หลักการวิเคราะห์จุลินทรีย์

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 192

แตจะไมเ หมอื นกนั เมอ่ื มปี รมิ าณการปนเปอ นของ Coliform bacteria ท่ีสูงขน้ึ เพราะวา เกดิ การ
เปลี่ยนแปลงในสวนประกอบของสิ่งแวดลอม และอาหารเลี้ยงเชื้อสําหรบั Coliform bacteria
ประกอบดวยสวนประกอบที่มีผลตอการตอบสนองความไวในการวัดการเปล่ียนแปลง
Impedance มากกวา สารเจอื ปนทม่ี ใี นอาหารเลย้ี งเชอ้ื สําหรบั Total variable count

การเจริญเติบโตของยีสตและราไมมีผลตอการเปลี่ยนแปลงใดๆใน M-value สวนคา
E-value จะเกิดการเปลี่ยนแปลงอยางเห็นไดชัด ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทป่ี ระกอบดว ยความเขม ขน
ของเกลือท่ีสูงจะมกี ารเพม่ิ ขน้ึ ของคา การนําไฟฟา ดงั นน้ั การเปลย่ี นแปลงของ Impedance จะมี
ความออนมากสาํ หรบั คา M-value เน่ืองจากเมตาบอลซิ มึ ของจลุ นิ ทรยี  คา E-value จะไมขึ้น
กับคาการนําไฟฟา มากนกั ซง่ึ ทําใหเ ปน ผลดตี อ การวิเคราะห นอกจากนค้ี า E-value จะมี
การตอบสนองกอนคา M-value จึงนิยมสําหรบั การวดั ในน้ํานม

การวิเคราะหป รมิ าณจลุ ินทรียมีความเปน ไปไดเ พราะคา M-value Threshold หรือคา
E-value threshold ไดถูกกําหนดใหมากเกินที่เวลาหนึ่งๆ ซง่ึ เปน สดั สว นกบั ความเขม ขน ของ
จุลนิ ทรีย การทํา Calibration curve จึงตองถกู กําหนดขึน้ โดยใชว ิธปี กตแิ บบเดิมเพ่ือวเิ คราะห
จํานวนจลุ ินทรีย

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 193

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา งเครอ่ื งดม่ื Cider

ในการวิเคราะหต วั อยางเครื่องด่ืมแบบเร็วน้ี จะใชตัวอยางเครื่องดื่ม Cider ทม่ี ี
แอลกอฮอลรอยละ 3.5 โดยใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื BiMedia 001 A

M (%) M-value E(%) E-value

15 15
13 13
11 Cider 1 11 Cider 1
9 Cider 2 9 Cider 2
7 Cider 3 7 Cider 3
5 5
3 3 Cider 4
1 Cider 4 1
0 0

0 5 10 15 0 5 10 15
เวลา (ชั่วโมง) เวลา (ชั่วโมง)

ภาพ 39 การวิเคราะห M-value และ E-value ในตัวอยาง Cider

ในภาพ 39 แสดงใหเห็นวาตัวอยาง Cider 3 ตัวอยาง (Cider 1-3) จะมีการปนเปอ น
ของเชอ้ื จลุ นิ ทรียในปรมิ าณทแ่ี ตกตา งกนั ในกรณนี ค้ี า Threshold value กําหนดที่รอยละ 5 ใน
การวัดคา M-value ความแตกตางของเวลาที่ผานเสน Threshold value น้ี ช้ีใหเหน็ ถงึ จํานวน
จุลินทรียท่ีแตกตางกนั หลงั จากทําการทดลองไป 15 ชว่ั โมงทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 องศาเซลเซยี ส
พบวาตัวอยางที่ 4 แสดงการเพิ่มของคา M-value ท่ีไมมีนัยสําคญั ทางสถติ ิ ดงั นน้ั ตวั อยา งน้ี
สามารถสรุปไดวาเปนตัวอยางที่ผานการฆาเชื้อมาแลว (Sterile)

การตรวจสอบ Total Variable Count สามารถทําไดโ ดยใช Threshold value ในกราฟ
ของ E-value ดังนั้นการเลือก Threshold value ท่ีเหมาะสมไมว า จะเปน คา E-value หรอื
M-value สามารถถูกนํามาใชไ ดข น้ึ กบั วธิ กี ารประยกุ ต

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 194

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา ง
Bicarbonated apple juice

ในการวเิ คราะหต วั อยา งเครอ่ื งดม่ื ชนดิ Bicarbonated apple juice แบบเรว็ นี้ จะใช
อาหารเลย้ี งเชอ้ื BiMedia 001 A

M (%) M-value E(%) E-value

28 28
24 24
20 20 Sample 1
16 Sample 1 18 Sample 2
12 Sample 2 12 Sample 3
8 Sample 3 8
4 4
0 0
-4 Sample 4 -4 Sample 4

0 5 10 15 0 5 10 15
เวลา (ชั่วโมง) เวลา (ชั่วโมง)

ภาพ 40 การวิเคราะห M-value และ E-value ในตัวอยาง Bicarbonated apple juice

การปนเปอนจากสายการผลิตน้ําแอปเปลสามารถท่ีจะตรวจสอบไดสะดวกดวยวิธีเร็ว
โดยใชเครื่อง BacTrac 4100

ในตัวอยางที่แสดงขางตนแสดงใหเห็นวาตัวอยางทั้งส่ีของนํ้าแอปเปลมีการปนเปอน
จุลินทรียในปริมาณที่แตกตางกัน การทดสอบจะใชเ วลาประมาณ 15 ชว่ั โมง ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30
องศาเซลเซยี ส ที่คา M-value เวลาทก่ี ราฟผา นคา Threshold value รอ ยละ 5 ชี้ใหเห็นถึง
ความเขม ของการปนเปอ นจลุ นิ ทรีย ตัวอยา งที่ 1 แสดงถงึ การปนเปอ นจลุ นิ ทรียทง้ั หมดมาก
ที่สุด ขณะท่ตี ัวอยางท่ี 4 เปน น้าํ แอปเปลที่ Sterile

ไมว า คา M-value หรือ E-value ก็สามารถใชในการตรวจสอบการปนเปอนจุลินทรยี ไ ด
ใชคาที่ซึ่งปรากฏกอนสําหรบั เวลาทท่ี ําการตรวจสอบตา่ํ สดุ

ขีดจํากัดของการปนเปอนหรือผลิตภัณฑ Sterile สามารถไดรับคาํ ตอบอยางรวดเร็ว
และมีความเชอ่ื มน่ั ในอตุ สาหกรรมเครอ่ื งดม่ื โดยใชเ ครอ่ื งมอื BacTrac

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 195

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็
ในการศึกษาประสิทธิภาพของสารกันเสีย

ในการตรวจสอบประสทิ ธิภาพของสารกนั เสีย เชน Sodium benzoate โดยศึกษากับ
เชอื้ E.coli

M (%) M-value 5 E(%) E-value 20
20
20 20
18 18
16 Control 16 Control
12 12
10 1 2 3 4 10 1 2 3 4
8 8
6 65
4 4
2 2
0
0 -2
-2
0 10
0 10 เวลา (ชั่วโมง)
เวลา (ชั่วโมง)

Sodium benzoate 1=3mM, 2=6mM, 3=10mM, 4=13mM, 5=18mM

ภาพ 41 การตรวจสอบประสิทธิภาพของสารกันเสีย

ประสิทธิภาพของสารกันเสียสามารถประเมินทางปรมิ าณไดจากการตรวจสอบดัชนีการ
เจรญิ เติบโตของเชื้อจลุ ินทรยี 

ในตัวอยา งนค้ี วามเขม ขน ของสารกนั เสยี Sodium benzoateในระดับตางๆถูกเตรียม
ข้ึนในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทป่ี ระกอบดว ย E.coli และทําการตรวจสอบมากกวา 20 ชว่ั โมงในการ
บมเพาะเชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 องศาเซลเซียส

ผลของการเพ่ิมความเขมขนของสารกันเสียแสดงใหเห็นไดอยางชัดเจนวาสามารถ
ยับย้ังการเจริญเตบิ โตของจลุ นิ ทรียท ที่ ําการทดสอบได

การศึกษาปริมาณสารกันเสียที่ถูกเลือกใชสามารถทาํ ไดโ ดยวธิ เี รว็ จากการวเิ คราะหจ าก
กราฟของ Time-lag ของคา M-value และ E-value และสามารถใชใ นการตรวจสอบขดี จํากดั
ความเขม ขน ของสารกนั เสยี ทใ่ี ช

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 196

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็
ในการศกึ ษาผลของสารยบั ยง้ั การเจรญิ เตบิ โตของแบคทเี รยี

ในการตรวจสอบผลของสารยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย สามารถใชเ ครอ่ื งมอื
วิเคราะหแ บบเรว็ ในหลกั การ Impedance method

M (%) M-value E(%) E-value

20 20
18 18 Control
16 16
12 12
10 10 1
8 Control 8
6 62
41 4
22 2

03 0
-2 -2 3

0 5 10 15 0 5 10 15
เวลา (ชั่วโมง) เวลา (ชั่วโมง)

Crystalviolet 1=0.01 mg/l , 2=0.1 mg/l , 3=1 mg/l

ภาพ 42 การตรวจสอบประสิทธิภาพของสารยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย

ในตัวอยางนี้แสดงถึงการเจริญเติบโตของเชื้อ Staphylococcus aureus ในอาหาร
เล้ียงเช้ือระหวา งการบม เพาะเชอ้ื ในชว ง 15 ชว่ั โมง ทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 องศาเซลเซียส เมอ่ื มกี าร
ผันแปรปรมิ าณของ Crystalviolet (CV) ในปรมิ าณทแ่ี ตกตา งกนั

ผลของการยบั ยง้ั ของ Crystalviolet สามารถแสดงผลไดอยางชัดเจน ในภาพ 42 กราฟ
ในชุดควบคุมชี้ใหเห็นถึงการเจริญเติบโตของเชื้อ Staphylococcus aureus ท่ีไมมกี ารเตมิ
สาร Crystalviolet สวนการเติมที่ระดับ 0.01 มิลลิกรัมตอลิตรมีผลทําใหเ กดิ การลดลงอยา งมาก
ของกิจกรรมของเชื้อจุลินทรียซึ่งแสดงใหเห็นในกราฟหมายเลข 1 ขณะทเ่ี ตมิ สารทร่ี ะดบั
1 มิลลกิ รมั ตอ ลิตร เกดิ การยบั ยง้ั การเจรญิ เตบิ โตของเชอ้ื จลุ นิ ทรียอยา งสมบรู ณ (กราฟ
หมายเลข 3)

ในวิธีการที่งายเชนนี้สามารถประยุกตใชในการศึกษาประสิทธิภาพของสารยบั ยั้งตา งๆ
เชน Antibiotics และสามารถตรวจสอบปริมาณสารยับยั้งตํ่าสดุ ทใ่ี ชเ พอ่ื ยบั ยง้ั การเจรญิ เตบิ โต
ของเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ไ ด

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 197

การตรวจสอบการปนเปอ นของแบคทเี รยี แกรมลบ
ใน Drinking milk โดยใช Impedance method

อายุการเก็บเปน พารามเิ ตอรท ส่ี าํ คัญอันหนึ่งสาํ หรบั Drinking milk ซ่ึงมปี จ จยั

หลายอยางที่มีอิทธิพลตออายุการเก็บของผลิตภัณฑดังกลาว ไดแก (1) คุณภาพของนํ้านมดบิ
(2) สภาวะการฆาเชื้อ (3) การปนเปอ นกลับ (4) การบรรจแุ ละชนดิ ของวสั ดทุ ใ่ี ชเ ปน ภาชนะ

บรรจุและสภาพการเก็บ และ (5) อุณหภูมใิ นขณะขนสง จากปจ จยั ดงั กลา วทง้ั หมดการปนเปอ น
เปนสวนที่สําคญั ทส่ี ดุ ทค่ี วรพจิ ารณา การใชเ ครอ่ื งมอื วเิ คราะหใ นระบบ Impedance method

เปนระบบท่ีเปน ไปไดใ นการตรวจสอบการปนเปอ นกลบั ของเชอ้ื จลุ นิ ทรยี แ กรมลบใน Drinking

milk ภายในเวลา 24 ชว่ั โมง โดยมขี น้ั ตอนการตรวจสอบดงั น้ี
1.! สุมตัวอยางหลงั ขน้ั ตอนการบรรจขุ องภาชนะใสน ้ํานม
2.! บมเพาะเช้ือเบ้ืองตน ของภาชนะบรรจนุ า้ํ นมทป่ี ด สนทิ ในหอ งบม เพาะเชอ้ื ท่ี 25
องศาเซลเซยี ส นาน 18 ชว่ั โมง
3.! หลังจากบมเพาะเช้อื เบอื้ งตนแลว เติม 10 มลิ ลิลิตรของนมในเซลวัดของเครื่องวัด

Impedance
4.! เติม 0.1 มิลลิลิตรของ Yeast-extract solution รอยละ 20 และ 0.1 มลิ ลิลิตรของ

Benzalkoniumchloride solution รอยละ 10 สารละลายทง้ั สองนค้ี วรเตรยี มเปน
Sterile stock solution เพื่อใชเฉพาะ กลาวคือ ละลาย Yeast extract 10 กรมั ใน

น้ํากลั่น 50 มิลลิลิตร และละลาย Benzalkoniumchloride 5 กรัม ในน้ํากลั่น 50

มิลลิลิตร ทาํ การเตรยี มและฆา เชอ้ื (15 นาที ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส) ของแตละ
Stock แยกกัน และเก็บสารละลายท้งั สองในตูเยน็ ที่ 4 องศาเซลเซยี ส

5.! เซทเครื่องมือวัด Impedance โดยกําหนดอุณหภูมิในการบมเพาะที่ 30 องศา
เซลเซียส เวลาในการบม เพาะ 24 ชว่ั โมง Threshold value (M-value) ที่รอยละ 7

และขีดจํากัดเวลาวัดคือ 20 ชว่ั โมง
6.! เดินเครื่องวัด โดยปลอยใหเครื่องดําเนนิ การ Operate ใหส มบรู ณ
7.! วางเซลวัดเขาไปในเครื่องวัด
8.! เคร่ืองจะบนั ทกึ การเจรญิ เตบิ โตของเชอ้ื และ Impedance Detection Time (IDT)

โดยอัตโนมัติ
9.! พิมพขอมูลออกมาจากเครื่องโดยคอมพิวเตอร และอานผล ถา IDT สั้นกวา 20

ช่ัวโมงแสดงวา เกดิ การปนเปอ นจากเชอ้ื จลุ นิ ทรยี  แตถา IDT เทากับหรอื มากกวา

20 ช่ัวโมงช้ีใหเ หน็ วา ตวั อยา งปราศจากการปนเปอ นจากเชอ้ื จลุ นิ ทรยี แ กรมลบ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 198

การตรวจสอบ Total Microbial activity
ในนมและผลิตภณั ฑนมโดยใช Impedance method

มีขั้นตอนการตรวจสอบดังนี้
1.! อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชคือ Bimedia 001 A หรอื 002 A (General impedance broth)
2.! การวัดดําเนนิ การดงั น้ี

