy)

การตรวจหาเชื้อทนกรด (AFB) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา (light microscope) โดยวิธี direct
smear ในผู้ท่ีมีอาการสงสัยวัณโรคปอดคือการไอเรื้อรังเกิน 2 สัปดาห์ และ/หรือมีภาพเอกซเรย์ปอดผิดปกติ
ซึ่งนอกจากเพ่ือการวินิจฉัยโรคแล้ว ก็เพ่ือตรวจหาผู้ป่วยที่อยู่ในระยะแพร่เชื้อด้วย การตรวจหาเชื้อทนกรด
(AFB) ด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้ยังเป็นวิธีหลักของการควบคุมวัณโรค ซึ่งสถานบริการสาธารณสุขทุกระดับ

218 บทท่ี 5 การวินจิ ฉัยแบคทเี รยี กอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชอื้ ราทพ่ี บบ่อย

ทั้งโรงพยาบาลศูนย์ โรงพยาบาลท่ัวไป รวมถึงโรงพยาบาลชุมชน สามารถให้บริการตรวจเสมหะด้วย
กลอ้ งจุลทรรศนใ์ หก้ ับประชาชนผ้มู ีอาการสงสัยวณั โรคได้ทวั่ ประเทศ

เหตผุ ลการสง่ เสมหะตรวจ
การควบคมุ วณั โรคตามแนวทางขององคก์ ารอนามยั โลกไดก้ ำ� หนดเหตผุ ลหรอื วตั ถปุ ระสงคข์ องการสง่
เสมหะตรวจทางห้องปฏิบตั กิ ารไว ้ 2 ประการคือ
1. เพื่อการวนิ จิ ฉัยโรคและแบง่ ประเภทของคนไข้
2. เพื่อการติดตามผลการรกั ษา
1. เพือ่ การวินิจฉัยโรคและแบง่ ประเภทของคนไข้
โดยกำ� หนดใหใ้ ชก้ บั ผปู้ ว่ ยใหมท่ ย่ี งั ไมข่ นึ้ ทะเบยี นสง่ รกั ษา ตรวจเสมหะ 3 ตวั อยา่ งตดิ ตอ่ กนั ซงึ่ ประกอบ
ด้วย spot sputum และ collection sputum นำ� ผลการตรวจทไ่ี ดม้ าพจิ ารณาดงั น้ี
1.1 ผปู้ ว่ ยใหมเ่ สมหะบวก หมายถงึ ผู้ป่วยท่ีมผี ลการตรวจเสมหะพบเช้อื อย่างน้อย 2 ใน 3 ตวั อยา่ ง
หรือพบเชื้อเพียง 1 ตัวอย่าง แต่มีภาพเอกซเรย์ปอดที่แพทย์วินิจฉัยว่าเป็นวัณโรคและมีอาการ
รนุ แรง
1.2 ผู้ป่วยใหม่เสมหะลบ หมายถึงผู้ป่วยที่มีผลการตรวจเสมหะไม่พบเชื้อทั้ง 3 ตัวอย่าง แต่มีภาพ
เอกซเรยป์ อดทีแ่ พทยว์ ินจิ ฉยั วา่ เปน็ วัณโรค
2. เพ่ือการตดิ ตามผลการรกั ษา
โดยกำ� หนดใหใ้ ชก้ บั ผปู้ ว่ ยทขี่ น้ึ ทะเบยี นรกั ษาแลว้ สง่ เสมหะตรวจซงึ่ จะเปน็ spot sputum หรอื collection
sputum ก็ได้ตามระยะเวลาดงั น้ี คือ
2.1 เม่ือสิ้นสุดระยะ intensive phase หรือส้ินสุดเดือนที่ 2 หรือเดือนที่ 3 เพ่ือดู conversion rate
(อัตราการเปลีย่ นแปลงของเสมหะจากพบเชอื้ เปน็ ไม่พบเชื้อ)
2.2 เมื่อข้ึนเดือนที่ 5 หรือส้ินสุดเดือนท่ี 5 ของการรักษา เพื่อดูว่าการรักษาล้มเหลวหรือไม่ หาก
ตรวจพบเชอื้ แสดงวา่ การรกั ษาลม้ เหลวตอ้ งเปลยี่ นยาใหม่
2.3 เมอ่ื ส้ินสุดการรกั ษาเพ่อื ดวู ่าผปู้ ว่ ยหายหรือไม่ โดยเสมหะจะตอ้ งตรวจไม่พบเชื้อในครั้งน้ี

ชนดิ ของเสมหะและจำ� นวนครง้ั ทีส่ ่งตรวจ
เสมหะท่ีเก็บจากผปู้ ่วยมี 2 ชนิดคอื spot และ collection sputum
spot sputum คือเสมหะท่ีเกบ็ ทันทเี ม่ือผปู้ ่วยมาพบแพทยท์ ี่สถานพยาบาล และ collection sputum คือ
เสมหะที่เก็บหลังต่ืนนอนตอนเช้าก่อนล้างหน้าแปรงฟัน จะเป็นเสมหะท่ีดีในการใช้ตรวจหาเช้ือ เน่ืองจากมี
การสะสมของเชอ้ื ในหลอดลมตลอดทงั้ คนื ผปู้ ว่ ย 1 รายควรเกบ็ เสมหะสง่ ตรวจ 3 ตวั อยา่ งตา่ งวนั กนั และอยา่ ง
น้อยต้องมี collection sputum 1 ตัวอย่างดงั นี้คือ

คมู่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

บทท่ี 5 การวนิ ิจฉัยแบคทเี รียก่อโรคกล่มต่างๆและเช้อื ราทพี่ บบ่อย 219

ตัวอย่างที่ 1 เป็นตวั อยา่ งท่ีใหผ้ ู้ปว่ ยเก็บเสมหะทนั ที (spot sputum) เม่ือมาพบแพทยค์ ร้ังแรก
ตวั อย่างที่ 2 เป็นตัวอยา่ งทผี่ ู้ป่วยเก็บเสมหะตอนเชา้ หลังต่นื นอน (collection sputum)
ตัวอย่างท่ี 3 เป็นตัวอย่างที่ให้ผู้ป่วยเก็บเสมหะทันที (spot sputum) เม่ือน�ำเสมหะตัวอย่างที่ 2 มาส่งหน่วย
ตรวจ

