หลักการวิเคราะห์จุลินทรีย์

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 42

2.2 ขอ กําหนดของความถกู ตอ งแมนยาํ

ตัวอยางอาหารควรเจือจางลงในระดับท่ีสามารถจะตรวจนับจุลินทรียใน
แตละชองเล็กไดในระหวาง 1-10 เซล

2.3 การตรวจนบั

2.3.1 ลางเครื่องมือใหสะอาด เช็ดใหแหง
2.3.2 ปด ทบั บรเิ วณสเ่ี หลย่ี มซง่ึ มชี อ งแบง ดว ยกระจกปด สไลด
2.3.3 ใชป เปตแบบซง่ึ ใชเ ฉพาะกบั เครอ่ื งมอื น้ี โดยมสี ายยางสวมปลาย
ท่ีจะใชด ดู ตวั อยา งอาหาร แตะปลายปเปตดา นแหลมทม่ี ชี อ งระหวา งสไลด
และกระจกปดสไลด เปา ใหต วั อยา งอาหารซมึ เขา ไปในบรเิ วณชอ ง ซง่ึ
กําหนดปริมาตรดังที่กลาวไวขางตน
2.3.4 ตรวจนับโดยใช Objective กําลงั ขยาย 40 เทา
2.3.5 นบั จํานวนจลุ นิ ทรียในแตล ะชอ งเลก็ ควรตรวจนบั จํานวนจลุ ินทรยี 
ท้ังสน้ิ ไมน อ ยกวา 10 ชอง

2.4 การคํานวณปรมิ าณจลุ นิ ทรยี 

2.4.1 รวมจํานวนที่นับจากแตละชองเล็กหารดวยจํานวนชอ ง จะได
คาเฉลี่ยของจาํ นวนจลุ นิ ทรียต อ หนง่ึ ชอ งเลก็ เชน ได X เซลตอชอง
2.4.2 คํานวณจํานวนจลุ นิ ทรียตอ ตวั อยา งอาหารหนง่ึ มลิ ลลิ ติ รไดด งั น้ี

อาหาร 0.00025 ลูกบาศกมิลลิเมตร มจี ลุ ินทรยี  = X เซล

(ปริมาตรของแตละชองเล็ก) = (X)(103) เซล

อาหาร 1 มิลลิลิตร มจี ลุ นิ ทรยี 

0.00025
= 4X x 106 เซล

3. การตรวจนับโดยคาํ นวณจาก Stage micrometer

Stage micrometer เปน สไลดซ่ึงมเี ครอ่ื งหมายแบง ชอ งขนานกนั โดยมรี ะยะ
หางของแตละชองอยางแนน อน ซ่ึงสวนมากจะกําหนดใหแ ตล ะชอ งหา งกนั 0.01
มิลลิเมตร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 43

3.1 การหาพน้ื ทห่ี นา กลอ ง (Microscopic field)

วาง Stage micrometer บนแทงของกลองจลุ ทรรศน โฟกสั จนเหน็ ชอ ง
แบงเล่ือนขอบดา นใดดา นหนง่ึ ของพน้ื ทห่ี นา กลอ งใหต รงกบั ขดี หาความยาวเสน
ผาศูนยกลางของแตล ะพน้ื ทไ่ี ดโ ดยนบั จํานวนชองแลวคูณดวย 0.01

เชน นบั ได D ชอง เสน ผา ศนู ยก ลางจะมคี า เทา กบั 0.01D มลิ ลิเมตร
พื้นที่หนากลอง = π 0.01D 2 ตารางมิลลิเมตร

2

ควรหาคาพนื้ ทหี่ นา กลองของ Objective แตละกําลงั ขยายแลว จดบนั ทกึ

3.2 การเตรยี มสไลดต วั อยา งอาหาร

อาหารทน่ี ยิ มใชใ นการตรวจวเิ คราะหด ว ยวธิ นี ้ี ไดแก ผลิตภัณฑนม
ไขเหลว (Liquid egg) และไขแชแ ขง็ (Frozen egg)

3.2.1 ขดี ตารางบนแผน สไลดใ หม เี นอ้ื ท่ี 1 ตารางเซนตเิ มตร
3.2.2 ใชปเปตซึ่งบอกหนวยยอยไดถึง 0.01 มิลลิลิตร ดูดตัวอยาง
อาหารหยดลงในตารางที่กาํ หนดไว ใชลูปสะอาดเกลี่ยใหตัวอยางแผ
เต็มตารางอยางสมํ่าเสมอทส่ี ดุ เทา ทจ่ี ะเปน ไปได สําหรบั อาหารทม่ี ไี ขมนั
มากควรเตมิ Tween 80 ปรมิ าณรอ ยละ 0.05 กอนดูดอาหารลงบนสไลด
ทําใหสไลดแหงโดยการองั ความรอนอุณหภมู ริ ะหวาง 40-45 องศา
เซลเซียส ในแนวราบ
3.2.3 ตรึงจุลินทรียใหติดสไลดโดยแชสไลดในแอลกอฮอลรอยละ 95
ประมาณ 1-2 นาที สําหรับอาหารทม่ี ไี ขมนั มากควรลา งไขมนั ออกดว ย
ไซลีน (Xylene)
3.2.4 ยอ มสตี ามวธิ ที เ่ี หมาะสม โดยทว่ั ๆ ไปนิยมใชว ธิ ีการยอมวิธีใด
วิธีหนึ่งดังนี้

3.2.4.1 ยอมดว ยสี North's anililine oil methylene blue
ประมาณ 10-20 นาที แลวลางสีออกดวยน้ําและลางซํ้าดวย
แอลกอฮอลรอยละ 95 ประมาณ 1-2 นาที
3.2.4.2 ยอ มดว ย Newman-Lampert stain ซ่ึงดดั แปลงโดย
Lerowitz-Webber เปนเวลา 2 นาที แลวลางสีออกดวยน้ํา 3 ครง้ั
3.2.4.3 ยอ มดว ย Methylene blue 2-3 นาที ลางนํ้า

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 44

3.3 การตรวจนับและการคํานวณ

3.3.1 นําสไลดท เ่ี ตรยี มไวว างบนแทน ของกลอ งจลุ ทรรศน ตรวจนับ
จํานวนจุลินทรียในแตละพื้นที่หนากลอง โดยใช Oil immersion objective
ควรตรวจนับจํานวนจากหลาย ๆ พน้ื ท่ี แลวหาคาเฉลี่ยตอพื้นที่ โดยมีหลักเกณฑใน
การนบั คอื ใหนบั แตละเซลทแ่ี ยกอยูเด่ียว ๆ เปน หนง่ึ เซล สาํ หรบั เซลทอ่ี ยเู ปน กลมุ
ใหน บั หนง่ึ กลมุ เปน 1 เซลเชนเดียวกัน ทง้ั นเ้ี นอ่ื งจากเมอ่ื ตรวจนบั ดว ยวธิ ี Viable
plate count นน้ั หนง่ึ กลมุ ของเซลจะเจรญิ เปน หนง่ึ โคโลนีเทานน้ั จํานวนพน้ื ทท่ี จ่ี ะ
นับข้ึนอยูกับความหนาแนน ของจลุ นิ ทรยี ใ นแตล ะพน้ื ทด่ี งั น้ี

จํานวนเฉลย่ี เซลหรือกลุมตอ พน้ื ท่ี จํานวนพน้ื ทท่ี ค่ี วรนบั

0.5 50
0.5 -1 25
1-10 10
10-30 5
30 ควรทําใหอาหารเจือจางลงอีก

3.3.2 คาํ นวณหาปรมิ าณจลุ นิ ทรียตอหนง่ึ มลิ ลิลติ รของอาหารดงั น้ี

เม่ือคา เฉลยี่ ของจํานวนจลุ นิ ทรียท่ีนบั ไดต อ พน้ื ทห่ี นา กลอ ง = X เซล

ดังนั้น ในอาหารทต่ี ดิ บนสไลดบ รเิ วณพน้ื ทห่ี นา กลอ งมจี ลุ นิ ทรยี  = X เซล

ในอาหารทต่ี ดิ บนสไลดบ รเิ วณ 1 ตารางเซนตเิ มตร มจี ลุ ินทรยี  = X x100

(ตัวอยา งอาหาร 0.01 มลิ ลิลิตร) พื้นที่หนากลอง

ตัวอยางอาหาร 1 มลิ ลิลิตร มจี ลุ ินทรยี  = X x100x100

พื้นที่หนากลอง
= X x104 เซล

พื้นที่หนากลอง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 45

4. การตรวจนับโดยใช Howard mold counting chamber

4.1 ประโยชน

วิธีน้ีจะมีประโยชนเฉพาะในการตรวจนบั จํานวนเสน ใยของเชอ้ื ราเทา นน้ั ซง่ึ
นิยมใชกับผลิตภัณฑอาหารที่ใชผักหรือผลไมเปนวัตถุดิบ ไดแก ซอสตา งๆ เชน
ซอสมะเขอื เทศ ซอสพรกิ แยมผลไม ผลไมเชื่อม น้าํ ผลไม ตลอดจนเครื่องเทศ
ตางๆ การตรวจพบเสน ใยของเชอ้ื ราในอาหารประเภทนใ้ี นปรมิ าณทม่ี ากเกนิ ขอ
กําหนด โดยเฉพาะอยางยิ่งเมื่อพบเสนใยของเชื้อราฝงแนนในเนื้อเยื่อของวัตถุดิบจะ
ช้ีบงไดว า อาหารนน้ั ผลติ จากวตั ถดุ บิ ทเ่ี นา เสยี จากเชอ้ื รา และผูผลิตไดตัดสวนที่
เนาเสียนัน้ ออก ซง่ึ ยอ มแสดงถงึ การผลติ อาหารอยา งไมถ กู ตอ งตามหลกั สขุ าภบิ าล
อาหาร และอาหารนน้ั อาจจะดอ ยในคณุ สมบตั ดิ า นกลน่ิ และรส ตลอดจนอาจมี
สารพิษที่เชอื้ ราผลติ ขน้ึ ในวัตถุดบิ และยังคงอยเู ม่อื ผานการแปรรปู เปนผลิตภณั ฑแลว

จากการตรวจนับเชื้อราตามวิธีของ Howard mold count น้ํามะเขือเทศมี
เชื้อราไดไมเกินรอยละ 2 สวนผลิตภัณฑมะเขือเทศ เชน ซอสมะเขอื เทศ มะเขอื เทศ
แชอม่ิ มเี ชอ้ื ราไดไ มเ กนิ รอ ยละ 40

4.2 เครอ่ื งมอื

Howard mold counting chamber นเ้ี ปน สไลดซ ง่ึ มลี กั ษณะคลา ยกบั

Haemacytometer แตก ารแบง ชอ งตา งกนั คือ มขี ดี แบง ชอ งขนาดหา งกนั 1.382

มิลลิเมตร และมขี อบรองรบั กระจกปด สไลด ซง่ึ ทําใหเ กดิ ระยะหา งระหวา งชอ งแบง

กับกระจกปด สไลดเ ปน ระยะ 0.1 มิลลิเมตร ดงั นน้ั เมื่อโฟกัสกลองโดยใชกําลงั ขยาย

90-125 เทา พน้ื ทว่ี งกลมระหวา งชอ งจะมคี า 1.5 ตารางมิลลิเมตร(เสน ผา ศนู ยก ลาง

1.382 มิลลเิ มตร) ของเหลวซง่ึ บรรจอุ ยใู นนน้ั จะมปี รมิ าตร 0.15 ลูกบาศกมิลลิเมตร

(0.1x1.5) ในกรณที ก่ี ลอ งทใ่ี ชไ มส ามารถปรบั ใหพ น้ื ทว่ี งกลมหนา กลอ งมเี สน

ผาศนู ยก ลาง 1.382 มิลลิเมตรได อาจคาํ นวณหาพน้ื ทด่ี งั กลา วไดโ ดยใช Stage

micrometer เครอ่ื งมอื นจ้ี ะมกี ระจกปด สไลดทม่ี ขี นาดและความหนาเฉพาะ

Eye piece micrometer เปนเครื่องมือเพื่อชวยในการตัดสินใจวา
ความยาวของเสน ใยเชอ้ื ราอยใู นขา ยทจ่ี ะนบั จํานวนหรอื ไม Micrometer นม้ี ชี อ ง
แบงเปนสี่เหล่ียมจัตุรัสแตละชองหางกันหนึ่งในหกของเสนผาศูนยกลางของ
ความกวางของชองบน Counting chamber

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 46

1.382 มม.

