หลักการวิเคราะห์จุลินทรีย์

หลกั การวิเคราะหจุลนิ ทรีย

รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี

ภาควชิ าเทคโนโลยกี ารพฒั นาผลติ ภณั ฑ

คณะอตุ สาหกรรมเกษตร มหาวทิ ยาลยั เชยี งใหม

ISBN:974-657-618-6
พมิ พค รง้ั ท่ี 1
จดั พมิ พโ ดย คณะอตุ สาหกรรมเกษตร มหาวทิ ยาลยั เชยี งใหม

2545
คณะอตุ สาหกรรมเกษตร
มหาวทิ ยาลยั เชยี งใหม เชยี งใหม 50100

คํานํา

หลักการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียโดยเฉพาะในผลติ ภณั ฑอ ุตสาหกรรมเกษตร เชน อาหาร
และ ชวี มวลท้ังหลายนบั วา เขา มามบี ทบาทในอุตสาหกรรมอยา งมาก และมคี วามสําคัญยิ่งตอ
การควบคุมคุณภาพวัตถุดิบ กระบวนการผลติ และ ผลิตภัณฑสําเรจ็ รปู ความเขา ใจถงึ หลกั การ
วิเคราะหจ ลุ นิ ทรีย รวมท้ังวิธีการและเทคนคิ ตา งๆในการวเิ คราะหจ งึ มคี วามจาํ เปน อยา งยง่ิ ท่ี
ตองทราบและปฏิบัตจิ นมคี วามชํานาญและสามารถประยกุ ตใ ชใ นสายงานตา งๆได เพื่อสราง
ความม่ันใจในเชงิ คณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรียในผลติ ภณั ฑต า งๆ

นอกจากน้ีเพ่ือเปน แนวทางในการใชพ จิ ารณาประกอบการพฒั นาผลติ ภณั ฑ การใช
หลักการและวิธีการรวมทั้งเทคนิคในการวิเคราะหจุลินทรียเปนแนวทางในการวิเคราะหคุณภาพ
ทางจุลินทรียในข้ันตอนตา งๆในระหวา งการพฒั นาผลติ ภณั ฑก ม็ คี วามสําคญั เชน กนั เพื่อใหการ
พัฒนาผลิตภัณฑเปนไปตามวัตถุประสงคของบริษัทหรือโรงงานอุตสาหกรรมเกษตรตางๆ
นอกจากจะเปนความตองการของผูบริโภคในดานความปลอดภัยแลว ยังเพื่อใหเกิดความ
สอดคลองกับมาตรฐานผลติ ภณั ฑท ส่ี ากลยอมรบั และขอ จํากดั ตา งๆในขน้ั ตอนการพฒั นา
ผลิตภัณฑ

อยางไรก็ตามผูเรียบเรียงไดใชความพยายามในการรวบรวมและเรียบเรียงจากหนังสือ
ตําราตางๆ รวมทง้ั จากประสบการณเ พอ่ื ใหเ กดิ ความสมบรู ณม ากทส่ี ดุ แตก อ็ าจจะยงั มี
ขอบกพรอ งเกดิ ขน้ึ ซง่ึ ผเู รยี บเรยี งขอนอ มรบั ไว ณ ทน่ี ด้ี ว ย และผเู รยี บเรยี งขอขอบพระคณุ
คุณครูและอาจารยท ไ่ี ดใ หข อ คดิ และความรทู เ่ี กย่ี วขอ งกบั จลุ นิ ทรียจนผูเ รยี บเรยี งสามารถ
ดําเนินการทางดานนี้มาไดดวยดีโดยตลอด โดยเฉพาะ Dr. J. D. Brooks รองศาสตราจารย
ดร. ปรียา วิบูลยเศรษฐ อาจารยส นุ ทร วงศสวัสดิ์ อาจารยพ รทพิ ย อภิรักษติวงค และ
รองศาสตราจารย ดร. สายสมร ลํายอง เปน ตน

ผูเรียบเรยี งคาดหวงั วา หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียเลมน้ี สามารถใชเ ปน แนวทางในการ
วิเคราะหจ ลุ นิ ทรียโดยทว่ั ไป และสามารถประยกุ ตใ ชก บั ผลิตภณั ฑอ ุตสาหกรรมเกษตรตา งๆ ได
อยา งดี

รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี
ภาควชิ าเทคโนโลยกี ารพฒั นาผลติ ภณั ฑ
คณะอุตสาหกรรมเกษตร มหาวทิ ยาลยั เชยี งใหม

2545

สารบญั เรอ่ื ง

หองปฏบิ ตั ิการทางจลุ นิ ทรยี  หนา
เทคนคิ ทางจลุ นิ ทรยี  1
การฆา เชอ้ื และการระงบั การตดิ เชอ้ื 5
การเจอื จางตวั อยา ง 11
การเพาะเชอ้ื จลุ นิ ทรยี  15
หลักการและวิธีการตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียโดยวิธีนับจุลินทรียที่มีชีวิต 19
ทง้ั หมด( Viable plate count) 25
หลักการและวธิ ตี รวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรียบ นพน้ื ผวิ
หลักการและวธิ ตี รวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรียด ว ยกลอ งจลุ ทรรศน 36
ห ลั ก ก า ร แ ล ะ วิ ธี ต ร ว จ วิ เ ค ร า ะ ห  จุ ลิ น ทรี ย  โ ด ย ก า ร ก ร อ ง ผ  า น แ ผ  นเมมเบรน 40
( Membrane) 51
หลักการและวธิ ตี รวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรียโดยหาคา MPN (Most Probable
Number) 56
การวิเคราะหค ณุ ภาพอาหารโดยการรดี วิ สส ี
ความหมายของการตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียด ชั นี 65
การตรวจวเิ คราะห Coliform, Faecal coliform และ E.coli 70
การวเิ คราะห Faecal streptococcus 73
การศึกษาเชื้อราทมี่ ีความสําคญั กบั อาหาร 78
การแยกยีสตจ ากอาหารและศกึ ษาคณุ สมบตั บิ างประการ 80
การหา Thermal Death Time คา D และคา Z 83
เปรียบเทยี บการทนความรอ นของจลุ นิ ทรียช นดิ ตา งๆ 88
การใชแสงอุลตราไวโอเลตทําลายจลุ ินทรยี  92
การหาความช้ืนและประมาณคา Aw ของอาหาร 95
การยับยง้ั การเจรญิ ของจลุ นิ ทรียดว ยการลด Aw ของอาหาร 97
ประสทิ ธภิ าพของสารกนั เสยี (Preservatives) ในอาหารทม่ี คี วามเปน กรดตา งๆ กัน 101
การวิเคราะหนํ้า 103
การวิเคราะหเ ครอ่ื งดม่ื บรรจขุ วด 106
108

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียในผลติ ภณั ฑป ระเภทคารโ บไฮเดรต หนา
การวิเคราะหจุลินทรียในไขและผลิตภัณฑจากไข 111
116
การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียในอาหารหมักดอง 118
การศกึ ษาเชอ้ื จลุ นิ ทรียระหวา งการหมกั กะหล่ําปลี 120
การศกึ ษาเชอ้ื จลุ นิ ทรียและการเปลย่ี นแปลงระหวา งการหมกั ผลติ ภณั ฑแ หนม 123
การวเิ คราะหจ ลุ ินทรียในน้ํานม 126
การเกดิ เงาโลหะบน EMB agar 128
การตรวจนบั วิเคราะห Staphylococcus ในอาหาร 129
การตรวจวเิ คราะห Salmonella ในอาหาร 132
การวิเคราะหจ ลุ นิ ทรียประเภท Food poisoning bacteria 136
สารเรง ชวี ภาพหรอื เอนไซม 142
การตรวจสอบอาหารกระปอ ง 144
การวิเคราะหน มขน หวาน 160
มาตรฐานทางจลุ ินทรียของอาหารควบคมุ 162
การวิเคราะหท างจลุ นิ ทรยี ด ว ยวธิ เี รว็ 168
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยางนํ้าดม่ื 185
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยาง Cosmetic cleansing milk 187
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยาง Pharmaceutical tablets 189
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยางนมดิบ 191
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยางเครื่องดื่ม Cider 193
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในตัวอยาง Bicarbonated apple juice 194
การประยุกตใ ชว ิธกี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในการศึกษาประสทิ ธภิ าพของสารกนั เสยี 195
การประยุกตใชวิธีการวิเคราะหแบบเร็วในการศึกษาผลของสารยับยั้งการ 196
เจรญิ เติบโตของแบคทีเรยี
การตรวจสอบการปนเปอนของแบคทีเรียแกรมลบใน Drinking milk โดยใช 197
Impedance method
การตรวจสอบ Total Microbial activity ในนมและผลิตภัณฑน มโดยใช 198
Impedance method
การตรวจสอบ Coliforms ในนมและผลิตภัณฑนมโดยใช Impedance method 199
การทดสอบกลั่นกรองสาํ หรบั Enterobacteriaceae ในนมผงโดยวธิ ี Impedance 201
method
การตรวจสอบ Total Microbial activity ในเนื้อและผลิตภัณฑเนื้อโดยใช 202
Impedance method

การทดสอบกลั่นกรองสาํ หรบั Enterobacteriaceae ในเนื้อบดโดยวิธี Impedance หนา
method 203
การตรวจสอบ Salmonella กับอาหารเลย้ี งเชอ้ื Selenite-Cystine Media
(Easter-Gibson Media) โดยวิธี Impedance method 204
การตรวจสอบ Salmonella กับอาหารเล้ียงเช้ือรวมสองชนิด (Rappaport-
Vassiliadis & Easter-Gibson Media) โดยวิธี Impedance method 206
การใชแผน เพาะเชอ้ื ชนดิ แหง ในการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี 
วิธีใชแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงในการตรวจสอบAerobic count plates ในอาหาร 208
วิธีใชแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงในการตรวจสอบ Coliform and Escherichia coli 212
counts ในอาหาร 215
วิธีใชแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงในการตรวจสอบ Yeast and Mold counts ใน
อาหาร 219
วิธีใชแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงในการตรวจสอบ S.aureus counts ในอาหาร
วิธีใชแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงในการตรวจสอบ Enterobacteriaceae counts ใน 224
อาหาร 227
เอกสารอา งอิง
229

สารบัญตาราง

ตาราง หนา
28
1 ตัวอยางการรายงานผลการตรวจนบั จลุ นิ ทรียในอาหาร 58
2 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ
60
เจอื จางละ 3 หลอด
3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ 68
90
เจอื จางละ 5 หลอด
4 เกรดน้ํานมทม่ี กี ารตรวจสอบแบบ Methylene blue reduction test 91
5 เปรยี บเทยี บคา D และคา Z ของแบคทเี รยี ทม่ี บี ทบาทในเรอ่ื งของ
91
อาหารกระปอ ง 94
6 เปรยี บเทยี บคา D และคา Z ของจลุ นิ ทรียท่ีมบี ทบาทเกย่ี วขอ งกบั 99
100
การพาสเจอรไ รสอ าหาร 100
7 ตัวอยางขอมูลการหา Lethal rate 100
8 เปรียบเทยี บการทนความรอ นของจลุ นิ ทรียต า งๆ 104
9 คา AW ของสารละลายอม่ิ ตัวของสารตา ง ๆ ทอ่ี ณุ หภมู ติ า ง ๆ 104
10 เปรียบเทยี บระหวา ง Aw และความเขม ขน ของน้ําเกลือ 105
11 Aw ของน้ําบรสิ ทุ ธท์ิ อ่ี ณุ หภมู ติ า งๆกนั 139
12 คา Aw ตํ่าสุดสําหรบั จลุ นิ ทรียต า งๆ 144
13 การประยกุ ตใ ช Propionate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า 145
14 การประยกุ ตใ ช Sodium benzoate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า 150
15 การประยกุ ตใ ช Sorbate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า 151
16 ความแตกตางของ V.parahaemolyticus จากจลุ นิ ทรียอ น่ื ๆ
17 ความสมั พนั ธร ะหวา ง pH กบั จลุ นิ ทรียใ นอาหาร
18 ความสมั พนั ธร ะหวา งชนดิ จลุ นิ ทรียกบั ลกั ษณะทป่ี รากฏ
19 การวินิจฉัยการเสยี ของอาหารกระปอ ง
20 การวินิจฉัยการเสียของอาหารกระปอง (อาหารทม่ี คี วามเปน กรดต่ํา

pH≥4.5)

ตาราง หนา
21 การวินิจฉัยการเสยี ของอาหารกระปอ ง (อาหารทม่ี คี วามเปน กรดสงู 152

pH≤4.5) 159
22 ความสัมพันธระหวางอุณหภูมิและเวลาในการทําลายสปอรของ

Bacillus stearothermophilus ในสภาพเดยี วกัน

สารบญั ภาพ

ภาพ หนา

1 ลักษณะโตะ ปฏบิ ตั กิ ารจลุ นิ ทรยี  1
2 ประเภทของหลอดเลย้ี งเชอ้ื แบบตา งๆ 3

3 กระบอกใสปเปตและใสจานเลี้ยงเชื้อ 3

4 เข็มและหว งเขี่ยเชื้อ 3

5 ประเภทของปเปตตา งๆ 4

6 ขวดใสอ าหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภทตา งๆ 4

7 ลักษณะของ Ocular micrometer และ Stage micrometer 7

8 ลักษณะการวางจานเล้ียงเช้ือเพ่ือทดสอบการฆาเชื้อดวยแสง 13

อุลตราไวโอเลท

9 การทดสอบคุณสมบัตินาํ้ ยาฆา เชอ้ื จลุ นิ ทรยี  14

10 ตัวอยางการเจอื จางและเพาะเชอ้ื จลุ นิ ทรยี  18

11 การเพาะเชอ้ื แบบ Streak plate วิธีที่ 1 20

12 การเพาะเชอ้ื แบบ Streak plate วิธีที่ 2 21

13 การเพาะเชอ้ื แบบ Pour plate 23

14 การเพาะเชอ้ื แบบ Spread plate 24

15 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียโ ดยวธิ ี Drop plate 30

16 อุปกรณ Haemacytometer 41

17 อุปกรณ Howard mold counting chamber 46

18 การวาง Cover slip บนจานเพาะเชื้อในการศึกษาอิทธิพลของอากาศ 86

ตอ การเจริญเติบโตของยีสต

19 การเกิด การแข็งตัวของ Blood plasma 137

20 การเสื่อมเสียของอาหารกระปอ ง 158

21 วิวัฒนาการวิเคราะหจ ลุ นิ ทรยี  171

22 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียแ บบ DEFT 172

23 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามเทคนคิ Microcolonies 173

24 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามเทคนคิ Impedance 174

ภาพ หนา

25 การลดลงของ NADH ถูกวัดที่ 340 nm ใน Autoanalyser system 174

26 การวเิ คราะหจ ลุ ินทรียตามเทคนคิ Fluorescence staining 175

27 การวเิ คราะหจ ลุ ินทรียตามเทคนคิ Radiometry 175

28 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียตามเทคนคิ Bioluminescence 176

29 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Enzyme patterns 176-177

30 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Pyrolysis with GLC or mass 177

spectrophotometry

31 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Light scatter 178

32 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Charm test 178

33 กราฟการเจรญิ เตบิ โตของ Listeria 2 สายพนั ธุ ทใ่ี ช M-value และ 180

E-value ท้ัง 2 สายพนั ธเุ จรญิ ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทต่ี า งกนั 2 ชนดิ