2.1! เซทเครื่องมือวัด Impedance ดังนี้ อุณหภูมิของเครื่องเทากับ 30 องศา
เซลเซยี ส Threshold value ท่ีแนะนําควรเซทท่ี คา M-value ที่รอยละ 5 และ
เซทขีดจํากัดของเวลาสงู สดุ เทา กบั 20 ชว่ั โมง ปรบั การทํางานของสเกล
M-value ในชวงรอยละ 0-30 สวนคา E-value ในชวงรอยละ 0-60
ขอสังเกต: ทวนสอบการเลือกคา Threshold value ที่เลือกเมื่อทาํ มาตรฐาน
ของเสน สหสมั พนั ธ กอ นเรม่ิ การวดั

! 2.2 เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 001 A หรอื Bimedia 002 A จํานวน 9 มิลลิลิตร
ในเซลวัด หรือเซลวดั อาจจะบรรจอุ าหารเลย้ี งเชอ้ื ทย่ี งั ไมไ ดฆ า เชอ้ื แลว อาหาร
เล้ียงเช้ือดงั กลา วสามารถนําไปฆา เชอ้ื โดยตรงในเซล

2.3! ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มลิ ลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

2.4! เติมตัวอยางนํ้านมและผลติ ภณั ฑน ม จํานวน 1 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัดและ
ผสม เขยาใหเขากันอยากลับหัวกลับทายของเซล เมอ่ื จะสรา งมาตรฐาน
ทุกตัวอยา งควรจะทดลอง 2 ซ้าํ

2.5! ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ชวั่ โมงการวัดแตละเซลจะเรม่ิ โดยอัตโนมตั ิ

3.! การประเมนิ ผล
ผลในดา นคณุ ภาพ : เมื่อมีสัญญาณของ Impedance เกินกวาคา Threshold value
รอ ยละ 5 บนคา M-value คา Impedance Detection Time (IDT) จะถูกกําหนด
อยางอัตโนมัติ
ผลในดา นปรมิ าณ : ถามีการสรางกราฟมาตรฐานของเชื้อไวกอนแลว แลวคา
Colony Forming Unit (CFU) จะถูกคํานวณทนั ทที ม่ี สี ญั ญาณของ Impedance
เกินคา Threshold value ที่ถูกเลือกในเบื้องตน
อาหารเลี้ยงเชื้อสําหรบั ใชส รา งมาตรฐานของเชอ้ื ทต่ี อ งการตรวจสอบ แนะนําใหใ ช
อาหารเลย้ี งเชอ้ื PCA (Plate Count Agar) หรอื Plate Count Skim Milk Agar ใน
การทํามาตรฐานจําเปน ตอ งใชต วั อยา งอยา งนอ ยประมาณ 100 ตัวอยาง และ
จํานวนจุลินทรียในตัวอยางที่ใชควรจะคลุมชวงอยางนอย 4 ชวงบน Logarithmic
scale

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 199

การตรวจสอบ Coliforms ในนมและผลติ ภณั ฑน ม

โดยใช Impedance method

มีขั้นตอนการตรวจสอบดังน้ี
1.! อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชคือ Bimedia 160 B (Coliform media)

การเตรียมตัวอยาง : pH correction

สําหรบั ผลติ ภณั ฑน มทม่ี ี pH ตํ่า เชน โยเกิรต นมเปรย้ี ว และครมี เปรย้ี ว การทํา
pH correction ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 160 B จําเปนที่ตองทํา โดยมขี น้ั ตอน
ดังนี้ (1) เตรียมสวนผสมของตัวอยางและอาหารเลี้ยงเชื้อในสัดสวน 1:10 และ
เชค pH ของมนั (2) เตมิ สารละลาย 1M NaOH ลงไปจนมคี า pH ของสว นผสมใน
ชวง pH 7.0+0.1 จดปรมิ าณดา งทเ่ี ตมิ ลงไปจนได pH ตามที่กําหนด (3) จากผลท่ี
ไดน้ีสามารถนําไปคํานวณปรมิ าณสารละลาย 1 M NaOH ที่ฆาเชื้อแลวที่จําเปน
ตองใชใ นอาหารเลย้ี งเชอ้ื 0.5 ลิตร ขอ ควรระวังในการเตมิ ดา งนล้ี งไปในอาหาร
เลี้ยงเชื้อที่ฆาเชื้อแลว อาหารเลย้ี งเชอ้ื นน้ั ควรมอี ณุ หภมู ติ ่ํากวา 40 องศาเซลเซียส
หมายเหตุ: ถาตัวอยางจะตองปนเปนเนื้อเดียวกันกอน (10 กรมั ตวั อยา ง +
สาร เจือจาง 90 มลิ ลิลิตร) ขน้ั ตอนการทํา pH correction สามารถละทง้ิ ขน้ั ตอนน้ี
ได
2.! การวดั โดยใช Impedance method ดําเนินการดงั น้ี
2.1!เซทอุณหภมู ขิ องเครอ่ื งท่ี 37 องศาเซลเซยี ส คา Threshold value ท่ีแนะนําคอื

รอ ยละ 5 ของคา M-value และขีดจํากดั ของเวลาสงู สดุ เทา กบั 24 ชว่ั โมง การ
ปรับการทํางานของสเกล M-value อยูในชว งรอยละ 0-30 สวนสเกล E-value
อยูในชวงรอยละ 0-60
2.2!เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 160 B จํานวน 9 มิลลิลิตรลงไปในเซลวัด หรอื
เซลวัดอาจจะบรรจุอาหารเล้ียงเช้ือท่ียังไมไดฆาเช้ือแลวอาหารเล้ียงเช้ือ
ดังกลาวสามารถนาํ ไปฆา เชอ้ื โดยตรงในเซล
2.3!ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดทเ่ี ตมิ เฉพาะอาหารเลย้ี ง
เช้ือท่ีใชจ าํ นวน 10 มลิ ลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)
2.4!เติมตัวอยางนํ้านมและผลติ ภณั ฑน ม จํานวน 1 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัดและ
ผสม เขยาใหเขากันอยากลับหัวกลับทายของเซล เมอ่ื จะสรา งมาตรฐาน
ทุกตัวอยา งควรจะทดลอง 2 ซ้าํ
2.5!ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ชวั่ โมงการวดั แตล ะเซลจะเริม่ โดยอัตโนมัติ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 200

3.! การประเมนิ ผล
ผลในดา นคณุ ภาพ : เมื่อมีสัญญาณของ Impedance เกินกวาคา Threshold value
รอ ยละ 5 บนคา M-value Impedance Detection Time (IDT) จะถูกกําหนด
อยางอัตโนมัติ
ผลในดา นปรมิ าณ : ถามีการสรางกราฟมาตรฐานของเชื้อไวกอนแลว แลวคา
Colony Forming Unit (CFU) จะถูกคํานวณทนั ทที ม่ี สี ญั ญาณของ Impedance
เกินคา Threshold value ที่ถูกเลือกในเบื้องตน
อาหารเล้ียงเช้ือสําหรบั ใชส รา งมาตรฐานของเชอ้ื ทต่ี อ งการตรวจสอบ แนะนําใหใ ช
อาหารเลย้ี งเชอ้ื VRB (Violet Red Bile Agar) ในการทํามาตรฐานจําเปน ตอ งใช
ตัวอยางอยา งนอ ยประมาณ 100 ตัวอยา ง และจํานวนจลุ ินทรียในตัวอยา งที่ใชควร
จะคลุมชวงอยางนอย 4 ชวงบน Logarithmic scale

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 201

การทดสอบกลัน่ กรองสําหรบั Enterobacteriaceae
ในนมผงโดยวธิ ี Impedance method

ก า ร ต ร ว จ ส อ บ ตั ว อ ย  า ง น ม ผ ง ว  า มี ก า ร ป น เ ป   อ น จ า ก เ ช้ื อ จุ ลิ น ทรี ย  ป ร ะ เ ภ ท
Enterobacteriaceae หรือไม (ตรวจพบหรอื ไมพบ) เปน วธิ กี ารทม่ี ปี ระโยชนอ ยา งมากในการ
กลั่นกรองตัวอยางที่มีจาํ นวนมากๆกอน ซง่ึ จะทําใหไ มเ สยี เวลาในการทดสอบในรายละเอยี ด
และสามารถทันการในการนําสินคา ดังกลา วออกจําหนา ย ซง่ึ มขี น้ั ตอนดงั ตอ ไปน้ี

1.! อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทใ่ี ช ไดแกอ าหารเลี้ยงเช้อื Bimedia 140 A (Enterobacteriaceae
media)

2.! ข้ันตอนเบอ้ื งตน ในการทําใหเ ซลคืนตัว สําหรบั ตวั อยา งแหง หรอื ผงจะทําใหเ ซลคนื
ตัวไดโดยการนําตวั อยา งผสมกบั น้ําเปปโตน (Buffered peptone water) และทิ้งไว
ท่ี 37 องศาเซลเซียส นาน 4 ชว่ั โมง โดยไมต องคนสารละลายดงั กลาว ทง้ิ ใหเ ซล
จุลนิ ทรียเกดิ การคนื ตวั อัตราสวนของนมผงที่ใชคือผสมนมผงกับ Buffered
peptone water ในอัตราสวน 1:10 เชน นมผง 10 กรมั ในน้ําเปปโตน 90 มิลลิลิตร

3.! การวดั โดยใช Impedance method ดําเนินการดงั น้ี

3.1!เซทอุณหภมู ขิ องเครอ่ื งท่ี 37 องศาเซลเซียส คา Threshold value ท่ีแนะนําคอื
รอ ยละ 10 ของคา E-value กอนและรอยละ 5 ของคา M-value และขีดจํากดั
ของเวลาสูงสดุ เทา กบั 15 ชว่ั โมง การปรบั การทํางานของสเกล M-value อยูใน
ชว งรอ ยละ 0-30 สวนสเกล E-value อยูในชวงรอยละ 0-30

3.2!เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 140 A จํานวน 9 มิลลิลิตรลงไปในเซลวัด หรอื
เซลวัดอาจจะบรรจุอาหารเล้ียงเช้ือท่ียังไมไดฆาเช้ือแลวอาหารเล้ียงเช้ือ
ดังกลาวสามารถนาํ ไปฆา เชอ้ื โดยตรงในเซล

3.3!ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มิลลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

3.4!เติมตัวอยางนํ้านมทผ่ี า นการทําใหเ ซลคืนตัวแลว จํานวน 10 มิลลิลิตรลงไปใน
เซลวัดและผสม เขยา ใหเ ขา กนั อยา กลบั หวั กลบั ทา ยของเซล

3.5!ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ช่ัวโมงการวดั แตละเซลจะเรมิ่ โดยอตั โนมัติ

4.! การประเมนิ ผล
ผลทางบวกทเ่ี พม่ิ ขน้ึ ของคา E-value รอยละ 10 โดยสังเกตการเจริญเติบโตใน
ลักษณะ Growth curve ภายในเวลาที่จาํ กัดไว 15 ชว่ั โมงแสดงวา มกี ารปนเปอ น
เชื้อ Enterobacteriaceae ในตัวอยาง การทดสอบยนื ยนั ตวั อยา งอาจจะใชอ าหาร
เลี้ยงเชื้อ VRBA (Violet Red Bile Agar) ในการเลี้ยงเชื้อดวยวิธีปกติ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 202

การตรวจสอบ Total Microbial activity
ในเนอ้ื และผลติ ภณั ฑเ นอ้ื โดยใช Impedance method

มีขั้นตอนการตรวจสอบดังน้ี
1. อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชคือ Bimedia 001 A หรอื 002 A (General impedance broth)
2! การวัดดําเนนิ การดงั น้ี

2.1! เซทเครื่องมือวัด Impedance ดังน้ี อุณหภูมิของเครื่องเทากับ 30 องศา

เซลเซยี ส Threshold value ท่ีแนะนําควรเซทท่ี คา M-value ที่รอยละ 5 และ
เซทขีดจํากัดของเวลาสงู สดุ เทา กบั 24 ชว่ั โมง ปรบั การทํางานของสเกล
M-value ในชวงรอยละ 0-30 สวนคา E-value ในชว งรอยละ 0-60
ขอสังเกต: ทวนสอบการเลือกคา Threshold value ที่เลือกเมื่อทาํ มาตรฐานของ
เสนสหสัมพันธ กอ นเรม่ิ การวดั
2.2!ผสมเน้ือ 10 กรมั ลงในสารละลายเกลอื แกงเขม ขน รอ ยละ 0.9 จาํ นวน 90
มิลลิลิตร และทําการปน ใหเ ปน เนอ้ื เดยี วกนั ใน Stomacher Lab-blender นาน
2-3 นาที
2.3!เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 001 A หรอื Bimedia 002 A (ถาจําเปน ควรทํา
ใหอุนที่อุณหภูมิหอง) จํานวน 9 มิลลิลิตรในเซลวัด หรอื เซลวดั อาจจะบรรจุ
อาหารเลี้ยงเช้ือท่ียังไมไดฆาเชื้อแลวอาหารเลี้ยงเชื้อดังกลาวสามารถนําไปฆา
เชื้อโดยตรงในเซล
2.4! ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มลิ ลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

2.5!เติมตัวอยา งจาํ นวน 1 มิลลิลิตรลงไปในเซลวัดและผสม เขยา ใหเ ขา กนั อยา กลบั
หัวกลับทายของเซล เม่ือจะสรา งมาตรฐาน ทุกตัวอยางควรจะทดลอง 2 ซ้าํ

2.6! ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ช่วั โมงการวัดแตละเซลจะเร่มิ โดยอัตโนมตั ิ

4.! การประเมนิ ผล
ผลในดา นปรมิ าณ : ถามีการสรางกราฟมาตรฐานของเชื้อไวกอนแลว แลวคา
Colony Forming Unit (CFU) จะถูกคํานวณทนั ทที ม่ี สี ญั ญาณของ Impedance
เกินคา Threshold value ที่ถูกเลือกในเบื้องตน
อาหารเลี้ยงเชื้อสําหรบั ใชส รา งมาตรฐานของเชอ้ื ทต่ี อ งการตรวจสอบ แนะนําใหใ ช
อาหารเลย้ี งเชอ้ื PCA (Plate Count Agar) ในการทํามาตรฐานจําเปน ตอ งใช
ตัวอยางอยา งนอ ยประมาณ 100 ตัวอยา ง และจํานวนจุลินทรียในตัวอยางที่ใชควร
จะคลุมชวงอยางนอย 4 ชวงบน Logarithmic scale