ภาพ 17 อปุ กรณ Howard mold counting chamber

4.3 การเตรยี มตวั อยา งอาหาร

อาหารแตละชนิดมขี อแนะนําในการเตรยี มเพอ่ื วเิ คราะหต า งกนั ขึ้นกบั
ความเขมขนขนาดของเนื้อเยื่อซึ่งมีเหลืออยูในผลิตภัณฑ ผลติ ภณั ฑบ างชนดิ จําเปน
ตองเตมิ สารทท่ี ําใหเ กดิ ความคงตวั ในผลิตภณั ฑ (Stabilizers) ซ่ึงนิยมใชส าร
ประกอบประเภท Sodium carboxymethylcellulose รอยละ 0.5 หรอื Pectin รอยละ
3-5 หรอื Algin รอยละ 1 ซง่ึ เตรยี มโดยการปน สารดงั กลา วในปรมิ าณทจ่ี ะให
ความเขมขนที่ตองการดวยนํ้ารอ นปรมิ าตร 500 มิลลิลิตร และ Formaldehyde 10
มิลลิลติ ร ในเครอ่ื งตปี น ไฟฟา ประมาณ 1 นาที ตมเพื่อไลฟองอากาศ ปรบั pH ให
อยูร ะหวา ง 7.0-7.5

4.3.1 ซอสมะเขอื เทศ (Catsup) บรรจุ Stabilizer ปรมิ าตร 50
มิลลิลิตร ในกระบอกตวง เตมิ ตวั อยา งซอสทผ่ี สมกนั เขา ดแี ลว ลงไปจนปรมิ าตรเปน
100 มิลลิลิตร ผสมใหเ ขากัน

4.3.2 ซอสมะเขอื เทศเขม ขน (Paste) เตมิ น้าํ จนไดซ อสซง่ึ เมอ่ื กรองแลว
มคี า Refractive index 1.3448 ถึง 1.3454 ท่ี 20 องศาเซลเซียส

4.3.3 น้าํ สม คน้ั ผสมน้าํ สม ใหเ ขา กนั ดี ตวงใหไดปริมาตร 50 มลิ ลิลิตร
นําไปปนดวยความเร็ว 2,200 รอบตอ นาที เปนเวลา 10 นาที เทน้าํ ใสทง้ิ เตมิ น้ํา 10
มลิ ลิลิตร และ Stabilizer 5 มลิ ลิลิตรลงในสวนตะกอน ผสมใหเขากนั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 47

4.3.4 น้าํ สบั ปะรด เตรยี มเชน เดยี วกบั น้ําสม คน้ั แตหลังจากปนและ
เทสวนใสทิ้งแลวเติมกรดเกลือเขมขน 0.5 มิลลิลิตร เพื่อละลายผลึกของเกลือ
ออกซาเลท

4.3.5 ผงเครื่องเทศตาง ๆ ชั่งเครื่องเทศ 10 กรมั ใสในโถของเครื่อง
ตีปนไฟฟา เติมสารละลายโซเดยี มไฮดรอกไซดร อ ยละ 1 ปรมิ าตร 100 มิลลิลิตร
ตีปนประมาณ 1 นาที เทสารละลายดา งชนดิ เดมิ โดยลา งขา ง ๆ โถใหเครื่องเทศซึ่ง
ติดอยูใ หผ สมกบั ดา ง ตีปน ตอ อีก 1 นาที เทดา งลงไปอกี จนครบ 200 มลิ ลิลิตร เติม
Capryl alcohol 2 ถึง 3 หยด เพื่อทําใหฟ องยบุ ผสมสว นผสมน้ี 100 มิลลิลิตร กับ
Stabilizer 50 มลิ ลิลิตร

4.4 การตรวจนบั และรายงานผล

4.4.1 ลาง Counting chamber และกระจกปดสไลดใ หสะอาดเชด็ ใหแหง
4.4.2 หยดตัวอยางที่เตรียมตามวิธีที่กลาวแลวลงบนCounting chamber

บรเิ วณสี่เหลี่ยมท่ีมชี องแบง ใช Spatula ซง่ึ มขี อบเรยี บปาดอาหาร
ใหแผอยา งสม่ําเสมอทวั่ บริเวณส่ีเหลี่ยมนนั้ ปด ทบั ดว ยกระจกปด
สไลด
4.4.3 ติด Eye piece micrometer เขา กบั Eye piece ตรวจนับดว ย
Objective กําลังขยาย 10 เทา นบั จํานวนเสน ใยของเชอ้ื ราใน
แตละพน้ื ที่หนากลอ ง (1.5 ตารางมิลลิเมตร) โดยนบั ทง้ั สน้ิ
ไมนอยกวา 25 บริเวณ
4.4.4 รายงานผลเปนรอยละของพื้นที่หนากลองที่มีเสนใย (ใหผลบวก)
โดยคิดจากจํานวนบรเิ วณทต่ี รวจนบั ทง้ั หมด บรเิ วณทจ่ี ะนบั วา ให
ผลบวกจะตอ งมีเสนใยไมน อยกวา 3 เสนทย่ี าวกวาหนงึ่ ในหกของ
เสนผา ศนู ยก ลางพน้ื ทห่ี นา กลอ ง (หนึ่งชองของ Eye piece
micrometer)

5. การตรวจนบั เซลจลุ นิ ทรียซ่ึงกรองผา นแผน เมมเบรน

หลงั จากการกรองตวั อยา งอาหารผา นแผน เมมเบรน ตามวิธีที่ไดกลาวถึงใน
เร่ืองเกย่ี วกบั การตรวจวเิ คราะหโ ดยการกรองแลว ผูวิเคราะหอ าจตรวจนบั จํานวน
เซล สปอร หรอื เสน ใยของเชอ้ื ราทต่ี ดิ อยบู นแผน เมมเบรน ไดดวยกลองจุลทรรศน
ดงั น้ี

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 48

5.1 ยอ มแผน กรองซง่ึ มจี ลุ นิ ทรียต ดิ อยดู ว ยสี Ponceau S แลวตรึงใหติด
สไลดดวยกรดอะซิตริค (Acetic acid)

5.2 วางแผน กรองบนสไลดใหด า นทม่ี จี ลุ นิ ทรียอยขู า งบน
5.3 ทาํ ใหแผนกรองแหง โดยยกสไลดผานเหนือเปลวไฟ
5.4 หยด Immersion oil บนแผน เมมเบรน แผน เมมเบรนจะใสและยอมให
แสงผา นได
5.5 ตรวจนบั จลุ นิ ทรียด ว ยกลอ งจลุ ทรรศน
5.6 รายงานผลเปน จํานวนตอ ปรมิ าตรของตวั อยา งอาหารทก่ี รองผา นแผน
เมมเบรน

ตัวอยา งปฏบิ ตั กิ าร:
การวิเคราะหจํานวนจลุ นิ ทรียด ว ยกลอ งจลุ ทรรศน

ตวั อยา ง

•ยาคลู ท
•ซอสมะเขือเทศ
•ซอสพรกิ
•น้ํามันหอย

อุปกรณ

•Haemacytometer
•Howard mold counting chamber
•Stage micrometer
•สไลด
•ปเปตขนาด 0.1 มิลลิลิตร
•แอลกอฮอล
•สียอม Methylene blue (Levowitz-Weber ดดั แปลงจาก
Newman-Lampert บรรจใุ น Cobblin jar ซง่ึ มฝี าปด )
•น้ํายาไอโอดีน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 49

การทดลองและรายงานผล

1.! การตรวจวิเคราะห Haemacytometer

1.1! ทําซอสมะเขือเทศใหเจือจางลงหนึ่งเทาโดยใชนํ้ายาไอโอดีนเปน
ตัวทําใหเ จอื จาง

1.2! ปด Cover slip ทบั บรเิ วณทเ่ี หลย่ี มซง่ึ มชี อ งแบง บน
Haemacytometer

1.3! ใชป เปตซึ่งมสี ายยางสวมปลาย ดูดตวั อยา งใหเตม็ กระเปาะกลาง
แตะปลายปเ ปตทช่ี อ งระหวา ง Cover slip และสไลด เปา ให
ตัวอยา งซง่ึ เขา ไปเตม็ บรเิ วณสเ่ี หลย่ี มซง่ึ มชี อ งแบง

1.4! นับจํานวนแบคทีเรียในแตละชองเล็ก รวม 10 ชอง หาจํานวน
เฉลี่ยตอชอง

1.5! คํานวณจลุ ินทรียตอตัวอยางอาหาร 1 มลิ ลิลิตร (4x106x จํานวน
เฉลี่ยของจุลินทรียตอชอ งเล็ก x ระดบั ความเจอื จางในน้ํายา
ไอโอดีน)

2.การตรวจวเิ คราะหโ ดยใช Stage micrometer

2.1 คํานวณคา Microscopic field (MF) ของ Oil immersion
objective โดยใช Stage micrometer

2.2 ขดี ตารางสเ่ี หลย่ี มจตุรัสขนาด 1 x 1 เซนตเิ มตร บนแผนสไลด
2.3 ใชป เ ปตขนาด 0.1 มิลลิลิตร ดดู ยาคูลทป รมิ าตร 0.01 มิลลิลิตร หยด
บนชองสีเ่ หลย่ี มบนสไลดเฉลยี่ ใหทั่วชองอยา งสม่ําเสมอ ปลอยใหตัวอยางอาหารแหง
ติดสไลด
2.4 แชสไลดในสียอม Methylene blue ประมาณ 2 นาที ควรปดฝา
Cobblin jar ตลอดเวลาขณะที่แผนสไลด เพื่อปอ งกันการตกตะกอนของสี
2.5 ยกสไลดข น้ึ และปลายดา มใดดา นหนง่ึ บนกระดาษซบั
2.6 ลางดวยน้ํา 2 - 3 ครง้ั ทิ้งใหแหง
2.7 นบั จํานวนแบคทเี รยี โดยใช Oil immersion objective หาจํานวนเฉลี่ย
ตอ Microscopic field
2.8 คาํ นวณจํานวนแบคทีเรียตอตัวอยางอาหารหนึ่งมิลลิลิตร ซง่ึ มคี า เทา กบั

จํานวนเฉลี่ย MF x 104
MF

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 50

2.! การตรวจวิเคราะหโดยใช Howard mold counting chamber

3.1 ติด Eye piece micrometer กับ Eye piece ของกลอง
3.2 หยดซอสมะเขอื เทศ ซอสพรกิ หรอื น้ํามนั หอย ลงบนบริเวณสี่เหลี่ยม
ซ่ึงมีชอ งแบง ของ Howard mold counting chamber เกลี่ยใหสมํ่าเสมอ ปดทับดวย
Cover slip
3.3 ตรวจนับดวยกลองจุลทรรศนโดยให Objective กาํ ลงั ขยาย 10 เทา
โดยนบั ทง้ั สน้ิ 25 Field บันทกึ จํานวน Field ทม่ี เี สน ใยเชอ้ื ราซง่ึ ขาวไมน อ ยกวา 1
ชองแบงของ Eye piece micrometerหารอ ยละของจํานวน Field ซง่ึ มเี สน ใยดงั กลา ว

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 51

หลกั การและวิธีตรวจวิเคราะหจุลินทรีย
โดยการกรองผานแผนเมมเบรน( Membrane)

1. หลกั การ

การตรวจนับจุลินทรียดวยวิธีนี้ใชไดเฉพาะกับตัวอยางอาหารที่เปนของเหลว
เทา นน้ั และจะไดประโยชนต อ เมอ่ื ตวั อยา งอาหารมปี รมิ าณจลุ นิ ทรียนอ ย เกนิ กวา จะ
นับจํานวนจลุ นิ ทรียไดในตวั อยา ง 1 มลิ ลิลิตร ดงั นน้ั จงึ ใชต วั อยา งอาหารปรมิ าณมาก
เชน 10, 25, 50 หรือ100 มลิ ลิลิตร โดยกรองอาหารผา นแผน เมมเบรน( Membrane)
ท่ีมีขนาดชอ งที่ของเหลวผาน (Pore size) ขนาด 0.45-0.50 ไมครอน จลุ นิ ทรยี ท ม่ี ี
เซลขนาดใหญกวาชองของเมมเบรนจะติดอยูบนแผนกรอง และเนอ่ื งจากอาหาร
เล้ียงเช้ือจะสามารถซึมผานแผน กรองประเภทน้ไี ด ดงั นน้ั เมอ่ื นําแผน กรองทม่ี เี ซล
ของจุลินทรยี ต ดิ อยดู า นบนวางบนอาหารเลย้ี งเชอ้ื จลุ นิ ทรียจะเจรญิ เตบิ โตเปน
โคโลนใี หตรวจนับได

2. อุปกรณสําหรบั ใชในการกรอง

2.1 กรวยซ่ึงมที ง้ั ชนดิ ทท่ี ําดว ยแกว และเหล็กเสตนเลส มลี ักษณะเปน
กรวยแยกจากกันไดสองตอนเพื่อวางแผนเมมเบรน คั่นไดโดยมีแผนลวดตาถี่ๆ หรอื
ใยแกวอัดรองรับเมื่อวางแผนเมมเบรน แลว จงึ ใชค ลิปซงึ่ เปนสวนประกอบของ
เคร่ืองมือหนีบกรวยท้งั สองตอนเขา ดวยกนั ทอ กรวยสว นลา งแทงผา นจกุ ยาง ซง่ึ มี
ขนาดพอดีกับปากฟลาสค

2.2 แผนเมมเบรน ประเภท Cellulose ester ซง่ึ มบี รษิ ทั ผลติ หลายบรษิ ทั
ดวยกนั เชน Millipore หรอื Gelman filter เปน ตน มีชองที่ใหของเหลวผาน
ขนาดตา ง ๆ กนั ตามแตว ตั ถปุ ระสงคของการใช

2.3 แผนเซลลูโลสสําหรบั ดดู ซบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื (Absorbing pad)
2.4 ปม ดดู อากาศ (Vacuum pump)

3. วธิ กี าร

3.1 การเตรยี มเครอ่ื งมอื เพอ่ื ฆา เชอ้ื

3.1.1 แยกสวนของกรวยทั้งสองสวนหอดวยแผนอลูมิเนียมหรือกระดาษ
สวนแผนลวดสําหรบั รองเมมเบรนนน้ั ใสใ นจานเพาะเชอ้ื

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 52

3.1.2 อุดปากฟลาสคและทอ ขา งฟลาสคด ว ยสาํ ลี ปด ทบั ดว ยกระดาษ หรอื
แผน อลมู เิ นยี ม

3.1.3 วางแผน เมมเบรนซอนกนั ในจานเพาะเชอ้ื ใหด า นมนั ขน้ึ ขา งบน
ระหวา งแผน เมมเบรนแตละแผน จะมกี ระดาษบางๆ คั่น

3.1.4 วางแผน เซลลโู ลส สําหรับดูดซบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื ซอ นกนั ในจาน
เพาะเชอ้ื

3.2 การฆา เชอ้ื เครอ่ื งมอื

3.2.1 สําหรับแผนเมมเบรนฆาเช้ือโดยนึ่งดวยหมออัดความดันไอใช
ความดันไอ 15 ปอนดต อ ตารางนว้ิ (121 องศาเซลเซยี ส) เปนเวลา 15 นาที ไม
ควรใชอุณหภูมิหรือเวลามากกวานี้ และเมื่อเปดหมอนึ่งตองรอใหความดันลดลงเอง
โดยไมไลไอนํ้าชว ย(Slow exhaust) การไลไอนาํ้ เพื่อเรงใหความดันลดลงเร็ว ๆ จะ
ทําใหแผนเมมเบรนเสียคุณสมบัติได แผน เมมเบรนนอ้ี าจซอ้ื ชนดิ ทฆ่ี า เชอ้ื มาจาก
โรงงานแลวได

3.2.2 สาํ หรับสวนอื่นๆของเครื่องมืออาจฆาเชื้อดวยตูอบ หรือนึ่งใน
หมอนึ่งความดันไอตามปกติ

3.3 การประกอบเครอ่ื งมอื

3.3.1 แกะกระดาษทห่ี อ กรวยสว นลา ง
3.3.2 เปด จกุ สําลีที่ปากฟลาสค อุดดวยจกุ ยางซึ่งมกี รวยสวนลางติดอยู
3.3.3 ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ คีบแผนลวดวางบนขอบกรวย
สว นลา ง
3.3.4 ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ คบี แผน เมมเบรนวางซอ นบนแผน
ลวดใหด า นมนั อยขู า งบน
3.3.5 ครอบกรวยสวนบนลง ใหขอบเสมอกับสวนลาง แผนกรองจะอยู
ระหวางกลางกรวยทั้งสองสวน ใชคลิปหนีบกรวยทั้งสองสวนเขาดวยกัน
3.3.6 สวมทอ ยางจากปม ดดู กับทอขางฟลาสค