Med I เปน Palcam-supplement ท่ีความเขม ขน ปกติ Med II เปน

Palcam-supplement ท่ีความเขม ขน 2 เทา

34 การเปรียบเทยี บวธิ ี Impedance method กับ Med I , Med II และ 182

FDA-broth (30 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง) สาํ หรบั Listeria

spp. จาก 120 ตัวอยางที่ตางกัน จากอาหาร 3 ประเภท

35 การวเิ คราะห M-value และ E-value ในนํ้าด่ืมในระบบทอ 185

36 การวิเคราะห M-value และ E-value ใน Cosmetic cleansing milk 187

37 การวิเคราะห M-value และ E-value ใน Pharmaceutical tablets 189

38 การวเิ คราะห M-value และ E-value ในตัวอยา งนมดิบ 191

39 การวเิ คราะห M-value และ E-value ในตัวอยาง Cider 193

40 การวิเคราะห M-value และ E-value ในตัวอยาง Bicarbonated 194

apple juice

41 การตรวจสอบประสิทธิภาพของสารกันเสีย 195

42 การตรวจสอบประสิทธิภาพของสารยับยั้งการเจริญเติบโตของ 196

แบคทเี รยี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 1

หอ งปฏบิ ตั กิ ารทางจลุ นิ ทรยี 

หองปฏบิ ตั กิ ารจลุ นิ ทรีย เปนหอ งทีม่ ีลักษณะเฉพาะทาง สง่ิ ทต่ี อ งพงึ ระมดั ระวงั อยา งยง่ิ

ในหองปฏบิ ตั ิการคอื ความสะอาด เนอ่ื งจากเปน หอ งทต่ี อ งใชใ นการตรวจสอบเชอ้ื จลุ นิ ทรยี 
ตางๆ การปฏิบัติการทุกครั้งตองสะอาด ปราศจากเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท ไ่ี มต อ งการหรอื มผี ลกระทบตอ
การตรวจสอบในแตละครั้ง หองปฏิบัติการถือวาเปนสิ่งแวดลอมอันดับแรกที่ตองพึงระวังเรื่อง
ความสะอาดอยา งมาก

โตะปฏิบัติการจะตอ งประกอบดว ยบรเิ วณทใ่ี ชใ นการเตรยี มตวั อยา ง สารเคมี อาหาร
เลี้ยงเชื้อที่ใชเปน ตน นอกจากนอ้ี าจจะตอ งมลี กั ษณะเปน ชน้ั ทม่ี กี ระจกสามารถปด เปด ไดส ําหรบั
เก็บอุปกรณที่จาํ เปน ตอ งใชป ฏบิ ตั กิ ารในแตล ะครง้ั เชนตะเกียงแอลกอฮอล อปุ กรณเ ขย่ี เชอ้ื
ขวดสารละลาย หรือหลอดทดลอง ผา ทําความสะอาด ไมข ดี ไฟ เปน ตน การจดั การบนโตะ
ปฏิบัติการเปนส่ิงสําคญั เชน กนั ความสะอาดบนโตะ จะตอ งเขม งวด และทําความสะอาดอยู
ตลอดเวลา และหา มมสี ง่ิ ของจดั วางไมเ ปน ระเบยี บบนโตะ ปฏบิ ตั กิ าร พน้ื โตะ อาจทําดวยวัสดุที่
สามารถทําความสะอาดไดอ ยา งดี และมปี ระสทิ ธภิ าพ มคี วามทนทานตอ สารเคมที ใ่ี ช รวมทง้ั
ความรอนดว ย อยา งไรกต็ ามบนโตะ อาจจะมกี ารตอ สายกา ซเพอ่ื ใชจ ดุ ตะเกยี งบนุ เซนได และ
อาจจะประกอบดว ยชดุ Laminar flow หรอื Biohazard เพ่ือใชใ นการเขย่ี เชอ้ื ทส่ี ําคญั รวมทง้ั
ศึกษาในรายละเอยี ดของเชอ้ื จลุ นิ ทรีย และอาจจะมีอางนาํ้ เพอ่ื ใชใ นการลา งทําความสะอาด
รวมทั้งเปน ที่ยอมสีจุลนิ ทรียดวย ดงั นน้ั อา งน้ําจะตองมีความสะอาดตลอดเวลา หา มมสี ง่ิ ของ
สกปรกติดอยู ตองสะอาดตลอดเวลา (ดงั ภาพ1)

ภาพ 1 ลกั ษณะโตะ ปฏบิ ตั กิ ารจลุ นิ ทรยี 

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 2

ขอควรระวงั ในการรกั ษาความสะอาด

เพอ่ื ปอ งกนั ไมใ หจ ลุ นิ ทรียเกิดการปนเปอ น เสือ้ ผาที่ผปู ฏบิ ตั กิ ารสวมอยคู วรมเี สอื้
สําหรับงานปฏบิ ตั กิ าร (Laboratory coat) สวมทับดานนอกทุกครั้งที่ทําการปฏบิ ตั ิการ และเมอ่ื
เริ่มและเสร็จส้ินการปฏบิ ัตกิ าร ตอ งเช็ดโตะปฏบิ ตั ิการดว ยน้ํายาฆา เชอ้ื ทเ่ี ตรยี มไว เพื่อปองกัน
เช้ือท่ีไมตองการไปปนเปอ นเชอ้ื ทก่ี ําลังตรวจสอบ นอกจากนไ้ี มค วรดม่ื สบู บหุ ร่ี หรอื นําวตั ถุ
ส่ิงของใดๆเขา ไปในปากขณะทํางานปฏบิ ตั ิการทางจลุ นิ ทรีย และไมค วรนําเครอ่ื งมอื อาหาร
เลี้ยงเชื้อ และเชื้อจุลินทรียใดๆออกไปนอกหองปฏิบัติการ อยางไรก็ตามเมื่อเกิดอุบัติเหตุหรือ
ทําเชื้อตกหรือหก หรอื ภาชนะทมี่ เี ชือ้ ตกลงแตกในหอ งปฏบิ ตั ิการควรเอาทชิ ชูวางลงบนเชือ้ แลว
เทนํ้ายาฆาเชื้อลงบนทิชชู หลงั จากนน้ั 15 นาที จงึ นํากระดาษทชิ ชไู ปทง้ิ ยงั ทก่ี ําหนด และทํา
ความสะอาดบรเิ วณนน้ั

เครื่องมือ เครอ่ื งใชต า งๆทม่ี เี ชอ้ื ตองนําไปแชใ นน้ํายาฆา เชอ้ื ทกุ ครง้ั หลงั จากใชแ ลว
เสมอ และหลังจากปฏิบตั กิ ารแลวเสร็จทกุ คร้งั ควรลางมือดวยสบหู รอื นาํ้ ยาลา งมอื เมื่อมือแหงดี
แลวทามือใหทั่วดวยแอลกอฮอลรอยละ 70

อุปกรณที่สําคญั ในหอ งปฏบิ ตั กิ ารทางจลุ นิ ทรยี 

1. ชุดตะเกียงแหลงกาํ เนดิ ความรอ น และกา ซ
สวนมากมักจะใชตะเกียงบุนเซนที่ตอติดกับทอตอกาซ แตบ างครง้ั กส็ ามารถใชต ะเกยี ง
แอลกอฮอลไดเชนกัน

2. เครอ่ื งมอื เจอื จางตวั อยา ง

การเจือจางตัวอยางอาจจะใชวิธีการเขยาในขวดอาหารเหลวปลอดเชื้อ หรอื ไมก อ็ าจจะ
ทําการปนในเครื่องปนที่ผานการฆาเชื้อแลว เชน Blenders ตางๆ นอกจากนอ้ี าจจะใชเ ครอ่ื งมอื
ทเ่ี รยี กวา Stomacher ซ่ึงเปนเครอ่ื งทใ่ี ชร ะบบตตี วั อยา งไปมา ดงั นน้ั จะตอ งมถี งุ พเิ ศษทส่ี ามารถ
ทนตอแรงตีของเครื่องมือได รวมทง้ั ถงุ ดงั กลา วตอ งผา นการฆา เชอ้ื มาแลว

3. หลอดเลี้ยงเชื้อ (Culture tube)

หลอดเล้ียงเชอ้ื มหี ลายขนาด ถา เปน หลอดทน่ี ยิ มใชจ ะเปน หลอดทไ่ี มม ขี อบทป่ี ากหลอด
อาจปดปากหลอดดวยจุกสําลี ฝาโลหะ ฝาพลาสติก ฝาเกลียว หรอื จกุ ยาง จกุ ยางหรอื ฝา
พลาสติกมักจะละลายไดถาลนปากหลอดเลี้ยงเชื้อรอนเกินไป ถา เปน ขวดนยิ มใช McCartney
bottles ขนาด 14 และ 28 มิลลิลิตร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 3

Culture tube Durham tube Culture tube
with screw cap with plastic closure with cotton plug

ภาพ 2 ประเภทของหลอดเลี้ยงเชื้อแบบตางๆ

4. กระบอกใสปเปต (Pipette can)และกระบอกใสจ านเลย้ี งเชอ้ื (Petri dish can)

Pipette can Petri dish can

ภาพ 3 กระบอกใสป เปตและใสจ านเลย้ี งเชอ้ื

5. เข็มและหวงเขี่ยเชื้อ (Transfer or inoculating needle or loop)

ภาพ 4 เข็มและหวงเขี่ยเชื้อ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 4

6. ปเปต (Pipette)

ภาพ 5 ประเภทของปเปตตา งๆ

7. ขวดใสอ าหารเลย้ี งเชอ้ื (Medium bottle)
7.1 Medical flat bottle

7.2 Screw cap medium bottle

7.3 McCartney vials and bottle
ภาพ 6 ขวดใสอ าหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภทตา งๆ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 5

เทคนคิ ทางจลุ นิ ทรยี 

1.! การเอาเชื้อออกจากหลอดทดลองโดยวิธี Aseptic techniques

อาจกลา วไดว า เทคนคิ ทางจลุ ชวี วิทยาท่ีใชก นั บอ ยครง้ั ทส่ี ดุ จะเกย่ี วกบั การถา ยเชอ้ื
(Transfer of cultures) ที่เลี้ยงไวในรูปเชื้อบริสุทธิ์ (Pure cultures) ซึ่งหมายถึงเชื้อที่เลี้ยงไว
เพียงชนดิ เดียวจากสง่ิ แวดลอมหนงึ่ (เชน หลอดหรอื จานเลย้ี งเชอ้ื ) ไปยังอีกสิ่งแวดลอมหนึ่ง แต
เน่ืองจากวา ในบรรยากาศและบนผวิ (Surface) ของสง่ิ ตา งๆในสง่ิ แวดลอ มจะมจี ลุ นิ ทรยี อ ยหู รอื
ติดอยูมากมายหลายประเภท จงึ มคี วามจาํ เปน ตอ งปอ งกนั เชอ้ื บรสิ ทุ ธท์ิ ม่ี อี ยไู มใ หเ กดิ การ
ปนเปอ น (Contamination) โดยจลุ นิ ทรียเ หลา นน้ั ได (Contaminants) การทเ่ี ชอ้ื บรสิ ทุ ธน์ิ น้ั จะ
บริสุทธิ์อยูไดตลอดไป ทุกส่ิงทุกอยางทน่ี ํามาสมั ผสั กบั เชอ้ื นน้ั จะตอ งไมม เี ชอ้ื อน่ื ใดตดิ อยู
กลาวคือจะตองปราศจากเชื้อหรือปลอดเชื้อ (Sterile) นน่ั เอง

การปองกันมิใหเกดิ การปนเปอ นดงั กลา ว ในขณะทม่ี กี ารถา ยเชอ้ื นน้ั สามารถกระทําได
โดยอาศยั เทคนคิ ในการทําใหปลอดเชื้อ (Aseptic techniques) ซ่ึงมขี น้ั ตอนดงั น้ี

1.1 ถือหวงลวด (Wire loop) ระหวางนิ้วหัวแมมือและนิ้วชี้ของมือขวา
1.2 นําไปทําใหป ราศจากเชอ้ื หรอื ปลอดเชอ้ื โดยนําไปเผาดว ยเปลวไฟจากตะเกยี ง
บุนเซน ใหร อ นแดงประมาณ ! ของความยาวลวด หรอื เปน ไปไดก ท็ ําใหร อ นแดงทง้ั หมดเทา ท่ี
จะทําไดเพื่อเปนการประกันความปลอดเชื้อนั่นเอง
1.3 ทิ้งไวใหเย็นสักครู ประมาณ 10-15 วินาที
1.4 ใชนว้ิ กอยของมือขวายึดจุกสําลีของหลอดทดลอง หรือจับที่ปากปดของหลอด
ทดลอง หรือขวดทดลอง โดยยึดไวพรอมๆกับถือหลอดหรือขวดทดลองในมือซาย
1.5 ดึงจุกสําลี/ฝาปด ออกโดยการเปด แบบบดิ ไมใชดึงออกตรงๆ ถาเปนขวดฝาเกลียว
ใหเปด ฝาขวดกอ นโดยใชน้ิวหัวแมม ือและนิ้วชี้ของมอื ซา ย
1.6 ลนปากหลอด / ขวดทดลองอยางรวดเร็วบนเปลวไฟ
1.7 สอด Loop ลงไปในหลอด / ขวดทดลอง และแตะเชื้อที่ขึ้นอยูบนอาหารเลี้ยงเชื้อใน
หลอด / ขวดทดลองอยางเบาๆ
1.8 ดึง Loop ออกจากหลอด / ขวดทดลอง โดยไมใหสัมผัสกับผิวในของหลอด / ขวด
ทดลอง และเอาปากหลอด / ขวด ลนไฟอยา งรวดเรว็
1.9! ใสจุกสําลลี งไปพรอ มทง้ั บดิ ใหแ นน ถาเปนขวดฝาเกลียวก็ใหใชนิ้วหัวแมมือ
และนิ้วชี้ที่ถือฝาขวดไว ปด ฝาขวดใหแ นน ดังเดมิ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 6

เชื้อที่ไดบน Loop โดยวิธนี จ้ี ะนําไปใสบนสไลดเพื่อดูของสด (Wet mount) ดวยวิธีการที่
จะกลาวตอไป

2.การเตรียมสไลดเพื่อดูของสด (Wet mount)

การเตรียมสไลดเพื่อดูเชื้อบริสุทธิ์ที่เขี่ยมาไดจากหลอด / ขวดทดลองนั้น มวี ธิ ีการท่ี
สามารถอธบิ ายไดด งั น้ี

2.1!เอานํ้าใสล งบนสไลดที่สะอาด 1 หยด โดยใชหวงลวดไปแตะนํ้า และนํามาแตะลง

บนสไลด

2.2!ใชหวงลวดแตะเชื้อจากหลอด / ขวดเลี้ยงเชื้อ (โดยวิธี Aseptic techniques) มา

ผสมกับหยดนํ้าบนสไลด แลวฆาเชื้อบนหวงลวดเสียกอนที่จะวางหวงลวดลง
2.3!ปดกระจกปด สไลดลงบนหยดนา้ํ
2.4!ใชกระดาษซับนาํ้ ที่มากเกินพอออก
2.5!นําไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน ดวยกาํ ลงั ขยายตางๆ กัน

3.การใชห ัวนํ้ามนั ของกลอ งจลุ ทรรศน

ในการตรวจดดู ว ยกลอ งจลุ ทรรศนน้ัน บางครง้ั มคี วามจําเปนตองใชหัวนํ้ามนั ในการ

ตรวจวิเคราะห ซง่ึ มขี น้ั ตอนตา งๆ ดงั น้ี
3.1!ตั้งกลองโดยปรับแสงและหมุน Condenser ข้ึนจนเกอื บสดุ
3.2!วางสไลดท ต่ี อ งการจะดภู าพ ลงบน Stage ของกลอง
3.3!หมนุ Objective ใหเขา ที่ โดยเรม่ิ จาก Objective ท่ีมีกําลังขยายตํ่าสดุ กอ น

แลวเปลี่ยนกําลังขยายใหสูงขึ้นตามลําดบั ปรับโฟกัสและหาตาํ แหนง ทเ่ี หมาะสมท่ี

ตองการจะศึกษา โดยการเปลย่ี น Objective น้ันใหจ บั ท่ี Revolving nose-piece
3.4!หมนุ Stage ลงพอประมาณ แลวหยดน้ํามนั ลงไปบนสไลดท บ่ี รเิ วณทต่ี อ งการดู

3.5!เลื่อน Oil immersion objective ใหเ ขา ทแ่ี ละหมนุ Stage ขึ้นจนกระทั่งหยดนํ้ามนั

น้ันสมั ผสั กบั ปลาย Objective (ควรระวังอยา หมนุ Stage ข้ึนมากเกนิ ไป เพราะ

จะทําให Objective กระแทกกบั สไลด ทาํ ใหส ไลดแ ตก และทําใหก ลอ งจลุ ทรรศน

เสียหายใชก ารไมไ ดต อ ไป)
3.6!ปรับภาพใหช ดั เจนดว ยปมุ ปรบั ภาพอยา งละเอยี ด (Fine adjustment)
3.7!หลังจากดูเสร็จแลว ใหใ ชป มุ ปรบั ภาพอยา งหยาบ (Coarse adjustment) หมนุ

