หลักการวิเคราะห์จุลินทรีย์

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 142

สารเรง ชวี ภาพ หรอื เอนไซม

สารเรง ชวี ภาพหรอื เอนไซม (Enzyme) เปนโปรตนี ประเภทหนง่ึ ทเ่ี ชอ้ื
จุลินทรียสามารถผลิตขึ้น เพอ่ื ใชใ นการยอ ยสลายสารอาหารตามทต่ี อ งการ เพื่อ
ประโยชนต อ เซลของเชอ้ื จลุ ินทรียน้ันๆ การใชค ณุ สมบตั ทิ เ่ี ชอ้ื จลุ นิ ทรยี ส ามารถสรา ง
เอนไซมไดไมเหมือนกันในสภาวะหนึ่งๆ เพอ่ื การตรวจสอบเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ป ระเภทนน้ั
ไดเขามามีบทบาทในการวิเคราะหจลุ ินทรยี  เพอ่ื เปน การจําแนกและสรา งความมน่ั ใจ
ในการตรวจสอบหรอื วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี ม ากขน้ึ

1.! เอนไซม Oxidase และ Catalase

1.1 เทอาหารน้ํามะพรา วลงในจานเพาะเชอ้ื 2 จาน รอจนวนุ แขง็ ขีดเสนใต
แบง อาหารเปน 4 สวน แตละสวน Streak ดวยเชื้อตอไปนี้ Lactobacillus sp.,
Streptococcus sp., Escherichia coli และ Bacillus megaterium

1.2!บมทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง 48 ชว่ั โมง
1.3! จานแรกใชต รวจสอบเอนไซม Catalase โดยหยดสารละลายนํ้ายา
Hydrogenperoxide รอยละ 3-4 ลงบนรอบ Streak สังเกตการเกิดฟองอากาศ
1.4! จานที่สองใหหยดนํ้ายา Tetramethyl - paraphenylene - idamine
dihydrochloride เชื้อที่ผลิตเอนไซม Oxidase จะเกดิ สีมว ง

2.! เอนไซม Dehydrogenase

2.1 Ionoculate เช้ือ E.coli ลงใน Nutrient broth 2 หลอด บม ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ ง
24 ชว่ั โมง

2.2 หยุดการทํางานของเอนไซมใ นหลอดท่ี 1 โดยแชห ลอดในน้าํ เดอื ด 10
นาที

2.3 เติมนํ้ายากลูโคสรอยละ 1 จาํ นวน 0.5 มลิ ลิลิตร และสี Methylene blue
เจือจาง 1 : 100,000 1 หรอื 2 หยดลงในหลอดทั้งสอง ปด ทบั หนา ดว ยวนุ รอ ยละ 3

2.4 บม ใน Water bath ท่ี 37 องศาเซลเซียส สังเกตการเปลี่ยนสีของ
Methylene blue ทกุ ๆ ครง่ึ ชว่ั โมง

2.5 วิจารณผลที่เกิดขึ้น

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 143

3.! β-galactosidase

3.1 ใชปเปตดูดเชื้อ E.coli อายุ 24 ชว่ั โมง ซง่ึ เจรญิ ใน Lactose broth
5 มิลลิลิตร ลงในฟลาสค ซง่ึ บรรจุ Lactose broth 25 มลิ ลิลิตร (ฟลาสค ก.)

3.2 ใชปเปตดูดเชื้อ E.coli อายุ 24 ชว่ั โมง ซง่ึ เจรญิ ใน Glycerol broth
5 มิลลิลิตร (ฟลาสค ข.) หนึ่งฟลาสค และอีก 5 มลิ ลิลิตร ลงในฟลาสคซ ง่ึ บรรจุ
Glycerol broth อีก 1 ฟลาสค (ฟลาสค ค.) เขยา ฟลาสคท ง้ั สาม (เวลาเริ่มตน)

3.3 ศกึ ษาการเกดิ เอนไซมใ นฟลาสคท ง้ั สามตามระยะเวลาดงั น้ี เรม่ิ ตน การ
ทดลอง 30, 60, 90 และ 120 นาที

3.3.1 หยด Toluene ลงในหลอดเล็ก ๆ 3 หลอด
3.3.2 ใชปเปตดูดเชื้อจากฟลาสคทั้งสามลงในแตละหลอด ในปรมิ าณ
หลอดละ 1 มิลลลิ ติ รเขยา ดว ย Vortex mixer ประมาณ 2 นาที แชหลอดใน Water
bath ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส นาน 30 นาที

3.3.3 เตมิ น้ํายา O-nitrophenyl-β-D-galactoside หลอดละ 0.2
มิลลิลิตรผสมใหเขากันทิ้งไว 15 นาที

3.3.4 เติม Na2CO3 1.0 M ลงไปหลอดละ 0.5 มลิ ลิลิตร เพื่อหยุด
ปฏิกิริยาของเอนไซม

3.3.5 เตมิ น้ํา Demineralized หลอดละ 4 มิลลิลิตร เขยาใหของเหลว
ในหลอดผสมกันดี

3.6 วัด O.D. (420 nm)
4. เขยี น Curve ระหวา ง O.D. และเวลาของทกุ ฟลาสค
5. วจิ ารณผ ลทเ่ี กดิ ขน้ึ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 144

การตรวจสอบอาหารกระปอ ง

การเปลี่ยนแปลงที่ผิดปกติของอาหารกระปองมีอยูหลายแบบ เชน การผดิ
ปกติภายในกระปอง การบวมของกระปอ ง การบบุ และการเกดิ สนมิ ภายนอก การ
ผิดปกติเหลา นต้ี อ งอาศยั การตรวจทางกายภาพ ทางเคมี และทางจลุ นิ ทรียประกอบ
จึงจะสามารถวินิจฉัยไดอยางถูกตองวามีสาเหตุมาจากอะไร เชน ความรอ นในการฆา
เช้ือไมเ พยี งพอ ตะเข็บกระปองผิดปกติ หรอื กรรมวธิ ีในการผลติ ไมถ ูกตอ ง

ความสัมพันธร ะหวา งการเปลย่ี นแปลงของอาหารกบั pH ในสวนที่

เก่ียวขอ งกบั จลุ นิ ทรยี 

อาหารชนดิ ตา งๆมสี ภาพความเปน กรด (pH) ท่ีไมเ หมอื นกนั บางชนดิ
เปร้ียวจัด มีกรดมาก บางชนดิ ไมเ ปรย้ี วเพราะมกี รดนอ ย สภาพความเปน กรดของ
อาหารมีผลใหการเจริญเติบโตของจุลินทรียแตกตางกันออกไป ผลคืออาหารจะเสีย
ไมเหมือนกัน และจากความเปน กรดน้ี จะวนิ จิ ฉยั ไดอ ยา งครา วๆวา อาหารจะเสยี โดย
จุลนิ ทรียกลมุ ใด ดงั ตาราง

ตาราง 17 ความสมั พนั ธร ะหวา ง pH กับจลุ นิ ทรียในอาหาร

สภาพความ ชนดิ อาหาร จุลนิ ทรยี ท พ่ี บ

เปน กรด

ถั่วพี Thermophilic group:

ความเปน ขาวโพด Flat sour types

กรดตํ่า นมระเหยนํ้า Thermophilic anaerobes-gas producers

(pH≥4.5) มนั ฝรง่ั Sulfide spoilage organism-H2S gas producers
เนอ้ื Mesophilic group:

ปลา Putrefactive anaerobes-gas producers

เปน ตน Aerobic spore formers

น้ํามะเขือเทศ Spore-formers:

ความเปน สาลี Aciduric flat sour types

กรดสงู ลูกทอ Bacillus thermoacidurans

(pH≤4.5) ลน้ิ จ่ี Butyric anaerobes-gas producers
สับปะรด Nonspore formers:

เปนตน Lactobacilli

Yeasts

Molds

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 145

จากลักษณะที่ปรากฏใหเห็น ทาํ ใหส ามารถสนั นษิ ฐานตอ ไปวา การเสยี ของ
อาหารน้ันเกดิ จากจลุ นิ ทรยี ก ลมุ ใด ดงั ตาราง

ตาราง 18 ความสมั พนั ธร ะหวา งชนดิ จลุ นิ ทรียกับลกั ษณะทป่ี รากฏ

สภาพความ ชนดิ จลุ ินทรีย ลักษณะทป่ี รากฏ

เปน กรด

ความเปน Flat sour กระปองปกติ สุญญากาศลดลงเล็กนอย

กรดตํ่า เมื่อเก็บไวน าน

(pH≥4.5) เน้ืออาหารไมเ ปลย่ี นแปลง pH ลดลงและมี
กลิ่นที่ผิดปกติ น้าํ ขนุ

ความเปน Thermophilic กระปอ งบวมและอาจจะระเบดิ ได

กรดต่ํา Anaerobes เน้ืออาหารมกี ลน่ิ หมกั กลน่ิ กรด เปรย้ี ว

(pH≥4.5)

ความเปน Sulfide spoilage กระปองปกติ กา ซไฮโดรเจนทเ่ี กดิ ขน้ึ จะทํา

กรดต่ํา ปฏิกิรยิ ากบั อาหาร

(pH≥4.5) เน้ืออาหารมสี ดี าํ มกี ลน่ิ กา ซไขเ นา

ความเปน Putrefactive กระปอ งบวมและอาจจะระเบดิ ได

กรดตํ่า Anaerobes เนื้ออาหารสลายตัวบางสวน pH สูงขึ้น

(pH≥4.5) เล็กนอย มกี ลน่ิ เนา

ความเปน Aerobic spore กระปองโดยปกตไิ มบ วม แตถ า เปน จําพวก

กรดตํ่า Formers ท่ีมีไนโตรเจนอยดู ว ย อาจบวมได

(pH≥4.5) เน้ืออาหารถา เปน นมระเหยนา้ํ อาจมตี ะกอน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 146

ตาราง 18 ความสมั พนั ธร ะหวา งชนดิ จลุ นิ ทรียกับลกั ษณะทป่ี รากฏ (ตอ )

สภาพความ ชนิดจลุ ินทรีย ลักษณะทป่ี รากฏ

เปน กรด

ความเปน Bacillus coagulans กระปองปกติ สญุ ญากาศเปลี่ยนแปลงลง
กรดสูง B.theromoacidurans เล็กนอย
เนื้ออาหาร pH ลดลงเล็กนอย มกี ลิ่น
(pH≤4.5)

ความเปน Butyric anaerobes กระปอ งบวม อาจจะระเบดิ ได

กรดสูง เน้ืออาหารมกี ลน่ิ กรด Butyric หรือกลิ่น

(pH≤4.5) Nonspore Formers หมกั
ความเปน (Lactic acid bacteria)
กรดสงู กระปอ งบวมมาก อาจระเบดิ ได
เน้ืออาหารมกี ลน่ิ กรด

(pH≤4.5)

ความเปน Yeasts กระปองบวม อาจระเบดิ ได
กรดสงู เน้ืออาหารมกี ลน่ิ หมกั และกลิ่นยีสต

(pH≤4.5) Molds กระปองปกติ
ความเปน เนอ้ื อาหารมกี ลน่ิ อบั

กรดสงู

(pH≤4.5)

วิธีการตรวจ

การตรวจอาหารกระปองแบงออกไดเปน 3 สวนคือ ตรวจสอบหาสาเหตกุ าร
เสีย ตรวจ Incubation test และตรวจ Sterility test รายละเอยี ดตางๆ ดงั น้ี

การตรวจหาสาเหตกุ ารเสยี

การเก็บตัวอยาง

จํานวนตัวอยางที่ควรจะเกบ็ ประมาณ 6-12 กระปอ ง โดยทําการสมุ จาก
กระปองที่ผลิตขึ้น ตวั อยา งทเ่ี กบ็ มานน้ั จะตอ งมตี ะเขบ็ ปกติ และไมบ บุ

การตรวจสอบ
1.การตรวจประวตั กิ ารบรรจุ ซึ่งรวมทั้งสภาพภายนอกที่ผิดปกติ จํานวน
กระปองที่เสีย วิธบี รรจุ อุณหภมู แิ ละเวลาทใี่ ชฆ า เช้อื วิธีการทําใหก ระปอ งเยน็ ตวั
ตลอดจนวธิ กี ารอน่ื ๆทผ่ี ดิ ไปจากปกติ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 147

2. การตรวจทางกายภาพ และการตรวจทางจลุ นิ ทรยี 

2.1 บันทึกจํานวนตัวอยางที่ไดรับ ชนดิ อาหาร สถานที่เก็บตัวอยาง
ขนาดกระปอง และรหัสบนฝากระปอง

2.2 ตรวจสอบสภาพกระปอง ทาํ การบนั ทกึ สภาพของกระปอ ง เชน
รอยบุบท่ีเกิดจากการกระแทก รอยโกงงอ หรือสิ่งผิดปกติอื่นๆ

2.3 การเตรียมกระปองกอนเปด และการเปด กระปอ ง เพื่อทําการ
ตรวจ ลา งกระปอ งดว ยสบแู ละน้ําสะอาดเช็ดใหแหง แลวเช็ดดวยแอลกอฮอลรอยละ
70 (หามลนไฟกระปองบวมเด็ดขาด) สาํ หรับกระปองที่มีรอยรั่วเช็ดดวยแอลกอฮอล
อยางเดียวไมตองลางนํ้า ถา กระปอ งนน้ั เปอ นน้ํามันตองลางดวยแอลกอฮอล หรอื
ปโตรเลียมอีเทอร โดยเฉพาะจดุ ทจ่ี ะทําการเปด ใชตะเกียงแอลกอฮอลลนบริเวณนี้
ใหทั่ว หรือจะเช็ดดวยแอลกอฮอลรอยละ 70 ก็ได

2.4! เปดกระปอ งดวยเครื่องเปด ท่ีผา นการฆาเชอื้ แลว สาํ หรบั
กระปองบวมใหเปด ดวยเคร่อื งเปดทสี่ ามารถเกบ็ กา ซไวต รวจได เครอ่ื งเปด นจ้ี ะมี
ลักษณะที่วางกระปองและมีเครื่องยกแปนใหกระปองขึ้นไปกดกับสกรูซึ่งกลวงและตอ
กับสายยางออกไป ใหเก็บกาซในหลอดแกวแทนที่นํ้า นํากาซที่เกบ็ ไวไ ปตรวจสอบ
วาเปน กา ซอะไรดงั น้ี

2.4.1การตรวจกา ซคารบ อนไดออกไซด คอยๆประกบหลอดกาซ
กับหลอดสารละลายโปแตสเซียมไฮดรอกไซด (KOH) เจือจางใหสารละลายไหลเขา
ไปในหลอดกา ซ เขยา ใหเ ขา กนั กา ซจะทําปฏกิ ริ ยิ ากบั KOH ทําใหเ กดิ สภาพ
สุญญากาศขึน้ ในหลอด ดังนั้นเม่อื คอยๆเปดนว้ิ ที่ปดหลอดอยอู อกจะมคี วามรูส กึ วามี
แรงดดู ทน่ี ว้ิ

2.4.2การตรวจกา ซไฮโดรเจน จดุ าํ ไมข ดี ไฟทป่ี ากหลอด คอยๆ
เลื่อนนิ้วที่ปดปากหลอดออก ถา เปน กา ซไฮโดรเจน จะเกดิ เสยี งดังพบึ

2.5! การเพาะเชอ้ื เปดกระปอ งดว ยทเ่ี ปด ทผ่ี า นการฆา เชอ้ื มา

กอนแลว ในกรณที อ่ี าหารเปน ของแขง็ ใชที่เปดแบบเปดฝาออกไดเลย สําหรบั
อาหารเหลว ใชท เ่ี ปด แบบเจาะรใู หพ อทจ่ี ะจมุ ปเปตลงไปได เมื่อเปดฝากระปองออก
แลวใหครอบบรเิ วณทเ่ี ปด ดว ยฝาจานเพะเชอ้ื ทผ่ี า นการฆา เชอ้ื มาแลว

2.5.1 อาหารทม่ี สี ภาพความเปน กรดต่ํา (pH≥4.5)