3.4 การเตรยี มอาหารเพาะเชอ้ื

3.4.1 ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ แลว คบี แผน เซลลโู ลสวางในจาน
เพาะเชื้อดูดอาหารเลี้ยงเชื้อหยดลงบนแผนเซลลูโลส ประมาณ 2 ถึง 2.5 มิลลิลิตร

3.4.2 ในกรณที ใ่ี ชอ าหารวนุ เทอาหารใสจ านเพาะเชอ้ื ใหห นาประมาณ
5 มลิ ลิเมตร ทิ้งใหวุนแข็ง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 53

3.5 การกรองและการเพาะเชอ้ื

3.5.1 เทตวั อยา งอาหารลงในกรวย เปดเครื่องปม เมื่อของเหลวในกรวย
ลดระดบั ลงจนมรี ะดบั เหนอื แผน เมมเบรนประมาณ 5 มิลลิเมตร ลางขา งกรวยดว ย
Phosphate buffer ประมาณ 20-30 มลิ ลิลิตร ลดระดับแรงดูดของปมลงเล็กนอย
เมื่อของเหลวผานแผนกรองหมดแลวจึงปดปม

3.5.2 แกะคลิปออกจากกรวย ยกกรวยสวนบนออก
3.5.3 ใชปากคีบจุมแอลกอฮอลลนไฟ แลว คบี แผน เมมเบรนวางบนแผน
เซลลูโลสซ่ึงชมุ ดว ยอาหารเลย้ี งเชอ้ื หรอื บนอาหารวนุ (ขอ 3.4.1,3.4.2) ใหด า นมนั อยู
ขา งบน
3.5.4 บม เชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู แิ ละระยะเวลาเหมาะสมสําหรบั จลุ นิ ทรยี ท ท่ี ําการ
ตรวจนับ

3.6 การตรวจนบั และรายงานผล

3.6.1 ตรวจนับจํานวนโคโลนบี นแผน เมมเบรน
3.6.2 ในกรณีที่สังเกตโคโลนีไดไมชัด อาจใชวิธียอ มสีโดยราดแผน
เมมเบรน ดว ยน้ํายา Malachite green oxalate รอ ยละ 0.01 ทง้ิ ไวป ระมาณ 10
วินาที เทสีออก แผนเมมเบรนจะติดสีเขียวออน ในขณะทโ่ี คโลนขี องจลุ นิ ทรียไ มต ดิ
สี จงึ ทําใหส ังเกตเหน็ โคโลนงี ายข้ึน
3.6.3 รายงานผลการตรวจนบั เปน จํานวนตอปริมาตรตัวอยา งอาหาร
ทง้ั หมด
3.6.4 การตรวจนับดว ยวิธนี ้ีจะมีความถูกตอ งมากท่ีสดุ เมอ่ื มโี คโลนบี น
แผนเมมเบรนไมเกิน 200 โคโลนีตอแผน ในกรณที ม่ี โี คโลนีเกิดขน้ึ มากกวา นค้ี วรทาํ
การทดลองซํ้า โดยลดปรมิ าณตวั อยา งอาหารลง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 54

ตัวอยา งปฏบิ ตั กิ าร:
การตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียโดยกรองผา นแผน เมมเบรน

ตัวอยา งอาหาร

• น้ําบรรจขุ วด
• น้ําประปา
• น้ําแขง็ หลอมละลาย

อุปกรณ

• เครื่องมอื สําหรบั กรองแบคทเี รยี ครบชดุ
• แผนเมมเบรนนึ่งฆาเชื้อแลว
• แผนเซลลูโลสนึ่งฆาเชื้อแลว
• จานเพาะเชื้อ
• PCA ขวดละ 60 มิลลิลิตร
• M.Endo broth
• ปากคบี
• แอลกอฮอล
• กระบอกตวงขนาด 100 มิลลิลิตรนึ่งฆาเชื้อแลว
• ปเปตขนาด 10 มิลลิลิตร

การทดลองและรายงานผล

1.! เท PCA ลงในจานเพาะเชอ้ื ใหห นาประมาณ 5 มิลลิลิตร
2.! วางแผน เซลลโู ลสในจานเพาะเชอ้ื 2 จาน ใชปเปตดูด M.Endo broth 2

มลิ ลิลิตร
3.! ประกอบเครื่องกรองแตละสวนเขาดวยกัน
4.! สวมทอ ยางจากปมดดู เขา กบั ทอ ทข่ี า งฟลาสค
5.! กรองนํ้าดม่ื ทจ่ี ะตรวจวเิ คราะหค รง้ั ละ 100 มิลลิลิตร สองครั้ง
6.! ตรวจนบั จลุ นิ ทรียท ง้ั หมด

6.1 วางแผน กรองจากน้ําทง้ั สามตวั อยา งบน PCA ในจานเพาะเชอ้ื

6.2 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 - 35 องศาเซลเซียส 1 - 2 วัน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 55

7. ตรวจนับ Escherichia coli
7.1 วางแผน กรองจากน้ําทง้ั สามตัวอยางบนแผน เซลลโู ลสซ่งึ ชุมดว ย
M.Endo broth ระวังไมใหเกิดชอง อากาศระหวางแผนกรองและ
แผนเซลลูโลส
7.2 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 44 + 1 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง
7.3 นบั จํานวนโคโลนขี อง E. coli ซง่ึ โคโลนจี ะมเี งาโลหะ

8. รายงานผลการตรวจนบั เปน จํานวนจลุ ินทรียตอ น้าํ 100 มิลลิลิตร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 56

หลกั การและวิธีตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรีย
โดยหาคา MPN (Most Probable Number)

1. หลกั การ

การตรวจวเิ คราะหป รมิ าณจลุ ินทรียโดยหาคา Most Probable Number
(MPN) น้ีเปนการคาดคะเนจํานวนมากทส่ี ดุ ของจลุ นิ ทรยี  ซ่ึงอาจจะมไี ดใ นตวั อยา ง
อาหารโดยใชห ลกั การทางสถติ ิ

2. การตรวจวเิ คราะห

2.1 ทําใหตัวอยา งอาหารเจอื จางลงระดับละ 10 เทา เลอื กระดบั ความเจอื จาง
ที่จะใชใหเหมาะสมกับอาหารแตละชนิด โดยใชปริมาณจลุ ินทรียซ่ึงนา จะมใี นอาหาร
ประเภทน้ันๆ เปน หลกั ใชค วามเจอื จาง 3 ระดบั ดว ยกนั ใสต วั อยา งอาหารซง่ึ เจอื จาง
ระดับตางๆ ตามปรมิ าณการทเ่ี หมาะสม เชน 1 มลิ ลิลิตร ลงในอาหารเหลวสําหรบั
เพาะเชื้อ ระดบั ความเจอื จางละ 3 หรอื 5 หลอด แลวแตจะเลือกใช ในกรณที ่ี
ตัวอยา งอาหารมจี ลุ นิ ทรียท่ีจะตรวจวเิ คราะหป รมิ าณนอ ย อาจเพม่ิ ปรมิ าณขน้ึ เปน
10 มิลลิลิตร โดยใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื ทม่ี คี วามเขม ขน เปน 2 เทาของปกติ

2.2 บมหลอดทง้ั หมดทอ่ี ณุ หภมู แิ ละเวลาทเ่ี หมาะสมกบั จลุ นิ ทรียท่ีจะทาํ การ
ตรวจวิเคราะห ตรวจผลโดยสงั เกตการเจรญิ เตบิ โตหรอื ปฏกิ ริ ยิ าทจ่ี ลุ นิ ทรียน น้ั ๆ
กอใหเกิดขน้ึ ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื เชน การเกดิ กรดหรอื เกดิ กา ซ เปน ตน บนั ทกึ จํานวน
หลอดของแตล ะระดบั ความเจอื จางทใ่ี หผ ลบวก

2.3 นําผลทไ่ี ดจ ากขอ 2.2 ไปเทยี บหาคา MPN ของจลุ นิ ทรียจากตารางท่ี 2
ในกรณีท่ีทดสอบระดบั ความเจอื จางละ 3 หลอด หรอื หาคา จากตารางท่ี 3 เมอ่ื
ทดสอบระดบั ความเจอื จางละ 5 หลอด ตัวอยา งเชน ในการวเิ คราะหอ าหาร โดยใช
ระดับความเจอื จาง 1:10, 1:100 และ 1:1,000 ระดบั ละ 3 หลอด พบวา ไดจ ํานวน
หลอดที่ใหผลบวก 2, 2 และ 1 ตามลําดบั จากตารางท่ี 2 MPN ของจลุ นิ ทรยี ต อ
มิลลิลิตรของหลอดทเ่ี จอื จางระดบั ท่ี 1 ซึ่งสาํ หรบั การทดลองนไ้ี ดแ กร ะดบั ความ
เจือจาง 1:10 มคี า เปน 3.0 ดงั นน้ั MPN ของจลุ นิ ทรียในตัวอยา งอาหารทท่ี ําการ
ตรวจวเิ คราะหจ ะมคี า 30

2.4 สําหรับการตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียบางชนดิ การเกิดผลบวกในอาหาร

เล้ียงเชอ้ื ทท่ี ดสอบในครง้ั แรกน้ี ไมสามารถจะบอกไดแ นน อนวา มจี ลุ ินทรียช นดิ นน้ั
อยจู รงิ หรอื ไม จึงจําเปน ตองมีการทดสอบเพื่อยืนยันผลในอาหารเลี้ยงเชื้อหรือโดย
ใชปฏิกิริยาอน่ื ๆ ทส่ี ามารถจะใหผ ลแนน อนวา เปน จลุ นิ ทรียชนดิ นน้ั ๆ แลวบันทึก

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 57

จํานวนหลอดทใ่ี หผ ลการยนื ยนั เปน ทแ่ี นน อนแลว เพอ่ื ใชใ นการอา นคา MPN จาก
ตาราง เชน ในการหาคา MPN ของเชื้อ Escherichia coli โดยใช Lactose broth
เปน อาหารทดสอบขน้ั ตน พบวาเมอ่ื ใชร ะดบั ความเจอื จาง 1:10, 1:100 และ
1:1,000 ระดบั ละ 5 หลอด จะไดจ ํานวนหลอดที่ใหผลบวก 5, 4 และ 2 ตามลําดบั
แตเ นอ่ื งจากไมเ ฉพาะ E. coli เทาน้ันทจ่ี ะเจรญิ และใหก า ซใน Lactose broth จงึ
จําเปนตองทดสอบเพื่อยืนยันวาเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวกหลอดใดบางเปน E. coli
โดยเขย่ี เชื้อลงบน EMB agar แลวสังเกตโคโลนีที่มีเงาโลหะซึ่งเปนลักษณะเฉพาะ
ของ E.coii ซ่ึงถา ในการทดสอบนพ้ี บวา เพยี ง 3 ใน 5 หลอดจากระดบั ความเจอื จาง
1:10, 2 ใน 4 หลอดจากระดบั 1:100 และ 1 ใน 2 จากระดบั 1:1,000 ทใ่ี หโ คโลนี
ลักษณะดังกลาว การทดสอบทใ่ี หผ ลบวกทจ่ี ะนําไปหาคา MPN จากตาราง คือ
3, 2, 1 ไมใ ช 5, 4, 2 เปน ตน

2.5 การหาคา MPN โดยคํานวณจากสตู ร ซง่ึ นยิ มใชใ นกรณที ค่ี วามเจอื จาง
ของอาหารไมใ ชร ะดบั ละ 10 เทา

MPN ตอมิลลิลิตร = จํานวนหลอดที่ใชใหผลบวก

[ปริมาณของตัวอยางที่ใหผลลบ x ปรมิ าตรทง้ั หมด]1/2

ตวั อยา ง ในการหาคา MPN ของจลุ นิ ทรียในตัวอยา งอาหารซง่ึ ใชป รมิ าณอาหาร

4 ระดบั คือ 10, 5, 1 และ 0.5 มิลลิลิตร ระดบั ละ 5 หลอด โดยการทดสอบนใ้ี ช
ระดับเจือจางเทากับ 1:100 มาทดสอบ เมื่อตรวจผลแลวไดหลอดซึ่งเกิดผลบวกดังนี้
5, 0, 2 และ 1

การคํานวณ จํานวนหลอดที่ใหผลบวก = 5 + 0 + 2 + 1 = 8

ปรมิ าตรทีใ่ หผ ลลบ = 0 + 25 + 3 + 2 = 30.0 มลิ ลิลิตร

ปรมิ าตรทง้ั หมด = 50 + 25 + 5 + 2.5 = 82.5 มลิ ลิลิตร

MPN ตอ มลิ ลิลิตร =8 = 0.16x100 = 16
[(30.0)(82.5)]1/2

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 58

ตารางท่ี 2 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 3 หลอด

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอ มลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดบั ความเจอื จาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 0.0 -
0 0 0 0.3 3
0 0 1 0.3 2
0 1 0 0.6 4
0 1 1 0.6 4
0 2 0

100 0.4 1
101 0.7 3
102 0.1 4
110 0.7 2
111 1.1 4

120 1.1 3
121 1.5 4
130 1.6 4
200 0.9 1
201 1.4 3

202 2.0 4

210 1.5 2

211 2.0 4

212 3.0 4

220 2.0 3

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั ิเปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 59

ตารางท่ี 2 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 3 หลอด (ตอ )

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอ มลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดับความเจอื จาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 3.0 4
2 2 1 3.5 4
2 2 2 4.0 4
2 2 3 3.0 4
2 3 0 3.5 4
2 3 1

332 4.0 4
300 2.5 1
301 4.0 2
302 6.5 4
310 4.5 1

311 7.5 2

312 11.5 3

313 16.0 4

320 9.5 1

321 15.0 2

322 20.0 3

323 30.0 4

330 25.0 1

331 45.0 1

332 110.0 1

333 140.0+ -

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั ิเปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 60

ตารางที่ 3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 5 หลอด

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอมลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดับความเจอื จาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 0.0 -
0 0 0 0.2 3
0 0 1 0.4 4
0 0 2 0.2 3
0 1 0 0.4 4
0 1 1 0.6 4
0 1 2 0.4 3
0 2 0 0.6 4
0 2 1 0.6 4
0 3 0 0.2 1
1 0 0

101 0.4 3
102 0.6 4
110 0.4 2
111 0.6 4
112 0.8 4

120 0.6 3

121 0.8 4

130 0.8 4

131 1.0 4

200 0.5 1

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั ิเปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 61

ตารางที่ 3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 5 หลอด (ตอ )

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอ มลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดบั ความเจือจาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 0.7 3
2 0 1 0.9 4
2 0 2 1.2 4
2 0 3 0.7 2
2 1 0 0.9 3
2 1 1

