หลักการวิเคราะห์จุลินทรีย์

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 92

เปรยี บเทยี บการทนความรอ นของจลุ นิ ทรยี ช นดิ ตา ง ๆ

จุลินทรียแตล ะชนดิ ไมว า จะเปน แบคทเี รยี ยีสต และเชอ้ื รา จะมคี วาม
สามารถในการตานทานความรอ นไดไมเ หมือนกัน แมแ ตจ ะเปน เชอ้ื จลุ นิ ทรยี ป ระเภท
เดียวกันก็มีความตา นทานความรอ นทไ่ี มเ ทา กนั เชน กนั บางชนดิ ทนความรอ นไดด ี
บางชนิดก็ไมท นความรอ น อยา งไรกต็ ามเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท เ่ี ปน Vegetative cells จะทน
ความรอนไดไมดีเทา กับเช้อื จลุ ินทรยี ทสี่ รางสปอรไ ด การศกึ ษาการทนความรอ นของ
จุลนิ ทรียชนิดตางๆจึงมีความสําคญั เพอ่ื ใหไ ดข อ มลู ทส่ี ามารถนําไปประยกุ ตใ ชใ น
การฆาเชอ้ื จลุ ินทรยี ใ นอาหารได เพื่อใหคุณภาพผลิตภัณฑที่ดี

จุลนิ ทรยี 
•Saccharomyces cerevisiae
•Aspergillus niger
•Mycobaterium sp.
•Staphyloccoccus aureus
•Bacillus stearothermophilus

อุปกรณ
•Glucose yeast extract broth (GYB) หลอดละ 5 มิลลิลิตร
•Glucose yeast extract agar (GYA) ขวดละ 100 มิลลิลิตร
•จานเพาะเชอ้ื
•Phosphate buffer
•Mixer
•ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร
•อางน้ําปรบั อณุ หภมู ใิ หค งท่ี
•หมอนึ่งอัดความดันไอ

การทดลองและรายงานผล

1. การเตรยี มเชอ้ื

1.1 เตรยี ม Suspension ของเชื้อราดวย Phosphate buffer

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 93

1.2 เขยา Suspension จากขอ 1.1 และเชื้ออื่นๆ ซึ่งเจรญิ เติบโตในอาหาร
เหลวดวย Mixer

1.3 ใชป เ ปตดดู เชอ้ื จากขอ 1.2 ลงในหลอด หลอดละ 0.1 มลิ ลิลิตร เชื้อละ 7
หลอด ยกเวน B. sterarothermophilus ซง่ึ ใชเ พยี ง 5 หลอด

2. การใหค วามรอ น

2.1 นําหลอดเชื้อจากขอ 1.3 ยกเวน B. sterarothermophilus เชื้อละ 6 หลอด
แชในอางนํ้ารอนซึ่งควบคุมอุณหภูมิใหคงที่ที่ 65 องศาเซลเซยี ส โดยใหร ะดบั น้ําใน
อางนํ้ารอนซึ่งควบคุมอุณหภูมิใหคงที่ที่ 63 องศาเซลเซยี ส โดยใหร ะดบั น้ําในอา งอยู
เหนือระดับน้าํ ในหลอด เรม่ิ จบั เวลาเมอ่ื อุณหภมู คิ วบคมุ ซง่ึ มี Thermometer เสียบ
อยู ขึ้นถึงระดับอณุ หภมู ิที่กําหนด ทุกชวงเวลาดังนี้ 5, 10, 15, 20 นาทตี ามลําดบั
หลอด นําหลอดออกจากอางนาํ้ รอนเชื้อละหลอดแลวแชในนํ้าเยน็ ทนั ที

2.2 สาํ หรบั B.sterarothermophilus นําเขาหมอนึ่งอัดความดันไอใหความรอนที่
อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซยี ส (ความดัน 15 ปอนดต อ ตารางนว้ิ ) เปน ระยะเวลาดงั น้ี
5, 10, 15, 20 นาทตี ามลําดบั หลอดซง่ึ นําออกจากหมอนึ่งทุกชวงเวลาใหแชใน
น้ําเยน็ ทันที

3. การตรวจการมีชีวิตรอดของเชื้อหลังจากใหความรอน

3.1 เท GYA ลงในจานเพาะเชอ้ื 6 จาน
3.2 ใชลูปเขี่ยเชื้อจากแตละหลอด (ขอ 2.1 และ 2.2) รวมทั้งหลอดควบคุมที่
ไมไดใหความรอน Streak บนอาหารจานละเชอ้ื แบง ชอ งตามระยะเวลาทใ่ี ห
ความรอนโดยรอบ Streak แตละรอบหางกันพอประมาณ
3.3 เชอ้ื ในจานเพาะเชอ้ื (ขอ 3.2) และในหลอดคุมทุกหลอดยกเวน
B. sterarothermophilus ที่อุณหภูมิหอง สวน B. sterarothermophilus บม ท่ี 55
องศาเซลเซียส
3.4!ตรวจการเจริญเติบโตของเชื้อที่ 2, 5 และ 7 วัน บันทกึ ผลเปรยี บเทยี บการ
เจริญเติบโตมากนอย โดยใชเ ครอ่ื งหมาย + สาํ หรบั หลอดและรอย Streak ทม่ี กี าร
เจริญเติบโตมากที่สุดของแตละเชื้อ 3+, 2+, 1+ และ 1- สาํ หรับหลอดและรอย
Streak ที่เจริญเตบิ โตนอยลงมาตามลําดบั จนไมม กี ารเจรญิ เตบิ โต

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 94

ตาราง 8 เปรยี บเทยี บการทนความรอ นของจลุ นิ ทรยี ต า งๆ

จุลนิ ทรยี  อุณหภูมิ เวลา
(นาที)
(องศาเซลเซยี ส)
10-15
ยีสต 10-15

Vegetative cell 50-58 5-10
Ascospore 60-70 5-10

มียกเวน บางชนดิ 10
2-3
เชอ้ื รา 4-5
18.8
Vegetative cell 60-70 18
สปอรทั่วไป 60-70 15
30
ยกเวนสปอรและ Scleratia ของรา
15
บางชนดิ ทนความรอ นไดส งู มาก 6-10
15-20
แบคทเี รยี 5-15
5-10
แบคทเี รยี ทไ่ี มส รา งสปอร : 300-330
780
Vegetative cell ทั่วไป 80 520
Neisseria gonorhveae 50 >1030
Salmonella typhosa 60 >1030
Staphylococcus aureus 60
E.coli 57
Streptococcus thermophilus 70-75
Lactobacillus bulgaricus 71
สปอรข องแบคทเี รยี : เวลาในการฆา เชอ้ื
ท่ี 100
Bacillus anthracis องศาเซลเซียส
Bacillus cereus

Bacillus subtilis

Clostridium tetani

Clostridium perfringens

Clostridium botulinum (Type A,B)

Putrefactive anaerobes P.A.3679

Clostridium calidotolerance

Bacillus stearothermophilus

Clostridium saccharolyticus var

Xerzones

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 95

การใชแ สงอลุ ตราไวโอเลตทําลายจลุ นิ ทรยี 

แสงอุลตราไวโอเลท เปน แหลง พลงั งานทส่ี ามารถทําลายเชอ้ื จลุ ินทรยี ไ ด
การประยุกตใชแสงอุลตราไวโอเลทในการฆาเชื้อจุลินทรียนับวามีบทบาททสี่ ําคัญใน
ปจจุบัน โดยอาจจะนํามาใชโ ดยตรงกบั การฆา เชอ้ื ในอาหาร สว นมากจะเปน การฆา
เชื้อเครื่องมือ และอาจจะใชในการฆาเชื้อในสภาพสิ่งแวดลอมตางๆของหองเก็บ
วัตถุดิบ สายการผลติ ในโรงงาน รวมทั้งในหองเก็บผลิตภัณฑ

จุลนิ ทรยี 
•Saccharomyces cerevisiae
•Asperqillus niger
•Staphylococcus aureus
•Bacillus subtilis
•Myobacterium sp.
•Bacillus sterarothermophilus

อุปกรณ
•PCA ขวดละ 70 มลิ ลิลิตร
•ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร
•จานเพาะเชอ้ื
•แทงแกวงอ
•แอลกอฮอล
•ปากคบี
•ถุงพลาสติก
•ตตู ิดแสดงอุลตราไวโอเลต
•ขนมปง

การทดลองและรายงานผล
1. การเตรยี มเชอ้ื
1.1 เทอาหารใสจ านเพาะเชอ้ื
1.2 ทาํ Suspension ของเชอ้ื รา

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 96

1.3 ใชปเปตดูด Suspension จากขอ 1.2 และจลุ นิ ทรียอนั ซง่ึ เจรญิ เตบิ โต
ในอาหารเหลวลงบนจานเพาะเชอ้ื (ขอ 1.1) จานละ 0.2 มิลลิลิตร เชื้อละ 5 จาน ใช
แทงแกวงอจุมแอลกอฮอลลนไฟรอจนหมดเปลว เกลย่ี เชอ้ื ใหก ระจายไปทว่ั ๆ ผิวหนา
อาหาร

2. การใหแ สงอลุ ตราไวโอเลต (Ultraviolet; UV)

2.1 เรียงจานเพาะเชอ้ื (ขอ 1.3) ในตูติดแสง UV เชื้อละ 4 จาน ใหร ะยะ
หางจากหลอดแสงเทา ๆ กัน

2.2 เปด ฝาจานนน้ั ปด ครอ มระหวา งจาน 2 จาน เพื่อใหซีกหนึ่งของแตละจาน
ไดรับแสง สว นอกี ซกี หนง่ึ ฝาจานจะบงั แสงไว

2.3 นําจานออกจากตคู รง้ั ละจานตามระยะเวลาการใหแ สงดงั น้ี 15, 30, 45
และ 60 นาที นําไปบม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2 วัน

2.4 ตรวจการเจริญเตบิ โตของเชอ้ื เปรยี บเทยี บการเจรญิ เตบิ โตระหวา ง
เช้ือสวนทไ่ี ดร บั แสง และสวนที่ถูกบงั คับดว ยฝาจาน บนั ทกึ ผลการทดลองโดยใช
เคร่ืองหมาย 4+ สาํ หรบั เชอ้ื ทไ่ี มไ ดร บั แสงในแตล ะจาน 3+, 2+, 1+ และ 1– สําหรบั
การเจริญเติบโตนอ ยลงมาตามลําดบั จนไมม กี ารเจรญิ เตบิ โต

3. การใชแสง UV ทําลายเชอ้ื ในขนมปง

3.1 ใชปากคีบจุมแอลกอฮอล ลนไฟ รอจนหมดเปลว คบี ชน้ิ ขนมปง วางใน
จานเพาะเชื้อ 8 ครง้ั

3.2 เรยี งจานในตซู ง่ึ แสง UV เชน เดยี วกบั ขอ 2.1
3.3 นําจานออกจากตคู รง้ั ละ 2 จาน ตามระยะเวลาเดยี วกบั ขอ 2.1
3.4 ใชป ากคบี จบั แผน ขนมปง ประกบดา นทไ่ี ดร บั แสงเขา ดว ยกนั แลวใส
ถุงพลาสติก รดั ดว ยยาง
3.5 บม ขนมปง ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 5 วัน
3.6 ตรวจการเจรญิ ของจลุ นิ ทรยี บ นชน้ิ ขนมปง ทง้ั ดา นทไ่ี ดร บั แสงและดา นท่ี
ไมไ ดร บั แสง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 97

การหาความชน้ื และประมาณคา Aw ของอาหาร

คา Aw ของอาหารเปนปจ จยั ที่สาํ คญั ปจ จยั หนง่ึ ซง่ึ จะทําใหอ าหารเกดิ การ
เนาเสียโดยจุลินทรียตางชนิดกัน อนั เปน ผลใหเ กดิ การเนา เสยี ในลกั ษณะทแ่ี ตกตาง
กัน ดังนั้นในการผลิตผลิตภัณฑอาหารแหงหรืออาหารกึ่งแหง จึงจําเปนตองลดคา
Aw ของอาหารลง ถึงระดับตาํ่ กวา Minimal Aw ของจลุ นิ ทรียท่ีคาดวา จะมบี ทบาท
ในอาหารประเภทนน้ั ๆ วิธีหาคา Aw นั้นมีหลายวิธีดวยกัน ตลอดจนมีเคร่อื งมอื
Electronic equipment ซึ่งหาคาไดคอนขางละเอียด

ในการศกึ ษานจ้ี ะเปน เพยี งวธิ กี ารประมาณคา ของอาหารอยา งครา ว ๆ เทา นน้ั
โดยใชหลกั การวา ดว ยสารละลายอม่ิ ตวั ของสารใดๆกต็ ามจะมอี นั ดนั ไอคงท่ี เมอ่ื
บรรยากาศเหนือสารละลายมีความดันไอสูงกวาความดันไอจากสารละลายน้ัน
สารละลายจะดดู ความชน้ื จากบรรยากาศจนถงึ สภาวะสมดลุ (Equilibrium) ดังนน้ั
เม่ือนําแผนกระดาษกรองซึ่งชุบสารละลายอิ่มตัวของสารตาง ๆ และใหแหง นํามา
วางไวในภาชนะปด ทม่ี อี าหารทจ่ี ะทดสอบวางอยู ถา อาหารมคี า Aw สูงกวา
สารละลายอิ่มตัวนั้น กระดาษชบุ สารละลายจะดดู ความชน้ื จากอากาศทําใหอ าหาร
เปยกชื้น ถาอาหารมคี า Aw ตํ่ากวาสารละลายอม่ิ ตวั ทท่ี ดสอบ แผน กระดาษชบุ
สารละลายยังคงแหงอยูตามเดิม ดงั นน้ั จากการเปลย่ี นชนดิ ของสารละลายหลายๆ
ชนิด จะทําใหสามารถประมาณคา Aw โดยประมาณเทา กบั ของสารใด

ตัวอยา งอาหาร

•น้ําผง้ึ
•แยมผลไม
•ขนมปง
•ไสกรอก

อุปกรณ

•จานเพาะเชื้อ
•กระดาษกรอง Whatman เบอร 1
•สารละลายอม่ิ ตวั (แสดงไวท า ยบท)
•เทปกาว
•กรรไกร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 98

การทดลองและรายงานผล

1. การประมาณคา Aw

1.1 ตัดกระดาษกรองขนาด 10x1 เซนตเิ มตร ตดั กระดาษกาวยาวประมาณ
3 เซนติเมตร เขยี นหมายเลขบนเทปใหต รงกบั หมายเลขของสารละลายทจ่ี ะใช และ
ใชมือจับปลายดา นทเ่ี ปน เทปกาว จมุ กระดาษกรองลงในสารละลายอม่ิ ตวั จนชมุ
ระวังอยาใหส ารละลายถูกสวนใดสวนหนึ่งของรางกาย นําไปผง่ึ ใหแ หง โดยใหด า นท่ี
เปนเทปกาวติดกับราวไว

