A4 LAYOUT ANTHROPOLOGIA

PolymorphismsPooflyUmorripdhiinsmesGofluurciduirneongloucsuyrlotnroasnylstrfaenrsafesreasgeegneneeaannddirIirnionteoctaenctoaxnicTityo:xLiocwitdyo:seLdoowes dnootsperodteocet fsronmottoxicity
protect from toxicity

γλυκουρονιδάσες των βακτηρίων του εντέρου διασπούν τον SN-38G σε SN-38 και γλυκουρονικό
οξύ. Ο SN-38 είτε επαναρροφάται στην κυκλοφορία (εντεροηπατικός κύκλος του SN-38) είτε
υφίσταται εκ νέου γλυκουρονιδίωση από τη γλυκουρονοσυλτρανσφεράση UGT1A7, που
εκφράζεται στο έντερο.

Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις UGT1A1 και UGT1A7 είναι μέλη της πολυγονιδιακής
οικογένειας UGT που εδράζεται στο 2ο χρωμόσωμα. Αποτελούνται από πέντε εξώνια, τέσσερα
είναι κοινά (II-V) και ένα μοναδικό (Ι) που χαρακτηρίζει το κάθε μέλος. Πολυμορφισμοί των
γονιδίων που κωδικοποιούν τα ένζυμα UGT1A1 και UGT1A7 έχουν συνδεθεί με την εμφάνιση
τοξικότητας από την ιρινοτεκάνη, καθώς η μειωμένη γλυκουρονιδίωση του ενεργού μεταβολίτη
SN-38 οδηγεί σε αυξημένη έκθεση σε αυτόν [1-6]. Μάλιστα, στο φύλλο οδηγιών του φαρμάκου
περιλαμβάνεται σύσταση για πιθανή μείωση της δόσης του φαρμάκου σε ασθενείς ομόζυγους για
τον πολυμορφισμό UGT1A1*28 (UGT1A1*28/*28). Έκτοτε έχουν δημοσιευθεί αρκετές μελέτες
πάνω στο θέμα, με συχνά αντιφατικά αποτελέσματα [7-10]. Το 2007 σε μία μεταανάλυση η
Hoskins et al κατέληξαν ότι οι χαμηλές δόσεις του φαρμάκου δεν προκαλούν τοξικότητα
ανεξάρτητα από τον γονότυπο του ασθενούς [11]. Αντίθετα ήταν τα αποτελέσματα του Hu et al
που συνέδεσε τον γονότυπο UGT1A1*28/*28 με την εμφάνιση ουδετεροπενίας ακόμα και σε
χαμηλές δόσεις ιρινοτεκάνης.) Eπιπλέον, τόσο οι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 όσο και οι
ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28 ασθενείς εμφάνιζαν αυξημένο κίνδυνο για διάρροια στις μεσαίες και
υψηλές δόσεις [12-13]. Πιο πρόσφατα, ο Liu et al έδειξε ότι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 και
ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28 ασθενείς είχαν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ουδετεροπενίας
ανεξάρτητα από τη δόση που λάμβαναν, καθώς και αυξημένο κίνδυνο διάρροιας σε μεσαίες και
υψηλές δόσεις [14].

Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της σχέσης των πολυμορφισμών των UGT1A1 και
UGT1A7 γονιδίων με την εμφάνιση τοξικότητας, σε Έλληνες ασθενείς με καρκίνο παχέος
εντέρου που λάμβαναν χαμηλή δόση ιρινοτεκάνης.

Υλικό και μέθοδοι

Στη μελέτη συμμετείχαν 46 ασθενείς (23 άνδρες και 23 γυναίκες) που λάμβαναν ιρινοτεκάνη
80mg/m2, 5-φθοριοουρακίλη 450mg/m2 και λευκοβορίνη 200mg/m2 τις ημέρες 1, 8, 15, 22, 29
και 36 κάθε 8 εβδομάδες. Η πρωτοπαθής εστία ήταν το παχύ έντερο στους 45 από τους 46
ασθενείς. Στον έναν η πρωτοπαθής εστία ήταν άγνωστη, με πιθανότερη όμως πρωτοπαθή
εντόπιση το παχύ έντερο σύμφωνα με την οστεομυελική βιοψία που έγινε. Η μέση ηλικία των
ασθενών ήταν τα 62,3 έτη (εύρος 33-78 έτη). Το performance status (Karnofsky) ήταν 70-90% σε
39 ασθενείς (84,8%) και 100% σε 7 ασθενείς (15,2%). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών
φαίνονται στον Πίνακα 1.

Οι ασθενείς αξιολογούνταν κλινικά και εργαστηριακά πριν από κάθε θεραπεία. Πριν τη θεραπεία
λάμβαναν 0,5mg ατροπίνης υποδορίως για πρόληψη χολινεργικού συνδρόμου και 8mg
ονδανσετρόνης ενδοφλεβίως για πρόληψη εμφάνισης εμέτων. Αυξητικοί παράγοντες
χορηγούνταν για θεραπεία της ουδετεροπενίας ή προφύλαξη προκειμένου να συνεχιστεί η
χημειοθεραπεία σύμφωνα με τις οδηγίες της EORTC. Σε περίπτωση εμφάνισης εμέτων ή
διάρροιας χορηγούνταν ονδανσετρόνη και λοπεραμίδη, αντίστοιχα. Η τοξικότητα αξιολογήθηκε
σύμφωνα με τα National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events
v3.0. Η θεραπεία αναβάλλονταν με την εμφάνιση αιματολογικής τοξικότητας και διάρροιας
βαθμού≥1, καθώς και με την εμφάνιση οποιασδήποτε άλλης τοξικότητας, (εκτός αλωπεκίας),
βαθμού ≥2. Σε περίπτωση τοξικότητας βαθμού 3-4 γινόταν μείωση της δόσης κατά 20% και στην
επανεμφάνιση τοξικότητας επιπλέον μείωση 20%. Η θεραπεία συνεχίζονταν μέχρι την πρόοδο
της νόσου ή την εμφάνιση μη ανεκτής τοξικότητας. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις
αρχές της διακήρυξης του Ελσίνκι και με την έγκριση της επιτροπής ηθικής του Λαϊκού
Νοσοκομείου. Όλοι ασθενείς, αφού ενημερώθηκαν, έδωσαν τη γραπτή συναίνεσή τους για τη
συμμετοχή τους στη μελέτη.

37 -51-

MMaarriiaaMnnnnaaarTViazairosntoonuua,,KVToanzsssiitolaitknoitiKuno,aslVoKtayocsnhssotiaulin,ktAoinpnKoaualNoltsoo,tkNyoicuch,oRloaesuvT,eskAakvanaTnrziasa,nNYeattenoan,kisIoaRukoo,mvRobsoeAsvremkeknais,Tzanetea, Iakovos Armenis, Marianna
Varsou, Konstantinos Konstantopoulos, Nicolas Tsavaris, Yannis Rombos

Πίνακας 1: Χαρακτηριστικά ασθενών

Χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών %
50%
Φύλο ανδρες 23 50%

γυναίκες 23 84,8%
15,2%
Ηλικία (έτη) μέση 62,3 97,8%
2,2%
εύρος 33-78

Performance 70-90% 39
status 100% 7
(Karnofsky παχύ 45
άγνωστη 1
Πρωτοπαθής
εστία

Έγινε λήψη περιφερικού αίματος και απομόνωση DNA με χρήση του QIAamp DNA Blood midi
kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Ακολούθησε PCR με εκκινητές τους:

F1: 5’CTTGGTGTATCGATTGGTTTTTG3‘ και

R1: 5‘TTTGCTCCTGCCAGAGGTTCG3‘ για το UGT1A1 και

F2: 5’TTTGCCGATGCTCGCTGGACG3‘ και

R2: 5’GCTATTTCTAAGACATTTTTGAAAAAATAGGG3‘ για το UGT1A7.