212 1.2 4
220 0.9 3
221 1.2 4
222 1.4 4
230 1.2 4

231 1.4 4

300 0.8 1

301 1.1 3

302 1.3 4

310 1.1 2

311 1.4 3

312 1.7 4

313 2.0 4

320 1.4 3

321 1.7 4

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั เิ ปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 62

ตารางที่ 3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 5 หลอด (ตอ )

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอมลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดับความเจอื จาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 2.0 4
3 2 2 1.7 3
3 3 0 2.1 4
3 3 1 2.1 4
3 4 0 2.4 4
3 4 1

400 1.3 1
401 1.7 3
402 2.1 4
403 2.5 4
410 1.7 2

411 2.1 3
412 2.6 4
420 2.2 2
421 2.6 3
422 3.2 4

430 2.7 3

431 3.3 3

432 3.9 4

440 3.4 3

441 4.0 4

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั ิเปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 63

ตารางที่ 3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 5 หลอด (ตอ )

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอมลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดับความเจือจาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 4.7 4
4 4 2 4.1 4
4 5 0 4.8 4
4 5 1 5.6 4
4 5 2 2.3 1
5 0 0

501 3.1 3
502 4.3 3
503 5.8 4
510 3.3 1
511 4.6 2

512 6.4 4

513 8.4 4

514 11.5 4

520 4.9 1

521 7.0 2

522 9.5 3

523 12.0 4

524 15.0 4

530 7.9 1

531 11.0 2

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั เิ ปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 64

ตารางที่ 3 คา MPN ทร่ี ะดบั ความเชอ่ื มน่ั รอ ยละ 95 เมอ่ื ใชร ะดบั ความ

เจอื จางละ 5 หลอด (ตอ )

จํานวนหลอดที่ใหผลบวก MPN ตอ มลิ ลลิ ติ รของหลอดท่ี ระดบั

ระดบั ความเจอื จาง เจือจางระดับที่ 1 ความถูกตอง*

ระดบั ท่ี 1 ระดบั ท่ี 2 ระดบั ท่ี 3 14.0 3
5 3 2 17.5 3
5 3 3 20.0 4
5 3 4 25.0 4
5 3 5 13.0 1
5 4 0

541 17.0 2
542 22.0 2
543 28.0 3
544 35.0 3
545 42.5 4

550 24.0 1

551 35.0 1

552 54.0 1

553 92.0 1

554 160.0 1

555 180.0+ -

* ระดับความถูกตอง ในการปฏบิ ตั ิเปน ประจําเมื่อระดับความถูกตองในการทดลอง

แตละคร้ังเปลย่ี นแปลงอยเู ฉพาะในระดบั 3 และ 4 ชบ้ี ง ถงึ ความเปน ไปไดท จ่ี ะเกดิ

ขอผิดพลาดของการทดลอง เชน ผสมตวั อยา งอาหารไมด พี อ หรอื มสี ารยบั ยง้ั การ

เจริญในตัวอยางอาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 65

การวเิ คราะหคุณภาพอาหารโดยการรีดิวสสี
(Dye reduction)

1.! หลักการ

วธิ กี ารนเ้ี ปน การวเิ คราะหค ณุ ภาพอาหารโดยใชห ลกั การทว่ี า จุลนิ ทรยี ท ่ี
ปนเปอนอยูในอาหารมีท้ังพวกท่ีตองการและไมตองการออกซิเจนในการเจรญิ เตบิ โต
พวกที่ตองการออกซิเจนจะใชออกซิเจนท่ีละลายในอาหารและท่ีอยูในภาชนะเหนือ
ผิวหนาอาหาร การลดลงของออกซเิ จนจะเปนปฏภิ าคโดยตรงกับจํานวนจลุ นิ ทรยี 
ซ่ึงเมื่อตัวอยางอาหารมีจุลินทรียอยูในปริมาณมากก็จะทําใหศักยภาพการรีดิวส
(Redox potatial) ซึ่งนิยมใชสัญญลักษณ Eh ของอาหารมคี าไปในทางลบมากขน้ึ
ดังนั้น เม่ือบม อาหารโดยเตมิ สารดชั นกี ารรดี วิ ส (Redox indicator) ซง่ึ เปน สารทม่ี ี
คุณสมบัติในการเปลี่ยนสีไดตามระดับ Eh การเปลย่ี นสขี องสารนน้ั ยอ มเปน ดชั นี
เปรียบเทียบใหเ หน็ ไดว า ตวั อยา งอาหารมปี รมิ าณจลุ นิ ทรยี อ ยมู ากนอ ยเพยี งไร ซง่ึ
ยอมเปนการแสดงถงึ ความสดและคณุ ภาพดา นสขุ ลกั ษณะของอาหารนน้ั

การวิเคราะหโดยใชหลักการนี้จะเหมาะสมเมื่อตัวอยางอาหารเปนของเหลว
ซึ่งสีสามารถกระจายไปไดทั่วถึง และควรเปน อาหารทม่ี อี งคป ระกอบคอ นขา งแนน อน
เพ่ือปองกนั การเปลย่ี นสขี องสารดชั นอี นั เนอ่ื งจากความแตกตา งของระดบั Eh ของ
องคประกอบของอาหาร

การปฏบิ ตั อิ าจทําไดโ ดยบม อาหารซง่ึ เตมิ สารดชั นี เปนระยะเวลาตามท่ี
กําหนดไว แลว สงั เกตการเปลี่ยนสีวา เปน ไปมากนอยเพียงใด หรอื บม อาหารซง่ึ เตมิ
สารดัชนีจนมกี ารเปลย่ี นสเี กดิ ขน้ึ ถงึ ระดบั หนง่ึ แลวเทยี บระยะเวลาทใ่ี ชใ นการบม
ซ่ึงท้ังสองวิธีการนี้จะสามารถทําใหเปรียบเทียบคุณภาพของอาหารที่วิเคราะหไดวา
คุณภาพอยูในระดับใดอยางคราวๆ การทจ่ี ะนําวธิ กี ารนม้ี าใชว เิ คราะหอ าหารประเภท
ใดก็ตามจะตองไดมีการทดลองหาความสัมพันธระหวางการเปล่ียนสีที่เกิดข้ึนกับ
ปริมาณจุลินทรียในอาหารซ่ึงไดจากการตรวจนับดวยวิธีอื่นๆท่ีแนนอนเสียกอนวา
มีสหพนั ธก นั อยา งไร

โดยปกตสิ ารดชั นกี ารรดี วิ สจ ะเรม่ิ เปลย่ี นสเี มอ่ื Eh = Eo + 0.05V และ
จะไมเปลี่ยนตอไปอีกเมื่อ Eh = Eo - 0.05V ซง่ึ ในอาหารบางชนดิ ถงึ แมว า จลุ นิ ทรยี 
จะทําใหคา Eh ลดลงจนถึงระดับตํ่าสุดแลว คา นน้ั กย็ งั สงู กวา Eo ของสารดชั นี
บางชนิดจึงทําใหไ มส ามารถสงั เกตการเปลย่ี นสไี ด ดังน้ันจึงควรเลือกสารดัชนีให

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 66

เหมาะสมกับระดับ Eh ของอาหาร ซ่ึงจุลินทรยี ใ นอาหารประเภทนน้ั อาจกอ ใหเ กดิ
การเปลี่ยนแปลงได สารดชั นกี ารรดี วิ สช นดิ ตา ง ๆ มคี า Eo ตางกัน ดงั น้ี

สารดชั นี Eo (V)

Phenol blue +0.224
Phenolinde-2, 6-dichlorophenol +0.217
Lauth"s violet +0.063
Methylene blue +0.011
Janus green -0.225
Phenosafranine -0.252
Neutral red -0.325

วธิ นี ใ้ี ชไ ดผ ลและเปน ทย่ี อมรบั วา เปน มาตรฐาน (Standard method) ในการ
ตรวจวิเคราะหคุณภาพของนํ้านมและผลติ ภณั ฑน ม ท้งั ในดา นเก่ียวกบั ความสดและ
การตรวจวิเคราะหปรมิ าณสารปฏชิ วี นะในน้ํานม ในการวเิ คราะหผ ลติ ภณั ฑน มน้ี
สารดชั นที น่ี ยิ มใชไ ดแ ก Methylene blue และ Resazurin ซ่ึงเรยี กวธิ กี ารวเิ คราะห
วา Methylene blue reduction method และ Resazurin reduction method

2. การวเิ คราะหโ ดย Methylene blue reduction method

เปนวิธีควบคุมและตรวจสอบคุณภาพนมอีกวิธีหนึ่งซึ่งเปนวิธีการงายๆ ไม
ละเอียดนักในการตรวจสอบทางแบคทีเรยี สําหรบั นมดบิ สามารถตรวจสอบนมที่มี
คุณภาพตํ่าไดอยางรวดเร็วและไดผลดีพอสมควร

ในประเทศองั กฤษใชก รรมวธิ ี Methylene blue reduction test แทนการทํา
Standard plate count สําหรับตรวจสอบคณุ ภาพนมดบิ

การตรวจสอบโดยวิธีนี้ขึ้นกับจาํ นวนแบคทเี รยี ทอ่ี ยใู นนม การวดั ผลขึ้นอยู
กับ Metabolic activity ของแบคทเี รีย เมอ่ื แบคทเี รยี เจรญิ เตบิ โตจะมกี ารใช
ออกซิเจนที่มีอยูในน้ํานม การเปลย่ี นสที เ่ี กดิ ขน้ึ จงึ ขน้ึ อยกู บั จํานวนแบคทเี รยี อัตรา
การเจริญเติบโต และอตั ราการใชอ อกซเิ จน โดยปกติ Methylene blue จะมีสีน้ําเงนิ
ซ่ึงอยใู นรปู ของ Oxidized form เมอ่ื อยใู นรปู Reduced form จะไมม สี ี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 67

2.1 ผลิตภัณฑท น่ี ยิ มใชไ ดแ ก น้าํ นมดบิ
2.2 เตรยี มสารละลาย Methylene blue โดยตม น้ํากลน่ั ปรมิ าตรมากกวา
200 มิลลิลิตรเล็กนอยใหเดือดในขวดสีชา ซง่ึ เมอ่ื น้ําเดือดแลวควรมีนํ้าเหลืออยู
ประมาณ 200+2 มิลลิลิตร ใชปากคีบท่ีสะอาดและแหง คบี เมด็ สซี ง่ึ มี Methylene
blue thiocyanate 8.8 มลิ ลกิ รมั ตอ เมด็ ลงในน้ํารอ นนน้ั ปลอ ยใหส สี ะลายจนหมด
แลวจึงเก็บในตูเยน็ สารละลายทเ่ี ตรยี มนจ้ี ะมคี วามเขม ขน ของสปี ระมาณ 1:250,000
เทาในน้ํา
ในการเตรียมสารละลายนี้ไมควรใชน้ําอื่นใด เชน น้ําท่ีผา นการแยกแรธ าตุ
ออก (Demineralization) แทนน้ํากล่ันและไมค วรเตมิ น้าํ ซง่ึ ไมไ ดต ม ลงในน้ําทจ่ี ะใช
ละลายสี ควรแนใ จวาสลี ะลายหมดแลวจงึ ทําใหเ ยน็
2.3 ใชป เ ปตดดู สารละลาย Methylene blue ปรมิ าตร 1 มิลลิลิตร ใสใน
หลอดแกว แลวเติมนํ้านมทท่ี ดสอบปรมิ าตร 10 มิลลิลิตรลงไปทันที ปดหลอดดวย
จุกยางซง่ึ สะอาด
2.4 นําหลอดลงแชใ นอา งน้าํ อนุ ซง่ึ ควบคมุ อณุ หภมู ิ 36 องศาเซลเซยี ส เพื่อ
เปนที่สังเกตวาอุณหภูมิในหลอดขึ้นถึงระดับที่ตองการเมื่อใด แชห ลอดบรรจนุ ม 10
มิลลิลติ ร ซ่งึ มีเทอรโมมิเตอรเ สยี บไวห นง่ึ หลอดลงไปพรอ มๆ กับหลอดตัวอยาง
เมื่ออุณหภูมิในหลอดนี้ขึ้นถึง 36 องศาเซลเซียส กลับหลอดตัวอยางขึ้นลง 3 ครง้ั
แลวเรม่ิ จบั เวลา ไมควรใชวิธีเขยาหลอดแทนการกลับหลอด
ในกรณวี เิ คราะหน มครง้ั ละหลายๆ ตัวอยา ง เมอ่ื ผสมนมกบั สารละลายสแี ลว
ใหแชไวในตูเย็นอุณหภูมิไมเกิน 4 องศาเซลเซยี ส เมอ่ื ผสมนมพรอ มกบั สารละลายสี
พรอมกันทุกตัวอยางแลว จงึ นํามาแชใ นอางน้ําอนุ พรอ มกนั และตอ งแนใ จวา ระดบั น้ํา
ในอางนํ้าอุนนน้ั มากพอทจ่ี ะทําใหอุณหภูมิในหลอดตัวอยางนมสูงขึ้นถึง 36 องศา
เซลเซยี ส ภายใน 10 นาที
2.5 การอา นและบนั ทกึ ผล

2.5.1 อา นผลครง้ั แรกหลงั จากอณุ หภมู ขิ น้ึ ถงึ 36 องศาเซลเซียส แลว
30 นาที ตัวอยางนมตวั อยา งใดทเ่ี ปลย่ี นจากสนี ้าํ เงนิ เปน ไมม สี ไี ปอยา งนอ ยสส่ี ว นใน
หาสวนของหลอด บันทึกผลวามีระยะเวลาการรดี ิวส (Reduction time) 30 นาที

2.5.2 สาํ หรบั ตวั อยา งนมทไ่ี มเ ปลย่ี นสี 30 นาที ใหบมตอ โดยตรวจ
การเปลย่ี นสที กุ ๆ ครง่ึ ชว่ั โมง บันทึกระยะเวลาท่ีเรม่ิ เปลี่ยนสีและเมอ่ื สขี องตัวอยา ง
เปลี่ยนไปสี่สวนในหาสวนของหลอด คาเฉลี่ยของระยะเวลาทั้งสองคือ ระยะเวลาท่ี
ใชในการรีดิวสของตัวอยางนมนั้น เชน เมอื่ เริม่ เปล่ยี นสีท่เี วลา 1 ชว่ั โมง และเปลี่ยน
ไปสี่สวนในหาสวนของหลอดเมื่อเวลา 2 ชว่ั โมง บนั ทกึ ผลระยะเวลาทใ่ี ชร ดี วิ สเ ปน
1.5 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 68