การป้ายเสมหะบนกระจกสไลด์ 5บทท่ี

ใชไ้ มเ้ ข่ียเสมหะสว่ นท่ีเป็นก้อนเมือกเหนียวสีขนุ่ เขม้ ใหต้ ดิ ปลายไม้ขึ้นมา ป้ายลงตรงกลางแผ่นกระจก
สไลด์ท่ีใหม่และสะอาด ละเลงเกล่ียเสมหะให้เป็นแผ่นบางๆสม่�ำเสมอ ไม่บางหรือหนาเกินไปให้ได้ขนาด
ประมาณ 2x3 cm โดยมีรูปแบบเป็นก้นหอยเล็กๆซ้�ำๆต่อเนื่องกัน แล้วทิ้งไว้ให้แห้ง จากน้ันน�ำไปผ่านเปลว
ไฟ 3-4 ครั้ง โดยให้ด้านท่ีละเลงเสมหะอยู่ด้านบนเพื่อตรึงให้เสมหะติดแน่นกับกระจกสไลด์ เพ่ือเวลาย้อมสี
จะได้ไม่หลดุ ออก น�ำสไลด์ท่ตี รงึ แลว้ นไี้ ปย้อมสีตามวธิ ีต่อไปน้ี
- วางเรียงกระจกสไลดบ์ นคานย้อม เว้นระยะห่างกัน 0.5 - 1 cm
- ราดสี 1% carbol fuchsin ใหท้ ว่ มแผน่ กระจกสไลด์
- ลนไฟใต้สไลด์ให้สีร้อน จนกระทั่งสังเกตเห็นมีไอเกิดข้ึนบนแผ่นสไลด์ (ระวังอย่าให้เดือด) แล้ว
ปลอ่ ยท้ิงไว้ให้เย็นประมาณ 5 นาที
- ลา้ งดว้ ยน้�ำสะอาด เทน้�ำที่ค้างบนสไลดอ์ อกให้หมด
- ฟอกสีด้วยน้�ำยา 3% acid alcohol จนกระทงั่ สีแดงของ carbol fuchsin หลุดออกหมด โดยการราด
น้�ำยา 3% acid alcohol ให้ท่วมสไลด์ท้ิงไว้ 2 นาที ล้างด้วยน้�ำ หากสีแดงยังออกไม่หมดให้ท�ำซ้�ำ
อีกคร้ังหนงึ่
- ลา้ งด้วยน�้ำสะอาด เทนำ�้ ทคี่ า้ งบนสไลดอ์ อกใหห้ มด
- ย้อมทบั โดยการราดดว้ ยสี 0.3% methylene blue ใหท้ ่วมสไลด์ แชท่ ้ิงไว้ 10 วินาที
- ลา้ งน�้ำใหส้ ะอาดท้งั ด้านหนา้ และดา้ นหลังกระจกสไลด์
- นำ� มาต้งั ผ่ึงลมใหแ้ ห้ง และตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศนใ์ ชห้ วั oil immersion objective lens (x 100)
จะเหน็ ตัวเชือ้ ติดสแี ดงบนพ้นื สีนำ้� เงนิ

การตรวจสไลด์ท่ีย้อมสแี ล้วด้วยกล้องจุลทรรศน์
การตรวจสไลดท์ ีย่ ้อมสีแลว้ ดว้ ยกล้องจุลทรรศน์ มขี ั้นตอนดังตอ่ ไปนี้
- ใชก้ ำ� ลงั ขยาย x10 ตรวจดบู รเิ วณทม่ี ีเซลลเ์ ม็ดเลอื ดขาว ไมใ่ ช่บรเิ วณทมี่ ี epithelial cell
- หยด oil immersion ลงบนแผ่นสไลด์ ระวังอย่าให้ส่วนหน่ึงส่วนใดของอุปกรณ์แตะหรือสัมผัส
โดนแผน่ สไลด์
- หมุนหวั เลนซก์ �ำลังขยาย x100 เขา้ แทนท่ี
- ปรบั ความคมชดั ของภาพ โดยการเลอ่ื นแผน่ สไลด์ออกห่างจากเลนซว์ ัตถเุ สมอ

คู่มอื การปฏิบัตงิ านแบคทีเรียและรา

220 บทที่ 5 การวนิ ิจฉยั แบคทเี รียกอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชอ้ื ราทพี่ บบอ่ ย

- อ่านโดยเร่ิมจากตรงกลางริมสุดของวงเสมียร์จากซ้ายไปขวา หรือขวาไปซ้าย ภาพเชื้อท่ีเห็นผ่าน
เลนซก์ ำ� ลังขยาย x100 จะตดิ สีแดง ลักษณะเปน็ แท่งยาวเดี่ยวๆ หรอื อยู่เปน็ คู่ หรอื เปน็ กลุ่ม

หลกั เกณฑ์การอา่ นและรายงานผลสไลดท์ ่ียอ้ มสดี ว้ ยวิธี Ziehl-Neelsen

สไลด์ที่ตรวจพบเชื้อจ�ำนวนมาก (>10 AFB/วงกล้อง) การรายงานผล “AFB 3+” จะต้องอ่านสไลด์
ให้ได้อยา่ งนอ้ ย 20 วงกลอ้ ง จงึ จะรายงานผลได้
สไลดท์ ต่ี รวจพบเชอื้ จำ� นวนปานกลาง (1-10 AFB/วงกลอ้ ง) การรายงานผล “AFB 2+” จะตอ้ งอา่ นสไลด์
ให้ไดอ้ ยา่ งน้อย 50 วงกล้อง จึงจะรายงานผลได้
สไลดท์ ต่ี รวจพบเชอ้ื จำ� นวนนอ้ ย (10-99 AFB/100 วงกลอ้ ง) การรายงานผล “AFB 1+” จะตอ้ งอา่ นสไลด์
ให้ได้อยา่ งนอ้ ย 100 วงกล้อง จึงจะรายงานผลได้
สไลด์ท่ีตรวจพบเช้ือจ�ำนวนน้อยมาก (1-9 AFB/100 วงกล้อง) การรายงานผล “นับจ�ำนวนเชื้อ AFB
ท่พี บ” จะตอ้ งอา่ นสไลดใ์ ห้ไดอ้ ย่างนอ้ ย 100 วงกลอ้ ง จึงจะรายงานผลได้
สไลด์ท่ีตรวจไม่พบเชื้อ การรายงานผล “Negative” จะต้องอ่านสไลด์ให้ได้อย่างน้อย 100 วงกล้อง
จงึ จะรายงานผลได้ ซง่ึ หมายถึง negative เฉพาะทีอ่ า่ นดูใน 100 วงกล้องนเ้ี ทา่ นัน้ ไม่ได้หมายรวมถึง
ตวั อย่างเสมหะทีน่ ำ� มาตรวจทัง้ หมด
การพบเชื้อต้ังแต่ 1 ตัวข้ึนไป ก็สามารถรายงานว่า “Positive” ได้โดยยึดหลักการอ่านผลข้างต้น และ
รายงานผลตามตารางข้างลา่ งน้ี

ตารางที่ 5.10-1 แสดงวธิ ีรายงานผลการตรวจสไลดด์ ้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์แบบ grading วิธี Ziehl-Neelsen

จำ� นวนเช้ือ AFB การรายงานผล

0 AFB / 100 วงกลอ้ ง Negative
1 - 9 AFB / 100 วงกล้อง นบั จ�ำนวน AFB ท่ีพบ
10 – 99 AFB / 100 วงกล้อง
1 - 10 AFB / วงกล้อง 1+
2+
>10 AFB / วงกล้อง 3+