Ο γονότυπος για το UGT1A1 προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR σε
πήκτωμα πολυακρυλαμίδης (PAGE) 12% . Τα τμήματα που προκύπτουν εφόσον αντιστοιχούν σε
διαφορετικά αλληλόμορφα έχουν μέγεθος 71-73bp ανάλογα με το μέγεθος της αλληλουχίας των
επαναλήψεων (ΤΑ) στην περιοχή του υποκινητή. Το τμήμα μήκους 71bp αντιστοιχούσε στο
UGT1A1*1 και το τμήμα μήκους 73bp στο UGT1A1*28. Ο προσδιορισμός του γονοτύπου για το
UGT1A7 έγινε με ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του εξωνίου 1 (sequencing) του
υποκείμενου γονιδίου. Οι πολυμορφισμοί που προέκυψαν ήταν οι UGT1A7*1 (G115, N129,
R131 και W208), UGT1A7*2 (K129 και K131), UGT1A7*3 (K129, K131 και R208) και
UGT1A7*4 (R208).

Ακολούθησε στατιστική ανάλυση των δεδομένων. Οι συσχετίσεις μεταξύ των γονοτύπων για τα
UGT1A1, UGT1A7 και των χαρακτηριστικών των ασθενών, καθώς επίσης και των δεδομένων
τοξικότητας βασίσθηκαν στον έλεγχο χ2 με διόρθωση συνέχειας. Τα 95% Διαστήματα
Εμπιστοσύνης που δηλώνουν το μέγεθος της συσχέτισης δόθηκαν στην περίπτωση των
στατιστικώς σημαντικών αποτελεσμάτων επί των προαναφερθέντων συσχετίσεων. Προκειμένου
για την επιπλέον αξιολόγηση των δεδομένων τοξικότητας υπολογίσθηκε ο αριθμός των
γεγονότων επί του συνολικού αριθμού των εβδομάδων θεραπείας. Στη συνέχεια εφαρμόσθηκε
ανάλυση μονής διακύμανσης (ANOVA) για να εξετασθούν πιθανές διαφορές σε σχέση με τους
γονοτύπους. Η ίδια ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν πιθανές διαφορές μεταξύ των
γονοτύπων σε σχέση με τα εργαστηριακά δεδομένα. Τα εργαστηριακά δεδομένα πριν την
ανάλυση μετασχηματίσθηκαν (όπου ήταν απαραίτητο) στους αντίστοιχους φυσικούς λογάριθμους
προκειμένου να μειωθεί η κύμανση μεταξύ των τιμών τους. Όλοι οι έλεγχοι ήταν δίπλευροι και
το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο 5%.

Αποτελέσματα
Στον πίνακα 2 παρουσιάζονται οι γονότυποι των ασθενών. Παρατηρούμε ότι ο συχνότερος
γονότυπος για το UGT1A1 γονίδιο είναι ο UGT1A1*1/*1. Συγκεκριμένα, 22/46 ασθενείς (47,8%)

-52- 38

PolymorphismsPooflyUmroridphiinsme sGofluurciudirnoenglouscyurlotrnaosnysltfrearnasfsereasgeegneeneaannddirIirnionteoctaenctaoxnicTityo:xLiocwitydo:sLe doowesdnootsperodteocet sfronmottoxicity
protect from toxicity

ήταν UGT1A1*1/*1, 20/46 (43,5%) UGT1A1*1/*28 και 4/46 (8,7%) UGT1A1*28/*28. Σε ό,τι
αφορά το UGT1A7, 4/46 ασθενείς (8,7%) ήταν UGT1A7*1/*1, 12/46 (26,1%) UGT1A7*1/*2,
15/46 (32,6%) UGT1A7*1/*3, 1/46 (2,2%) UGT1A7*1/*4, 3/46 (6,5%) UGT1A7*2/*2, 7/46
(15,2%) UGT1A7*2/*3 και 4/46 (8,7%) UGT1A7*3/*3.

Πίνακας 2:Συχνότητες γονοτύπων

Γονότυπος Αριθμός ασθενών %

UGT1A1

UGT1A1*1/*1 22 47,8%

UGT1A1*1/*28 20 43,5%

UGT1A1*28/*28 4 8,7%

UGT1A7

UGT1A7*1/*1 4 8,7%

UGT1A7*1/*2 12 26,1%

UGT1A7*1/*3 15 32,6%

UGT1A7*1/*4 1 2,2%

UGT1A7*2/*2 3 6,5%

UGT1A7*2/*3 7 15,2%

UGT1A7*3/*3 4 8,7%

Σοβαρή τοξικότητα θεωρήθηκε η τοξικότητα βαθμού≥3 σύμφωνα με τα National Cancer Institute
Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0. Η τοξικότητα διακρίθηκε σε
αιματολογική (αναιμία, λευκοπενία, ουδετεροπενία, εμπύρετη ουδετεροπενία και θρομβοπενία)
και μη αιματολογική (διάρροια, ναυτία, έμετοι). Οι ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28 ασθενείς
εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη λευκοπενία (p = 0,0002), ουδετεροπενία (p = 0,0146),
θρομβοπενία (p = 0,0032), εμπύρετη ουδετεροπενία (p = 0,0002) και συνολική αιματολογική
τοξικότητα (p < 0,00001), από τους UGT1A1*1/*1 και UGT1A1*28/*28 ασθενείς. Οι ομόζυγοι
UGT1A1*28/*28 ασθενείς εμφάνισαν επίσης αιματολογική τοξικότητα, ιδιαίτερα λευκοπενία και
ουδετεροπενία, αλλά το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό, πιθανόν λόγω του μικρού
αριθμού περιστατικών που αναλύθηκαν (μόνο 4 ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 ασθενείς). Η
εμφάνιση αναιμίας δεν είχε σχέση με τον γονότυπο.

Οι ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28, καθώς και οι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 ασθενείς, είχαν
σημαντικά περισσότερη διάρροια και συνολική μη αιματολογική τοξικότητα σε σχέση με τους
UGT1A1*1/*1 ασθενείς (p = 0,0002 και p = 0,02204, αντίστοιχα) (Πίνακας 3).

Σε σχέση με τους πολυμορφισμούς του UGT1A7, οι γονότυποι UGT1A7*1/*3, UGT1A7*2/*3 και
UGT1A7*3/*3, που εμφάνισαν αιματολογική τοξικότητα, είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά
από αυτούς, UGT1A7*1/*4 και UGT1A7*2/*2, που δεν εμφάνισαν. Ο γονότυπος UGT1A7*1/*3
είχε σημαντικά μεγαλύτερη τοξικότητα από τους UGT1A7*1/*1 και UGT1A7*1/*2 (p = 0,0005).

Για τη μη αιματολογική τοξικότητα, και πάλι οι γονότυποι UGT1A7*1/*2, UGT1A7*1/*3,
UGT1A7*2/*3 και UGT1A7*3/*3, που εμφάνισαν τοξικότητα, είχαν σημαντική διαφορά από
αυτούς, UGT1A7*1/*1, UGT1A7*1/*4 και UGT1A7*2/*2, που δεν εμφάνισαν (p = 0,00702)
(Πίνακας 4).