ปจจัยที่มีผลตอวิธีนี้ไดแก (1) แสงแดดและแสงสวางมีผลทําใหก าร
เปลี่ยนแปลงสั้นลง (2) Leucocyte ที่ปะปนลงมาในนํ้านมทําใหเวลาสั้นลง รวมทง้ั
(3) น้ํานมทใ่ี สใ นภาชนะทใ่ี ชส ารพวก Chemical agent ตางๆ ถา ลา งไมห มดจะทําให
เวลาของการเปลย่ี นสยี าวขน้ึ และ (4) ถา เขยา หลอดแรงๆเวลาการเปลย่ี นสจี ะยาว
ขน้ึ

ขอดีของวิธีนี้ไดแก (1) เปน วธิ ที ง่ี า ยในการตรวจสอบหาคณุ ภาพนมท่ี
เกี่ยวกับความสะอาด (2) ใชเครื่องมือและอุปกรณนอย (3) นมทม่ี คี ณุ ภาพต่าํ จะให
ผลเร็ว (4) ในการปฏบิ ตั งิ านทําไดง า ย ไมใ ชเ ทคนคิ มากนกั และ (5) สามารถ
ตรวจสอบไดครงั้ ละมากๆ

สวนขอเสียของวิธีนี้ไดแก (1) ความแตกตางในอัตราการเจริญเติบโตของ
แบคทีเรีย (2) ความแตกตางในอตั ราการใชออกซเิ จนของแบคทีเรีย (3) การขาด
ความสมํ่าเสมอในการกระจายของแบคทเี รยี ซง่ึ เนอ่ื งจากการกวนไมท ว่ั ถงึ (4) ความ
แตกตางในปริมาณของออกซเิ จนทก่ี ระจายอยใู นน้ํานม อนั เนอ่ื งมาจากอุณหภมู แิ ละ
การคนนมกอ นการตรวจ (5) Reducing factors อ่ืนๆท่ีมอี ยใู นน้ํานม และ (6) ในวัวที่
กิน Antibiotics เพอ่ื รกั ษาโรคตางๆ ฤทธิ์ของ Antibiotics จะไปทําใหก จิ กรรม
แบคทเี รยี นอ ยลง

ในการทาํ Methylene blue reduction test สามารถแบง เกรดนมได 3 เกรด
ดังตาราง

ตาราง 4 เกรดนํ้านมทม่ี กี ารตรวจสอบแบบ Methylene blue reduction test

เกรดนํ้านม เวลาในการรดี วิ ส จํานวนแบคทีเรียตอ

(ชั่วโมง) มิลลลิ ติ ร

A 4.5 20,000

B 2.5-4.5 200,000-2,000,000

C 2.5 >2,000,000

นอกจากนี้ American Public Health Association แบงเกรดของนํ้านมดงั น้ี

เกรด 1 Excellent (ดมี าก) 8 ชว่ั โมง

เกรด 2 Good (ด)ี 6-8 ชว่ั โมง

เกรด 3 Fair (พอใช) 2-6 ชว่ั โมง

เกรด 4 Poor (เลว) 2 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 69

3.การวิเคราะหนา้ํ นมโดย Resazurin reduction method

เปนการตรวจสอบที่มีวิธีคลายกับวิธี Methylene blue reduction test แต
สามารถอานผลไดรวดเร็วกวา การรดี วิ สข อง Resazurin น้ีใชว ัดกจิ กรรมจลุ ินทรยี  มี
อยู 2 ขน้ั ตอนดงั น้ี

ขน้ั ตอนท่ี 1 Irreversible transformation to resazurin ซ่ึงสีจะอยรู ะหวา ง
น้ําเงินและชมพู

ขน้ั ตอนท่ี 2 Reversible from resazurin เปน Dihydroresazurin ซง่ึ ไมม สี ี
3.1 ผลิตภัณฑท น่ี ยิ มตรวจวเิ คราะหด ว ยวธิ นี ไ้ี ดแ ก น้าํ นมดบิ
3.2 เตรยี มสารละลาย Resazurin โดยใชวิธีการเดียวกับการเตรียม
สารละลาย Methylene blue แตใชเม็ดสี Resazurin แทน Methylene blue
thyocyanate
3.3 ทดสอบเชน เดยี วกบั เมอ่ื ใชส ารละลาย Methylene blue แตไมควรทํา
การทดสอบในทน่ี แ้ี สงจา เน่ืองดว ยแสงจะมผี ลทําใหเ กดิ การเปล่ียนสอี ยา งรวดเรว็
เกนิ ความจรงิ
3.4 การอานและบนั ทกึ ผลทําไดสองขั้นตอน

3.4.1 อา นผลการเปลย่ี นสขี องน้ํานมเมอ่ื บม ได 1 ชว่ั โมงนมจะเปลย่ี น
จากมวงปนฟา ไปเปน สตี า งๆตามลําดบั คือ มว ง บาเวนเดอร (มว งอมชมพ)ู และ
สีชมพู อนั เกดิ จากการท่ี Resazurin เปลย่ี นไปเปน Resorufin ซง่ึ เปน ปฏกิ ริ ยิ าทไ่ี ม
ยอยกลับ และ Resorufin จะเปลย่ี นตอ ไปเปน Dihydroresorufin ซ่ึงจะทําใหส ชี มพู
ซีดลงเปนไมม สี ี ซง่ึ ปฏกิ ริ ยิ าสดุ ทา ยนส้ี ามารถยอ นกลบั ได เพื่อใหการสังเกตการ
เปล่ียนแปลงของสชี ดั เจนยง่ิ ขน้ึ ผูวิเคราะหอาจเทยี บกบั สมี าตรฐานซง่ึ มขี อ กาํ หนด
ของบริษัทผูผลิต เชน 5PB 7/4 (สีฟา), 1OPB 7/5.5 (มว งปนฟา ), 5P 7/4 (มว ง)
และ 10P 7/8 (มว งปนชมพ)ู การตดั สนิ คณุ ภาพของน้ํานม ตัดสินตามลักษณะการ
เปลี่ยนสี คือ นมจะดอ ยคุณภาพตามลําดบั เมอ่ื สเี ปลย่ี นจากฟา มว งอมฟา ไปทางชมพู

3.4.2 อานผลทกุ ชว งหนง่ึ ชั่วโมง จนครบ 3 ชว่ั โมง (Tripple test)
แลวบนั ทกึ เวลาทน่ี มเปลย่ี นไปเปน สมี ว ง (5P 7/4) ซึ่งนมที่คุณภาพดีจะใชเวลาใน
การเปลี่ยนสี นานกวา นมทด่ี อ ยคณุ ภาพ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 70

ความหมายของการตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ด ชั นี
(Index microorganisms)

วัตถุประสงคหลักขอหนึ่งของการตรวจวิเคราะหจุลินทรียในอาหารก็เพ่ือให
ทราบถงึ สขุ ลักษณะของอาหาร เพอ่ื ความปลอดภยั ของผบู ริโภคจากเชอ้ื โรคทางเดนิ
อาหาร ซ่ึงการตรวจวเิ คราะหเ ชอ้ื โรคโดยตรงนน้ั ทาํ ไดยากและสิ้นเปลือง ดงั นน้ั จงึ
นิยมตรวจหาจุลินทรียบางชนิดท่ีเมื่อมีอยูในอาหารแลวจะเปนดัชนีบงถึงความเปน
ไปไดท่ีอาหารอาจจะไดร บั การปนเปอ นจากเชอ้ื โรค จุลินทรียท จ่ี ะชว ยเปน ดชั นใี น
เรื่องนี้ไดดีควรมีคุณสมบัติเหลานี้คือเปนพวกที่มีแหลงอาศัยปกติ (Natural flora) อยู
ในระบบทางเดนิ อาหารของคนหรอื สตั ว ตรวจพบจลุ นิ ทรยี เ หลา นน้ั ไดป รมิ าณมาก
ในอุจจาระ เปนจุลินทรยี ท ท่ี นตอ สภาวะแวดลอ มภายนอกไดด ี และสามารถตรวจ
วิเคราะห และยนื ยนั ผลไดแ นน อนดว ยวธิ งี า ยๆ และไมส น้ิ เปลืองถึงแมจ ะมจี ลุ ินทรยี 
นั้นอยูในอาหารในปริมาณนอ ย ซง่ึ จลุ นิ ทรยี ท ม่ี คี ณุ สมบตั ดิ งั กลา วนน้ั มอี ยหู ลายกลมุ
ดวยกันและไดมีผูใชกําหนดเปนดัชนีบงถึงการปนเปอนท้ังโดยตรงและโดยทางออม
จากอจุ จาระ(Index of faecal contamination) เชน Coliform, Faecal coliform,
E.coli, Enterobacteriaceae ทง้ั แฟมมลิ ี และ Enterococci ซง่ึ การกําหนดจลุ ินทรยี 
กลุมใดกลมุ หนง่ึ หรอื ชนดิ ใดชนดิ หนง่ึ ทก่ี ลา วถงึ นเ้ี ปน ดชั นี จะมีความหมายและความ
เหมาะสมในการใชต า งกนั อยบู า ง

แบคทเี รยี Coliform

หมายถงึ กลมุ แบคทเี รยี ทม่ี รี ปู รา งเปน ทอ นสน้ั ติดลีแกรมลบ ไมส รา งสปอร
สามารถเฟอรเ มนตแ ลคโตสใหไดก รดและกา ซทอ่ี ณุ หภมู ิ 30-37 องศาเซลเซยี ส
ภายในเวลา 48 ชว่ั โมง แบคทีเรียที่มีคุณสมบัติดังกลาวสวนใหญไดแกแบคทีเรียใน
ยนี สั Escherichia ซ่ึงมีแหลงอาศัยปกติในทอทางเดินอาหารของคนและสัตว และ
แบคทเี รยี ในยนี สั Enterobacter ซ่ึงมีแหลง อาศยั ปกตใิ นดนิ และปนเปอ นมากบั พชื
ผักตางๆ นอกจากนน้ั ยงั รวมถงึ แบคทเี รยี บางสายพนั ธขุ องยนี สั Serratia,
Citrobacter และ Klebsialla ดังน้ันในปจจุบันจงึ ไมน ยิ มกาํ หนดแบคทเี รยี กลมุ น้ี
ท้ังกลุมเพ่ือเปน ดชั นแี สดงการปนเปอ นของจลุ นิ ทรยี ท เ่ี ปน เชอ้ื โรค แตการตรวจพบ
แบคทเี รยี Coliform ในอาหารทผ่ี า นการใหค วามรอ นระดบั พาสเจอรไ รส เชน นมและ
ผลิตภัณฑนม จะเปน ดชั นแี สดงถงึ การผดิ พลาดในกรรมวธิ กี ารผลติ เชน การให
ความรอนไมเ พยี งพอหรอื มกี ารปนเปอ นขณะบรรจุ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 71

Faecal coliform และ E. coli

ดงั ไดก ลา วแลว ถงึ ความไมเ หมาะสมในการใชแ บคทเี รยี Coliform ทั้งกลุม
เปนดัชนีแสดงการปนเปอ นของเชอ้ื โรคในระบบทางเดนิ อาหาร และเนื่องดวย E.coli
มีคุณสมบตั ติ า งจาก Enterobacter spp. ทจ่ี ะทดสอบไดอ ยา งงา ย ๆ คือ E. coli
สามารถเฟอรเ มนตน าํ้ ตาลแลคโตสไดกาซที่อุณหภูมิ 44-45.5 องศาเซลเซียส
ภายในเวลา 24-48 ชว่ั โมง และใหผ ลการทดสอบปฏกิ ริ ยิ า IMViC (Indol, Methyl
red, Voges-Proska, Citrate test) เปน + + - - แตข้ันตอนการตรวจวเิ คราะหเพอ่ื
ยืนยันผลวา เปน แบคทเี รยี นน้ั คือ E.coli ยุงยากและสิ้นเปลือง ดงั นน้ั การกําหนด
มาตรฐานอาหารบางชนิดในบางประเทศจึงนิยมกําหนดการทดสอบเฉพาะขน้ั ตน โดย
ดูปฏิกิริยาการเฟอรเ มนตนํ้าตาลแลคโตสใหไดกาซที่อุณหภูมิ 44-45.5 องศา
เซลเซยี สดงั กลา ว โดยเรยี กกลมุ แบคทเี รยี ทว่ี เิ คราะหว า Faecal coliform ซง่ึ การท่ี
จะใช Faecal coliform หรอื E.coli เปนดัชนีข้ึนกบั แตละประเทศและขอ กําหนดของ
แตละมาตรฐานอาหาร

Faecal streptococcus และ Enterococcus

การจดั หมวดหมขู อง Streptococcus นน้ั จะใชห ลกั การทาง Serology เปน
หลัก ประกอบกับการทดสอบคุณสมบัตทิ างเคมี Species ซง่ึ จดั เปน กลมุ เดยี วกนั
ตามหลัก Serology ไดแก Streptococcus faecalis, S. faecium, S. durans,
S. bovis และ S.equinus ซง่ึ เรยี กวา Landsfield Group D S.durans นน้ั ใน
ปจจุบันเปน ทย่ี อมรบั วา เปน สายพนั ธหุ นง่ึ ของ S.faecium ในการจําแนกชนดิ แตเ ดมิ
S.faecalis และ S.faecium ถูกจัดวาเปนพวก Enterococcus แตใ นปจ จบุ นั นก้ี าร
เรียงกลุมแบคทเี รยี เหลา นท้ี ป่ี รากฏในเอกสารตา งๆ จะคอ นขา งสับสน และนยิ มเรยี ก
แบคทเี รยี ทกุ Species ที่กลาวถึงวา Faecal streptococcus เนื่องดวยสวนใหญมี
แหลงอาศัยปกติในระบบทางเดินอาหารของคนและสัตว แตก ม็ ปี รากฏในหลายๆแหง
ท่ีเรียกแบคทเี รยี เหลา นท้ี ง้ั หมดวา Enterococcus ดงั นน้ั ตามความหมายของการใช
แบคทีเรียเหลานี้เปนดัชนีบงการปนเปอนของอุจจาระแลวเปนที่ยอมรับวาคําเรียก
กลุมตางๆ เหลานี้ไดแก Faecal streptococcus, Group D streptococcus หรอื
Enterococcus

Faecal streptococcus นับวาเปนแบคทีเรียทท่ี นตอสภาวะแวดลอม
ภายนอกไดดีกวา Coliform หรอื E.coli โดยเฉพาะอยา งยง่ิ จะทนตอ การแชแ ขง็
และการทําใหอ าหารแหง ไดด มี าก ดังน้ันจึงเปนท่ีนยิ มใชเ ปน ดชั นสี ําหรบั อาหาร
ประเภทน้ี สวนในอาหารบางชนดิ นน้ั ไมส ามารถจะใชแ บคทเี รยี เหลา นเ้ี ปน ดชั นแี สดง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 72