วธิ กี ารย้อมสเี รอื งแสงด้วย auramine O ตามวธิ ี fluorescent acid-fast staining
- วางเรยี งสไลดบ์ นคานยอ้ มส ี เวน้ ระยะหา่ งระหว่างแผ่นสไลด ์ 0.5-1 cm
- ราดสี auramine O solution จนทว่ มท้ังแผ่นสไลด์ ทิง้ ไว้ 10 นาที
- ลา้ งดว้ ยนำ้� สะอาด เทน�้ำท่คี า้ งบนแผ่นสไลด์ออกใหห้ มด
- ฟอกสีดว้ ย 1% acid alcohol นาน 2 นาที จนกระทัง่ สี auramine O หลุดออกหมด

คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รยี และรา

บทที่ 5 การวินิจฉยั แบคทเี รียก่อโรคกลม่ ต่างๆและเชื้อราทพี่ บบ่อย 221

- ล้างออกดว้ ยน�ำ้ สะอาด เทนำ้� ท่คี ้างบนแผ่นสไลดอ์ อกใหห้ มด
- ยอ้ มทบั ดว้ ยน้ำ� ยา 0.5% potassium permanganate นาน 2 นาที
- ลา้ งดว้ ยน้�ำสะอาด ผ่งึ ให้แห้ง
- นำ� ไปตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนช์ นดิ เรอื งแสง(fluorescence microscope)โดยใช ้ lowpower objective
lens (x20) จะเห็นตวั เชื้อตดิ สีเรอื งแสงสีเหลืองทองบนพื้นสีด�ำ

ตารางที่ 5.10-2 แสดงวิธีรายงานผลการตรวจสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศนเ์ รืองแสงแบบ grading
วิธี fluorescent acid-fast staining ด้วย objective lens x20

จ�ำนวนเชอ้ื AFB การรายงานผล 5บทท่ี

0 AFB / 30 วงกล้อง Negative
1 - 29 AFB / 30 วงกล้อง นบั จำ� นวน AFB ทพี่ บ
>29 AFB / 30 วงกลอ้ ง
1 - 10 AFB / วงกลอ้ ง 1+
2+
>10 AFB / วงกล้อง 3+

การรายงานผลการตรวจดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนจ์ ะรายงานไดเ้ พยี งวา่ พบเชอื้ AFB เทา่ นนั้ และหอ้ งชนั สตู ร
ควรจดั ทำ� สมดุ ทะเบยี นการตรวจเสมหะหาเชอื้ วณั โรค โดยเฉพาะแยกจากการตรวจสง่ิ ตรวจอน่ื ๆ เพอ่ื เปน็ หลกั
ฐานการตรวจ สะดวกในการตรวจสอบ และทำ� รายงาน การจะรายงานวา่ เปน็ เชอื้ วณั โรค หรอื เชอื้ มยั โคแบคทเี รยี
อื่นๆ ต้องน�ำไปเพาะเลี้ยงเชื้อและท�ำการทดสอบเพ่ือพิสูจน์ยืนยันชนิดต่อไป ในห้องปฏิบัติการที่ไม่สามารถ
เพาะเล้ียงเชื้อได้ การตรวจพบเช้ือทนกรด (AFB) ด้วยกล้องจุลทรรศน์เพียงอย่างเดียว ก็สามารถช่วยในการ
วินิจฉัยโรคได้ แต่จะต้องมีจ�ำนวนเชื้อมากพอถึง 10,000 ตัว/เสมหะ 1 ml จึงจะพบได้โดยวิธีนี้ ความแม่นย�ำ
ของการตรวจขน้ึ อยกู่ บั ความชำ� นาญของผตู้ รวจ การพบเชอ้ื ใน smear แสดงวา่ ผปู้ ว่ ยเปน็ วณั โรคและอยใู่ นระยะ
แพร่เชื้อท่ีต้องให้การรักษาทันทีเพื่อตัดวงจรการแพร่กระจายเช้ือ จ�ำนวนเช้ือ AFB ท่ีพบแสดงถึงความ
รุนแรงของการติดเชื้อในผู้ป่วย จึงเป็นความส�ำคัญอย่างยิ่งท่ีจะต้องอ่านและรายงานส่ิงที่ตรวจพบให้ถูกต้อง
มากที่สุด

การวนิ จิ ฉยั โดยวธิ กี ารเพาะเลย้ี งเชอื้
วัตถปุ ระสงคข์ องการท�ำเพาะเลยี้ งเช้อื
1. เพ่อื การค้นหาผูป้ ว่ ยจากสงิ่ ตรวจทีไ่ ม่สามารถตรวจหาดว้ ยวิธีกลอ้ งจุลทรรศนไ์ ด้
2. เพื่อยนื ยนั ความมชี วี ติ ของเชื้อวณั โรค
3. เพอ่ื เพม่ิ ปรมิ าณและพิสจู นช์ นดิ โดยการทดสอบคุณสมบตั ิทางกายภาพ และทางชีวเคมี

คูม่ ือการปฏิบัติงานแบคทเี รยี และรา

222 บทที่ 5 การวินิจฉยั แบคทีเรียกอ่ โรคกลม่ ต่างๆและเชือ้ ราที่พบบ่อย

4. เพ่อื ทดสอบความไวของเชอื้ วัณโรคตอ่ ยาเพ่อื ใช้เป็นแนวทางในการรกั ษาอย่างมปี ระสิทธิภาพ
5. เพอ่ื เฝา้ ระวงั การดอื้ ยาวณั โรคในชมุ ชน หรอื ในพน้ื ทพ่ี เิ ศษเฉพาะ เชน่ ในเรอื นจำ� และบรเิ วณชายแดน
เปน็ ตน้

การส่งสงิ่ ตรวจเพาะเชื้อ ให้สง่ ในรายตอ่ ไปนี้
1. ในรายท่เี ปน็ ผปู้ ว่ ยใหม่
1.1 เมอ่ื ตรวจเสมหะดว้ ยกล้องจุลทรรศนไ์ มพ่ บเช้ืออย่างนอ้ ย 3 คร้งั ข้ึนไป
1.2 เมื่อสงสยั เช้อื ด้อื ยา
1.3 เมอื่ มีประวตั สิ ัมผัส หรือใกลช้ ิดกบั ผปู้ ว่ ยดื้อยาหลายขนาน หรอื ตดิ เชอื้ HIV
1.4 เม่ือมีการเฝ้าระวังการดอื้ ยารักษาวัณโรค
2. ในรายทก่ี ำ� ลังตดิ ตามการรกั ษา
2.1 เม่ือสิ้นสุดระยะเขม้ ขน้ (เดอื นที่ 2) ตรวจเสมหะด้วยกล้องจุลทรรศน์พบเชอ้ื AFB
2.2 เมื่อส้ินเดือนท่ี 5 หรือในเดือนสุดท้ายของการรักษา เสมหะยังตรวจพบเช้ือ AFB ด้วยกล้อง
จุลทรรศน์
2.3 เมอ่ื จะประเมนิ ว่าผูป้ ่วยหายจากการเปน็ วัณโรค