Stage ลงกอนดึงสไลดออก
3.8!เช็ดน้ํามันออกจากหัวนํ้ามนั ทกุ ครง้ั เมอ่ื ใชก ลอ งจลุ ทรรศนเ สรจ็ เรยี บรอ ยแลว

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 7

4. การวดั ขนาดของจลุ นิ ทรยี 

การวดั ขนาดของจลุ นิ ทรียน้ัน กระทําไดโดยใชเ ครอื่ งมือทเ่ี รียกวา Micrometer ซง่ึ
ประกอบดว ย Ocular micrometer และ Stage micrometer

Ocular micrometer Stage micrometer

ภาพ 7 ลักษณะของ Ocular micrometer และ Stage micrometer

4.1! Ocular micrometer เปนแผนแกวกลม ตรงกลางจะมีสเกลแบงออกเปนสวนๆ ซง่ึ ไม

ทราบขนาดของสเกลทแี่ นนอน
4.2 Stage micrometer ลักษณะเหมือนสไลด ตรงกลางเปนสเกลที่วัดไวแนนอนแลวคือ

แตละเสน (1 ชอง) จะหา งกนั 0.01 มิลลิเมตร Stage micrometer น้ีใชเ ปน มาตรฐาน
ในการคํานวณหาระยะกวา งของสเกลบน Ocular micrometer ในการคํานวณหาขนาด
ของสเกลบน Ocular micrometer น้ันทําไดดังนี้

4.2.1 ใส Ocular micrometer โดยใสด า นทม่ี รี อยสเกลลงบนไดอาแฟรมของ Ocular
ของกลองจุลทรรศน

4.2.2! วาง Stage micrometer ลงบน Stage ของกลอง
4.2.3! ปรับปุมปรับภาพเพื่อทําใหเห็นสเกลของ Stage micrometer ชดั เจน

4.2.4! เลื่อน Ocular และ Stage micrometer ใหส เกลของทัง้ สองมาอยูขนานกนั และ
ใหบางสวนเชื่อมตอกันหรือทับกัน ดังรูปใหเสนแรกของสเกลของ Ocular
micrometer ทับกับเสนแรกของสเกลของ Stage micrometer ทางซา ยมอื

4.2.5! นับไปทางขวามอื ดูวาเสนที่เทาไรตอไปของ Micrometer ทั้งสองเสนทับกัน

4.2.6! เน่ืองจากทราบระยะระหวางเสน บน Stage micrometer จึงสามารถหาระยะ
ระหวางเสนบน Ocular micrometer ไดโดยการคํานวณ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 8

ตวั อยา ง

20 ชองของ Ocular micrometer เทา กบั 50 ชองของ Stage micrometer
แตทราบแลววา 1 ชองของ Stage micrometer เทา กบั 0.01 มลิ ลิเมตร
ดังนน้ั 20 ชองของ Ocular micrometer เทา กบั 50 x 0.01 มิลลิเมตร
นน่ั คอื 1 ชองของ Ocular micrometer เทา กบั 50 x 0.01 มิลลิเมตร

20
เทา กบั 0.025 มิลลิเมตร
เทา กบั 25 Microns

เมื่อใช Ocular micrometer ในการวัดขนาด ขนาดจะอานออกมาเปน Micron เชน ถา
จุลินทรียที่ดูในกลองจลุ ทรรศนมีขนาดเทากับสเกลบน Ocular micrometer 5 ชอง จลุ นิ ทรยี น น้ั
จะมีขนาด 125 Microns

เมื่อใช Objectives ท่ีมีกําลงั ขยายสงู ขน้ึ สเกลบน Stage micrometer จะถกู ขยายมาก
ข้ึน ทําใหจํานวนชอ งของ Ocular micrometer ตอจาํ นวนชอ งของ Stage micrometer เปลี่ยน
ไป จึงตองคํานวณหาขนาดของสเกลของ Ocular micrometer ใหมท กุ ครง้ั ทเ่ี ปลย่ี น Objective
นอกจากนี้เมื่อนาํ Micrometer ไปใชกับกลองจุลทรรศนกลองใหม ขนาดของสเกลของ Ocular
micrometer ก็จะไมเทากับท่ีคํานวณไดจากกลองเดิมเมื่อใชกําลงั ขยายตางๆกนั จึงตองคํานวณ
หาสเกลของ Ocular micrometer ใหมด ว ยทกุ ครง้ั

5.การยอ มสแี กรม

ในการยอมสีแกรมเปนเทคนิคในการจําแนกประเภทของจุลินทรียและชวยใหเห็นเซล
ของจุลินทรียใ นกลองจลุ ทรรศนไ ดอ ยางชัดเจน เทคนคิ นม้ี ขี น้ั ตอนดงั น้ี

5.1!นําสไลดม าวางยงั ทย่ี อ ม หยดนํา้ ยา Crystal violet (ประกอบดว ย Crystal violet;
gentian violet 0.5 กรัม ในน้ํากลั่น 1ลิตร) ปลอยทง้ิ ไวน าน 30-60 วินาที

5.2!เทสีออก ลางดว ยนํ้ายาไอโอดนี และใสนํ้ายาไอโอดนี ไวน าน 1-2 นาที เพื่อชวยใหสี
ติดดีขึ้น (Mordant)

5.3!ลางดว ยน้ํากอกที่ไหลออนๆ สลัดนํ้าออกจากสไลดจนหมด
5.4!ใชนํ้ายาลา งสี (Decolorizer; ประกอบดวยเอทธานอลรอยละ 95 จํานวน 250

มลิ ลิลิตร และAcetone 250 มลิ ลิลิตร) หยดใหไหลผานสไลดจนนํ้าทห่ี ยดผา นไมม สี ี
ติดออกมาดวย ขั้นนี้ใชเวลา 20 วินาทีถึง 1 นาที ขน้ึ อยกู บั ความหนาบางของเชอ้ื ท่ี
ทาลงบนสไลด ระวังอยาลางสีออกมากเกินควร เพราะจะทําใหผลที่ไดผิดพลาด

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 9

5.5!ลางดวยนาํ้ อยา งรวดเรว็ สลัดนํ้าออกจากสไลดจ นหมด
5.6!ยอ มควบดวยสียอมควบคู (Counterstain) คือ Safranin (ทป่ี ระกอบดว ย Safranin

2.5 กรัม ในเอทธานอล 100 มิลลิลิตร เมอ่ื ตองการนํามาใชใ หเ จอื จางลงอีก 5-10

เทาโดยใชนํ้ากลั่น) นาน 30-60 วินาที
5.7!ลางออกดวยนาํ้
5.8!ซับน้ําออกและปลอยใหสไลดแหง แลวดูดวยหัวนํ้ามนั ของกลอง

แบคทีเรียท่ีเปน แกรมบวกจะตดิ สมี ว งหรอื สนี ้ําเงนิ ของ Crystal violet สวนพวกที่เปน
แกรมลบจะตดิ สแี ดงหรอื สชี มพขู อง Safranin

6. การยอ มสีสปอร

แบคทเี รยี ประเภท Bacillus และ Clostridium จะสรางสปอร ซง่ึ เปน สภาพของเซลทม่ี ี
ความทนทานสูงกวาเซลปกติ การยอมสีสปอรจะทาํ ใหเ หน็ เซลดังกลา วชดั เจนมากขน้ึ ซง่ึ มี
วธิ กี ารดงั น้ี

6.1 ใชเ ชอ้ื จลุ นิ ทรียทต่ี อ งการยอ มสปอร มา Smear บางๆ ลงบนสไลด
6.2 เอาสไลดท่ีทําใหแ บคทเี รยี ตดิ แนน บนสไลด โดยการนําไปลนไฟมาแลววางบนท่ี
ยอ ม
6.3 ใสสี Malachite green (ประกอบดว ย Malachite green รอยละ 5 ในน้ํากลั่น) ลง
บนสไลดจ นทว ม ใชเปลวไฟออนๆจากตะเกียงบุนเซนเผานานประมาณ 5 นาที คอยระวังอยา
ใหน ้าํ สแี หง ทิ้งสไลดไวใหเย็น
6.4 ใชนํ้าลา งสไลด แลวซับใหแหง
6.5 ใสสี Safranin ลงไปทิ้งไว 1 นาที
6.6 ลางดวยนํ้าและซบั ใหแ หง
6.7 สองดูดวยกลองจุลทรรศน โดยใชห วั น้ํามนั สปอรจ ะตดิ สเี ขยี ว เซลธรรมดาจะตดิ
สีแดง

7. การยอ มสเี พอ่ื แสดงแคปซลู

แบคทีเรียหลายชนดิ จะมสี ง่ิ หอ หมุ ตวั ซง่ึ เปน สารประกอบพวก Polysaccharide หรอื
Polypeptide ถาสารเหลานี้มีเปนจํานวนมากจะทําใหเ กดิ โครงสรา งทเ่ี รยี กวา แคปซลู แคปซลู
ของแบคทีเรียที่มีอยูในเลือดหรือในเนื้อสัตวนั้น มกั จะมองเหน็ ไดจ ากการยอ มสแี กรม โดยเปน
บริเวณที่ไมติดสีอยูลอมรอบตัวแบคทีเรีย ในการทจ่ี ะทําใหแ คปซลู ของแบคทีเรยี ท่จี ะศึกษาเหน็
เดนชัดขึ้นจะตองใชเทคนิคพิเศษ เทคนคิ ทใ่ี ชใ นการยอ ม Flagella สามารถนํามาใชใ นการยอ มสี
แคปซลู ได แตวิธีที่งายมีดังตอไปนี้

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 10

7.1 ใชหวงลวดแตะ Indian-ink มาใสบ นสไลด 1 หยด
7.2 ผสมเชอ้ื แบคทเี รยี 1 หยด กับ Indian-ink ใหเขากัน
7.3 ปดดวยกระจกปดสไลด ระวงั อยา ใหม ฟี องอากาศ ใชก ระดาษทชิ ชวู างบนกระจก
ปด สไลด กดใหแนน ระวังอยาใหกระจกปดสไลดแตก
7.4 ตรวจดูแคปซูลโดยใชห ัวนํ้ามนั จะเหน็ แคปซูลเปนบรเิ วณขาวใสอยูลอ มรอบตัว
แบคทเี รยี

8. การยอ มสี Acid fast

แบคทเี รยี ประเภท Mycobacterium มีลักษณะเฉพาะทางเคมี โดยมสี ารจําพวกไขมนั
ซึ่งสามารถยอมไดดวยสีที่มีฤทธิ์เปนดางและสารละลายอยูใน Phenol เน่ืองจากมนั ตดิ สยี อ มไดด ี
มากแมจะลางดวยแอลกอฮอลที่มีฤทธิ์เปนกรดก็ไมออก เนอ่ื งจาก Mycobacterium ประกอบ
ดวยแบคทีเรียที่มคี วามสําคญั ทางการแพทย เชนพวกท่ีทําใหเกิดโรควัณโรคและโรคเรื้อน
เทคนคิ การยอ มสดี ว ยวธิ นี ม้ี ดี งั น้ี

8.1 เอาสไลดท ท่ี าเชอ้ื บางๆ ไปลนไฟใหต ดิ แนน แลววางบนทย่ี อ ม ใสสี Carbonfuchsin
(ประกอบดว ย Basic fuchsin 0.25 กรมั Absoluted ethanol 10 มลิ ลิลิตร และ Phenol รอ ยละ
5 ในน้ํากลั่น 100 มิลลิลิตร) ยอ มนาน 5 นาที

8.2 ลางสีออกดวยนาํ้ และตามดวยแอลกอฮอลที่มีฤทธิ์เปนกรดอีกครั้งหนึ่ง
8.3 ใชนํ้ายา Methylene blue (ประกอบดว ย Methylene blue 0.3 กรัม ในน้าํ กลั่น 100
มลิ ลิลิตร) ยอมควบคูโดยใสลงบนสไลด 1 นาที ลางดวยนํ้าและซบั ใหแ หง
8.4 สองดูดวยกลองหัวนํ้ามนั เซลทเ่ี ปน Acid fast จะติดสีแดง ทไ่ี มเ ปน Acid fast จะ
ติดสีนาํ้ เงนิ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 11

การฆาเช้อื และการระงบั การตดิ เชอื้

ความรเู กย่ี วกบั การฆา (Killing) การกําจดั (Removing) หรือการระงบั การเจรญิ เติบโต
(Inhibition of growth) ของจลุ นิ ทรีย นับวา เปน สว นสําคัญของจุลชีววิทยา ซ่ึงจะนําไปใชใ นการ
ปองกันการเกดิ โรคในมนษุ ย สัตว และพืช ปอ งกนั การบดู เสยี หรอื เนา เสยี ของอาหารตา งๆ และ
ปองกันการแทรกสอด (Interference) หรือปนเปอ น (Contamination) โดยจลุ นิ ทรยี ช นดิ อน่ื ใน
งานที่เกี่ยวกับเชื้อบริสุทธิ์ในหองปฏิบัติการ เชน การวนิ จิ ฉยั การคน ควา หรอื ในทางอุตสาหกรรม
เพื่อวาจะไดไมสับสนในการศึกษาและอื่นๆ วิธีการที่สําคัญในการฆา กําจดั หรอื ระงบั การเจรญิ
เติบโตดงั กลา วจะรวมอยใู นกระบวนการทเ่ี รยี กวา Sterilization และ Disinfection

Sterilization หมายถึงการทําใหป ราศจากเชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีมชี วี ติ ทง้ั ปวง รวมทง้ั ไวรสั
แบคทเี รยี และสปอรของเชื้อแบคทีเรีย เชอ้ื ราและสปอรข องเชอ้ื รา ทง้ั พวกทเ่ี ปน อนั ตราย
(Pathogenic organisms) และไมเ ปน อนั ตราย (Non-pathogenic organisms) ใหหมดสิ้นไป
เชนอาจกระทําไดโ ดยอาศยั กรรมวธิ ที างฟส กิ สเ ชน การใชค วามรอ น ทง้ั ความรอ นแหง (Dry heat)
และความรอ นชน้ื (Moist heat) นอกจากนอ้ี าจเปนการใชร ังสี เชน Ultraviolet หรือโดยการ
กรอง(Filtration) และอาจจะกระทําไดโ ดยกรรมวธิ ที างเคมี เชน การใชส ารเคมตี า งๆ
(Preservatives) กา ซตางๆ เปน ตน

Disinfection หมายถึง การฆา หรอื กาํ จดั จลุ ินทรียท่ีเปนหรอื อาจเปน อนั ตราย
Disinfection ไมจําเปน ตอ งรวมถงึ การ Sterilization ถึงแมวากรรมวิธีบางชนิดจะเปน การ
Sterilization อยา งไรกต็ าม Disinfection อาจจะกระทําไดโ ดยใชส ารเคมี เชน Carbolic acid,
Alcohol และ Mercuric chloride เปนตน ตัวที่กระทาํ ใหป ราศจากเชอ้ื หรอื ระงบั การตดิ เชอ้ื โดย
วิธี Disinfection เรียกวา Disinfectants

สวนการฆา หรือกําจดั จลุ นิ ทรยี ท ท่ี ําใหเ กดิ โรคภายในรา งกายของมนษุ ยแ ละสตั วน น้ั มกั
ใชสารเคมที เ่ี รยี กวา สารปฏชิ วี นะ (Antibiotics) ซ่ึงหมายถงึ สารเคมที ผ่ี ลติ ขน้ึ โดยจลุ นิ ทรยี 
สวนใหญเ ปน พวกราและแบคทเี รยี ซง่ึ มผี ลในการฆา (เชน เปน Bactericidal) หรือระงบั การ
เจรญิ เติบโต (เชน เปน Bacteriostatic) ของจลุ นิ ทรียช นดิ อน่ื ตัวอยางไดแก Penicillin,
Tetracycline, Chloramphenical และ Streptomycin นอกจากนี้ยังอาจใชสารเคมีที่สังเคราะห
ข้ึนทเ่ี รยี กวา Chemotherapeutic agents เชน Sulphonamides