สุขลักษณะได เนอ่ื งดว ยมกั พบเปน ประจําอยูแลว เชน ในอาหารหมักดองตางๆ
และเนยแขง็ หลายชนดิ

ความเช่ือมน่ั ในการเปน ดชั นี

การใชจุลินทรียดังท่ีกลาวแลว นเ้ี ปน ดชั นเี รม่ิ ตน มาจากการตรวจวเิ คราะห
ในน้ําบริโภค และนํ้าใช ซง่ึ ปรากฏวา ไดผ ลดมี าก ทง้ั นเ้ี นอ่ื งดว ยจลุ นิ ทรียเ หลา นไ้ี ม
สามารถเพ่ิมจํานวนได ดงั นน้ั ผลการวเิ คราะหย อ มเปน ดชั นแี สดงการปนเปอ นได
แนนอน สว นการตรวจพบจลุ นิ ทรีย เหลานใ้ี นอาหารนน้ั เปน การยากทจ่ี ะกลา ววา
ปริมาณดังกลาวเกิดจากการปนเปอนโดยตรง หรอื มกี ารเพม่ิ จํานวนมากขน้ึ ในอาหาร
ซ่ึงในปจจุบันไดมีขอถกเถียงกันมากเก่ียวกับความสัมพันธระหวางการตรวจพบ
จุลนิ ทรียท่ีเปน เชอ้ื โรคกบั การตรวจพบจลุ นิ ทรียด ชั นี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 73

การตรวจวเิ คราะห Coliform, Faecal coliform และ E.coli

1.! การตรวจวิเคราะหดวยการหาคา MPN

1.1! การตรวจ Presumptive coliform

1.1.1 ทาํ ตวั อยา งอาหารซง่ึ ไมใ ชข องเหลวเจอื จางระดบั 10เทา 3 ระดบั
1.1.2 เลอื กใชอ าหารเพาะเชอ้ื อยา งใดอยา งหนง่ึ จากอาหารเหลา น้ีLauryl
sulphate tryptose broth (LSTB), MacConkey broth (MB) หรือ Brilliant
green lactose bile broth (BGLB)
1.1.3ใสตัวอยางอาหารแตล ะระดบั ความเจอื จางในหลอดอาหารเลย้ี งเชอ้ื
ระดบั ความเจอื จาง 1 มลิ ลิลิตร 3 หรอื 5 หลอด สําหรบั ตวั อยา งอาหารเหลวหรอื
ตัวอยางนํ้าใชต ัวอยา งปรมิ าณ 10, 1 และ 0.1 มิลลิลิตร ตามลําดบั โดยใชอ าหาร
เล้ียงเชอ้ื ซง่ึ มคี วามเขม ขน สองเทา (Double strength) สําหรับหลอดซึ่งใสตัวอยาง
10 มิลลิลิตร
1.1.4 บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35 - 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง
1.1.5! ตรวจผลโดยสังเกตหลอดที่ใหผลบวกดังนี้คือ เกิดกาซใน
หลอดดักกาซ (Durham tube) สาํ หรบั LSTB และ BGLB และเกดิ กา ซและกรดซง่ึ
จะเปลี่ยนสีอาหารเลี้ยงเชื้อเปนสีเหลืองใน MB

1.2! การตรวจเพื่อยืนยันวาเปน Coliform (Conferm coliform test)

1.2.1 จากหลอดที่ใหผลบวกใน LSTB และ MB
1.2.1.1 ถายเชื้อลงใน BGLB หลอดละ 2 - 3 ลูป
1.2.1.2 บม ท่ี 35-37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง
1.2.1.3 ตรวจผลโดยที่หลอดที่ใหผลบวกจะเกิดกาซ
1.2.1.4 นบั จํานวนหลอดที่ใหผลบวก นําไปหาคา MPN จาก

ตาราง คา MPN คาที่ไดคือ ปรมิ าณมากทส่ี ดุ ของ Coliform ซง่ึ อาจพบในตวั อยา ง
อาหารทต่ี รวจวเิ คราะห

1.3! การตรวจ Presumptive faecal coliform

1.3.1 ใชลูปถายเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวก (ในขอ 1.2.1.4) ลงใน
E.C. broth ซง่ึ แชใ น Water bath ทอ่ี ณุ หภมู ิ 44.5 องศาเซลเซียส กอนใสเชื้อ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 74

1.3.2 บมท่ี 44.5 + 0.2 องศาเซลเซียส หรอื 45.5 + 0.2 องศา
เซลเซยี ส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง

1.3.3 ตรวจผลโดยดกู ารเกดิ กา ซในหลอดดกั กา ซ
1.3.4 นับหลอดที่ใหผลบวกในขอ 1.3.3 นําผลไปหาคา MPN ของ
Faecal coliform จากตาราง MPN

1.4! การตรวจ E.coli

1.4.1 ใชลูปแตะเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวกในขอ 1.3.4 Streak บน Eosin
methylene blue agar บม ท่ี 35 - 37 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

1.4.2 เลือก Typical colony ของ E.coli ซง่ึ กลางโคโลนี มีสเี ขม คล้ํา อาจจะ
มีเงาโลหะหรอื ไมม กี ไ็ ด ในกรณที ไ่ี มป รากฏโคโลนที ม่ี ลี กั ษณะดงั กลา ว ใหเลือก
โคโลนี ที่มีลักษณะใกลเคียงที่สุด 2 โคโลนี ถายเชื้อลงบน Nutrient agar (NA)
slant จานละ 2 โคโลนี บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35 - 37 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

1.4.3 การทดสอบปฏกิ ริ ยิ า IMViC
1.4.3.1 ถายเชื้อลงใน Tryptophan broth บม ท่ี 35 – 37 องศา

เซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง ทดสอบการเกิดอินโดลโดยเติมนาํ้ ยาทดสอบ Kovac
0.2 ถึง 0.3 มิลลิลิตรลงในหลอด เมื่อเกิดสีชมพูหรือสีแดงขึ้นที่ผิวหนาแสดงวา
ปฏิกิริยาใหผลบวก

1.4.3.2 ถายเชื้อลงใน MR-VP medium บม ท่ี 35-37 องศาเซลเซยี ส
เปน เวลา 48 ชว่ั โมง ใชปเปตดูดเชื้อ 0.7 มิลลิลิตร หยดลงบนจานกระเบอ้ื งหลมุ

สขี าว เพื่อตรวจการเกิด Acety - methylcarbinol โดยเตมิ น้ํายา ∝ - naphthol 0.1
มิลลิลิตร และน้ํายา KOH รอ ยละ 40 จํานวน 0.1 มลิ ลิลิตร และเกล็ด Creatine
2 - 3 เกล็ด ตั้งทิ้งไว 2 ชว่ั โมง เมื่อมีสีขมพูเกิดขึ้นแสดงวาใหผลบวก

บมหลอดเชื้อตออีก 48 ชว่ั โมง ตรวจปฏกิ ริ ยิ า Methyl red โดยเติม
น้ํายา Methyl red ปรมิ าณ 5 หยดลงในหลอด เมื่อมีสีแดงเกิดขึ้นแสดงวาใหผลบวก
การเกิดสีเหลืองในหลอดเชื้อแสดงวาใหผลลบ

1.4.3.3 ถายเชื้อลงใน Koser citrate broth บม ท่ี 35 – 37 องศา
เซลเซียส เปนเวลา 96 ชว่ั โมง สงั เกตการเจรญิ ของเชอ้ื ในอาหารโดยดคู วามขนุ
แลวบันทึกผลเปนบวกหรือลบ

1.4.4 ยอ มสแี บบแกรม E.coli จะติดสีแกรมลบ
1.4.5 จําแนกชนดิ ของเชอ้ื จากผลของปฏกิ ริ ยิ าชวี เคมี ดงั น้ี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 75

จุลนิ ทรยี  Indol MR VP Citrate

Typical E.coli + +- -

Atypicao E.coli - +- -

Typical intermediate + +- +

Atypical intermediate - +- +

Typical Enterbacter aerogenes - -+ +

Atypical E.aergoenes + -+ +

1.4.6 คํานวณคา MPN ของ E.coli ตอกรมั ของอาหารจากหลอดที่ทดสอบ
แลววา มแี บคทเี รยี รปู ทอ นไมส รา งสปอร ติดสีแกรมลบ และใหผลการทดสอบ IMViC
เปน + + - - หรอื - + - -

2.! การตรวจวิเคราะหโดยวิธี Shake plate

2.1 การนบั จํานวน Presumptive coliform

2.1.1 ใชป เปตดูดอาหารใสจ านเพาะเชอ้ื โดยใชต วั อยา งอาหารอยา งนอ ย
3 ระดบั ความเจอื จาง

2.1.2 เท Violet red bile agar ลงในจานทเ่ี ตรยี มไวใ นขอ 2.1.1
เขยานานใหต วั อยา งอาหารกระจายไปทว่ั ๆ

2.1.3 รอจนอาหารเพาะเชอ้ื แขง็ เททบั หนา ดว ยอาหารเพาะเชอ้ื ชนดิ
เดียวกนั ใหห นาประมาณ 1 มลิ ลิเมตร

2.1.4 บม เชอ้ื 37 + 1 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง
2.1.5 ตรวจนับจํานวน Coliform ซ่ึงโคโลนีมีสีแดงเขม ขนาดประมาณ

0.5 - 1 มลิ ลิเมตร รอบโคโลนีมีการตกตะกอนของเกลือนํ้าดี

2.2 การตรวจเพอ่ื ยนื ยนั วา เปน Coliform

2.2.1 เลอื กโคโลนีจากจานเพระเชื้อในขอ 2.1.5 Incubate ใน
MacConkey broth หรอื Brilliant green lactose bile broth

2.2.2 บม ท่ี 37 + 1 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง
2.2.3 หลอดทเ่ี กดิ กา ซในหลอดดกั กา ซยนื ยนั ไดว า เปน Coliform

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 76

2.3 การตรวจ Faecal coliform และ E.coli

เลือกโคโลนีจากขอ 2.1.5 ทดสอบเชนเดียวกับขอ 1.3 และ 1.4

3. การตรวจวิเคราะหโดยการกรองดวยเมมเบรน (Membrane filtration
method)

วธิ นี น้ี ยิ มใชต รวจวเิ คราะหใ นอาหารซง่ึ เปน ของเหลว เชน เครื่องดื่มตางๆ
น้ําใชน้ําบริโภค โดยเฉพาะอยา งยง่ิ ในตวั อยา งซง่ึ มจี ลุ นิ ทรียปรมิ าณนอ ยๆ และ
ตองการทราบจํานวนทแ่ี นน อน

3.1 การตรวจจํานวน Presumptive coliform

3.1.1 วางแผนเซลลโู ลสสําหรบั ดดู ซบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื ลงในจานเพาะ
เชื้อใชป เปตดูด M. Endo broth 2 มิลลิเมตร หยดลงบนแผน เซลลูโลส

3.1.2 กรองตัวอยา งอาหารเหลวผา นแผน กรองเมมเบรนโดยใชป รมิ าตร
ท่ีตองการ (สําหรบั นา้ํ หรอื เครอ่ื งดม่ื นยิ มใช 100 มลิ ลิลิตร)

3.1.3 ใชปากคีมจุมแอลกอฮอลลนไฟ คบี แผน กรองซง่ึ มจี ลุ นิ ทรยี อ ยู
ดานบนวางบนแผน เซลลโู ลส ในขอ 3.1.1 ระวังอยาใหเกิดชองวางระหวางแผน
เซลลูโลส และแผนกรอง

3.1.4 บม เชอ้ื ท่ี 30 + 1 องศาเซลเซยี ส 4 ถึง 6 ชว่ั โมง แลวจึงนําไปบม
ท่ี 31 + 1 องศาเซลเซยี ส 24 ชว่ั โมง (การบม เชอ้ื ท่ี 30 องศาเซลเซยี สนน้ั เพื่อ
ปรับสภาวะของเชอ้ื โดยเฉพาะในตัวอยา งน้ําซง่ึ มคี ลอรนี หรือตัวอยางเครื่องดื่มซึ่ง
มีสาร Preservative)

3.1.5! นับจํานวนแบคทีเรีย Coliform ซง่ึ มขี นาดโคโลนปี ระมาณ
0.3-0.5 มลิ ลิเมตร โคโลนีของ Enterobacter sp. จะมสี แี ดง สวนโคโลนีของ E.coli
จะมีเงาโลหะ

3.2! การตรวจเพื่อยืนยันวาเปน Coliform

ทดสอบเชนเดียวกับขอ 2.2

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 77

3.3 การตรวจนบั จํานวน Presumptive E.coli

3.3.1 ทดสอบเชนเดียวกับขอ 3.1 ยกเวน หลงั จากทป่ี รบั สภาวะของ
เช้ือโดยการบม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 + 1 องศาเซลเซียส แลวนําไปบม ตอ ทอ่ี ณุ หภมู ิ 44 + 1
องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

3.3.2 นบั เฉพาะจํานวนโคโลนที ม่ี เี งาโลหะ

3.4 ตรวจเพอ่ื ยนื ยนั วา เปน E.coli

เชน เดยี วกบั ขอ 1.4

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 78

การวเิ คราะห Faecal streptococcus

1. อาหารเพาะเชอ้ื

อาหารเพาะเชือ้ เพือ่ ตรวจวเิ คราะห Faecal streptococcus นน้ั มหี ลายสตู ร
ดวยกัน จะอยา งไรก็ดีแตละสูตรจะใชห ลักการคลา ยคลงึ กัน คือ ในอาหารจะประกอบ
ดวยโซเดยี มอาไซด เพ่ือยับย้ังการเจรญิ ของจลุ นิ ทรยี พ วกทส่ี รา งเอนไซมอ อกซเิ ดส
และเติม Triphenyltetrazolium chloride เพอ่ื จําแนกเชอ้ื ทม่ี คี วามสามารถในการ
รดี ิวสส ารน้ี ซึ่งสวนใหญ Faecal streptococcus โดยเฉพาะอยา งยง่ิ S.faecalis จะ
สามารถรดี ิวสส ารนใ้ี หไ ด Formasan derivative ซง่ึ จะทําใหโ คโลนเี ปลย่ี นเปน สแี ดง
เชื้อแตละ Species จะมคี วามสามารถในการรดี ิวสม ากนอ ยตางกนั ซึ่งสังเกตได
จากความเขมของสีที่เกิดขึ้น สวน Streptococcus กลุมอื่น เชน กลุมแลคติค
สวนใหญจ ะไมเ กดิ ปฏกิ ริ ยิ ารดี วิ ส