1.2 ตัดกระดาษกรองทช่ี บุ สารละลายและทําใหแ หง และยาวชน้ิ ละประมาณ
2.5 เซนติเมตร (จบั กระดาษชบุ สารละลายทกุ ครง้ั ดว ยปากคบี )

1.3 หงายฝาจานเพาะเชอ้ื ขน้ึ พบั เทปกาวประกอบกนั เปน สองหนา กดดา น
หน่ึงใหต ดิ กบั ฝาจาน นํากระดาษชุบสารละลาย (ขอ 1.2) มาแตะใหต ดิ กบั เทปกาวน้ี
โดยใหมีสวนยน่ื ออกมาจากเทปกาวประมาณ 2 เซนตเิ มตร ใชก ระดาษชบุ สารละลาย
ประมาณ 3 ช้ินตอ จาน เขยี นหมายเลขสารละลายบนฝาจาน

1.4 นําอาหารทต่ี อ งการจะทดสอบใสจ านเพาะเชอ้ื ระวงั ไมใ หอ าหารมโี อกาส
แตะกับกระดาษชบุ นํ้ายาเมอ่ื เปด ฝาจานแลว

1.5 ปด ฝาจานแลว ใชเ ทปกาวพนั โดยรอบเพอ่ื ปอ งกนั ความชน้ื จากภายนอก
เก็บจานไวท อ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2 วัน

หมายเหตุ เลือกใชสารละลายอ่ิมตัวทม่ี คี า Aw ใกลเคียงกับคา Aw โดยประมาณของ

อาหาร ดงั น้ี

อาหาร คา Aw

ไสกรอก 0.94-0.99

ขนมปง 0.92-0.98

แยมผลไม 0.80-0.90

น้ําผึ้ง 0.70-0.85

1.6 สังเกตความชื้นของกระดาษกรอง วาอาหารแตล ะชนดิ ทําให
กระดาษกรองซง่ึ ชบุ สารอะไรเปย กชน้ื ไดบ า ง และสารอะไรซง่ึ ยงั คงแหง อยู บนั ทกึ คา
Aw ของอาหารโดยเปรยี บกบั Aw ของสารละลาย

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 99

2. การหาความชน้ื ของอาหาร

2.1 ชง่ั Beaker ขนาด100 มิลลิลิตร ใหท ราบน้าํ หนกั ตกั อาหารใส Beaker
ช่ังใหไดนํ้าหนกั อาหาร 10 กรัมนําไปอบท่ี 110 องศาเซลเซียส เปนเวลา 12 ชว่ั โมง
ทิ้งใหเ ยน็ ใน Desiccator ช่ังหาน้าํ หนกั แหง คํานวณหาความชน้ื ของอาหารคดิ เปน
รอ ยละ

ตาราง 9 คา AW ของสารละลายอม่ิ ตวั ของสารตา ง ๆ ทอ่ี ณุ หภมู ติ า ง ๆ

สาร คา Aw อุณหภูมิ

Na2HPO4.12H2O 0.990 20
Pb(NO3)2 0.985 20
K2Cr2O7 0.980 25
Na2SO4.10H2O 0.975 20
NaBrO3 0.955 20
KNO3 0.950 20
KNO2 0.924 25
ZnSO4.7H2O 0.905 20
Na2CO3.10H2O 0.870 25
KCl 0.842 25

KBr 0.807 25

NH4Cl 0.793 25
NaCl 0.752 25

NaNO3 0.737 25
SrCl2.6H2O 0.708 25
NaNO2 0.660 20
NaBr.2H2O 0.577 25

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 100

ตาราง 10 เปรยี บเทยี บระหวา ง Aw และความเขม ขน ของน้ําเกลอื

Aw ความเขม ขน ของน้ําเกลอื

Molar รอ ยละ (w/v)

0.995 0.15 0.9

0.99 0.30 1.7

0.98 0.61 3.5

0.96 1.20 7.0

0.94 1.77 10.0

0.92 2.31 13.0

0.90 2.83 16.0

0.88 3.33 19.0

0.86 3.81 22.0

ตาราง 11 Aw ของนา้ํ บรสิ ทุ ธท์ิ อ่ี ณุ หภมู ติ า งๆกนั

Aw อุณหภมู ิ(องศาเซลเซยี ส)

1.00 0
0.953 5
0.907 -10
0.864 -15
0.823 -20

ตาราง 12 คา Aw ต่ําสุดสําหรบั จลุ นิ ทรยี ต า งๆ Aw ต่ําสดุ

จุลนิ ทรยี  0.91
0.88
Normal bacteria 0.80
Normal yeasts 0.75
Normal molds 0.65
Halophilic bacteria 0.65
Xerophilic molds
Osmophilic yeasts

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 101

การยบั ยง้ั การเจรญิ ของจลุ นิ ทรยี ด ว ยการลด Aw ของอาหาร

การใชเทคนิคการลดปริมาณอิสระหรือนํ้าทเ่ี ปน ประโยชนต อ การเจรญิ เตบิ โต

ของเช้ือจุลินทรียในผลติ ภณั ฑน บั วา มคี วามสําคญั มาก เนอ่ื งจากปจ จยั น้าํ อสิ ระทม่ี อี ยู

ในอาหารเปนปจ จัยบง ชี้ถงึ ความคงตวั และการเนา เสยี ของผลิตภณั ฑ นอกจากจะเปน

ปจจัยที่ทําใหเกดิ การเปลย่ี นแปลงทางจลุ ินทรยี ใ นอาหารแลว ยังมีผลตอการ

เปลี่ยนแปลงคุณภาพทางดา นเคมแี ละกายภาพอกี ดว ย อยา งไรกต็ ามการไดข อ มลู

ของการเจริญเติบโตของเชือ้ จุลินทรยี ที่คา น้ําอสิ ระตา งๆ จะเปน แนวทางในการใช

ประยุกตเพื่อการผลิตผลิตภัณฑอาหารไดอยางดี เชน เดยี วกบั การประยกุ ตใ ชค วาม

เปนกรดเปน ดา งในการผลติ ผลติ ภณั ฑอ าหาร แตอ าจจะแตกตา งกนั ในรายละเอยี ด

ของผลิตภัณฑน้นั ๆ

จุลนิ ทรยี 

•Sacharomyces cerivisiae
•Saccharomyces rouxii
•Pichia sp.
•Aspergillus niger
•Aspergillus glaucus
•Pseudomonas fluorescens
•Staptylococcus aureus

อุปกรณ

•GYB (Glucose Yeast extract agar) เติมเกลือระดับตางๆ คือ
รอยละ 0.9, 8.5, 10.0, 16.0, 22.0 ระดบั 7 หลอด

การทดลองและรายงานผล

1. เตรยี ม Suspension ของสปอรเ ชอ้ื รา
2. ใชสูปแตะ Suspension สปอรข องเช้อื รา และจลุ นิ ทรียช นดิ อน่ื ๆ ซง่ึ
เจรญิ ในอาหารเหลว Inoculate ใน GYB ที่เติมเกลือระดับตาง ๆ กัน
3. บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง
4. ตรวจผลการเจรญิ เตบิ โตตามระยะเวลาดงั น้ี 2 และ 5 วัน ตามลําดบั
บันทึกผลเปรียบเทยี บการเจรญิ เตบิ โตมากนอ ย โดยใชเ ครอ่ื งหมาย 4+ สําหรบั

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 102

หลอดที่เจริญเติบโตหรือเกิดสปอรมากที่สุด 3+, 2+ และ 1- สาํ หรบั หลอดทม่ี กี าร
เจรญิ เติบโตและการเกิดสปอรนอ ยลงตามลาํ ดบั

5. คาํ นวนคา AW ของอาหารที่เติมเกลือแตละระดับ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 103

ประสทิ ธภิ าพของสารกนั เสยี ( Preservatives) ในอาหารทม่ี ี
ความเปน กรดตา งๆ กัน

สารกนั เสยี (Preservatives) เปนสารเจอื ปนทใ่ี ชใ นอุตสาหกรรมอาหารกนั
อยางมาก ท้ังน้ีดวยเหตผุ ลทต่ี อ งการลดการเปลย่ี นแปลงตา งๆในอาหารเชน การ
เปล่ียนแปลงทางเคมี กายภาพ และทางจลุ นิ ทรีย เพื่อใหอาหารและผลิตภัณฑอาหาร
สามารถเก็บรักษาไวไ ดนาน อกี ทง้ั มสี ภาพทส่ี ามารถบรโิ ภคได แตอยางไรก็ตามควร
ใชในปริมาณท่ีกฎหมายอาหารระบใุ หใ ชไ ด ซง่ึ มอี ยหู ลายชนดิ เชน กรดอนิ ทรยี ต า งๆ
กรดเบนโซอิคและเกลือเบนโซเอท กรดโพรปโอนิคและเกลือโพรปโอเนท กรด
ซอรบิคและเกลือซอรเบท สารประกอบประเภทพาราเบน รวมทง้ั สารประกอบ
บางอยางตามธรรมชาติเปนตน การใชส ารกนั เสยี ในแงป อ งกนั การเปลย่ี นแปลงจาก
เชื้อจุลินทรียจําเปนที่ตองทราบวาสารกันเสียใดมีประสิทธิภาพตอเชื้อจุลินทรียชนิด
ใด เพ่ือใชเปน ขอ มลู ประกอบการนําสารกนั เสยี ไปใชใ หถ กู ประเภท และใชรว มกบั
ปจจัยอื่นๆที่มีผลรวมกับสารกันเสีนน้ันๆในการยับย้ังและปองกันการเจริญเติบโต
ของเช้ือจลุ ินทรยี  เชน ความเปน กรดเปน ดา ง (pH) เปน ตน

จุลนิ ทรยี 

•Saccharomyces cerevisiae
•Aspergillus niger
•Lactobacillus sp

อุปกรณ
•GYB เตมิ Sodium benzoate รอ ยละ 0.1 pH 3.0, 4.0, 5.0

ระดบั pH ละ 3 หลอด
•GYB เติม Potassium sorbate รอ ยละ 0.1 pH 3.0, 4.0, 5.0 และ

6.0 ระดบั pH ละ 3 หลอด
•GYB เติม Potassium metabisulfite 100 ppm pH 3.0, 4.0, 5.0

และ 6.0 ระดบั pH ละ 3 หลอด

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 104

การทดลองและรายงานผล

1. เตรยี ม Suspension ของ A. niger
2. ใชลูกเขี่ย Suspension ของ A. niger เชื้อยีสตและแบคทีเรียซึ่ง
เจริญเติบโตในอาหารเหลว เชื้อละ 1 ลูป Inoculate ในอาหารซง่ึ เตมิ สารกนั เสยี
ท้ังสามชนดิ ทกุ ระดบั
3. บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง
4. ตรวจผลทร่ี ะยะเวลา 2 และ 5 วัน
5. บนั ทกึ ผลเปรยี บเทยี บการเจรญิ เตบิ โตโดยใชเ ครอ่ื งหมาย 4+, 3+, 2+,
1+ และ 1- สําหรับหลอดที่เจริญเติบโตที่สุด และนอ ยลงมาตามลาํ ดบั จนถงึ ไมม กี าร
เจริญเตบิ โต

ตาราง 13 การประยกุ ตใ ช Propionate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า

ผลติ ภณั ฑ ปริมาณการใช

ตอ 100 กรมั ของแปง หรอื เนย

White bread, rolls etc. 0.16-0.31

Dark breads 0.19-0.375

Cakes 0.44

Pasteurized process Up to 0.3 % maximum

Cheese and cheese foods

And cold pack cheese food

ตาราง 14 การประยกุ ตใ ช Sodium benzoate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า

ผลติ ภัณฑ ปรมิ าณการใช( รอ ยละ)

Carbonate beverages 0.03--0.05

Fruit drinks 0.05--0.1

Beverage syrups 0.1

Cider 0.05--0.1

Margarine 0.1

Fruit pie fillings 0.1

Prepared salads 0.1

Jam and Jellies 0.1

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 105

ตาราง 15 การประยกุ ตใ ช Sorbate และปริมาณการใชใ นอเมรกิ า

ผลิตภัณฑ ปริมาณการใช (รอ ยละ)

Cheese and cheese products 0.2-0.3

Fruit drinks 0.025-0.075

Beverage syrups 0.1

Cider 0.05-0.1

Wine 0.03-0.04

Cakes and icing 0.05-0.1

Pie fillings 0.05-0.1

Margarine (unsalted) 0.1

Prepared salads 0.05-0.1

Dried fruits 0.02-0.05

Dog food patties 0.3

Dried sausage Casings are treated with

2.5 % potassium sorbate solution

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 106

การวิเคราะหนํ้า

น้ําเปนสวนประกอบที่สําคัญเก่ียวขอ งในอุตสาหกรรมการทําหรอื ผลิตอาหาร
มาก น้ํามีอยูในอาหารทกุ ชนิด มากหรอื นอ ยแตกตา งกนั ไปตามประเภทของอาหาร
น้ันๆและจากน้ําที่ใชในการลางอาหารหรือทําความสะอาดเครื่องมือผลิตอาหารตางๆ
ดังนั้นนํ้าที่ใชในอุตสาหกรรมอาหารตางๆจึงควรปราศจากพวกจุลินทรียที่เปนตัวการ
ท่ีทําใหเกิดโรค และจลุ นิ ทรียท่ีเปนสาเหตทุ ําใหอ าหารนน้ั ๆเนา เสยี ได วธิ ีการตรวจ
หาจุลินทรียในนํ้าจึงเปน วธิ หี นง่ึ ทใ่ี ชต รวจหาความเหมาะสมของน้ําทจ่ี ะใชใ น โรงงาน
อาหาร ซ่ึงอาจเปน สาเหตทุ ําใหเ กดิ โรคหรอื อาหารทผ่ี ลติ ขน้ึ มานน้ั เนา เสยี ไดง า ยหรอื
รวดเรว็

การสมุ ตวั อยา ง ตัวอยางของนํ้าทจ่ี ะนํามาทดสอบนน้ั ควรเก็บในขวด
ปากกวา งทม่ี ี Ground glass sloppers ปดเรียบรอ ยและผา นการฆา เชอ้ื มาแลว
ถาหากวานํ้าที่นํามาทดลองเปน นา้ํ ที่ผสมคลอรีนอยูดวย ในขวดตัวอยาง น้าํ ควรจะมี
0.1 มิลลิลิตรของสารละลาย Sterile sodium thiosulphate รอยละ 2 ตอตัวอยางนํ้า
100 มลิ ลิลิตร