อาหารเล้ยี งเช้ือ ท่นี ิยมใช้ประกอบดว้ ย
1. อาหารแขง็ ที่มีสว่ นประกอบของไข ่
1.1 Lowenstein-Jensen media
1.2 2% Ogawa media
2. อาหารแข็งทม่ี สี ่วนประกอบของวุ้น เช่น Middlebrook 7H11
3. อาหารเหลว
3.1 Middlebrook 7H9
3.2 BBL MGIT
การเพาะเช้ือวัณโรคจ�ำเป็นอย่างย่ิงท่ีจะต้องปฏิบัติในตู้ปลอดเช้ือ BSC class II ที่มีระบบการดูแล
บำ� รงุ รกั ษาอยา่ งดีและตอ้ งกำ� จดั เชอ้ื แบคทเี รยี อน่ื ๆทป่ี นเปอ้ื นมากบั สง่ิ ตรวจกอ่ นทจ่ี ะนำ� ไปเพาะเลย้ี งเชอื้ เรยี กวา่
ขบวนการ decontamination procedure โดยมากมักจะใชก้ ับเสมหะ หนอง และอืน่ ๆ แตถ่ า้ เปน็ ตัวอยา่ งทเี่ ก็บมา
ดว้ ยวธิ ี aseptic technique เช่น CSF กส็ ามารถเพาะลงบนอาหารเลย้ี งเชือ้ Lowenstein-Jensen ไดโ้ ดยตรง การ
การเพาะเลี้ยงเช้ือยังมีประโยชน์ในการจ�ำแนกชนิดของเชื้อวัณโรคออกจากเช้ือมัยโคแบคทีเรียอ่ืนๆได้ และ
สามารถน�ำเชื้อที่เพาะเลี้ยงได้ไปท�ำทดสอบความไวต่อยาได้ อาหารเล้ียงเชื้อที่นิยมใช้กันมากคือ
Lowenstein-Jensen และ 2% Ogawa medium ซึ่งอาหารทั้งสองชนิดนี้จะมีไข่เป็นส่วนประกอบที่ส�ำคัญ

คูม่ ือการปฏิบตั ิงานแบคทเี รยี และรา

บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทีเรยี กอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเชอ้ื ราที่พบบอ่ ย 223

แต่ในปัจจุบันมีการเพาะเล้ียงเช้ือในอาหารเหลว BBL MGIT ท่ีใช้กับเครื่องเพาะเลี้ยงเช้ืออัตโนมัติ
Bactec MGIT 960 ที่ตรวจหาการเจริญของเช้ือโดยใช้หลักการของ oxygen consuming ที่สามารถตอบผล
ที่รวดเรว็ กวา่ การเพาะเล้ียงเชอ้ื บนอาหารแขง็ แต่มีราคาแพงกว่า

น้ำ� ยาท่ีใช้ในการกำ� จัดเชือ้ ปนเป้อื น (digestion-decontamination solution)
1. 4% NaOH
2. NALC-2% NaOH (N-acetyl-L-cysteine-2% sodium hydroxide)

วธิ เี พาะเล้ยี งเชอื้ วัณโรคแบบง่าย (TB simple culture method) 5บทที่
วธิ นี ใ้ี ชไ้ ดผ้ ลดเี ฉพาะกบั สงิ่ ตรวจทตี่ รวจพบเชอ้ื ดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศนเ์ ทา่ นน้ั และไมต่ อ้ งใชเ้ ครอ่ื งปน่ั ตก
ตะกอน สามารถปฏิบัติไดด้ งั นี้
1. ถา่ ยเสมหะจากถว้ ยเกบ็ เสมหะใส่ในขวดแก้ว McCartney
2. เตมิ นำ�้ ยา 4% NaOH ลงในขวดบรรจเุ สมหะ ในอตั ราสว่ น 1:1 ของปรมิ าณเสมหะ ถา้ ตวั อยา่ งเสมหะ
มคี วามหนืด เหนียว และความสกปรกมาก ก็ให้เพม่ิ สัดส่วนของน�ำ้ ยา 4% NaOH เปน็ 1:2 ได้
3. ปิดฝาขวดใหแ้ น่น ผสมใหเ้ ขา้ กันดีดว้ ยเคร่อื ง vortex mixer และตัง้ ทิง้ ไว้ 15 นาที
4. เม่ือครบก�ำหนดใช้ pasteur pipette ท่ีผ่านการฆ่าเช้ือแล้วดูดสารแขวนลอยที่เตรียมได้หยดลงบน
อาหารเล้ยี งเช้ือ 2% Ogawa 2 ขวดๆละ 100 µl หรอื ประมาณ 4 หยด
5. นำ� เขา้ ตู้อบเชอ้ื อุณหภูมิ 35-37 OC นาน 8 สัปดาห ์ และนำ� ออกมาอา่ นผลทกุ สัปดาหจ์ นมีการเจรญิ
ของเช้ือเกิดข้ึนมีลักษณะแห้ง ขรุขระ ขนาด 2-3 mm คล้ายดอกกระหล�่ำ เรียกลักษณะแบบนี้ว่า
eugonic type แต่ถา้ โคโลนีมีลักษณะกลม แบน เรยี บ และขนาด 1-2 mm จะเรียกว่า dysgonic type
ซงึ่ จะเปน็ ลักษณะของเชอ้ื มัยโคแบคทเี รียอื่นๆทีไ่ ม่ใช่เชอื้ วัณโรค

วิธีเพาะเลี้ยงเช้ือวัณโรคแบบมาตรฐานบนอาหารแข็ง (TB conventional culture method)
วธิ ีนใี้ ช้ได้กบั เสมหะทง้ั ชนดิ พบเชอื้ และไมพ่ บเชอ้ื รวมทงั้ ตวั อย่างอนื่ ๆ เชน่ pus, plural effusion, tissue
biopsy, gastric lavage เปน็ ต้น สำ� หรบั ส่ิงตรวจทเ่ี ปน็ เสมหะสามารถปฏิบตั ิไดด้ งั นี้
1. ถา่ ยเสมหะจากภาชนะบรรจใุ สใ่ นหลอดปน่ั (sterile centrifuge tube) ขนาด 50 ml ปรมิ าณของเสมหะ
ต้องไม่เกนิ 10 ml
2. เตมิ นำ�้ ยาNALC-2%NaOHลงในขวดบรรจเุ สมหะในอตั ราสว่ น1:1ของปรมิ าณเสมหะปดิ ฝาหลอด
ให้แนน่ น�ำไปเขยา่ ผสมใหเ้ ขา้ กนั ดว้ ยเครอ่ื ง vortex mixer นานไมเ่ กิน 30 วินาที
3. ตง้ั ทิง้ ไว้ 15 นาที
4. เปดิ ฝาหลอด เติมน้�ำยา phosphate buffer saline pH 6.8 ให้ถงึ ระดับ 50 ml