2.การตรวจวิเคราะห

2.1 การนับจํานวน Presumptive faecal streptococci

2.1.1 เตรยี มตัวอยา งอาหารใหเ จอื จางระดบั 10 เทา
2.1.2 ใชป เปตดูดอาหารใสจ านเพาะเชอ้ื เท KF agar เขยา จานใหต วั อยา ง
อาหารกระจายไปทว่ั ๆ บม ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35 - 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชว่ั โมง
2.1.3 นบั จํานวนโคโลนีทม่ี สี แี ดงหรอื ชมพู

2.2! การทดสอบเพื่อยืนยันวาเปน Faecal streptococcus

2.2.1 ถายเชื้อจากโคโลนีสีแดงหรือชมพูลงใน Tryptose agar บม ท่ี 35 - 37
องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชว่ั โมง

2.2.2 เตรียมสไลดยอมสีแบบแกรม ตรวจดแู บคทเี รยี รปู รา งกลมตดิ สแี กรม
บวก

2.2.3 ทดสอบความสามารถในการเจรญิ ทอ่ี ณุ หภมู ิ 45 องศาเซลเซียส โดย
ถายเชอ้ื จากขอ 2.2.1 ลงบน Typtose agar slant บม ท่ี 45 + 1 องศาเซลเซยี ส เปน
เวลา 48 ชว่ั โมง สังเกตการเจริญเติบโต

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 79

2.2.4 ทดสอบความสามารถในการเจรญิ ในอาหารทป่ี ระกอบดว ยเกลอื น้ําดี
โดยถายเชื้อลงใน Tryptose agar broth รอ ยละ 40 บม ท่ี 35 - 37 องศาเซลเซยี ส
เปนเวลา 48 ชว่ั โมง บนั ทกึ การเจรญิ เตบิ โตโดยสงั เกตความขนุ

2.2.5 ทดสอบการสรางเอนไซมแคตตาเลส โดยใชเ ชอ้ื อายุ 48 ชว่ั โมง ซง่ึ
เจริญเติบโตบน Tryptose agar slant ลาดดว ยไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2)
รอ ยละ 3 ใหท ว มหนา Slant บันทกึ การสรา งเอนไซมโ ดยสงั เกตจากฟองกา ซ

2.2.6 เชอ้ื ทเ่ี จรญิ ไดท ่ี 45 องศาเซลเซียส (ใหผลบวกในขอ 2.2.3) และเจรญิ
ในอาหารทม่ี เี กลอื น้ําดรี อ ยละ 40 (ใหผลบวกในขอ 2.2.4) ไมส รา งเอนไซม
แคตตาเลสจัดวาเปน Faecal streptococcus

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 80

การศกึ ษาเชอ้ื ราทม่ี คี วามสําคัญกับอาหาร

เชื้อรานับวาเปนจุลินทรียที่มีบทบาทในอุตสาหกรรมอาหารไมนอยไปกวา
จุลินทรียประเภทแบคทเี รยี โดยปกตมิ กั จะเจรญิ เตบิ โตไดด ใี นอาหารทม่ี คี วามชน้ื ต่ํา
และมีคา น้าํ อสิ ระ(Water activity)ไมสูงมากนักรวมทั้งขึ้นอยูกับสภาพของสิ่งแวดลอม
เชนอุณหภูมิและความช้ืนสมั พัทธ โดยเฉพาะประเทศไทยเปน เขตรอ นชน้ื ซง่ึ มสี ภาพ
สิ่งแวดลอมที่เอื้ออาํ นวยใหเ ชอ้ื ราสามารถเจรญิ เตบิ โตไดอ ยา งดี การวเิ คราะหเ ชอ้ื รา
จึงมีความสําคัญย่ิงโดยเฉพาะอยา งยง่ิ เชอ้ื ราประเภททม่ี คี วามสําคัญในอาหาร เพื่อ
เปนดัชนีในการบง ชถ้ี งึ ความสะอาด และคณุ ภาพของผลิตภัณฑอาหาร

จุลนิ ทรยี  ตวั อยางเช้ือราไปยีนัสตอ ไปน้ี

• Mucor • Monilia
• Botrytis • Penicillium
• Aspergillus • Rhizopus
• Cladosportum • Geotrichum
• Fusarium

อุปกรณ

•สไลด และ Cover slip
•เขม็ เขย่ี เชอ้ื ลูป
•จานเพาะเชอ้ื
•แทงแกวสําหรบั รองสไลด
•น้ําท่ีปราศจากเชอ้ื ขวดละประมาณ 100 มลิ ลิลิตร
•Potato dextrose agar (PDA) หลอดละ 10 มิลลิลิตร
•เทปกาวชนดิ ใส
•Mounting fluid (Lactopherol)
•ยาเคลือบ (Sealing fluid)

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 81

การทดลองและรายงานผล

ลักษณะทางสัณฐานวิทยา

1. ลักษณะการเจรญิ ของเชอ้ื บนอาหารแขง็ (Culture characteristic) สังเกต

ลักษณะตอไปนี้แลวจดบันทึก
1.1 ขอบเขตของโคโลนี มีขอบเขตแนนอน (Zonate) หรอื ไมม ขี อบเขต
(Nonzonate)
1.2 ความหนาแนนของกลุมเสนใย
1.3 สีของเสนใยและสีของสปอร
1.4 ลักษณะโคโลนี

2. ลักษณะซง่ึ ศกึ ษาจากกลอ งจลุ ทรรศน (Microscopic study)

2.1 เตรียมสไลดเ พอ่ื การศกึ ษาดว ยกลอ งจลุ ทรรศนด งั น้ี

2.1.1 การทํา (Wet mount)

2.1.1.1 ใชเ ขม็ เขย่ี เขย่ี เสน ใยพรอ มทง้ั Fruiting body วางบน
สไลด

2.1.1.2 หยด Mounting fluid อยา งแรงๆ สองสามครง้ั เพื่อทําให
สปอรซ ง่ึ เกาะกลมุ หนาแนน หลดุ ออกไปบา ง

2.1.1.3 ปดทับดวย Cover slip ระวงั อยา ใหเ กดิ ฟองอากาศ ซบั
Mounting fluid ซง่ึ ซมึ ออกมานอกขอบ Cover slip ดว ยกระดาษซบั

2.1.2 การแตะเชอ้ื ดว ยเทปกาวใส (Scotch tape)

2.1.2.1 ตัดเทปกาวประมาณ 3 เซนตเิ มตร พบั รมิ ทง้ั สองเขา มาทาง
ดานท่ีมีกาว ใหเ กดิ ขอบหนาประมาณ 0.5 เซนตเิ มตร

2.1.2.2 แตะเทปดา นทม่ี กี าวกบั เสน ใยบรเิ วณทม่ี ี Fruiting body
หรือโครงสรา งชนดิ อน่ื ๆ

2.1.2.3 หยด Mounting fluid บนสไลด 1 หรอื 2 หยด วางเทปบน
สไลดใ หด า นทม่ี กี าวอยดู า นบน

2.1.2.4 หยด Mounting fluid ลงอีก 1 หรอื 2 หยด ปดทับดวย
Cover slip

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 82

2.1.3! การเพาะเชื้อบนสไลด (Slide culture)

ทุกขั้นตอนของการเพาะเชื้อนี้ตองปฏิบัติดวยวิธีปราศจากเชื้อ (Aseptic
technique)

2.1.3.1 เท PDA ลงในจานเพาะเชอ้ื ประมาณ 10 มิลลิลิตร ทิ้งให
แขง็

2.1.3.2 ใชเขม็ เขย่ี ตดั วนุ ซง่ึ แขง็ แลว ชน้ิ ละประมาณ 1 ลูกบาศก
เซนติเมตร ใชล ปู แซะชน้ิ วนุ ขน้ึ วางบนสไลด

2.1.3.3 วางสไลดบ นแทง แกว งอในจานเพาะเชอ้ื เทน้ําซง่ึ นง่ึ
ฆาเชื้อแลวลงในจาน ใหร ะดบั น้ําอยูใตสไลด

2.1.3.4 บม เชือ้ ทอี่ ณุ หภูมหิ อ ง 2-5 วัน สังเกตการเจริญเติบโตและ
การเกดิ สปอร (จะไดส ไลดท ส่ี งั เกตโครงสรา งตา งๆไดช ดั เจน เม่ือราเจรญิ เตบิ โต
และเรม่ิ สรา งสปอรเ พยี งเลก็ นอ ย

2.1.3.5 ยก Cover slip ออกจากแผน วนุ ในแนวตรงขน้ึ ดา นบน ใช
เข็มเข่ียยกแผน วนุ ออกจากสไลดใ นแนวตรงขน้ึ ดา นบนเชน กนั

2.1.3.6 หยด Mounting fluid บนสไดลซ ง่ึ มเี ชอ้ื ราตดิ อยู ปด ทบั
ดวย Cover slip ซง่ึ สะอาด

2.1.3.7 หยด Mounting fluid บนสไลดท ส่ี ะอาด ปดทับดวย Cover
slip ที่มีเชื้อราติดอยู สไลดซง่ึ เตรยี มจากทกุ วธิ กี ารนถ้ี า ตองการเก็บไวศกึ ษาใน
คราวตอไป ใหเคลือบขอบ Cover slip ดว ยยาเคลอื บ

2.2! ศึกษาลักษณะทางสณั ฐานวทิ ยาของราจากสไลดซ ง่ึ เตรยี มไว

โดยใช Objective กําลังขยาย 10 และ 40 สังเกตลักษณะตอไปนี้ วาดรปู และ
จดบันทึกลักษณะตางๆ

2.2.1 ลักษณะ Hypha มผี นงั กน้ั (Septate) หรอื ไม ทบึ หรืบใสหรอื มลี กั ษณะ
พิเศษอื่น ๆ

2.2.2 มีโครงสรา งพเิ ศษ เชน Rhizoid, Food cell และ Sclerotium เปนตน
หรอื ไม

2.2.3 ลักษณะ Asexual spore เปน Aproangiospore, Conidium,
Arthrospore หรอื chlamydospore

Sporangiospore สังเกตรูปรางของ Sporangium ตําแหนงที่เกิด
ลักษณะ Columella

Conidia สงั เกตรปู รา ง กลม รปู ไข รปู เคยี ว เปน ตน เปน เซลเดยี วหรอื
หลายเซล เกิดเดี่ยว ๆ ตอเปนสาย หรือเกาะกลุมแบบอื่น ๆ

2.2.4 มี Sexual spore หรอื ไม เปน แบบไหน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 83

การแยกยสี ตจากอาหารและศึกษาคุณสมบัติบางประการ

เช้ือยีสตเปนจลุ นิ ทรยี อ กี ประเภทหนง่ึ ทท่ี ําใหอ าหารเกดิ การเนา เสยี และเกิด
การหมักได โดยเฉพาะอาหารทม่ี คี ารโ บไฮเดรต เชน น้าํ ตาลเปน องคประกอบ ซง่ึ เชอ้ื
ยีสตสามารถใชแ หลงนํ้าตาลเปน แหลงพลงั งานในการเจรญิ เติบโต ดังนั้นในวัตถุดิบ
หรือแมแตผลิตภัณฑท ม่ี นี ้ําตาลเปน องคประกอบจงึ มคี วามจําเปน อยา งยง่ิ ทต่ี อ งตรวจ
วิเคราะหเชื้อยีสต เพื่อเปน การประกนั วาวัตถุดบิ หรือผลิตภณั ฑด ังกลาวมคี ุณภาพ
เหมาะสมตอการนําไปใชเ ปน วตั ถดุ ิบในการผลติ หรอื เหมาะสมตอ การวางจําหนา ย
ในตลาดตอไป

ตัวอยา งอาหาร

จุลนิ ทรยี  •น้ําผง้ึ
อุปกรณ •น้ําตาลปบ
•ผลไมซ ง่ึ มรี อยช้ํา
•ถั่วงอกดอง
•ผักเสี้ยนดอง
•องนุ หมกั 2-3 วัน

•Saccharsmyces cerevisiae (Burgandy)
•Saccharomyces rouxii
•Pichia sp.
•Film yeast

•จานเพาะเชื้อ
•Cover slip
•ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร
•อาหารเลี้ยงเชื้อสาํ หรบั Osmophilic yeast หลอดละ 20 มลิ ลิลิตร
• Potato Dextrose Agar (PDA) ขวดละ 40 มิลลิลิตร และ ขวดละ
90 มลิ ลิลิตร

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 84

•กรดแลคติค รอ ยละ10
•น้ํามะพราวเติมนํ้าตาลรอ ยละ 15 หลอดละ 10 มิลลิลิตร
•น้ําผักดองขวดละ 50 มิลลิลิตร
•วุน รอ ยละ 3 จํานวน 15 มิลลิลิตร
•Sporulating medium
•Malachite green รอ ยละ 5
•แอลกอฮอลรอยละ 95
•Safranin รอ ยละ 5

การทดลองและรายงานผล

1. การแยกเชอ้ื
1.1 แยกยสี ตท ม่ี ปี ระสทิ ธภิ าพการหมกั (Fermentability)

1.1.1 ใชปเปตดูดกรดแลคติค 0.5 มิลลิลิตรผสมใน PDA ที่หลอมเหลว
แลว 40 มิลลิลิตร (Acidified PDA) เทใสจ านเพาะเชอ้ื 2 จาน รอจนวนุ แขง็

1.1.2 ใชลูปและบริเวณชํ้าของผลไมช นดิ ใดชนดิ หนง่ึ Streak บน
Acidfied PDA ทเ่ี ตรยี มไวห นง่ึ จานใหแ ยกเปน โคโลนเี ดย่ี ว ๆ

1.1.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2-5 วัน
1.1.4 เลือกโคโลนีที่มีลักษณะขุนขาว นนู ไมแผลายไวศึกษาตอไป

1.2 แยกยสี ตท ม่ี ลี กั ษณะการเจรญิ เปน ฝา (Film yeast)

1.2.1 ใชลูปแตะนํ้าผกั ดองชนดิ ใดชนดิ หนง่ึ Streak บน Acidified PDA
ที่เหลืออีก 1 จาน โดยใหแ ยกเปน โคโลนเี ดย่ี ว ๆ เชน กนั

1.2.2 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2-5 วัน
1.2.3 เลือกโคโลนีที่มีลักษณะเปนฝาแผลายหรือผิวหนาโคโลนียน ๆ
เพื่อการศึกษาตอไป

1.3 แยก Osmophilic yeast

1.3.1 เทอาหารสาํ หรบั แยก Osmophilic yeast (ประกอบดว ยน้ําตาล
รอยละ 60) ใสจ านเพาะเชอ้ื 1 จาน รอจนอาหารแขง็