การเตรียมตัวอยาง กอนท่ีจะใชน้ําตวั อยางทําการทดลอง ควรเขยา ขวด
เก็บนํ้าตัวอยางเสียกอน และเตรยี มการเจอื จาง 1:10 และ 1:100 และกอ นนํา
สารละลายเจือจางแลวทั้งสองไปใชควรเขยากอนใชดวย

การตรวจสอบ Coliform bacteria
1.! Presumptive test

1.1!Inoculation น้ําตัวอยางอยางละ 1 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลองที่มี
Lactose broth พรอ มทง้ั Durham tube อยูดวย

1.2!ทําการบม เพาะเชื้อของหลอดทดลองทั้งหมดที่อุณหภูมิ 35+0.5
องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง หลงั จากนก้ี ต็ รวจดกู า ซ ถา หากมี
กาซเกิดขึ้นในหลอดดักกาซแสดงวาเปน Positive (+)
Presumption test สําหรับหลอดท่ีไมม กี า ซเกดิ ขน้ึ กน็ ําไปบม เพาะ
เชื้อตออีก 24 ชว่ั โมง ตรวจดูผลเชนเดียวกัน หลอดไหนที่ไมเกิด
กาซภายใน 48 ชว่ั โมง ถือวาเปน Negative (-)

2.! Confirmed test
การทดสอบจะใชอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด Brilliant green lactose bile
broth, Endo agar หรอื Eosin methylene blue agar (EMB agar)

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 107

ทําตอ จาก Presumption test จากหลอดทม่ี กี ารหมกั เกดิ ขน้ึ ทง้ั ท่ี 24
และ 48 ชว่ั โมง

2.1!Streak บนอาหารพวก EMB agar plate ดวย Inoculum ท่ีไดจ าก
หลอด Positive presumption test

2.2!นํา Plate เหลานไ้ี ปบม เพาะเชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35+0.5 องศาเซลเซียส
นาน 24 ชว่ั โมง และตรวจดูลักษณะของโคโลนีของพวก Coliform
bacteria ถาหากมกี แ็ สดงวา Confirmed test เปน Positive (+)

3.! Completed test

เปนการทําตอ จาก Confirmed test โดยทําการทดลองดงั น้ี
3.1!เลือกเอาโคโลนีที่แสดงลักษณะของ Coliform bacteria
3.2!เขี่ยเอาโคโลนีนั้นลงใน Lactose broth fermentation tube และ

ลงใน Nutrient agar slant

3.3!ทําการบมเพาะเชื้อของหลอดเหลานี้ที่อุณหภูมิ 35+0.5 องศา
เซลเซียส นาน 24-48 ชว่ั โมง

3.4!ตรวจดูหลอดทดลองที่ใหกาซออกมา เตรยี ม Gram stained
smears จาก Nutrient agar slants ใหตรงกับหลอดที่ทําใหเ กดิ กา ซ
ถาเปน Coliform bacteria มีลักษณะเปน Nonspore forming, Rod
shaped bacteria และ Gram negative

4. รายงานผลการตรวจหา Coliform bacteria
การรายงานผลแสดงในรปู Most Probable Number (MPN) ในนํ้า

ปฏิกิริยาของแบคทีเรียในนํ้าตอ Litmus milk

Inoculate litmus milk tube ดวย 0.1 มิลลิลิตรของนํ้าตัวอยาง และนําไปบม
เพาะเช้ือที่อุณหภูมิ 30-32 องศาเซลเซียส นาน 2-5 วัน รายงานผลการเปลย่ี นแปลง
ในนม ถามีการเปลย่ี นแปลงใหต รวจดผู ลการเปลย่ี นแปลงโดยนํามา Smear และยอม
สแี กรม

Plate count ของนํ้า

Inoculate จานเพาะเชื้อดวยตัวอยางที่เจือจางเปน 1:10 และ 1:100 และเท
Plate count agar ลงไปในจานเพาะเชื้อ ทาํ การบม เพาะเชอ้ื สว นหนง่ึ ท่ี 30-32 องศา
เซลเซียส นาน 2 วัน อกี สว นหนง่ึ นําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 7 องศาเซลเซยี ส นาน 10 วัน
นับจํานวนโคโลนี และรายงานผล รวมทง้ั ลกั ษณะของโคโลนที เ่ี กดิ ขน้ึ บนจานเพาะ
เชื้อดวย

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 108

การวเิ คราะหเ ครอ่ื งดม่ื บรรจขุ วด

เน่ืองจากเคร่ืองด่ืมตางๆไดเขามามีอิทธิพลตอการบริโภคของประชาชน
มากขึ้น การตรวจหาจุลินทรยี ใ นอาหารประเภทน้ีจึงเพิ่มความสาํ คญั ขน้ึ เปน ลาํ ดบั
การผลิตเคร่ืองดมื่ ตางชนดิ กันกม็ ีความแตกตางกนั มาก แตล ะชนดิ มสี ว นประกอบ
และกล่ินแตกตางกันไปข้ึนอยูกับวัตถุดิบท่ีนํามาใชในการผลิตและกระบวนการผลิต
สวนมากจะประกอบดวยนํ้า น้าํ ตาล และกรดตางๆ อาหารเครอ่ื งดม่ื เหลา น้ี
ตองปราศจากจุลินทรียที่ทาํ ใหเ กดิ โรคกบั ผบู รโิ ภคโดยเดด็ ขาด เนื่องจากเครื่องดื่ม
เหลานไ้ี มม กี าร Sterilization กอนสงออกจาํ หนา ย ฉะนน้ั การตรวจหาจลุ นิ ทรยี ใ น
สวนประกอบแตละชนดิ จงึ มคี วามสําคญั ทาํ ใหท ราบถงึ จดุ ทอ่ี าจทําใหเ ครอ่ื งดม่ื นน้ั ๆ
มีเช้ือโรคแพรป ะปนหรอื เกดิ การเนา เสยี ได

วิธีการตรวจสอบ
1.! น้ํา ทําการตรวจหาจลุ นิ ทรียเชนเดยี วกบั ทก่ี ลา วในเรอ่ื งการวเิ คราะหน ้ํา
2.! น้ําตาล น้ําตาลท่ีใชใ นการผลติ เครอ่ื งดืม่ ควรปราศจากจลุ นิ ทรียท เ่ี ปน

ตัวทําใหเนาเสีย การตรวจอาจทําไดโ ดย
2.1 ตัวอยา ง นําเอาตัวอยา งน้ําตาล 0.5 ปอนด ใสลงในขวดปากกวางที่

ผานการฆาเชื้อแลว โดยใชชอนหรือถวยที่ฆาเชื้อเรียบรอยตักใสใน
ขวดพรอ มกบั ปด ใหส นทิ
1.2!วิธีวิเคราะหทางจุลินทรีย ชง่ั น้าํ ตาล 100 กรมั ใสใ นภาชนะทผ่ี า น
การฆาเชื้อมาแลว เตมิ น้ําทผ่ี า นการฆา เชอ้ื มาแลว เชน กนั จํานวน
102.5 มิลลิลติ ร (แตละ 2.1 มิลลิลิตรของนํ้าเชอ่ื มทไ่ี ดจ ะมนี ้ําตาลอยู
1.25 กรัม) ดูดเอา 2.1 มิลลิลิตรของนํ้าเชอ่ื มใสล งในจานเพาะเชอ้ื
2 จาน เติม Total plate count agar สําหรับนับจํานวนจลุ นิ ทรยี 
ท้ังหมด และอีก 4 จานใหเ ทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Mycological agar ซง่ึ
ทําใหมีความเปนกรดแลว หรอื Malt agar สําหรับยีสตและเชื้อรา
นําไปบมเพาะเชื้อที่ 30-32 องศาเซลเซียส นาน 3 วันและ 3-5 วัน
ตามลําดบั
3.! น้ําเชอ่ื ม ทําเชนเดียวกับนํ้าตาล
4.! กลิ่นและสารใหสีตางๆ พวกสารท่ีทําใหเกิดกลิ่น รส ความเปน กรด
หรือสี ควรจะปราศจากเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท ท่ี ําใหเ กดิ การเนา เสยี ได
4.1!ตัวอยาง ถา เปน น้ําใหน ํามา 50 มิลลิลิตร แตถาเปนของแหงควร
ทําใหเปนสารละลาย (Stock solution) ท่ีมีความเขม ขน รอ ยละ 1

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 109

4.2!การวเิ คราะหจ ุลินทรีย พวกที่เปน Liquid flavoring หรอื Coloring
ตองทําการเจอื จางเปน 1:10 กอนทจ่ี ะเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื ดูดเอา
1 มิลลิลิตร และ 0.1 มลิ ลลิ ติ รของตวั อยา งมาใสใ นจานเพาะเชอ้ื
อยางละ 2 จาน เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Total plate count agar ลงไป
และอีกอยางละ 2 จาน เทดว ยอาหารเลย้ี งเชอ้ื Mycological agar ท่ี
ไดทําใหม คี วามเปน กรดแลว หรอื Malt agar นําไปบมเพาะเชื้อที่
30-32 องศาเซลเซียส นาน 3 และ 3-5 วัน ตามลําดบั รายงาน
ปรมิ าณของ Mesophilic colonies ตอมิลลิลิตรของสารละลาย
เร่ิมตน หรอื ตอกรัมของวัสดุแหงที่ใชเปนตัวอยาง

5.! ขวดบรรจุท่ีผา นการลา งทําความสะอาดแลว ในขวดบรรจเุ ครอ่ื งดม่ื

กอนท่ีจะบรรจุควรปราศจากเชื้อจุลินทรียท่ีมําใหเกิดโรคและจุลินทรียที่
ทําใหอาหารเนาเสีย
5.1!ตัวอยาง นําเอาขวดทจ่ี ะบรรจเุ ครอ่ื งดม่ื มา 5 ขวด ภายหลงั ทผ่ี า น

การลา งเรยี บรอ ยแลว ปดจุกดวย Sterile stopper เกบ็ ที่ 4 องศา
เซลเซียส และตรวจผลภายในเวลาไมเกิน 4 ชว่ั โมง ถา หากวา ไมไ ด
ตรวจผลในทนั ที
5.2!การวิเคราะหจุลนิ ทรยี 
5.2.1! ถาหากเปน ขวดใสไมม สี ี ใหเทอาหารเล้ียงเชอ้ื Total plate

count agar 10 มลิ ลิลิตร ลงไปในขวด และหมนุ ขวดไป
รอบๆ เมื่อเย็นลงแลว นําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 32 องศา
เซลเซียส และนบั จํานวนโคโลนี ภายหลงั 3-5 วัน
5.2.2! ถาหากตองการตรวจอยา งละเอียด อาจทาํ ไดโ ดยเตมิ น้าํ ท่ี
ผานการฆาเชื้อมาแลวจํานวน 10 มลิ ลิลิตร ลงไปในขวด
พรอมท้ังทรายทผ่ี า นการฆา เชอ้ื แลว เชน กนั เขยา ใหท ว่ั
ท้ังขวด ดูดเอาน้ําในขวดใสใ นจานเพาะเชอ้ื 2 จาน
เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Total plate count agar ลงไป และ
อีก 2 จาน เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Malt agar ลงไป นําไปบม
เพาะเช้ือที่ 32 องศาเซลเซยี สนาน 3 และ 3-5 วันตามลําดบั
รายงานผลการตรวจ
5.2.3! ถาหากขวดนั้นมีสี มองขา งในเหน็ ไมช ดั เจน ควรจะทําตาม
วิธีที่ 2 ขา งตน
6.! ฝาจบี สวนทางดานในของฝาปด หรือกระปอง ท่ีมโี อกาสสมั ผสั กับ

เคร่ืองด่ืมควรจะปราศจากจลุ นิ ทรยี ท จ่ี ะมผี ลตอ เครอ่ื งดม่ื

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 110

6.1!ตัวอยาง นําฝามาจํานวน 10 ฝาจากกลอ งทย่ี งั ไมไ ดเ ปด นํามาเกบ็
ใน Sterile jar โดย Sterile tongs พยายามไมหยบิ ใหแตะสวนดาน
ในของฝาปด

6.2!วิเคราะหจุลินทรีย นําฝาปด มาเผาดว ยเปลวไฟทางดา นนอก จงึ จะ
ไมใหส ว นดา นในของฝาถกู กบั เปลวไฟ อาจจะใชแอลกอฮอลรอยละ
70 เช็ดเอาก็ได วางฝาปด ลงในจานเพาะเชอ้ื และเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื
Total plate count agar และ Malt agar นําไปบมเพาะเชื้อที่ 30-32
องศาเซลเซยี ส นาน 3 วัน และ 3-5 วันตามลําดบั รายงานผลการ
ตรวจสอบของแตละโคโลนีตอฝาปด 1 ฝา
อีกวิธีหนึ่งอาจจะทําไดโดยใสฝาปด ลงไปในน้ําทผ่ี า นการฆา
เชื้อแลว 20 มลิ ลิลิตร จาํ นวน 5 ฝา ในน้ํานน้ั มที รายทผ่ี า นการ
ฆาเชื้อแลวเชนกัน เขยา แรงๆ นําสว นเปน น้าํ 4 มลิ ลิลิตร ใสลงใน
จานเพาะเชื้อ 2 จาน และเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Total plate count
agar ลงไป และอีก 2 จานเตมิ Malt agar ลงไป นําไปบม เพาะเชอ้ื
ท่ี 30-32 องศาเซลเซยี ส นาน 3 และ 3-5 วันตามลําดบั

7.! ผลิตภัณฑเครื่องดื่มสุดทาย

7.1!ตัวอยาง นําเอาตวั อยา งมา 2 ขวด หรอื 2 กระปอ ง โดยใชวิธีการ
สมุ ตวั อยา ง

7.2!การวิเคราะหจลุ ินทรยี  เปดฝาขวดหรือกระปองแลวเผาปากขวด
หรือกระปองดวยเปลวไฟ ถาหากเปน กระปอ งควรลา งดว ยน้ํากอน
แลวนําไปเช็ดดวยแอลกอฮอล และเผาดวยเปลวไฟ เปดดวย
Sterile opener ใชปเปต 10 มิลลิลิตรดูดเอาสารละลายออกมาใสใน
จานเพาะเชื้อ 2 จาน เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Total plate count agar
และอีก 2 จานเทดว ย Malt agar โดยทําจานละ 1 มิลลิลิตร และ
0.1 มิลลิลิตร นําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30-32 องศาเซลเซียส นาน
3 และ 3-5 วัน ตามลําดบั รายงานผลการทดลองเปน จลุ ินทรยี เ ฉลย่ี
ที่มีในเครื่องดื่ม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 111