คมู่ ือการปฏบิ ัติงานแบคทเี รยี และรา

224 บทที่ 5 การวินิจฉัยแบคทเี รยี ก่อโรคกลม่ ต่างๆและเช้อื ราทพี่ บบ่อย

5. น�ำเข้าเครื่องปั่นตกตะกอนความเร็วสูงปรับอุณหภูมิ (high speed refrigerate centrifuge) ปั่นท่ี
ความเรว็ 3,000 x g นาน 20 นาที เทสว่ นใสท้ิงลงในภาชนะเฉพาะด้วยความระมดั ระวัง
6. เตมิ 1 หยดของน้ำ� ยา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกับตะกอนทไี่ ด้
7. ใช้ pasture pipette ที่ผ่านการฆ่าเช้ือแล้วดูดสารแขวนลอยที่เตรียมได้หยดลงบนอาหารเล้ียงเช้ือ
Lowenstein-Jensen (LJ) 2 ขวดๆละ 100 µl หรือประมาณ 4 หยด
8. นำ� เขา้ ต้อู บเชอ้ื อณุ หภมู ิ 35-37OC นาน 8 สปั ดาห์ และนำ� ออกมาอ่านผลทุกสัปดาหจ์ นพบการเจริญ
ของเชือ้
9. บนั ทึกระยะเวลาทต่ี รวจพบการเจริญ จำ� นวน และลกั ษณะของโคโลนี
การเพาะเลีย้ งในอาหารเหลว BBL MGIT
1. ถา่ ยเสมหะจากถว้ ยเกบ็ เสมหะใสใ่ นหลอดปน่ั (sterilecentrifugetube)ขนาด 50 ml ปรมิ าณของเสมหะ
ต้องไม่เกิน 10 ml
2. เตมิ นำ้� ยาNALC-2%NaOHลงในขวดบรรจเุ สมหะในอตั ราสว่ น1:1ของปรมิ าณเสมหะปดิ ฝาหลอด
ใหแ้ น่นน�ำไปเขยา่ ผสมให้เขา้ กันดว้ ยเครือ่ ง vortex mixer นานไมเ่ กิน 30 วินาที
3. ต้งั ท้งิ ไว้ 15 นาที
4. เปดิ ฝาหลอด เติมน้�ำยา phosphate buffer saline pH 6.8 ใหถ้ งึ ระดับ 50 ml
5. น�ำเข้าเครื่องปั่นตกตะกอนความเร็วสูงปรับอุณหภูมิ (high speed refrigerate centrifuge) ปั่นท่ี
ความเร็ว 3,000 x g นาน 20 นาที ในภาชนะปัน่ ชนิด aerosol free protection
6. ระหว่างที่รอเวลาให้เตรียมเขียนหมายเลขข้างหลอด BBL MGIT tube และเตรียมสารละลาย
supplement PANTA โดยดูดสารละลาย supplement ปริมาตร 15 ml ละลายผง PANTA lyophilized
เขย่าให้เขา้ กัน
7. เมือ่ ครบเวลา 20 นาที นำ� หลอดปนั่ มาเทสว่ นใสท้ิงลงในภาชนะเฉพาะด้วยความระมดั ระวงั
8. เตมิ 1 ml ของน้ำ� ยา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกับตะกอนที่ได้
9. เติม dissolved supplement PANTA ลงใน BBL MGIT ปริมาตร 0.8 ml แล้วเติม 0.5 ml ของ
ตะกอนทไี่ ด้ ปิดฝาหลอดให้แนน่ คว�่ำหลอดไปมา 2–3 คร้ัง เช็ดหลอดด้วยนำ้� ยาฆ่าเชื้อ
10. น�ำเข้าเครื่อง Bactec MGIT 960 โดยดึงลิ้นชักตู้ออก แล้วปฏิบัติตามวิธีที่ระบุในคู่มือ โดยกดปุ่ม
icon บนหน้าจอที่เป็นรูปสัญญาลักษณ์หลอดท่ีมีลูกศรช้ีลง น�ำหลอดทดสอบไปผ่านเครื่องสแกน
barcode สังเกตช่องในล้ินชักที่ใส่หลอดทดสอบ คว�่ำหลอด 2–3 ครั้ง แล้วใส่หลอดทดสอบใน
ชอ่ งที่มไี ฟกระพรบิ สีเขยี ว ทำ� แบบนีจ้ นครบจำ� นวนตวั อย่างที่เตรยี มไว้
11. ปดิ ลิ้นชักใหส้ นทิ เครื่อง Bactec MGIT 960 จะตรวจสอบการเจริญของเช้อื มัยโคแบคทเี รีย บนั ทกึ
และจดั พิมพ์รายงาน

คมู่ ือการปฏบิ ัตงิ านแบคทเี รียและรา

บทท่ี 5 การวินจิ ฉัยแบคทีเรียก่อโรคกล่มตา่ งๆและเชื้อราท่พี บบอ่ ย 225

การพสิ ูจน์ชนิดของเชอื้ มัยโคแบคทเี รีย

ตารางท่ี 5.10-3 ลักษณะตา่ งๆทีใ่ ชส้ �ำหรับแยกเช้ือวัณโรคออกจากเชือ้ มยั โคแบคทเี รียอ่ืนๆ (NTM)

ลกั ษณะ M. tuberculosis NTM 5บทท่ี

1. อัตราการเจริญเติบโต > 7 วนั นอ้ ยกว่า หรือมากกวา่ 7 วัน
2. อณุ หภูมิ 35-37 OC 25- 45 OC
3. ลักษณะโคโลนีบนอาหารแข็ง แห้ง ขรุขระคลา้ ยดอกกระหลำ�่
4. สีของโคโลนี แบบ eugonic มที ้งั แห้ง ขรุขระ และเรยี บ
5. Niacin test คลา้ ยสีฟางหญ้าแหง้ แบบ dysgonic
6. Nitrate reduction test
7. Catalase 68 OC test + ครีม เหลอื ง สม้ หรือ ชมพู
8. Cord formation + -
9. การเจริญบนอาหาร L-J ทผ่ี สม - +/ -
PNB ความเข้มข้น 500 µg/ml + +
10. Immunochromatography Assay - -
(SD-Bioline) + +
-

เม่ือแยกเชื้อวัณโรคออกจากเช้ือ NTM ได้แล้ว ขั้นตอนต่อไปต้องพิสูจน์ชนิดของเชื้อ NTM โดยท�ำ
การทดสอบคณุ ลักษณะต่างๆ เชน่ growth rate, growth at different temperature (25 OC, 37 OC, 42 OC, 45 OC),
pigment in the dark, photoreactivity, nitrate reduction test, catalase 68 OC, 20 min test, semi-quantitative
catalase test, arylsulfatase 3 and 14 days test, Tween 80 hydrolysis 3 and 14 days test, tellurite reduction 3
and 14 days test, iron uptake, growth on L-J contain 5% NaCl เป็นตน้ ซึง่ การทดสอบคณุ ลักษณะตา่ งๆ
เหล่านี้สามารถท�ำได้ในห้องปฏิบัติการอ้างอิงของกลุ่มปฏิบัติการอ้างอิงชันสูตรวัณโรคแห่งชาติ ห้อง
ปฏิบัติการของสมาคมปราบวัณโรคแห่งประเทศไทยในพระบรมราชูปถัมภ์ ห้องปฏิบัติการของ
โรงพยาบาลมหาวทิ ยาลยั แพทย์ต่างๆ และหอ้ งปฏิบตั ิการของสถาบันโรคทรวงอก เปน็ ต้น