39 -53-

MMMaarraiiaarnninnaaanVTnazairostoTouuz,,iKVooatnsossuitlai,kniVtiKnaoasslosKtiylocinkhsoitauKn, tAaonplnooautylNoctsoh, kNooiuuc,o,RlAaesvnTenskakavaaNTrzitsao,nYkeaotenuan,,isIRaRkeoomvvoebskoAskramTenzias,netea, Iakovos Armenis, Marianna
Varsou, Konstantinos Konstantopoulos, Nicolas Tsavaris, Yannis Rombos

Πίνακας 3: Συσχέτιση UGT1A1*28 με τοξικότητα (αιματολογική και μη αιματολογική)

Αιματολογική τοξικότητα (Εμπ.ουδ./Hb/WBC/Neu/Plts)*

Βαθμός 0-2 ∞ Βαθμός 3-4╒ 95%ΔΕ βαθ3-4╕ Εβδ. Θερ. ┼ p-value
589 <0,00001
Γονότυπος *1/*1 579 (98,3%) 10 (1,7%) 0,93%-3,09% 397 χ2=55,024,
Σύνολο *1/*28 99
*28/*28 347 (87,4%) 50 (12,6%) 9,69%-16,22% 1085 df=2

97 (98,0%) 2 (2,0%) 0,62%-7,04% Εβδ. Θερ. ┼ p-value

1023 (94,3%) 62 (5,7%)

Μη αιματολογική τοξικότητα (Διάρροια/Έμετοι/Ναυτία)

Βαθμός 0-2 ∞ Βαθμός 3-4 ╒ 95%ΔΕ βαθ3-4╕

Γονότυπος *1/*1 564 (95,8%) 25 (4,2%) 2,90%-6,20% 589 0,02204
*1/*28 364 (91,7%) 33 (8,3%) 5,99%-11,45% 397 χ2=7,63,

*28/*28 91 (91,9%) 8 (8,1%) 4,20%-15,16% 99 df=2

Σύνολο 1019 (94,9%) 66 (5,1%) 1085

*Αιματολογική τοξικότητα (Εμπύρετη ουδετεροπενία/Αιμοσφαιρίνη/Λευκά/Ουδετερόφιλα/Αιμοπετάλια), ∞ Επεισόδια βαθμού 0-2, ╒
Επεισόδια βαθμού 3-4, ╕95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Βαθμός 3-4, ┼Εβδομάδες Θεραπείας

Πίνακας 4: Συσχέτιση UGT1A7*2 και UGT1A7*3 με τοξικότητα (αιματολογική και μη αιματολογική)

Αιματολογική τοξικότητα (Εμπ.ουδ./Hb/WBC/Neu/Plts)*

Βαθμός 0-2 ∞ Βαθμός 3-4 ╒ 95%ΔΕ βαθ3-4╕ Εβδ. Θερ. ┼ p-value

Γονότυπος *1/*1 109 (98,2%) 2 (1,8%) 0,56%-6,30% 111 0,0005
*1/*2 290 (96,0%) 12 (4,0%) 2,30%-6,82% 302 χ2=24,083,

*1/*3 294 (90,5%) 31 (9,5%) 6,81%-13,23% 325 df=6

*1/*4 32 (100,0%) 0 32

*2/*2 60 (100,0%) 0 60

*2/*3 155 (91,2%) 15 (8,8%) 5,44%-14,06% 170

*3/*3 83 (97,6%) 2 (2,4%) 0,73%-8,15% 85

Σύνολο 1023 62 1085

Μη αιματολογική τοξικότητα (Διάρροια/Έμετοι/Ναυτία)

Βαθμός 0-2 ∞ Βαθμός 3-4 ╒ 95%ΔΕ βαθ3-4╕ Εβδ. Θερ. ┼ p-value

Γονότυπος *1/*1 111 (100,0%) 0 (0,0%) 111 0,00702
*1/*2 281 (93,0%) 21 (7,0%) 302 χ2=17,701,
4,61%-10,40%

*1/*3 303 (93,2%) 22 (6,8%) 4,53%-10,04% 325 df=6

*1/*4 32 (100,0%) 0 (0,0%) 32

*2/*2 60 (100,0%) 0 (0,0%) 60

*2/*3 155 (91,2%) 15 (8,8%) 5,44%-14,06% 170

*3/*3 77 (0,6%) 8 (9,4%) 4,90%-17,51% 85

Σύνολο 1019 66 1085

*Αιματολογική τοξικότητα (Εμπύρετη ουδετεροπενία/Αιμοσφαιρίνη/Λευκά/Ουδετερόφιλα/Αιμοπετάλια), ∞ Επεισόδια βαθμού 0-2,
╒ Επεισόδια βαθμού 3-4, ╕95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Βαθμός 3-4, ┼Εβδομάδες Θεραπείας

-54- 40

Polymorphisms PooflyUmroirdphinisemsGolfuucriudirnoengoluscyulrtornaonsysltfrearnasfseeragseegneeneaanndd iIrriniontoectaenctaonxicTitoy:xLicowityd:osLeodowesdnoost eprodtoecetsfronmottoxicity
protect from toxicity

Οι αναβολές της θεραπείας και οι μειώσεις δόσης δεν έδειξαν συσχέτιση με τον γονότυπο,
παρόλο που έμμεσα αναφέρονται στην τοξικότητα. Ο γονότυπος UGT1A1*28/*28 είχε
σημαντικά υψηλότερη μέση (p = 0,043) και μέγιστη (p = 0,034) ολική χολερυθρίνη. Τέλος,
ασθενείς με αιματολογική τοξικότητα μόνο είχαν σημαντικά χαμηλότερη αρχική και μέση
αιμοσφαιρίνη σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς (p = 0,003 και p = 0,023, αντίστοιχα).

Συζήτηση -55-

Μελετήθηκε η ύπαρξη συσχέτισης ανάμεσα στον γονότυπο των ασθενών που λαμβάνουν χαμηλή
δόση ιρινοτεκάνης και την εμφάνιση τοξικότητας. Φαίνεται ότι ο πολυμορφισμός UGT1A1*28
σχετίζεται με την εμφάνιση τόσο αιματολογικής όσο και μη αιματολογικής τοξικότητας.
Συγκεκριμένα, οι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 και οι ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28 για τον
πολυμορφισμό ασθενείς εμφανίζουν στατιστικά σημαντική περισσότερη μη αιματολογική
τοξικότητα σε σxέση με τους ομόζυγους για την αλληλουχία αναφοράς UGT1A1*1/*1. Επιπλέον,
οι ετερόζυγοι UGT1A1*1/*28 ασθενείς εμφανίζουν στατιστικά σημαντικά περισσότερη
αιματολογική τοξικότητα σε σχέση με τους υπόλοιπους. Οι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 για τον
πολυμορφισμό, επίσης εμφανίζουν τοξικότητα, ιδιαίτερα λευκοπενία και ουδετεροπενία, αν και η
διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική λόγω του μικρού αριθμού των ομόζυγων ασθενών στο
δείγμα μας. Οι πολυμορφισμοί του UGT1A7 φαίνεται επίσης να σχετίζονται με την εμφάνιση
τοξικότητας. Ιδιαίτερα ο UGT1A7*3 φαίνεται να έχει ρόλο στην εμφάνιση τόσο αιματολογικής
όσο και μη αιματολογικής τοξικότητας.

Τα συμπεράσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τις πρώτες μελέτες που δημοσιεύθηκαν πάνω στο
θέμα αυτό [1-6]. Αργότερα αμφισβητήθηκε η επίδραση των πολυμορφισμών στην τοξικότητα
όταν το φάρμακο χορηγείται σε χαμηλές δόσεις [8,11]. Έτσι, ο γενετικός έλεγχος πριν την έναρξη
της θεραπείας με ιρινοτεκάνη δεν εισήλθε ποτέ στην καθημερινή κλινική πράξη.

Ένα άλλο σημείο που απασχολεί τους ερευνητές είναι ο καθορισμός της ιδανικής δόσης για κάθε
γονότυπο. Έχει δειχθεί ότι οι ομοζυγώτες για την αλληλουχία αναφοράς ασθενείς UGT1A1*1/*1,
καθώς και οι ετεροζυγώτες UGT1A1*1/*28 ασθενείς, μπορούν να ανεχθούν υψηλότερη δόση από
τη συνήθως χορηγούμενη. Αντίθετα, οι ομοζυγώτες UGT1A1*28/*28 εμφανίζουν συχνά
τοξικότητα με τις συνηθισμένες δόσεις και για αυτό προτείνεται μείωση της δόσης που
λαμβάνουν [15-16].