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ใ นผลติ ภณั ฑป ระเภทคารโ บไฮเดรต

อาหารจําพวกคารโบไฮเดรตไดถูกนํามาใชในการผลิตผลิตภัณฑอาหาร
ตางๆหลายชนิด เชนพวกนํ้าตาล ซง่ึ อาจถกู แพรเ ชอ้ื ปะปนโดยพวกแบคทเี รยี ยีสต
และเชื้อรา ซง่ึ แหลง คารโ บไฮเดรตเปน แหลง พลงั งานทด่ี ขี องเชอ้ื จลุ นิ ทรีย การ
วิเคราะหปริมาณจุลินทรียในอาหารประเภทคารโบไฮเดรตกอน ทาํ ใหท ราบถึงสภาพ
ของอาหารนั้นๆ ชว ยในการทําใหผ ลติ ภณั ฑอ าหารทม่ี คี ารโ บไฮเดรตอยดู ว ยมี
คุณภาพดีขึ้น ในการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี จ ะเปน ดชั นบี ง ชถ้ี งึ การแพรป ะปนในอาหาร
คารโบไฮเดรต ทอ่ี าจทําใหเ กดิ ปญ หาในผลติ ภณั ฑอ าหารทใ่ี ชค ารโ บไฮเดรตเปน
สวนประกอบได

การตรวจหาจุลินทรียในนาํ้ ตาล

ตัวอยา งอาหาร

•น้ําตาลทรายขาว
•น้ําตาลสีราํ
•น้ําตาลทรายแดง
•น้ําตาลปบ

อุปกรณ

•ฟลาสคขนาด 250 มลิ ลิลิตร หรอื ขวดมขี ดี บอกระดบั ปรมิ าตร 100
มิลลิลิตร ขวดบรรจุ Diluent
•จานเพาะเชื้อ
•Brewer' thiogbycollate broth
•Sulfite agar
•วุนรอ ยละ 3 ขวดละ 25 มิลลิลิตร
•Bromcresol purple agar (BCP) ขวดละ 100 มิลลิลิตร
•Glucose yeast extract agar (GY) ขวดละ 100 มลิ ลิลิตร
•Oxytetracycline รอ ยละ 0.1
•อางน้ําอนุ ควบคมุ อณุ หภมู ิ 100 องศาเซลเซยี ส

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 112

การทดลองและรายงานผล

1. การทําใหน า้ํ ตาลเจอื จาง

เตรยี มตัวอยา งน้าํ ตาลใหเ จอื จางในระดบั 1:5 โดยชง่ั น้ําตาล 20 กรมั ใสใน
ขวดหรือฟลาสคซึ่งมีขีดบอกระดับ 100 มิลลิลิตร เท Diluent ลงไปใหถึงระดับ
ดังกลาว เขยา ใหน ้ําตาลละลายเปนเน้ือเดียวกัน

2. ตรวจนบั จํานวน Mesophile

2.1 ตรวจนับจํานวนจลุ นิ ทรยี ท ง้ั หมด (Total count) และ

จุลินทรยี ท ส่ี รา งกรด

2.1.1 ตรวจนับดวยวิธี Shake plate โดยใชต วั อยา งเจอื จาง 1:5
จานละ 2 มิลลิลิตร 5 จาน ใช BCP agar เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง
2 - 5 วัน

2.1.2 รายงานเปนจํานวนจลุ นิ ทรยี ท ง้ั หมดตอ อาหาร 10 กรมั โดย
นับจํานวนจุลนิ ทรยี ท ง้ั หมดรวมทง้ั 5 จาน แลวคูณดวย 5

2.1.3 นับเฉพาะจํานวนจลุ ินทรยี ท ส่ี รา งกรด ซ่ึงจะสงั เกตไดจ าก
การเกดิ บรเิ วณสเี หลอื งรอบโคโลนี รายงานผลเปนจํานวนจลุ นิ ทรียตอ น้าํ ตาล
10 กรมั เชนเดียวกัน

2.2 ตรวจนบั จํานวนเชอ้ื ยสี ตแ ละเชอ้ื รา

2.2.1 หลอม GY agar ตง้ั ทง้ิ ไวจ นเยน็ ลงถงึ ระดบั ประมาณ 60
องศาเซลเซยี ส เติม Oxytetracycline glucose yeast extract agar เปน อาหาร
เพาะเชอ้ื บม เชือ้ ทอ่ี ุณหภมู หิ อ ง 2 - 5 วัน

3.ตรวจนบั สปอรข อง Thermophile

3.1 การเตรียมตัวอยางอาหาร นําตวั อยา งน้ําตาลเจอื จาง 1:5 ซง่ึ ตรวจนบั
จํานวน Mesophile แลว มาแชใ นหมอ น้ําตมเดือดตลอดเวลาเปนเวลา 6 นาที เพื่อ
ทําลายเซล

3.2 ตรวจนบั จํานวนสปอรข องแบคทเี รยี Flat sour วิธีเดียวกับขอ 2 โดย
ใช BCP agar เปนอาหารเพาะเชอ้ื บม เชอ้ื ท่ี 55 องศาเซลเซียส นาน 2 - 5 วัน
นับจํานวนโคโลนแี บคทเี รยี Flat sour ซง่ึ จะมลี กั ษณะโคโลนเี ลก็ ๆ ขนาดเสน
ผาศูนยกลางประมาณ 2 - 5 มิลลิลิตร กลางโคโลนมี สี นี ้ําตาลเขม รอบๆ โคโลนี
บริเวณสีเหลือง ซ่ึงเกดิ จากการสรา งกรด รายงานผลเปน จํานวนตอ น้าํ ตาล 10 กรมั
เชนเดียวกัน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 113

3.3 ตรวจสปอรของ Thermophilic anaerobe (T.A.) ทไ่ี มส รา ง H2S
3.3.1 ตม Brewer's thioglycolate broth ทง้ั 6 หลอด เพื่อไลอากาศที่

ละลายอยใู นอาหารออกใหห มด ทง้ิ ไวใ หเ ยน็ ลงประมาณ 50 องศาเซลเซยี ส
3.3.2 ใชปเปตดูดตัวอยางนํ้าตาลจากขอ 3.1 ครั้งละ 10 มิลลิลิตร

สองครง้ั แบงใสหลอดอาหารซึ่งตมไลอากาศแลว (ขอ 3.3.1) หลอดละประมาณ
3.3 มลิ ลิลิตร

3.3.3 คอยๆ เทวุนรอยละ 3 ทบั หนา ใหห นาประมาณ 2 เซนตเิ มตร
3.3.4 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 55 องศาเซลเซยี ส นาน 2 - 5 วัน
3.3.5 ตรวจการเจรญิ เตบิ โตของแบคทเี รยี กลมุ น้ี ซง่ึ เมอ่ื มกี าร
เจริญเติบโตจะสรา งกาซ CO2 และ H2 ดันวุนที่ทับหนาใหแยกตัวออกจากผิวหนา
อาหาร รายงานผลเปนจํานวนหลอดทม่ี กี ารเจรญิ เตบิ โต
3.3.6 เตรียมสไลด ยอ มสแี กรม สังเกตการตดิ สแี ละรูปรางของเชื้อ
3.4 ตรวจนบั สปอรข อง Thermophilic anaerobe ทไ่ี มส รา ง H2S ซง่ึ
แบคทีเรียกลมุ นก้ี อ ใหเ กดิ การเนา เสยี โดยสรา งกา ซ H2S ในอาหาร(Sulfide spoilage
microorganism)
3.4.1 ตม Sulfite agar เพื่อไลอากาศออกใหหมด
3.4.2 ใชป เปตดูดตัวอยางจากขอ 3.1 ครั้งละ 10 มิลลิลิตร สองครั้ง แบงใส
หลอดอาหารประมาณหลอดละเทา ๆ กัน เขยาหลอดโดยระวังไมใหเกิดฟองอากาศ
3.4.3 เทวุนรอยละ 3 ทบั หนา ใหห นาประมาณ 2 เซนตเิ มตร
3.4.4 บม ท่ี 55 องศาเซลเซยี ส นาน 2 - 5 วัน
3.4.5 นบั จํานวนโคโลนขี องแบคทเี รยี กลมุ น้ี ซง่ึ จะมโี คโลนสี ีดาํ เนื่องดวย
กาซท่ีเช้ือสรา งขน้ึ ทําปฏกิ ริ ยิ า Ferric acetate ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื รายงานผลเปน
จํานวนตอนํ้าตาล 10 กรมั โดยรวมจํานวนโคโลนใี นหลอดอาหารทง้ั 6 หลอดแลว
คูณดวย 2.5

การตรวจหาจุลินทรียในแปง
1.! การตรวจหาจุลินทรียประเภท Mesophiles

ช่ังแปง มา 11 กรมั ใสลงใน Sterile water blank 99 มลิ ลิลิตร พรอม
ดวยทรายท่ีผา นการฆา เชอ้ื มาแลว เขยา 2 นาที ปลอยใหตกตะกอน เตรยี มทําการ
วิเคราะห

1.1! จุลนิ ทรียท้ังหมด ใชส ารละลายทเ่ี จอื จางแลว 1 มิลลิลิตร และ
เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Dextrose tryptone bromcresol purple agar
ทําการบมเพาะเชื้อท่ี 30-32 องศาเซลเซียส นาน 2-3 วัน นบั
จํานวนจุลนิ ทรยี ท ง้ั หมดรวมทง้ั Acid และ Nonacid colonies

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 114

1.2! จุลินทรยี ท ไ่ี มต อ งการอาหารทง้ั หมด (Total anaerobes) ใช
สารละลายที่ทาํ การเจอื จางมาแลว 1 มลิ ลิลิตร เติมลงใน Freshly
melted plate count agar ท่ีทําใหเย็น 45 องศาเซลเซียส ภายหลงั
แข็งตัวแลว ใหปดทับดวย Nutrient agar สูง 0.5 นว้ิ นําไปบม
เพาะเชื้อท่ี 30-32 องศาเซลเซยี ส นาน 2-3 วัน รายงานจํานวน
จุลินทรยี ท ไ่ี มต องการอากาศ

2.! การตรวจหาจุลินทรียประเภท Thermophiles

2.1! Flat sour spores นําสารละลายทเ่ี จอื จางมาแลว 20 มลิ ลิลิตร ใส
ลงใน 100 มิลลิลิตรของ Melted dextrose tryptone bromcresol
purple agar นําไปตมและเขยา ใหร อ นในนา้ํ เดอื ด 3 นาที นําไปอบ
ไอนํ้า 30 นาที และเทในจานเพาะเชอ้ื จํานวน 5 จาน นําไปบม
เพาะเช้ือท่ี 55 องศาเซลเซียส นาน 72 ชว่ั โมง นบั จํานวนโคโลนที ่ี
ปรากฏ

1.2! จุลินทรยี ป ระเภท Gas forming thermophiles anaerobic spores
ท่ีไมส รา ง H2S นําสารละลาย 20 มลิ ลิลิตร แบงใสในหลอดทดลอง
6 หลอดที่มี Thioglycolate broth อยูดวย เขยา และนําไปตม ใน
น้ําเดือด 3 นาที อบดวยไอนาํ้ 30 นาที ทาํ ใหเ ยน็ ปด ทบั อาหาร
เลี้ยงเชื้อดวย Nutrient agar ทําใหร อ น 55 องศาเซลเซียส และ
นําไปบมเพาะเชื้อที่ 55 องศาเซลเซียส นาน 72 ชว่ั โมง รายงาน
Positive และ Negative tubes

2.3! จุลินทรยี ป ระเภท Thermophiles anaerobic spores ท่ีสรา ง H2S
นําสารละลายที่เจือจางมาแลว 20 มลิ ลิลิตร ใสในหลอดทดลอง 6
หลอด ทม่ี ี Melted sulphite agar อยูดวย ตม ในน้าํ เดอื ด 3 นาที
อบไอน้ํา 30 นาที ปลอยใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว ทาํ ใหร อ น 55
องศาเซลเซยี ส และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศาเซลเซยี ส นาน
72 ช่ัวโมง นบั จํานวนของโคโลนสี ดี ําทง้ั 6 หลอด รายงานการ
วิเคราะหตอ 10 กรัมของแปงตัวอยาง

มาตรฐานสําหรบั แปง และน้าํ ตาล

1.! จํานวน Total thermophilic spore count ใชตัวอยาง 5 ตัวอยาง แตละ
ตัวอยา งจะมีสปอรไ ดไ มเ กนิ 150 สปอรตอ 10 กรมั และจํานวนเฉลี่ย
ของตัวอยา งทง้ั หมดจะมจี ํานวนสปอรไ ดไ มเ กนิ 125 สปอรตอ 10 กรมั

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 115

2.! Flat sour spores ใชตัวอยาง 5 ตัวอยาง แตล ะตวั อยา งจะมจี ํานวน
สปอรไดไมเกิน 75 สปอรตอ 10 กรมั และจํานวนเฉลี่ยของตัวอยาง
ทั้งหมดจะมีสปอรไดไ มเกิน 50 สปอรตอ 10 กรมั

3.! Thermophilic anaerobes spores ใชตัวอยาง 5 ตัวอยา ง จะมีสปอร
ชนิดนไ้ี ดไ มเ กนิ 3 ตัวอยาง (รอ ยละ 60) และในแตละตัวอยา งจาก
จํานวนหลอดทดลอง 6 หลอดจะมีสปอรไ ดเ พยี ง 4 หลอด (รอ ยละ 65)
เทา นน้ั

4.! Sulfide spoilage spores ใชตัวอยาง 5 ตัวอยาง จะมีสปอรช นดิ นไ้ี ด
ไมเกิน 2 ตัวอยา ง (รอ ยละ 40) และในแตละตัวอยางจํานวนสปอรตอง
ไมเ กนิ 5 โคโลนีตอ 10 กรมั

มาตรฐานสําหรบั นํ้าตาลทรายละเอยี ด

1.! มีจํานวนจุลินทรียเจริญเติบโตไดดีที่อุณหภูมิ 25-37 องศาเซลเซียส ได
ไมเกิน 200 โคโลนีตอ 10 กรมั

2.! มีจํานวนยีสตไดไมเกิน 10 โคโลนีตอ 10 กรมั
3.! มีเชอ้ื ราไดไ มเ กนิ 10 โคโลนีตอ 10 กรมั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 116