การเพาะเลย้ี งเชือ้ วัณโรคจากสงิ่ ตรวจทไ่ี ม่ใชเ่ สมหะ
gastric lavage และชน้ิ เนอ้ื gastric lavage ตอ้ งดำ� เนนิ การตรวจภายใน 4 ชม. นบั ตง้ั แตเ่ กบ็ ตวั อยา่ งชน้ิ เนอื้
(biopsy tissue) กรณีเป็นชิ้นเน้ือขนาดใหญ่ ให้ใช้กรรไกร (sterile scissor) ตัดออกเป็นชิ้นเล็กๆใช้ที่บดเช้ือ
(sterile tissue grinder) บดเน้ือเยือ่ ท่ีส่งตรวจในน้ำ� เกลอื ปราศจากเช้อื 2 - 5 ml แลว้ ดำ� เนนิ การตรวจสง่ิ ตรวจ
ท้งั สองชนดิ ดงั นี้

คู่มอื การปฏบิ ตั ิงานแบคทเี รยี และรา

226 บทท่ี 5 การวนิ จิ ฉัยแบคทเี รียกอ่ โรคกลม่ ตา่ งๆและเชอื้ ราทีพ่ บบ่อย

1. เกบ็ สว่ นใสในหลอดปนั่ (centrifuge tube) ขนาด 50 ml ในปริมาตรไม่เกิน 10 ml
2. ปัน่ ตกตะกอนทค่ี วามเรว็ 3000 x g นาน 15 นาที ในภาชนะปั่นชนิด aerosol free protection
3. หลงั จากนัน้ เทส่วนใสทิง้ และละลายตะกอนด้วยนำ�้ กล่นั ปลอดเชอ้ื ปรมิ าตร 2-5 ml
4. เตมิ สารละลายNALC-2NaOHในอตั ราสว่ น1:1ผสมใหเ้ ขา้ กนั และเอยี งหลอดไปมาเพอ่ื ใหส้ ารละลาย
NALC-2% NaOH สัมผสั ภายในหลอดและฝาหลอดใหม้ ากที่สุด
5. ตัง้ ท้งิ ไว้ 15 นาที
6. เตมิ สารละลาย phosphate buffer saline pH 6.8 ให้ถงึ ระดับ 50 ml
7. ปดิ ฝาหลอดใหแ้ นน่ นำ� ไปปน่ั ตกตะกอนทคี่ วามเรว็ 3000 x g นาน 15 นาที ในภาชนะปน่ั ชนดิ aerosol
free protection อีกคร้งั หน่งึ
8. เทส่วนใสท้ิงและละลายตะกอนด้วยน้�ำกลั่นฆ่าเชื้อปริมาตร 1-2 ml ผสมให้เข้ากันดีด้วย pasture
pipette 1 ml แลว้ เจอื จาง 1:10 เพื่อลดความเป็นพษิ ของสารละลาย NALC-2% NaOH
9. Inoculate 0.1 ml ของสารละลายทีเ่ จอื จางและไม่เจอื จางลงบนอาหารเลีย้ งเชื้อ Lowenstein-Jensen
media และ Middlebrook 7H11
10. นำ� เข้าตู้อบเชอื้ ที่อณุ หภูมิ 35-37 OC
11. อ่านผลทุกสัปดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์ถ้าพบการเจริญของเชื้อให้ท�ำการส่งต่อเพ่ือวินิจฉัยเช้ือและ
ทดสอบความไวต่อไป

เลือด (blood)

1. น�ำเลอื ด 20 ml ใสล่ งในอาหารเหลวชนดิ Middlebrook 7H9 20 ml
2. น�ำเข้าตูอ้ บเช้อื ทีอ่ ุณหภูมิ 35-37 OC เขยา่ ด้วยมือทกุ วันๆละครงั้
3. ท�ำ smear ยอ้ มสที กุ สัปดาห์
4. ถ้าพบเช้ือ AFB น�ำอาหารเหลวน้ันมา inoculate ลงบนอาหารแขง็ L-J 2 ขวด
5. นำ� เข้าตู้อบเชอ้ื ทีอ่ ุณหภูมิ 35-37 OC
6. อ่านผลทุกสัปดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์

การเตรยี มสียอ้ มและอาหารเลยี้ งเช้ือ

1. วิธเี ตรียมนำ้� ยาสียอ้ มแบบ Ziehl-Neelsen

ก. นำ�้ ยา 1% carbol fuchsin

- basic fuchsin powder 1.0 g

- ethanol 95% 10.0 ml

(ละลายสว่ นผสมท้งั สองเข้าด้วยกัน).....................(A)

คูม่ ือการปฏิบตั ิงานแบคทีเรียและรา

บทที่ 5 การวินจิ ฉยั แบคทีเรียก่อโรคกลม่ ต่างๆและเชอ้ื ราที่พบบอ่ ย 227

- phenol crystals 5.0 g

- distilled water 95.0 ml

(ละลายผลกึ phenol ก่อนเติมน้�ำกล่ัน)...................(B)

ผสม 90 ml ของสารละลาย (B) ในสารละลาย (A)

น้�ำยาสยี อ้ ม carbol fuchsin ทไ่ี ด้นี้ตอ้ งกรองหลงั จากเตรยี มเสร็จ และเก็บในท่มี ืด ซงึ่ สยี ้อมท่ี

เตรยี มแตล่ ะคร้ังควรใชใ้ ห้หมดภายใน 6 เดือน

ข. น�้ำยาฟอกสี 3% acid alcohol

- hydrochloric acid (conc.) 97.0 ml

- ethanol 95% 3.0 ml

(ผสมสารทั้งสองสว่ นเข้าด้วยกนั )

ค. สียอ้ มทบั 0.3% methylene blue

- methylene blue 0.3 g

- distilled water 100.0 ml 5บทท่ี

(ผสมสารทง้ั สองจนละลายเขา้ กันดี)

ตารางที่ 5.10-4 วธิ ีเตรียมอาหารไขท่ ้งั ชนดิ Lowenstein-Jensen (LJ) และ 2% Ogawa medium

ส่วนประกอบ Lowenstein-Jensen (LJ) 2% Ogawa medium

1. monopotassium dihydrogen phosphate 0.4 g 2g
2. magnesium sulfate 0.04 g -
3. magnesium citrate 0.1 g 0.1 g
4. asparagine 0.6 g -
5. sodium glutamate 0.5 g
6. glycerol - 4 ml
7. distilled water 2 ml 100 ml
8. 2% malachite green solution 100 ml 4 ml
9. homogenized whole eggs 3.3 ml 200 ml
167 ml