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 12

ความจําเปนในการฆา เชอ้ื และปอ งกนั การตดิ เชอ้ื

ใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื Nutrient agar 6 จาน ปฏบิ ตั ิดงั น้ี
จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1 และ 2 ใชห ว งสวดที่ยังไมไดฆา เช้ือ ลากเบาๆไปมาบน
ผิววุนในจานอาหารเลย้ี งเชอ้ื ดงั กลา ว
จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3 และ 4 ใชหวงลวดอันเดียวกัน แตนําไปฆา เชอ้ื โดยเผา
ดวยเปลวไฟจากตะเกียงบุนเซน รอสักครูใหเย็น แลว ลากเบาๆไปมาบนผวิ วนุ ในจานอาหาร
เลี้ยงเชื้อดังกลาว
จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 5 และ 6 เปดฝาจานเลี้ยงเชื้อออก ปลอ ยใหว นุ ในจานไดร บั
อากาศนาน 10 นาที แลวปดฝา
นําจานอาหารเลี้ยงเชื้อทั้ง 6 จานไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30-32 องศาเซลเซียส
นาน 24-48 ชว่ั โมง สงั เกตการขน้ึ โคโลนขี องเชอ้ื จลุ นิ ทรีย ซ่ึงพบวา จานอาหารเลย้ี งเชอ้ื ท่ี 1,2 ,5
และ 6 มกี ารขน้ึ ของโคโลนขี องเชอ้ื จลุ นิ ทรยี 

การฆาเชื้อจุลินทรียดวยความรอน

ความรอนมีผลตอการมีชีวิตของเชื้อจุลินทรีย โดยท่ีความรอนไปทําลายการทํางาน
ของเอนไซม หรือโปรโตพลาสซึมของเซล โดยทําใหเ กดิ ความผดิ ปกตขิ องเซลไปจากธรรมชาติ

นอกจากความรอนจะเปนตัวการสําคญั ในการทาํ ลายเซลจลุ นิ ทรียแลว ปรมิ าณน้าํ ทม่ี ใี นอาหาร
ความเปนกรดเปนดาง ซง่ึ มกั จะเปน ปจ จยั รว มกบั ความรอ นในการทําลายเซลจลุ นิ ทรยี 

การทดสอบการฆาเชื้อดวยความรอน

1.! ทําเครื่องหมายบนหลอดทดลองและจานเลี้ยงเชื้อ ชอ่ื จลุ นิ ทรียทใ่ี ชใ นการ
ทดลอง อุณหภมู ิที่ใชในการทดลอง ดงั น้ี

ก.! ไมไดน ําไปใหค วามรอ น (Control)
ข.! ใหค วามรอ นท่ี 30 องศาเซลเซยี ส
ค.! ใหค วามรอ นท่ี 50 องศาเซลเซยี ส
ง.! ใหค วามรอ นท่ี 75 องศาเซลเซยี ส
จ.! ใหค วามรอ นท่ี 100 องศาเซลเซียส
ฉ.! ใหค วามรอ นท่ี 121 องศาเซลเซียส

2.! เขยา ขวดทม่ี เี ชอ้ื E.coli หรอื B. subtilis ท่ีมีอยใู นอาหารเหลว เพื่อใหเชื้อมีการ
กระจายตัวที่สมาํ่ เสมอ

3.! เอาปเปต 10 มิลลิลิตรออกโดยวิธีปลอดเชื้อ และดูดเชื้อในอาหารเหลวมา 6

มลิ ลิลิตร ใสลงในหลอดทดลองทั้ง 6 หลอดหลอดละ 1 มิลลิลิตร ใสปเปตที่ใช
แลวลงในภาชนะทม่ี นี ้ํายาเชอ้ื เชอ้ื ผสมอยู
4.! นําหลอดท่ี 1 ตั้งไวที่อุณหภูมิหอง สวนหลอดที่ 2, 3, 4 และ 5 นําไปแชใ น

Water bath ทิ้งไวสักครูเพื่อรอใหอุณหภูมิของหลอดเทากับอุณหภูมิของ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 13

Water bath แลวจับเวลาใหแตละหลอดอยูที่แตละอุณหภูมิ นาน 10 นาที สวน
หลอดท่ี 6 ใหน ําไปใหค วามรอ นใน Autoclave ท่ีอณุ หภมู ิ 121 องศาเซลเซยี ส
นาน 10 นาที
5.! เมื่อครบ 10 นาทแี ลว นําหลอดทง้ั หมดไปตรวจหาเชอ้ื จลุ นิ ทรีย โดยเชอ้ื จาก
หลอดแตละหลอดลงในจานเลี้ยงเชื้อเปลาแตละจาน ทาํ เครอ่ื งหมาย นําวนุ ท่ี
หลอมละลายใน Water bath 50 องศาเซลเซยี ส มาเทลงในจานแตล ะจาน หมนุ
ไปมา เพ่ือผสมเชอ้ื ใหเ ขา กนั ในแตล ะจาน การผสมนจ้ี ะตอ งดําเนนิ การดว ย
ความรวดเรว็ กอ นทว่ี นุ จะแขง็ ตวั
6.! เมื่อผสมกนั ดแี ลว ปลอยใหวุนแข็งตัว แลว กลบั จานจากบนเปน ลา ง สวนหลอด
ท่ีเทเช้ือออกหมดแลว ใหใ สล งในภาชนะทม่ี นี ้ํายาฆา เชอ้ื อยู

การใชแ สงอุลตราไวโอเลทในการฆา เชอ้ื และปอ งกนั เชอ้ื

การทดลองสามารถแสดงไดดังนี้
1.! ใชสําลที พ่ี นั ปลายไม จมุ เชอ้ื E.coli หรอื B.subtilis ที่เจริญอยูในอาหารเหลว

พอชุม กดสําลีที่ขางขวดแลวบิด เพื่อไมใหนํ้าโชกสาํ ลจี นเกนิ ไป
2.! นําไปกวาดบนผวิ วนุ ในจานเลย้ี งเชอ้ื จนทว่ั
3.! ทิ้งไวสักครู เพื่อใหนํ้าบนผวิ วนุ แหง โดยวนุ ดดู น้ําเขา ไป

4.! นําจานเลี้ยงเชื้อดังกลาวไปเปดรับแสงอุลตราไวโอเลท โดยใหห า งจากตน
กําเนิดแสงประมาณ 76 มิลลิเมตร นาน 10 นาที เมอ่ื เสรจ็ เอาฝาปด จาน
เลี้ยงเชื้อไวดังเดิม

แหลงกําเนดิ แสงอุลตราไวโอเลท

76 มิลลิลิมตร

ภาพ 8 ลกั ษณะการวางจานเลย้ี งเชอ้ื
เพ่ือทดสอบการฆา เชอ้ื ดว ยแสงอุลตราไวโอเลท

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 14

คุณสมบตั ขิ องยาฆา เชอ้ื จลุ นิ ทรยี 

ในการทดสอบคุณสมบตั ขิ องยาฆา เชอ้ื จลุ นิ ทรยี ส ามารถดาํ เนนิ การไดด งั น้ี

1.! ใชไมที่มีสําลพี ันปลาย จมุ เชือ้ ในขวดอาหารเหลว โดยกดสําลกี บั ขา งขวด
และบิด เพื่อไมใหนํ้าโชกเกนิ ไป

2.! นําไปลากบนผิววุนในจานเล้ียงเชอื้ 1 เสน
3.! ใชไมที่มีสําลีพันปลาย จมุ เชอ้ื ใหมม าลากบนผวิ วนุ ทาํ เชน นจ้ี นครบ 4 เชอ้ื

( E.coli , B subtilis, Pseudomonas aeruginosa และ Staphylococcus
aureus) ขอ ควรระวงั คอื เช้อื Pseudomonas aeruginosa ปลอย
สารปฏิชวี นะได ดงั นน้ั ควรลากเสน ใหหา งจากเชอ้ื อืน่ เพื่อกันผลผิดพลาด
4.! ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลแลวเผาไฟเพื่อฆาเชื้อ ปลอยใหเย็นลงแลวคีบเอา
แผนกระดาษกรองออกจากขวดที่ใสโดยวิธี Aseptic techniques นําไปจุม
ลงในน้ํายาฆา เชอ้ื จนเปย กทว่ั แผน (น้ํายาที่ตองการทดสอบ เชน
แอลกอฮอลรอยละ 70 หรอื HgCl รอ ยละ 0.1 หรอื Chlorox หรอื
Listerine) แลวดงึ แผน กระดาษกรองออกเบาๆ ระวังอยา ใหก ระดาษฉกี
แลวนําไปวางบนแผนวุนในจานโดยใหกระดาษต้ังฉากกับเสนที่ลากเพาะ
เช้ือ ทง้ิ ไวส กั ครจู งึ กลบั จานเลย้ี งเชอ้ื

เชื้อที่ 1 กระดาษกรองชุบน้ํายา
เชื้อที่ 2

เชื้อที่ 3
เชื้อที่ 4

ภาพ 9 การทดสอบคณุ สมบตั ิน้ํายาฆา เชอ้ื จลุ นิ ทรยี 

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 15

การเจอื จางตวั อยา งอาหาร

1. หลกั การ

การตรวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ ินทรียด ว ยวิธตี า ง ๆ น้ันมีความจําเปน ตอ งทําใหต วั อยา ง
อาหารเจือจางลงไปจนถงึ ระดบั ทจ่ี ะตรวจนบั ดว ยวธิ นี น้ั ๆ ไดถูกตองและแมนยํา ซ่ึงมีขอ กําหนด
ไวในแตละวิธี และตองเขยา ใหต วั อยา งอาหารกระจายอยใู นน้ํายาสําหรบั เจอื จาง (Diluent)
อยางทั่วถึงเปนเนื้อเดียวกัน (Homogenous)

2. ปริมาณตวั อยา งอาหารทใ่ี ชว เิ คราะห

ปริมาณตัวอยางอาหารท่ีใชวิเคราะหแตละครั้งขึ้นกับวาอาหารน้ันมีลักษณะเปน
เน้ือเดยี วกนั มากนอ ยแคไ หน โดยปกตแิ ลว ไมค วรใชต วั อยา งอาหารนอ ยกวา 10 กรมั
สวนมากนยิ มใช 25-50 กรมั

3. น้ํายาสําหรบั เจอื จาง (Diluent)

น้ํายาสําหรบั เจอื จางทจ่ี ะใชข น้ึ อยกู บั วตั ถปุ ระสงค และชนดิ ของจลุ ินทรียท จ่ี ะตรวจ
วิเคราะห ดงั น้ี

วัตถุประสงคการใช นา้ํ ยาสําหรบั เจอื จาง

ตรวจวเิ คราะหท ว่ั ๆ ไป 1. Phosphate buffer
2. น้าํ เกลอื ปกติ (รอ ยละ 0.85)
อาหารทม่ี ไี ขมนั สงู 3. เปบโตนรอ ยละ 0.1 ในน้ํา
ตรวจวิเคราะห Osmophile 4. เปบโตนรอยละ 0.1 Tween 80 รอ ยละ 0.05
ตรวจวิเคราะห Halophile เปบโตนรอ ยละ 0.1 วุนรอยละ 0.15
น้ํายาซูโครสรอยละ 10
น้ําเกลือรอ ยละ 3-18

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 16

4.การเตรยี มตวั อยา งอาหาร

4.1 อาหารทแ่ี ตล ะหนว ยเปน ชน้ิ เลก็ ๆ นํามารวมกนั ชง่ั ใหไ ด 50 กรมั ในภาชนะท่ี
ปราศจากจลุ นิ ทรยี 

4.2 อาหารซง่ึ แตล ะหนว ยเปน ชน้ิ ใหญม าก ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟจับชิ้น
อาหารไวแลวตัดอาหารใหเปนหนวยยอยดวยมีดซึ่งจุมแอลกอฮอลและลนไฟเชนเดียวกัน
ควรตัดอาหารจากหลาย ๆ บรเิ วณของอาหารกอ นนน้ั แลว จงึ นํามารวมกนั เพอ่ื ชง่ั ใหไ ด 50 กรมั

4.3 อาหารแชแข็ง กอนชั่งอาหารแชแข็งตองทาํ ใหอ าหารละลายในตเู ยน็ อณุ หภมู ิ 0-4
องศาเซลเซยี ส เปนเวลาไมเกิน 18 ชว่ั โมง แลวจึงตัดเปนหนวยยอยเพื่อนําไปชง่ั หรือใชส วาน
ซ่ึงใบสวานผา นการฆา เชอ้ื แลว เสียบผานปลายกรวยพลาสติกที่ตัดปลายแหลมออก กดปลาย
กรวยพรอมสวานลงบนชิน้ อาหารแขง็ เจาะอาหารดว ยสวาน อาหารจะยุยออกผานปลาย
กรวยข้ึนมาในกรวย นําไปชง่ั ใหไ ด 50 กรมั เชน กนั

5.การทําใหต วั อยา งอาหารเจอื จาง

5.1 การเจอื จางขน้ั ตน

การเจอื จางขน้ั ตน นโ้ี ดยทว่ั ๆ ไปนิยมทําใหอ าหารเจอื จาง 1:10 เทา เรียกวา Dilution
1:10 (หนึ่งตอสิบ)

5.1.1 สําหรบั ตวั อยา งอาหารทเ่ี ปน ของเหลว เขยา อาหารแรง ๆ อยา งนอ ย
25 ครง้ั ใชปเปตดูดตัวอยาง 10 มลิ ลิลิตร ใสใ นขวดซง่ึ มนี ้ํายาสําหรับเจือจาง 90 มิลลิลิตรโดย
เปาตัวอยางอาหารในปเปตลงในน้ํายาสําหรับเจือจางใหหมด แลวดูดน้ํายาสําหรับเจือจางกลับ
ข้ึนมาใหม ทาํ เชน นส้ี องสามครง้ั เพอ่ื ลา งตวั อยา งอาหารทต่ี ดิ อยขู า งปเปต เขยา ขน้ึ ลงอยา งแรง
25 ครง้ั

5.1.2 สําหรบั ตวั อยา งอาหารทเ่ี ปน ของแขง็ ซง่ึ อาหาร 50 กรมั ใสใน
เครื่องตีปนไฟฟา เทนํ้ายาสําหรบั เจอื จาง 450 มิลลิลิตร ลงในเครื่องตีปน ตีปน อาหารเปน เวลา
2 นาที การเตรยี มความเจอื จาง 1:10 ของอาหารแขง็ นป้ี จ จบุ นั นยิ มใชเ ครอ่ื ง Stomacher
ซึ่งตีปนอาหารในถุงพลาสติกบรรจุนาํ้ ยาสําหรบั เจอื จาง โดยใชอ าหาร 50 กรัมตอ นา้ํ ยา สาํ หรบั
เจอื จาง 450 มิลลิลิตรเชนเดียวกัน การตปี น ดว ยเครอ่ื ง Stomacher นเ้ี หมาะสมทจ่ี ะใชเ มอ่ื
ตองการตรวจวเิ คราะหต ัวอยา งอาหารครง้ั ละหลายๆ ตัวอยา ง เนื่องจากไมตองเสียเวลาฆาเชื้อ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 17

ภาชนะสําหรับบรรจอุ าหารสาํ หรบั ตปี น ถุงพลาสติกซึ่งใชกับ Stomacher นจ้ี ะผา นการฆา เชอ้ื
แลวจากโรงงานซง่ึ ผลติ ในขนาดตา ง ๆ กัน

5.1.3 สําหรับตัวอยา งอาหารซง่ึ มลี กั ษณะเปน ผง เชน แปง ซบุ ผง หรอื อาหารท่ี
ยุยเละไดงาย ทําใหเชอื้ กระจายท่ัวถงึ ในนา้ํ ยาสําหรบั เจอื จางไดโ ดยชง่ั ตวั อยา งอาหาร 50 กรมั
ใสในน้ํายาสําหรบั เจอื จางปรมิ าตร 450 มิลลิลิตร ซง่ึ บรรจอุ ยใู นถงุ พลาสตกิ ทนรอ นสวมปากถงุ
ดวยปลอกพลาสติก ทาํ ใหเกิดลักษณะคลายคอขวด อุดจุกดวยสาํ ลี นง่ึ ฆา เชอ้ื เชน เดยี วกบั เมอ่ื
บรรจุนํ้ายาสําหรบั เจอื จางในขวด เมื่อใสตัวอยางอาหารแลวใชมือบีบถุง เพื่อขยี้ใหตัวอยาง
อาหารแตกละเอียดเปนเนื้อเดียวกัน

5.2 การทําใหเ จอื จางลงตามลําดบั (Serial dilution)

โดยทั่วๆ ไปนิยมทําใหเจือจางตัวอยางลงลําดบั ละ 10 เทา ใชป เปตดดู ตวั อยา งเจอื จาง
1:10 จากขอ 5.1 1 มลิ ลิลิตรใสในหลอดหรอื ขวดบรรจุนํ้ายาสําหรบั เจอื จาง 9 มิลลิลิตรหรือใช
ตัวอยา ง 10 มลิ ลิลิตร ใสในขวดบรรจุนาํ้ ยาสําหรบั เจอื จาง 90 มิลลิลิตร เปา ตวั อยา งอาหาร
ใหหมด แลวดูดน้ํายาสําหรบั เจอื จางขน้ึ ไปใหมส องสามครง้ั เขยาหลอดดวยเครื่องเขยาไฟฟา
ในกรณที ่ใี ชข วด เขยา ขวดขน้ึ ลง 25 ครง้ั ตวั อยา งอาหารในขน้ั น้ี จะมีความเจอื จางเปน 1:100
(10-2) เตรยี มตัวอยา ง เจอื จาง 1:1,000 (10-3), 1:10,000 (10-4) และอน่ื ๆ ตามลําดบั โดยวิธี
เดียวกัน ควรเปลย่ี นปเปตใหมท กุ ๆ ระดบั ความเจอื จางทเ่ี ตรยี ม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 18

อาหาร + นา้ํ ยาเจอื จาง เจอื จาง 1:10 (10-1)
11 กรมั 99 มลิ ลลิ ติ ร

1 มลิ ลิลิตร (10-1) + 9 มลิ ลิลิตรน้ํายา

1 มิลลิลิตร (10-4) 1 มลิ ลิลิตร (10-3) 1 มิลลิลิตร (10-2)
+ 9มลิ ลิลิตร น้าํ ยา + 9 มลิ ลิลิตร น้าํ ยา + 9 มลิ ลิลิตร น้าํ ยา

10-2

10-5 10-4 10-3

. . . . . ....