Τα πράγματα περιπλέκονται ακόμα περισσότερο, καθώς και άλλοι πολυμορφισμοί των γονιδίων
που κωδικοποιούν τις γλυκουρονοσυλτρανσφεράσες ενδέχεται να παίζουν ρόλο στον
μεταβολισμό της ιρινοτεκάνης. Επίσης, ένας ασθενής είναι δυνατό να φέρει περισσότερους από
έναν πολυμορφισμό. Στο σημείο αυτό να σημειωθεί ότι είναι γνωστό ότι οι UGT1A1*28 και
UGT1A7*2 και UGT1A7*3 βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης [17]. Ακόμα, επιγενετικοί
μηχανισμοί μπορούν να επηρεάζουν την έκφραση των ενζύμων [18-19].

Οι αναβολές και οι μειώσεις δόσης δε φάνηκε να έχουν σχέση με τον γονότυπο. Τα
χαρακτηριστικά των ασθενών επίσης δε σχετίζονται με τον γονότυπο ή την τοξικότητα. Οι
ασθενείς που εμφάνιζαν αιματολογική τοξικότητα είχαν χαμηλότερη αρχική και μέση
αιμοσφαιρίνη κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Οι ομόζυγοι UGT1A1*28/*28 για τον
πολυμορφισμό ασθενείς είχαν υψηλότερη μέση και μέγιστη χολερυθρίνη. Καμία άλλη
παράμετρος που αναλύθηκε δε βρέθηκε να έχει συσχέτιση με τον γονότυπο ή την τοξικότητα.

Συμπερασματικά, με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης οι πολυμορφισμοί UGT1A1*28,
UGT1A7*2 και UGT1A7*3 φαίνεται να σχετίζονται με την εμφάνιση τοξικότητας, ακόμα και
όταν η ιρινοτεκάνη χορηγείται σε χαμηλές δόσεις, όπως στο θεραπευτικό σχήμα που χορηγήθηκε.
Η παρατήρηση αυτή θα μπορούσε να θέσει την αφετηρία για τη διενέργεια του γενετικού ελέγχου
πριν την έναρξη της χορήγησης του φαρμάκου, ώστε ανάλογα με το γενετικό προφίλ των
ασθενών να είναι δυνατή η τροποποίηση και η εξατομίκευση της χορηγούμενης θεραπείας.
Παράλληλα, νέες μελέτες απαιτούνται για τον προσδιορισμό της ιδανικής δόσης για κάθε
γονότυπο.

41

MMaarriiaaMnnnnaaaTVraizairosntoonuu,a,KVToanszssiitolaikntoitiKnuoa,sloVKtyaocnshssotiauln,iktAoinpnoKaualNoltsoo, ktNyoiucc,ohRloaesuvTe,skAakvanaTrnziasa,nYNeatentoan,iksIoaRkuoo,mvoRbsoeAsvremkeknais,Tzanetea, Iakovos Armenis, Marianna
Varsou, Konstantinos Konstantopoulos, Nicolas Tsavaris, Yannis Rombos

Βιβλιογραφία

Martinez-Balibrea E et al (2010) UGT1A and TYMS genetic variants predict toxicity and response of
colorectal cancer patients treated with first-line irinotecan and fluorouracil combination therapy Br J
Cancer 103 581–9 2. Marcuello E et al (2004) UGT1A1 gene variations and irinotecan treatment in
patients with metastatic colorectal cancer Br J Cancer 91 678–82

Innocenti F et al (2004) Genetic variants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of
severe neutropenia of irinotecan J Clin Oncol 22(8) 1382–8

Ando Y et al (2000) Polymorphisms of UDP-glucuronosyltransferase gene and irinotecan toxicity: a
pharmacogenetic analysis Cancer Res 60 6921–6

Lankisch TO et al (2008) Gilbert’s syndrome and irinotecan toxicity: combination with UDP-
glucuronosyltransferase 1A7 variants increases risk Cancer Epidemiol Biomark Prev 17(3) 695–701

Cecchin E et al (2009) Predictive role of the UGT1A1, UGT1A7, and UGT1A9 genetic variants and their
haplotypes on the outcome of metastatic colorectal cancer patients treated with fluorouracil,
leucovorin, and irinotecan J Clin Oncol 27(15)

Carlini LE et al (2005) UGT1A7 and UGT1A9 polymorphisms predict response and toxicity in colorectal
cancer patients treated with capecitabine/irinotecan Clin Cancer Res 11 1226–36

Schulz C et al (2009) UGT1A1 gene polymorphism: impact on toxicity and efficacy of irinotecan-based
regimens in metastatic colorectal cancer World J Gastroenterol 15(40) 5058–66

Denlinger CS et al (2009) Pharmacokinetic analysis of irinotecan plus bevacizumab in patients with
advanced solid tumors Cancer Chemother Pharmacol 65(1) 97–105

Nakamura Y et al (2011) Randomized phase II trial of irinotecan with paclitaxel or gemcitabine for non-
small cell lung cancer J Thorac Oncol 6(1) 121–7

Hoskins JM et al (2007) UGT1A1*28 genotype and irinotecan-induced neutropenia: dose matters J Natl
Cancer Inst 99(17)

Hu ZY et al (2010) Dose-dependent association between UGT1A1*28 genotype and irinotecan-induced
neutropenia: low doses also increase risk Clin Cancer Res 16(15) 3832–42

Hu ZY, Yu Q and Zhao YS (2010) Dose-dependent association between UGT1A1*28 polymorphism and
irinotecan-induced diarrhea: a meta-analysis Eur J Cancer 46 1856–65

Liu X et al (2013) Association of UGT1A1*28 polymorphisms with irinotecan-induced toxicities in
colorectal cancer: a meta-analysis in Caucasians Pharmacogenomics J 1–10

Toffoli G et al (2010) Genotype-driven phase I study of irinotecan administered in combination with
fluorouracil/leucovorin in patients with metastatic colorectal cancer J Clin Oncol 28(5) 866–71

Marcuello E et al (2011) A genotype-directed phase I-IV dose-finding study of irinotecan in combination
with fluorouracil/leucovorin as first-line treatment in advanced colorectal cancer Brit J Cancer 105
53-57

Kohle C et al (2003) Frequent co-occurrence of the TATA box mutation associated with Gilbert’s
syndrome (UGT1A1*28) with other polymorphisms of the UDP-glucuronosyltransferase-1 locus
(UGT1A6*2 and UGT1A7*3) in Caucasians and Egyptians Biochem Pharmacol 65 1521–7

Gagnon JF et al (2006) Irinotecan inactivation is modulated by epigenetic silencing of UGT1A1 in colon
cancer Clin Cancer Res 12(6) 1850–8

Yasar U et al (2013) Evidence for regulation of UDP-glucuronosyltransferase (UGT)1A1 protein

expression and activity via DNA methylation in healthy human livers J Pharm Pharmacol 65 874–
83

-56- 42

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture

Η γενετική προέλευση των κατοίκων της Σαρδηνίας: μια νέα εικόνα

The genetic origin of Sardinians: a new picture

Paolo Francalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

Dipartimento di Scienze della Natura e del Territorio, Università di Sassari

Abstract

The genetic variation in island populations shows peculiar features because of the effect of many
evolutionary forces such as founder effect, inbreeding and genetic drift. Moreover, for human
populations, the environmental, historical and geographical background introduces additional
variables, which are able to shape the genetic landscape of each island in a unique way. Sardinia
is of special interest for human geneticists, because it is a large genetic isolate with a high
incidence of many heritable diseases and a peculiar distribution of alleles at multiple loci. Studies
on classical genetic markers pointed out Sardinia as an outlier in the European variability.
Uniparental markers, such as mtDNA and Y-chromosome, also confirm this finding where
Sardinia shows a significant differentiation from surrounding populations, reflecting an ancient
link with the Northern Iberian region and the subsequent relationship with other populations,
witnessing the complex demographic history of the Mediterranean.