การตรวจ Aerobic bacteria นําหลอดที่บรรจุ Dextrose tryptone bromcresol
purple broth ( ดู 1) 4 หลอด ใสอ าหารหลอดละ 2 กรมั หรอื 2 มิลลิลิตร นําหลอด
ไปบมเพาะเชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส และอีก 2 หลอดไปบมเพาะเชื้อที่ 55 องศา
เซลเซียส เปนเวลา 48-72 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 148

การตรวจ Anaerobic bacteria นําหลอดทบ่ี รรจุ Tryptone broth (ดู 2) มา 4
หลอด ใสอ าหารหลอดละ 2 กรมั หรอื 2 มลิ ลิลิตร แลวคอยๆเท Tryptone agar
(ดู 3) ปด ทบั ไวข า งบน ถา สงสยั วา มี Sulfide spoilage ใหใช Sulfide agar (ดู 4)
จํานวน 4 หลอด และดําเนนิ การอยา งเดยี วกนั กบั การตรวจ Anaerobic bacteria นํา
2 หลอดไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส และอีก 2 หลอดไปบมเพาะเชื้อที่ 55
องศาเซลเซยี ส

2.5.2 อาหารทม่ี คี วามเปน กรดสงู (pH ≤4.5) อาหารจําพวกนท้ี ํา
การฆาเช้ือที่อุณหภูมิน้ําเดือดหรือตาํ่ กวาเทา นน้ั เปน การทําลายจลุ นิ ทรยี ช นดิ ทท่ี น
กรดและสามารถเจรญิ เตบิ โตไดบ นอาหารชนดิ นเ้ี ทา นน้ั อาหารทใ่ี ชเ ลย้ี งเช้อื จงึ ตอ งมี
ลักษณะพิเศษที่จะตรวจสอบวามีเชื้อจุลินทรียเหลานี้เหลืออยูอีกหรือไม

การตรวจ Aerobic bacteria นําหลอดที่บรรจุ Orange serum broth (ดู 5) มา 2
หลอด ใสอาหารลงไปหลอดละ 2 กรมั หรอื 2 มลิ ลิลิตร นําไปทําการเพาะเชอ้ื ท่ี 37
องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 72 ชว่ั โมง

การตรวจ Anaerobic bacteria นําหลอดทบ่ี รรจุ Liver broth (ดู 6) มา 2 หลอด
ใสอ าหารลงไปหลอดละ 2 กรมั หรอื 2 มิลลิลิตร คอยๆเท Plain agar (ดู 7) ทับไว
นําไปทําการเพาะเชื้อที่ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 72 ชว่ั โมง

หมายเหตุ 1 จะเห็นไดวาการตรวจ Aerobic และ Anaerobic bacteria ไมใ ช

อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส ทง้ั นเ้ี พราะอาหารทม่ี คี วามเปน กรดสงู ไมค อ ยพบ
Thermophilic bacteria แตอยางไรกต็ ามอาหารจําพวกมะเขอื เทศ น้าํ มะเขอื เทศ
อาจพบพวก Bacillus thermoacidurans ได ถามีเชื้อพวกน้ีอยอู าจสงั เกตไดจาก
กลิ่นของอาหารที่ผิดปกติ แตกระปองไมบวม และอาจจะทาํ การตรวจสอบดงั น้ี

เท Plate โดยใชอาหาร 1 หรอื 0.1 มิลลิลิตร ใช Proteose peptone acid
agar (ดู 8 ) เปนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทาํ 2 ชดุ ชดุ หนง่ึ นําไปเพาะเชอ้ื ท่ี 37 องศา
เซลเซียส และอกี ชดุ หนง่ึ นําไปเพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48-72 ชว่ั โมง

หมายเหตุ 2 ในกรณีที่อาหารจําพวกมะเขอื เทศ สาลี่ สบั ปะรด เกดิ การบวมและมี

กลน่ิ กรด Butyric สันนิษฐานไดว า เกดิ จาก Clostridium paseurianum ใหทดสอบ
โดยการนําเชื้อจากหลอด Anaerobic tube ยอมสีดวย Methylene blue (ดู10) แลว
ตรวจหาเช้ือทม่ี ลี ักษณะคลาย Clostridium ดวยกลองจุลทรรศน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 149

2.5.3 อาหารท่ีมีความเขม ขน สงู เชน มะเขอื เทศเขม ขน เนอ้ื
ผลไมเขมขน การเสยี จะเรม่ิ จากสว นทอ่ี ยตู ดิ กน หรือฝากอน การตรวจจะตองกวน
ตัวอยางใหเขากันกอน น้าํ ตวั อยา งมาเจอื จางดว ยน้ํา และนําไปเพาะเชอ้ื

3. การตรวจอื่นๆที่จําเปน

3.1 การตรวจดว ยกลองจลุ ทรรศน เนอ่ื งจากจลุ นิ ทรียท เ่ี ปน ตน เหตุ

ใหอาหารเสยี อาจตายไปแลว และตรวจไมพ บดว ยวิธีอน่ื การตรวจดว ยกลอง
จุลทรรศนทาํ ไดด งั น้ี

เตรยี ม Smear บนแผน กระจก โดยตักของเหลวดวย Platinum loop
ถาเปนของแข็งใหเติมนาํ้ 1 หยด แลว ละเลงบนแผน กระจก ทาํ ใหแ หง ดว ยความรอ น
ยอ มสดี ว ย Gential violet (ดู 11) หรอื Methylene blue (ดู 10 )

3.2 ตรวจดกู ารสรา งสปอร นําเชอ้ื จาก Agar slant (ดู 9) มาเพาะ
เชื้อที่ 37 และ 55 องศาเซลเซยี ส เปนเวลา 72 ชว่ั โมง แลวตรวจดูสปอรดังนี้

3.2.1 เตรยี ม Smear จาก Agar slant (ดู 9) ทาํ ใหแ หง ดว ย
ความรอน

3.2.2 หยด Malachite green (ดู 12) ลงบน Smear และ
ท้ิงไว 30-60 วินาที และทําใหร อ น

3.2.3 ลางสวนเกินออกดวยนํ้ากอก
3.2.4 จุงลงใน Safranin (ดู 13) ประมาณ 30 วินาที
3.2.5 ลาง ทาํ ใหแ หง และตรวจดดู ว ยกลองจลุ ทรรศน
3.3 วัด pH โดยใชเครื่องวัด pH meter
3.4 ตรวจดลู ักษณะของอาหาร ดูลักษณะทั่วไป และกลิ่น แตอยาชิม
เปน อนั ขาด
3.5 ช่ัง คํานวณน้ําหนกั สทุ ธิ และน้ําหนกั เนอ้ื เพอ่ื ใชป ระกอบการ
พิจารณาวา อาหารจะเต็มเกนิ ไปหรอื ไม

4. ตรวจตะเขบ็ กระปอ ง

ซ่ึงมีรายละเอียดวิธีการตรวจในเร่ืองของตะเข็บกระปองในหนังสือ
อาหารกระปอ งโดยทว่ั ไป

5. วิเคราะหก า ซทอ่ี ยภู ายในกระปอ ง

ในกรณีทีก่ ระปอ งบวม แตม ปี รมิ าณจลุ นิ ทรียต่ํามาก จะตอ งทาํ การ
วิเคราะหกาซที่อยูภายในกระปองดวย ถาการบวมนน้ั เกดิ จากกา ซไฮโดรเจน กา ซจะ
ติดไฟ และภายในกระปอ งจะกรอ นมาก สว นกา ซทเ่ี กดิ จากจลุ นิ ทรียม แี ต

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 150

คารบอนไดออกไซด การตรวจกา ซไฮโดรเจนทําไดง า ยๆ โดยการเจาะรกู ระปอ งท่ี
บวมใกลๆเปลวไฟ ถา มกี า ซไฮโดรเจนกา ซจะตดิ ไฟ

การวิเคราะหผล
การวิเคราะหผลทําไดง า ยๆ โดยดจู ากขอ สรปุ ทใ่ี หไ วข า งลา งน้ี

ตาราง 19 การวินิจฉยั การเสยี ของอาหารกระปอ ง

ลักษณะท่ี สุญญากาศต่ํา กระปอ งรว่ั เกดิ จาก H2 เสยี กอ น ไมไ ดร บั
ปรากฏ การฆา เชอ้ื การฆา เชอ้ื

กระปอง ปกติ อาจปกติ บวม บวม บวม บวม
อาหาร ไมม สี ญุ ญากาศ มีหรือไมมี
ปกติ หรือ ปกติ เปนฟอง นํ้า
ปกติ สญุ ญากาศกไ็ ด อาจเปน ฟอง อาจเปน เมอื กๆ
ปกติหรอื และเนื้ออาหาร
อาจปกติ มีกลิ่นเปรี้ยว มีลักษณะไมสุก
เปนฟอง หรือ
เลก็ นอย กลิ่นเปรี้ยว
มีนํ้าขนุ มกี า ซ CO2
มกี า ซ CO2
กลิ่น ปกติ ปกติหรือ ปกตหิ รอื ปกตหิ รอื
ลดลงเล็กนอย ลดลงเล็กนอย
มีกลิ่นเปรี้ยว มีกลิ่นโลหะ ไมพบจุลินทรีย
พบเชื้อหลาย
กา ซ - ไมมีกาซหรือ มกี า ซ H2 ไมพบจุลินทรีย ชนิดทั้ง Rod
ลดลงเล็กนอย มกี า ซ CO2 มากกวารอยละ และ Cocci
pH ไมพบจุลินทรีย ยสี ตและรา
จากกลอง อาจลดลงหรือ 20 พบทั้ง Aerobic
จลุ ทรรศน ไมพบจุลินทรีย เพิ่มขึ้น ปกติ และ Anaerobic
bacteria ท่ี 37
จากการ พบเชื้อหลาย ไมพบจุลินทรีย และ 55 องศา
เพาะเชอ้ื ชนิดทั้ง Rod เซลเซียส
และ Cocci ไมพบจุลินทรีย
ยสี ต และรา
พบทั้ง Aerobic
และ Anaerobic
bacteria ที่ 37
และ 55 องศา
เซลเซียส

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 151

ตาราง 20 การวินิจฉัยการเสียของอาหารกระปอง (อาหารทม่ี คี วามเปน กรด

ต่ํา pH≥4.5) ใหค วามรอ นไมเ พยี งพอ

ลักษณะท่ี Thermophilic Sulfide Putrefactive Aerobic
ปรากฏ Anaerobic spoilage Anaerobic spore
bacteria bacteria formers
Thermophilic ปกตหิ รอื บวม บวม
Flat sour บวม เลก็ นอ ย บวม
ปกตหิ รอื
กระปอง ปกติอาจมี เปนฟอง มีสีดํา เปนฟอง เปนฟอง
อาหาร สญุ ญากาศหรอื เฉพาะแหง และมีลักษณะ
ปกติหรอื มีกลิ่น
ไมม ีกไ็ ด มีกลิ่นเปรี้ยว มีกาซไขเนา สลายตัว แอมโมเนียเลก็
มีกลิ่นเนา
ปกติหรือ นอย
มีนํ้าขนุ CO2
ลดลงเล็กนอย
กลิ่น ปกติหรือ หรือมากก็ได
มีกลิ่นเปรี้ยว พบจุลินทรีย
ชนิด Rod
กา ซ - CO2 และ H2 H2S CO2 และสปอร
pH ลดลงเล็กนอย ลดลงเล็กนอย ลดลงเล็กนอย ลดลงเล็กนอย
หรือมากก็ได หรือมากก็ได พบทั้ง Aerobic
จากกลอง พบจุลินทรีย พบจุลินทรีย พบจุลินทรีย และ Anaerobic
จุลทรรศน ชนิด Rod แต พบจุลินทรีย ชนิด Rod และ ชนิด Rod และ bacteria ท่ี 37
ไมพบสปอร ชนิด Rod แต และ 55 องศา
ไมคอยพบ พบสปอร พบสปอร
จากการ พบทั้ง Aerobic เซลเซียส
เพาะเชอ้ื และ Anaerobic สปอร พบ Anaerobic พบ Anaerobic พรอมทั้งเปนฝา
bacteria ที่ 37 bacteria ที่ 55 bacteria ที่ 37
และ 55 องศา พบ Anaerobic องศาเซลเซียส องศาเซลเซียส ที่ผิว
bacteria ท่ี 55
เซลเซียส องศาเซลเซียส
อาจพบบา งท่ี

37 องศา
เซลเซียส

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 152

ตาราง 21 การวินิจฉัยการเสียของอาหารกระปอง (อาหารทม่ี คี วามเปน กรดสงู

pH≤4.5) Flat sour ใหค วามรอ นไมเ พยี งพอ Nonspore formers
Butyric anaerobic
ลักษณะทป่ี รากฏ ปกติ bacteria บวม
มหี รอื ไมม สี ญุ ญากาศ บวม
กระปอง ปกติ หรือมีนํ้าขุน ปกติ หรือเปนฟอง อาจมี
มีกาซและมีฟองมาก เชอื้ ขึ้นที่ผิวของอาหารได
อาหาร
มีกลิ่นเปรี้ยว มีกลิ่นกรด Butyric acid ปกติหรือมีกลิ่นยีสต
กลิ่น - H2 และ CO2 CO2
กา ซ ลดลงมาก
PH ลดลงเล็กนอย ปกติหรือลดลงเล็กนอย
หรือมากก็ได พบจุลินทรยี ชนิด Rod
จากกลองจุลทรรศน พบจุลินทรยี ชนิด Rod พบทั้ง Rod, Cocci
ยสี ตและรา
จากการเพาะเชื้อ พบ Aerobic bacteria ท่ี พบ Anaerobic bacteria
พบ Aerobic และ
55 องศาเซลเซียส ท่ี 37 องศาเซลเซียส Anaerobic bacteria ที่

37 และ 55 องศา
เซลเซียส

การตรวจ Incubation test

วิธีน้ีใชเวลานอ ย เปน การทดสอบวา อาหารจะเสยี หรอื ไม วธิ กี ารตรวจสอบมี
ดงั น้ี

การเก็บตัวอยาง ควรเก็บตัวอยางอยางนอย 24 ตัวอยา ง อยาเก็บตัวอยาง
ซ้ําจากกลองเดียวกัน

การเพาะเชอ้ื อุณหภูมิและเวลาในการเพาะเชือ้ นน้ั ข้นึ อยูก ับ pH ของอาหาร

1.! อาหารท่ีมสี ภาพความเปน กรดต่ํา (pH ≥4.5) ทําการเพาะเชื้อท่ี 37
องศาเซลเซียส เปนเวลา 14-30 วัน หรอื ทําการเพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศาเซลเซยี ส เปน
เวลา 7-10 วัน

ขอยกเวน อาหารจําพวกเนื้อและปลา ไมตองทําการเพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศา
เซลเซียส แตถามีธัญพืชผสมอยูดวย เชน ขา ว การเพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศาเซลเซยี สก็มี
ความจําเปน

2.! อาหารทม่ี สี ภาพความเปน กรดสงู (pH ≤4.5) ทําการเพาะเชอ้ื
กระปองที่ 37 องศาเซลเซยี ส เปน เวลานาน 14 วัน

ขอยกเวน ถา เปน ผลติ ภณั ฑจ ากมะเขอื เทศ ควรทําการเพาะเชอ้ื ท่ี 55 องศา
เซลเซียสดวย เพื่อทําการตรวจสอบ Thermophilic bacteria ที่อาจหลงเหลืออยู หรอื
ทําการเพาะเชื้อที่ 32 องศาเซลเซยี ส ถา สงสยั วา มี Butyric anaerobes อยูดวย

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 153

การวิเคราะหผล

1.! อาหารท่ีมีการฆา เชอ้ื อยา งสมบรู ณ กระปอ งจะไมบ วมผดิ ปกติ หรือเสีย
ดวยสาเหตุอื่น เชน Flat sour

2.! ถากระปอ งบวม ตองนําไปตรวจหาสาเหตุดวยวิธีที่กลาวมาแลว
3.! เม่ือถึงเวลาทกี่ ําหนด ตองเปดกระปองดู เพราะถงึ แมว า กระปอ งจะไม