. . . . . . . .. . . . … .. …
.

. . . . . .. . .. .. . . . .
. . . . . . . . . . .. . . .

.........

ภาพ 10 ตวั อยา งการเจอื จางและเพาะเชอ้ื จลุ นิ ทรยี 

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 19

การเพาะเลย้ี งจลุ นิ ทรยี 

กระบวนการหลกั ทส่ี ําคัญทางจุลชีววิทยา

ในทางปฏิบัตกิ ารทางจลุ ชวี วิทยา จะมีขั้นตอนหลักที่สาํ คัญอยู 2 ประการคอื การแยก
หรือจําแนก (Isolation) และการเพาะเลย้ี งเชอ้ื (Cultivation)

การแยกหรือจาํ แนก เปน การแยกจลุ นิ ทรียชนิดหนง่ึ ออกจากประชากรผสม (Mixed
population) ท่ีเกิดขน้ึ ในธรรมชาตใิ หเ ปน เชอ้ื บรสิ ทุ ธ์ิ (Pure culture)

สวนการเพาะเลี้ยงเชื้อ เปน การเพาะเลย้ี งเชอ้ื ในสง่ิ แวดลอ มทส่ี รา งขน้ึ เชน ในอาหาร
เลี้ยงเชื้อ (Culture medium) ในหองทดลอง

ในการแยกเชื้อใดเชื้อหนึ่งออกจากเชื้อผสม (Mixed culture) ใหไ ดเ ปน เชอ้ื บรสิ ทุ ธน์ิ น้ั
อาจจะกระทาํ ไดห ลายวิธี วิธีงายๆที่ใชกันเสมอคือวิธีที่เรียกวา Plating method มักใชก บั
จุลนิ ทรียท่ีสามารถเจรญิ เตบิ โตเปน โคโลนีบนอาหารแขง็ เชน แบคทีเรยี สวนใหญ ยสี ตแ ละรา
หลายชนิด วธิ นี เ้ี ปน การแยกและทําใหจ ลุ นิ ทรียแตล ะตวั หยดุ การเคลอ่ื นทบ่ี นหรอื ในอาหารท่ี
ทําใหแข็งดวยวุน (Agar) หรืออาหารประเภทวนุ อน่ื ๆทเ่ี หมาะสม จลุ นิ ทรียแ ตล ะตวั ทเ่ี จรญิ
เตบิ โตไดใ หโ คโลนซี ง่ึ สามารถแยก (Isolate) หรอื ถา ยเชอ้ื (Transfer) ไดง า ย

การทํา Plating method อาจทําไดห ลายวธิ คี อื
1.! Streak plate (Looping out) อาจทําไดห ลายแบบ แตหลักการที่เหมือนกันคือ

ทําใหเชื้อเจือจางลงเรื่อยๆ โดยการใชหวงลวดที่ฆาเชื้อแลวแตะเชื้อและนําไปลาก
(Streak) บนผิวของอาหารแข็ง ไมใ หเ สน ทบั กนั Streak แรกๆจะใหการเจริญที่
ติดตอกัน (Confluent growth) Streak ทายๆ จะใหเ ซลแตล ะเซลแยกหา งจากกนั
เม่ือนําไปเพาะแตล ะเซลจะเจรญิ ใหโคโลนีท่แี ยกกนั เนอ่ื งจาก 1 โคโลนีเจรญิ มาจาก
เซล 1 เซล ดงั นน้ั โคโลนีเหลา นจ้ี ะตอ งประกอบดว ยเชอ้ื ทบ่ี รสิ ทุ ธ์ิ

เทคนคิ ในการทํา Streak plate ใหใชจานอาหารวนุ ทม่ี ผี วิ หนา ทแ่ี หง ในการทํา
Streak plate เสมอ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 20

วิธีที่ 1

1.1! ใชหวงลวดที่ฆาเชื้อแลวแตะเชื้อจุลินทรียที่ตองการศึกษา จากอาหารวนุ เอยี ง

(Agar slant) มาผสมกันในหยดนํ้าบนสไลด
1.2! นําหวงลวดไปลนไฟฆาเชื้อและแตะเช้ือผสมไปปายบนผิววุนในจานตําแหนง

ก. (ดงั ภาพ 5)
1.3! ลากเชอ้ื อกจากแนว ก. ตามแนว ข.
1.4! ใชหวงลวดแทงลงในวุน ณ ตําแหนง ค. หลายๆครัง้
1.5! นําหวงไปลากเชือ้ จากแนว ข. ไปตามแนว ง. แลวแทงหวงลวด ณ ตําแหนง

จ. หลายๆ ครง้ั
1.6! นําหวงไปลากเชื้อจากแนว ง. ไปตามแนว ฉ.
1.7! เอาลวดไปลนไฟฆาเชื้อ ปลอยใหเย็นลงแลวนํามาลากเชอ้ื จากแนว ฉ. ไป

แนว ช.

หมายเหตุ การทํา Streak plate โดยวิธนี ้ี แทนทจี่ ะใชห วงลวดแทงลงในวนุ หลายๆ

ครั้ง เพ่ือลา งเชอ้ื ทม่ี ากเกนิ พอ ยงั อาจทาํ ไดโ ดยการเผาหว งลวดดว ยเปลวบนุ เซน

ระหวางการลากเชื้อแตละแนว

ก. ค.
ข.

ช. ง.
จ.

ฉ

ภาพ 11 การเพาะเชอ้ื แบบ Streak plate วิธีที่ 1

วิธีที่ 2

1.1 เอาหวงลวดท่ีปา ยเชอ้ื มาแลว ลากไปมาหลายๆครง้ั ตามตําแหนง บนจาน (บริเวณ
ก.) แลว ปด ฝาจาน

1.2!นําหวงลวดไปลนไฟฆาเชื้อ เมอ่ื เยน็ ลงนํามาลากผา นกลางบรเิ วณทป่ี า ยเชอ้ื
ครง้ั แรก (บริเวณ ข.) แลว ปด จาน

1.3!นําลวดไปฆาเชื้อแลวนาํ มาลากกลมุ เสน ค. ใหตั้งฉากกับเสน ข. โดยไมจ ําเปน ตอ ง
นําลวดไปฆาเชื้อขณะนาํ มาลากกลมุ เสน ค. แตละเสน

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 21

บริเวณ ก.

ค.
ข. ค.

ค.
ค.

ภาพ 12 การเพาะเชอ้ื แบบ Streak plate วิธีที่ 2

2.! Pour plate โดยการทําเชื้อใหเจือจางลงเรื่อยๆ แลวนําไปผสมกบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื
เฉพาะที่หลอมเหลวและเย็นลง (ประมาณ 50 องศาเซลเซียส) ในจานอาหารทผ่ี า น
การฆาเชื้อโรคแลว เมื่อทิ้งไวใหแข็งและนําไปเพาะ ( Incubate) โคโลนีก็จะเจริญใน
หรือบนอาหารเลย้ี งเชอ้ื วิธีนี้นอกจากจะใชแยกเชื้อใหบริสุทธิ์แลว ยงั สามารถใชใ น
การคํานวณหาจํานวนคราวๆของจุลินทรียอีกดวย

การใช Pour plate technique เพ่ือแยกเชอ้ื ใหบ รสิ ทุ ธห์ิ รอื นบั จํานวนจลุ นิ ทรยี 
น้ัน จะตอ งมีการทําใหเ จอื จางใน Medium ที่เปนของเหลว เชน อาหารเหลว หรอื
น้ําเกลือ หรอื น้ํากลั่น โดยอาศัยปเปตเปนหลัก

2.1! เทคนคิ การใชป เ ปต
ปเปตจะไดรับการฆาเชื้อโดยใสไวในกระบอกแกว กระบอกโลหะ ถุงหรือหอ

กระดาษ ในการใชปเปตเพื่อทาํ ของใหเจือจางนี้ ปเปตทกุ อนั จะตอ งปราศจากเชอ้ื
การปอ งกนั มใิ หเ ชอ้ื ตดิ มาบนปเ ปต ควรจะเอาปเปตออกมาจากกระบอกหรือหอ
เม่ือพรอมทจ่ี ะใชง านเทา นน้ั และไมใหสัมผัสกับสิ่งอื่นๆที่วางไวบนโตะ เพราะจะ
ทําใหปนเปอนจากเชื้ออื่นๆที่ไมตองการได

วิธีการนําปเปตออกมาใช ถาอยูในกระบอกหรือหลอดแกวใหปฏิบัติดังนี้
2.1.1! เอาสวนฝากระบอกที่บรรจุปเปตออก และถือไวในมือขวา
2.1.2! ลนไฟที่ปากกระบอกและเอียงกระบอกใหปเปตเลื่อนออกมาราว 1 นว้ิ

ใชฝาดักไว เพื่อไมใหปเปตออกมามากเกินไป
2.1.3! ดงึ ปเปตออกมา 1 อัน โดยจบั ดา นทม่ี สี ําลจี กุ อยู
2.1.4! เอาปากกระบอกปเ ปตไปลนไฟพรอ มทง้ั ปด ฝา
2.1.5! ผา นปเปตไปอยา งชา ในเปลวไฟบนุ เซน 3 ครง้ั และนําไปใชท นั ทที ่ี

ปเ ปตเยน็ ลง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 22

ถา ปเปตอยใู นถงุ หรอื กระดาษ
2.1.1 ใชมอื จบั ดวู า ปลายทใ่ี ชด ดู อยดู า นใด แลว ฉกี กระดาษทห่ี มุ ทางปลายนน้ั
ออก
2.1.2 ดงึ ปเปตออกทางปลายนน้ั แลว ผา นปเปตอยา งชา ๆ ในเปลวไฟ 3 ครง้ั
เชน กนั

2.2! วิธีการเจอื จาง

การเจอื จางตัวอยา งกอ นการ Pour plate ดําเนินการเชนเดียวกับในบทการ
เจือจางตวั อยา งทีก่ ลา วมาแลว ขา งตน

2.3! วิธี Pour plate
2.3.1 ดูดเช้ือจากขวดทเ่ี จอื จางในสดั สว นทเ่ี หมาะสม เชน 10-2 , 10-3 และ 10-4

ใสในจานเพาะเชื้อที่ฆาเชื้อมาแลว จานละ 1 มิลลิลิตร ทาํ 2 จานตอ 1 Dilution โดย
ใชป เปตอนั เดยี วกบั ทใ่ี ชด ดู เชอ้ื จากขวดทเ่ี จอื จาง 10-2 ไปทํา 10-3 และ 10-3 ไปทํา
10-4 และใชปเปตอันใหมสาํ หรบั จาก 10-4 ตามลําดบั

2.3.2 นําเอาอาหารวุน ท่ีอยใู นสภาพท่หี ลอมเหลวในขวดอาหารเลย้ี งเชือ้ จาก
Water bath มาเทลงในจานทุกจาน โดยขณะทเ่ี ทใชฝ าจานปอ งกนั สว นผสมขา งใน
มิใหเชื้อจากอากาศตกลง

2.3.3 หมนุ จานไปมาใหส ว นผสมเขา กนั ดกี บั อาหาร ระวังอยาใหกระฉอกไปติด
ฝาจานเลย้ี งเชอ้ื

2.3.4 ตง้ั ทง้ิ ไวจ นวนุ แขง็ แลว จงึ กลบั จาน เพื่อปองกันมิใหนํ้าตดิ บนฝาจาน
เล้ียงเชอ้ื หยดลงมาบนวนุ

2.4! วิธีนับจํานวนโคโลนี

ในการนับจํานวนโคโลนี เพอ่ื ความสะดวกอาจจะใชเ ครอ่ื งบนั ทกึ ทเ่ี รยี กวา
Colony counter เคร่ืองนี้ประกอบดว ยแสงและเลนซสําหรบั ชว ยขยาย เวลานับควร
ทําเครื่องหมายบนจานตรงตําแหนงโคโลนีที่นับแลว เพอ่ื ปอ งกนั การนบั ซ้ํา ถาจะ
ใหดีมีเคร่ืองนบั โดยใชม อื กดจะชว ยใหก ารนบั มปี ระสทิ ธภิ าพมากขน้ึ

จํานวนจุลนิ ทรียในตัวอยางท่ีนํามาตรวจนน้ั สามารถคํานวณไดด งั น้ี

จํานวนจลุ ินทรีย = จํานวนโคโลนีบานจานเลย้ี งเชอ้ื

(ตอ 1 มิลลิลิตร) ความเจอื จางของตวั อยา งทน่ี ํามาตรวจสอบ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 23

เชน ถาน้ํา 1 มิลลิลิตร นําไปเจอื จาง 10-4 เม่ือนําไปผสมกบั อาหารวนุ ในจานเลย้ี งเชอ้ื
และนําไปบม เพาะเช้ือ ปรากฏวา มโี คโลนเี กดิ ขน้ึ 432 โคโลนี ดังนน้ั จํานวนจลุ นิ ทรียใ นน้ํา
1 มิลลิลิตรมจี ลุ ินทรีย เทา กบั 432/10-4 เทา กบั 4,320,000 เซล หรอื 4.32 x 106 เซล

สิ่งสําคัญท่ีตองระวังมากคอื ถา สง่ิ มชี วี ติ ไมส ามารถเจรญิ ในอาหารทก่ี ําหนดให กไ็ ม
สามารถนบั จํานวนได ซึ่งไดแก ไวรัส และแบคทเี รยี ทเ่ี พาะยากบางประเภท

จํานวนโคโลนีที่มีความเจือจางที่สูงควรนอยกวาจํานวนโคโลนีท่ีมีความเจือจางที่ตํ่า
ลงมาประมาณ 10 เทา เนอ่ื งจากวา ไดท ําใหเ จอื จาง 10 เทา ถาผลทอ่ี อกมาคลาดเคลอ่ื นไปมาก
คือไมเปน 10 เทา แสดงวา ความผดิ พลาดอาจเนอ่ื งมาจากการทผ่ี สมเชอ้ื กบั อาหารวนุ ไมด พี อ
หรือการทาํ เจอื จางไมด ี