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 203

การทดสอบกลั่นกรองสําหรบั Enterobacteriaceae
ในเนอ้ื บดโดยวธิ ี Impedance method

ก า ร ต ร ว จ ส อ บ ตั ว อ ย  า ง เ นื้ อ บ ด ว  า มี ก า ร ป น เ ป   อ น จ า ก เ ชื้ อ จุ ลิ น ทรี ย  ป ร ะ เ ภ ท
Enterobacteriaceae หรือไม (ตรวจพบหรือไมพ บ) เปน วธิ กี ารทม่ี ปี ระโยชนอ ยา งมากในการ
กลั่นกรองตัวอยางที่มีจาํ นวนมากๆกอ น ซง่ึ จะทําใหไ มเ สยี เวลาในการทดสอบในรายละเอยี ด
และสามารถทันการในการนําสินคาดังกลาวออกจําหนา ย ซง่ึ มขี น้ั ตอนดงั ตอ ไปน้ี

1.! อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทใ่ี ช ไดแกอาหารเลยี้ งเชอ้ื Bimedia 140 A (Enterobacteriaceae
media)

2.! การเตรียมตัวอยาง นําเนอ้ื บด 25 กรมั + สารละลาย Buffered peptone water
จํานวน 225 มิลลิลิตร และปนใน Stomacher

3.! การวัดโดยใช Impedance method ดําเนินการดงั น้ี

3.1! เซทอุณหภมู ขิ องเครอ่ื งท่ี 37 องศาเซลเซยี ส คา Threshold value ท่ีแนะนํา
คือรอยละ 10 ของคา E-value กอนและรอยละ 5 ของคา M-value และขีด
จํากัดของเวลาสูงสุดเทากับ 20 ช่ัวโมง การปรบั การทํางานของสเกล M-value
อยูในชวงรอยละ 0-30 สวนสเกล E-value อยูในชวงรอยละ 0-30

3.2! เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 140 A จํานวน 9 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัด หรอื
เซลวัดอาจจะบรรจุอาหารเล้ียงเช้ือท่ียังไมไดฆาเช้ือแลวอาหารเล้ียงเช้ือ
ดังกลาวสามารถนาํ ไปฆา เชอ้ื โดยตรงในเซล

3.3! ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มลิ ลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

3.4! เติมสารละลายตวั อยา งจํานวน 1 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัดและผสม เขยา ใหเ ขา
กันอยากลับหัวกลับทายของเซล

3.5! ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ช่วั โมงการวัดแตละเซลจะเรมิ่ โดยอตั โนมตั ิ

4.! การประเมนิ ผล
ผลทางบวกทเ่ี พม่ิ ขน้ึ ของคา E-value รอยละ 10 โดยสังเกตการเจริญเติบโตใน
ลักษณะ Growth curve ภายในเวลาที่จาํ กัดไว 20 ชว่ั โมงแสดงวา มกี ารปนเปอ น
เช้อื Enterobacteriaceae ในตัวอยาง การทดสอบยนื ยนั ตัวอยา งอาจจะใชอ าหาร
เลี้ยงเชื้อ VRBA (Violet Red Bile Agar) ในการเลี้ยงเชื้อดวยวิธีปกติ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 204

การตรวจสอบ Salmonella กบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื Selenite-Cystine
Media (Easter-Gibson Media) โดยวิธี Impedance method

การตรวจสอบเชอ้ื Salmonella โดยใชเ ทคนิค Impedance method มีขน้ั ตอนดงั ตอ ไปน้ี
1.! อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช ถามีการใชอาหารเลี้ยงเชื้อเดี่ยวเพื่อการตรวจสอบ มกั นยิ มใช

อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 205 A ( ดดั แปลงมาจาก EASTER-GIBSON media)
2.! ข้ันตอนเบอ้ื งตน ในการทําใหเ ซลสมบรู ณ (Pre-enrichment) อาหารเลย้ี งเชอ้ื

มาตรฐานทใ่ี ชใ นการทําใหเ ซลสมบรู ณไ ดแ ก Buffered peptone water เพื่อใหการ
เกิดสัญญาณของ Impedance กับตวั อยา งในอาหารเลี้ยงเช้ือ Bimedia 205 A
อาจจะใช Pre-media 205 A ในตัวอยา งทง้ั หมดสาํ หรบั Pre-enrichment
ตัวอยางการทํา Pre-enrichment

• เนอ้ื : นําตัวอยางเนื้อ 25 กรมั + สารละลาย Buffered peptone water จํานวน
225 มิลลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A และทําการปน เปน เนอ้ื เดยี วกนั ใน
Stomacher

• หนัง เชน หนงั ไก: แชช น้ิ สว นของหนงั (~ 8x8 เซนติเมตร) ในสารละลาย
Buffered peptone water จํานวน 100 มลิ ลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A ใน
ถุงพลาสติก และกวนหรือคน

• นมผง: ผสมนมผง 25 กรมั ในสารละลาย Buffered peptone water จํานวน 225
มลิ ลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A

•ผลิตภัณฑอื่นๆ ทั่วไป: ตัวอยาง 25 กรมั + สารละลาย Buffered peptone water
จํานวน 225 มิลลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A
สํ าห รั บตัวอยางแหงหรือผงจะทํ าใหเซลคืนตัวไดโดยการนํ าตัวอยางผสมกับ
Pre-enrichment media และทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง นาน 1 ชว่ั โมง ทง้ิ ใหเ ซลจลุ นิ ทรยี 
เกิดการคืนตัว
3.! การบม เพาะเชอ้ื Pre-enrichment broth บมเพาะเชื้อตัวอยางที่ปนแลวใน
Pre-enrichment broth ท่ี 37 องศาเซลเซียส นาน 16-18 ชว่ั โมง
4.! การวัดโดยใช Impedance method ดําเนินการดงั น้ี
4.1! กําหนดให Bimedia 205 A สมดุลเปน เวลานาน 12 ชว่ั โมง โดยตั้งทิ้งไวที่

อุณหภูมหิ อง
4.2! เซทอุณหภมู ขิ องเครอ่ื งท่ี 37 องศาเซลเซียส คา Threshold value ท่ีแนะนํา

คือรอยละ 5 ของคา M-value และคา E-value ควรจะมกี ารเพม่ิ ทนั ที
เชนเดียวกับคา M-value และขีดจํากดั ของเวลาสงู สดุ เทา กบั 24 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 205

การปรับการทํางานของสเกล M-value อยูใ นชวงรอยละ 0-30 สวนสเกล
E-value อยูใ นชวงรอยละ 0-50
4.3! เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 205 A จํานวน 10 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัด
4.4! ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มิลลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

4.5! เติมตัวอยางที่ Pre-enrichment แลว จาํ นวน 0.1 มิลลิลิตรลงไปในเซลวัดและ
ผสมอยางระมดั ระวงั เขยา ใหเ ขา กนั อยา กลบั หวั กลบั ทา ยของเซล

4.6! ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ชั่วโมงการวดั แตละเซลจะเริ่มโดยอัตโนมตั ิ

5.! การประเมนิ ผล
ผลทางบวกทเ่ี พม่ิ ขน้ึ ของคา M-value รอ ยละ 5 โดยสังเกตการเจริญเติบโตใน
ลักษณะ Growth curve ภายในเวลาที่จาํ กัดไว 24 ชว่ั โมงแสดงวา มกี ารปนเปอ น
เชือ้ Salmonella ในตัวอยาง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 206

การตรวจสอบ Salmonella กบั อาหารเลย้ี งเชอ้ื รว มสองชนดิ
(Rappaport-Vassiliadis & Easter-Gibson Media)
โดยวิธี Impedance method

การตรวจสอบเชอ้ื Salmonella โดยใชเทคนคิ การใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื รว มสองชนดิ ( Two
Impedance media) มีขน้ั ตอนดงั ตอ ไปน้ี

1.! อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชคือ Bimedia 201 B (ดัดแปลงมาจาก Rappaport-Vassiliadis
Media) และ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 205 A ( ดัดแปลงมาจาก Easter-Gibson
Media)

2.! ข้ันตอนเบอ้ื งตน ในการทําใหเ ซลสมบรู ณ (Pre-enrichment) อาหารเลย้ี งเชอ้ื
มาตรฐานทใ่ี ชใ นการทําใหเ ซลสมบรู ณไ ดแ ก Buffered peptone water เพื่อใหการ
เกิดสัญญาณของ Impedance กับตวั อยางในอาหารเลยี้ งเชอ้ื Bimedia 205 A
อาจจะใช Pre-media 205 A ในตวั อยา งทงั้ หมด( ทง้ั Bimedia 201 B และ 205A )
สําหรบั Pre-enrichment
ตัวอยา งการทํา Pre-enrichment

• เนอ้ื : นําตัวอยางเนื้อ 25 กรมั + สารละลาย Buffered peptone water จํานวน
225 มิลลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A และทําการปน เปน เนอ้ื เดยี วกนั ใน
Stomacher

• หนงั เชน หนงั ไก: แชช น้ิ สว นของหนงั (~ 8x8 เซนติเมตร) ในสารละลาย
Buffered peptone water จํานวน 100 มลิ ลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A ใน
ถุงพลาสติก และกวนหรือคน

• นมผง: ผสมนมผง 25 กรมั ในสารละลาย Buffered peptone water จํานวน 225
มลิ ลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A

•ผลิตภัณฑอื่นๆ ทั่วไป: ตัวอยา ง 25 กรมั (มิลลิลิตร) + สารละลาย Buffered
peptone water จํานวน 225 มลิ ลิลิตร หรอื ใช Pre-media 205 A
สํ าห รั บตัวอยางแหงหรือผงจะทํ าใหเซลคืนตัวไดโดยการนํ าตัวอยางผสมกับ
Pre-enrichment media และทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง นาน 1 ชว่ั โมง ทง้ิ ใหเ ซลจลุ นิ ทรยี 
เกดิ การคนื ตวั
3. การบม เพาะเชอ้ื Pre-enrichment broth บมเพาะเชื้อตัวอยางที่ปนแลวใน
Pre-enrichment broth ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส นาน 16-18 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 207

4. การวดั โดยใช Impedance method ดําเนินการดงั น้ี
4.1! กําหนดให Bimedia 201 B สมดุลเปน เวลานาน 12 ชว่ั โมง โดยตั้งทิ้งไวที่
อุณหภมู หิ อง
4.2! เซทอณุ หภมู ขิ องเครอ่ื งท่ี 40 องศาเซลเซยี ส คา Threshold value ท่ีแนะนํา
คือรอยละ 15 ของคา E-value และขีดจํากดั ของเวลาสงู สดุ เทา กบั 24 ชว่ั โมง
การปรับการทํางานของสเกล M-value อยูในชวงรอยละ 0-20 สวนสเกล
E-value อยูในชวงรอยละ 0-80
4.3! เตมิ อาหารเลย้ี งเชอ้ื Bimedia 201 B จํานวน 10 มลิ ลิลิตรลงไปในเซลวัดที่ฆา
เชื้อแลว
4.4! ทําเซล Blank (Negative control) โดยการวางเซลวัดที่เติมเฉพาะอาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทใ่ี ชจ ํานวน 10 มิลลิลิตร(ไมเติมตัวอยาง)

4.5! เติมตัวอยางที่ Pre-enrichment แลว จํานวน 0.1 มิลลิลิตรลงไปในเซลวัดและ
ผสมอยางระมัดระวัง เขยา ใหเ ขา กนั อยา กลบั หวั กลบั ทา ยของเซล

4.6! ทําการวางเซลวัดตอครั้งของการวัดเขาไปในเครื่องวัด หลังจากวางเซลวัดไป
ได 1 ชวั่ โมงการวัดแตละเซลจะเร่ิมโดยอตั โนมตั ิ

5.! การประเมนิ ผล
ผลทางบวกทเ่ี พม่ิ ขน้ึ ของคา E-value รอ ยละ 15 โดยสังเกตการเจรญิ เติบโตใน
ลักษณะ Growth curve ภายในเวลาที่จาํ กัดไว 24 ชว่ั โมงแสดงวา มกี ารปนเปอ น
เช้อื Salmonella ในตัวอยาง

6.! ทดสอบยนื ยนั ตวั อยา งทม่ี ผี ลทางบวกของ Salmonella
อาหารเล้ยี งเชือ้ ทีป่ กติใชเพื่อการทดสอบยนื ยนั การพบเชื้อ Salmonella ในตัวอยาง
ไดแก Bismuth Sulfite Agar, BPLS Agar, Rambach Agar, SMID Agar และ
XLD Agar เพ่ือทดสอบยนื ยนั การปนเปอ นของ Salmonella การใชอาหารเลี้ยงเชื้อ
รวมกัน 2 ชนดิ (อาหารเลย้ี งเชอ้ื ชนดิ หนง่ึ มคี วามจําเพาะทส่ี งู สวนอีกชนิดมี
ความจําเพาะที่นอยกวา) เชน การใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื Bismuth Sulfite Agar กับ
XLD Agar หลงั จากนนั้ ใชลูปแตะตัวอยา งโดยตรงจากเซลวัดในเคร่ืองมอื วดั
Impedance และ Streak บนอาหารเลี้ยงเชื้อดังกลาวทั้งสองชนิด โดยใชล ูปเดยี ว
และตามดวยการอานผลที่ได และข้นั ตอนตอ ไปจะทําการศกึ ษาทาง Serological
และ Biochemical test

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 208

การใชแ ผน เพาะเชอ้ื ชนดิ แหง ในการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี 

การใชแผนเพาะเชื้อท่ีประกอบดวยอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแหงนี้เปนวิธีท่ี
สะดวกสําหรับตรวจสอบการปนเปอนของจุลินทรียในสภาพแวดลอมและในอาหาร
โดยเปนทร่ี จู กั กนั ในทางการคา วา Petrifilm ซึ่งสามารถใชไดดีทั้งในการทํา Air
sampling, Direct contact และ Swab contact ในวิธีดังกลาวนี้สามารถใชไดกับ
Diluent หลายชนดิ เชน Standard method buffer, Bufferfields buffer, Peptone
water รอ ยละ 0.1 และ Letheen broth ในกรณีที่มีนํ้ายาทําความสะอาดอยใู นบรเิ วณ
ท่ีจะทําการตรวจมเี งอ่ื นไขวา หา มใช Diluent ท่ีมีองคป ระกอบของ Thiosulphate
หรอื Sodium citrate

วิธีการสมุ ในอากาศ (Air sampling method) วิธีนใ้ี ชใ นการตรวจสอบ
สภาพสิ่งแวดลอมแบบการสุมในอากาศ สามารถจดั วางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ได
ทั้งในแนวนอนและแนวตั้ง โดยกอ นใชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื นใ้ี นการตรวจสภาพ
สิ่งแวดลอมควรทําใหแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื เกดิ การฟอรม เจลกอ น โดยใช Diluent ท่ี
เหมาะสมปรมิ าตร 1 มิลลิลิตร วางแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงไวอยางนอย 1 ชว่ั โมง
กอนนํามาใช

ในกรณีท่ีตอ งการจดั วางแผนอาหารเลี้ยงเชอ้ื ในแนวนอน ใหใชคลิปหนีบ
ขอบดานบนของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ใชเทปกาวสองหนาติดบนตัวคลิป แลวพับแผน
ฟลมดา นบนขน้ึ ไปตดิ กบั เทป ระวังอยาใหมือถูกบริเวณเจล เปด แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
แหง ทิ้งไว 15 นาที แลวจึงปดแผนฟลมกลับ นําไปบม เพาะเชอ้ื และอา นผล