บวมก็ตาม อาหารอาจจะมกี ารเสยี แบบ Flat sour ได

การตรวจจลุ นิ ทรียแ บบ Sterility test

เปนการตรวจสอบวา จะมจี ลุ นิ ทรียเหลอื ภาพหลงั การฆา เชอ้ื อกี หรอื ไม โดย
ปกติแลวจะทําการตรวจกระปอ งทผ่ี ลติ ออกมาใหมๆ หรือกระปองที่มีลักษณะปกติ
วิธีการตรวจก็เหมือนกับการตรวจหาสาเหตุของการเสียทุกประการ แตใ ชป รมิ าณ
อาหารมากกวา เชน ใช 15-25 กรมั

จุลนิ ทรียท่ีเก่ียวขอ งกบั การเสยี ของอาหารกระปอ ง

Flat sour (Low acid foods): Bacillus stearothermophilus

Bacillus pepo

Flat sour (High acid foods): Bacillus coagulans

Thermophilic anaerobes : Clostridium thermosaccharolyticum

Sulfide spoilage : Clostridium nigrificans

Putrefactive anaerobes : Clostridium histolytica

Clostridium sporogenes

Clostridium botulinum

Clostridium putrefaciens

Clostridium bifermentans

Aerobic spore formers : Bacillus subtilis

Bacillus mesentericus

Butyric anaerobes : Clostridium butyricum

Clostridium pasteurianum

Nonspore formers : Streptococcus

Micrococcus

Lactobacillus

Microbacterium

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 154

อาหารทใ่ี ชเ ลย้ี งเชอ้ื

1.! Dextrose Tryptone Bromcresol Broth

Tryptone or Trypticase 10 กรมั
Dextrose 5 กรมั
Bromcresol purple 0.04 กรมั
Distilled water 1 ลิตร
pH 6.8
ตมจนละลาย ใสหลอดหรือขวด ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส

นาน 15 นาที

2.! Tryptone Broth

เปน อาหารทใ่ี ชต รวจ Thermophilic anaerobes ท่ีไมส รา ง H2S รวม
ทง้ั Putrefactive anaerobes และ Mesophilic anaerobes อื่นๆ

Tryptone or Trypticase 10 กรมั

Dextrose 5 กรมั

Dipotassium phosphate 1.25 กรมั

Yeast extract 1 กรมั

Distilled water 1 ลิตร

pH 6.8

ใสหลอดๆละ 6-8 มลิ ลิลิตร ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซียส 20 นาที

กอนใชควรไลอ ากาศ โดยใชไอนํ้าประมาณ 20 นาที

3.! Tryptone Agar
เปนอาหารทใ่ี ชป ด หนา Tryptone Broth ประกอบดว ย

Tryptone or Trypticase 5 กรมั
กรมั
Agar 20 ลิตร

Distilled water 1

pH 6.8

ฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 155

4.! Sulfide Agar
ใชเ ปน อาหารตรวจสอบ Clostridium nigrificans ท่ีสรา งกา ซ H2S

Tryptone or Trypticase 10 กรมั

Sodium sulfide (Anhydrous) 1 กรมั

Agar 20 กรมั

Distilled water 1 ลิตร

ใสหลอดละ 15 มิลลิลิตร และตะปูตัวเล็กๆ 1 ตัว ฆา เชอ้ื ท่ี 121

องศาเซลเซยี ส นาน 20 นาที ไมค วรเตรยี มอาหารชนดิ นไ้ี วเ กนิ 7 วัน

5.! Orange Serum Broth

อาหารชนิดน้ีเหมาะสําหรับเลี้ยงเช้ือจุลินทรียที่เจริญเติบโตไดใน
อาหารทม่ี สี ภาพความเปน กรดสงู เชน Bacillus coagulans, Lactobacillus และ
Butyric acid forming anaerobes แตไมเ หมาะสมสําหรบั Butyric anaerobes เพราะ
เกดิ กา ซมาก

Tryptone or Trypticase 10 กรมั

Yeast extract 3 กรมั

Dextrose 4 กรมั

Dipotassium phosphate 3 กรมั

Distilled water 800 มลิ ลิลิตร
Orange serum*
200 มลิ ลิลิตร

pH 5.5

ฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที
*Orange serum เตรียมจากนํ้าสม ทท่ี ําใหร อ น 93 องศาเซลเซยี ส

เติม Filter aid 30 มลิ ลิลิตร คนใหเ ขา กัน กรอง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 156

6. Liver Broth with Crushed Tomatoes

เปนอาหารทเ่ี หมาะสาํ หรบั แยกเชอ้ื Butyric acid forming

anaerobes และจลุ นิ ทรียชนิดท่ีทนกรดอน่ื ๆ จากอาหารกระปอ งทเ่ี สยี เชอ้ื ชนดิ น้ี

สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรียชนิดอื่นๆได

Liver broth 500 มลิ ลิลิตร

Crushed tomatoes 500 มิลลิลิตร

ใสตับบดลงไปหลอดละ 0.5 นว้ิ แลวเติมนํ้าลงไปใหท ว ม ฆา เชอ้ื ท่ี

121 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที

7.! Plain Agar for Covering

Agar 20 กรมั
Distilled water 1 ลิตร
ตมใหเดือด ใสหลอด หรือขวด ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส

นาน 15 นาที

8.! Proteose Peptone Acid Agar

เปนอาหารทใ่ี ชส าํ หรบั ตรวจจลุ ินทรียในน้ํามะเขอื เทศ คือ Bacillus
thermoacidurans

Proteose peptone or Polypeptone 5 กรมั

Yeast extract 5 กรมั

Dipotassium phosphate 4 กรมั

Dextrose 5 กรมั

Distilled water 500 มิลลิลิตร

pH (adjusted with HCl) 5

ฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส 30 นาที กอนใชใหเติมวุนรอยละ 4 ใน

สัดสวน 1:1

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 157

9.! Nutrient Agar

Beef extract 3 กรมั

Peptone 5 กรมั

Agar 15 กรมั

Distilled water 1 ลิตร

pH 6.8

ตมจนละลาย ใสหลอด หรือขวด ฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซียส

นาน 15 นาที

10.!Methylene Blue Stain

Methylene blue 5 กรมั
Distilled water 100 มลิ ลิลิตร

11.!Gential Violet Stain

Gential violet, crystalline 1 กรมั
Distilled water 100 มลิ ลิลิตร

12.!Malachite Green Stain

Malachite green 5 กรมั
Distilled water 100 มลิ ลิลิตร

13.Safranin Stain

Safranin 0.5 กรมั
Distilled water 100 มิลลิลิตร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 158

การเส่ือมเสยี ของอาหารกระปอ ง

Gas (Swell) No gas (Flat)

H2 CO2 H2+CO2 Drop in pH H2S Odor Molds
Blackened Usually
(Corn, peas) leakage
Sulfide
spoilage

Alcoholic Cured meats Thermophilic Mesophilic
Yeasts Bacillus sp. Flat sour

Thermophilic Mesophilic Flat sour Lactobacilli Mixed

(Acid odor) (Fruits) flora

leakage

Putrid odor Acid odor
putrefactive
anaerobes

Butyric Mixed Aerobacilli
fermentation fermentation
saccharolytic mixed flora
anaerobes (leakage)

ภาพ 20 การเส่ือมเสยี ของอาหารกระปอ ง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 159

ตาราง 22 ความสัมพันธระหวา งอุณหภมู แิ ละเวลาในการทําลายสปอรข อง
Bacillus stearothermophilus ในสภาพเดียวกัน

อุณหภมู ิ(องศาเซลเซยี ส) เวลา(นาที)

100 1,200
105 600
110 190
115 70
120 19
125 7
130 3
135 1

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 160

การวเิ คราะหน มขน หวาน

นมขนหวาน (Sweetened condensed milk) เปนนมชนดิ หนง่ึ ทน่ี ยิ มบรโิ ภค
กันมาก คณุ สมบตั ทิ าง Keeping quality ของนมขนหวาน ขน้ึ อยกู บั ประสทิ ธภิ าพใน
การฆาเชื้อของผลิตภัณฑสุดทาย หรอื จากการปอ งกนั การแพรป นเปอ นระหวา งการ
ใหความรอนครั้งสุดทาย ซง่ึ อาจเกดิ ไดเ นอ่ื งจากกระปอ งนน้ั มรี อยตะเกบ็ ไมส นทิ ใน
Cooling water จึงมีการปองกนั พวกจลุ นิ ทรยี ท เ่ี ปน เชอ้ื โรคและเปน พวกทท่ี ําให
อาหารเนาเสยี โดยการเตมิ สารประกอบคลอรนี ลงไป เพื่อทําลายจลุ นิ ทรียเ หลา น้ี
นมขน หวานไมไ ดเ ปน Sterile product เลยทเี ดยี ว แตข น้ึ อยกู บั ความเขม ขน ของ
น้ําตาลซูโครส ในผลติ ภณั ฑท จ่ี ะปอ งกนั การรกั ษาไมใ หเ กดิ การเนา เสยี ไดง า ยๆ

การเตรียมตัวอยาง
1.! นมขนหวานอาจจะเหนยี วหรือขน มาก กอ นทําการทดลองควรนําไปอนุ

ใน Water bath ท่ี 45 องศาเซลเซยี ส นาน 15 นาที กอ นทจ่ี ะเปด
กระปองเพื่อลดความเหนียวของนมขนหวานลง
2.! เปดกระปอ งนมขน หวานเชน เดยี วกบั อาหารกระปอ งอยา ง Aseptic
technique

การวิเคราะหจุลินทรีย

1.! เตรียมการเจอื จาง ใชป เปตดดู นมขน หวานขน้ึ มา 10 กรมั ใสลงใน
Sterile flask ขนาด 250 มลิ ลิลิตร เติม Quarter-strength ringer’s
solution ท่ี 37 องศาเซลเซียส เขยา ประมาณ 25 ครง้ั เตรยี ม Dilution
ไปเรอ่ื ยๆจนถงึ ความเจอื จางทร่ี ะดบั 10-3

2.! การดูดเชอ้ื ลงจานเพาะเชอ้ื และการเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื ดดู สารละลาย
แตละ Dilution ออกมาคร้ังละ 1 มิลลิลิตร ใสล งในจานเพาะเชอ้ื อยางละ
2 จาน เติมอาหารเลี้ยงเชื้อดังตอไปนี้
2.1! สําหรบั พวก Mesophilic microorganism ใหเ ทอาหารเลย้ี งเชอ้ื
Total plate count agar ลงไป และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศา
เซลเซียส นาน 3 วัน นบั จํานวนโคโลนี และรายงานผล
2.2! สําหรบั พวก Lipolytic microorganism ใหเทอาหารเลี้ยงเชื้อดวย
Tributyrin agar และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศาเซลเซียส
นาน 3 วัน นบั จํานวนโคโลนี และรายงานผล
2.3! สําหรบั พวก Coli-aerogenes bacteria ใหเทอาหารเลี้ยงเชื้อดวย
Violet red bile agar และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศาเซลเซียส

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 161

นาน 24 ชว่ั โมง และดดู เชอ้ื ทเ่ี จอื จาง Dilution ละ 1 มลิ ลิลิตร
ลงใน MacConkey’s broth และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศา
เซลเซยี ส นาน 48 ชว่ั โมง ถาหากเปน Positive tube อาจ
Subculture ลงใน MacConkey’s agar อีกครั้งหนึ่ง เพื่อเปนการ
ทํา Confirmed test
2.4! สําหรบั พวก Yeast and mold เทอาหารเลี้ยงเชื้อดวย Malt
extract agar และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 22-25 องศาเซลเซยี ส
นาน 3-5 วัน
รายงานผลการวิเคราะหทั้งหมดตอนํ้าหนกั นมขน หวาน 1 กรมั ซึ่งปกติ
นมขนหวานไมค วรมี Viable count มากกวา 100 ตอกรัม และไมค วรมี
จุลนิ ทรียท เ่ี ปน Lypolytic microorganism มากกวา 10 ตอกรัม

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 162

มาตรฐานทางจลุ นิ ทรยี ข องอาหารควบคมุ

1. ผลติ ภณั ฑน ม

ผลิตภัณฑน มโคเปน อาหารควบคมุ เฉพาะ
1.1! นมโคสดผา นความรอ นตามกรรมวิธพี าสเจอรไ รส สเตอริไลส หรอื

ยู เอส ที ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรยี  คือ
1.1.1! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี ชนดิ E.coli ในผลิตภัณฑ 0.1
มิลลิลิตร และ
1.1.2! ตรวจไมพบแบคทเี รยี ในนมสเตอริไลส 0.1 มลิ ลิลิตร
1.1.3! และใหม แี บคทเี รยี ไมเ กนิ 50,000 ในนมสดพาสเจอรไ รส 1

มิลลลิ ติ ร และไมเกิน 10 ในนมสด ยู เอส ที
1.2! นมผง ตอ งมคี ุณภาพทางจลุ ินทรียดังน้ี มแี บคทเี รยี ไมเ กนิ 100,000

ในอาหาร 1 กรมั และไมป รากฏเชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
1.3! นมขน ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรียด งั น้ี

1.3.1! ตรวจไมพบแบคทีเรียในนมขนไมหวานและนมขนขาด

มันเนยไมห วาน 0.1 มิลลิลิตร

1.3.2! มีแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10,000 ในนมขน หวาน และนมขน ขาด
มันเนยหวาน 1 กรมั

1.3.3! ตรวจไมพบแบคทีเรียจําพวกโคลิฟอรมในนมขนหวานและ
นมขนขาดมันเนยหวาน 0.1 กรมั

1.3.4! มียีสตและเชอ้ื รารวมกนั ไดไ มเ กนิ 10 ในนมขน หวาน และ
นมขนขาดมนั เนยหวาน 1 กรมั

1.3.5! ไมม เี ชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

1.4! นมคืนรูป ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรียดังนค้ี อื มคี ณุ ภาพเชน เดยี วกบั
นมสด และนมขน

1.5! เนยเหลว และเนยแขง็ กีแทและกีเทียม ตอ งมคี ณุ ภาพทางดา น

จุลนิ ทรียค ือตอ งไมม เี ชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
1.6! นมดัดแปลงสําหรบั ทารก ตอ งมคี ณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรียด งั น้ี

1.6.1! ตอ งไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

1.6.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียหรือสารพิษอ่ืนในปริมาณที่อาจ
เปน อนั ตรายตอ สขุ ภาพ

1.6.3! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli ในนมดัดแปลงสําหรบั ทารก
0.1 กรมั หรอื 0.1 มิลลิลิตร

1.6.4! ตรวจไมพบแบคทีเรียในนมดัดแปลงสําหรับทารกที่ใช

กรรมวธิ ีสเตอรไิ ลส 0.1 มิลลิลิตร

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 163

1.6.5! ตรวจพบแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10,000 ในนมดัดแปลงสําหรบั

ทารกชนดิ ผงหรอื แหง 1 กรมั

1.6.6! ตรวจพบแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10 ในนมดดั แปลงสําหรบั ทารกท่ี

ใชก รรมวธิ ี ยู เอส ที 1 มิลลิลิตร

1.7! นมปรุงแตงกลิ่น

1.7.1! นมปรุงแตงกลิ่นชนิดผง ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรยี ด งั นค้ี อื

ตองไมมีเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท ท่ี ําใหเ กดิ โรค และไมม สี ารพษิ จาก

เช้ือจุลินทรียใ นปรมิ าณทอ่ี าจเปน อนั ตรายตอ สขุ ภาพ และมี

แบคทเี รยี ไดไ มเ กนิ 100,000 ในอาหาร 1 กรมั

1.7.2! นมปรุงแตงกลิ่นชนิดเหลวตองมีคุณภาพทางจุลินทรียดังนี้

คือตองไมม เี ชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท ท่ี าํ ใหเ กดิ โรค และสารพษิ จาก

จุลนิ ทรีย ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli ในอาหาร 0.1

มิลลิลิตร นอกจากนต้ี อ งตรวจไมพ บแบคทเี รยี ในนม

ปรุงแตงสเตอริไรส 0.1 มลิ ลิลิตร และมแี บคทเี รยี ไดไ มเ กนิ

50,000 ในนมปรงุ แตง พาสเจอรไ รส 1 มลิ ลิลิตร และไมเกิน

10 ในนมปรงุ แตง ยู เอส ที 1 มิลลิลิตร

1.8! นมเปรี้ยว ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรียด งั นค้ี อื ตอ งตรวจไมพ บ