จํานวนโคโลนีที่เหมาะสมควรอยูระหวาง 30-300 โคโลนี จานทม่ี โี คโลนี ≥ 300 โคโลนี
อาจนับจํานวนโดยการแยกแบงเนื้อที่ออกเปน 4 สวน นับเพียงสวนใดสวนหนึ่งแลวคูณดวย 4
แตม ขี อ แมว า ตอ งมกี ารกระจายของโคโลนีท่ีสม่ําเสมอ

การเจอื จางตัวอยา ง

เชื้อเริ่มตน

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

ภาพ 13 การเพาะเชอ้ื แบบ Pour plate

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 24

3. Spread plate นําเช้ือที่ทําใหเจือจางแลว ทค่ี วามเจอื จางทเ่ี หมาะสมมากวาด
(Spread) บนผิวของอาหารแข็ง โดยใช Spreader ท่ีทําดวยแกวหรือโลหะ วิธีนี้ก็อาจใช
นับจํานวนครา วๆของจลุ นิ ทรียไ ดเ ชน กนั

การเจอื จางตัวอยา ง

เชื้อเริ่มตน

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Spreader

ภาพ 14 การเพาะเชอ้ื แบบ Spread plate
นอกจากนี้ยังอาจตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเชื้อจุลินทรียไดโดยการนาํ ไปยอ มสี เพื่อ
ตรวจดูความแตกตา งของรปู รา ง การเรยี งตัว หรือคุณสมบัติในการติดสียอมของเซล ทใ่ี ชก ัน
มากที่สุดก็คือการยอมสีแบบแกรม (Gram stain)

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 25

หลกั การและวธิ กี ารตรวจวเิ คราะหป ริมาณจลุ นิ ทรยี 
โดยวธิ นี บั จลุ นิ ทรยี ท ม่ี ชี วี ติ ทง้ั หมด( Viable plate count)

1. หลกั การ

การตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียโดยวิธีนับจุลินทรียที่มีชีวิตทั้งหมด
(Viable plate count) นเ้ี ปน การนบั จํานวนจลุ นิ ทรยี เ ฉพาะทย่ี งั มชี วี ติ อยแู ละสามารถ
เพิ่มจํานวนเจริญเติบโตเปนโคโลนีไดบนอาหารวุน (Agar media) โดยถือหลักการ
วาเซลหน่ึงเซล หรอื กลมุ ของเซลท่ีอยใู กลๆกันจะเพม่ิ จํานวนเจริญเติบโตทับถมกัน
เปน 1 โคโลนี

การตรวจนบั จะใหค วามแมน ยําทส่ี ดุ เมอ่ื
1.1 ตัวอยา งมคี วามเจอื จางพอเหมาะ คอื มปี รมิ าณจลุ นิ ทรยี ใ นระดบั ทเ่ี มอ่ื
เจริญเติบโตในอาหารวนุ แลว จะมจี ํานวนโคโลนรี ะหวา ง 30-300 โคโลนตี อ จาน
เพาะเชอ้ื
1.2 จลุ นิ ทรยี ใ นตวั อยา งมกี ารกระจายดแี ละเกาะกลมุ นอ ยทส่ี ดุ
1.3 อาหารเลย้ี งเชอ้ื เหมาะสม
1.4 อุณหภมู ิ และ สภาพแวดลอ มอน่ื ๆเหมาะสมตอการเจรญิ เตบิ โตของ
จุลนิ ทรยี 

2. การตรวจวิเคราะหจํานวนโดยวธิ เี ขยา จาน (Shake plate)

2.1 หลอมอาหารเพาะเชอ้ื ใหล ะลายแลว ทง้ิ ใหเ ยน็ ประมาณ 50 องศา
เซลเซยี ส

2.2 เตรยี มตัวอยา งอาหารใหเ จอื จางตามความตองการ 3 ระดบั ความเจอื จาง
2.3 ใชปเปตดดู อาหารแตล ะความเจอื จาง โดยเรม่ิ จากตวั อยา งทเ่ี จอื จางมาก
ท่ีสุดใสใ นจานเพาะเชอ้ื จานละ 1 มิลลลิ ติ ร แตล ะระดบั ความเจอื จางควรทําอยา งนอ ย
2 จานและใชระดับลางสุดกอนแลวไลขึ้นมาจนถึงใบบนสุด เทอาหารเลี้ยงเชื้อลงใน
จานประมาณ 15-20 มิลลิลิตร โดยเรม่ิ จากจานใบลา งสดุ เชน เดยี วกนั เขยา จานท่ี
ซอนอยูท้ัง 4 ใบพรอ มกนั โดยหมนุ ไปทางขวา 3-4 ครง้ั หมนุ ไปทางซา ย 3-4 ครง้ั
ต้ังท้งิ ไวจนวนุ แขง็

การใสต ัวอยา งอาหารและการเทอาหารเพาะเชอ้ื โดยเรยี งจานซอ นกนั 4 ใบ
น้ัน ทําไดโดยควํ่ามอื ซา ยบนจานทซ่ี อ นกนั ไวใ หน ว้ิ ชก้ี ดฝาบนของจานใบบนสดุ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 26

น้ิวกลางอยูท ข่ี อบดา นนอกของจานใบทส่ี อง นว้ิ นางอยทู ข่ี อบดา นนอกของจานใบ
ลางสุด เผยอฝาจานใบลา งสดุ โดยใชน ว้ิ หวั แมม อื และนว้ิ นาง และเลื่อนนิ้วนางและ
น้ิวหัวแมมือมาทจ่ี านใบถดั ขน้ึ มาตามลําดบั จนถงึ ใบบนสดุ เพื่อปองกันไมใหตัวอยาง
อาหารแหงตดิ จานเพาะเชือ้ ซง่ึ จะทําใหย ากตอ การกระจายของเช้อื ไมควรใส
ตัวอยางอาหารทง้ิ ไวใ นจานนานเกนิ 10 นาที กอ นทจ่ี ะเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื และเพื่อ
ปองกันการเพิ่มจํานวนของจลุ นิ ทรียในนํ้ายาสําหรบั เจอื จาง ควรประมาณระยะเวลา
ระหวางการทําใหอาหารเจือจางในคร้ังแรกจนถึงการเทอาหารเพาะเช้ือจานสุดทาย
ไมใหเกิน 20 นาที

2.4 บมเชื้อที่อุณหภูมิและใชระยะเวลาท่ีเหมาะสมสําหรับจุลินทรียแตละ
ประเภท โดยกลับจานเพาะเชอ้ื สาํ หรบั การบม เชอ้ื ยสี ต แบคทเี รยี และการตรวจนบั
จํานวนทั้งหมด สําหรบั เชอ้ื รานน้ั บม เชอ้ื โดยไมต อ งกลบั จานเพาะเชอ้ื

2.5 นบั จํานวนโคโลนที ง้ั บนผวิ หนา ทฝ่ี ง ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื โดยใชเครือ่ งนับ
โคโลนี (Colony counter) ในกรณที ่ตี ัวอยางอาหารมลี ักษณะเปน ผงละเอยี ด
ไมละลายในนํ้ายาสําหรบั เจอื จาง ผงละเอียดเหลานี้จะมีลักษณะคลายโคโลนีเล็ก ๆ
มาก จนในบางครง้ั ผวู เิ คราะหไ มส ามารถจะบอกความแตกตา งได ในกรณเี ชน น้ี
อาจขจัดปญหาไดโดยเตมิ 2, 3, 5 Triphenyl-tetrazolim chloride (TTC) ลงใน
อาหารเลี้ยงเชื้อโดยใชสารละลาย TTC เขม ขน รอ ยละ 0.5 ทาํ ใหป ราศจากเชอ้ื โดย
การกรอง แลว เติมในอาหารเลยี้ งเชอ้ื ทีห่ ลอมเหลวกอ นทจี่ ะเทลงในจานเพาะเชอ้ื
ใชสารละลาย TTC 1 มลิ ลิลิตรตออาหารเลี้ยงเชื้อ 100 มิลลิลิตร โคโลนีของ
แบคทีเรียสว นใหญจ ะมสี แี ดงในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ซง่ึ เตมิ สารดงั กลา ว อยา งไรกต็ าม
เพื่อใหแนใจวา TTC จะไมยับยง้ั การเจรญิ ของจลุ นิ ทรยี ท ต่ี รวจวเิ คราะห ผูวิเคราะห
ควรไดเปรียบเทียบผลการตรวจนับจํานวนระหวางการใชอาหารท่ีเติมและไมเติม
สารนีเ้ สยี กอ น

2.6 รายงานผลการตรวจนบั จํานวนจลุ นิ ทรยี ต อ กรมั หรือมลิ ลิลิตรของ
ตัวอยางอาหารโดยคูณจํานวนที่นับไดตามหลักการท่ีจะกลาวถึงดวยระดับความ
เจือจางที่ตรวจนับ ในกรณที จ่ี ํานวนทน่ี บั ไดใ นระดบั ความเจอื จางนน้ั เปน ตวั เลข
สามหลัก ใหปดเลขหลักหนวยขึ้นเปนหลักสิบโดยอาศัยหลักการตามวิธีเลขคณิต
ดังตวั อยา งทแ่ี สดงในตาราง 1

2.6.1 สาํ หรบั การตรวจนบั ทท่ี กุ ซ้ํา หรอื ไมน อ ยกวา ครง่ึ หนง่ึ ของจํานวน
ซ้ําที่ระดับความเจือจางเดียวเทานั้น ทส่ี ามารถนบั จํานวนไดระหวาง 30-300 โคโลนี
ใหหาคาเฉล่ียของจํานวนทต่ี รวจนบั ไดข องทกุ ซ้ําทร่ี ะดบั ความเจอื จางนน้ั (ตัวอยาง
อาหารท่ี 1 และ 2)

2.6.2 สาํ หรบั การตรวจนบั ซง่ึ สามารถนบั จํานวนไดระหวาง 30-300
โคโลนีท่ีระดับความเจอื จางสองระดบั ตดิ กนั โดยทใ่ี นแตล ะระดบั จะมเี พยี งบางซ้ํา

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 27

หรือทุกซํ้าท่ีนับจํานวนไดในชวงดังกลาว และจํานวนเฉลย่ี ของทกุ ซ้ําในระดบั ความ
เจือจางที่ใหการตรวจนับไดส งู มคี าไมถ งึ สองเทา ของจํานวนเฉลย่ี ของทกุ ซ้ําใน
ระดับความเจือจางที่ใหการตรวจนับไดตาํ่ ใหหาคาเฉลี่ยของจํานวนทน่ี บั ไดข อง
ทุกซ้ําท้ังสองระดบั ความเจอื จาง (ตัวอยางอาหารที่ 3 และ 4)

2.6.3 สาํ หรบั การตรวจนบั ซง่ึ สามารถนบั จํานวนไดระหวาง 30-300
โคโลนี ทร่ี ะดบั ความเจอื จางสองระดบั ตดิ กนั และในแตละระดับนับจํานวนไดใ นชว ง
ดังกลาวทุกซํ้า แตคาเฉลี่ยของจํานวนทน่ี บั ไดจ ากระดบั ความเจอื จางทใ่ี หก ารตรวจ
นับไดสูงมีคาถงึ สองเทา หรอื มากกวา คา เฉลย่ี ของจํานวนทน่ี บั ไดจ ากระดบั ความ
เจือจางที่ใหการตรวจนับไดตํ่า ใหใชแ ตเ ฉพาะคา เฉลย่ี จากทกุ ซ้ําทร่ี ะดบั ความ
เจือจางที่ใหการตรวจนับไดตํ่า (ตัวอยางอาหารที่ 5)

2.6.4 ในการตรวจนบั ครง้ั ใดกต็ ามทไ่ี มม โี คโลนเี กดิ ขน้ึ ในจานใดจานหนง่ึ
โดยที่แนใจวาอาหารเลี้ยงเชื้อและสภาวะที่บมเชื้อถูกตองแลวใหรายงานผลวาอาหาร
นั้ น มี จุ ลินทรียอยูนอยกวาตัวเลขของระดับความเจือจางต่ํ าสุดท่ีตรวจนับโดย
ประมาณ (ตัวอยางอาหารที่ 6)

2.6.5 การตรวจนบั ทไ่ี มม จี านใดเลยทม่ี โี คโลนเี กดิ ขน้ึ ถงึ 30 โคโลนี
ใหรายงานจํานวนเฉล่ียทน่ี บั ไดจ ากระดบั ความเจอื จางต่ําสดุ โดยกํากบั คําวา โดย
ประมาณไวดวย (ตัวอยางอาหารที่ 7)

2.6.7 การตรวจนบั ทโ่ี คโลนเี กดิ ขน้ึ หนาแนน มากทกุ จาน ในทกุ ระดบั
ความเจือจาง ใหรายงานวาอาหารน้ันมีจุลินทรียมากกวาตัวเลขของระดับความ
เจือจางสูงสุดคูณดวย 300 โดยประมาณ (ตัวอยา งอาหารที่ 8)

2.6.7 ในกรณที ม่ี โี คโลนแี ผล าม (Spreader) เกิดขึ้น ถาการแผล ามนน้ั
ไมถึงคร่ึงหน่ึงของจานเพาะเชอ้ื ใหน บั จํานวนโคโลนที แ่ี ผล ามเปน หนง่ึ และนบั
จํานวนโคโลนีที่เกิดขึ้นทั้งในและนอกบริเวณการแผลาม

2.6.8 ไมค วรรายงานผลการทดลองทม่ี ขี อ ผดิ พลาดดงั ตอ ไปน้ี เชน
จํานวนที่นับไดจากระดับความเจือจางสูงมีคามากกวาท่ีนับไดจากระดับความเจือจาง
ตํ่ามีโคโลนีแผลามคลมุ ทง้ั จาน มมี ดหรอื แมลงเดนิ บนผวิ หนา อาหารทําใหเ กดิ
โคโลนีเรียงตอ กนั เปน สาย หรอื จานซง่ึ โคโลนเี กาะกลมุ หนาแนน เฉพาะบรเิ วณใด
บรเิ วณหนง่ึ ซ่ึงแสดงถึงเขยา จานไมม ากพอทจ่ี ะทําใหต ัวอยา งอาหารกระจาย
ไปท่ัวถึง หรอื ทง้ิ ตวั อยา งอาหารนานเกนิ ไปจนแหง ตดิ จาน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 28

ตาราง 1 ตวั อยางการรายงานผลการตรวจนบั จลุ นิ ทรยี ใ นอาหาร

ตวั อยา ง จํานวนโคโลนี อัตราสวน จํานวนกรมั ตอ ราย
อาหารที่ ระดบั ความ (จํานวนสูงตอ อาหาร ละเอียด
จํานวนต่าํ )
1 เจือจาง (ขอ)
เฉลี่ย -
1:100 1:1,000 19,000(1.9x104) 2.6.1
2 -
เฉลี่ย 175 16 30,000(3.0x104) 2.6.1
208 17 3.6x104/2.7x104 31,000(3.1x104) 2.6.2
3 191.5 16.5 = 1.3
เฉลี่ย (190) 33,000(3.3x104) 2.6.2
322 23 3.3x104/3.2x104
4 278 29 = 1.0 15,000(1.5x104) 2.6.3
เฉลี่ย 300 26
291 32 3.6x104/1.5x104 ประมาณ<100 2.6.4
5 250 40 = 2.4 ประมาณ 1,800 2.6.5
6 270.5 36 -
7 (270) - (1.8x103) 2.6.6
281 40 ประมาณ
378 24
329.5 32 >300,000
(330) (3.0x105)
138 42
162 30
00

18 2

8 >300 >300 -

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 29

3. การตรวจวิเคราะหดวยวิธีเกลี่ยบนผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อ (Spread plate)