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ใ นไขแ ละผลติ ภณั ฑจ ากไข

ไขเปนอาหารและใชเ ปน สว นประกอบของอาหารหลายๆชนดิ โอกาสของไข
ท่ีจะสกปรกและชนดิ ของแบคทเี รยี ทพ่ี บในไขม มี าก วธิ กี ารตรวจวเิ คราะหห าเชอ้ื
จุลินทรียในไขจ งึ เปน ทน่ี า สนใจมาก ไขเมื่อออกจากแมไ กในตอนแรกๆจะสะอาดมาก
ถาหากทิ้งไวในที่ที่สกปรกและชื้น หรือในระหวางการขนสงออกสูตลาด หรือกระบวน
การผลิตผลิตภัณฑจากไขนั้นไมถูกสุขอนามัยเพียงพอ อาจเปน หนทางใหเ ชอ้ื
จุลินทรยี ห ลายชนดิ เจรญิ เติบโตได

การเตรียมตัวอยาง
เลือกเอาไขทม่ี อี ายแุ ตกตา งกนั มาทําการวิเคราะห ขณะทร่ี อการวเิ คราะห
ควรเก็บไขในที่มีอุณหภูมิตาํ่ กวา 50 องศาฟาเรนไฮต ลางไขแตละฟองดวยนํ้าอุนให
สะอาด และจุมลงในแอลกอฮอลรอยละ 70 นาน 10 นาที นําออกจากแอลกอฮอล
ปลอยใหแหงและลนกับไฟกอนวางไขดานที่มี Air cell ลงแลว เจาะไขด า นตรงขา มให
มีรูเสนผาศนู ยก ลาง 0.5 นว้ิ ลนไฟสว นทเ่ี จาะรู วางดา นทเ่ี จาะรลู งบน Triangle ท่ี
วางบน Tripod ใตไขว างขวดปากกวา งทผ่ี า นการฆา เชอ้ื แลว ใชไฟลนสวนที่เปน Air
cell หลังจากนั้นก็ใชถุงมือที่ฆาเชื้อแลวจับไขไว เจาะดา น Air cell ใหเ ปน รดู ว ย
Flamed forceps เขยาเน้ือของไขท ไ่ี ดจ นกระทง่ั ไดเ นอ้ื ไขอ ยา งสมา่ํ เสมอ อาจตีดวย
ชอนที่ฆาเชื้อแลว

การวิเคราะหจุลนิ ทรยี 
ช่ังไข 11 กรมั ใสลงใน 99 มลิ ลิลิตรของ Saline dilution blank พรอมดวย
Glass beads (เพื่อตีไขใหแตก) เขยา 25 ครง้ั เตรยี มการเจอื จางตอๆไป
1.! การวิเคราะหหาจุลินทรียทั้งหมด ปเ ปต 1 มลิ ลิลิตร ของ Dilution

1:10 ทํา 2 ซ้ํา ใสใ นจานเพาะเชอ้ื และเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Total plate
count agar อาจทาํ Dilution 10-2 ,10-3 และ 10-4 ตองพยายามเท
อาหารเลี้ยงเชื้อลงไปอยางรวดเร็ว เพราะไขอ าจยดึ เกาะตดิ จานเพาะเชอ้ื
ได ทําใหไดโคโลนีอยูตรงสวนที่เกาะติดแหงมากกวาสวนอื่นๆในอาหาร
เลี้ยงเชื้อ นําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30-32 องศาเซลเซยี ส นาน 3 วัน รายงาน
ผลการวิเคราะหจากคาเฉลี่ย 2 จานเพาะเชอ้ื ตอ จํานวนกรมั ของไข
2.! การวิเคราะหเชื้อยีสตและรา ปเปตทกุ ๆความเจอื จางลงบนจาน
เพาะเชื้ออยางละ 2 จาน และเทอาหารเลี้ยงเชื้อดวย Malt agar นําไป
บมเพาะเชื้อที่ 30-32 องศาเซลเซียส นาน 3 วัน อาจจะดจู านเพาะเชอ้ื

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 117

ทุกๆวันก็ได ถา หากสามารถนบั ไดก น็ บั จํานวนโคโลนไี ปกอ นได

รายงานการวิเคราะหออกมาตอจํานวนกรมั ของไข

3.! การวิเคราะหหา Salmonella ช่ังตัวอยา งมา 20 กรมั ใสใ น Selenite

broth ท่ีผา นการ Steam มาแลว 80 มิลลิลิตร เขยา ใหเ ขา กนั ทว่ั นําไป

บมเพาะเช้ือท่ี 35 องศาเซลเซยี ส นาน 16-24 ชว่ั โมง หลงั จากนน้ั นํามา

Streak ลงบน Salmonella-Shigella agar (SS agar) ทิ้งใหผิวหนาแหง

แลวนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 35 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง ตรวจดู

โคโลนีที่แสดงคุณลักษณะของเชื้อ Salmonella รายงานผลการวเิ คราะห

มาตรฐานสําหรบั ไขแ ละผลติ ภณั ฑไ ข

1. เนื้อไขสด (Liquid egg) ท่ีอบเพาะเชอ้ื ท่ี 22 องศาเซลเซยี สมจี ลุ ินทรยี ไ ด

ไมเ กิน 5,000,000 โคโลนีตอกรัม

2. ไขผ งมจี ลุ นิ ทรียช นดิ ตา งๆไดไ มเ กนิ

Lot (โคโลนีตอกรัม) Sample unit (โคโลนีตอกรัม)

จุลนิ ทรียท กุ ชนดิ 50,000 75,000

โคลิฟอรม 50 100

เชื้อราและยีสต 20 50

3. ไขแชแ ขง็ มจี ลุ นิ ทรียชนดิ ตา งๆไดไ มเ กนิ

Lot (โคโลนีตอกรัม) Sample unit (โคโลนีตอกรัม)

จุลินทรียท กุ ชนดิ 10,000 15,000

โคลิฟอรม 50 100

เชื้อราและยีสต 50 75

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 118

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ใ นอาหารหมกั ดอง

อาหารท่ีทําจาการหมกั โดยพวกจลุ ินทรียมีอยหู ลายชนดิ ดว ยกนั ในวิธีการ
วิเคราะหหาจุลินทรียในอาหารหมักดองในท่ีนี้ไมไดหมายความถึงอาหารหมักดอง
แลวนําไปทําแหงอยางเชนพวกชา กาแฟ หรอื เปน อาหารหมกั ดองจําพวกเครื่องดื่ม
แตจะใชก บั อาหารทใ่ี ชห มกั ดองจรงิ ๆเทา นน้ั เชนผักกาดดอง Sauerkraut และ
ผลิตภณั ฑเ นอ้ื หมกั เชน แหนม ไสกรอกเปรีย้ ว และม่ัม เปนตน

การเตรียมตัวอยาง
ในอาหารจําพวกของดองเหลานี้มักจะใชนํ้าที่ดองเปนตัวอยางในการตรวจ
หาจุลินทรยี ท ง้ั หมดทม่ี อี ยู

การวิเคราะหจลุ ินทรีย
1.! จุลนิ ทรียทง้ั หมด ชงั่ ตัวอยาง 11 กรมั ใสใน Sterile water blank 99

มิลลิลติ ร เตรยี มการเจอื จางเปน 1:10 ทําDilution ละ 2 จาน เทอาหาร
เลี้ยงเชื้อ Total plate count agar นําไปบมเพาะเชื้อที่ 32 องศา
เซลเซียส นาน 1 วัน รายงานผลการวเิ คราะหต อ น้ําดอง 1 มิลลิลิตร
2.! เช้ือยีสตและรา ทาํ การถายสารละลายทม่ี กี ารเจอื จางทเ่ี หมาะสมลงใน
จานเพาะเชื้อ ทาํ Dilution ละ 2 จาน และเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื Malt agar
นําไปบมเพาะเชื้อที่ 30-32 องศาเซลเซียส นาน 5 วัน ควรเริ่มนับตั้งแต
วันที่ 3 เปนตน ไป รายงานผลการวเิ คราะหเ ปน จํานวนยสี ตแ ละราตอ
กรัมของตัวอยาง
3.! จุลินทรียที่สามารถผลิตกรดได ดูดเอาสารละลายเจอื จางแตละ Dilution
ใสลงในจานเพาะเชอ้ื อยา งละ 2 จาน เทอาหารเลย้ี งเชอ้ื ATP agar หรอื
ใช Total plate count agar ทม่ี ี Bromcresol purple เปน ดชั นบี ง ช้ี หรอื
ใช Liver infusion sorbic acid agar นําบมเพาะเชื้อที่ 30-32 องศา
เซลเซียส นาน 72 ชว่ั โมง นบั จํานวนโคโลนีท่ีแสดงปฏกิ ริ ยิ าเปน กรด
รายงานผลการวเิ คราะหข อง Acid formers ตอกรมั ของตัวอยาง

อาจจะทําการทดสอบไดอีกอยา งหนึ่ง โดยการเตมิ สารละลาย
ไฮโดรเจนเปอรออกไซดรอยละ 3-5 และสังเกตโดยการใช Hand lens
หรอื Wide field binocular โคโลนีไหนทไ่ี มไ ดท ําใหเ กดิ กา ซแสดงวา
เปน Catalase-negative รายงานผลการวเิ คราะหเ ปน Lactic acid
forming bacteria สําหรับโคโลนีที่ยอมสีใหแกรมบวก ไมส รา งสปอร มี
รูปรา งเปน แทง และกลม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 119

การตรวจโดยตรงดวยกลองจุลทรรศน

ใชปเปตดดู เอาน้ําดองออกมา 0.01 มลิ ลิลิตร Spread ใหท ั่วท้งั พื้นท่ี 1
ตารางเซนตเิ มตรบนสไลด หลังทิ้งใหแหงแลว Fixed อีกครั้งหนึ่งดวยเปลวไฟ และ
ยอมสีแกรม ตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน และนับจํานวนของจลุ นิ ทรียแ ตล ะชนดิ

1 cm 0.01 มิลลิลิตรตัวอยาง
1 cm

หา Microscopic factor = MF = จํานวน Field ใน 1 ตารางเซนตเิ มตร
= 100 mm2
MF = พ้ืนท่ี 1 ตารางเซนตเิ มตร

π !"#"(พื้นที่วงกลม) π !"#""""""( r ของเลนซ = mm)

สไลดม าตรฐาน 100 ขดี =0.01 mm ใน 1 Field มี 18 ขดี (d)

ดังนน้ั 100 ขดี = 0.01 มิลลิเมตร

ถา 18 ขดี = 0.01 x 18/100 = 0.0018 มลิ ลิเมตร (d)

ดงั นน้ั r = 0.0009 มิลลิเมตร
MF = 100 mm2 = 39,281,705
[22/7] [0.0009]2 mm2

a
bc

a + b + c = n โคโลนีตอ Field
3

สมมตุ ิ a = 69 เซล b = 72 เซล และ c = 59 เซล
คาเฉลี่ย = 69 + 72 + 59 /3 = 66.67 เซล
เมอ่ื MFxn = จํานวนจุลินทรียในพื้นที่ 1 ตารางเซนตเิ มตร (0.01 มลิ ลิลิตร)

MFxnx100 = จํานวนจุลินทรียใ นตัวอยา ง 1 มลิ ลิลิตร(1 กรมั )
ดังนั้น จํานวนจลุ นิ ทรียในพน้ื ท่ี 1ตารางเซนตเิ มตร = [39,281,705][ 66.67][100]

= 261,891,120,568 เซลตอกรัม

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 120

การศกึ ษาเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ร ะหวา งการหมกั กะหล่ําปลี

กะหลํ่าปลีดองเปนผลิตภัณฑหมักประเภทหนึ่งที่ยกตัวอยางเปนตัวแทนของ

ผักดองโดยเช้ือจุลินทรียท เ่ี ขา ไปมบี ทบาทในการใชน า้ํ ตาลทเ่ี ปน แหลง คารบ อนทม่ี อี ยู
ในวัตถุดิบเพอ่ื ใหจ ลุ นิ ทรยี ไ ดเ ปลย่ี นเปน กรดอนิ ทรยี  ในสภาพสิ่งแวดลอมที่ไดถูก
ควบคุมของเกลอื เพอื่ มิใหจลุ นิ ทรยี อื่นๆท่ีไมตองการเจริญเติบโตไดค งไวแ ตจุลินทรยี 
ที่สามารถผลิตกรดอินทรียที่สามารถเจริญเติบโตในสภาพที่มีเกลืออยูได ทาํ ใหค วาม
เปนกรดทง้ั หมดของระบบเพม่ิ ขน้ึ หรือคาpH ลดลงและทําใหผลิตภัณฑกะหลํ่าปลี
ดองมีความคงตวั ดงั นน้ั การศกึ ษาบทบาทของจลุ นิ ทรียท่ีมผี ลตอ การหมกั จงึ เปน
สิ่งที่ตองศึกษา

วตั ถดุ บิ •กะหล่ําปลี
อุปกรณ •เกลือแกง

•ขวดโหลปากกวาง
•ถุงพลาสติกขนาดเสนผาศูนยกลางใหญกวาปากขวดเล็กนอย
•ภาชนะสําหรับคลุกกะหลํ่าปลี
•มดี เขยี ง
•เครื่องชั่ง
•MRS agar หรอื อาหารน้ํามะพรา ว (Coconut Juice agar) ขวดละ
100 มลิ ลิลิตร
•MRS agar หรอื Coconut Juice ager (CJ agar) เติม
Bromcresol purple รอยละ 0.004, Sodium azide รอ ยละ 0.02
ขวดละ 100 มลิ ลิลิตร
•Diluent ขวดละ 9 มิลลิลิตร
•ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร
•Standard sodium hydroxide 0.5 N
•Phenolpthaline
•จานเพาะเชื้อ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 121

การทดลองและรายงานผล

1. การเตรยี มกะหล่ําปลแี ละการหมกั

1.1 ตัดสวนที่เสียทิ้ง ลางกะหลํ่าปลที ง้ั หวั ผา เปน สองซกี สลัดใหแหง
ตัดแกนกลางออก ซง่ึ กะหลํ่าปลใี หท ราบน้าํ หนกั ทแ่ี นน อน แลวหั่นตามขวางใหชิ้น
กวางประมาณ 0.5 เซนตเิ มตร

1.2 ชั่งเกลือแกงใหไดรอยละ 2.5 ของน้ําหนกั กะหล่าํ ปลี
1.3 เคลาชิ้นกะหลํ่าปลแี ละเกลอื จนกะหลา่ํ ปลีออนตัวและมนี ้ําซึมออก
มา
1.4 บรรจกุ ะหลํ่าที่เคลาเกลือแลวลงโหลแกว อัดใหแนน ใชถุงพลาสติก
บรรจุนํ้าวางทับเพื่อกดใหชิ้นกะหลาํ่ อยใู ตร ะดบั น้ําทซ่ี มึ ออกมาจากการคลกุ เคลา เก็บ
โหลกะหลาํ่ หมักไวที่อุณหภูมิหอง 1 โหล และทอ่ี ณุ หภมู ิ 20 องศาเซลเซียส 1 โหล