วิธเี ตรยี มอาหาร Lowenstein-Jensen (LJ) หรือ 2% Ogawa medium

ละลายส่วนประกอบอันดับที่ 1-7 (แล้วแต่ชนิดของอาหารที่จะเตรียม) น�ำเข้า autoclave ปล่อยทิ้งไว้
ไวใ้ ห้เยน็ แล้วน�ำมาเติม 2% malachite green solution ตามสว่ น นำ� สารละลายนม้ี าผสมกับ homogenized whole

คมู่ ือการปฏบิ ตั งิ านแบคทเี รียและรา

228 บทที่ 5 การวนิ จิ ฉัยแบคทีเรียกอ่ โรคกลม่ ต่างๆและเชอื้ ราทีพ่ บบ่อย

eggs เขย่าใหเ้ ข้ากัน ตงั้ ท้งิ ไว้ 30 นาที แบ่งใสข่ วด McCartney ขวดละ 7 ml นำ� เขา้ ต้นู ึง่ อาหารระบบไอน้ำ� ร้อน
(inspissator) ทอ่ี ณุ หภมู ิ 85-90 OC ในสภาพเอียง (slant) เป็นเวลา 45 นาที เพ่ือทำ� ให้ไข่สุก อาหารจะแขง็ ตาม
ต้องการ จากนั้นนำ� เขา้ ตูอ้ บ 35-37 OC นาน 48 ชม. เพ่อื เช็ค sterility แล้วน�ำไปเก็บในถงุ พลาสติก มดั ปากถงุ ให้
แนน่ เก็บไวใ้ นตู้เย็นจนกวา่ จะใชง้ าน

วธิ ีเตรียม Homogenized whole eggs
น�ำไข่ไก่สดประมาณ 10 ฟอง มาล้างน้�ำและขัดผิวไข่ให้สะอาดด้วย 70% alcohol ปล่อยให้แห้ง
แล้วเช็ดด้วยน้�ำยา 70% alcohol น�ำมาวางเรียงบนภาชนะที่สะอาด ตอกไข่ใส่ภาชนะเช่น plate หรือ beaker
เพ่ือตรวจสอบคุณภาพของไข่ จากนั้นน�ำไปเทลงในเครื่องปั่น (blender) ตีไข่ให้เข้ากัน เทใส่กระบอกตวง
โดยผ่านผา้ กรองทีผ่ ่านการฆา่ เชอื้ แล้วให้ไดป้ ริมาณทีต่ ้องการ

วิธีเตรยี ม 2% Malachite green solution
ช่งั ผง malachite green 2 g ละลายในน�้ำกลัน่ 100 ml

เอกสารอ้างองิ
1. Kent PT and Kubica GP. Public health mycobacteriology: a guide for the level III
laboratory Center for Disease Control, Atlanta, Georgia; 1985.
2. Kudoh S and Kudoh T. Simple Technique for Culturing Tubercle Bacilli. Bull WHO; 1974.
51: p. 7-12.
3. Smithwick RW. Laboratory Manual for Acid fast Microscopy. 2nd ed. Center for Disease
Control, Atlanta, Georgia. 1976.
4. The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National
Laboratory Network. IUATLD; 1998.
5. Vestal AL. Procedure for the Isolation and Identification of Mycobacterium. Department of
health Education and welfare, UPH , Atlanta, Georgia. 1977.
6. ชัยเวช นุชประยูร. วัณโรคปฏิบัติการ. สมาคมปราบวัณโรคแห่งประเทศไทยในพระบรม
ราชปู ถมั ภ์ กรงุ เทพมหานครฯ: โรงพิมพ์แห่งจฬุ าลงกรณม์ หาวิทยาลัย; 2529.

คู่มอื การปฏิบัติงานแบคทีเรยี และรา

บทท่ี 5
การวนิ ิจฉยั แบคทีเรยี กอ่ โรคกลุ่มตา่ งๆและเชอื้ ราทพ่ี บบอ่ ย

5.11 การวนิ ิจฉยั เชอ้ื ราที่พบบอ่ ย

ณฎั ฐีวรรณ ปุน่ วนั

โรคติดเช้ือราส่วนใหญ่ มีสาเหตุมาจากราฉวยโอกาส ผู้ป่วยที่มีภูมิคุ้มกันต่�ำ ผู้ป่วยเบาหวาน ผู้ป่วย 5บทที่
ต่อมพาราไทรอยด์ท�ำงานได้น้อย ผู้ป่วยที่ได้รับยาเป็นพิษต่อเซลล์ ยากดภูมิคุ้มกัน สารต้านจุลชีพ ฮอร์โมน
จะท�ำให้ราฉวยโอกาสเพ่ิมจ�ำนวนมากข้ีนและเกิดโรครุนแรงขึ้น ตัวอย่างราฉวยโอกาสประเภทราสาย
(molds) ได้แก่ Aspergillus, Mucor และ Rhizopus ซี่งพบได้ไม่บ่อยนัก ประเภทยีสต์ได้แก่ Cryptococcus
neoformans และ Candida albicans ราบางชนิดมีคุณสมบัติเป็นราสองรูป (dimorphic fungi) คือมีรูปร่าง
แบบราสายเม่ือเจริญอยู่ในสภาวะแวดล้อมท่ีอุณหภูมิไม่เกิน 35 OC และเปลี่ยนรูปร่างเป็นยีสต์เม่ือเจริญอยู่ใน
สภาวะแวดลอ้ มทอ่ี ณุ หภูมไิ มต่ ำ่� กวา่ 35 OC ตัวอย่างรา 2 รปู ทพี่ บบอ่ ยในประเทศไทย คอื Penicillium marneffei
และ Histoplasma capsulatum โรคตดิ เชอื้ ราทพี่ บบอ่ ยในผปู้ ว่ ยเอดสแ์ ละผปู้ ว่ ย immunocompromised อนื่ ๆ ไดแ้ ก่
candidiasis, cryptococcosis, penicillosis marneffei, และ histoplasmosis

1. การวนิ ิจฉัย Candida albicans กอ่ โรค candidiasis


หลกั การ การตรวจสดสงิ่ ตรวจในสารละลาย potassium hydroxide (KOH) 10-30% หรอื การยอ้ มแกรม
จะท�ำให้เหน็ ลกั ษณะรูปร่างของ Candida albicans หรอื Candida species อื่นๆ ได้ชัดเจน และโคโลนที ี่เพาะได้
บนอาหารเล้ียงเช้ือ น�ำมาทดสอบการสร้าง germ tube และการสรา้ งสโี คโลนีบน CHROMagar Candida เพื่อ
วินิจฉยั และรายงานผล Candida แบบ presumptive identification Candida species อืน่ ๆทกี่ อ่ โรคได้นอกจาก
C. albicans ไดแ้ ก่ C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei และ C. glabrata เปน็ ต้น