การตรวจวเิ คราะหด ว ยวธิ นี ม้ี ขี อ ดหี ลายประการ เชน สามารถนบั จํานวน
โคโลนใี นอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทข่ี นุ ได สังเกตลักษณะโคโลนีไดชัดเจน เชอ้ื ไมม โี อกาส
สัมผัสกับความรอนในอาหาร ซ่ึงความรอนของอาหารวนุ ระดบั ทใ่ี ชใ นวธิ ีเขยา จาน
อาจทําใหจํานวนจลุ นิ ทรยี น อ ยลงได สามารถเตรยี มจานอาหารไวไ ดล วงหนา และ
ในกรณีที่อาหารเลี้ยงเช้ือหรือจานเพาะเชื้อมีจุลินทรียปนเปอนอยูจะสังเกตเห็นได
แตวิธีนผ้ี วู เิ คราะหจ ะตอ งใชค วามระมดั ระวงั ในขอ ผดิ พลาด ซง่ึ อาจจะเกดิ ขน้ึ ได
เน่ืองจากเปน วธิ ใี ชต วั อยา งอาหารปรมิ าณนอ ย คือ 0.1-0.2 มิลลิลิตร และไม
สามารถใชวิธีนี้กับอาหารที่มีจุลินทรียอยูนอยกวา 3,000 เซลตอมิลลิลิตรได

การตรวจวเิ คราะหด ว ยวธิ เี กลย่ี บนผวิ หนา อาหารเลย้ี งเชอ้ื มวี ธิ กี ารดงั น้ี
3.1 เทอาหารเพาะเชอ้ื ลงในจาน ทิ้งไวอยางนอย 6 ชว่ั โมง เพื่อใหผิวหนา
อาหารแหง
3.2 เตรยี มตัวอยา งอาหาร โดยใชระดบั ความเจอื จางต่ํากวา ทต่ี รวจนบั ได
โดยวธิ เี ขยา จาน 10 เทา
3.3 ใชป เ ปตดดู ตวั อยา งอาหารตามระดบั ความเจอื จางทต่ี อ งการ ลงบน
ผิวหนาอาหารเพาะเชื้อจานละ 0.1 หรอื 0.2 มิลลิลิตร โดยใช 2-4 จานในแตล ะระดบั
ความเจอื จาง
3.4 ใชแทงแกวที่ปลายหนึ่งงอจุมแอลกอฮอลลนไฟเกลี่ย (Spread) เชื้อให
กระจายไปท่ัวผิวหนา อาหารเพาะเชอ้ื ซง่ึ อาจทําไดโ ดยใชม อื หนง่ึ ชว ยหมนุ จาน
เพาะเชื้อ หรอื วางจานบนแปน หมนุ (Turn table) โดยแตะแทงแกวไวบนผิวหนา
อาหารเพาะเชื้อพรอ มทง้ั ผลักแปนใหหมนุ ไปรอบๆ
3.5 นบั จํานวนโคโลนีท่ีผิวหนา อาหารเพาะเชอ้ื โดยใชห ลักการเดียวกบั ขอ
2.6 และเนอ่ื งจากการเกลย่ี บนผวิ หนา อาหารนใ้ี ชต วั อยา งอาหารเพยี ง 0.1 มิลลิลิตร
ดังนั้นในการคํานวณหา จาํ นวนจลุ นิ ทรยี ต อ กรมั หรือมิลลิลิตรของอาหาร ระดบั
ความเจือจางที่จะใชคูณคาเฉลี่ยของโคโลนีที่นับไดตอจานจึงตองเพิ่มขึ้นอีก 10 เทา
จากระดับความเจอื จางทเี่ ตรียมไวเดิม

1.! การตรวจวิเคราะหจํานวน โดยวิธี Drop plate

วิธีการตรวจวิเคราะหโดยวิธีนี้ มีขั้นตอนดังตอไปนี้
4.1 เตรยี มจานอาหารเพาะเชอ้ื เชน เดยี วกบั ขอ 3.1
4.2 เตรยี มตวั อยา งอาหารเจอื จางเชน เดยี วกบั ขอ 3.2

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 30

4.3 ใชป เ ปตขนาด 0.1 มลิ ลลิ ติ รซง่ึ มขี ดี แบง ทจ่ี ะอา นไดช อ งละ 0.02มิลลิลิตร
หรือ Pasteur pipette ซง่ึ ปลายเลก็ ขนาดหยดน้ําไดห ยดละ 0.02 มิลลิลิตร ดูด
ตัวอยางอาหารแตละระดับความเจอื จาง หยดบนผิวหนา อาหารเพาะเชอื้ จดุ ละ 0.02
มิลลิลิตร จานละ 5 จดุ ใชต วั อยา งอาหารระดบั ความเจอื จางตา งๆ กัน 3 ระดบั

ตัวอยางอาหาร 0.02 มลิ ลลิ ติ ร

ความเจอื จางระดบั ท่ี 1 ความเจอื จางระดบั ท่ี 2 ความเจอื จางระดบั ท่ี 3

ภาพ 15 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี โ ดยวธิ ี Drop plate

4.4 หลงั จากหยดตัวอยา งอาหารแลว รอจนน้ําจากตัวอยา งอาหารซมึ เขา ไป
ในผิววนุ จนแหง ซง่ึ ใชเ วลาประมาณ 20-30 นาที

4.5 บม เชอ้ื เชน เดยี วกบั ขอ 2.4
4.6 นับจํานวนโคโลนีเฉพาะในระดับความเจือจางที่มีโคโลนีแตละจุดไมเกิน
20 โคโลนี รวมจํานวนโคโลนีท้ัง 5 จดุ ซง่ึ จะเปน จํานวนตอ ตวั อยา งทร่ี ะดบั ความ
เจือจางนน้ั ถา ใชต ัวอยา งอาหาร 0.1 มิลลิลิตร คาํ นวณหาจํานวนจลุ นิ ทรยี ต อ กรมั
หรือมิลลิลิตร ของอาหารโดยคณู จํานวนโคโลนที น่ี บั ไดด ว ยระดบั ความเจอื จางแลว
คูณดวย 10

การตรวจนบั จํานวนโคโลนใี นแตล ะจดุ นค้ี วรใช Colony counter หรอื
แวนขยาย

5. ความถกู ตอ งของผลการวเิ คราะห

การนบั จํานวนจลุ นิ ทรยี โ ดยวธิ ี Viable plate count นย้ี อ มมขี อ ผดิ พลาด
เกิดขึ้นไดหลายประการ กอ นจะรายงานผลผวู เิ คราะหค วรตรวจสอบวา ผลนน้ั มี
ความถูกตองอยใู นขา ยทจ่ี ะยอมรบั ได ซง่ึ มหี ลกั เกณฑใ นการพจิ ารณา คือ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 31

5.1 ในการตรวจนบั จํานวนโดยใชต วั อยา งอาหารทม่ี คี วามเจอื จางตา งกนั
ระดับละ 10 เทา จํานวนท่ีนับไดใ นแตละระดับควรจะตา งกนั ประมาณ 10 เทาดวย

5.2 จํานวนที่นับไดในแตละจานของระดับความเจือจางใดความเจือจางหนึ่ง
ควรใกลเคียงกัน ซึ่งอยูใน Range ท่ีมีระดบั ความเชอ่ื มน่ั ทางสถติ ริ อ ยละ 95 โดย
คํานวณจากสูตร

(nx) + 1.96 √( n x )
n

nx = จํานวนโคโลนรี วมทกุ จาน
n = จาํ นวนจานทน่ี บั
x = จาํ นวนโคโลนใี นแตล ะจาน
x = จาํ นวนโคโลนีเฉลี่ย

6. รายละเอยี ดทค่ี วรบนั ทกึ ในการรายงานผล

ในการรายงานผลควรบันทึกรายละเอียดของการตรวจวิเคราะหบางประการ
เชน น้ํายาที่ใชสาํ หรบั เจอื จาง อาหารเพาะเชอ้ื และอณุ หภมู ทิ บ่ี ม เชอ้ื

ตัวอยา งปฏบิ ตั กิ าร :
การตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียโดยวิธี Viable plate count

จํานวนและปรมิ าณจลุ นิ ทรียท่ีมีอยูในอาหาร และสวนประกอบของอาหารจะ
เปนตัวบงบอกถงึ คณุ ภาพของอาหารนน้ั ๆ ถาหากมจี ํานวนของจลุ นิ ทรียอยมู ากใน
อาหาร อาจแสดงถงึ วา วตั ถดุ บิ ทเ่ี ขา มาผลิตอาหารดอ ยคณุ ภาพ หรือขนสงและวิธี
การผลิตไมดพี อ ดงั นน้ั จงึ ไดม กี ารพฒั นาการตรวจหาจลุ นิ ทรียในอาหาร และสวน
ประกอบอาหารหลายๆอยาง ในวธิ กี ารวเิ คราะหด งั ตอ ไปนเ้ี ปน วธิ กี ารทน่ี ยิ มใชก นั
มากในการหาปริมาณหรือจํานวนของจลุ นิ ทรยี ท ง้ั พวก Aerobic และ Facultative
microorganisms

ตวั อยางอาหาร

เน่ืองจากจลุ นิ ทรียในอาหารนน้ั มอี ยไู มส มา่ํ เสมอกันตลอด บางสวนของ
อาหารก็มีมาก บางสว นของอาหารกม็ นี อ ย ฉะนน้ั การหาปรมิ าณของจลุ นิ ทรยี ใ น
อาหารจึงตองใชสวนของอาหารหลายๆสวนเปนตัวแทน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 32

อุปกรณ

• ขวดบรรจุนํ้ายาสําหรบั เจอื จางปรมิ าณ 90 มลิ ลิลิตร และ99 มิลลิลิตร
• ขวดหรือหลอดบรรจนุ ้าํ ยาสําหรบั เจอื จางปรมิ าตร 9 มลิ ลิลิตร
• ปเ ปตขนาด 10 มิลลิลิตร ขนาด 1 มลิ ลิลิตร และ ขนาด 0.1 มิลลิลิตร
• จานเพาะเชื้อ และจานเพาะเชอ้ื ซง่ึ เท Plate count agar (PCA) ไวข า มคนื
รวมทั้ง PCA ขวดละ 150 มิลลิลิตร
• แทงแกวงอ
• เครอ่ื งตีปนไฟฟาหรอื Stomacher

การทดลองและรายงานผล
1. ตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ใ นอาหารเหลว

1.1! เตรียมนมพาสเจอรไรสเ จอื จาง 1:10, 10-2, 10-3
1.2! ตรวจดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop plate โดยใช

ระดับความเจอื จาง 1:10, 10-2 และ 10-3 ระดบั 4 จาน ใช PCA เปน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื
1.3! บมทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง 2 - 5 วัน
1.4! รายงานผลจํานวนจุลินทรยี ต อนํ้านมหนึ่งมิลลิลิตร เปรยี บเทยี บจํานวน
ท่ีนับไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

2.ตรวจวิเคราะหจํานวนจลุ นิ ทรยี ใ นอาหาร

ตัวอยา งไสก รอก
2.1 เตรยี มตวั อยา งไสก รอกเจอื จาง 1:10, 10-2, 10-3 และ 10-4

โดยให ตัวอยาง 50 กรมั ในการเตรยี มระดบั ความเจอื จาง 1:10
2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop

plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 10-2, 10-3 และ 10-4 ระดบั 4 จาน ใช
PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซียส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรียตอ กรมั ของไสก รอก โดย
เปรียบเทียบจาํ นวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 33

ตัวอยางผลติ ภณั ฑจ ากเนอ้ื สตั วอ น่ื ๆ

2.1 เตรียมตัวอยางผลิตภัณฑจากเนื้อสัตว โดยชง่ั ตัวอยา งมา 11

กรัมใสใ น Sterile phosphate buffer 99 มลิ ลิลิตร (1:10 Dilution) ปนใน

Blender 2 นาที (หรือใช Stomacher) ในท่ีน้ีใหท ําการเจอื จางดงั น้ี
Bacon 1:10, 10-2
10-5, 10-6
Hamburger 10-3, 10-4

Bulk sausage 10-2, 10-3

Wiener

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop
plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 10-2, 10-3 และ 10-4 ระดบั 4 จาน ใช

PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง

2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรียตอ กรมั ของผลติ ภณั ฑเ นอ้ื โดย

เปรียบเทียบจาํ นวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

ตัวอยา งผลติ ภณั ฑจ ากไข

2.1 เตรยี มตวั อยา งผลติ ภณั ฑจ ากไข โดยชง่ั ตัวอยา งมา 11 กรมั ใส
ใน Sterile physiological saline (รอ ยละ 0.85 ของเกลือแกง) ทม่ี ี
Hard-glass beads (เพอ่ื ใชไ ขก ระจายตวั ดขี น้ึ ) 99 มิลลิลิตร (1:10 Dilution)
เขยา 25 ครง้ั หรือปน ใน Blender 2 นาที (หรือใช Stomacher) ในทน่ี ใ้ี หท ํา
การเจอื จางดงั นี้ ตัวอยางทั้งที่เปน Liquid, frozen หรอื dried ใหเจือจาง
ตัวอยางเปน 10-2 10-3, 10-4

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ
Drop plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 10-2, 10-3 และ 10-4 ระดบั 4 จาน ใช
PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรียตอ กรมั ของผลติ ภณั ฑจ ากไข
โดยเปรียบเทียบจํานวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

ตัวอยา งแปง

2.1 เตรยี มตัวอยา งแปง โดยชง่ั ตัวอยา งมา 11 กรัมใสใน Sterile
water blank 99 มิลลิลิตร (1:10 Dilution) ทม่ี ี Sterile sand อยูดวย 10 กรมั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 34

(เพ่ือตแี ปง ใหก ระจายตวั ดขี น้ึ ) เขยา 2 นาที หรือปน ใน Blender 2 นาที
(หรือใช Stomacher) และเตรยี มการเจอื จางตวั อยา งเปน 10-2

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop
plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 1:10 และ 10-2 ระดบั 4 จาน ใช PCA เปน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรยี ต อ กรมั ของแปง โดยเปรยี บเทยี บ
จํานวนที่นับไดจากทั้งสามวิธี

ตัวอยา งผกั และผลไมแ หง

2.1 เตรยี มตวั อยา งผกั และผลไมแ หง โดยชง่ั ตวั อยา งมา 50 กรมั ใส
ใน Sterile distilled water 450 มลิ ลิลิตร (1:10 Dilution) แชไว 30 นาที
เขยา 2 นาที หรอื ปน ใน Blender 2 นาที (หรือใช Stomacher) และเตรียม
การเจอื จางตวั อยา งเปน 10-2, 10-3 และ 10-4

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop
plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 1:10 และ 10-2 ระดบั 4 จาน ใช PCA เปน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรียต อกรมั ของผกั และผลไมแ หง
โดยเปรียบเทียบจํานวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

ตัวอยา งเครือ่ งเทศ

2.1 เตรยี มตวั อยา งเครอ่ื งเทศ โดยชง่ั ตัวอยา งมา 1 กรมั ใสใน
Sterile distilled water 100 มลิ ลิลิตร (1:10 Dilution) เขยา 5 นาที หรอื ปน
ใน Blender 2 นาที (หรือใช Stomacher) ปลอยใหเครื่องเทศตกตะกอน และ
เตรียมการเจอื จางตัวอยา งเปน 10-2 , 10-3 และ 10-4

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop
plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 1:10 และ 10-2 ระดบั 4 จาน ใช PCA เปน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซยี ส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 35

2.4 รายงานผลเปนจํานวนจลุ นิ ทรียต อกรมั ของเครอ่ื งเทศ โดย
เปรียบเทียบจาํ นวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

ตัวอยา งกระหล่ําปลี

2.1 เตรยี มตัวอยา งกระหล่ําปลี โดยชง่ั ตวั อยา งมา 50 กรมั ของ
Inner หรือ Outer leaves ใสใน Sterile distilled water 450 มิลลิลิตร (1:10
Dilution) ปนใน Blender 2 นาที (หรือใช Stomacher) และเตรยี มการ
เจือจางตวั อยา งเปน 10-5 และ 10-6 (ถา วเิ คราะหส ว น Outer leaves) หรอื
เตรียมการเจอื จางตัวอยา งเปน 10-2 และ 10-3 (ถาวเิ คราะหส ว น Inner
leaves)

2.2 ตรวจวิเคราะหดวยวิธี Shake plate, Spread plate และ Drop
plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 1:10 และ 10-2 ระดบั 4 จาน ใช PCA เปน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื

2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซียส หรือที่อุณหภูมิหอง
2 - 5 วัน

2.4 รายงานผลเปน จํานวนจลุ นิ ทรียตอ กรมั ของกระหล่ําปลี โดย
เปรียบเทียบจาํ นวนทน่ี บั ไดจ ากทง้ั สามวธิ ี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 36

หลกั การและวธิ ตี รวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรยี บ นพน้ื ผวิ

1. หลกั การ

การตรวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรยี บ นพน้ื ทผ่ี วิ น้ี จะกระทําเมื่อตองการ
ทราบปริมาณจุลนิ ทรยี เ ฉพาะบนพน้ื ผวิ ของอาหารบางชนดิ ซ่ึงคอนขา งจะแนใ จวา
จุลินทรียมกี ารปนเปอ นและเจรญิ อยเู ฉพาะทผ่ี วิ ของอาหาร เชน หนังสัตวปก ผลไม
ตากแหงทั้งผล บริเวณผิวนอกของผลไม ไสกรอก ผิวนอกของเปลือกไข เปน ตน
และยังใชตรวจวิเคราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรยี ใ นภาชนะทใ่ี ชบ รรจอุ าหาร เชน ถุงพลาสติก
หรือขวดทจ่ี ะใชบ รรจนุ มพลาสเจอไรส นอกจากนย้ี งั ใชต รวจวเิ คราะหป รมิ าณ
จุลินทรียในบรเิ วณตา ง ๆ ของโรงงานอตุ สาหกรรมอาหารอกี ดว ย ซง่ึ การตรวจ
วิเคราะหจุลินทรยี บ นพ้นื ผิวน้ีอาจทําไดห ลายวิธีดว ยกนั

2. การตรวจวิเคราะหโดยวิธีเลาะผิวตัวอยางอาหาร ( Surface slice)

2.1 ใชมีดบางจุมแอลกอฮอลลนไฟ กรดี ผวิ อาหารใหล กึ ประมาณ 1-2
มิลลิเมตรโดยใหม ขี นาดกวา งยาวตามตองการหรอื อาจใช Cork borer เจาะผวิ อาหาร
ตามขนาดทต่ี อ งการ

2.2 เลาะผวิ อาหารออก โดยใชป ากคบี จบั ชน้ิ อาหารไวใ นขณะทเ่ี ลาะดว ยมดี
2.3 ตปี น ชน้ิ อาหารจากขอ 2.2 ดวยเครื่องตีปนไฟฟา หรอื Stomacher โดย
ใชนํ้ายาสําหรับเจือจางปริมาณที่จะทําใหตัวอยางอาหารที่ตีปนแลวมีระดับความ
เจือจาง 1:10

3. การตรวจวิเคราะหโดยวิธีถูดวยสาํ ลพี นั ปลายไม

3.1 เตรยี ม Swab (สําลีพันปลายไม) ซง่ึ แชใ นน้ํายาสําหรบั เจอื จาง
3.2 กด Swab กับดานในของหลอดเพื่อให Swab แหง
3.3 ถู Swab บนพ้ืนผวิ ไปทางใดทางหนง่ึ ใหท ว่ั บรเิ วณทจ่ี ะตรวจนบั จลุ นิ ทรยี 
3.4 จมุ Swab จากขอ 3.3 ลงในขวดนํ้ายาสําหรบั เจอื จาง 10 มิลลิลิตร กด
ปลายไมใกลๆ สําลี หักไมออกทิ้งไป ใหสําลีคงอยูในขวด เขยา ขวดแรงๆ ประมาณ
25 ครั้ง จะไดร ะดบั ความเจอื จาง 1:10

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 37

4. การตรวจวิเคราะหโดยวิธีแชตัวอยางอาหาร

นิยมใชในการตรวจนบั จํานวนจลุ ินทรยี บ นผวิ อาหารทแ่ี ตละหนว ยของอาหาร
เปนหนวยเฉพาะ ขนาดไมใ หญเ กนิ ไปนกั เชน ไสกรอก ปกไก กลวยตาก และผลไม
แหงชนิดอื่น ๆ เปน ตน

4.1 เตรียมนํ้ายาสําหรบั เจอื จางบรรจถุ งุ พลาสตกิ ชนดิ ทนรอ นได สวมปากถุง
ดวยปลอกพลาสติกทําใหเกิดมีลักษณะคลายคอขวด อุดจุกดวยสาํ ลี ปรมิ าณน้าํ ยา
สําหรับเจือจางอาจเปน 10 หรอื 100 มลิ ลลิ ติ รขน้ึ กบั ขนาดของชน้ิ อาหาร ฆา เชอ้ื ท่ี
อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซยี ส 20 นาที

4.2 แชตัวอยางอาหารในน้ํายาสําหรบั เจอื จางประมาณ 15 นาที เขยาและ
ใชมือบีบถุงเบา ๆ เพื่อชะลางจุลินทรียใหหลุดออกจากผิวอาหาร ในขน้ั ตอนนจ้ี ะได
ระดับความเจือจาง 1:10 หรอื 1:100 เกบ็ ปรมิ าณน้ํายาสําหรบั เจอื จางทใ่ี ช

5. การตรวจวิเคราะหภ าชนะบรรจุอาหารโดยวธิ ชี ะลาง

เทน้ํายาสําหรับเจือจางปริมาณประมาณหนึ่งในสี่ของความจุของภาชนะ
เขยาภาชนะใหจุลินทรียที่ผิวภายในของภาชนะหลุดกระจายอยูในนํ้ายาสําหรับ
เจอื จาง คิดระดบั ความเจอื จางตามปรมิ าณทใ่ี ช

6. การตรวจวเิ คราะหโ ดยวธิ ี Agar sausage

วิธีนเ้ี ปน การตรวจนบั จํานวนจุลินทรียบนพื้นผิวโดยตรง ไมตองทําใหเ จอื จาง
ลงกอนนับจํานวน วธิ นี จ้ี งึ เหมาะเฉพาะกบั การตรวจนบั บรเิ วณพน้ื ผวิ ทม่ี จี ลุ นิ ทรยี 
จํานวนนอ ย

6.1 เตรยี มอาหารวนุ ในถุงพลาสตกิ ทนรอ นรปู ทรงกระบอก (ลักษณะเชน
เดียวกับเตาหูหลอด)

6.2 ใชมีดจุมแอลกอฮอลลนไฟ ตดั ปลายดา นหนง่ึ ของวนุ ใหผ วิ เรยี บ
6.3 กดผวิ หนา วนุ ซง่ึ ปรบั ใหเ รยี บ (ขอ 6.2) ลงบนพน้ื ผวิ ทจ่ี ะตรวจนบั
6.4 ตัดวุนออกเปนแวน หนาประมาณ 0.5 เซนตเิ มตร วางในจานเพาะเชอ้ื
ใหดานทไ่ี ดร บั การสมั ผสั กบั พน้ื ผวิ อยดู า นบน
6.5 บมเชื้อท่ีอุณหภูมแิ ละเวลาตามตองการ ตรวจนับจํานวนจลุ นิ ทรยี ต อ
พื้นที่ผิวหนาของแผนวุน

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 38

ตัวอยา งปฏบิ ตั กิ าร :
การตรวจวิเคราะหปริมาณจลุ นิ ทรียบนพน้ื ผิว

ตัวอยา งอาหารและภาชนะ

อุปกรณ •ไขไก
•ลูกชิ้นหรือไสกรอก
•ขวดสําหรับบรรจนุ ้าํ อดั ลมหรอื ถงุ บรรจนุ มพาสเจอไรส
•จาน
•ชอน

• สําลพี นั ปลายไม (Swab) แชในขวดซึ่งมีนาํ้ ยาสําหรบั เจอื จาง
ปริมาตร 10 มิลลิลิตร
• ขวดบรรจุนํ้ายาสําหรบั เจอื จางปรมิ าตร 10 มิลลิลิตร และปรมิ าตร
9 มิลลิลิตร
• จานเพาะเชื้อซึ่งเท PCA ไวข า มคนื
• ปเปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร และ ขนาด 0.1 มิลลิลิตร
• จานเพาะเชื้อ
• ถุงพลาสติกซึ่งมีคอขวดรวมที่ปากถุงและอุดจุกดวยสําลี บรรจุ
ดวยน้ํายาสําหรบั เจอื จาง 100 มิลลิลิตร

การทดลองผลและรายงาน

1.วธิ ถี ู (Swab technique )

1.1 ตรวจนบั จลุ นิ ทรียบนเปลอื กไข
1.1.1! วางไขบ นจานเพาะเชอ้ื ซง่ึ ฆา เชอ้ื แลว
1.1.2! ใชสําหรบั พนั ปลายไมถ เู ปลอื กไขใ หท ว่ั
1.1.3! เตรียมระดับความเจอื จาง 1:10 โดยจมุ สาํ ลพี นั ปลายไมล ง
ในขวดซ่ึงมีนํ้ายาสําหรบั เจอื จางอาหาร 10 มิลลิลิตร หกั ไม
ท้ิงเขยา ขวดอยา งนอ ย 25 ครง้ั
1.1.4! ทําตัวอยางใหเจือจางลงเปน 10-2, 10-3, 10-4 ตามลําดบั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 39

1.1.5! ตรวจนบั จลุ นิ ทรียด ว ยวธิ ี Drop plate โดยใชร ะดบั ความ
เจอื จาง 10-2, 10-3 และ 10-4 ใช PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื

บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2 - 5 วัน
1.1.6! รายงานผล เปน จํานวนจลุ ินทรีย ตอพื้นที่เปลือกไข 1 ฟอง

1.2 ตรวจนบั จลุ นิ ทรียบ นชอ น
1.2.1 ใชสําลีพันปลายไมถ ชู อ นทง้ั ดา มในและดา นนอก
1.2.2 ทําใหเจือจางในระดับ 1:10 เชน เดยี วกบั ขอ 1.1.4
1.2.3 เตรยี มตวั อยา งใหเ จอื จางเปน 10-2
1.2.4 ตรวจนบั จลุ นิ ทรียโ ดยวธิ ี Drop plate โดยใชร ะดบั ความ
เจอื จาง 1:10 และ 10-2 ใช PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื บม
เชื้อที่อุณหภูมิหอง 2 - 5 วัน
1.2.5 รายงานผลเปนจํานวนจลุ นิ ทรียต อ ชอ น 1 อัน

2.! วิธีลางภาชนะบรรจอุ าหาร

2.1! เตรียมระดับความเจอื จาง 1:10 โดยเทน้าํ ทป่ี ราศจากเชอ้ื
ปรมิ าตร 10 มลิ ลิลิตร ใสใ นขวดหรอื ถงุ ทจ่ี ะตรวจนบั จลุ นิ ทรยี 
เขยา ขวดอยา งนอ ย 25 ครง้ั

2.2! ตรวจนบั จลุ นิ ทรยี  ดวยวิธี Drop plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง
1:10 ใช PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2 - 5 วัน

2.3! รายงานผล เปน จํานวนจลุ นิ ทรียตอ พน้ื ทภ่ี ายในขวดหรอื ถงุ

3.! วิธีลางผวิ อาหารในถงุ พลาสตกิ

3.1! ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ คีบลูกชิ้นหรือไสกรอกใสในถุง

พลาสติก
3.2! ใชมือบีบถุงเบา ๆ เพื่อลูบใหจุลินทรียหลุดออกจากผิวอาหาร
3.3! เตรยี มตัวอยา งใหเ จอื จางเปน 10-3 และ 10-4 ตามลําดบั
3.4! ตรวจนบั จลุ นิ ทรียด ว ยวธิ ี Drop plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง

10-2, 10-3 และ 10-4 ใช PCA เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื บม เชอ้ื ท่ี

อุณหภูมิหอง 2 - 5 วัน
3.5! รายงานผล เปนจํานวนจลุ นิ ทรียตอตวั อยา งอาหารหนง่ึ หนว ย

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 40

หลกั การและวิธีตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียดวยกลองจุลทรรศน
(Direct Microscopic Count)

1. หลกั การ

วิธีการน้ีเปนการตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียโดยนับจํานวนเซลของ
แบคทีเรยี หรอื ยสี ต จํานวนเสน ใยหรอื สปอรข องเชอ้ื ราจากกลอ งจลุ ทรรศนโ ดยตรง
ซึ่งสไลดท่ีใชเปนสไลดท่ีมีชองแบง เพ่ือกําหนดปริมาตรของตัวอยางท่ีใชแตละครั้ง
จากปริมาตรดงั กลาวสามารถคํานวณ ปริมาณจุลินทรียตอกรมั หรอื มิลลิลิตรของ
อาหารได แตไมสามารถแยกไดว า จลุ นิ ทรยี ท ต่ี รวจนบั นน้ั ยงั มชี วี ติ อยหู รอื ไม และ
จะใหผลถูกตองแมน ยําเมอ่ื ตวั อยา งอาหารมจี ลุ นิ ทรยี อ ยใู นปรมิ าณมากเทา นน้ั ขอดี
ของการวิเคราะหวิธีนี้คือใหผลรวดเร็วและไมสิ้นเปลือง

2. การตรวจนบั โดยใช Haemacytometer (Petreoff-Hausser chamber)

Haemacytometer เปนเคร่ืองมอื ซง่ึ ใชส ําหรบั การนบั เมด็ เลือด แตไ ดนํา
มาประยุกตใชใ นการนบั จํานวนจลุ นิ ทรียและสปอรข องเชอ้ื รา เครอ่ื งมอื นเ้ี ปน สไลดม ี
ชองแบงไวแนนอนและมีขอบยกสูงจากบริเวณขีด เม่ือปดดวยกระจกปด สไลดข อบน้ี
จะรองรับกระจกปดสไลดไว ทาํ ใหเ กดิ ระยะหา งระหวา งกระจกและสไลดใ นบรเิ วณทม่ี ี
ขีดคดิ เปนความลึกได 0.1 หรือ 0.2 มิลลิลิตรแลวแตบริษัทผูผลิต ขดี แบง ทก่ี ําหนด
ไวประกอบดวยชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญ 25 ชอง แตล ะชอ งมขี นาด 0.2x0.2 ตาราง
มิลลิเมตรในแตละชองใหญน ม้ี ีขีดแบงเปน ชองเล็กอกี 16 ชอง แตละชองมีเนื้อที่
0.05x0.05 ตารางมิลลิเมตร ดงั นน้ั ของเหลวทบ่ี รรจอุ ยใู นแตล ะชอ งเลก็ จะมปี รมิ าตร
(0.05x0.05x0.1) ลูกบาศกมลิ ลิเมตร เครอ่ื งมอื นจ้ี ะมกี ระจกปด สไลดซ ง่ึ มขี นาด และ
ความหนาเฉพาะ ไมค วรใชก ระจกปด สไลดอ่ืนแทน เนอ่ื งจากน้ําหนกั ของกระจกจะมี
ผลทําใหปริมาตรภายในชอ งระหวางสไลดก ับกระจกคลาดเคลอื่ นไปได และเมื่อใช
กระจกท่ีหนาไปจะเปน อุปสรรคตอ การโฟกสั กลอง หา มใชน ้าํ มนั ในการปรบั โฟกสั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 41

0.2 มิลลิเมตร

Haemacytometer
ภาพ 16 อปุ กรณ Haemacytometer

2.1 การเตรยี มตวั อยา งอาหาร
สําหรับตัวอยางซ่ึงเปนของแข็งตองทําใหเจือจางลงโดยใชสารละลาย

ไอโอดีน ซ่ึงนอกจากจะทําใหตัวอยา งเจือจางแลวยังทําใหจ ลุ นิ ทรยี ห ยดุ การเคลอ่ื นท่ี
และตัดแสงทําใหก ารสงั เกตจลุ นิ ทรียเปนไปไดช ดั เจนยง่ิ ขน้ึ สาํ หรบั ตวั อยา งอาหาร
เหลวถามีจุลินทรียมากเกินกําหนดท่ีจะตรวจนับไดถูกตองและแมนยํา ก็ตองทําให
เจอื จางลงเชน กนั การตรวจวเิ คราะหโ ดยใช Haemacytometer นไ้ี มค วรใชก บั
อาหารซ่งึ มีความขุนหรอื เมอ่ื ละลายแลว เกิดความขุน