ในกรณีท่ีตอ งการจดั วางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ในแนวดง่ิ ใหพบั แผน ฟลม ดา น
บนและใชเทปกาวติดแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหง ระวังอยาใหมือถูกบริเวณเจล

การแปลผลแบบ Air sampling method ผลที่ไดถือเปนตอพื้นที่ 40 ตาราง
เซนติเมตรสําหรบั แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Aerobic count และ Coliform count
และ E.coli count แตผลที่ไดถือเปนตอพื้นที่ 60 ตารางเซนตเิ มตรสําหรบั แผน อาหาร
เลย้ี งเชอ้ื ประเภท Yeast and Mold count

วิธกี าร Swab contact method วิธีการน้จี ะตอ งใชสารละลายท่สี ามารถใช
ชะลา ง Swab (rinse solution) ที่เขากับแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงนั้นๆได (ชนดิ ของ
Diluent ไดกลาวมาแลว ขา งตน ) โดยแนะนําวา ใหใ ช Swab สําลีมากกวา Swab แบบ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 209

Calcium alginate ถา จะใช Swab แบบ Calcium alginate ควรใช Letheen broth ท่ี
มี Sodium glycerophosphate รอ ยละ 1 เปน Rinse solution และ Solubilizing

วิธีการใหตวง Rinse solution ใสหลอดแกวฝาเกลียวใหไดปริมาตร 5
มิลลิลิตร หลังการฆาเชื้อแลว จากนน้ั จมุ ปลาย Swab ลงใน Rinse solution แลว
กดทับหลอดแกว ดา นในเพอ่ื รดี ไมใ หส ารละลายชมุ เกนิ ไป จรดปลาย Swab ทํามุม
ประมาณ 30 องศากับพื้นผิว ปาดพน้ื ผวิ ทต่ี อ งการตรวจสอบอยา งชา ๆ ใหทั่วถึงใน
ลักษณะขึ้นลงและซายขวา หลงั จากใช Swab ปาดพื้นผิวแลวหักปลาย Swab ใสใน
Rinse solution ปดฝาเกลียวและเขยาหลอดแกวแรงๆ 10 วินาที ปเปตสารละลาย 1
มิลลิลิตร ลงในแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื นําไปบม เพาะเชอ้ื และอานผล

การแปลผลแบบ Swab contact method จะคิดเปนจาํ นวนโคโลนที ง้ั หมดใน
พื้นท่ีท่ีทาํ การ Swab เทากับ จํานวนโคโลนที น่ี บั ไดค ณู ดว ยปรมิ าตรของ Diluent
ทใ่ี ช (มลิ ลิลิตร)

วิธกี าร Direct contact method เปนวธิ กี ารตรวจหาเชอ้ื จลุ ินทรยี ใ น

ตัวอยางตางๆโดยตรง โดยวิธีการดังกลาวจะตองเตรียมแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงให
เปน เจลลว งหนา ดว ยการใช Diluent ท่ีเหมาะสม 1 มลิ ลิลิตร เพื่อใหเกิดการฟอรม
เจลดี ควรเตรียมแผนอาหารเลี้ยงเชื้อลวงหนาอยางนอย 30 นาทสี าํ หรบั แผน อาหาร
เลย้ี งเชอ้ื ประเภท Aerobic count และ 1-2 ชว่ั โมงสําหรบั แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
ประเภท Coliform count หรอื E.coli count และเกบ็ แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทเ่ี ตรยี มให
เปนเจลแลวในถุงพลาสติก ปด ฝาถงุ ดว ยเทปกาวหรอื ทม่ี ซี ปิ ปด ปากถงุ ตอง
หลีกเลย่ี งจากแสงสวา ง และเกบ็ ในตเู ยน็ หรอื ทม่ี อี ณุ หภมู ิ 2-8 องศาเซลเซียส แผน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทใ่ี ชใ นการตรวจหา Aerobic count ท่ีเตรยี มแลวสามารถเกบ็ ไวใน
ตูเย็นไดถึง 14 วัน สวนแผนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดอื่นๆเก็บไวในตูเย็นไดถึง 7 วัน

สําหรับแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Yeast and Mold count ควรใช
Letheen broth เปน Diluent เม่ือจะทําการตรวจพน้ื ผวิ แบบ Direct contact นําแผน
อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใส Diluent แลวใสถุงพลาสติกปดปากถุงและนําไปบม ท่ี 30-37
องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ชว่ั โมง หลงั จากบม กน็ ําแผนอาหารเลี้ยงเชื้อใสในตูเย็น
อยางนอย 4 ชั่วโมงเพื่อใหเจลแข็งตัวดี แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทเ่ี ตรยี มดว ย Letheen
broth จะมีลักษณะเปนลายดางๆ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 210

วิธีการสุมตัวอยางพื้นผิวนั้นสามารถดาํ เนนิ การตามขน้ั ตอนดงั นค้ี อื คอยๆ
เปดแผน ฟล ม ดา นบน ระวงั อยาใหน ้ิวมอื สมั ผสั กบั เนอื้ เจล เนื้อเจลสวนใหญจะติดเปน
วงกลมอยกู บั แผน ฟล ม ดา นบน แตะเนื้อเจลบริเวณพื้นผิวที่ตองการตรวจสอบ ใชน ว้ิ
ลูบดานนอกของแผนฟลมดานบนเพื่อใหเนื้อเจลทั้งวงสัมผัสกับพื้นผิว ทาํ ความ
สะอาดพื้นผิวนั้นๆหลังการแตะกันเนื้อเจล ปด แผน ฟล ม ดา นบนกลบั นําไปบม เพาะ
เช้ือและนับจํานวนโคโลนตี ามวธิ ขี องแผนอาหารเลี้ยงเช้ือแตล ะชนดิ

การแปลผลแบบ Direct contact method ผลที่ไดถือเปนตอพื้นที่ 20 ตาราง
เซนติเมตร สําหรบั แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Aerobic count , Coliform count
และ E.coli count และผลที่ไดถือเปนตอพื้นที่ 30 ตารางเซนตเิ มตรสําหรบั แผน
อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Yeast and mold

วิธีการใชแผน อาหารเล้ยี งเช้อื แหง

การใชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง (Petrifilm plates) นี้สามารถดําเนนิ การได
ตามขั้นตอนตอ ไปน้ี

1.! แชเย็นแผนอาหารเลี้ยงเชื้อแหงที่ 4-8 องศาเซลเซียสสําหรบั ซองทย่ี งั ไม
ไดเปดใชง าน (อยา งไรกต็ ามแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง นม้ี อี ายกุ ารใชง าน
ตามที่บริษัทผูผลิตกําหนดเชน กนั ดงั นน้ั จงึ ตอ งดวู นั หมดอายทุ ร่ี ะบุ
บนขางซองดว ยกอ นการใชง านทกุ ครง้ั เสมอ)

2.! เม่ือตองการใชงานใหนําซองท่ีบรรจุแผนอาหารเลี้ยงเช้ือแหงมาตัด
ตามรอยประดา นเดยี ว

3.! หลังจากเปดซองแลวใหเก็บที่ 25 องศาเซลเซยี ส และความชนื้ สัมพทั ธ
ไมเกินรอยละ 50 หา มนําเขา ไปแชเ ยน็ อีกอยา งเดด็ ขาด (ซองที่เปดแลว
สามารถเก็บที่สภาพ 25 องศาเซลเซียส ความช้นื สัมพัทธนอยละ 50 ได
นาน 1 เดือน)

4.! เตรียมตัวอยางอาหารตามทก่ี ําหนดในวิธีการมาตรฐานทว่ั ไป
5.! สารละลายทเ่ี จอื จางตวั อยา งอาหารมดี งั น้ี Standard phosphate buffer,

Peptone water รอ ยละ 0.1, Sterile water, Phosphate buffered
saline และ Bufferfield’s buffer หามใช Buffers ที่มีองคประกอบของ
Sodium citrate หรอื Thiosulphate เดด็ ขาด
6.! วางแผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื บนแนวราบโดยใหแ ผน ฟล ม อยดู า นบน
7.! คอยๆปลอยสารละลายตวั อยา ง 1 มิลลิลิตรในแนวตั้ง พยายามให
สารละลายตกอยูเหนือตรงกลางแผนเล็กนอย

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 211

8.! สําหรับแผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไมคํานึงถึงฟองอากาศก็ใหปลอยแผนฟลม
ลงไดทนั ทเ่ี ชน แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Aerobic count plates หรอื
Yeast and mold count plates เปนตน สว นทต่ี อ งระมดั ระวงั การมผี ล
กระทบเนื่องจากฟองอากาศก็ใหคอยๆปลอยแผนฟลมดานบนลงอยาง
ชาๆเพอ่ื ปอ งกนั การเกดิ ฟองอากาศ เชน แผน อหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท
Coliform count plates หรอื E.cloi count plates เปนตน

9.! วาง Spreader ลงบนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื สําหรบั Aerobic count
plates ใช Spreader ดานที่มีชองรูปวงกลม สาํ หรบั Coliform และ
E.coli count plates ใช Spreader ดานเรียบ สําหรบั Yeast and mold
count plates ใช Spreader พิเศษที่เหมาะสม

10.!คอยๆ ใชน้วิ ชี้หรือนวิ้ หวั แมมอื กดตรงกลาง Spreader เพื่อใหสารละลาย
กระจายตัวเต็มวงกลม (อยาใชแรงกดบิดหรือเคลื่อน Spreader ไปมา)

11.!ยก Spreader ออก ทง้ิ ไวป ระมาณ 1 นาทีเพื่อรอใหวุนแข็งตัว
12.!นําแผนอาหารเลี้ยงเชื้อเรียงซอนกันไดสูงสุดไมเกิน 20 แผน สาํ หรบั

Aerobic counts ทําการบมเพาะเชื้อท่ี 32-35 องศาเซลเซียส นาน 48
ช่ัวโมง สาํ หรบั Coliform counts ทําการบม เพาะเชื้อท่ี 32-35 องศา
เซลเซียส นาน 24 ชว่ั โมง สําหรบั E.coli counts ทําการบม เพาะเชอ้ื ท่ี
32-35 องศาเซลเซียส นาน 24-48 ชว่ั โมง และสําหรบั Yeast and mold
counts ทําการบมเพาะเชื้อที่ 21-25 องศาเซลเซียส นาน 3 วัน และ 5
วัน
13.!อานผลและคํานวณจํานวนโคโลนตี อตวั อยา งตามวิธีการมาตรฐาน

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 212

วธิ ใี ชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในการตรวจสอบ
Aerobic count plates ในอาหาร

หลักการ :

วิธีนี้ใหอ าหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบดวยอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแหง และเจลที่
ละลายไดในนํ้าเยน็ เตมิ ตวั อยา งทเ่ี ตรยี มโดยเจอื จางหรอื ไมเ จอื จางปรมิ าตร 1
มิลลิลิตร ลงในแผน เพาะเชอ้ื แรงกดบนแผนพลาสติกซึง่ วางทับแผน แผนฟลม แผน
บน จะทําใหตัวอยา งแผก ระจายในบรเิ วณทจ่ี ะใหเ ชอ้ื เจรญิ เตบิ โตเปน พน้ื ทป่ี ระมาณ
20 ตารางเซนตเิ มตร หลังจากพักไวสักครู เจลจะแขง็ ตวั และแผน เพาะเชอ้ื จะถกู นํา
ไปบมและตรวจนบั จํานวนเชื้อตอไป อปุ กรณท ส่ี ามารถใชใ นการเตมิ ตวั อยา งลงใน
แผนเพาะเชื้อไดแก ปเ ปต ปเปตแบบตอเนื่อง หรือปเปตแบบอัตโนมัติ สว นการเกบ็
รักษาแผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื นน้ั ซองแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทย่ี งั ไมไ ดเ ปด ใชใ หแ ชเ ยน็ ท่ี
อุณหภูมิ 4-8 องศาเซลเซียส และซองที่เปดแลวแตใชไมหมดใหเก็บที่อุณหภูมิหอง
ไดไมเกนิ 1 เดือน หา มนําเขา แชเ ยน็ อีกเดด็ ขาด

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยาง :
ขอแนะนําในการเตรยี มสารละลายเจอื จาง (Dilution water) เพอ่ื เปน การ

เตรยี ม Stock solution ใหละลาย KH2PO4 จํานวน 34 กรมั ในน้าํ 500 มิลลิลิตร และ
ปรบั pH เปน 7.2 ดวย 1N NaOH (ประมาณ 175 มลิ ลิลิตร) และเจอื จางเปน 1 ลิตร
ดวยน้ํากลั่น เพื่อเตรียม Buffer water สําหรับใชเจอื จาง ใหทําการเจอื จาง Stock
solution 1.25 มิลลิลิตร เปน 1 ลิตรดวยนาํ้ กลั่น และฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส
นาน15 นาที

เตรียมตัวอยางอาหารตามแบบการเจอื จางอนกุ รมใหเ หมาะสม โดยใช
สารละลายเจือจางตวั อยา งที่เปน Standard phosphate buffer, Peptone water
รอยละ0.1, Sterile water, Phosphate buffered saline และ Bufferfield’s buffer
หา มใช Buffers ที่มีองคประกอบของ Sodium citrate หรอื Thiosulphate เพราะมี
ผลยับยง้ั การเจรญิ เตบิ โตของเชอ้ื จลุ นิ ทรยี 

การวิเคราะห :
ใหวางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง บนพน้ื ราบ ใหแ ผน ฟล ม ดา นใสอยขู า งบน

ปเปตสารละลายตวั อยา ง 1 มลิ ลิลิตร เปด แผน ฟล ม แผน บนขน้ึ อยา งชา ๆ และคอยๆ
ปลอยสารละลายตัวอยางลงตรงกลางแผน ปลอยแผนฟลมลง วาง Spreader ลงบน
แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื โดยใหดา นที่มีรอ งวงกลมคว่ําหนา ลง คอยๆใชนิ้วชี้กดลง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 213