2. การศกึ ษาจลุ นิ ทรียในระหวา งการหมกั

2.1 ตรวจนบั จํานวนจลุ นิ ทรยี ท ง้ั หมด

2.1.1 เตรยี มน้ําหมกั กะหล่าํ ปลี ใหเ จอื จางตามระยะเวลาของ
การหมกั ดงั น้ี

ระยะการหมกั ระดบั ความเจอื จาง
10-3, 10-4, 10-5
กอนอัดลงขวด 10-4, 10-6, 10-5
1 วัน 10-4, 10-5, 10-7
10-4, 10-5, 10-6
2, 3, 4, 5, 6, 7 วัน 10-3,10-4, 10-5
14 วัน
4 สปั ดาห

2.1.2 ตรวจนบั แบคทีเรียท้งั หมดดว ยวธิ ี Shake plate โดยใช MRS
agar หรือน้ํามะพรา ว (CJ agar) ตามระดบั ความเจอื จาง ทก่ี ําหนดในขอ 2.1.1
โดยนํา 2 จานในแตละระดับความเจือจางบมที่อุณหภูมิหอง รายงานจํานวนจลุ นิ ทรยี 
โดยแยกเปน แบคทเี รยี ยีสตและเชื้อรา

2.1.3 ตรวจนบั แบคทเี รยี ทส่ี รา งกรด
ตรวจนับดวยวิธี Shake plate ใชร ะดบั ความเจอื จางเดยี วกบั

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 122

การตรวจนบั จลุ นิ ทรียท ง้ั หมด แตใช MRS หรอื CJ agar เติม Bromcresol purple
รอยละ 0.004 และ Sodium azide รอยละ 0.02 ตามระดบั ความเจอื จางทก่ี ําหนดใน
ขอ 2.1.1 บม เช้อื ท่ีอุณหภมู หิ อ ง 2 วัน นับเฉพาะโคโลนีซึ่งมีบริเวณสีเหลืองลอมรอบ
ซ่ึงเกิดจากแบคทเี รยี นน้ั สรา งกรด และเนื่องดวยในอาหารเพาะเชอ้ื ประกอบดวย
Sodium azide ซ่ึงยับย้ังการเจรญิ ของจลุ ินทรียซ ง่ึ มเี อนไซม Oxidase จงึ อนมุ าณวา
แบคทีเรียที่มีบริเวณสีเหลืองรอบโคโลนีเปนแลคติคแบคทีเรีย

2.2! ศึกษาลักษณะทางสณั ฐานวทิ ยาของน้ําหมกั กระหล่ําปลี

ทุก ๆ ชวงเวลาตามที่กําหนดไว ขอ 2.1.1 เตรียมสไลดของนํ้าหมกั ยอมสี
แบบแกรม ตรวจดวยกลองจุลทรรศน สงั เกตรปู รา งและความหนาแนน ของเชอ้ื ตอ
พื้นที่หนากลอง วาดรปู แสดงอตั ราสว นของจลุ นิ ทรียในทุกชว งเวลาทน่ี ํามาศกึ ษา

2.3 การศกึ ษาการเปลย่ี นแปลงทางเคมี

2.3.1 วัด pH ของน้ํากะหลํ่าปลี โดยวัดทุก ๆ ชว งเวลาทศ่ี กึ ษาจลุ นิ ทรยี 
2.3.2 ศกึ ษาการเปลย่ี นแปลงปรมิ าณกรดทง้ั หมด ใชป เปตดดู น้ํา
กะหล่ําปลี 9 มลิ ลิลิตร ใสฟลาสค เตมิ น้ํากลั่น 25 มิลลิลิตร ตมใหเดือดเพื่อไลกาซ
คารบอนไดออกไซด เติม Phenolphthaline 2-3 หยด แลวไตเตรทดวย 0.5 N
Standard sodium hydroxide solution ใหได End point สีชมพูออน ๆ คาํ นวณ
รอยละของกรดโดยคิดเปนกรดแลคติค

รอ ยละของกรด = มลิ ลิลิตรของ NaOH x Normlity ของ NaOH

2.3! ศึกษาคุณสมบัติทางประสาทสัมผัส (Organoleptic) ของ
กะหลํ่าปลหี มกั
สังเกตคุณสมบัติตอไปนี้ กลิ่น รส และความกรอบ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 123

การศกึ ษาเชือ้ จลุ ินทรยี และการเปลยี่ นแปลงระหวางการหมัก
ผลติ ภณั ฑแ หนม

แหนมเปนผลิตภัณฑเนื้อหมัก โดยเปน การหมกั ดว ยเชอ้ื แบคทเี รยี ประเภท
แลคติคแบคทีเรีย ที่ใชแหลงคารบอนที่มีในสูตรการผลิตเพื่อเปลี่ยนเปนกรดแลคติค
มีผลทําใหผลิตภณั ฑม คี วามเปน กรดทง้ั หมดเพม่ิ ขน้ึ หรอื ทําใหค า pH ลดลง ทาํ ให
ผลิตภัณฑมีความคงตัว อยา งไรกต็ ามเทคนคิ การผลติ แหนมเปน การใชป จ จยั หลายๆ
อยางในการควบคุมการผลิตใหไดผลิตภัณฑที่ปลอดภัยและมีความคงตัวมากขึ้น เชน
ในผลิตภัณฑจะประกอบดวยเกลือแกง เพื่อชวยลดคา Aw ลง และใชเกลือไนเตรท
ไนไตรทเพ่ือชว ยยบั ยง้ั การเจรญิ เตบิ โตของเชอ้ื จลุ นิ ทรียบางอยา ง นอกจากจะชว ยใน
เร่ืองสีชมพแู ดงทป่ี รากฏดขี น้ึ และการที่ผลิตโดยใหผลิตภัณฑอยูในลักษณะที่มี
อากาศนอยก็เปนอีกปจจัยหน่ึงที่ที่จํากัดการเจริญเติบโตของจุลินทรียท่ีตองการ
อากาศในการเจรญิ ทาํ ใหจ ลุ ินทรียดังกลา วไมส ามารถเจรญิ เตบิ โตได แตเ ปน การ
สรางบรรยากาศใหจ ลุ นิ ทรียท่ีสามารถผลติ กรดได และเจรญิ ในทท่ี ม่ี อี ากาศนอ ยไดด ี
สามารถผลิตกรดอนิ ทรยี ไ ดอ ยา งมปี ระสทิ ธภิ าพ และการทร่ี ะบบมคี วามเปน กรด
เพ่ิมข้ึนก็จะเปน การชว ยใหผลิตภัณฑม ีความคงตวั มากขน้ึ

นอกจากน้ีไดมีการนําเอาเทคโนโลยีเชื้อบริสุทธ์ิเร่ิมตนผสมมาใชในการผลิต
ผลิตภัณฑแ หนม เพื่อใหไดผลิตภัณฑที่คุณภาพมากขึ้น ทั้งในแงลักษณะเนื้อสัมผัส
ท่ีมีความแนนเนื้อมากข้ึน มสี ที ป่ี รากฏดขี น้ึ รวมทง้ั ทําใหผ ลิตภณั ฑมีความปลอดภยั
สูงขึ้น มีอายุการเกบ็ รกั ษาทย่ี าวนานมากขน้ึ กวา ปกตทิ ค่ี วรจะเปน

1.! วิธีหมกั แหนม

สวนผสมและวธิ กี ารผลติ

หมูเนื้อแดง 1 กิโลกรัม
หนงั หมตู ม สกุ 300 กรมั
กระเทยี ม 30 กรมั
ขา วเหนยี วนง่ึ 70 กรมั
โปแตสเซยี มไนเตรท 0.2 กรมั
พรกิ ไทย 0.5 กรมั
เกลือ (รอ ยละ) 3-4
พรกิ ขห้ี นู แลวแตความเหมาะสม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 124

นําหมูสดเนื้อแดงซึ่งคัดเลือกเอาสวนที่เปนมันออกหมดแลว มาสับหรอื บด
ใหละเอยี ด ใชผ า ขาวทแ่ี หง และสะอาดซบั บนเนอ้ื หมหู ลาย ๆ ครง้ั เพอ่ื ใหป ระมาณ
ความชื้นในหมูลดนอยลง เติมเกลือและโปแตสเซียมไนเตรทซึ่งบดละเอียดลงในเนื้อ
หมูเคลาใหเขากัน นําพรกิ ไทย กระเทยี ม ขาวเหนียวนึ่งที่บดละเอียดแลวเขาดวย
กันอีกครง้ั หน่งึ นําหนงั หมู (ตมเดือดประมาณ 10-15 นาท)ี ใสห นงั หมลู งนวดตอ
จนสวนผสมทงั้ หมดเขากันดแี ละมลี กั ษณะเหนยี ว บรรจใุ นถงุ พลาสตกิ ประมาณ
30-40 กรมั เติมพริกขี้หนูหอละ 1-2 เมด็ หอดวยใบตอง 2-3 ชน้ั ผูกหอใหแนน
จนภายในหอมีอากาศนอยที่สุด เกบ็ ไวร ะยะ 4-5 วัน

2. ศึกษาการเปลย่ี นแปลงระหวา งการหมกั

ตรวจการเปลย่ี นแปลงทกุ ๆ วนั จนครบ 5 วัน ซง่ึ เปน ระยะทร่ี บั ประทานได
2.1! ตรวจจลุ นิ ทรียด ว ยกลอ งจลุ ทรรศน

เตรียมสไลด ยอมสแี บบแกรม สังเกตจํานวนและรปู รา งของแบคทเี รยี ใน
แตล ะระยะของการหมกั วาดรปู แสดงอตั ราสว นของแบคทเี รยี รปู รา งตา ง ๆ

2.2 ตรวจนบั จํานวนจลุ นิ ทรียท ง้ั หมด (Total viable count) และ
จํานวนแลคตคิ แบคทเี รยี
โดยทํา Serial dilution ดงั น้ี

กอ นบรรจหุ อ ใช Dilution 10-4, 10-5, 10-6
หมกั 1 วัน ใช Dilution 10-6, 10-7, 10-8
หมกั 2 วัน ใช Dilution 10-6, 10-7, 10-8
หมกั 3 วัน ใช Dilution 10-6, 10-7, 10-8
หมกั 5 วัน ใช Dilution 10-6, 10-7, 10-8

แตละ Dilution ทาํ 4 plates โดยใชอาหารนาํ้ มะพรา ว หรอื MRS medium
เติม Sodium azide รอ ยละ 0.01 เปน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ตรวจนับจํานวนจลุ ินทรียโ ดย
แยกเปนจํานวนยีสต รา แบคทเี รยี สาํ หรบั แบคทเี รยี แยกเปน จํานวนแลคตคิ
แบคทเี รยี ซึ่งสังเกตไดจากรอบ ๆ โคโลนจี ะมี Zone สีเหลืองใส

2.3 ไตเตรทหารอ ยละของกรด

โดยชง่ั แหนม 3 กรมั บดในเครื่องปนใหละเอียด เตมิ น้าํ กลั่น 50 มลิ ลิลิตร
กรองดวยกระดาษกรองตมไล CO2 ไตเตรทดวย Standard NaOH solution 0.1 N

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 125

คํานวณเปน รอ ยละของกรดแลคตคิ

Lactic acid = ml of NaOH x normality of NaOH x 0.09 x 100
ml of sample

2.4วัดความเปน กรดเปน ดา ง( pH )

โดยช่ังแหนมหนกั 5 กรมั บดในเครอ่ื งปน ใหล ะเอยี ดเตมิ น้ํากลั่น 5 มิลลิลิตร
และวดั ความเปน กรดเปน ดา งดว ยเครอ่ื งวดั pH meter

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 126

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียใ นน้ํานม

น้ํานมเปนอาหารท่ีอดุ มสมบรู ณไ ปดว ยสารอาหารตางๆมากมาย เชน โปรตนี
เกลือแรและวิตามินตางๆ มปี ระโยชนต อรา งกาย ชว ยเสรมิ สรา งใหร า งกายแขง็ แรง
จุลนิ ทรียก็เปนส่ิงมชี วี ติ ประเภทหนง่ึ ทต่ี อ งการสารอาหารตา งๆ เพื่อการเจริญเติบโต
ในการสรา งเซล ดังน้ันจึงมีโอกาสความเปน ไปไดอ ยา งมากทอ่ี าหารนมอาจจะ
ปนเปอ นจากจลุ นิ ทรียได การควบคุมคุณภาพนาํ้ นมจงึ เปน สง่ิ ทม่ี คี วามสําคญั ยง่ิ เพื่อ
เปนการประกนั ความปลอดภยั จากเชอ้ื จลุ ินทรีย โดยเฉพาะจลุ นิ ทรียท่ีทําใหเกิดโทษ
การวเิ คราะหจ ลุ ินทรียท้ังในน้ํานมดิบ และน้ํานมทผ่ี า นกระบวนการมาแลว จงึ เปน
สิ่งที่หลีกเลี่ยงไมได

ตัวอยา งอาหาร

•นมพาสเจอรไ รสไมปรุงแตง รส
•นมพาสเจอรไรสปรงุ แตงรส
•นมดิบ
•ยาคลู ท

อุปกรณ

•จานเพาะเชื้อ
•หลอดทดสอบปราศจากเชอ้ื พรอ มจกุ ยาง
•ปเปตขนาด 10 มลิ ลิลิตร และ 0.01 มิลลิลิตร
•ขวดบรรจุ Diluent ปรมิ าตร 9 มลิ ลิลิตร
•Brillient Green Lactose Bile Broth (BGLB) เขม ขน สองเทา
•Brilliant Green Lactose bile Broth
•Violet red bile agar ขวดละ 80 มลิ ลิลิตร
•Standard plate count agar (SPCA) ขวดละ 100 มลิ ลิลิตร
•Resazurin solution
•Methylene blue thiocyanate solution
•Newman - Lampert stain

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 127

ทดลองและรายงานผล

1. การตรวจนบั จํานวนแบคทเี รยี ทง้ั หมด

1.1 ตรวจนบั โดยวิธี Shake plate โดยใชร ะดบั ความเจอื จาง 10-4,
10-5, 10-6 สําหรับการตรวจนับนมดิบ และ 10-2, 10-3, 10-4 สําหรับนมพาสเจอรไ รส
โดยตรวจนับระดับความเจือจางสองซํ้า ใชเ ปน อาหารเพาะเชอ้ื