แบคทเี รยี E.coli ในอาหาร 0.1 กรมั และตอ งไมม แี บคทเี รยี ทท่ี ําให

เกดิ โรค

1.9! ครมี

1.9.1! ครีมแทสด ครมี ผสม ครมี เทยี ม ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรยี 

ดังนี้ ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli ในอาหาร 0.01 กรมั และ

ตองไมม เี ชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

1.9.2! ครีมแทท่ีทําใหแหง ครมี ผสมทท่ี ําใหแ หง ครมี เทยี มทท่ี ําให

แหง ตอ งมคี ณุ ภาพทางจลุ นิ ทรียดงั น้ี ตรวจพบแบคทเี รยี

ไดไมเกิน 100,000 ในอาหาร 1 กรมั และตองไมมีเชื้อ

จุลนิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

1.10! ไอศกรมี หวานเย็น ไอศกรมี นม ไอศกรีมดัดแปลง ไอศกรีมผสม

มีแบคทเี รยี ไดไ มเ กนิ 600,000ในอาหาร 1 กรมั ตรวจไมพ บแบคทเี รยี

E.coli ในอาหาร 0.01 กรมั และไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

สวนไอศกรมี ชนดิ แหง หรอื ผง มแี บคทเี รยี ไดไ มเ กนิ 100,000 ใน

อาหาร 1 กรมั และตอ งไมม เี ชอ้ื จลุ ินทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 164

2.! อาหารเสริมสําหรับเด็ก ทง้ั อาหารเสรมิ ครบถว น และเสริมเฉพาะอยาง

ผลิตภัณฑด งั กลา วนจ้ี ะตอ งมคี ณุ ภาพดา นจลุ นิ ทรียด งั นค้ี อื
2.1! ตอ งไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

2.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียหรือสารพิษอื่นในปริมาณท่ีเปนอันตรายตอ
สขุ ภาพ

2.3! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli ในอาหารเสริม 0.1 กรมั หรอื 0.1
มิลลิลิตร

2.4! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี ในอาหารเสรมิ ทใ่ี ชก รรมวธิ ีสเตอรไิ รส 1
มลิ ลิลิตร

2.5! ตรวจพบแบคทเี รยี ไมเ กนิ 50,000 ในอาหารเสรมิ ชนดิ แหง ทไ่ี มต อ ง
ผานการหงุ ตม กอ นรบั ประทาน 1 กรมั และไมเกิน 100,000 ในอาหาร
เสริมชนิดแหง ทต่ี อ งผา นการหงุ ตม กอ นรบั ประทาน 1 กรมั

2.6! ตรวจพบแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10 ในอาหารเสรมิ ทใ่ี ชก รรมวธิ ี ยู เอส ที 1
มลิ ลิลิตร

3.! น้ําบริโภคและเครอ่ื งดม่ื ในภาชนะบรรจปุ ด สนทิ นา้ํ แขง็ และเครื่องดื่ม

เกลอื แร

ตองมคี ณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรียด งั น้ี
3.1! ตรวจพบแบคทีเรียชนิดโคลิฟอรมนอยกวา 2.2 ตอนํ้าบรโิ ภค 100

มลิ ลิลิตร โดยวิธี MPN
3.2! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli
3.3! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
3.4! ไมม ยี สี ตแ ละรา
4.! น้ําแร

ตองมีคณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรยี ด งั น้ี
4.1 ตรวจพบจลุ นิ ทรียท่ีเจรญิ เตบิ โตไดท ่ี 30-37 องศาเซลเซียส 48 ชว่ั โมง
ไมเกิน 500 โคโลนีตอนํ้าแร 1 มลิ ลิลิตร
4.2 ตรวจพบแบคทีเรียชนิดโคลิฟอรมนอยกวา 2.2 ตอนํ้าบรโิ ภค 100
มลิ ลิลิตร โดยวิธี MPN
4.3 ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli
5.! ซอสพริก ซอสมะเขือเทศ ซอสมะละกอ ซอสแปง หรอื ซอสแปง ผสมสี

และซอสผสม

ตองมคี ณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรียด งั น้ี
5.1!มีแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10,000 ในอาหาร 1 กรมั

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 165

5.2!ตรวจพบแบคทเี รยี ชนดิ E.coli นอ ยกวา 3 ในอาหาร 1 กรมั โดยวิธี
MPN

5.3!มียีสตและรารวมกนั ไมเ กนิ 10 ในอาหาร 1 กรมั
5.4!ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
6.! อาหารกึ่งสําเรจ็ รปู

6.1!กวยเตี๋ยว กวยจบ๊ั บะหม่ี เสน หม่ี และวนุ เสน ทป่ี รุงแตง คุณภาพทาง

จุลินทรียในตัวผลิตภัณฑตองเปนดังนี้
6.1.1! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
6.1.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียในปริมาณท่ีอาจเปนอันตรายตอ

สขุ ภาพ

6.1.3! มีแบคทเี รยี ชนดิ E.coli (โดยวิธี MPN ) นอ ยกวา 3 ใน
อาหาร 1 กรมั

6.1.4! มีแบคทเี รยี ไมเ กนิ 10,000ในอาหาร 1 กรมั สาํ หรบั บะหม่ี

และไมเ กิน 30,000ในอาหาร 1กรมั สําหรบั กว ยเตย๋ี ว กว ยจบ๊ั

เสน หม่ี และวุนเสน
6.1.5! มีเช้ือราไมเ กนิ 100 ในอาหาร 1 กรมั

6.2!มาตรฐานเครื่องปรุงที่บรรจุควบคูกับผลิตภัณฑขอ 6.1 ตองมคี ุณภาพ

ทางจลุ นิ ทรียด งั น้ี
6.2.1! มีแบคทเี รยี ไมเ กนิ 500,000ในอาหาร 1 กรมั

6.2.2! มีแบคทเี รยี ชนดิ E.coli (โดยวิธี MPN ) นอ ยกวา 3 ใน
อาหาร 1 กรมั

6.2.3! มีเช้ือราไมเ กนิ 500 ในอาหาร 1 กรมั
6.2.4! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
6.2.5! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียในปริมาณที่อาจเปนอันตรายตอ

สขุ ภาพ
6.3!ขาวตมและโจกที่ปรุงแตง ตอ งมคี ุณภาพจลุ นิ ทรียด งั น้ี

6.3.1! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
6.3.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียในปริมาณท่ีอาจเปนอันตรายตอ

สขุ ภาพ

6.3.3! มีแบคทเี รยี ชนดิ E.coli (โดยวิธี MPN ) นอ ยกวา 3 ใน
อาหาร 1 กรมั

6.3.4! มีเช้ือราไมเ กนิ 100 ในอาหาร 1 กรมั

6.4 แกงจดื และซปุ ชนดิ เขม ขน ชนิดกอน ชนดิ ผงหรอื ชนดิ แหง ตองมี

คุณภาพทางจลุ นิ ทรียด งั น้ี

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 166

6.4.1! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

6.4.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียในปริมาณที่อาจเปนอันตรายตอ

สขุ ภาพ

6.4.3! มีแบคทเี รยี ชนดิ E.coli (โดยวิธี MPN ) นอ ยกวา 3 ใน
อาหาร 1 กรมั

6.4.4! มีเช้ือราไมเ กนิ 100 ในอาหาร 1 กรมั
6.5! แกงและน้ําพรกิ ตา งๆ ตองมคี ุณภาพดา นจลุ นิ ทรียด งั น้ี

6.5.1! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค

6.5.2! ไมมีสารพิษจากจุลินทรียในปริมาณท่ีอาจเปนอันตรายตอ

สขุ ภาพ

6.5.3! มีแบคทเี รยี ชนดิ E.coli (โดยวิธี MPN ) นอ ยกวา 3 ใน
อาหาร 1 กรมั

6.5.4! มีเช้ือราไมเ กนิ 100 ในอาหาร 1 กรมั
7.! กาแฟ

ตองมคี ณุ ภาพจลุ นิ ทรียด งั น้ี
7.1! ตรวจพบแบคทีเรียชนิดโคลิฟอรมนอยกวา 2.2 ตอนํ้าบรโิ ภค 100

มลิ ลิลิตร โดยวิธี MPN
7.2! ตรวจไมพ บแบคทเี รยี E.coli
7.3! ไมม จี ลุ นิ ทรียท่ีทําใหเ กดิ โรค
7.4! ไมม สี ารพษิ จากจลุ นิ ทรียในปริมาณทอ่ี าจเปน อนั ตรายตอ สขุ ภาพ
7.5! ไมม ยี สี ตแ ละรา

8.! อาหารในภาชนะบรรจทุ ป่ี ด สนทิ

ตองมีคุณภาพมาตรฐานทางจลุ ินทรียด งั น้ี
8.1 ตรวจพบจลุ นิ ทรียท่ีเจรญิ เตบิ โตไดท อ่ี ณุ หภมู ิ 37 องศาเซลเซยี ส หรอื 55
องศาเซลเซยี ส ไมเ กิน 1,000 ตออาหาร 1 กรมั สําหรบั อาหารทผ่ี า นกรรมวธิ ี
การใชทําลายหรือยับยั้งการขยายพันธุของจุลินทรียดวยความรอนภายหลัง
หรือกอนการบรรจหุ รอื ปด ผนกึ ซง่ึ เกบ็ รกั ษาไวใ นภาชนะบรรจทุ ป่ี ด สนทิ ท่ี
เปนโลหะหรือวัตถุอื่นที่คงรูปที่สามารถปองกันมิใหอากาศภายนอกเขาไปใน
ภาชนะไดและสามารถเก็บรักษาไวไดในอุณหภูมิปกติ

และไมเกิน 10,000 ตออาหาร 1 กรมั สําหรบั อาหารในภาชนะบรรจุ
ชนิดลามเิ นต ฉาบ เคลือบ อัด หรือติดดวยโลหะหรือสิ่งอื่นใด หรอื อาหารใน
ภาชนะบรรจุที่เปนขวดแกวที่ฝามียางหรือวัสดุอื่นผนึก หรอื อาหารในภาชนะ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วริ ิยจารี 167

บรรจุอื่น ซ่ึงสามารถปอ งกนั มใิ หค วามชน้ื หรอื อากาศผา นซมึ เขา ภายใน
ภาชนะบรรจุนั้นไดในสภาวะปกติและสามารถเก็บรักษาไวไดในอุณหภูมิปกติ
8.2 ตรวจไมพบแบคทีเรียชนิดโคลิฟอรม หรอื ตรวจพบแบคทเี รยี ชนดิ
โคลฟิ อรม ไมเ กนิ 3 ตออาหาร 1 กรมั ในกรณีตรวจโดยวิธี MPN
8.3 ตรวจพบยสี ตแ ละราไมเ กนิ 100 ตออาหาร 1 กรมั
9. อาหารแชแ ขง็ ทผ่ี า นการแปรรปู แลว

ผลิตภัณฑอาหารแชแข็งท่ีผานการแปรรูปแลวมีจุลินทรียไดไมเกิน
50,000 โคโลนีตอกรัม และมีโคลิฟอรมไดไมเกิน 10 โคโลนีตอกรัม และตอง
ปราศจาก Staphylococcus และ Salmonella ชนิดท่ีกอ ใหเกดิ โรคระบบทาง
เดนิ อาหาร

ผักแชแ ขง็ มแี บคทเี รยี ไดไ มเ กนิ 100,000 โคโลนีตอกรัม สวนผลไม
แชแ ขง็ ควรมจี ลุ นิ ทรียไ ดน อ ยกวา ผกั แชแ ขง็

ของหวานแชแ ขง็ จะมจี ลุ นิ ทรียไดไ มเ กนิ 50,000-100,000 โคโลนีตอ
มลิ ลิลิตรหรือกรัม
10. ผลิตภัณฑเน้ือ ปลา สตั วน า้ํ ประเภทมเี ปลอื ก

เน้ือบดมจี ลุ นิ ทรียไ ดไ มเ กนิ 250,000–10,000,000 โคโลนีตอกรัม
หรอื 10,000 –100,000 โคโลนีตอ เน้อื ที่มพี ื้นทีผ่ วิ 1 ตารางเซนตเิ มตร สวน
เนอ้ื สดมจี ลุ นิ ทรียไ ดไ มเ กนิ 2,000,000 –5,000,000 โคโลนีตอกรัม

สว นสตั วป ก มจี ลุ นิ ทรียไดไ มเ กนิ 5,000 โคโลนีตอสัตวปกที่มีพื้นที่ผิว
1 ตารางเซนตเิ มตร หรือไมเกิน 100,000 โคโลนีตอกรัม

สวนไสกรอกที่ผานความรอนแลวและแฮมกระปองมีจุลินทรียได
ไมเกิน 10,000 โคโลนีตอกรัม ไมควรมีเชือ้ โคลิฟอรม ในผลติ ภณั ฑเ นอื้ 0.1
กรัม และไมค วรมเี ชอ้ื E.coli และ Clostridium perfringens ในผลิตภัณฑ
เน้ือ 1 กรมั และควรปราศจากเชอ้ื ชนดิ ทเ่ี ปน พษิ ทกุ ชนดิ และมีสปอรไ ดไ ม
เกิน 10 โคโลนีตอกรัม

ปลามจี ลุ นิ ทรียไ ดไ มเ กนิ 100,000 โคโลนีตอกรัม กงุ มจี ลุ นิ ทรยี ไ ด
ไมเกิน 500,000 โคโลนีตอกรัม เนอ้ื ปมู จี ลุ นิ ทรียไดไ มเ กนิ 100,000 โคโลนี
ตอกรัม และมี S.aureus โคลิฟอรมไดไมเกิน 100 โคโลนีตอกรัม หรือมี
Enterococci ไดไมเกิน 1,000 โคโลนีตอกรัม

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 168

การวเิ คราะหท างจลุ นิ ทรยี ด ว ยวธิ เี รว็

ในระยะหลงั ทผ่ี า นมา อุตสาหกรรมอาหารไดข ยายตัวอยา งรวดเรว็ ระบบการขนสง

ผลิตภัณฑไดเพม่ิ ความซบั ซอ นมากขน้ึ การควบคมุ คณุ ภาพอาหารไดป รบั ปรงุ วธิ กี าร

อยางรวดเร็ว แนวโนม ความสนใจในเรอ่ื งการปอ งกนั การเสอ่ื มเสยี ของอาหารและการปนเปอ น

จากเชื้อจุลินทรียที่ทําใหเ กดิ โทษไดข ยายตัวอยา งกวา งขวาง ดงั นน้ั การมงุ เนน ในการควบคมุ

คุณภาพใหไดมาตรฐานจงึ เปน สง่ิ ทจ่ี าํ เปน อยา งยง่ิ

การควบคุมกระบวนการผลติ ใหม คี ณุ ภาพทางดา นจลุ นิ ทรยี ท ด่ี ี จะตอ งมกี ารควบคุม
คุณภาพตั้งแตวัตถุดิบ จนถงึ ผลติ ภณั ฑส ดุ ทา ย ขอกาํ หนดเวลาในการวเิ คราะหจ ลุ ินทรยี เ ปน
สิ่งที่สําคัญ โดยปกติการวเิ คราะหป รมิ าณจลุ นิ ทรยี จ ะใชเ วลาในการวเิ คราะหป ระมาณ 24-72
ชั่วโมงหลังจากไดรับตวั อยา งมา ซง่ึ มผี ลกระทบตอ ขนาดของวตั ถดุ บิ และรายการผลติ ภณั ฑ
ตัวอยางที่จะวิเคราะห ในการวเิ คราะหท างจลุ นิ ทรยี เ ปน ทท่ี ราบกนั วา ใชเ วลาในการวเิ คราะห
คอนขางมาก ทง้ั การเตรยี มตวั อยา ง และการวิเคราะหในหองปฏิบัติการซึ่งตองใชหลอดทดลอง
และจานเพาะเชื้อคอนขางมาก และเปน กจิ กรรมทท่ี ําซา้ํ ๆกนั ดังน้นั ดวยเหตผุ ลดังกลาวอาจจะ
ทําใหเกิดความคลาดเคลอ่ื นในการรายงานผลการตรวจเชอ้ื ได ปกตมิ กั จะเกดิ ความยงุ ยากใน
การอานผลและวิเคราะหผล