ตรงกลาง Spreader จนเห็นสารละลายกระจายเตม็ วงกลม อยาบิดหรือเลื่อน
Spreader ไปมา ยก Spreader ออก ทิ้งแผนอาหารเลี้ยงเชื้อไว 1 นาทีกอนเคลื่อน
ยายเพื่อใหวุนแข็งตัว บม แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Aerobic count plates
ท่ี 35+1 องศาเซลเซยี ส นาน 48+3 ช่ัวโมง ในการบม เพาะเชอ้ื ใหว างแผน อาหาร
เล้ียงเช้ือแหงน้ใี นตําแหนง ราบกบั พน้ื ใหส ว นใสขน้ึ บนและสามารถเรยี งซอ นแผน
อาหารเลี้ยงเชื้อไดไมเกิน 20 แผน อา นผลหลงั จากเสรจ็ สน้ิ การบม เพาะเชอ้ื โดยนบั
โคโนนีสีแดงทุกโคโลนี (ชว งทเ่ี หมาะสมคอื 30-300 โคโลนี) และคํานวณจํานวน
แบคทีเรีย โดยการคณู จํานวนโคโลนีทั้งหมดตอแผน (หรอื คา เฉลย่ี จํานวนโคโลนตี อ
แผนถาการนับเปนการทําซา้ํ ในระดบั การเจอื จางเดยี วกนั ) ดวย (1/ ระดบั การเจอื จาง
ท่ีใช) เมื่อนับจํานวนโคโลนใี นแผน ซ้ําของระดบั การเจอื จางตา งๆกนั ใหคํานวณคา
เฉล่ียของจํานวนโคโลนีของแตละระดับการเจือจางกอนจําคํานวณคาเฉล่ียจํานวน
แบคทีเรียเปน จํานวน cfu/ml หรือ cfu/g การนับโดยประมาณสามารถกระทําไดบ น
แผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีจาํ นวนโคโลนมี ากกวา 300 โคโลนี และควรจจะรายงานเปน
การนับโดยประมาณ ในการกระทําดงั กลา วพน้ื ทก่ี ารเจรญิ ของเชอ้ื สามารถถกู นํามา
พิจารณาเพื่อใหไดพื้นที่ประมาณ 20 ตารางเซนตเิ มตร เพอ่ื การจําแนกโคโลนที ม่ี ี
ความสนใจตอไปสามารถกระทําไดเ ชน กนั โดยการยกสว นบนของฟล ม ออก และเก็บ
ตัวอยางโคโลนที ส่ี นใจจากเจล อยา งไรกต็ ามหลงั จากเสรจ็ สน้ิ การบม เพาะเชอ้ื แลว

แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื อาจจะถกู เกบ็ ในสภาพแชแ ขง็ (≤ -15 องสาเซลเซียส) ถึง 7 วัน
เพ่ือหลีกเลย่ี งการปฏบิ ตั กิ ารประจําวนั

ขอแนะนําในการอา นผลของ Aerobic count plate

1.! จํานวนโคโลนีเปน 0 เมอ่ื แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ไมม โี คโลนขี องจลุ นิ ทรยี 
เลย

2.! จํานวนโคโลนเี ปนเลขหลักสิบ แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื กจ็ ะปรากฏโคโลนี
ของจุลนิ ทรยี อ ยเู ลก็ นอ ย อนิ ดเิ คเตอรยอ มสีโคโลนใี หเปน สแี ดง ใหน บั
จํานวนโคโลนีท่ีติดสแี ดงทง้ั หมดไมว า จะมขี นาดเลก็ หรอื ใหญห รอื มสี แี ดง
เขมหรือแดงออน อาจจะใชเ ครอ่ื งนบั โคโลนมี าตรฐานเปน เครอ่ื งชว ยนบั

3.! จํานวนโคโลนีที่อยูในชวง 25-250 โคโลนี กส็ ามารถดาํ เนนิ การนบั
เชนเดียวกบั วธิ ีมาตรฐานทัว่ ไป

4.! จํานวนโคโลนีท่ีมากกวา 250 โคโลนี ถาพบวาจํานวนโคโลนมี ากกวา
250 โคโลนีใหทําการนบั โดยประมาณ เลอื กนบั จํานวนโคโลนใี นหนง่ึ
ชองของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื (1 ตารางเซนตเิ มตร) เปนตัวแทนแลวคูณ
จํานวนที่นับไดดวย 20 กจ็ ะไดจ ํานวนโคโลนีทง้ั หมดในแผน อาหาร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 214

เล้ียงเช้ือโดยประมาณ บรเิ วณวงกลมทเ่ี ชอ้ื เจรญิ เตบิ โตมพี น้ื ทป่ี ระมาณ
20 ตารางเซนตเิ มตร
5.! ถาจํานวนโคโลนมี ากเกนิ ไปจนนบั ไมไ ดไ ดพ น้ื ท่ี 1 ตารางเซนตเิ มตร
ก็ระบุวามจี าํ นวนโคโลนีมากเกนิ วา จะนบั ได (TNTC)

ถามีจํานวนโคโลนีอยูหนาแนน มาก บรเิ วณเจลทม่ี กี ารเจรญิ ของเชอ้ื
จะเปลยี่ นเปนสีชมพู อาจจะสงั เกตเหน็ โคโลนีเปน จุดๆไดบ รเิ วณขอบ
วงกลมเทา นน้ั ในกรณนี ก้ี ใ็ หบ นั ทกึ ผลเปน TNTC

ในบางคร้ังโคโลนีดูจะกระจายตัวกันไมสมํ่าเสมอลักษณะเชนน้ีเปน
เคร่ืองบงชไ้ี ดอ กี อยา งวา มจี ํานวนโคโลนมี ากเกนิ กวา จะนบั ได ก็ให
บนั ทกึ ผลเปน TNTC

ในลักษณะของแผนอาหารเล้ียงเชื้อที่ดูเหมือนวาสามารถนับ
โคโลนีไดแตเม่ือสังเกตท่ีบริเวณของขอบวงกลมจะเหน็ วา มโี คโลนเี จรญิ
อยูห นาแนน ใหบ นั ทกึ ผลเปน TNTC
6. ในกรณีพิเศษ ทม่ี แี บคทเี รยี บางสายพนั ธสุ ามารถใชเ นอ้ื เจลของแผ
อาหารเล้ียงเช้ือไดหรือมีการสังเกตเปนลักษณะคลายเนื้อเจลละลาย
เมื่อเกิดปรากฏการณเชนนี้ ใหน บั จํานวนโคโลนใี นชอ งทไ่ี มเ กดิ การใช
เนื้อเจลดังกลาวสัก 2-3 ชอ งแลว ประมาณจํานวนทง้ั หมด ไมตองนับ
จํานวนโคโลนีสีแดงที่อยูบริเวณที่เกิดการใชของเนื้อเจล
7.! โคโลนีของแบคทีเรียในแผนอาหารเล้ียงเชื้อจะถูกยอมเปนสีแดงทําให
สามารถแยกแยะจากเศษของตัวอยาง ซงึ่ กอใหเ กิดความสบั สนในการ
อานจากการเลี้ยงเชื้อดวยวิธีดั้งเดิมที่อาจจะเกิดปญหาได

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 215

วธิ ใี ชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในการตรวจสอบ
Coliform and Escherichia coli counts ในอาหาร

หลักการ:

เชนเดยี วกบั การใชแ ผนอาหารเลีย้ งเชือ้ แหง ในการตรวจสอบ Aerobic count
plates ท่ีกลาวมาแลว ขา งตน

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยาง:

การเตรยี มสารละลายเจอื จางเพอ่ื Coliform count plate ก็เชนเดียวกับที่เคย
กลาวมาแลวในสวนของ Aerobic count plates แตสําหรบั E.coli count plate กต็ า ย
กับ Coliform count plate ดวยการเตมิ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyle-D-
glucuronide เปนดัชนบี ง ชข้ี องกจิ กรรมเอนไซม Gluconidase ซ่ึงเปนการดที ท่ี ําให
สามารถอา นผลไดท ง้ั Coliform และ E.coli ไดใ นแผน เดยี วกนั

การวิเคราะห :

สําหรบั Coliform count ใหวางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในแนวราบกบั พน้ื

ยกแผนฟลม ดา นบนขน้ึ และปเ ปตสารละลายตวั อยา ง 1 มลิ ลิลิตรลงไปที่ตาํ แหนง

กลางของแผนฟลม และระมดั ระวงั การวางของแผน บนของฟล ม ลงอยา งชา ๆ

กระจายตัวอยางใหดีบนพื้นที่เจลอาหารเลี้ยงเชื้อโดยการใช Spreader กดลงตรงสวน

เจลอาหารเลี้ยงเชื้อ (พยายามกดในแนวราบอยา บดิ หรอื เลอ่ื น Spreader ไปมา) วาง

แผนอาหารเลี้ยงเชื้อทิ้งไว 1 นาทีเพื่อใหเจลเซทตัวเปนวุนแข็ง นําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี

35 องศาเซลเซียส นาน 24+2 ชว่ั โมง

ในการบมเพาะเชื้อ แผนอาหารเลี้ยงเชื้อควรวางในตาํ แหนง ราบกบั พน้ื ดา น
ใสอยูดานบน และวางเรยี งซอ นกนั ไมเ กนิ 20 แผน การอา นผลจะทําเมอ่ื เสรจ็ สน้ิ การ
บมเพาะเชื้อ หลงั จากเสรจ็ สน้ิ การบม เพาะเชอ้ื แลว แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื สามารถ

เกบ็ ไวใ นสภาพแชแ ขง็ (≤ -15 องสาเซลเซยี ส) ถึง 7 วันเพื่อหลีกเลี่ยงการปฏิบัติการ
ประจําวนั นับจํานวนโคโลนีโดย Coliforms จะปรากฏเปนโคโลนีสีแดงที่มีฟองกาซ
อยูดวย (1หรอื มากกวา 1 ฟองกาซ) อา นโคโลนที ง้ั หมดในชว ง 15-150 โคโลนี
โคโลนีสีแดงทไ่ี มม ฟี องกา ซจะไมถ กู นบั เปน จลุ นิ ทรียประเภท Coliforms การนับ
จํานวนโคโลนีของ Coliforms บนแผนเพาะเชอ้ื สามารถทําไดง า ยมาก อินคิเคเตอรจ ะ
ยอมสีทุกโคโลนีในแผนอาหารเลี้ยงเชื้อใหเปนสีแดง แผน ฟล ม แผน บนจะดกั ฟองกา ซ
ซง่ึ Coliforms ผลิตไว ดงั นน้ั โคโลนจี ะตดิ สแี ดงและมฟี องกา ซอยูดว ย (คลา ยปก
ผีเสื้อ) โคโลนที ไ่ี มใ ช Coliforms จะติดสีแดงแตไมมีฟองกาซติดอยู ฟองอากาศเลก็ ๆ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 216

ที่กระจายอยูทั่วแผนเจลเปนลักษณะปกติของแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ ซง่ึ ไมไ ดเ กดิ จาก
Coliforms ขนาดของฟองอากาศจะเล็กกวาฟองกาซที่ผลิตโดย Coliforms มาก ไม
ตองนับโคโลนีที่ปรากฏบนของโฟมเพราะโคโลนีเหลานี้เจริญเติบโตอยูนอกสภาวะท่ี
กําหนดไว

สําหรบั E.coli count ใช E.coli count plate และดําเนนิ การเชน เดยี วกบั การ
ทําใน Coliform count plate แตบม เพาะเชอ้ื นานเปน 48+4 ชว่ั โมงทอ่ี ณุ หภมู ิ 35
องศาเซลเซียส โคโลนีของ E.coli จะปรากฏเปนสีน้ําเงนิ ทม่ี ฟี องกา ซอยดู ว ย สวน
โคโลนีของ Coliforms จะปรากฏเปนโคโลนีสีแดงที่มีฟองกาซ แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
ประเภทน้ีมีสวนประกอบพน้ื ฐานเชน เดยี วกบั แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Coliform
count plates แตเพิ่มสียอมกลูคิวโรนิเดส (Glucuronidase indicator dye) เอนไซม
ดังกลาวผลิตไดโดย E.coli สวนใหญจ ะทําปฏิกิริยากับอินเคเตอรดังกลาวและเกิด
ตะกอนสีน้ําเงินรอบๆโคโลนี (แตบ างสายพนั ธุไ มผ ลิตเอนไซมดังกลาว ดงั นน้ั จะไม
เกิดตะกอนสีนํ้าเงนิ รอบโคโลนไี ด) นอกจากน้ี E.coli สวนใหญยังผลิตกาซ ซง่ึ จะถกู
ดักไวโดยแผน ฟล ม แผน บน ดงั นน้ั ใหน บั โคโลนที ต่ี ดิ สนี ้ําเงนิ และมฟี องกา ซเปน
E.coli

ขอแนะนําการอา นผลของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Coliform

count plate

1.! ใหสังเกตการเปลี่ยนแปลงสีของเจล เมอ่ื จํานวนของ Coliforms มากขึ้น
สีของเจลจะเปลย่ี นจากสชี มพอู อ นเปน สชี มพเู ขม ขน้ึ

2.! แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท Coliform count plate ควรจะมชี ว งการนบั
ระหวาง 15-150 โคโลนี เชน เดยี งกบั การใช Violet red bile agar (วิธี
มาตรฐานทั่วไป)

3.! เม่ือมีจํานวนโคโลนีมากกวา 150 โคโลนี ใหน บั โดยประมาณ โดยเลือก
นับโคโลนใี นหนง่ึ ชอ งบนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื (1 ตารางเซนตเิ มตร) คูณ
ดวย 20 จะไดจาํ นวนโคโลนที ง้ั หมดในแผน โดยประมาณ ทง้ั นพ้ี น้ื ทท่ี ่ี
เช้ือเจรญิ ประมาณ 20 ตารางเซนตเิ มตร

4.! แผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีจาํ นวนโคโลนมี ากเกนิ กวา ทจ่ี ะนบั ได (TNTC) มี
ลักษณะทั่วไปดังนี้ (1) มีโคโลนีเล็กๆจํานวนมาก (2) มฟี องกา ซจํานวน
มาก และ (3) มสี เี จลเขม ขน้ึ
ถาจํานวนโคโลนีหนาแนนมากจนไมสามารถแยกตัวออกมาเปน
โคโลนีเดี่ยวๆ กับฟองกาซได สขี องพน้ื ทเ่ี จลท่ีเขม ขน้ึ แสดงวา ผลทไ่ี ด
เปน TNTC

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 217

ขอแนะนําการอา นผลของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท E.coli count

plate

1.! ใหสังเกตสีของเจล เมอ่ื มจี ํานวนของ E.coli มากขึ้น สขี องเจลจะเปลย่ี น
เปนสนี ้ําเงนิ อมมว ง

2.! ชวงของการนับทเ่ี หมาะสมอยใู นชว ง 15-150 โคโลนี ถา มสี นี ้าํ เงนิ แทรก
อยูในโคโลนใี ดก็ตามใหน บั เปน E.coli

3.! เมื่อมีจํานวน E.coli มากกวา 150 โคโลนี ใหทําการนบั โดยประมาณ
โดยเลือกนับโคโลนีในหนึ่งชองของแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ (1 ตาราง
เซนติเมตร) คูณดวย 20 กจ็ ะไดจ าํ นวนโคโลนที ง้ั หมดในแผน อาหาร
เล้ียงเชอ้ื โดยประมาณ

4.! แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทม่ี จี ํานวนโคโลนขี อง E.coli มากเกนิ กวา จะนบั ได
(TNTC) มีลักษณะทว่ั ไปดงั น้ี (1) มโี คโลนเี ลก็ ๆมากมาย (2) มฟี องกา ซ
มากมาย และ (3) เจลเปลย่ี นเปน สนี ้ําเงนิ อมมว ง
จํานวนโคโลนีหนาแนนมากจนไมสามารถแยกตัวออกมาเปนแตละ
โคโลนีและฟองกา ซได เจลจะเปลย่ี นเปน สนี ้ําเงินอมมวงแสดงผลวาเปน
TNTC