Key words: genetic origines, Sardinians, isolates, uniparental markers demographic history

Περίληψη

Η γενετική ποικιλομορφία στους νησιωτικούς πληθυσμούς παρουσιάζει ιδιαιτερότητες λόγω της
επίδρασης πολλών εξελικτικών παραγόντων, (αρχή του ιδρυτή, ομομειξία και τυχαία γενετική
παρέκκλιση). Επιπλέον, στους ανθρώπινους πληθυσμούς το περιβαλλοντικό, ιστορικό και
γεωγραφικό υπόβαθρο εισάγει πρόσθετες μεταβλητές που είναι σε θέση να διαμορφώνουν το
γενετικό τοπίο του κάθε νησιού με μοναδικό τρόπο. Η Σαρδηνία είναι ειδικού ενδιαφέροντος για
τους γενετιστές, επειδή είναι ένας τόπος μεγάλης γενετικής απομόνωσης με υψηλή συχνότητα
εμφάνισης ορισμένων κληρονομικών ασθενειών και μια περίεργη κατανομή των αλληλόμορφων
σε πολλούς γονιδιακούς τόπους. Μελέτες σχετικά με τους κλασικούς γενετικούς δείκτες
επεσήμαναν τη Σαρδηνία σαν μια εξαίρεση στο Ευρωπαϊκό τοπίο της γενετικής ποικιλομορφίας.
Η διαπίστωση αυτή επιβεβαιώνεται και από τους μονογονεϊκούς δείκτες, όπως το μιτοχονδριακό
DNA και το χρωμόσωμα Υ, των οποίων η αξιοσημείωτη διαφοροποίηση από τους γύρω
πληθυσμούς αντανακλά την αρχαία σύνδεση με την περιοχή της Βορείου Ιβηρικής και την
επακόλουθη σχέση με τους άλλους πληθυσμούς, μαρτυρώντας την πολύπλοκη δημογραφική
ιστορία της Μεσογείου.

Λέξεις κλειδιά: γενετική προέλευση, Σαρδινοί, απομονωμένοι πληθυσμοί, μονογονεϊκοί δείκτες,
δημογραφική ιστορία

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει όχι μόνον το σχέδιο που απαιτείται για την ανάπτυξη ενός
ανθρώπινου όντος αλλά και ίχνη μέρους της ιστορίας του. Στην πραγματικότητα, η συντριπτική
πλειοψηφία του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι κοινή μεταξύ όλων των ζώντων ανθρώπων, ενώ
το μικρό κλάσμα που διαφοροποιεί τον καθένα μας είναι αποτέλεσμα των μεταλλάξεων που
έχουμε κληρονομήσει από τις προηγούμενες γενιές μέχρι τους πιο πρόσφατους κοινούς
προγόνους. Οι αλλαγές αυτές είναι γενετικοί δείκτες που προσδιορίζουν τις καταγωγές και μας
οδηγούν πίσω στο μονοπάτι του χώρου και του χρόνου. Για το λόγο αυτό, η μελέτη της γενετικής
ποικιλότητας αποτελεί βασικό εργαλείο για τη γνώση της εξελικτικής ιστορίας μας. Πέρα από τις
πρωτοποριακές μελέτες πάνω σε κλασικούς δείκτες, όπως ομάδες αίματος και πολυμορφισμοί
πρωτεϊνών, η πρόσφατη εξέλιξη της μοριακής βιολογίας ευνοεί την άμεση διερεύνηση της
πρωταρχικής πηγής της ποικιλομορφίας, το DNA.

43 -57-

Paolo Francalacci, Daria Sanna, AntonelPlaaUosleoli Francalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

Ωστόσο, δεν είναι όλα τα τμήματα του γονιδιώματος κατάλληλα για πληθυσμιακές μελέτες. Στην
πραγματικότητα, ακόμη και όταν η εξελικτική ιστορία ενός πληθυσμού φαίνεται να είναι η ίδια,
επί μέρους τμήματα του γονιδιώματος μας διηγούνται διαφορετικές ιστορίες. Είναι προφανές ότι
τα βασικά γονίδια δεν μπορούν να μεταβληθούν με γρήγορο ρυθμό καθώς οι αλλαγές τους
συνεπάγονται σημαντικές τροποποιήσεις στις πιο βασικές μεταβολικές λειτουργίες, συνεπώς
αυτά είναι χρήσιμα μόνο για την ανασύσταση φυλογενετικών σχέσεων σε ανώτερο ταξινομικό
επίπεδο, αλλά όχι και για τη διαφοροποίηση πληθυσμών. Οι μικρότερης βιολογικής σημασίας
περιοχές του γονιδιώματος ωστόσο, είναι δυνατόν να αλλάζουν με ταχύτερους ρυθμούς
επιτρέποντας τη διάκριση μεταξύ των ειδών, των πληθυσμών ή ακόμη και των ατόμων. Όσο πιο
γρήγορος είναι ο ρυθμός της μεταβολής, τόσο πλησιέστερα είναι τα εξελικτικά συμβάντα για τα
οποία μπορούμε να εξάγουμε συμπεράσματα.

Πρόσφατα, μεγάλη σημασία έχει δοθεί στους δείκτες μονογονεϊκής μετάδοσης, όπως το
μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) (Cann et al.,1987) και το χρωμόσωμα Υ (Jobling and Tyler-
Smith,1995). Ως γνωστόν, κληρονομούμε το μεγαλύτερο μέρος των χρωμοσωμάτων μας εξίσου
από τους δύο γονείς μας, ωστόσο το mtDNA μας παρέχεται μόνο από το ωάριο και όχι από τα
σπερματοζωάρια, δηλαδή μόνο από τη μητρική πλευρά, ενώ το χρωμόσωμα Υ, που καθορίζει το
άρρεν φύλο και απουσιάζει στις γυναίκες, μεταδίδεται από πατέρα σε γιο. Κατά συνέπεια, τα δύο
αυτά γενετικά συστήματα δεν υπόκεινται σε ανασυνδυασμό, όπως συμβαίνει με τα άλλα
χρωμοσώματα, και κληρονομούνται αμετάβλητα από γενιά σε γενιά. Αυτό ισχύει συλλογικά για
το mtDNA και για ένα μεγάλο μέρος του χρωμοσώματος Υ ονομαζόμενο μη ανασυνδυασμένο Y
(NRY, Non Recombinant Y ή ΜSΥ, Male Specific Y = Ειδικό Αρσενικό Y). Η μόνη δυνατή
πηγή διαφοροποίησης για αυτά τα δύο γενετικά συστήματα είναι η μετάλλαξη. Έτσι, οι αλλαγές
νουκλεοτιδίων συσσωρεύονται με την πάροδο του χρόνου στο μόριο DNA, χωρίς ανάμιξη μεταξύ
των γενεαλογικών γραμμών. Ένα ειδικό πρότυπο μετάλλαξης σε ένα τμήμα μη-
ανασυνδυαζόμενου DNA ονομάζεται απλότυπος (haplotype), ενώ ένα σύμπλεγμα διαφορετικών
απλοτύπων, που εμπεριέχει μια κοινή χαρακτηριστική μετάλλαξη θεωρούμενη προγονική των
επακόλουθων γενεαλογιών, ονομάζεται απλοομάδα (haplogroup). Όλα τα mtDNA και
χρωμοσώματα Υ των σύγχρονων ανθρώπων δια της αναγωγής συγκλίνουν σε μία μόνη γυναίκα-
πρόγονο και σε ένα μοναδικό άνδρα. Καθώς οι μεταλλάξεις από τους κοινούς προγόνους
συσσωρεύονται με το πέρασμα του χρόνου στις γενεαλογικές γραμμές, είναι δυνατό να
χρησιμοποιηθούν ως ίχνη για την παρακολούθηση της δημογραφικής ιστορίας της
ανθρωπότητας.