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 85

1.3.2 ใชลูปแตะนํ้าผง้ึ หรอื น้ําตาลปป Streak บนอาหารเพาะเชอ้ื
1.3.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 5 - 15 วัน
1.3.4 เก็บโคโลนีที่เจริญบนอาหารไวศึกษาตอไป

2. การศกึ ษาคณุ สมบตั ทิ างสณั ฐานวทิ ยา

2.1 ศกึ ษาคณุ สมบัติทางสัณฐานวทิ ยา

2.1.1 ทาํ Wet mount ของยีสตที่แยกได ตรวจดลู กั ษณะรปู รา งของเซล
ดวยกลองจลุ ทรรศนก ําลงั ขยาย 400 และ 1,000 เทา

2.1.2 ทํา Wet mount น้าํ องนุ หมกั ตรวจดยู สี ตซ ง่ึ ปะปนมากบั องนุ และ
เจริญในน้าํ องนุ หมกั ซ่ึงจะมียีสตท ม่ี รี ปู รา งหลายแบบหลายลกั ษณะดว ยกนั ตรวจดู
รูปรางของยีสตเ หลา นโ้ี ดยใชก ลอ งจลุ ทรรศนก ําลงั ขยาย 400 และ 1,000 เทา

2.1.3 เข่ียยสี ตซ ง่ึ แยกไดจ ากขอ 1 และ S. cerevisiae ลงใน
Sporulationg medium บมที่อุณหภูมหิ อง 14 วัน ทาํ Wet mount และยอมสี
สปอรด งั น้ี Smear เชื้อบนสไลด เมอ่ื Smear แหง ตรึงใหเชื้อติดสไลดดวยความรอน
หยด Malachite green รอ ยละ 5 ลงใหทวม Smear อังสไลดบนเปลวไฟจนเกิดไอ
ลางสีออกดวยนา้ํ ทําใหเจือจางดวยแอลกอฮอลรอยละ 95 เปนเวลา 30 วินาที
ลางดวยนํ้า ตัดสีดวย Safranin รอ ยละ 5 นาน 30 วินาที ลางนํ้า เมื่อสไลดแหง
ตรวจดู สปอรดวยกลองจุลทรรศนกําลงั ขยาย 1,000 เทา Ascospore ของยีสตจ ะ
ติดสีเขียว Ascus จะติดสีแดง

2.2 ศึกษาประสทิ ธภิ าพการหมกั

2.2.1 เขย่ี เชอ้ื S. cerevisiae และเชอ้ื ทแ่ี ยกจากขอ 1.1.4 และ 1.2.4
ใสในหลอดซึ่งมีนาํ้ มะพรา วเตมิ น้าํ ตาลรอ ยละ 15 เชื้อละหลอด

2.2.2 คอย ๆ เทวุน รอ ยละ 3 ทบั หนา ใหห นาประมาณ 1 ถึง 1.5
มิลลิเมตร

2.2.3 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2-5 วัน
2.2.4 ตรวจผลประสทิ ธภิ าพการหมกั โดยสงั เกตการเกดิ กา ซ ซ่ึงจะดนั
วุนท่ีทับหนาใหหางจากผิวหนา นํ้ามะพรา ว วดั ระยะหา งนเ้ี ปรยี บเทยี บกบั เชอ้ื
S. cerevisiae

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 86

2.3 ศึกษาความสามารถในการใชก รดอนิ ทรยี แ ละลกั ษณะการเจรญิ
ของฝา

2.3.1 วัด pH น้าํ ผักดองซึ่งฆาเชื้อแลวดวยกระดาษวัด pH
2.3.2 เทน้าํ ผกั ดองลงในจานเพาะเชอ้ื 3 จาน
2.3.3 เขี่ย Film yeast และเชอ้ื ทแ่ี ยกจากขอ 1.1.4 และ 1.2.4 ลงใน
น้ําผักดองจานละเชื้อ
2.3.4 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2-5 วัน
2.3.5 สังเกตลักษณะการเจริญเติบโตของเชื้อ และวัด pH ของน้ําผักดอง

2.4 ศึกษาอทิ ธพิ ลของอากาศตอ การเจรญิ เตบิ โต

2.4.1 เท PDA ใสจ านเพาะเชอ้ื 4 จาน
2.4.2 Streak เชื้อ S. cerevisiae, Film yeast และเชอ้ื ทแ่ี ยกไดจ ากขอ
1.1.4 และ 1.2.4 ใหเ ปน เสน ตรงตามแนวเสน ผา ศนู ยก ลางของจาน จานละเชอ้ื
2.4.3 ใชป ากคบี คีบ Cover slip จุมแอลกอฮอลลนไฟ รอใหเย็นสักครู
วาง Cover slip ทับรอบ Streak ของเชอ้ื ตรงกลางจาน

Cover slip

แนวการเจริญเติบโตของเชื้อ

ภาพ 18 การวาง Cover slip บนจานเพาะเชอ้ื ในการศกึ ษาอทิ ธพิ ลของอากาศ
ตอการเจรญิ เตบิ โตของยสี ต

2.4.4 บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 2-5 วัน และนอก
2.4.5 เปรียบเทยี บการเจรญิ เตบิ โตภายใต Cover slip
Cover slip ของทุกเชื้อ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 87

2.5 ศกึ ษาการเจรญิ เตบิ โตในทม่ี นี ้ําตาลความเขม ขน สงู

2.5.1 เทอาหารสําหรบั แยก Osmophilic yeast และ PDA ลงในจาน
เพาะเชอ้ื อยา งละ 1 จาน

2.5.2 เข่ยี S. cerevisiae, S. rouxii และยสี ตจ ากขอ 1.3.4 ลงใน
อาหารสําหรบั Osmophilic yeast โดยแบง อาหารในจานออกเปน 3 สวน Streak
สวนละเชื้อ

2.5.3 เข่ียเชอ้ื ชดุ เดยี วกนั น้ี (ขอ 2.5.2) ลงบน PDA โดยแบง อาหาร
เปน 3 สวนเชนเดียวกัน

2.5.4 บม เช้ือที่อุณหภูมหิ อ ง 2-5 วัน
2.5.5 เปรยี บเทยี บการเจรญิ เตบิ โตของเชอ้ื ทง้ั สามในอาหารเพาะเชอ้ื ทง้ั
สองชนิด

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 88

การหา Thermal Death Time คา D และคา Z

การทําลายจลุ นิ ทรยี ด ว ยความรอ นทอ่ี ณุ หภมู หิ นง่ึ อณุ หภมู ใิ ดนน้ั จํานวน
จุลินทรียจะลดลงตามระยะเวลาทไ่ี ดร บั ความรอ น เมอ่ื เขยี นกราฟระหวา ง Log ของ
จํานวนจุลินทรียที่เหลือกับระยะเวลาที่ไดรับความรอน จะไดกราฟเสนตรงเรียกวา
Survivor curve หรอื Thermal date rate curve ซึ่งจดุ ตดั ของกราฟกบั แกนดานเวลา
คือ Thermal date time (TDT) ท่ีอุณหภมู นิ น้ั จากกราฟนส้ี ามารถหาคา D ซง่ึ
หมายถึงระยะเวลาที่ตองใหความรอนที่อุณหภูมินั้นเพื่อทําลายเชอ้ื ลงรอ ยละ 90 หรอื
10 เทา กราฟระหวา ง log ของคา TDT ทอ่ี ณุ หภมู ติ า ง ๆ กับอณุ หภมู กิ จ็ ะเปน องศา
ฟาเรนไฮต ที่ตองเพิ่มขึ้นเพื่อลดคา TDT ลง 10 เทา คา D ทอ่ี ณุ หภมู ติ า ง ๆ และ
คา Z ของจลุ นิ ทรยี ช นดิ เดยี วกนั อาจแตกตา งกนั ไปขน้ึ อยกู บั อายขุ องเชอ้ื สภาพการ
เลี้ยงเชื้อ และ Heating medium เปนตน

การหาคา Thermal death time อาจทําไดห ลายวธิ โี ดยใชภ าชนะบรรจเุ ชอ้ื
เพื่อใหความรอนที่ตางลักษณะกัน สําหรบั การศึกษานใ้ี ช Test tube method

จุลนิ ทรยี 

• เชือ้ Eschorichia coli อายุ 24 ชั่วโมงใน NA broth

อุปกรณ
1. จานเพาะเชอ้ื ซง่ึ เท Nutrient agar เติม Blie salt ไวข า มคนื
2. ปเ ปตขนาด 1 มลิ ลิลิตร และ 0.1 มลิ ลิลิตร
3. ขวด Diluent 9 มลิ ลิลิตร
4. Water bath ตัง้ อุณหภูมทิ ่ี 52, 54, 56 และ 50 และ 60 องศาเซลเซียส
5. อางนํ้าเยน็
6. หลอดแกวปราศจากเชื้อ

การทดลองและรายงานผล

1. นบั จํานวนเชื้อเรม่ิ ตน โดยวธิ ี Drop plate โดยตรวจนบั ทร่ี ะดบั ความ
เจอื จาง 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 บม เชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส

2. ใชปเปตดูดเชื้อใสหลอดแกวที่ปราศจากเชื้อหลอดละ 3 มิลลิลิตร 6 หลอด
ระวังไมใหเชื้อเปอนขางหลอด

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 89

3. แชหลอดเชื้อใน Water bath ตามอณุ หภมู ทิ ก่ี ําหนด ใหระดับใน Water
bath อยูในเหนือระดับเชื้อในหลอด ใชเชื้อหนึ่งในหกหลอดเปนหลอดคุมอุณหภูมิ
โดยเสยี บ Thermometer ไวในหลอดนี้

4. เรม่ิ จบั เวลาการใหค วามรอ น เม่ืออณุ หภมู ใิ นหลอดคมุ ขน้ึ ถงึ ระดบั ท่ี
ตองการ

5. นําหลอดเชื้อออกจาก Water bath ตามระยะเวลาทกี่ ําหนดสาํ หรบั การ
ใหความรอ นในแตล ะอณุ หภมู เิ มอ่ื นําออกจาก Water bath แลวแชหลอดเชื้อใน
น้ําเย็นจดั ทนั ที

อุณหภูมิ เวลาท่ีใหค วามรอ น (นาที)
องศาเซลเซียส องศาฟาเรนไฮต หลอดที่

1 2 3 45

52 125.5 10 20 30 40 50
54 129.2 10 20 30 40 50
56 132.2 10 20 30 40 50
58 136.4 5 10 15 20 25
60 140.0 5 10 15 20 25

6. นับจํานวนแบคทีเรียที่ยังคงเหลืออยูในแตละหลอดโดยวิธี Drop plate ใช
ระดับความเจอื จางตา งกนั ตามระยะเวลาทใ่ี หค วามรอ น บม เชอ้ื 37 องศาเซลเซยี ส

หลอดที่ ระดบั ความเจอื จาง
10-6 10-5 10-4 10-3
1 10-5 10-4 10-3 10-2
2 10-4 10-3 10-2 10-1
3 10-3 10-2 10-1 ไมเ จอื จาง
4 10-3 10-1 1 : 10 ไมเ จอื จาง
5

หลอดที่ = ลําดบั การนําหลอดเชื้อออกจาก Water bath ในระยะเวลาตางๆ กนั ตาม
ท่ีกําหนดในหวั ขอ 5

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 90

7. เขยี น Survivor curve โดยใชก ระดาษกราฟซง่ึ มี Scale ดา นหนง่ึ เปน
Log scale และอกี ดา นหนง่ึ เปน Arithmatic scale (Semilog)

8. หาคา D และ Thermal daath time จาก Survivor curve
9. เขยี น Thermal death time curve โดยใชคา TDT ทอ่ี ณุ หภมู ติ า ง ๆจาก
การปฏบิ ตั ิงานของทกุ กลมุ
10. หาคา Z จาก Thermal death time curve

ตาราง 5 เปรยี บเทยี บคา D และคา Z ของแบคทเี รยี ทม่ี บี ทบาทในเรอ่ื งของ

อาหารกระปอ ง

ความเปน กรดของอาหาร คา D คา Z

(นาที) (องศา

ฟาเรนไฮต)

Low acid และ Semi acid food D250
สปอรข อง Thermophile

•Bacillus stearothermophilus 4.0-5.0 14-22
•Clostridium thermosaccharolyticum 3.0-4.0 16-22
•Clostridium nigricans 2.0-3.0 16-22

สปอรข อง Mesophile 0.1-0.2 14-18
•Clostridium botulinum (Type A,B) 0.1-1.5 14-18
•Clostridium sporogenes (P.A.3679)

Acid food

สปอรข อง Thermophile

•Bacillus coagulans 0.1-0.07 14-18
สปอรข อง Mesophile D212
0.1-0.5 12-16
•Bacillus polymixa 0.1-0.5 12-16
•Bacillus macerans 0.1-0.5 12-16
•Clostridium pasteurianum

High acid food D150 8-10
•Lactobacillus spp. 0.5-1.0 8-10
•Leuconostoc spp. 0.5-1.0 8-10
• Yeast and mold 0.5-1.0

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 91

ตาราง 6 เปรยี บเทยี บคา D และคา Z ของจุลินทรยี ท ม่ี บี ทบาทเกย่ี วขอ งกบั การ

พาสเจอรไ รสอ าหาร

จุลนิ ทรยี  คา D คา Z

(นาที) (องศา

D180 D150 ฟาเรนไฮต)

เช้ือโรคและจลุ นิ ทรยี ซ ง่ึ สรา งสารพษิ

Prucella spp. 0.1-0.2 8-10

Mycobacterium tuberculosis 0.2-3.0 8-10

Coxiella burnetti 0.5-6.0 8-10

Salmonella spp. 0.02-0.25 8-10

Salmonella senftenberg 0.8-1.0 8-12

Staphylococcus aureus 0.2-2.0 8-12

Staphylococcus pyogenes 0.2-2.0 8-12

Clostridium botulinum (Type E spore) 0.1-3.0 9-16

จุลินทรียซง่ึ กอ ใหอ าหารเนา เสยี

(Spoilage microorganism)

แบคทเี รยี ซง่ึ ไมส รา งสปอร 0.5-3.0 8-12

ยีสตและเชื้อรา

ตาราง 7 ตวั อยา งขอ มลู การหา Lethal rate

เวลา อุณหภูมิ TDT Lethal rate
(นาที) (องศาฟาเรนไฮต) (นาที)
1/1000=0.001
10 185 1000 1/1000=0.001
20 198 1000 1/416=0.0024
30 211 416 1/125=0.008
40 221 125 1/60=0.017
50 227 60 1/32=0.031
60 231 32 1/23=0.0434
70 234 23 1/18=0.0624
80 236 18 1/16=0.0624
90 237 16