การสังเกตฟองกาซ ในรปู แบบตา งๆทอ่ี าจจะเกดิ ขน้ึ บนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
บางคร้ังฟองกา ซทําใหโ คโลนแตกเกิดเปนเสน ตามขอบฟองกา ซน้ันๆ ใหน ับโคโลนีท่ี
มีฟองกาซตดิ อยหู รอื มฟี องกา ซอยใู นรศั มไี มเ กนิ 1 โคโลนี นอกจากนเ้ี ศษอาหารท่ี
อาจจะปะปนในตัวอยา งมรี ปู รา งแตกตา งจากโคโลนแี บคทเี รยี ซง่ึ มกั เปน จดุ ๆ และไม
มีฟองกาซติดอยูอีกดวย อยางไรก็ตามอาจจะมฟี องอากาศปลอมปนซึ่งอาจเกิด
ระหวางการปลอ ยสารละลายตวั อยา งหรอื เกดิ ขน้ึ ระหวา งการเตรยี มตวั อยา ง ฟอง
อากาศเหลานม้ี รี ปู รา งตา งจากฟองกา ซทเ่ี กดิ จากแบคทเี รยี และไมอยูติดกับโคโลนี

โคโลนีสีน้ําเงนิ ทไ่ี มม ฟี องกา ซนน้ั อาจจะสรปุ วา ไมใ ช E.coli เพราะประมาณ
รอ ยละ 95 ของ E.coli ที่สามารถผลิตกาซได บางกรณโี คโลนสี นี ้ําเงนิ ทไ่ี มม ฟี องกา ซ
ติดอยอู าจจะเปน หรอื ไมเ ปน E.coli ก็ได และอาจจะทําการตรวจสอบเพอ่ื ยนื ยนั
ถา จําเปน

แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ประเภท E.coli count plate ทม่ี ี Coliforms ท่ีไมใ ช
E.coli อยูจํานวนมาก ใหสังเกตวามีลักษณะติดสีแดงเหมือนแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ
ประเภท Coliform count plate และถามีจํานวน E.coli นอยมากแตมโี คโลนขี อง
แบคทเี รยี แกรมลบอน่ื ๆทไ่ี มใ ช Coliforms อยูจํานวนมากจะมลี กั ษณะโคโลนีทต่ี ิด

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 218

สีแดงแตไมมีฟองกา ซ เมอ่ื มแี บคทเี รยี บางชนดิ อยจู ํานวนมากเชน จลุ นิ ทรยี ป ระเภท
สรางกรดได แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื จะเกดิ การเปลย่ี นแปลงสเี ชน เปลย่ี นเปน สเี หลอื ง
เปนตน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 219

วธิ ใี ชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในการตรวจสอบ
Yeast and Mold counts ในอาหาร

หลักการ :
วิธีการไดใชอาหารเลี้ยงเชื้อแหงที่เสริมดวยสารปฏิชีวนะ สียอมเพื่อให

สามารถสังเกตเห็นการเจริญเติบโต และใชส ารทท่ี ําใหเกิดเจลท่ีละลายไดด วยนํ้าเยน็
ตัวอยางที่ไมเจือจางหรือเจือจางจะถูกเติมลงไปในแผนอาหารเลี้ยงเชื้อในอัตรา 1
มิลลิลิตรตอแผน ตัวอยางจะถูกทําใหก ระจายในพน้ื ทป่ี ระมาณ 30 ตารางเซนตเิ มตร
ท่ีตองการใหเชอ้ื เจริญเตบิ โต เจลจะถูกทิ้งไวเพื่อใหเปนวุนแข็ง และแผน อาหาร
เล้ียงเช้ือจะถูกนําๆปบม เพาะเชอ้ื และจํานวนโคโลนขี องเชอ้ื ยสี ตแ ละราจะถกู นบั

เอนไซม Phosphatase ท่ีมีอยใู นเซลของสง่ิ ทม่ี ชี วี ติ ทกุ ชนดิ อินดิเคเตอรใน
แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื จะถกู กระตนุ โดยเอนไซมด งั กลา วและจะยอ มสโี คโลนขี องยสี ต
และราใหเปนสีนาํ้ เงนิ อันอาจกอใหเกิดความสับสนกับสีของตัวโคโลนีที่แทจริงได
ปฏิกิริยาการเปลี่ยนแปลงสีที่อาจสังเกตไดคือ สพี น้ื ดา นหลงั เปน สนี ้ําเงนิ คราม หรอื
พบจุดสีนํ้าเงนิ เขม กรณีหลังนี้มักพบกับตัวอยางเครื่องเทศหรือตัวอยางผลิตภัณฑที่
เปนเมด็ การสงั เกตความแตกตา งของการเปลย้ี นแปลงสที เ่ี กดิ จาก Phosphatase
จากสีของโคโลนีเชื้อยีสตและราไดโดยมีเทคนิคดังนี้

1.! การเจือจาง ถา ตวั อยา งทท่ี ดสอบสามารถทําใหเจือจางลงไปอีกได จะ
ชวยกําจัดปญหาสีพ้ืนดา นหลงั เปน สนี ้ําเงนิ ครามได หรอื ชว ยลดจํานวน
จุดสีน้ําเงนิ เขม ได

2.! ใชของเหลวสกัด โดยการเตรยี มตวั อยา ง แลวปลอยใหสวนที่เปนของ
แข็งตกตะกอนประมาณ 3-5 นาที นําเฉพาะสว นทเ่ี ปน ของเหลวจาก
ตัวอยางนั้นมาทาํ การทดสอบ ทั้งนี้เพราะเศษวัสดุหรือเศษอาหาร
ตัวอยางมักเปนสาเหตุใหเกิดจุดสีนาํ้ เงนิ เขม

3.! อุณหภูมิในการบม ควรบม เพาะเชอ้ื ทอ่ี ณุ หภมู ิ 20-25 องศาเซลเซยี ส
เพราะอณุ หภมู ทิ ส่ี งู จะเรง ปฏกิ ริ ยิ า Phosphatase ใหเกิดไดเร็วขึ้น

4.! ตรวจผลเปน ระยะ ใหต รวจดแู ผนอาหารเล้ยี งเช้อื หลงั จากบม เชอ้ื เปน
เวลา 24-48 ชว่ั โมง การเปลย่ี นสอี าจเกดิ ขน้ึ ได บนั ทกึ การเปลย่ี นแปลง
ของสีทีเ่ กิดขนึ้ เพ่ือชวยในการแปลผผลขั้นสดุ ทา ย

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 220

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยาง:

1.! การเตรยี ม Yeast and mold count plates ในแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื จะ

ประกอบดว ยสารอาหารทเ่ี สรมิ ดว ยChlortrtracycline, chloramphenicol

สารกอใหเกิดเจลที่ละลายไดในนาํ้ เยน็ และสยี อมที่ไวตอ การที่มี

เอนไซมฟ อสฟาเตส (Phosphatase) คือ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyle

phosphate) ซ่ึงทําใหสามารถเห็นการเจริญเติบโตของเชื้อยีสตและราได

ชัดเจน พื้นที่วงกลมที่ใหเชื้อเจริญเติบโตประกอบดวยพื้นที่ 1 ตาราง

เซนติเมตร จํานวน 30 ชอง

2.! ตัว Spreader พลาสติก ทเ่ี ตรยี มไวเ พอ่ื กระจายสารละลายตวั อยา งให

เกิดความสม่ําเสมอบนพนื้ ทท่ี ตี่ อ งการใหเ ชื้อเจริญเตบิ โต

3.! ปเ ปต Serological pipet หรือปเปตที่ใหความละเอียดในการปลอย

สารละลาย 1.0 มิลลิลิตร

4.! เคร่ืองตรวจนบั เชอ้ื เครอ่ื งตรวจนบั เชอ้ื มาตรฐานอาจจะถกู เตรยี มเพอ่ื ใช

ในการตรวจนบั

5.! เครื่องปน เครอ่ื งปน ทม่ี คี วามเรว็ สงู ทส่ี ามารถควบคมุ ความเรว็ ไดใ นชว ง

10,00-12,000 รอบตอ นาที หรอื Stomacher ควรถกู เตรยี มใหพ รอ ม

6.! สารละลายเจอื จาง Bufferfield’s phosphate-buffered dilution water ได

ถูกเตรยี มเพอ่ื ใชเ ปน สารละลายเจอื จาง โดยชง่ั KH2PO4 จํานวน 34
กรมั ใน Volumetric flask ขนาด 1 ลิตร และละลายดว ยน้ํากลน่ั จํานวน

500 มลิ ลิลิตร ปรบั pH เปน 7.2 ดวย 0.1N NaOH และปรบั ปรมิ าตร

เปน 1 ลิตรดวยนํ้ากลั่น ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส นาน 15 นาที

เก็บ Stock solution ในตูเย็น เตรยี มสารละลายเจอื จางโดยการดดู

Stock solution จํานวน 1.25 มิลลิลิตรดวยปเปตลงใน Volumetric

flask ขนาด 1 ลิตร และปรบั ปรมิ าตรเปน 1 ลิตรดวยนาํ้ กลั่น และแบงใส

ขวดจํานวน 90-99+1 มิลลิลิตร ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส นาน 15

นาที

วิธีการวิเคราะหโดยทั่วไป:

เก็บรักษาแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทย่ี งั ไมไ ดเ ปด ซองในทอ่ี ณุ หภมู ิ ≤ 8 องศา
เซลเซียส หลังจากเปดซองแลวแผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ยังไมไดถูกใชใหใสเก็บไวใน

ซองเดิมและปด ปากซองโดยใชเ ทปกาว เกบ็ ซองที่ปดปากแลว ที่ อุณหภมู ิ ≤ 8 องศา
เซลเซียส ในทแ่ี หง สามารถใชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ไดใ น 1 เดอื นหลงั จากเปด ปาก
ซองแลว การนําแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ยสี ตแ ละรานไ้ี วใ นทอ่ี ณุ หภมู มิ ากกวา 25 องศา

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 221

เซลเซียส และ/หรอื ทม่ี คี วามชน้ื สมั พทั ธม ากกวา รอ ยละ 50 สามารถใหผ ลกระทบตอ
การแสดงผลของแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ

หลังจากการใช แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทป่ี ระกอบดว ยเชอ้ื ยสี ตแ ละราทเ่ี จรญิ
เติบโตควรถกู ฆา เชอ้ื ทง้ิ ท่ี 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาทกี อ นทจ่ี ะทง้ิ

การวิเคราะหมีขั้นตอนดังนี้ วางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ดงั กลา วบนพน้ื ราบ ยก
ฟลม สว นบนขน้ึ ปเ ปตสารละลายตวั อยา ง 1 มลิ ลิลิตร บนสวนกลางของฟลม วาง
แผนฟล ม ดา นบนลงอยา งชา ๆ ยก Spreader พลาสติกโดยใชสวน Circular handle
โดยแนวกลางเสนตรงของสวนกลางของ Spreader สามารถประมาณเปน จดุ กง่ึ กลาง
ของแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ กระจายตวั อยา งใหท ว่ั สม่ําเสมอโดยการกดเบาๆตรงกลาง
ของ Spreader อยาเขยาหรือบิดหรือเลื่อน Spreader ไปมา ทง้ิ แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
ไว 1 นาทกี อ นการเคลอ่ื นยา ย เพื่อใหวุนแข็งตัว วางแผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ในตบู ม
เพาะเชื้อในตําแหนง แนวราบกบั พน้ื ดา นใสอยา ดา นบน และสามารถวางเรยี งซอ นได
ไมเกนิ 20 แผน บม เพาะเชอ้ื ท่ี 20-25 องศาเซลเซียส นาน 5 วัน เวลาและอุณหภูมิที่
เหมาะสมในการบมเช้ือมีความสําคัญตอการเจริญของเชื้อยีสตและราท่ีทําใหอาหาร
เนาเสีย ยีสตแ ละราเหลานเี้ จรญิ เตบิ โตชา และออนไหวตออุณหภูมิสูงทั้งนี้ไมวาจะ
เปนการทดสอบโดยวิธีใดๆก็ตาม ควรบม แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ท่ี 20-25 องศา
เซลเซียส หรือที่อุณหภูมิหอง และตรวจนบั การเจรญิ ของเชอ้ื หลงั จาก 3 วัน และ 5
วัน การตรวจนับจะไมทําใหเ กดิ การเคล่อื นยายตําแหนง ของสปอรห รอื การปนเปอ น
เพิ่มเติมของรา ทง้ั นเ้ี พราะราถกู ตรงึ ใหอ ยกู บั ทโ่ี ดยแผน ฟล ม ดา นบนและลา งท่ี
ประกบกันอยู การบม ทอ่ี ณุ หภมู สิ งู ไมไ ดใ หผ ลทเ่ี รว็ ขน้ึ แตอ าจจะทาํ ใหไ ดผ ลทไ่ี ม
แมนยาํ ได

นับจํานวนโคโลนีหลงั จากเสรจ็ สน้ิ การบม โดยยสี ตจ ะปรากฏสชี มพอู มเทาถงึ
สีเขียวอมนํ้าเงนิ มีโคโลนีเล็ก โคโลนมี ขี อบชดั เจน โคโลนมี ลี ักษณะนนู สมั ผสั ได และ
โดยท่ัวไปไมม จี ดุ โฟกสั (จดุ สเี ขม ) ตรงกลางโคโลนี สว นโคโลนเี ชอ้ื ราโดยทว่ั ไปจะมสี ี
น้ําเงินแตอาจจะมีสีแตกตางไปเพราะเชื้อราสรางสีไดเฉพาะตัว เชน สดี ํา เหลืองและ
เขียว มีแนวโนม วา มโี คโลนขี นาดใหญ ขอบโคโลนไี มช ดั เจน โคโลนีมีลักษณะแบน
ราบ และมกั จะมจี ดุ โฟกสั กง่ึ กลางโคโลนี

เพ่ือคํานวณจํานวนเชื้อยีสตและรา ใหค ณู จํานวนโคโลนีทัง้ หมดของเช้ือยสี ต
และราตอแผนอาหารเลี้ยงเชื้อ (หรอื จํานวนเฉลี่ยของโคโลนีตอแผน ถา มกี ท่ี ําซา้ํ ใน
ระดับการเจือจางเดียวกัน) ดว ยปจ จยั ทก่ี ารเจอื จางในระดบั ทเ่ี หมาะสม เมอ่ื การนบั

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 222

จํานวนโคโลนีในแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทร่ี ะดบั การเจอื จางในอนกุ รมตา งๆกนั ให
คํานวณจํานวนเฉลี่ยของโคโลนีสําหรับแตละระดับของการเจือจางกอนท่ีจะคํานวณ
คาเฉลี่ยของจํานวนเชอ้ื ยสี ตแ ละราสดุ ทา ย