Η κατανομή των διακριτών απλοτύπων μπορεί να εμφανίζει αντιστοιχίες με τη γεωγραφική
διαμόρφωση, παρέχοντας έτσι πρότυπα συγγένειας και ενδείξεις σχετικά με τις μετακινήσεις των
πληθυσμών κατά το παρελθόν. Τέτοια γενετικά δεδομένα είναι ανεξάρτητα, αλλά συχνά
συμβατά, με σενάρια προερχόμενα από άλλους τομείς διαφορετικούς από τη γενετική. Στην
Ευρώπη έχουν καταγραφεί μη τυχαίες κατανομές απλοομάδων του μιτοχονδριακού mtDNA και
του χρωμοσώματος Υ, οι δε διαβαθμίσεις στις συχνότητες εμφάνισης τους έχουν ερμηνευθεί σαν
αντανάκλαση δημογραφικών γεγονότων του παρελθόντος.

Ωστόσο, θα πρέπει να λάβουμε υπόψη μας τις διαφορές μεταξύ των δύο συστημάτων, τόσο ως
προς το ρυθμό μετάλλαξης όσο και ως προς τη διαφορετική ανά φύλο εξελικτική δυναμική των
πληθυσμών. Όσον αφορά τον ρυθμό μετάλλαξης, αυτός είναι πολύ υψηλότερος στο mtDNA και
ιδιαίτερα στην περιοχή ελέγχου (control region), η οποία χωρίζεται σε δύο υπερμεταβλητά
(hypervariable) τμήματα. O υψηλός αυτός ρυθμός έχει ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη
γενετική ποικιλία χρήσιμη στις πληθυσμιακές μελέτες, παρά ταύτα όμως συχνά ευθύνεται για την
εμφάνιση επαναλαμβανόμενων και αντίστροφων μεταλλάξεων που αποπροσανατολίζουν τη
γενετική ανάλυση. Αντιθέτως, το χρωμόσωμα Υ είναι πιο σταθερό και οι μεταλλάξεις, οι οποίες
είναι ευρέως διαδεδομένες σε ένα πολύ μεγαλύτερο μόριο, αντιπροσωπεύουν μοναδικά
εξελικτικά γεγονότα, οπότε το πρόβλημα του «πληροφοριακού θορύβου» λόγω υπερβολικής
γενετικής ποικιλομορφίας που αντιμετωπίζουμε στο μιτοχονδρακό mtDNA, δεν υφίσταται για το
χρωμόσωμα Υ.

-58- 44

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture

Οι προηγμένες τεχνολογίες των τελευταίων χρόνων έχουν ενισχύσει σημαντικά την ευκρίνεια της -59-
ανάλυσης ευρέων τμημάτων του γονιδιώματος. Μελετώντας εκατοντάδες χιλιάδες
πολυμορφισμούς (300K μέχρι 650K) απλού νουκλεοτιδίου (SNPs) οι ερευνητές έχουν εμβαθύνει
στην κατανόηση των σχέσεων μεταξύ των ευρωπαϊκών και των άλλων ανά τον κόσμο
πληθυσμών. (Tian et al. 2008; Novembre et al. 2008; Li et al. 2008).

Ωστόσο από τη φύση τους αυτές οι τεχνολογίες αδρής χαρτογράφησης του γονιδιώματος
υπόκεινται σε αβέβαιες εκτιμήσεις. Οι προσεγγίσεις πλήρους ανάλυσης των αλληλουχιών
παρακάμπτουν τα σχετικά προβλήματα και παρέχουν το ύψιστο επίπεδο ευκρίνειας στη γενετική
ανάλυση. Έτσι, η αλληλούχιση του πλήρους μιτοχονδριακού γονιδιώματος (16.569 bp) παρέχει
το καλύτερο επίπεδο ανάλυσης και συνήθως πραγματοποιείται σε μεγάλη κλίμακα, σε επίπεδο
πληθυσμών (Torroni et al. 2006; Pala et al. 2009). Για μεγάλο χρονικό διάστημα η προσέγγιση
αυτή δεν ήταν εύχρηστη για το πυρηνικό γονιδίωμα, λόγω μεγάλου μεγέθους του μορίου του
DNA. Ωστόσο οι νέες τεχνολογίες ανάλυσης των αλληλουχιών επέτρεψαν μια συνολική
αξιολόγηση ολόκληρου του γονιδιώματος με στόχο την κατηγοριοποίηση των γενετικών προφίλ
διαφορετικών εθνοτήτων, με τυπικό παράδειγμα το πρόγραμμα των 1000 γονιδιωμάτων (“1000
Genomes Project”). Μέχρι σήμερα περισσότεροι από 1.700 δείκτες αναγνωρίζονται παγκοσμίως
από τη Διεθνή Ένωση Γενετικής Γενεαλογίας (International Society of Genetic Genealogy-
ISOGG), όπως εμφαίνεται στην ιστοσελίδα της. Πρόσφατα το 2010, η Σύμπραξη του
Προγράμματος των 1000 γονιδιωμάτων (1.000 Genomes Project Consortium), με την
ολοκλήρωση της πιλοτικής φάσης του προγράμματος ανακοίνωσε τον εντοπισμό 2.780 SNPs,
μέσω της αδρής ανάλυσης αλληλουχιών του πλήρους γονιδιώματος 77 ανδρών από τέσσερις
διαφορετικές πληθυσμούς. Ακολούθησε και μια πιο ολοκληρωμένη έκδοση της πρώτης φάσης
που ανέβασε τον αριθμό αυτό σε 18.962 SNPs από τον παγκόσμιο πληθυσμό. Στη συνέχεια, ο
Wei και οι συνεργάτες του, (Wei et al., 2012) ανέλυσαν με υψηλή κάλυψη τις πλήρεις ακολουθίες
χρωμοσωμάτων Υ μήκους 8,97 Mb από 35 δείγματα. Τα αποτελέσματα, είναι ήδη διαθέσιμα από
την εταιρεία Complete Genomics. Σε συνδυασμό με αποτελέσματα από την πλήρη ανάλυση ενός
γονιδιώματος διαθέσιμη από το Πρόγραμμα των 1000 γονιδιωμάτων, αποκάλυψαν 6.662 νέες
παραλλαγές.

Ένα ανάλογο ευρείας κλίμακας πρόγραμμα το οποίο αφορά την πλήρη ανάλυση των
αλληλουχιών του συνολικού γονιδιώματος μερικών χιλιάδων κατοίκων της Σαρδηνίας είναι σε
εξέλιξη (Francalacci et al., 2013). Κατωτέρω γνωστοποιούμε τα πρώτα αποτελέσματα της
μελέτης αυτής, η οποία περιλαμβάνει δεδομένα από το.χρωμόσωμα Υ 1.200 Σαρδηνών.