ผลการวิเคราะหท างจลุ นิ ทรยี จ ะขน้ึ อยกู บั วธิ กี ารสมุ และการเตรยี มตวั อยา ง และปกติมัก
จะบอกในเชงิ ปรมิ าณเปน ปรมิ าณจลุ นิ ทรยี ท ง้ั หมด (Total count) ซึ่งใหผลคอนขางคลุมเครือ
และอาจจะไมถูกตอง โดยทว่ั ไปปรมิ าณจลุ นิ ทรียท้ังหมดทน่ี บั จํานวนในรปู Colony forming
unit (cfu) ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไดทาํ การเพาะเชอ้ื ในสภาพทม่ี อี ากาศทอ่ี ณุ หภมู ิ 30 หรอื
37 องศาเซลเซยี ส ในการวิเคราะหดังกลาวจะเปนการละเลยจลุ ินทรียประเภท Psychrophiles,
Thermophiles หรือ จุลินทรียท่ีไมต องการอากาศ รวมทง้ั จลุ นิ ทรยี เ ฉพาะทอ่ี าจจะไมส ามารถ
เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นๆได เซลจลุ นิ ทรยี พ กิ ารทเ่ี กดิ จากความรอ นอาจจะไมส ามารถเจรญิ
ในอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะ แตอ าจจะเจรญิ อยา งชา ๆ ปรมิ าณเชอ้ื ทป่ี รากฏในอาหารในปรมิ าณ
คอนขางต่ําอาจจะทําใหไมสามารถตรวจวิเคราะหไดงายอยางถูกตองและแมนยําแมวาจะมีวิธี
การสุมตัวอยางที่ดีแลวก็ตาม

ดังนั้นความตองการเครื่องมือที่สามารถใชวิเคราะหจุลินทรียใหรวดเร็วจึงไดเพิ่ม
บทบาทอยางมากในปจจบุ ัน แตต อ งมคี วามเชอ่ื มน่ั ในแงก ารไดม าตรฐานวเิ คราะหท างจลุ นิ ทรยี 

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 169

เครอ่ื งมอื ในอดุ มคติ

ลักษณะเครื่องมือในอุดมคติควรมีลักษณะที่แนนหนา มคี วามเปน ไปไดใ นการตรวจ
วิเคราะหที่สามารถอธิบายในเชิงวิชาการ และตอ งไมแ พงมากนกั มขี นาดเลก็ และไมตองซอม
บํารุงมากนัก ซ่ึงอาจจะสามารถตรวจสอบจลุ นิ ทรยี ท ง้ั หมดได ตั้งแตพวก Mycoplasmas,
Protozoa รวมทั้งแบคทีเรีย ยีสต และเชอ้ื รา การใชเ ครอ่ื งมอื ดงั กลา วตอ งมคี วามแมน ยําในการ
นับจํานวนจุลินทรียท่ีชวงความเขมขนตํ่าไปจนถงึ มากโดยใชเ วลาในการวเิ คราะหเ พยี งไมก น่ี าที
จุลินทรียทม่ี คี วามสนใจเปน การเฉพาะ เชน Clostridium, Salmonella และ Staphylococcus จะ
ถูกจําแนกแมวาจะอยูในลักษระเปนเชื้อผสม และมปี รมิ าณทต่ี ่าํ รายงานผลจะตองถูกประมวล
และพิมพอยางอัตโนมัติ และจะตองเสยี คา ใชจ ายในการวิเคราะหตัวอยา งแตละตวั อยา งไมแพง
เกินไป

ดังนั้นความตองการหลักของการใชเครื่องมือดังกลาวมีดังนี้
1.! คาใชจายตอการวิเคราะหครั้งหนึ่งจะตองตาํ่ สดุ เทา ทส่ี ามารถทําได ดังนั้นวิธีจึงตอง

เทคโนโลยที ไ่ี มส งู มากนกั และสามารถชผ้ี ลเปน บวกและลบโดยไมต อ งใชก าร
วิเคราะหผลที่ซับซอน
2.! วิธีวิเคราะหตองสามารถประยุกตและปรับใชไดกับผลิตภัณฑอาหารตางๆไดอยาง
กวางขวาง ซ่ึงเปน การลดชว งการวเิ คราะหท ด่ี ําเนนิ การในหอ งปฏบิ ตั กิ ารปกติ และ
มีประสิทธิภาพพอสมควร
3.! วิธีวิเคราะหจะตองเปนที่นาเชื่อถือและไดมาตรฐาน ขอ จํากดั ในมาตรฐานจะตอ ง
สามารถตรวจสอบไดอยางมีความมั่นใจ ความคลาดเคลอ่ื นไมค วรเกดิ ขน้ึ มากนกั
กลาวคอื ผลทางบวกทเ่ี กดิ การผดิ พลาดเพยี งเลก็ นอ ยสามารถยอมรบั ได แตผลทาง
ลบท่ีผิดพลาดเพยี งเลก็ นอ ยไมส ามารถยอมรบั ได
4.! กอนที่การวิเคราะหแบบเรว็ จะถูกนาํ มาใชใ นการควบคุมคณุ ภาพ จะตองมคี วาม
ระมัดระวังในการเปรยี บเทยี บวธิ วี เิ คราะหท ใ่ี ช เพ่อื ประกนั วาเทคนิคดังกลา วมี
ความเชื่อถือไดอยางดี

การพัฒนาวธิ วี เิ คราะหจ ลุ นิ ทรียแ บบเรว็

ลักษณะของการพฒั นาวธิ วี เิ คราะหจ ลุ นิ ทรียแบบเรว็ มอี ยู 3 ลักษณะเบื้องตนพื้นฐาน
ดงั น้ี

1.! สามารถตรวจวิเคราะหจํานวนจลุ นิ ทรยี 
2.! การตรวจวิเคราะห หรอื การวดั ผลติ ภณั ฑห รอื สารทส่ี รา งโดยจลุ นิ ทรยี 
3.! วัดการเจริญเติบโตหรือวัดกระบวนการที่เกี่ยวของกับการเจริญเติบโต

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 170

ในการพัฒนาการวิเคราะหจ ลุ นิ ทรียแบบเรว็ อาจจะเปน การปรบั ปรงุ เทคนคิ ทใ่ี ชอ ยู
ปจจุบัน หรือเปนการแนะนําวิธีหรือเทคนิค ซง่ึ ปจ จบุ นั ยงั ไมม กี ารประยกุ ตใ ชใ นจลุ ชวี วทิ ยา

การพัฒนาวิธกี ารวเิ คราะหจ ลุ ินทรียมดี งั น้ี
1.! การใชวิธีผสมอยางอัตโนมัติ การเตรยี มอาหารเลย้ี งเชอ้ื แบบอตั โนมตั ิ และการ
เติมอาหารเล้ียงในจานเพาะเช้ือแบบอัตโนมัติสามารถลดเวลาท่ีตองสิ้นเปลืองในการเตรียม
คร้ังหน่ึงๆ การวเิ คราะหแ บบอตั โนมตั โิ ดยใชเ ทคนคิ ขา งตน นน้ั สามารถเพม่ิ อตั ราเรว็ ในการ
ตรวจนับจุลนิ ทรยี จ ากการบม เพาะเชอ้ื ได
2.! การลดขั้นตอนการวิเคราะห เปน การออกแบบการวเิ คราะหใ หม และทดแทน
วิธีการวิเคราะหที่มีความไวมากขึ้น ตัวอยางเชน การตรวจนบั Faecal coliform อาจจะถูกแสดง
โดยการบม เพาะเชอ้ื ตวั อยา งทางตรงท่ี 44.5 องศาเซลเซียส ในอาหารเลีย้ งเช้อื เฉพาะ เวลา
ท้ังหมดสําหรบั การตรวจ Salmonella อาจจะถกู ลดลงโดยการเพม่ิ Antigen และทดสอบดวย
Polyvalent antisera
3.! ลดสเกลของการดาํ เนนิ การ เปน การใชแ บบพมิ พพ ลาสตกิ ทฆ่ี า เชอ้ื ดว ยรงั สที ่ี
ประกอบดวยอาหารเลีย้ งเชอ้ื ทท่ี ําใหแ หง ระดบั หนง่ึ โดยเตรยี มใหม รี ปู แบบทเ่ี หมาะสมตอ การใช
งานการทดสอบมากๆ กลาวคือสามารถวิเคราะหไดตัวอยางมากๆในคราวเดียวกัน

เทคนิคใหมท ใ่ี ชใ นการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี 

เทคนิคที่จะกลาวตอไปน้ีไมไดถูกประยุกตใชในการวิเคราะหทางจุลินทรียมากนัก
สวนมากจะใชใ นสาขาอน่ื ๆทางดา นวทิ ยาศาสตร เชนเคมีหรือฟสิกส เทคนิคดังกลาวไดแก
Microcalorimetry, Impedance/conductance measurement, Turbidity measurement,
Fluorescence measurement, Reflectance measurement และ Radiometry เปนตน

ตัวอยางการใชวธิ วี เิ คราะหแ บบเรว็ ในอตุ สาหกรรมนม

วิธีวิเคราะหจุลินทรียแบบเร็วนี้มีเหตุผลหลายๆอยางเชน ความแมนยํา ความชํานาญ

แรงงาน เวลา การลดความคลาดเคลื่อน และความเหมาะสมตอการใชกับคอมพิวเตอร วิธี

วิเคราะหแบบเร็วนส้ี ามารถใชต วั แปรทไ่ี มม ากนกั และมคี วามแมน ยาํ มากกวาวิธดี ัง้ เดิม ความ

ชํานาญที่ตองการเพื่อใหไดผลการวิเคราะห หรอื แรงงานทใ่ี ชส ามารถถกู ลดลงได โดยทั่วไปวิธี

การวิเคราะหแบบเร็วนี้จะใหผลการตรวจสอบที่รวดเร็ว ไมเ สยี เวลามากนกั ในการวิเคราะห และ

เกิดความคลาดเคลื่อนที่นอยในการวิเคราะหตัวอยางจํานวนมากๆ และผลการวเิ คราะห

สามารถถูกนําเสนอทางคอมพวิ เตอรไ ด ซง่ึ ทําใหป ระมวลผลไดอ ยา งรวดเรว็

โดยท่ัวไปการวิเคราะหจ ลุ นิ ทรยี ท างอตุ สาหกรรมนมมกั จะเปน การแยกเชอ้ื และตรวจ
นับจํานวนจุลินทรีย ตลอดจนการจําแนกประเภท และการตรวจสอบทางชวี เคมี และมีอยหู ลาย

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 171

ขั้นตอนในการวิเคราะหดังกลาวสามารถเรงใหเร็วขึ้นไดดวยเทคนิคทางจุลินทรีย เชน การนํา
เคร่ืองมือมาใชแ ทนการวิเคราะหป กติ รวมทง้ั การใชร ะบบอตั โนมตั มิ าใชร ว มกบั คอมพวิ เตอร
ดังแสดงในภาพ 21

Sensor Analyzer Computer

1. Manual 2. Instrument 3. Automatic

ภาพ 21 ววิ ฒั นาการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี 

วิวัฒนาการวธิ กี ารวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียในอุตสาหกรรมนม
วิธีการวิเคราะหจุลินทรียในอุตสาหกรรมนมไดมีการพัฒนาการตั้งแตอดีตจนถึงปจจุบัน
และมีแนวทางการพฒั นาในอนาคตทพ่ี อจะสรปุ ไดด งั น้ี

1.! วิธีการตรวจนับเชื้อแบคทีเรีย
เทคนิคในการตรวจนบั แบคทเี รยี ในปจ จบุ นั นม้ี ขี อ จํากดั ตางๆ กลาวคือ

• ขอจํากัดในขน้ั ตอนการเตรยี ม ไดแก เทคนิคความปลอดเชื้อ และแรงงาน เปนตน
• ขอจํากัดในข้ันตอนการเจอื จางตวั อยา งและการเขย่ี เชอ้ื ไดแก แรงงาน ความชํานาญ
และความถกู ตอ งแมน ยํา เปนตน
• ขอจํากดั ในขน้ั ตอนการบม เพาะเชอ้ื ไดแก เวลาที่ใช เปน ตน
• ขอจํากดั ในขน้ั ตอนการอา นผล ไดแก เวลาที่ใช และแรงงาน เปน ตน
• ขอจํากัดในขน้ั ตอนการประมวลผล การบนั ทกึ และรายงานผล ไดแก เวลาที่ใช และ
แรงงาน เปน ตน

ในการวิเคราะหแบบเรว็ ทป่ี รากฏในปจ จบุ นั ในอตุ สาหกรรมนม จะมเี ทคนคิ พน้ื ฐาน
ข้ันตนท่ีใหความรวดเรว็ ในการวเิ คราะหแ ละลดความนา เบอ่ื ในการวเิ คราะหล งไดร ะดบั หนง่ึ และ
หลายๆขั้นตอนไดถูกนาํ มาใชเ พอ่ื การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี แ ลว เชน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 172

• ในขั้นตอนการเตรียมตัวอยา ง ไดม เี ทคนคิ การใช Homogenizes , Stomacher ,
และ Mechanical shakers ซ่ึงเทคนิคทง้ั หมดนไ้ี ดเ คยถกู นําไปใชใ นการผลิต Reconstitution
ของผลิตภัณฑนมกอ นทจ่ี ะนาํ มาใชใ นการวเิ คราะหแ บคทเี รยี

• ในข้ันตอนการเทอาหารเลย้ี งเชอ้ื ไดม กี ารนําเทคนคิ Plate loop method และ
Autoloop มาใชทดแทนการทําการเจอื จางทเ่ี ปน ขน้ั ตอน (Serial dilution) เม่ือมกี ารวเิ คราะหใ น
หองปฏิบัตกิ ารทม่ี ลี กั ษณะงานเปน ประจํา

• ในขั้นตอนการตรวจนับปริมาณเชื้อ การตรวจนบั ปรมิ าณของโคโลนบี นจานเพาะ
เชื้อสามารถถูกทดแทนในสภาวะที่เหมาะสม โดยการใชคอมพิวเตอร ในลักษณะของ Fixed
point หรือไมก็เปนลักษณะ Gradient form นอกจากนี้ยังมีเครื่องมืออื่นๆที่ไดมีการใชเพื่อเพิ่ม
ประสิทธิภาพในขั้นตอนการเจือจางตัวอยาง และการเขย่ี เชอ้ื ในสว นของกระบวนการตรวจนบั
เชื้อแบคทีเรีย เชน การใช Droplette และ Spiral plating method

นอกจากนี้การนับโคโลนีบนจานเพาะเลี้ยงเช้ือปรากฏวามีความรวดเร็วและลดความ
นาเบื่อลง เมอ่ื มกี ารใชเ ครอ่ื งมอื นบั จํานวนโคโลนี (Mechanized colony counters)

แมวาจะมีทางเลือกในวิธกี ารวิเคราะหแบบเรว็ ตางๆ ตงั้ แตขัน้ ตอนการเตรยี มตัวอยา ง
การเจือจางตัวอยา ง การเขย่ี เชอ้ื การอา นผล จนถงึ การประมวลผล แตสวนการดําเนนิ การท่ี
ชาที่สุดที่ปรากฏอยูเสมอไดแกเวลาที่ใชสาํ หรบั เซลแบคทีเรียแตละเซลเจรญิ เตบิ โตจนมลี กั ษณะ

ท่ีสามารถเหน็ ไดเ ปน โคโลนี

• เทคนิคทางกลทส่ี ว นใหญป รากฏวา สามารถใชเ ปน ทางเลอื กของการทํา Standard
Plate Count (SPC) มักจะมีลักษณะทค่ี ลา ยกบั วธิ ที ร่ี จู กั กนั โดยทว่ั ไปทเ่ี รยี กวา Direct
microscopic count ซึ่งเปนวิธีที่ใชประมาณการจํานวนแบคทเี รยี ในนมโดยการตรวจสอบดว ย

กลอ งจลุ ทรรศนโ ดยตรง ไดแก วิธีที่เรียกวา DEFT ( Direct Epifluorescent Technique) ซง่ึ มี
วิธีการดังแสดงในภาพ 22