ขอแนะนําในการนบั เชอ้ื ยสี ต

ดูลักษณะท่ัวไปของยีสตจากทก่ี ลา วมาแลว ขา งตน โดยจํานวนโคโลนที เ่ี หมาะ
สมควรอยูในชวง 15-150 โคโลนี และการประมาณจํานวนเชอ้ื ยสี ตส ามารถกระทาํ ได
ในแผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีจาํ นวนโคโลนมี ากกวา 150 โคโลนแี ละควรจะรายงานคา
โดยประมาณ โดยการนับจํานวนโคโลนตี อ 1 ตารางเซนตเิ มตร และคูณดวย 30
เพราะพื้นที่ที่ใหเชื้อเจริญเติบโตมีพื้นที่ 30 ตารางเซนตเิ มตร

อยางไรก็ตามถาแผนอาหารเลี้ยงเชื้อประกอบดวยโคโลนีของยีสตที่มีจาํ นวน
มากเกนิ กวา ทจ่ี ะนบั ได (TNTC) โคโลนีสีเขียวขนาดเล็กๆที่อยูตามขอบวงกลมของ
แผนอาหารเล้ียงเชอ้ื เปน โคโลนีของยีสตซึ่งแสดงผลใหทราบวา เปน TNTC ของเชื้อ
ยีสตไมใช TNTC ของเช้ือรา ในบางกรณบี นแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทป่ี ระกอบดว ยยสี ต
จํานวนมากๆ จะพบโคโลนีสีเขียวของยีสตเจริญเติบโตอยูตามขอบวงกลมเทานั้น ใน
กรณนี จ้ี ะบนั ทกึ ผลเปน TNTC ของยีสตเ ทา นน้ั ถา ไมพ บการเจรญิ ของเชอ้ื บนแผน
อาหารเลี้ยงเชื้อ ใหเปดแผนฟลมดานบนออก เจลจะตดิ อยกู บั แผน ฟล ม แผน บน ถา
เห็นโคโลนีสีขาวจํานวนมากทเ่ี จล แสดงวา มยี สี ตอ ยเู ปน จํานวนมาก ใหบันทึกผลเปน
TNTC ของเชื้อยีสต

จํ านวนท่ีสูงมากของยีสตอาจจะทํ าใ หพ้ืนที่ทั้งหมดของการเจริญเติบโต
เปลี่ยนเปนสีนํ้าเงนิ ดาํ หรือเหลือง เปนตน เมื่อเกิดในลักษณะดังกลาวไมควรจะนับ
โดยการประมาณแตควรทําการเจอื จางใหมใ หม รี ะดบั การเจอื จางสงู กวา เดมิ และ
ทดสอบใหมเพื่อใหไดคาจํานวนทแ่ี มน ยํามากขน้ึ

ขอแนะนําในการนบั เชอ้ื รา

โคโลนีของเชอ้ื ราจะมสี แี ตกตา งกนั ไป โดยมจี ดุ โฟกัสตรงกลางของโคโลนี
แตไมม ขี อบทข่ี ดั เจน แตละโคโลนีมขี นาดใหญ สังเกตเห็นสปอร และกินขอบเขตทับ
โคโลนีขางเคียง เพอ่ื ชว ยใหก ารนบั งา ยขน้ึ ใหขีดเสนบนแผนอาหารเลี้ยงเชื้อออก
เปนสวนๆและนบั จํานวนโคโลนีโดยยึดเอาจดุ โฟกสั กึง่ กลางโคโลนีเปน หลกั สวนที่
ขีดเสนแบงไวค วรมเี ชอ้ื ราทส่ี ามารถนบั ไดจ าํ นวนไมม าก เชน 15 โคโลนี เปนตน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 223

เม่ือมีโคโลนีของเชอ้ื ราจํานวนมาก และมกี ารสรา งสปอรท ําใหเกิดสีที่
แตกตางออกไป และไมส ามารถกาํ หนดขอบเขตของแตละโคโลนีได ใหป ระมาณ
จํานวนโคโลนีโดยนบั จากจดุ โฟกสั ในชอ งสเ่ี หลย่ี ม

จํานวนท่ีสูงมากของเชื้อราอาจจะทําใหพื้นท่ีทั้งหมดของการเจริญเติบโต
เปลี่ยนเปนสีนํ้าเงนิ ดาํ หรือเหลือง เปนตน เมื่อเกิดในลักษณะดังกลาวไมควรจะนับ
โดยการประมาณแตควรทําการเจอื จางใหมใ หม รี ะดบั การเจอื จางสงู กวา เดมิ และ
ทดสอบใหมเพื่อใหไดคาจํานวนทแ่ี มน ยํามากขน้ึ

การยืนยันชนิดของเชื้อโดยกลองจุลทรรศน

ยีสตและรามสี ายพนั ธืทห่ี ลากหลายมาก การสงั เกตดว ยตาเปลา ไมส ามารถ
บอกไดวาเปนเชื้อชนิดใดได แตถ า มกี ารตรวจยนื ยนั ดว ยกลอ งจลุ ทรรศนจ ะทําให
ทราบชนิดไดดีขึ้น การดําเนนิ การสามารถทําไดโ ดยนําโคโลนใี นแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
ไปตรวจวิเคราะหตอไดโดยเปดแผนฟลมดานบนขึ้นใชปลายเข็มเหล็กแหลมเก่ียว
โคโลนที ต่ี อ งการจากแผน เจล จุมปลายเขม็ เหลก็ แหลมลงในหยดน้ําปลอดเชื้อที่อยู
บนแผนสไลดสําหรบั กลอ งจลุ ทรรศน ปด ทบั หยดนา้ํ ดว ยแผน กระจกและสอ งดตู าม
เทคนิคทก่ี ลา วในบทตน ๆ เพื่อดูลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเชื้อยีสตและราตอไป

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 224

วธิ ใี ชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในการตรวจสอบ

S.aureus counts ในอาหาร

หลักการ:

วิธีนี้ใหอ าหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบดวยอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแหง และเจลที่
ละลายไดในน้ําเยน็ เตมิ ตวั อยา งทเ่ี ตรยี มโดยเจอื จางหรอื ไมเ จอื จางปรมิ าตร 1
มิลลิลิตร ลงในแผน เพาะเชอ้ื แรงกดบนแผนพลาสติกซ่ึงวางทบั แผนแผนฟลมแผน
บน จะทําใหตัวอยา งแผก ระจายในบรเิ วณทจ่ี ะใหเ ชอ้ื เจรญิ เตบิ โตเปน พน้ื ทป่ี ระมาณ
30 ตารางเซนตเิ มตร หลังจากพักไวสักครู เจลจะแขง็ ตวั และแผน เพาะเชอ้ื จะถกู นํา
ไปบมและตรวจนับจํานวนเชื้อตอไป อุปกรณท ่สี ามารถใชในการเติมตวั อยางลงใน
แผนเพาะเชื้อไดแก ปเ ปต ปเปตแบบตอเนื่อง หรือปเปตแบบอัตโนมัติ สว นการเกบ็
รักษาแผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื นน้ั ซองแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ทย่ี งั ไมไ ดเ ปด ใชใ หแ ชเ ยน็ ท่ี
อุณหภูมิ 4-8 องศาเซลเซียส และซองที่เปดแลวแตใชไมหมดใหเก็บที่อุณหภูมิหอง
ไดไมเกนิ 1 เดือน หา มนําเขา แชเ ยน็ อกี เดด็ ขาด แผนอาหารเลย้ี งเชอ้ื นเ้ี ปน ระบบ
อาหารเพาะเชื้อสําเร็จรูปที่ประกอบดวยสองสวนคือแผนอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งมีอาหาร
เลี้ยงเชื้อดัดแปลง Baird Parker และเจลที่ละลายไดในนาํ้ เยน็ เรยี กวา Petrifilm RSA
และอกี สว นคอื แผน ปฏกิ ริ ยิ า (TNase reactive disk) ซ่ึงแผน ปฏกิ ริ ยิ าประกอบดว ย
DNA , Toluidine blue-O และ Tetrazolium indicator ชวยในการนบั และยนื ยนั ผล
ของเอนไซมช นิดทนความรอนของ Staphylococcal thermostable nuclease

TNase เปน เอนไซมท ่ีผลติ โดย S.aureus ซ่ึงทนความรอ น การตรวจหา
TNase เปนวิธียืนยันวามี Staphylococcal อยูในตวั อยา งเชน เดยี วกบั การตรวจหา
เอนไซมโ คอกูเลส บนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA ปฏกิ ริ ยิ า TNase จะ
ปรากฏเปน บริเวณสีชมพูรอบโคโลนีสีแดงหรือสีนํ้าเงนิ

แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA จะตองใชร ว มกบั แผน ปฏกิ ริ ยิ า TNase
การใชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA ดังกลา วอยา งเดยี วจะไมป รากฏโคโลนี
และบริเวณสชี มพใู หเ หน็ เพราะอนิ ดเิ คเตอรท ง้ั หมดถกู บรรจอุ ยใู นแผน ปฏกิ ริ ยิ า
TNase ซ่ึงในแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA จะไมมีอินดิเคเตอรอยูเลย

หลังจากบมคร้ังแรกแผนอาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกนําไปบมท่ีอุณหภูมิสูงเพ่ือ
ทําลายเอนไซมชนดิ ไมทนความรอ นท่ผี ลิตโดยเชอ้ื S.aureus แผนปฏกิ ริ ยิ าจะถกู
สอดเขา ไปในแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื เอนไซม Nuclease ท่ีทนความรอ นเปน เอนไซมท ่ี
ผลิตโดย S.aureus สวนมากและยังคงสภาพหลงั การบม ทอ่ี ณุ หภมู สิ งู จะทาํ ปฏกิ ริ ยิ า
กับ DNA ในแผน ปฏกิ ริ ยิ า กอใหเกิดการเปลี่ยนสี Toluidine blue-O จากสีนํ้าเงนิ
เปนสชี มพู ดงั นน้ั S.aureus จะปรากฏเปนโคโลนีที่มีสีชมพูลอมรอบ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 225

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยาง:

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยางก็เชนเดียวกับที่กลาวมาแลว
ขางตน การเตรยี มตวั อยา งทต่ี อ งการตรวจสอบทร่ี ะดบั เจอื จาง 1:10 หรือนอยกวา
โดยชง่ั หรอื ปเปตอาหารในภาชนะทเ่ี หมาะสม เชน ถงุ Stomacher ขวดเจอื จาง หรอื
ถุง Rhirl-Pak หรือภาชนะปลอดเชื้ออื่นๆ สารละลายเจอื จางตวั อยา งทใ่ี ชม ดี งั น้ี
Bufferfield’s phosphate buffer (IDF phosphate buffer, 0.0425 กรัมตอลิตรของ
KH2PO4 และปรบั pH เปน 7.2 ) นอกจากนอ้ี าจจะใช Peptone water รอ ยละ 0.1,
Peptone salt diluent, Saline solution (0.85-0.90%), Bisulfite free letheen broth
หรือนํ้ากลั่น หา มใช Buffers ที่มีองคประกอบของ Citrate, bisulfite หรอื
Thiosulfate เพราะมผี ลยับยง้ั การเจริญเตบิ โตของเชอ้ื จุลนิ ทรยี 

การปนหรือผสมตัวอยางตามขั้นตอนปกติ สาํ หรบั ตวั อยา งทม่ี คี วามเปน กรด
ใหป รบั สภาพใหอ ยใู นชว ง pH 6.5-7.5 ดวย 1N NaOH สําหรับตัวอยางที่มีความ
เปนดา งใหป รบั สภาพดว ย 1N HCl

การวิเคราะห:

วางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA บนพ้ืนราบ ใหแผนฟลมดานใสอยู
ขางบน ปเ ปตสารละลายตวั อยา ง 1 มลิ ลิลิตร เปด แผน ฟล ม แผน บนขน้ึ แลวคอยๆ
ปลอยสารละลายตัวอยางลงตรงกลางแผน ปลอ ยแผน ฟล ม ลงอยา งชา ๆ อยาใหเกิด
ฟองอากาศ อยาใหแผนฟลมตกลงมาเอง วาง Spreader เฉพาะของ Petrifilm RSA
count ลงบนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื คอยๆใชนิ้วกดตรงกลาง Spreader จนเห็นวา
สารละลายตวั อยา งกระจายเตม็ วงกลม อยาบิดหรือเลื่อน Spreader ไปมา ยก
Spreader ออก ทิ้งแผนอาหารเลี้ยงเชื้อไว 2-3 นาทกี อ นเคลอ่ื นยา ย เพื่อใหวุนแข็ง
ตัว บม แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ท่ี 35+1 หรอื 37+1 องศาเซลเซยี ส นาน 24+2 ชว่ั โมง
สามารถเรียงซอนแผนอาหารเลี้ยงเชื้อไดไมเกิน 10 แผน หลงั การบม จะยงั ไมเ หน็
โคโลนีเพราะอิดิเคเตอรอ ยใู นแผน ทําปฏกิ ริ ยิ า นําแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื ไปบม ตอ ท่ี
อุณหภมู ิ 62+2 องศาเซลเซียส เปน เวลานาน 1-4 ชว่ั โมง (ถาตอ งการนําโคโลนที ย่ี งั
มีชีวิตไปทําการทดลองตอ ใหบ ม ไมเ กนิ 1 ชว่ั โมง) หลงั การบม ใหน ําแผน อาหารเลย้ี ง
เชื้อออกจากตู ใช Sterile forceps คีบแผน ปฏกิ ริ ยิ า (ดึงขอบทิ้งใหเหลือแตวงกลม)
เปดแผน ฟล ม ดา นบนของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA แลววางแผนปฏิกิรยิ า
ลงในหลุมกลม ปดแผนฟลมกลับ ใชแทงแกวรูปตัวแอล คอยๆรีดใหเนื้อเจลแนบกับ
แผนปฏกิ ริ ยิ า นําแผน Petrifilm RSAท่ีมีแผนปฏกิ ริ ยิ าแลว ไปบม ตอ ทอ่ี ณุ หภมู ิ 35+1
องศาเซลเซยี ส นาน 1-3 ชว่ั โมง หรือที่ 37+1 องศาเซลเซียส นาน 1 ชว่ั โมง อานผล
โดยนับจํานวนโคโลนีที่มีบริเวณสีชมพูลอมรอบ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 226

ขอแนะนําการนบั โคโลนีของแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA
1.! ถาแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื RSA plate ทม่ี ี TNase reactive disk สอดอยู

และไมมีการเจรญิ ของโคโลนจี ะปรากฏเปน สนี ้ําเงนิ ตลอดแผน
2.! ถา หากมเี ชอ้ื อยู อินดิเคเตอรในแผน TNase reactive disk จะยอ ม