Τα γενετικά δεδομένα

Προσδιορίστηκε ένα σύνολο διαλληλικών πολυμορφισμών απλού νουκλεοτιδίου (SNP’s) του
χρωμοσώματος Υ. Αυτοί οι ίδιοι δείκτες SNPs έχουν χρησιμοποιηθεί για να καθορίσουν και να
χαρακτηρίσουν τους κύριους απλοτύπους σε πολλούς ευρωπαϊκούς και μη ευρωπαϊκούς
πληθυσμούς (Underhill et al. 2000; Semino et al. 2000). Μερικοί απλότυποι που ορίστηκαν από
συγκεκριμένους πολυμορφισμούς, εμφανίζουν μια σταδιακή μείωση συχνότητας στον Ευρωπαϊκό
χώρο, η οποία θα μπορούσε να είναι ενδεικτική των μεταναστευτικών συμβάντων κατά τη
διάρκεια της ιστορίας του σύγχρονου ανθρώπου. Έχει προταθεί ότι οι τρεις απλοτύποι του
χρωμοσώματος Υ που χαρακτηρίζονται από τους πολυμορφισμούς M173, M170 και M26
υπήρχαν στην Ευρώπη από την Ανώτερη Παλαιολιθική εποχή (Semino et al. 2000). Ωστόσο, θα
μπορούσαν πιθανόν να είχαν περιοριστεί στην Ιβηρική χερσόνησο (M173) και στα Βαλκάνια
(M170) μέχρι την τελευταία εποχή των παγετώνων, διαχεόμενοι προς τα ανατολικά οι πρώτοι και
προς τα δυτικά οι δεύτεροι, εδώ και 14.000 χρόνια, κατ' αναλογία με τις μεταναστευτικές
διαδρομές πολλών ζωϊκών και φυτικών ειδών. (Hewitt 2000). Ειδικότερα, υψηλά επίπεδα
πολυμορφισμού του δείκτη M26 βρέθηκαν μεταξύ των κατοίκων της Σαρδηνίας. Ο απλότυπος
αυτός, ενώ απουσιάζει στην κοντινή Κορσική, εμφανίζεται με μια μοναδικά υψηλή συχνότητα
(περίπου 40%) στη Σαρδηνία (Francalacci et al. 2003). Ο απλότυπος M26 εμφανίζεται επίσης σε
Βάσκους της Γαλλίας (περίπου 9%) (Semino et al. 2000) και έχει αναφερθεί με μικρότερη
συχνότητα εμφάνισης στην Αγγλία, την Ανδαλουσία, και τη Βορειοδυτική Αφρική (Bosch et al.
2003).

45

Paolo Francalacci, Daria Sanna, AntonePllaaUosleoliFrancalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

Οι απλότυποι που ορίστηκαν από τούς πολυμορφισμούς M35 και M172 έχουν ερμηνευθεί ως
αντιπροσωπευτικοί, μεταξύ άλλων, της Νεολιθικής συνιστώσας στην Ευρωπαϊκή ποικιλομορφία
του χρωμοσώματος Υ. Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή άρχισαν να διαχέονται από τη Μέση
Ανατολή εδώ και 9.000 έτη (yrs BP) (Semino et al. 2000; Quintana-Murci et al. 2003). Τέλος, ο
πολυμορφισμός M17 έχει συνδεθεί με τη διάδοση του πολιτισμού Kούργκαν (Kurgan) από την
Ουκρανία μετά την εξάπλωση των Ινδοευρωπαϊκών γλωσσών στην Ευρώπη και την Ασία (Wells
et al. 2001). Συνολικά, καταγράφεται ένας περιορισμένος αριθμός από γενεαλογικές γραμμές του
χρωμοσώματος Υ στην Ευρώπη, εύρημα που υποδεικνύει ότι ο ανδρικός πληθυσμός στην ήπειρο
αυτή αντιμετώπισε κρίσιμα συμβάντα πληθυσμιακής στενωπού (bottleneck effects) κατά τη
διάρκεια της ιστορίας του.
Τόσο το δενδρόγραμμα που παράγεται από την υπολογιστική μέθοδο γνωστή ως
Ανάλυση Μεγίστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) (Σχήμα 1) όσο και η ανάλυση
των κύριων συνιστωσών (Σχήμα 2), που υπολογίστηκαν βάσει της ποικιλομορφίας του
χρωμοσώματος Υ των διαφόρων ευρωπαϊκών πληθυσμών, δείχνουν την επίδραση των
κυρίων εποικιστικών γεγονότων στον Ευρωπαϊκό χώρο, δηλαδή α) τη μετά την περίοδο
των παγετώνων επανεγκατάσταση του πληθυσμού από την Ιβηρική Χερσόνησο και τα
Βαλκάνια, β) τη Νεολιθική διάχυση από την Εγγύς Ανατολή και γ) την εξάπλωση των
Ινδοευρωπαίων από την Κεντροανατολική Ευρώπη. Και οι δύο υπολογιστικές μέθοδοι
υποδεικνύουν τρεις κύριες ομάδες, που αποτελούνται από Δυτικούς, Ανατολικούς και
Βορειοανατολικούς λαούς, με τη Σαρδηνία ως εξαίρεση.

Σχ.1. Ανάλυση (Maximum Parsimony) για το χρωμόσωμα Υ σε διάφορους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς.

Στην πραγματικότητα, συγκρίνοντας τους πληθυσμούς της Σαρδηνίας με άλλους μεσογειακούς
πληθυσμούς, ως προς την ποικιλομορφία του χρωμοσώματος Υ επισημαίνεται μια αξιοσημείωτη
διαφοροποίηση, οφειλόμενη σε μεγάλο βαθμό στον απλότυπο που ορίζεται από τη μετάλλαξη
M26, ένα γενετικό χαρακτηριστικό το οποίο είναι εξαιρετικά σπάνιο αλλού. Αυτός ο απλότυπος
παρουσιάζει την ίδια κατανομή με τις απλοομάδες V, H1 και H3 του mtDNA, υποδεικνύοντας ότι
είναι αποτέλεσμα του ίδιου εποικιστικού γεγονότος: της επανεγκατάστασης των πληθυσμών προς
τα ανατολικά της Ευρώπης από τους Ιβηρούς πρόσφυγες μετά την απόσυρση των παγετώνων
κατά την τελευταία παγετώδη εποχή. Είναι εκπληκτικό το γεγονός ότι ο γενετικός δείκτης M26

-60- 46

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture

(και σε μικρότερο βαθμό επίσης οι προαναφερθείσες απλοομάδες του mtDNA), τόσο κοινός στη
Σαρδηνία, είναι πολύ σπάνιος, αν όχι απών, στα εδάφη που διέσχισαν οι πρόγονοι των σημερινών
κατοίκων της Σαρδηνίας όπως η Νότια Γαλλία, η Βόρεια Ιταλία, η Τοσκάνη και η Κορσική. Μια
πιθανή ερμηνεία της παρατήρησης αυτής θα ήταν η λειτουργία της αρχής του ιδρυτή (founder
effect) στη Σαρδηνία, ή και η απώλεια της ποικιλομορφίας λόγω τυχαίας γενετικής παρέκκλισης
κάπου αλλού, αλλά ίσως και η απ’ ευθείας μετακίνηση ανθρώπων από την Iβηρία μέσω
θαλάσσης. Αν και η τελευταία αυτή υπόθεση εργασίας φαίνεται λιγότερο πιθανή λόγω της
απόστασης της Σαρδηνίας από την ηπειρωτική χώρα, λαμβάνεται ωστόσο υπόψη λόγω της
πιστοποιημένης παρουσίας του δείκτη M26 στο βόρειο τμήμα της Ιβηρικής χερσονήσου (κυρίως
στη Χώρα των Βάσκων). Η γεωγραφική και πολιτιστική απομόνωση αυτού του πληθυσμού
μπορεί να συνέβαλε στη διατήρηση υψηλών συχνοτήτων του συγκεκριμένου απλότυπου, ο
οποίος έχει σχεδόν εξαφανιστεί στην υπόλοιπη ήπειρο. Επιπλέον, η εντυπωσιακή διαφορά στην
κατανομή του απλότυπου M26 μεταξύ Σαρδηνίας και Κορσικής αποκλείει επίσης τη σημαντική
ροή γονιδίων από το ένα νησί στο άλλο.