• น้าํ นม
+ Trypsin

+ Surfactant • กรองผา น เมมเบรน
ทก่ี กั กนั แบคทเี รยี

• เติม Fluorescent dye

• ตรวจนับเซลที่ติดสี
(Fluorescing cells)
ดว ยกลอ งจลุ ทรรศน

ภาพ 22 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียแ บบ DEFT

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 173

วิธีน้ีไดมีขอเสยี เนอ่ื งจากมปี ญ หาบางอยา ง เชน ไมส ามารถบอกความแตกตา งระหวาง
เซลที่ตายและเซลที่มีชีวิตได และยงั คงเปน วธิ ที น่ี า เบอ่ื ในการตรวจนบั ปรมิ าณเซลดว ย อยา งไร
ก็ตามไดมีการพัฒนาวิธีการทางคอมพิวเตอรมาใชในการวิเคราะหโดยจะทําการตรวจนับเซล
แบคทีเรีย และคํานวณจาํ นวนแบคทีเรียตอมลิ ลิลิตรของนมได ซง่ึ ปจ จบุ นั จงึ ไดใ ชเ ปน วธิ ที ง่ี า ย
แมวาจะมีราคาคอนขา งแพง เพื่อเปน ทางเลอื กในการวเิ คราะห Standard Plate Count

• ความเปนไปไดในอนาคต ไดม เี ทคนคิ ตา งๆและมคี วามเปน ไปไดใ นการประยกุ ตใ ช
เพ่ือการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  ไดแก

1.1! เทคนิคที่เรียกวา Microcolonies วิธีนี้ไดใช Coulter Counter เพื่อตรวจนับ
จํานวนโคโลนีที่เกิดขึ้นในอาหารเลี้ยงเชื้อเจลาติน โคโลนีจะถูกตรึงใน Formalin กอนการ
ตรวจนับ วิธีการดงั กลา วจะใชเ วลาเพยี งไมก ช่ี ว่ั โมงแทนทเ่ี ปน วนั ในการวเิ คราะห ความสัมพันธ
ระหวางวิธีนี้กับวิธี SPC ปรากฏวามีแนวโนมสอดคลองกันดวยดี

ก. เจลาติน ข. บม เพาะเชอ้ื ค. เตมิ สารตรงึ

oo
o

o

ง. Coulter counter

ภาพ 23 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียตามเทคนคิ Microcolonies

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 174

1.2! เทคนิคที่เรียกวา Impedance เปนการใชร ะบบอตั โนมตั ิในการแปลคา การนํา
ความรอนของตัวอยางเพื่อเปลี่ยนเปนคาทางไฟฟา เวลาเพอ่ื ใชจ นถงึ จดุ เฉพาะคา หนง่ึ จะเปน
สัดสวนกับจํานวนแบคทีเรียที่มีชืวิตเริ่มตน วธิ นี ส้ี ามารถดดั แปลงเพอ่ื ประมาณการกลมุ ทม่ี ี
ลักษณะจําเพาะ โดยการเตมิ สารเฉพาะอยา งลงไป ซง่ึ สามารถใชว ดั สารยบั ยง้ั ตา งๆได
อยางไรก็ตามวธิ ีน้คี วามสมั พนั ธกบั คา SPC ไมคอยดีเทาที่ควร

ตัวอยาง

เวลาท่ใี ชว ดั การเปลี่ยนแปลง

ภาพ 24 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียตามเทคนคิ Impedance

1.3! เทคนิคที่เรียกวา Autoanalysis of pyruvate เทคนคิ นพ้ี บวา มคี วามสมั พนั ธท ด่ี ี
ระหวางกิจกรรมของแบคทีเรียในน้ํานมกบั จํานวนไพรเู วททป่ี รากฏในน้ํานมนน้ั ๆ ดงั นน้ั จงึ มี
ความเปนไปไดที่จะใชความสัมพันธดังกลาวในการประมาณจํานวนแบคทีเรียในตัวอยา งน้ํานม
โดยการวิเคราะหปริมาณไพรูเวทที่ปรากฏในนํ้านม ความสัมพนั ธดังกลาวจะไมคอยตรงกบั
ความเปนจริงโดยเฉพาะถา ปรากฏปรมิ าณแบคทเี รยี ทต่ี ่ําในระบบ

Lactate dehydrogenase

Pyruvate Lactate

NADH NAD+

ภาพ 25 การลดลงของ NADH ถูกวัดที่ 340 nm ใน Autoanalyser system

1.4! เทคนิคที่เรียกวา Fluorescence staining แบคทีเรยี ในตวั อยา งอาจจะถกู ยอ มสี

ใหมีความแตกตา งกนั เพอ่ื ตรวจหาระหวา งแบคทเี รยี ทม่ี ชี วี ติ กบั แบคทเี รยี ทต่ี ายไปแลว

ถาจุลินทรียท่ียอ มสแี ลว ถกู แพรก ระจายบนพน้ื ผวิ (เชน การกรอง) อนภุ าคทส่ี วา งสามารถถกู

ตรวจนับ หรือคาความสวางถูกวัด และจํานวนแบคทเี รยี จะถกู ประเมนิ เชน BACTOSCAN ซง่ึ

มีขอจํากัดท่มี คี วามไวสงู ไป สวน DEFT มีขอจํากัดที่กาํ ลงั คนหาอยู อยา งไรกต็ ามวธิ นี ม้ี ขี อ ดี

ที่วาสามารถตรวจสอบจุลินทรียไดอยางรวดเร็ว การบํารงุ รกั ษาไมแ พง แมว า ตน ทนุ จะสงู

ความสมั พนั ธก บั คา ทว่ี ดั แบบ SPC มีคา ทส่ี อดคลอ งกนั ดมี าก

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 175

Fluorescence dye

ขน้ั ตอนท่ี 1 ขน้ั ตอนท่ี 2

UV light

Luminous light
Photosenser

ขน้ั ตอนท่ี 3
ภาพ 26 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียตามเทคนคิ Fluorescence staining

1.5 เทคนิคที่เรียกวา Radiometry สารที่ถูกกําหนดจะถกู บม เพาะกบั ตวั อยา ง และกา ซ
คารบอนไดออกไซดที่ปรากฏจะถูกวัดออกมา วธิ นี ส้ี ามารถใชก บั สารกลมุ เฉพาะเชน สารยบั ยง้ั
ซ่ึงเหมอื นกบั เทคนคิ แบบ Impedance และมีขอ เสยี ทม่ี ตี น ทนุ คอ นขา งสงู

Radiation counter

ก. ตัวอยาง + Radiolabelled ข. เพาะบม สว นผสม และให Radioactive CO2
substrate

ภาพ 27 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามเทคนคิ Radiometry

1.6! เทคนิคที่เรียกวา Bioluminescence จุลินทรียทง้ั หลายทม่ี ชี วี ติ อยจู ะประกอบ
ดวย ATP ในองคประกอบของเซล การวดั ATP เปนการวัดอยางคราวๆของ Active biomass
ของตัวอยา ง เทคนคิ ดงั กลา วถูกใชก บั อาหารบางชนดิ แตใ นน้ํานมแหลง ATP อาจจะมาจาก
แหลงอื่นนอกจากแบคทีเรีย ดงั นน้ั วธิ นี ไ้ี มส ามารถนํามาใชก บั น้าํ นมดบิ ได อยา งไรกต็ ามอาจจะ
มีประโยชนกับอาหารประเภทอน่ื ๆ เปน เทคนคิ ทร่ี วดเรว็ งา ย และไมแ พงมากนกั

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 176

Substrate + ATP+ Enzyme Substrate-AMP-Enzyme + PP
Substrate-AMP-Enzyme +O2 Reaction products- bioluminescence

ภาพ 28 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียตามเทคนคิ Bioluminescence

2! การจําแนก และการวเิ คราะหท างชวี ภาพ
2.1 เทคนิคที่เรียกวา Enzyme patterns ปจจบุ นั ไดม เี ทคนคิ การใช Test kits ท่ี

ออกแบบใหมีขนาดเลก็ เพอ่ื ชว ยในการจําแนกจลุ นิ ทรยี  โดยใชห ลกั การทางการทดสอบชวี เคมี
และใชวธิ กี ารเขย่ี เชอ้ื การอานผลและการประมวลผลโดยระบบอัตโนมตั ิ เทคนิคดงั กลา ว
สามารถใชกับตัวอยางในจํานวนมาก แตม คี า ใชจ า ยทค่ี อ นขา งสงู และมแี นวโนม การใชใ นเชงิ
การแพทยมากกวา ใชในอาหาร ซง่ึ ในทางการแพทยม กั มตี วั อยา งทต่ี อ งวเิ คราะหแ ละพสิ จู นเ ปน
จํานวนมากในแตละวัน เทคนิคดงั กลาวยังคงใชระบบ Autoanalysers แทนทจ่ี ะใชว ธิ ี
Miniaturized test kits แตก็ใชหลักการที่เหมือนกัน

Enzyme 1

Enzyme 2

Cultures Enzyme 3 Results Microcomputer
Enzyme 4
Enzyme patterns

Enzyme 5

Enzyme 6

Autoanalyser

ภาพ 29 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Enzyme patterns

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 177

Culture

Photometer

Microcomputer
Optical analyser

ภาพ 29 การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Enzyme patterns (ตอ )

2.2 เทคนิคที่เรียกวา Pyrolysis / Mass spectrometry / GLC การวเิ คราะหโ ดย
วิธี GLC หรอื Mass spectrometry ของผลิตภณั ฑท ร่ี ะเหยไดท ไ่ี ดจ ากเมตาบอลซิ มึ ของเชอ้ื
จุลินทรีย หรอื ไดจ ากกระบวนการ Pyrolysis ของเช้ือจุลินทรีย สามารถนํามาประยกุ ตใ ชเ พอ่ื
การจําแนกเชื้อจุลินทรียได แตย งั อยรู ะหวา งทําการทดลอง แมว า จะมกี ารใช GLC ในการ
วิเคราะหผลพลอยไดจ ากจุลนิ ทรยี ประเภท Anaerobes ไดมีการใชเ ปนประจําในปจ จบุ นั
เทคนิคนม้ี คี า ใชจ า ยคอ นขา งสงู มากทเี ดยี ว

Cultures

GLC Computer

ภาพ 30 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี
Pyrolysis with GLC or mass spectrophotometry

2.3 เทคนิคที่เรียกวา Light scatter วิธีที่มีความไวในการตรวจสอบสารยบั ยั้งไดใช
หลักการการเปลี่ยนแปลงในกระจายตัวของแสงเลเซอรโดยจุลินทรียที่ทดสอบหนึ่งๆ ผลกระทบ

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 178

ของสารปฏิชีวนะบางชนิดจะมีตอผนังเซลของแบคทีเรียซึ่งทําใหมีผลตอรูปรางและรูปแบบของ
การกระจายตัวของแสงโดยการสะทอ นและการหักเหของแสง เทคนคิ ดงั กลา วสามารถวเิ คราะห
ตัวอยางไดอ ยา งรวดเรว็ แตม รี าคาแพง และไมส ามารถตรวจสอบสารยบั ยง้ั ไดท ง้ั หมด

ตัวอยา ง

เลเซอร คอมพิวเตอร

การกระจายของแสง

ภาพ 31 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Light scatter

2.4 เทคนิคที่เรียกวา The charm test เปน วธิ ที ป่ี ระดษิ ฐโ ดย Charm of Boston
เปน เทคนคิ ทเ่ี ตมิ สาร C14 และสารที่ยึดเกาะกับเอนไซมลงไปในนาํ้ นม สารปฏชิ วี นะเพนนซิ ลิ ิน
จะบล็อคปฏิกิรยิ าของเอนไซม ซง่ึ จะไปรบกวนการถา ยทอดของสาร C14 ท่ีมีไปยังสารยึดเกาะ
และ Radioactivity ที่ปรากฏข้ันตอมาจะถูกวดั และบนั ทกึ และสามารถบง ชถ้ี งึ ปรมิ าณของสาร
เพนนิวิลินในนํ้านมได เปน เทคนคิ ทเ่ี รว็ ใชเ วลาประมาณ 15 นาที แตก ม็ คี า ใชจ า ยคอ นขา งแพง
มีความไวตอสารเพนนซิ ลิ ินทด่ี ี แตไ มส ามารถตรวจสอบสารชนดิ อน่ื ๆ ไดอ ยางกวางขวาง

Penicillin blocks binding

Radiation meter

1. Sample and labeled 2. Precipitate protein 3. Measure activity
penicillin concentration is inversely proportional to activity
ภาพ 32 เทคนคิ วเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียต ามวธิ ี Charm test

จากเทคนิคท้ังหมดทม่ี คี วามเปน ไปไดใ นการเปด กวา งตอ การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  ซง่ึ

ขึ้นกับแนวความคิดที่ฉลาดของมนุษย ซง่ึ ในอนาคตอาจจะมกี ารพฒั นาเครอ่ื งมอื ในทาง

จลุ ชวี วิทยาอกี มากมาย

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 179

การตรวจสอบ Listeria spp. โดยวิธี Impedance method

วิธีการวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรียแบบเดมิ สําหรบั การตรวจสอบ Listeria ในอาหารเพื่อใหไดผล
การวิเคราะห มักจะเปน การสน้ิ เปลอื งแรงงานและไดร บั ผลการวเิ คราะหค อ นขา งชา ในปจ จบุ นั
ไดมีการพัฒนาวิธีวิเคราะหแบบใหมเพื่อใชในการกลั่นกรองตัวอยางอาหาร หลักการหลักอยู
บนพน้ื ฐานของ ELISA และเทคโนโลยขี องยีนส อยา งไรกต็ ามวธิ ที าง Impedance method เปน
วิธีทางท่คี ลา ยกันทส่ี ามารถใชเ ปน วธิ ีตรวจสอบจลุ นิ ทรยี ไ ด Phillips and Griffiths (1989)
ไดทดลองวิธี impedance method เพื่อกลั่นกรองอาหารจาํ แนกเชอ้ื Listeria บางสายพนั ธุ
สําหรับใชในการคัดเลือกและแสดงผลในเครื่องมือ Bactometer M64 ในรายละเอยี ดของงานท่ี
ดําเนินการไดมุงเนนในการศึกษาอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมสาํ หรบั ตรวจสอบ Listeria spp.
โดยใชระบบการนําไฟฟา ทม่ี กี ารพฒั นาขน้ึ มา ซง่ึ เรยี กวา BacTrac 4100 หลักการหลักของ
ระบบดังกลาวเปนการใชประโยชนของตัวแปรใหมประเภทหนึ่งท่ีอยูบนพ้ืนฐานของการ
เปล่ียนแปลงประจุท่พี นื้ ผิวของ Electrode (E-value) ตัวแปรปกติที่ใชของการเปลยี่ นแปลง
ประจุในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวจะถูกตรวจสอบโดยเครื่องมือนี้เรียกวา M-value ดงั นน้ั วธิ กี าร
กลั่นกรองในทางปฏบิ ัติ เพอ่ื ประยกุ ตใ ชใ นการตรวจสอบประจําของ Listeria ในอาหารโดยใช
ระบบ BacTrac จึงไดร บั การพฒั นาขน้ึ

วิธีการทดสอบ เชอ้ื จลุ นิ ทรียท่ีใชในการศกึ ษาเพอ่ื ทดสอบความจําเพาะและ

ประสิทธิภาพของระบบการนําไฟฟา ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื จะเปน เชอ้ื ทจ่ี ําแนกมาจากเนอ้ื ตัวอยา ง

นม และไดร บั เชอ้ื จากศนู ยเ กบ็ เชอ้ื สายพนั ธทุ ท่ี ดสอบจะรวมถงึ เชอ้ื Non- Listeria 30 สายพนั ธุ

ที่ประกอบดวย Bacillus spp., Enterococcus spp., Micrococcus spp., Staphylococcus spp.,

Streptococcus spp. และ ยีสต และสายพนั ธุ Listeria 50 สายพนั ธุ ประกอบดว ย L. innocua

และ L. monocytogenes (1/2a, 1/2b, 4b)