สิ่งตรวจ เยือ่ บุจากชอ่ งปาก เยอ่ื บุจากหลอดอาหารหรอื ล�ำไส้ เยอ่ื บจุ ากชอ่ งคลอด เย่อื บหุ ัวใจ ผิวหนงั
เล็บ ปัสสาวะ สิง่ ตรวจจากระบบหายใจ เลือด

230 บทที่ 5 การวินจิ ฉยั แบคทีเรยี กอ่ โรคกล่มตา่ งๆและเช้อื ราทพี่ บบอ่ ย

วิธปี ฏิบตั ิงาน
1. การตรวจสิ่งตรวจโดยตรงทางกล้องจลุ ทรรศน์
1.1 การตรวจสดด้วยสารละลาย KOH
1.2 การย้อมแกรม (วิธีการเชน่ เดยี วกบั การยอ้ มแกรมแบคทเี รีย)
2 . การเพาะเชื้อ
เพาะส่ิงตรวจบน SDA หรือ BA ส่ิงตรวจจากต�ำแหน่งทีม่ ีเช้ือประจ�ำถิ่น (non sterile site) เพาะบน
SDA ท่ีเติม chloramphenicol อบเชือ้ ทีอ่ ณุ หภูม ิ 25-30 OC นาน 24-48 ชม. ตรวจดูการเจรญิ ของเชอื้ ลกั ษณะ
รปู ร่างของเซลลท์ างกลอ้ งจุลทรรศนโ์ ดยทำ� mounting slide ด้วย lactophenol aniline blue
3. การสรา้ ง germ tube
ใช้ loop ตกั เชือ้ จากโคโลนีเดยี่ วที่เจรญิ บน SDA 24 ชม. เพาะลงในซีรัมของคนปรกตปิ รมิ าตร 0.5
ml อบทีอ่ ณุ หภมู ิ 37 OC เวลา 2.5-3 ชม. หยดเช้อื ในซีรัมลงบนแผ่นสไลดแ์ กว้ และปิดทบั ดว้ ย cover glass ตรวจ
ด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์
เชื้อควบคมุ คุณภาพ positive control Candida albicans DMST 15313
negative control Candida tropicalis DMST 15195
4. การสร้างสโี คโลนบี น CHROMagar Candida
ใช้ลูปตักเช้อื จากโคโลนเี ดีย่ วท่ีเจริญบน SDA 24 ชม. streak บน CHROMagar Candida plate และ
streak เชอื้ ควบคมุ คุณภาพลงบน plate เดยี วกัน อบเช้ือในท่ีมืดท่ีอณุ หภูมิ 35-37 OC นาน 24-48 ชม.
เช้ือควบคุมคณุ ภาพ Candida albicans DMST 15313…….....โคโลนีสเี ขียว (bright green)
Candida tropicalis DMST15195……....โคโลนีสนี ้ำ� เงนิ อมเขยี ว (dull greenish blue)
Candida krusei DMST 15317……........โคโลนีสชี มพู (rose-colored)

การอ่านผล
1. การตรวจสดด้วยสารละลาย KOH พบเซลล์ยีสต์เป็นสีใสๆไม่มีสี เซลล์ยีสต์รูปไข่ budding yeast
อยรู่ ว่ มกบั pseudohyphae
2. การยอ้ มสแี กรม เซลล์ยสี ตต์ ิดสแี กรมบวก ลกั ษณะรูปร่างเช่นเดยี วกบั การตรวจสดดว้ ยสารละลาย
KOH การตรวจสดสิ่งตรวจผิวหนังและเล็บทางกล้องจุลทรรศน์เพ่ือตรวจหาเช้ือ Candida ใช้การ
ตรวจสดด้วยสารละลาย KOH เหมาะสมกวา่ การย้อมสแี กรม
3. การเพาะเชอื้ ลกั ษณะของโคโลนบี นอาหารเลย้ี งเชอ้ื SDAคลา้ ยครมี สขี าวผวิ หนา้ เรยี บเปน็ มนั ตรงกลาง
นูน ลักษณะทางกล้องจุลทรรศน์ พบเซลล์ยีสต์รูปไข่หรือรูปกลม และเซลล์ยีสต์ที่ก�ำลังแตกหน่อ

คมู่ อื การปฏิบัติงานแบคทีเรียและรา

บทที่ 5 การวินจิ ฉัยแบคทเี รียกอ่ โรคกลม่ ต่างๆและเชื้อราทพี่ บบ่อย 231

(budding yeast cell) อาจพบลกั ษณะของ short pseudohyphae
4. การสร้าง germ tube ลักษณะของ germ tube เป็นสายรูปทรงกระบอกขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง
สมำ่� เสมอ ไมม่ รี อยคอดตรงจดุ ทงี่ อกออกจากเซลลย์ สี ต์ เชอื้ ที่ germ tube positive นอกจาก C.albicans
แลว้ ยังมี C. dubliniensis ระยะเวลาที่อ่านผลตอ้ งอยใู่ นช่วง 2.5-3 ชม. เน่ืองจาก Candida species
อน่ื ๆเชน่ C. tropicalis สามารถสรา้ ง germ tube ไดห้ ลงั จากอบเพาะเชอื้ ไวเ้ กนิ 3 ชม. และ C. albicans
ทุก isolate ไม่ได้สร้าง germ tube ได้ท้ังหมด ดังนั้น การรายงานผล germ tube positive ของ
C. albicans จดั เป็น presumptive identification
5. การสร้างสีโคโลนีบน CHROMagar Candida สีโคโลนีของยีสต์แต่ละ species แสดงในตาราง
5.11-1 การสรา้ งสีโคโลนีบน CHROMagar จดั เปน็ presumptive identification

ตารางท่ี 5.11-1 สโี คโลนขี อง Candida species บน CHROMagar Candida

Candida species สโี คโลนบี น CHROMagar Candida 5บทที่
Candida albicans bright green/ dark green
Candida dubliniensis dark green/ bright green
Candida tropicalis dull greenish blue
Candida krusei rose -colored
Candida parapsilosis pale purplish pink
Candida glabrata pale purplish pink
Candida guilliermondii Light purple
Candida famata
dull greenish blue/ bright green

การรายงานผล
การตรวจสดด้วยสารละลาย KOH และการย้อมสีแกรม เม่ือได้ผลการตรวจสดหรือการย้อมสีแกรม
รายงานใหแ้ พทยท์ ราบทนั ที
รายงานผลการตรวจสด “Hyaline oval yeast cells, budding yeast cells with pseudohyphae suggestive
for candidiasis”
รายงานผลการยอ้ มแกรม “Gram positive oval yeast cells, budding yeast cells with pseudohyphae
suggestive for candidiasis”
การเพาะเชื้อ รายงานผลจากการทดสอบ germ tube และ การสร้างสีโคโลนีบน CHROMagar Candida
ซ่งึ เปน็ presumptive identification

คู่มือการปฏิบตั ิงานแบคทีเรียและรา