1.2 บม เชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู ิ 32 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง ตรวจนับ
จํานวนแบคทีเรียทั้งหมด

2. ตรวจนบั จํานวน Psychrophile ในน้าํ นมพาสเจอรไ รส

2.1 ตรวจนับ Psychrophile จากตวั อยา งนมทไ่ี มไ ดเ จอื จางปรมิ าตร 1
มิลลิลิตร ตอ จานเพาะเชอ้ื และตวั อยา งทเ่ี จอื จาง 1:10 เทา โดยตรวจนบั ระดบั ความ
เจือจางละสองซ้ํา

2.2 บม เชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู ิ 8 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 7 วัน นบั จํานวน
Psychrophile

3. วิเคราะหป รมิ าณ Coliform และ E.coli

3.1 หาคา MPN ของ Coliform โดยใช BGLB broth แบบ 5 หลอด ใช

ตัวอยางนมที่ไมไดทาํ ใหเ จอื จาง 10, 1 และ 0.1 มลิ ลิลิตร ตามลําดบั
3.2 นบั จํานวน Coliform ในตัวอยางนม 1 มิลลิลิตร และ 0.1 มิลลิลิตร

โดยใชว ธิ ี Violet red bile agar
3.3 ตรวจวิเคราะหผลจากขอ 3.1 และ 3.2 เพอ่ื ยนื ยนั วา เปน E. coli

นมสดจากแหลงผลิตแตละแหลงสําหรับใชใ นการพาสเจอรไ รสจ ะมแี บคทเี รยี
ไดไ มเกิน 100,000 โคโลนีตอ มิลลิลิตร แตถาจากแหลงผลิตหลายแหลงจะมีไดไมเกิน
300,000 โคโลนีตอมิลิลิตร สวนนมพาสเจอรไรสและผลิตภัณฑนมเกรดเอ จะมี
จุลินทรียไ ดไ มเ กนิ 20,000 โคโลนตี อมิลลิลิตร และจะมโี คลฟิ อรม ไดไ มเ กนิ 10
โคโลนีตอมิลลิลิตร สว นผลติ ภณั ฑน มทใ่ี ชจ ลุ นิ ทรยี ช นดิ ตา งๆในกระบวนการผลติ
และผา นการพาสเจอรไ รสเกรดเอ จะมโี คลิฟอรม ไดไ มเ กนิ 10 โคโลนตี อมิลลิลิตร
สวนนมผงเกรดเอมจี ลุ ินทรียไดไ มเ กนิ 30,000 โคโลนีตอกรัม และโคลิฟอรมมีได
ไมเกนิ 90 โคโลนีตอกรัม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 128

การเกดิ เงาโลหะบน EMB agar

การเกดิ เงาโลหะบน EMB agar เปนคณุ สมบตั ขิ อ หนง่ึ ซง่ึ ใชใ นขน้ั ตอนการ
วินิจฉัย E. coli ผูวิเคราะหก ารทําความเขา ใจวา มี E. coli หลายสายพนั ธดุ ว ยกนั ท่ี
ไมใหป ฏกิ ริ ยิ าน้ี และมจี ลุ นิ ทรียอ่ืนๆ อกี หลายชนดิ ทอ่ี าจมลี กั ษณะโคโลนเี ปน เงา
โลหะบนอาหาร EMB โดยเฉพาะอยา งยง่ิ ในกรณที ใ่ี นสตู รอาหารมนี า้ํ ตาลอน่ื
นอกเหนือจากแลคโตส เนอ่ื งดว ยปฏกิ ริ ยิ าดงั กลา วเกดิ จากการทจ่ี ลุ นิ ทรยี เ ฟอรเ มนต
น้ําตาลไดกรดในปริมาณท่ีมากพอท่ีจะทําใหความเปนกรดดางของอาหารลดลงถึง
ระดับ pH ตํ่ากวา 4.5

จุลนิ ทรยี 

•Enterobacter aerogenes
• E. coli

อุปกรณ

•จานเพาะเชื้อ
•Levine' s EMB agar ขวดละ 50 มลิ ลิลิตร
•แผนกระดาษกรองขนาดเสน ผา ศนู ยก ลางประมาณ 5 มิลลิเมตร
•กรดแลคติคเขมขนรอ ยละ 8, 4 และ 2
•กรด HCl เขม ขน 2, 1 และ 0.1 N

การทดลองและรายงานผล
1. เท EMB agar ใสจ านเพาะเชอ้ื 3 จาน
2. เขย่ี เชอ้ื E. coli และ Enterobacter aerogenes ลงบน EMB agar ให

แยกเปน โคโลนีเดยี่ ว ๆ จานละเชอ้ื
3. ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ คบี แผน กระดาษกรองวางบน EMB agar

ใหระยะหา งกนั พอประมาณ
4. หยดกรดความเขม ขน ตา ง ๆ ลงบนแผนกระดาษ แผน ละความเขม ขน
5.อานผลเมื่อหยดกรดลงไปแลว 2 ชว่ั โมง และเมื่อบมไวที่ 37 องศา

เซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง เปรยี บเทยี บกนั โคโลนขี อง E. coli และ
Enterobacter ทบ่ี ม ไว 48 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 129

การตรวจนบั วเิ คราะห Staphylococcus ในอาหาร

การตรวจพบเชอ้ื Staphylococcus ปริมาณมากในอาหารนับวา เปน การ
แสดงถึงการไมป ลอดภยั ตอ บรโิ ภคของอาหารนน้ั เนื่องดวย Staphylococcus บาง
สายพันธุสามารถเจริญและผลิตเอนเทอไรทอกซนิ ในอาหารทําใหผ บู รโิ ภคเกดิ
อาการอาหารเปน พษิ ได นอกจากนน้ั การตรวจพบ Staphylococcus ในอาหารที่
ผานกรรมวิธีการผลิต ยงั เปน ดชั นแี สดงถงึ การปนเปอ นภายหลงั การผลติ ซง่ึ
สวนใหญแหลงที่มาของเชื้อคือผูสัมผัสอาหาร ซง่ึ จลุ ินทรียอาจมาจากในชอ งจมกู
ปาก หรือผิวหนัง

จุลนิ ทรยี 

•Staphyloccccus aureus
•อาหารสําเรจ็ ประเภท ยํา หรอื ลาบ
•เอแคร
•เคร่ืองปรงุ บะหมส่ี ําเรจ็ รปู

อุปกรณ

•ถุงพลาสติกสวมคอขวดบรรจุ Trypticase Soy (TS) broth 40
มิลลิลิตร
•ขวดบรรจุ TS broth 50 มลิ ลิลิตร
•ขวดบรรจุ Diluent 225 มิลลิลิตร
•ขวดบรรจุ Diluent 9 มลิ ลิลิตร
•Baird parker (BP) agar
•Manitol salt agar เติมไขแดง
•Brain heart infusion broth
•น้ําเดอื ด
•น้ําเกลือรอ ยละ 0.8
•หลอดขนาด 10 x 75 มลิ ลิลิตร
•อางน้ําอุน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 130

การทดลองและรายงานผล

1. การตรวจวเิ คราะหโ ดยไมน บั จํานวน

1.1 ชง่ั เครอ่ื งปรงุ บะหม่ี 5 กรมั ใสในถุงพลาสติกบรรจุ TS broth 20
มิลลลิ ติ ร เขยา ขวด บม ท่ี 25 องศาเซลเซียส เปนเวลา 2 ชว่ั โมง

1.2 เติม TS broth ซึ่งมเี กลือแกงรอยละ 20 ปรมิ าตร 20 มิลลิลิตร ลงในขอ
1.1 บม ท่ี 35 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ถึง 48 ชว่ั โมง

1.3 ใชลูป Streak เชอ้ื จากขอ 1.2 และ S.aureus ลงบน BP agar MSEY
agar เพื่อใหไดโคโลนีเดี่ยว ๆ บม ท่ี 35 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง

1.4 สังเกตการเจริญของ Staphylococcus ซง่ึ เมอ่ื อยบู น BP agar โคโลนมี ี
สีดําเปนมนั มขี อบขาวมกี ารตกตะกอนรอบๆ โคโลนี บน MSEY agar โคโลนมี ี
สีเหลือง

2. การตรวจวเิ คราะหเ พอ่ื นบั จํานวน

2.1 ชง่ั ตวั อยา งลายหรอื เอแคร 25 กรมั ทาํ ใหอ าหารเจอื จางระดบั 1:10
ดว ยเครื่องตีปนไฟฟา หรอื Stomacher

2.2 ทาํ ใหต ัวอยา งเจอื จางคงเปน 10-2 ,10-3 และ 10-4
2.3 ตรวจนับจํานวนดวยวิธี Spread plate โดยใช BD agar และ MSEY
agar

3. การทดสอบเอนไซม Coagulase

3.1 ใชลูปเข่ยี เชื้อจากโคโลนใี นขอ 1.4 และ 2.2 และเชื้อ S.aureus ลงใน
BHI broth โคโลนีและหอลด บม ท่ี 35 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

3.2 เจอื จางนา้ํ เลือดดวยนํ้าเกลอื รอ ยละ 0.85 โดยใชอัตราสวน 1:2
(น้ําเดือดตอนํา้ เกลือ)

3.3 ใชป เปตดูดน้ําเดอื ด (ขอ 3.2) ใสห ลอดขนาดประมาณ 10 X 75
มิลลิเมตร หลอดละ 0.5 มลิ ลิเมตร

3.4 ใชป เปตดดู เชอ้ื จากขอ 3.1 ปรมิ าตร 0.2 มลิ ลิลิตร ลงในหลอดน้ําเดอื ด
3.5 เตรยี มหลอดควบคมุ โดยใช BHI broth 0.2 มิลลิลิตรแทนเชื้อ
3.6 บม หลอดจากขอ 3.4 และ 3.5 ในอางนํ้าอุน ซง่ึ ควบคมุ อณุ หภมู ทิ ่ี 37
องศาเซลเซียส

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 131

3.7 ตรวจผลการแข็งตัวของนํ้าเลอื ดทกุ ๆ ชว่ั โมงจนครบ 4 ชว่ั โมง บมหลอด
ที่ใหผลลบตอไปอีก 24 ชว่ั โมง การแข็งตัวของนํ้าเลือดจะมลี กั ษณะตา งๆ กนั ตาม
ปริมาณเอนไซมท เ่ี ชอ้ื สรา งขน้ึ ดงั น้ี

- = ไมท ําใหเลือดแข็ง
+ = จํานวนเครอ่ื งหมายแสดงถงึ การแขง็ ของเลอื ดมากขน้ึ ตามลําดบั
3.8 รายงานผล
3.8.1 สําหรบั เครอ่ื งปรงุ บะหมร่ี ายงานวา ตรวจพบเชอ้ื Staphylococcus
ท้ังหมด(จากโคโลนีบนอาหารแขง็ ) และ S. aureus หรือไม (จากผลการตรวจ
Coagulase)
3.8.2 สําหรบั ลาบ และ เอแคร นบั จํานวน Staphylococcus ทง้ั หมด
และรายงานผลการตรวจเอนไซม Coagulase

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 132

การตรวจวเิ คราะห Salmonella ในอาหาร

การตรวจวเิ คราะห Salmonella ในอาหารนน้ั มวี ธิ กี ารและขน้ั ตอนการ
วิเคราะห ตลอดจนการทใ่ี ชเ ลย้ี งเชอ้ื แตกตา งจากการตรวจวเิ คราะหเ ชอ้ื นใ้ี นอจุ จาระ
ผูปวยอยูบาง ทง้ั นข้ี น้ึ กบั ชนดิ และลกั ษณะของอาหารในการตรวจวเิ คราะห อาหาร
ซึ่งผานกรรมวิธีการผลิตซึ่งมีผลทําใหเ ชอ้ื มคี วามแขง็ แรงนอ ยลง หรอื บาดเจ็บ
(Injury) เชน อาหารแหง อาหารแชแข็ง อาหารทผ่ี า นการฉายรงั สหี รอื ความรอ น
อาหารหมกั ดอง ไมค วรเรม่ิ ดว ยการใช Selective medium เลยทนั ที เนอ่ื งจากสาร
บางชนิดในอาหารประเภทน้ีในอาหารเพาะเชื้อที่ปราศจากสารยับยั้งการเจริญเติบโต
เสียกอน

สาํ หรบั อณุ หภมู ทิ ใ่ี ชบ ม เชอ้ื ในระยะ Pre-enrichment น้ันไมค วรใชอ ณุ หภมู ิ
สูงกวา 37 องศาเซลเซยี ส การใชอณุ หภูมิสงู ระดบั 42-43 องศาเซลเซยี ส จะมี
ประโยชนเ ฉพาะการ Enrich เชอ้ื จากตวั อยา งอาหารสดหรอื เชอ้ื ซง่ึ ผา นการ
Pre-enrich มาแลว เทา นน้ั

จุลนิ ทรยี 

•Salmonella spp.