โคโลนีใหเปนสีแดง (หรือมวง) อินดิเคเตอรอ ีกชนิดทาํ ใหเกิดบริเวณ
สีชมพูรอบโคโลนี (ปฏกิ ริ ยิ ากบั TNase)
3.! เชอ้ื S.aureus บางชนิดผลติ เอนไซม Thermostable nuclease ปริมาณ
นอยใหนับทุกโคโลนีที่มีบริเวณ TNase zone (สีชมพู) เปน S.aureus
ไมวาจะมีขนาดเล็กหรือใหญก็ตาม ชว งการนบั ทเ่ี หมาะสมควรอยู
ระหวาง 15-100 โคโลนี จาํ นวนมากสดุ ทน่ี บั ไดข น้ึ อยกู บั ปรมิ าณ TNase
ท่ี S.aureus ผลิตหรือจํานวนของแบคทเี รยี ชนดิ อน่ื ๆทป่ี ะปนอยู
4.! เชอื้ S.aureus บางชนิดผลติ เอนไซม Thermostable nuclease ปริมาณ
มากทําใหเกิดบริเวณ TNase zone (สีชมพู) ไดเ ร็ว ซึ่งอาจเห็นไดตั้งแต
30 นาทขี องการบม ขน้ั สดุ ทา ย
5.! บริเวณวงกลมสําหรบั ใหเ ชอ้ื เจรญิ เตบิ โตมพี น้ื ท่ี 30 ตารางเซนตเิ มตร
การประมาณจํานวนโคโลนีทําไดโดยการนับจํานวนวงสีชมพูในพื้นท่ี
สี่เหลี่ยม 3 ชองติดตอกันแลวคูณดวย 10

เม่ือมีจํานวน S.aureus อยูมาก วงสชี มพอู าจคาบเกย่ี วกนั ทําให
แผนอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเปนสีชมพูเกือบตลอดแผน ลักษณะเชนนี้ให
บันทกึ เปน TNTC และควรเจอื จางตัวอยางเพ่อื ใหไดช วงการนบั ท่ี
เหมาะสมตอ ไป
6.! บางครั้งแบคทีเรียบางชนิดที่ทําใหเนื้อเจลเหลวสามารถเจริญเติบโตบน
แผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื RSA โคโลนีของแบคทเี รยี เหลา นเ้ี ปน สแี ดงถงึ มว ง
ซ่ึงมีรูปท่ีผิดปกติ (ไมเ ปน ทรงกลม) และไมม วี งสชี มพรู อบๆ ไมใ หน บั
เปน S.aureus โคโลนีทรงกลมสีแดงทไ่ี มม วี งสชี มพลู อ มรอบกไ็ มน บั เปน
S.aureus เศษอาหารขนาดใหญอาจทาํ ใหแ ผน ฟล มแผน บนไมส ัมผสั
แนบกับแผนปฏกิ ริ ยิ า และทําใหเ กดิ ฟองอากาศได เศษอาหารมกั จะมี
รูปรา งตา งจากโคโลนี และอาจมสี แี ตกตา งกนั ไปตามชนดิ ของตัวอยา ง
7.! เมอ่ื มี S.aureus สองโคโลนีที่เจริญอยูใกลกัน วงสีชมพูที่เกิดจากสอง
โคโลนีอาจคาบเกี่ยวกันทําใหบ รเิ วณสชี มพู (จากปฏกิ ริ ยิ า TNase ) เปน
รูปทรงยาวแทนทจ่ี ะเปน วงกลมใหน บั เปน 2 โคโลนี

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 227

วธิ ใี ชแ ผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื แหง ในการตรวจสอบ
Enterobacteriaceae counts ในอาหาร

หลักการ:
วิธีนี้ใหอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบดวยอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแหง สารบง ช้ี

ความเปน กรดเปน ดา ง และสารกอเจลท่ีละลายไดใ นน้ําเยน็ เติมตัวอยางท่ีเตรียมโดย
เจือจางหรือไมเ จอื จางปรมิ าตร 1 มลิ ลิลิตรลงในแผนเพาะเชื้อ แรงกดบนแผน
พลาสติกซึ่งวางทับแผนแผนฟลมแผนบน จะทาํ ใหต วั อยา งแผก ระจายในบรเิ วณทจ่ี ะ
ใหเช้ือเจรญิ เตบิ โตเปน พน้ื ทป่ี ระมาณ 20 ตารางเซนตเิ มตร หลังจากพักไวสักครู เจล
จะแข็งตัวและแผนเพาะเชื้อจะถูกนาํ ไปบม และตรวจนบั จํานวนเชื้อตอไป อปุ กรณท ่ี
สามารถใชในการเติมตัวอยางลงในแผนเพาะเชื้อไดแก ปเ ปต ปเปตแบบตอเนื่อง
หรือปเปตแบบอัตโนมัติ สว นการเกบ็ รกั ษาแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื นน้ั ซองแผน อาหาร
เล้ียงเชอ้ื ทย่ี งั ไมไ ดเ ปด ใชใ หแ ชเ ยน็ ทอ่ี ณุ หภมู ิ 4-8 องศาเซลเซียส และซองที่เปดแลว
แตใชไมหมดใหเก็บที่อุณหภูมิหองไดไมเกิน 1 เดือน หา มนําเขา แชเ ยน็ อีกเดด็ ขาด
Enterobacteriacea ใชน้ําตาลในอาหารเลี้ยงเชื้อทาํ ใหเ กดิ กรดและกา ซ ปรากฏเปน
โคโลนีสีแดงและมีฟองกาซหรือลอมรอบบริเวณสีเหลืองจากสารบงชี้ความเปนกรด
เปนดาง

การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยาง:
การเตรียมสารละลายเจือจางและตัวอยางก็เชนเดียวกับท่ีกลาวมาแลว

ขางตน การเตรยี มตวั อยา งทต่ี อ งการตรวจสอบทร่ี ะดบั เจอื จาง 1:10 หรือมากกวา
ตามความเหมาะสม โดยชง่ั หรอื ปเปตอาหารในภาชนะทเ่ี หมาะสม เชน ถงุ
Stomacher ขวดเจือจาง หรือถุง Rhirl-Pak หรือภาชนะปลอดเชอ้ื อน่ื ๆ สารละลาย
เจือจางตวั อยา งทใ่ี ชม ดี งั น้ี Standard phosphate buffer นอกจากนอ้ี าจจะใช
Peptone water รอ ยละ 0.1, Sterile water, Phosphate buffered saline และ
Bufferfield’s buffer หา มใช Buffers ที่มีองคประกอบของ Citrate หรอื Thiosulfate
เพราะมผี ลยบั ยงั้ การเจริญเติบโตของเชอ้ื จุลินทรยี 

การวิเคราะห:
วางแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื Petrifilm RSA บนพื้นราบ ใหแผนฟลมดานใสอยู

ขางบน ปเปตสารละลายตัวอยาง 1 มลิ ลิลิตร เปด แผน ฟล ม แผน บนขน้ึ แลวคอยๆ
ปลอยสารละลายตัวอยางลงตรงกลางแผน ปลอ ยแผน ฟล ม ลงอยา งชา ๆ อยาใหเกิด
ฟองอากาศ อยาใหแผนฟลมตกลงมาเอง วาง Spreader ลงบนแผน อาหารเลย้ี งเชอ้ื
โดยใหดา นเรยี บคว่ําหนา ลง คอยๆใชนิ้วกดตรงกลาง Spreader จนเห็นวา

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 228

สารละลายตัวอยา งกระจายเตม็ วงกลม อยาบิดหรือเลื่อน Spreader ไปมา ยก
Spreader ออก ทิ้งแผนอาหารเลี้ยงเชื้อไว 2-3 นาทกี อ นเคลอ่ื นยา ย เพื่อใหวุนแข็ง
ตัว บมแผนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 32-35 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง สามารถเรยี ง
ซอนแผนอาหารเลี้ยงเชื้อไดไมเกิน 20 แผน อานผลจํานวน Enterobacteriaceae
โดยนบั โคโลนสี แี ดงทม่ี ฟี องกา ซ โคโลนีสีแดงที่มีบริเวณสีเหลืองลอมรอบ และโคโลนี
สีแดงที่มีทั้งฟองกาซและบริเวณสีเหลืองลอมรอบ เปน จํานวน Enterobacteriaceae
ทง้ั หมด

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 229

เอกสารอา งองิ

1.! Adam, M.R. 1986. Process in Industrial Microbiology. Volume 23.
Microorganisms in the Production of Food. Elsevier Science Publishers,

B.V., The Netherlands.
2.! AOAC International. 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). 8th

edition Revision A, Published and distributed by AOAC International,

USA.
3.! Bailey, W.R., and Scott, E.G. 1966. Diagnostic Microbiology, 2nd Edition,

C.V.Mosby : Saint Louis.
4.! Blackburn. C.de W. 1993. Rapid and Alternative methods for the

detection of Salmonellas in Foods. J. of Appl. Bacteriol. 199-214.
5.! Brooks, J.D. 1983. Proceedings of the first short course on rapid methods

of analysis in food microbiology. Massey University, New Zealand.
6.! Bradshaw, L.J. 1963. Laboratory Microbiology, Philadelphia : W.B.

Saunders
7.! Buchanan, R.E., and Gibbons, N.E. 1974. Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology. The Williams and Wilkins Company,
Baltimore.
8.! Chinachoti, P. 1996. Food Products Shelf-life Stability. Department of

Food Science University of Massachusetts, U.S.A.
9.! Connolly, P., Bloomfield, S.F., and Denyer, S.P. 1993. A study of the use

of rapid methods for preservative efficacy testing of pharmaceuticals. J. of
Appl. Bacteriol., 75,456-462.
10.!Connolly, P., Bloomfield, S.F., and Denyer, S.P. 1994. The use of

impedance for the preservative efficacy testing of pharmaceuticals and
cosmetic products. J. Appl. Bacteriol. 76,68-74.
11.!CruicKshank, R., 1968. Medical Microbiology, 11st Edition,
E.S.Livingstone : Edinburgh.
12.!Department of General Microbiology, College of Agriculture, Faculty of

Science, Edinburgh University. 1970. HND II Practical
Microbiology.
13.!Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chiang-Mai
University. 1971. Microbiology, Laboratory Manual.

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 230

14.!Difco. 1966. Difco Manual of Dehydrated Culture Media and
Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedure, 9th
Edition. Detroit Michigan : Difco Laboratory.

15.!Faculty of Science, Mahidol University, 1975. General and Medical
Microbiology, Laboratory Manual.

16.!Frazier, W.C. 1967. Food Microbiology. 2nd Edition, Mc Graw-Hill Book
Company, New York.

17.!Futschik, K., Pfutzner, H., Doblander, A., and Asperger, H. 1988.
Automatical registration of microorganism growth by a new impedance
method. Abstr. Int. Meet.Chem. Eng.&Biotechnol. Achema 88.3p.

18.!Geory, B. 1969. Principles of Food Science, Volume II, Food Microbiology
and Biochemistry. The Macwillan Company Collier Macmillan Ltd.,
London.

19.!Gibbs, B.M., and Skinner, F.A. 1966. Identification Methods for
Microbiologists Part A. Academic press, London and New York.

20.!Jay, J.M. 1970. Modern Food Microbiology. Van Nostrand Reinhold Co.,
New York.

21.!Kiss, I. 1984. Testing Met5hods in Food Microbiology. Elsevier,
Amsterdam-Oxford.

22.!Lamanna, C., Mallette, M.F., and Zimmerman, L.N. 1973. Basic
Bacteriology: Its Biological and Chemical Background: Chapter 10
Nutrition of Bacteria. The Williams and Wilkins company, Baltimore.

23.!Lowry, P.D. 1984. Microbiology Methods for Meat Industry. Meat Industry
Research Institute of New Zealand. MIRINZ 757.

24.!Normann, W.D. 1970. The Technology of Food Preservation. 3rd Edition,
The AVI Publishing Company, INC. Westport, Connecticut.

25.!Merck, E. 1984. Handbook Culture Media MERCK. Frankfurter Straβe
250 D-6100 Darmstadt 1.

26.!Parry, R.T., Haysom, L.,Thomas, N.L., and Davis, R. 1982. A Manual of
Recommended Methods for the Microbiological Examination of Poultry
and Poultry Products. British Poultry Meat Association Ltd., High
Holborn, London.

27.!Pederson, C.S. 1979. Microbiology of Food Fermentations. 2nd Edition.
AVI Publishing Company, Inc., Westport, Connecticut.

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 231

28.!Pelczar Jr., M.J., 1965. Laboratory Exercises in Microbilogy, 2nd Edition.
Mc Graw-Hill.New York.

29.!Pelczar Jr., M.J., and Reid, R. B. 1972. Microbiology. Mc Graw-Hill Book
Co., New York.

30.!Philip, L.C. 1967. Microbiology. 2nd Edition. W.B. Saundus Company

Philadelphia-London; Toppan Company, Ltd., Japan.
31.!Phillips, J.D., and Griffiths, M.W. 1989. An electrical method for detecting

Listeria spp. Let. Appl. Microbiol., 9,129-132.
32.!Pirt, A.J. 1975. Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell

Scientific Publication. London.
33.!Pless, P. 1993. Detection of Listeria spp. By new impedance method. 3rd

World Congress Foodborne Infections and Intoxications, Proceedings,

Vol. II, 1194-1197.
34.!Pless, P., Futschik, K., and Schopf, E. 1994. Rapid detection of

Salmonellae by means of a new impedance-splitting method. J. of Food

Protection. 57(5):369-376.
35.!Prescott, S.C. and Dunn, C.G. 1959. Industrial microbiology. 3rd Edition.

Mc. Graw Hill Book Co., New York.
36.!Rehm, H-J. and Reed, G. 1983. Biotechnology A Comprehensive Treatise

in 8 Volumes: Volume 5 Food and Feed Production with Microorganisms.

Verlag Chemie, Weinheim, Florida.
37.!Rockland, L.B., and Beuchat, L.R. 1987. Water Activity: Theory and

Applications to Food. Marcel Dekker, Inc., New York.
38.!Rohde, P.A. 1970. BBL Manual of Products and Laboratory

Procedures, 5th Edition, CocKeysville, Maryland : BBL Division of

Becton, Dickinson and Co.
39.!Seeley Jr., H.W., and Vandemark, P.J. 1965. Selected Exercises from

Microbes in Action. A Laboratory Manual of Microbiology, San
Francisco and London : W.H. Freeman and Company.
40.!Seow, C.C. 1988. Food Preservation by Moisture Control. Elsevier

Applied Science, New York.
41.!Sharf, J.M. 1966. Recommended Methods for the Microbiology

Examination of Food. 2nd Edition, American Public Health Association,
Washington, D.C.

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 232

42.!Speck, M.L. 1976. Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 2nd Edition. American Public Health Association,

Washington, D.C.
43.!Stanier, R.Y., Doudoroff, M., and Adelburg, E.A. 1970. General

Microbiology, London : Macmillan.
44.!Tilton, R.C. 1982. Rapid methods and automation in microbiology.

American Society for Microbiology, Washington, D.C.
45.!Wistreich, G.A., and Lechtman, M.D. 1969. Laboratory Exercises in

Microbiology, Toronto Canada : Glencol Press.
46.!Wood, B.J.B. 1985. Microbiology of Fermented Foods. Volume2. Elsevier

Applied Science Publishers, Ltd., London.
47.!Weiser, H.H., Mountney, G.J., and Gould, W.A. 1978. Practical Food

Microbiology and Technology. The AVI Publishing Co., Westport,

Connecticut.