ตัวอยางอาหารที่ใช เปน ตวั อยา งอาหาร 120 ชนดิ ทม่ี ที ง้ั เนอ้ื สด (เนื้อวัว เนอ้ื หมู
เนื้อไก เนื้อปลา) ไสกรอกหมัก และเนยแขง็

การตรวจสอบ จะใชว ธิ กี ารเปลย่ี นแปลงในคณุ สมบตั ทิ างไฟฟา ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื
(M-value) และของอิเลคโตรด (E-value) โดยใชระบบ BacTrac เวลาในการบม เพาะเชอ้ื เทา กบั
40 ช่ัวโมง และอณุ หภมู ใิ นการบม เพาะเชอ้ื เทา กบั 37 องศาเซลเซยี ส

วิธีการ นําตัวอยาง 25 กรมั ไป Homogenize กับ FDA-broth 10 เทา หรอื ซบั ใน
FDA-broth และบมเพาะเชอื้ นาน 24 ชว่ั โมงท่ี 30 องศาเซลเซยี ส หลงั จากทําการบม เพาะเชอ้ื
เรียบรอยแลว ดดู อาหารเลย้ี งเชอ้ื 0.1 มิลลิลิตรและถายเชื้อใสลงในหลอดทดลอง BacTrac ทม่ี ี
อาหารเลีย้ งเชอ้ื ท่เี รียกวา Impedance medium จํานวน 9.9 มิลลิลิตรและวัดโดยใชเครื่องมือ
BacTrac หลงั จากวดั เสรจ็ นํา Impedance medium 1 ลูปจากหลอดทดลองมา Streak บน

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 180

จานอาหารที่เปนอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะของ Listeria (ทป่ี ระกอบดว ย Impedance medium ท่ี
มี Agar รอยละ 1.3) จานอาหารเลย้ี งเชอ้ื จะถกู นําไปบม ท่ี 37 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง
และหลงั จากนน้ั จะตรวจสอบตามวธิ ีของ Henry method โคโลนีท่ีสงสยั หรอื ไมแ นใ จจะถกู ตรวจ
ซ้ํา

ในเวลาเดียวกันที่วิเคราะหแบบ Impedance method อาหารเลย้ี งเชอ้ื FDA-broth
จะถูก Streak บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่เรียกวา Oxford and modified Listeria selective agar
(Impedance medium ทม่ี ี Agar รอยละ 1.3 ) และบม เพาะเชอ้ื ท่ี 37 องศาเซลเซียส นาน 24
ช่ัวโมง และถูกตรวจซํ้าตามวิธีขา งตน

ผลการทดลอง เมอ่ื มกี ารทดสอบ Non-Listeria 30 สายพนั ธุ และ Listeria 50
สายพนั ธุ พบวาอาหารเลย้ี งเชอ้ื Listeria มีความจําเพาะทด่ี ี และแสดงใหเห็นถึงคุณสมบัติใน
การเปลย่ี นแปลง Impedanceที่สูง การเปลย่ี นแปลงของคา E-value สามารถคิดไดเปนรอยละ
100 ในขณะทก่ี ารเปลย่ี นแปลงของคา M-value มีคาต่ํามาก ดงั ภาพ 33

E-value 65 L.monocyt, 4b 40
55 Med I
45 Med II
35
25 L.monocyt (1/2a)
15 Med I
5 Med II
-5
เวลา (ชว่ั โมง)

M-value 65 เวลา (ชว่ั โมง) 40
55
45
35
25
15
5
-5

ภาพ 33 กราฟการเจริญเติบโตของ Listeria 2 สายพันธุ ที่ใช M-value และ E-value
ทั้ง 2 สายพนั ธเุ จรญิ ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทต่ี า งกนั 2 ชนิด Med I เปน Palcam-supplement

ที่ความเขม ขน ปกติ Med II เปน Palcam-supplement ท่ีความเขม ขน 2 เทา

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 181

Impedance medium ตอไปน้ีเปนตัวแทนของการดดั แปลงอาหารเลี้ยงเช้อื ของ
FDA-broth และ Palcam-agar

•Typtone-soya broth (Oxoid CM 129)
•Yeast extract (Oxoid L21)
•Lithiumchlorid (Merck 5679)
•PALCAM-selective-supplement (Merck 12122)

อาหารเลย้ี งเชอ้ื PALCAM-supplement ไดถูกนํามาใชใ นความเขม ขน 2 ลักษณะ คือ
เปน Single (Med I) และ เปน Double (Med II) ความเขม ขน ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทม่ี ากขน้ึ
คาเวลาในการตรวจสอบ Impedance (Impedance Detection Time; IDT) จะเพิ่มขึ้นสาํ หรบั
Listeria spp. เชนเดียวกับ Selectivity ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื ในภาพ 33 แสดงใหเห็นวา บาง
สายพนั ธุ จะมคี า IDT เกือบจะเหมอื นกนั ในการใช Med I และ Med II และมีความแตกตา งอ่นื ๆ
ในเวลา IDT ประมาณ 10-20 ชว่ั โมง

Selectivity ของอาหารเลย้ี งเชอ้ื Med I ไมพอเพยี งในบางกรณี เพราะวา
Enterococcus spp. 2 สายพนั ธุ และ Bacillus sp. 1 สายพนั ธุ และ ยีสต 1 สายพนั ธุ ทแ่ี ยกมา
จากผลิตภัณฑนม และไสกรอกหมัก ไดแสดงถึงการเจริญเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อดังกลาวดวย

การศึกษาเชิงเปรียบเทียบเพ่ือประเมินถึงประโยชนของวิธีการวิเคราะหแบบ
Impedance method ใน Med I และ Med II ในการเปรยี บเทยี บกบั FDA-broth (ทบ่ี ม เพาะเชอ้ื
ท่ี 30 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชว่ั โมง ) อาหารเลย้ี งเชอ้ื FDA-broth จะใหผลทางบวกกับ
Listeria 48 สายพนั ธุ (รวมทง้ั รอ ยละ 19 ของ Listeria monocytogenes) สวน Med I และ
Med II จะใหผลทางบวกกับ Listeria 72 สายพันธุและ 68 สายพนั ธุ ตามลําดบั (รวมทง้ั
Listeria monocytogenes รอยละ 21 และรอยละ 23 ตามลําดบั )

ในวิธกี ารวเิ คราะหแบบ Impedance method ใน Med I จะใหผลทางบวกผิดพลาดไป
8 ครั้งจากการตรวจสอบไสกรอกหมัก และเนยแขง็ และไมปรากฏเลยในผลิตภัณฑเนือ้ สด แตมี
ขอผิดพลาดทางลบ 1 ครง้ั และไมพบวามีขอผิดพลาดทางบวกเลยใน Med II

เวลาที่ตองใชทั้งหมดเพ่ือตรวจสอบผลจากการวิเคราะหของไสกรอกสดและเนยแข็ง
ประมาณ 40-60 ชว่ั โมง ในขณะทเ่ี นอ้ื สดจะใชเ วลาระหวา ง 30-45 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 182

Listeria / sample (%) Med I
60 Med II
50 FDA-broth
40
30
20
10
0
เนื้อสด
ไสกรอกหมัก
เนยแขง็

ภาพ 34 การเปรียบเทียบวิธี Impedance method กับ Med I , Med II และ FDA-broth
(30 องศาเซลเซยี ส นาน 24 ชั่วโมง) สาํ หรบั Listeria spp. จาก 120 ตวั อยา งทต่ี า งกนั

จากอาหาร 3 ประเภท

ขอสรุปของการศึกษาน้ีเปนเครื่องพิสูจนถึงความที่สูงและความแมนยํ าของวิธีการ
วิเคราะหแบบ Impedance method กับมีการปฏิบัติการท่ดี แี ละมคี วามสะดวกในการทํางาน
รวมทั้งเวลาที่ตองใช วธิ นี อ้ี ยบู นพน้ื ฐานของหลกั การการ Enrichment 2ขั้นตอน เชนเดียวกับวิธี
USDA method ซ่ึงตอนขน้ั ท่ี 2 สามารถผนวกสวนของ Impedance method สําหรบั การ
ตรวจสอบ Listeria spp. ในเนื้อสด การใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื Palcam-supplement ในความ
เขม ขน ปกติ (Med I) เปนอาหารเลย้ี งเชอ้ื ทเ่ี หมาะสมทจ่ี ะใหผ ลทน่ี า เชอ่ื ถอื ใน 2 วัน
ในไสกรอกสดและเนยแข็งควรใช Med II เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดขอผิดพลาดในทางบวกที่อาจ
เกดิ จาก Ernterococcus spp. และ Bacillus sp. และยสี ต และการใช Med II น้ีใชเ วลาประมาณ
3 วัน

การตรวจสอบเชื้อ Listeria โดยใช BacTrac 4000 Series
1.! อาหารเลย้ี งเชอ้ื : ถา ตอ งการตรวจสอบเชอ้ื ดงั กลาวใน Non-fermented
products เชน เนื้อสด จะใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื ทเ่ี รยี กวา Bimedia 401A ถา ตองการตรวจสอบเชื้อ
ดังกลาวใน Fermented products เชน เนยแข็งหรอื ไสกรอกหมัก จะใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื ท่ี
เรียกวา Bimedia 402A

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 183

2.! Pre-enrichment สําหรับการทํา Pre-enrichment ของตัวอยาง อาหารเลย้ี งเชอ้ื

ทเ่ี รยี กวา FDA-broth จะถูกนาํ มาใช

Listeria Enrichment broth base acc. To FDA/IDF-FIL (Merck No.:11521)

Peptone from Casein 17.0 กรมั /ลิตร

Peptone from Soya meal 3.0 กรัม/ลิตร

D(+) Glucose 2.5 กรมั /ลิตร

Sodium chloride 5.0 กรมั /ลิตร

Potassium dihydrogen phosphate 2.5 กรัม/ลิตร

Yeast extract 6.0 กรมั /ลิตร

ปรบั pH เปน 7.3+ 0.1 และทําการฆา เชอ้ื ท่ี 121 องศาเซลเซยี ส นาน 15 นาที

ตัวอยา งการทํา Pre-enrichment

Selective supplements for the broth base acc. To FDA (Merck No.: 11883)

Acriflavine hydrochloride 7.5 มลิ ลิกรัม

Cycloheximide 25.0 มลิ ลิกรัม

Nalidixic acid (Sodium salt) 20.0 มลิ ลิกรัม

• เนื้อสด : เนื้อสด 25 กรมั + FDA-broth 225 มิลลิลิตร และทําการปน เปน
เนื้อเดียวกัน

• เนยแขง็ : เนยแข็ง 25 กรมั + FDA-broth 225 มิลลิลิตร และทําการปน เปน
เนื้อเดียวกัน

• หนงั เชน ซากหนงั ไก : แชช น้ิ ของหนงั (~ 8x8 เซนตเิ มตร) ใน FDA-broth
100 มิลลิลิตร และกวนหรือคน

• ผลิตภัณฑอื่นๆ : ตัวอยา ง 25 กรมั + FDA-broth 225 มิลลิลิตร และทําการ
ปน เปนเนือ้ เดียวกัน

สําหรับการทําใหเชื้อมีความสมบูรณขึ้นมาใหมนั้นถาตัวอยางเปนผงหรือแหง
จะนําตัวอยางไปทํา Pre-enrichment ในอาหารเลย้ี งเชอ้ื ประมาณ 1 ชว่ั โมง ที่อุณหภูมิหอง
กอ นการคน และทิ้งไวใหเกิดการ Regeneration ของเซลทพ่ี กิ าร

3.! การบมเพาะเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อ Pre-enrichment broth โดยการบม
เพาะเชื้อตัวอยางที่ทาํ การปน เปน เนอ้ื เดยี วกนั แลว ใน Pre-enrichment broth ท่ี 30 องศา
เซลเซียส นาน 24 ชว่ั โมง

4.! การวัด มขี น้ั ตอนดงั น้ี
4.1!ทิ้งใหตัวอยางที่เตรียมเกิดสมดุลเปนเวลา 12 ชว่ั โมง (ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง)

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 184

4.2!ทําการตั้งอุณหภูมิของ BacTrac ท่ี 37 องศาเซลเซียส
และตั้ง Threshold ทรี่ อยละ 15 ของ E-value เปนฐานเมื่อตัวอยางทจ่ี ะทดสอบ
จะถูกวางในเครื่องมือ
และต้ังขดี จํากัดเวลาสูงสุดไวที่ 40 ชว่ั โมง
ปรับสเกลที่จะแสดงคา E-value ในชวงรอ ยละ 0-80

4.3ปเปตอาหารเล้ยี งเชอ้ื 10 มลิ ลลิ ติ รลงไปในเซลท่ีใชว ดั ซง่ึ ไดผ า นการฆา เชอ้ื
มาแลว
4.4เติมตัวอยางที่ Pre-enrichment แลว 0.1 มลิ ลิลิตร และผสมอยา งระมดั ระวงั
(เขยาซา ยขวาได แตหามกลับควํ่าเซลขน้ึ ลง)

4.5!สอดเซลวัดเขาเครื่องมือวัด BacTrac ในตําแหนงที่วาง สามารถสงั เกตไดจ าก
คอมพิวเตอร หลงั จาก 1 ชั่วโมงที่เซลวัดไดถูกวางลงในเครื่องวัด การวัดใน
แตละตัวอยา งจะเรม่ิ ทําการวัดอยา งอตั โนมตั ิ

4.6!จากผลในคอมพิวเตอรถาเกิดคาผลทางบวกเพิ่มขึ้นจากรอยละ 15 ของ
E-value threshold โดยมี Growth curve ภายใน 40 ชว่ั โมง แสดงวาตัวอยางมี
เช้อื Listeria

5.! การตรวจเพื่อยืนยันในตัวอยางที่ใหผลบวกตอ Listeria
อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชสวนใหญเพื่อเปนการตรวจสอบยืนยัน Listeria ไดแก
• Oxford Listeria agar
• LPM agar
• Modified McBride agar
• PALCAM agar

ในการยนื ยนั การปรากฏของเชอ้ื Listeria ในตัวอยางแนะนําใหใ ชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื
รวมกัน 2 ชนดิ เชน ใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื Oxford Listeria agar และ PALCAM agar

ใหน ําลูปไปแตะตัวอยางโดยตรงจากเซลวัดของเครื่อง BacTrac และ Streak บน
อาหารเล้ียงเช้อื ทัง้ สองจากลูปเดียวกันนน้ั และตามดว ยการวเิ คราะหผ ลทเ่ี กดิ ขน้ึ บนอาหาร
เล้ียงเช้ือ ขน้ั ตอนตอ ไปจะทําการยนื ยนั Listeria โดยการทดสอบทางชวี เคมตี อ ไป

หลกั การวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 185

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา งน้ําดื่ม

ในการวิเคราะหตัวอยางนํ้าดื่มแบบเร็วนี้แนะนําวาควรเปนการวิเคราะหนํ้าดื่มในระบบ
ทอ โดยใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื BiMedia 001 A

M (%) M-value E(%) E-value

30 30
25! 25
20! 20
15! W2 15 W2
10! 10 W1
5 W4
5 W1 W4 0
0! -5 W3
-10
-5 W3
0 3 6 9 12 15 18
-10 เวลา (ชั่วโมง)

0 3 6 9 12 15 18

เวลา (ชั่วโมง)

W1 = Ground water W2= Intake well W3 = After UV Irradiation W4 = User pipe

ภาพ 35 การวเิ คราะห M-value และ E-value ในน้ําด่ืมในระบบทอ

ระดับการเพิ่มขึ้นของมลภาวะ และการปนเปอ นของ Ground water มีความจําเปน ตอ ง
ประยุกตกระบวนการผลติ นํ้าใหด ี นอกจากนก้ี ารใชเ ทคโนโลยใี นกระบวนการผลติ น้ํากย็ ังคง
เส่ียงตอการปนเปอนอกี คร้งั หน่ึงในระหวา งกระบวนการผลิต ระดบั ของการปนเปอ นสามารถ
ตรวจสอบไดงายโดยใชเทคนิคของ BacTrac