ตัวอยา งอาหาร

•ปลาปน
•ไขผง
•แหนม
•เครื่องในไก

อุปกรณ

•ถุงพลาสติกสวมคอขวดบรรจุ Buffered peptone water 225
มิลลิลิตร และบรรจุ Selenite cystine broth 225 มิลลิลิตร

•หลอดบรรจุ Selenite cystine broth 10 มลิ ลิลิตร และ บรรจุ
10 แ ห น ม
ον"ε"(λ"(λ7& α60∃∋Α%!"ne water 225แหนม
""("(7&

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 133

•Lysine decarboxylase broth
•ONPG broth
•NA slant
•น้ําเกลือรอยละ 0.85 ปราศจากเชอ้ื
•Polyvalent "O" antiserum
•Polyvalent "N" antiserum
•Vi antiserum
•จานเพาะเชื้อ
•ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร
•สไลด

การทดลองและรายงานผล

1. การ Pre-enrich (ปลาปน ไขผ ง และแหนม)

ชั่งตัวอยางอาหาร 25 กรมั ใสใ นถงุ พลาสตกิ ซง่ึ บรรจุ Buffered peptone
water ใชมือบีบถุงใหอาหารแตกละลาย สําหรับอาหารทเ่ี ปน กรดจดั ควรปรบั ให
อยูร ะหวา ง 6.8-7.0 ดวย สารละลาย NaOH 1 N บม เชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส 24
ชว่ั โมง

2. การ Enrich ใน Selection medium

2.1 สําหรบั ปลาปน ไขผง และอาหารสตั ว เมื่อเชื้อปรับตัวใน Buffered
peptone water แลว ถายเชอ้ื ปรมิ าตร 1 มิลลิลิตรจากขอ 1 ใสล งในอาหารเพาะเชอ้ื
สองชนดิ นี้คอื Selenite cystine broth ปรมิ าตร 10 มลิ ลิลิตร และ Tetrathionate
broth ปรมิ าตร 10 มลิ ลิลิตร บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 37 องศาเซลเซยี ส 24 ชว่ั โมง

2.2 สําหรบั อาหารสด เชน เครื่องในไก ชั่งตัวอยางอาหาร 25 กรมั ใสใ น
ถุงพลาสตกิ บรรจอุ าหาร Selenite cystine broth ปรมิ าตร 225 มิลลิลิตร และ
Tetrathionate broth ปรมิ าตรเทา กนั อยางละถุง ใชมือบีบถุงใหตัวอยางอาหารแตก
บมท่ี 37 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 134

3. การแยกเชอ้ื บนอาหารแขง็

3.1 ใชลูปแตะเชื้อจากขอ 2.1 และ 2.2 Streak ใหไดโคโลนีเดี่ยวๆ บน
SS agar บม ท่ี 37 องศาเซลเซียส 40 ชว่ั โมง

3.2 สังเกตโคโลนีของ Salmonella ซง่ึ โคโลนจี ะไมม สี ี โคโลนีใสหรือทึบ
บางสายพนั ธอุ าจมสี เี ขา กลางโคโลนี

4. การทดสอบปฏกิ ริ ยิ าทางชวี เคมบี างประการ

เขี่ยเชื้อจากโคโลนีลักษณะดังกลาวในขอ 3.2 ลงในอาหารเพาะเชื้อตอไป
น้ี บม ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส 24 ชว่ั โมง

TSI agar (Slant และ Butt) เชอื้ Salmonella จะไมสรา ง Urease
อาหารจะไมเ ปลย่ี นสี

Lysine decarboxylase broth Salmonella จะสรา ง Lysine
decarboxlase ทาํ ใหอ าหารเปลย่ี นเปน สมี ว ง

ONPG broth เชอ้ื Salmonella ไมส รา งเอนไซน D-galactosidase
อาหารจะยงั คงไมม สี ตี ามเดมิ

5. การทดสอบแอนทเิ จน

5.1 ถายเชื้อลงบน NA slant บม ท่ี 27 องศาเซลเซยี ส 24 ชว่ั โมง ทํา
Suspension ดว ยน้ําเกลอื ปกตปิ ริมาตร 1 มิลลิลิตร

5.2 หยด Suspension ลงบนสไลด 3 หยด หางกันพอสมควร
5.3 หยด Polyvalent "O" Antiserum ลงใน Suspension หยดแรก
Polyvalent "N" Antiserum ลงในหยดที่สอง
5.4 เอยี งสไลดไ ปมา สังเกตการตกตะกอน (Agglutination) การ
ตกตะกอนในหยดซง่ึ มี Antiserum โดยทใ่ี นหยดทส่ี ามซง่ึ ไมม ี Antiserum อยู ไมม ี
ตะกอนเกิดขึ้น แสดงวาเกิดผลบวก ในกรณีที่เกิดตะกอน Suspension หยดทไ่ี มไ ด
เติม Antiserum แสดงวาเกิด Autoagglutination การทดสอบนจ้ี ะไมไ ดแ สง
5.5 ในกรณที เ่ี กดิ ปฏกิ ริ ยิ าเฉพาะกบั "H" Antiserum หยด "Vi"
Antigen ลงใน Suspension หยดทส่ี าม หรือทดสอบกับ "O" Antiserum ใหม
หลังจากตม Suspension ประมาณ 1 นาที

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 135

หมายเหตุ

การทดสอบตั้งแตขอ 3-5 ใหเปรยี บเทยี บผลการทดสอบเชื้อคมุ (Salmonella
spp.)

6.! การสรปุ และรายงานผล

6.1 เชอ้ื ซง่ึ ใหผ ลการทดสอบทางชวี เคมซี ง่ึ แสดงวา เปน Salmonella และ
ตกตะกอนแยกกับ Antiserum ถือวาเปน Salmonella

6.2 เชอ้ื ซง่ึ ใหผ ลการทดสอบทางชวี เคมเี พยี งบางการทดสอบ แตไ ม
ตกตะกอน กับ Antiserum ถือวาไมใช Salmonella

6.3 รายงานผลวา ตรวจพบ Salmonella หรือไมใ นตวั อยา งอาหาร 25 กรมั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 136

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ป ระเภท Food poisoning bacteria

การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเกิดโรคเปนสิ่งที่จาํ เปน อยา งมาก เพราะเปน
ดัชนใี นการบง ช้ึถึงความปลอดภยั ของผบู รโิ ภค และความไดม าตรฐานของผลติ ภณั ฑ
จากเทคโนโลยีที่ทําการผลติ อาหารนน้ั ๆ

1.! ตรวจเชอ้ื Staphylococcus aureus ในอาหาร

1)! เท Plate โดยใช Baird – Parker ‘s media และ Mannitol salt agar ทง้ิ
คางคืนไวเพื่อใหผิวหนาแหง

2) เตรยี มการเจอื จางตวั อยา ง 1/10 โดยซง่ึ อาหาร 50 กรัม ปน ดว ยเครอ่ื งปน
ไฟฟา (Blender) ประมาณ 1นาที โดยเตมิ น้ํา 450 มิลลิลิตร จากความเจอื จาง
1/10 ใหเตรยี มความเจอื จาง 1/1,000

3)! ใชป เปตดูดความเจอื จาง 1/10 หยดบนผวิ หนา อาหารทเ่ี ตรยี มไวใ นขอ 1
จานละ 0.1 มลิ ลิลิตร 2 จาน และความเจอื จาง 1/1,000 จานละ 0.1 มลิ ลิลิตร
2 จาน และจานละ 1 มิลลิลิตร 2 จานใชแ ทง แกว ทง่ี อเปน รปู L จมุ
แอลกอฮอลลนไฟรอใหเย็นสักครู เกล่ียอาหารใหก ระจายไปทว่ั จาน

4) ทําการบม เพาะเชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง ตรวจและนับ
จํานวนโคโลนีของ Staphylacoccus aureus ซ่ึงจะสงั เกตไดด งั น้ี
บน Baird – Parker’s medium โคโลนีจะมีสีดําเปน มนั มขี อบขาว
เล็กๆ รอบ ๆโคโลนจี ะมี Clear zone
บน Mannitol salt agar โคโลนีมีสีเหลือง รอบๆโคโลนจี ะมสี เี หลือง
เชน กนั

5) ทดสอบเพื่อใหแนใจวาโคโลนีที่สังเกตเหลานั้นเปน Staphylococcus aureus
จริงโดยตรวจ
ก. Subculture เชื้อลงใน Brain heart infusion broth นําไปบม เพาะเชอ้ื
ไว 48 ชว่ั โมง
ข. ทาํ ให Blood plasma เจอื จางลง โดยใช Plasma 1 สวน ตอนํ้าเกลือ
รอยละ 0.85 จาํ นวน 2 สวน (ใช Rabbit plasma หรอื Human plasma
ก็ได)
ค. ใชป เ ปตดดู เช้อื จากขอ ก. ลงในหลอดเล็กๆ 0.1 มิลลิลิตร และดูด
Plasma 0.3 มิลลิลิตร ลงในหลอดนั้น แชใน Water bath ท่ี 37 องศา
เซลเซียส เปนเวลา4 ช่ัวโมง เชอ้ื ทส่ี รา งเอนไซม Coagulase (Coagulase

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 137

positive) จะสามารถ Clot blood plasma ใหแข็งตัว ซ่ึงอาจจะมลี กั ษณะ
ตางๆ กัน สําหรบั เชอ้ื ทใ่ี ห Coagulase มากนอ ยไมเ ทา กนั ดงั นค้ี อื

-+ ++ +++ ++++

ภาพ 19 การเกดิ การแขง็ ตวั ของ Blood plasma

สาํ หรับหลอดที่ใหผลเปน Negative ใหบมเพาะเชื้อตอไปเปน 24 ชว่ั โมง
อีกครั้งหนึ่ง

การตรวจ Coagulase น้ี อาจทาํ ดวยวิธีสไลดได คือหยดเชื้อลงบนสไลด
1 หยด หยด Plasma ลงบนเชอ้ื เอยี งสไลดไ ปมา ถาเชื้อเปน Coagulase positive
จะมีตะกอนเกิดขึ้นเห็นไดชัด

2.! ตรวจเชอ้ื Clostridium perfringens ในอาหาร

2.1 เท Plate ดวย Shahidi - Perfringens medium ทิ้งคางคืนไวเพื่อให
ผิวหนาแหง

2.2 ใชป เปตดูดอาหารทเ่ี จอื จาง 1/10 (จากขอ 1(2)) หยดบนผวิ หนา ของ
อาหารเลย้ี งเชอ้ื จานละ 0.1 มิลลิลิตร ใชแทงแกวรูป L จุมแอลกอฮอลลนไฟ หยด
อาหารใหแผไปจนทว่ั จาน แลวเติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไมไดเติมไขแดงทับหนา

2.3 นําไปบมเพาะเชื้อ โดยไมต องกลบั จานใน Anaerobic jar นาน 24
ชั่วโมงตรวจดูโคโลนีของ Cl. perfringens ซ่ึงจะมีสีดําขนาดประมาณ 2-3 มลิ ลิเมตร
รอบๆโคโลนมี ี Precipitation zone สีขาวๆ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 138

3.! การตรวจหาเชื้อ Vibrio parahaemolyticus ในอาหาร

3.1!Enrich อาหารทะเลทจ่ี ะตรวจ เชน ปู กุง และหอย เปนตน ใน Broth ซง่ึ

ประกอบดว ย

Peptone รอ ยละ 1

Yeast extract รอ ยละ 3

NaCl รอ ยละ 2

Polymyxin 250 µg/ml

การใสต วั อยา งอาหารใน Broth นําไปบม เพาะเชอ้ื ไว 2 - 3 วัน
3.2 Loop แตะ Broth ท่ี Enrich ไวจ ากขอ (1) Streak บน TCBS agar
นําไปบมเพาะเชื้อที่อุณหภูมิหอง
3.3! ตรวจโคโลนีของ Vibrio parahaemolyticus ซ่ึงจะมลี ักษณะกลม
ของเรยี บ นูน มสี เี ขยี ว ตรงกลางโคโลนีมีสีเขม กวา รอบนอก ขนาดประมาณ
2 - 3 มิลลิเมตร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 139

ตาราง 16 ความแตกตา งของ V.parahaemolyticus จากจลุ นิ ทรียอ น่ื ๆ

จุลินทรีย Colonial TSI Lysine Voges Growth

appearance Slant/butt Decarbo Proskauer in 8 %

on TCBS xylase NaCl

V.parahaemolyticus Large,dark Alk/Acid + - +
green centre
V.cholorae Acid/Acid + d* or + -
Medium
V.alginolyticus yellow Acid/Acid + + +
V.anguillarum Large yellow Acid/Acid - + -
Other marine vibrios No growth d + +
Aeromonas Large green d/d - d -
Small yellow Acid/Acid
Pseudomonas sp Or no growth (gas d) - - -
Small, Alk/Alk
Plesimonas ale green + - -
Protieus sp. or colourless Alk/Acid (mirabilis)
No growth (d)/(gas d)
*d = variable. Small, yellow (d)
black or green

4.! การตรวจเชอ้ื Salmonella sp. ในอาหาร

4.1! Enrich ตวั อยา งอาหารทจ่ี ะตรวจ เชน ตับไก Swab จากเปลือกไข

ใน Selenite cystine broth นําไปบม เพาะเชอ้ื ไว 2 - 3 วัน
4.2! ใช Loop แตะ Broth จากขอ (1) Streak บน Brillient green sulfa

agar
4.3! ตรวจดูโคโลนีของ Salmonella sp. ซง่ึ อาจจะไมม สี ี หรือสีชมพู
รอบๆ โคโลนมี สี ชี มพหู รอื แดง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 140

สูตรอาหารเลย้ี งเชอ้ื
1. Baird – Parker ‘ s Medium

Tryptone 10 กรมั
Meat extract 5 กรมั
Yeast extract 1 กรมั
Lithium chloride 5 กรมั
Agar 20 กรมั
Distilled water 1 ลิตร

ตมใหวุนละลาย ปรบั pH ใหได 6.8 แบงใสขวดๆละ 90 มลิ ลิลิตร Autoclave
ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส 15 นาที หลงั จาก Autoclave แลว ทง้ิ ใหเ ยน็ ลงประมาณ 50
องศาเซลเซียส เติมสารละลายตอ ไปน้ีซึ่งไดกรองผานเครอื่ งกรองแบคทีเรียแลว
Glycine รอยละ 20 จํานวน 5 มิลลิลิตร Egg yolk emulsion 5 มลิ ลิลิตร เมื่อผสม
แลวตองใชทันที

การเตรียม Egg yolk emulsion

ลางไขใหสะอาด แชใน Mercuric Chloride รอ ยละ 0.1 ตอยไขใหและแยก
ไขขาวออกไปใหหมด เทไขแดงลงในกระบอกตวงที่นึ่งฆาเชื้อแลว เตมิ น้ําเกลือ
รอยละ 0.85 ท่ีน่ึงฆาเชอ้ื แลวลงไปใหเ ทากบั ปริมาตรของไขแ ดง ใชปเปตคนใหเขา
เปนเนื้อเดียวกัน

2. SEP agar

Tryptose 15 กรมั
Yeast extract 5 กรมั
Ferric amononium citrate 1 กรมั
Sodium metabisulfite (Na2S2O5) 1 กรมั
Polymysin B sulfate 30,000 units
Kanamycin sulfate 0.01 กรัม
Agar 20 กรมั
Distilled water 900 มิลลิลิตร

ปรบั pH 7.6 Autoclave 121 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 10 นาที ทิ้งใหเย็น
ประมาณ 50 องศาเซลเซยี ส เติมEgg yolk emulsion 100 มิลลิลิตร ผสมแลวใชทันที

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 141

3. TCBS agar

Yeast extract 5 กรมั
Ferric citrate 1 กรมั
Peptone 10 กรมั
Bromthymol blue 0.04 กรมั
Sodium citrate 10 กรมั
Thymol blue 0.04 กรมั
Sodium thiosulfate 10 กรมั
Agar 15 กรมั
Oxgall 5 กรมั
Distilled water 1 ลิตร
Sodium cholate 3 กรมั
Saccharose 20 กรมั
Sodium chloride 10 กรมั

4. Selenite cystine broth

Tryptone 5 กรมั
Lactose 4 กรมั
NaHPO4 20 กรมั
Sodium acid selenite 4 กรมั
L-cystine solytion 1 มิลลิลิตร