ในภาพ 35 แสดงใหเ หน็ วา ระดบั การปนเปอ นของจลุ นิ ทรยี ใ นน้ําดม่ื มคี วามหลากหลาย
ในหลายระดับที่ไดทําการสุมตรวจในจุดตางๆในระบบการผลติ นาํ้ ดม่ื ตัวอยางน้ําถกู เจอื จางใน
อัตราสวน 1:1v/v (Nutrient medium : water) และนําไปบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศาเซลเซียส (86
องศาฟาเรนไฮต ) นาน 46 ชว่ั โมง

ในกราฟของตัวอยาง W1 ซึ่งเปนนํ้าบาดาลแสดงใหเห็นถึงการปนเปอนตามธรรมชาติ
ของน้ําบาดาลหรือนาํ้ ทย่ี งั ไมผ า นกระบวนการ Treated น้ําบาดาลจะผานกระบวนการทาง
ชีวภาพ และถูกเก็บในบอนํ้า (W2) ในกราฟแสดงใหเห็นไดอยางชัดเจนวาความเขมขนของ
จุลินทรียเกิดขึ้นในบอ น้ํา ซง่ึ ดชั นจี ากเครอ่ื งบง ชใ้ี หเ หน็ การเพม่ิ ขน้ึ ของคา M-value และ

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 186

E-value ในตัวอยาง W2 เม่อื เทียบกับตวั อยาง W1 ความจรงิ ในกราฟ W3 จะไมมีการเพิ่มของ

คาดังกลาวจากเคร่ือง ซง่ึ แสดงวา มกี ารลดลงของเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ท ป่ี นเปอ นอยา งเพยี งพอในน้ําดม่ื

ท่ีผา นการฆา เชอ้ื ดว ย UV irradiation อยางไรก็ตามเมอ่ื น้ําผา นไปตามระบบทอ หลงั จากผา น

กระบวนการฉายแสง UV แลว การปนเปอนอีกครั้งหกนึ่งในนาํ้ ดม่ื เปน สดั สว นกบั ความยาวจาก

ข้ันตอนการฉายแสง UV วามากนอ ยเพยี งไร ตัวอยา ง W4 ซึ่งเปนทอ ของผูใ ชน ํ้าทม่ี จี ลุ นิ ทรยี 

ปนเปอนอีกครั้งหนึ่งนั้น ในกรณที ไ่ี ดท ําการทดลองนพ้ี บวา ความเขม ขน ของจลุ นิ ทรยี ใ น

น้ําตัวอยาง W4 มีจํานวนนอ ยกวา 10 เซล/มลิ ลิลิตร

ในการกําหนดคา Threshold value และหลงั จาก Calibrating การวเิ คราะหข อง
เครอ่ื งมอื ทง้ั ระบบ จะมีความเปนไปไดท จ่ี ะตอ งคน ควา ใหแ นน อนวา การปนเปอ นทเ่ี กนิ ระดบั จะ
เกิดข้ึนหรือไม ในกรณีขา งตน การเพม่ิ ของ E-value รอยละ 3 ถูกกําหนดเปน คา Threshold
value เพราะคา E-value มีแนวโนม ตอ ปฏกิ ริ ยิ าทม่ี คี วามไวมากและรวดเรว็ กวา คา M-value
บนพื้นฐานของวิธีนี้ตอการประเมินคุณภาพของนาํ้ บาดาล ผลของการฆา เชอ้ื และระดบั การ
ปนเปอนกลับอีกควรจะตองไดรับขอมูลภายในเวลาอันสั้น ในวธิ ีการเดิมที่ตรวจนบั โคโลนใี น
กระบวนการปนเปอนกลับอีกพบวาสายเกินไปที่ทราบผล ระบบการตรวจวเิ คราะหจ ลุ นิ ทรยี 
แบบเรว็ ในระบบ BacTrac เปนวิธีการทท่ี ดสอบไดอ ยา งมปี ระสทิ ธภิ าพในการตรวจวเิ คราะห
ตัวอยางคราวละมากๆ และสามารถตรวจทราบในสว นการปนเปอ นกลับในระบบทอ สง ได
อยางดี ดังน้ันจึงมีความเปน ไปไดท จ่ี ะไดร บั ผลทนั เวลา โดยเฉพาะหลงั จากกระบวนการทําให
น้ําบริสุทธิ์

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 187

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา ง
Cosmetic cleansing milk

ในการวเิ คราะหต วั อยา ง Cosmetic cleansing milk แบบเรว็ น้ี เปน การตรวจวดั เชอ้ื
แบคทีเรียในตัวอยา ง โดยใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื BiMedia 001 A

M (%) M-value E(%) E-value

30 30 Dilution milk medium
25 1:106
25 Dilution milk medium 20 1:105
20 1:106 15 1:104
15 1:105 1:103 10 Threshold 1:103
10 1:104 1:102 5 1:102
0 1:10
5 1:10 -5

0

-5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
เวลา (ชั่วโมง) เวลา (ชั่วโมง)

ภาพ 36 การวเิ คราะห M-value และ E-value ใน Cosmetic cleansing milk

สําหรบั Cosmetic agents ไดมีกฎหมายกํากบั การใชท ส่ี อดคลอ งกบั กฎหมายอาหาร
เนื่องจากสวนประกอบของ Cosmetic agents ไดแสดงคุณสมบัติเปนอันตรายตอการ
เปลย่ี นแปลงของเชอ้ื จลุ นิ ทรีย ดังนั้นการเติมสารกันเสียมีความจําเปน อยา งเลย่ี งไมไ ดส ําหรบั
ปองกันสุขภาพ เพอ่ื ประเมนิ ประสทิ ธภิ าพของสารกนั เสยี ใน Cleansing milk จึงไดทดลองเติม
สารละลายแบคทเี รยี มาตรฐาน 9:1 (v/v) (Sample : Suspension) ลงไปในนํ้านม สาํ หรบั การ
วิเคราะหแบคทีเรียทั้งหมดในสวนผสม จะทาํ การเจอื จางดว ยอาหารเลย้ี งเชอ้ื ใหไ ดห ลายๆ
ความเจอื จาง ตง้ั แตใ นชว งจาก 1:10 ถึง 1:106 V/V (Mixture : Medium) และในแตละ
ความเจือจางจะถกู นําไปบม ท่ี 30 องศาเซลเซยี ส (86 องศาฟาเรนไฮต) นาน 20 ชว่ั โมง ใน
เครื่องมือ BacTrac

ในภาพ 36 เปน การแสดงคา M-value และ E-value ท่ีความเจอื จางทม่ี ากกวา 1:103
การเจริญเติบโตของแบคทีเรียจะชา หรอื ถกู ปอ งกนั โดยสารประกอบทอ่ี ยใู น Cleansing milk ท่ี
ระดับความเจอื จางสูงขน้ึ Cleansing milk จะไมมีผลตอการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ซง่ึ
สามารถตรวจวัดไดดวยเครื่องในกราฟภาพที่ 36

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 188

ความสนใจเพิ่มเติมที่วา การเปลย่ี นแปลง E-value ของตัวอยางถูกวัดกอนการ
เปลี่ยนแปลงของคา M-value ซึ่งหมายถึงแบคทีเรียในบริเวณสิ่งแวดลอมของอาหารเลี้ยงเชื้อจะ
มีกิจกรรมเมตาบอลิซึมที่เพิ่มขึ้นที่บริเวณพื้นผิวของอิเลคโตรด ดงั นน้ั คา Threshold value
สําหรับการเจริญเตบิ โตของแบคทเี รยี จะถกู กําหนดทก่ี ารเปลย่ี นแปลงของคา E-value ท่ี
รอ ยละ 7

ตัวอยางนช้ี ใ้ี หเ หน็ วา การประยกุ ตเ ครอ่ื งมอื BacTrac 4100 แสดงถึงผลของความ
แตกตางของ Cosmetic agents เมื่อสารดงั กลา วถูกผสมดว ยความเขม ขนแบคทเี รยี ท่แี ตกตาง
กัน ซ่ึงสามารถใชใ นการควบคมุ คณุ ภาพ เชน สามารถใชว เิ คราะห Total bacterial count
ในตัวอยา ง หรอื วเิ คราะหอ ายกุ ารเกบ็ รกั ษาผลติ ภณั ฑท ใ่ี ชส ารกนั เชอ้ื แบคทเี รยี

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 189

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา ง
Pharmaceutical tablets

ในการวเิ คราะหต ัวอยา ง Pharmaceutical tables แบบเร็วนี้ เปน การตรวจวดั เชอ้ื
จุลินทรียในตวั อยา ง โดยใชอ าหารเลย้ี งเชอ้ื BiMedia 001 A

M (%) M-value 50 E(%) E-value 50

40 40
35 35 Tablets
30 30 T1
25 25 T2
20 20 T3
15 Tablets 15 T4
10 T1 10
5
5 T2 T3 T4 0
0 -5
-5
0 10 20 30 40
0 10 20 30 40 เวลา (ชั่วโมง)
เวลา (ชั่วโมง)

ภาพ 37 การวิเคราะห M-value และ E-value ใน Pharmaceutical tablets

ในตัวอยางการประยุกตนี้ เมด็ ยาจะผนั แปรระดบั ความเขม ขน ของจลุ นิ ทรยี ท ป่ี นเปอ น

และทําการตรวจสอบ ปรมิ าณเกลอื ของเมด็ ยานใ้ี หผ ลตอ การนําไฟฟา ทส่ี งู ในสารละลาย

ปริมาณอิออนที่สูงของสิ่งแวดลอมในการวัดเซล ซง่ึ ทําใหก ารวดั Impedance คอ นขางยาก

อยางไรกต็ ามการวดั ในระบบ BacTrac 4100 จะไมมีปญ หา เพราะวา เครอ่ื งมอื มกี ารตดิ ตง้ั การ

วัดคา M-value และ E-value ท่ีแยกจากกนั

ตัวอยางจะถูกทดสอบตามขั้นตอนดังนี้ ตวั อยา งเมด็ ยาทง้ั 4 ตัวอยาง (T1-T4) โดยมี
น้ําหนัก 10 กรมั ถกู ใสล งในภาชนะขนาด 100 มิลลิลิตร และละลายในน้ําเปปโตนจํานวน 90
มลิ ลิลิตรโดยใช Magnetic stirrer ตัวอยา งทง้ั สล่ี ะลายในอาหารเลย้ี งเชอ้ื และไมตอ งใชการบด
ใน Mortar กอนการละลาย การนําไฟฟา จําเพาะของสารละลายโดยเฉลย่ี เปน 14 mS/cm และ
ดูดสารละลายมา 1 มลิ ลลิ ิตรผสมกับอาหารเลีย้ งเชอ้ื BiMedia 001 A จํานวน 9 มลิ ลิลิตร
( Impedance medium สําหรับวิเคราะห Total aerobic counts) และบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศา
เซลเซยี ส (86 องศาฟาเรนไฮต) นาน 60 ชว่ั โมง

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 190

ในภาพ 37 แสดงใหเห็นวาคา M-value มีการเพิ่มขึ้นคอนขางนอ ยอยางเห็นไดชัดเจน
เมื่อเทียบกบั คา E-value ปจจัยอื่นทที่ ําใหน ยิ มวัดคา E-value ในกรณีนี้คือคาดังกลาวเพิ่มขึ้น
คอนขา งเรว็ เมอ่ื เทยี บกบั คา M-value การเปลย่ี นแปลงในคา M-value ของตัวอยาง T4 ไมม ี
ความแตกตา งอยา งมนี ยั สาํ คญั ทางสถิติ เฉพาะคา E-value ท่ีสามารถใชในการประเมินได

สําหรับการวิเคราะหจํานวนจลุ ินทรีย ระดบั Threshold value ของคา E-value ถูก
กําหนดไวที่รอยละ 7 อาหารเลี้ยงเชื้อของตัวอยาง T1 จะถูกเริ่มวัดไดโดยการวัด Impedance
ซ่ึงมเี ชอ้ื 50 cfu/ml หลังจากเวลาตรวจสอบผา นไป 11 ชว่ั โมง ตัวอยาง T4 ท่ีมจี ลุ นิ ทรยี  1-2
cfu/ml จะถูกตรวจสอบภายใน 32 ชว่ั โมง กราฟของตัวอยาง T2 มีความสัมพนั ธก บั จํานวน
จุลนิ ทรีย 30 cfu/ml สวนตัวอยา ง T3 มเี ชอ้ื 10 cfu/ml เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีเดิมจะตองใชเวลา
ถึง 5 วัน

อยา งไรกต็ ามตวั อยา งทาง Pharmaceutical และ Cosmetical samples จะแสดงใหเห็น
ถึงการมีคุณสมบตั กิ ารนําไฟฟา ทค่ี อ นขา งสงู ในตอนเรม่ิ ตน ซง่ึ เครอ่ื งมอื BacTrac ที่วัดคา
E-value สามารถใชเปน เครอ่ื งมอื วดั ทเ่ี หมาะสมตอ การตรวจสอบการปนเปอ นจากจลุ นิ ทรยี 
นอกจากการตรวจนับจุลินทรียทั้งหมดที่ปนเปอนแลวการตรวจวิเคราะหเฉพาะสามารถ
ตรวจสอบได เชน การตรวจสอบยสี ตแ ละเชอ้ื รา โดยใชอาหารเฉพาะและใชว ธิ ีการเดียวกบั
ขา งตน

หลกั การวเิ คราะหจ ุลนิ ทรยี  รองศาสตราจารย ดร. ไพโรจน วิริยจารี 191

การประยกุ ตใ ชว ธิ กี ารวเิ คราะหแ บบเรว็ ในตวั อยา งนมดบิ

ในการวิเคราะหต วั อยา งนมดบิ แบบเรว็ น้ี เปน การตรวจวดั เชอ้ื จลุ นิ ทรียในตวั อยา ง
โดยเฉพาะ Total viable count, coliform count และ yeasts / molds count โดยใชอ าหารเลย้ี ง
เชื้อ BiMedia 001 A, 160 A และ 501 A

M (%) M-value E(%) E-value

30 Total variable 30 Total variable
25 Coliform bacteria 25 Coliform bacteria
20 20
15 15
10 10 Yeast/mold
5 Yeast /mold 5
0 0
-5 Sterile raw milk -5 Sterile raw milk

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
เวลา (ชั่วโมง) เวลา (ชั่วโมง)

ภาพ 38 การวเิ คราะห M-value และ E-value ในตัวอยางนมดิบ

นมดิบจะตองมีการจํ าแนกคุณภาพในระดับต างๆ เพื่อ ใ หเหมาะสมสอดคลองกับ
กฎหมาย ดังน้ันการวเิ คราะหเ พอ่ื ใหไ ดผ ลทร่ี วดเรว็ ในแงก ารตรวจนบั เชอ้ื จลุ นิ ทรยี จ งึ เปน สง่ิ ท่ี
สําคัญและจําเปน ปริมาณจลุ นิ ทรยี ท ม่ี ากอาจจะทําใหเ กดิ การเสอ่ื มเสยี ในนมระหวา งการเกบ็ ท่ี
ยาวนานขึ้น และถา สามารถตรวจนบั จลุ นิ ทรียไดภายใน 1 วนั กน็ บั วา จะเปน ประโยชนอ ยา งยง่ิ
ในการประกันคุณภาพนํ้านมดบิ ได

ตัวอยางนํ้านมดิบท่ีไดมาตรฐานตามกฎหมายไดถูกนํามาใชเพ่ือการวัดจุลินทรียใน
ระบบ BacTrac 4100 ดังนี้ นํานํ้านมดบิ ดงั กลา วจํานวน 1 มลิ ลิลิตรผสมกับ Culture medium
จํานวน 9 มลิ ิลิตร และบม เพาะเชอ้ื ท่ี 30 องศาเซลเซยี ส (86 องศาฟาเรนไฮต) นาน 15 ชว่ั โมง
ในเครื่อง BacTrac ซง่ึ Culture media ท่ีใชใ นการตรวจสอบ Total variable count จะเปน
อาหารเลี้ยงเชื้อทั่วไป (Universal medium) สวน Coliform bacteria และ Yeast/mold จะใช
อาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะ (Selective media)

จากภาพ 38 เปน การแสดงคา M-value และ E-value ซ่ึงลกั ษณะกราฟของการวดั
Total variable count และ Coliform bacteria จะมีลักษณะการเจรญิ ทค่ี ลา ยกนั ในชว งแรกๆ