Σχ. 2. Χάρτης της διασποράς των δύο κυρίων συνιστωσών του χρωμοσώματος Υ σε διάφορους ευρωπαϊκούς
πληθυσμούς (πάνω: πρώτη συνιστώσα, κάτω: δεύτερη συνιστώσα).

Πρόσφατα, η ερευνητική μας ομάδα συμμετείχε σε ένα έργο ανάλυσης των αλληλουχιών του
πλήρους γονιδιώματος σε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα 1.200 Σαρδηνών ανδρών με αποτέλεσμα
τον προσδιορισμό περίπου 20.000 πληροφοριακών SNPs σε ένα τμήμα του μορίου του

47 -61-

Paolo Francalacci, Daria Sanna, AntonelPlaaUosleoli Francalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

χρωμοσώματος Υ μήκους 23 Mεγαβάσεων (Mb). Τα περισσότερα από αυτά (τα SNPs)
εντοπίστηκαν για πρώτη φορά, αναβαθμίζοντας κατά μια τάξη μεγέθους τις γνώσεις μας για την
ποικιλομορφία του Υ. Η ανάλυσή τους επέτρεψε το σχεδιασμό ενός φυλογενετικού δέντρου με
άνευ προηγουμένου επίπεδο ευκρίνειας (Σχήμα 3).

Οι πιο κοινές απλοομάδες του χρωμοσώματος Υ πού ανιχνεύθηκαν στην Ευρώπη ήταν όλες
παρούσες στο δείγμα της Σαρδηνίας, εκτός της απλοομάδας Ν, η οποία που προέρχεται από τα
βορειότερα μέρη. Έτσι, με την ακριβέστερη αυτή ανάλυση εμβαθύνεται η συνεπαγωγή
(inference) που είχε γίνει με τη χρήση των λίγων προαναφερθέντων δεικτών

Η απλοομάδα A, ένα σύμπλεγμα γενεαλογικών γραμμών του χρωμοσώματος Υ κοινών στην υπο-
Σακχάρια περιοχή, βρέθηκε περίπου στο 0,5% των δειγμάτων (Cruciani et al. 2011). Αυτά τα
Σαρδηνικά δείγματα της απλοομάδας A, όπως εκείνα που ανιχνεύτηκαν σε προηγούμενες μελέτες
(Underhill et al. 2000; Francalacci et al. 2003), χαρακτηρίστηκαν από την παρουσία της
μετάλλαξης Μ13 (που αντιστοιχεί στην υπο - απλοομάδα A1b1b2b), η οποία θα μπορούσε να
υποδηλώνει ένα σχετικά πρόσφατο κοινό πρόγονο.

Η απλοομάδα E υπάρχει περίπου στο 10% των δειγμάτων, και κατανέμεται σε τέσσερις κύριους
κλάδους. Μερικά δείγματα ανήκουν στον υπο-απλότυπο Ε1a-M13, του οποίου η κατανομή
απαντάται κυρίως στη Δυτική Αφρική (Underhill et al. 2000). Η χαμηλή ποικιλομορφία αυτών
των δειγμάτων βρίσκεται σε συμφωνία με κάποιο πιθανό συμβάν - αποτέλεσμα της «αρχής του
ιδρυτή» κατά τους ιστορικούς χρόνους, όπως και στην προαναφερθείσα περίπτωση της υπο-
απλοομάδας A1b1b2b. Το υπόλοιπο των δειγμάτων σ’αυτή την απλοομάδα ανήκουν στον
ευρωπαϊκό κλάδο που χαρακτηρίζεται από την παρουσία του δείκτη M35. Η απλοομάδα αυτή,
κοινή στην Ανατολική Αφρική, είναι επίσης ευρέως διαδεδομένη στην περιοχή της Μεσογείου,
με αιχμή στα Βαλκάνια (Bosch et al. 2006).

Η σπάνια απλοομάδα F είναι παρούσα στο 0,5% των δειγμάτων της Σαρδηνίας. Η απλοομάδα
αυτή εμφανίζεται σποραδικά στην Ευρώπη (Karafet et al. 2008).

Ένα άλλο 10% των δειγμάτων ανήκε στην απλοομάδα G. Η απλοομάδα αυτή είναι περιορισμένη
στον Καύκασο, στην Εγγύς/Μέση Ανατολή, και στη Νότια Ευρώπη (Rootsi et al. 2012), αλλά και
στη Σαρδηνία (Contu et al. 2008). Ό κλάδος G2a2b-L91 που περιλαμβάνει την αλληλουχία που
βρέθηκε στον λεγόμενο Ötzi iceman (άνθρωπο των Πάγων) εντοπίζεται σε ικανό ποσοστό στη
Σαρδηνία, όπου ένας κοινός πρόγονος θα μπορούσε να είχε αφιχθεί κατά τη Νεολιθική εποχή
(Keller et al. 2012).

Η απλοομάδα Ι εμφανίζεται στην πλειοψηφία του δείγματός μας, φθάνοντας σε ποσοστό άνω του
40%, αλλά σχετικά λίγα άτομα ανήκουν σε κλάδους Ι διαφορετικούς από τους I2a1a-M26. Στην
πραγματικότητα, ο κλάδος Ι1-M253, ο οποίος, εξαιτίας της μεγάλης συχνότητας εμφάνισής του
στη Σκανδιναβία, συνδέεται με τη διάχυση σκανδιναβικών γενετικών χαρακτηριστικών (Rootsi et
al. 2004) εκπροσωπείται εδώ από δύο μόνο άτομα. Λιγότερο σπάνιες είναι οι υπο–απλοομάδες
I2c και I2a2a που συσχετίζονται με την εξάπλωση των γερμανικών λαών (Rootsi et al. 2004). Η
υπο-απλοομάδα I2a1 που χαρακτηρίζεται από μετάλλαξη P37.2, χαρακτηριστική των
Βαλκανικών πληθυσμών (Battaglia et al. 2008), είναι παρούσα στα δείγματα μας σε δύο κλάδους:
τον I2a1b, σπανιότατο στη Δυτική Ευρώπη (Battaglia et al. 2008), και τον I2a1a, από τούς πιο
κοινούς στο σύνολο των δεδομένων μας φθάνοντας το ποσοστό του 39%. Σύμφωνα με
προηγούμενες παρατηρήσεις, η απλοομάδα αυτή είναι η πιο κοινή στη Σαρδηνία, ενώ απουσιάζει
τελείως ή είναι σπάνια αλλού (Semino et al. 2000; Francalacci et al. 2003). Η σπάνια αλλά
σταθερή παρουσία του δείκτη M26 στην Ιβηρική χερσόνησο, με σημαντική εμφάνιση στους
Βάσκους (Alonso et al. 2005), φαίνεται να σηματοδοτεί καταφύγια πληθυσμών κατά τη διάρκεια
του τελευταίου παγετώνα, που θα μπορούσαν να είναι οι άμεσοι προγόνοι των απλοτύπων M26
της Σαρδηνίας.

Η απλοομάδα J, ένα σύμπλεγμα από γενεαλογικές γραμμές με υποτιθέμενη Νοτιοδυτική ασιατική
καταγωγή και διάδοση (Cinnioğlu et al. 2004), και με σημαντική παρουσία στην περιοχή της
Μεσογείου, αντιπροσωπεύει εδώ περίπου το 13% των δειγμάτων. Οι δύο παρόμιοι κλάδοι J1 και

-62- 48

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture

J2, που εκπροσωπούνται στο δείγμα της Σαρδηνίας, έχουν ανόμοια κατανομή, πιθανόν
αντανακλώντας διαφορετικούς δρόμους εγκατάστασης.
Ό J1-M267 παρουσιάζει κορυφές συχνότητας στην Ανατολία και στη Βόρεια Αφρική και
συνδέεται στενά με την εξάπλωση των αραβικών πληθυσμών. Αντίθετα, ο κλάδος J2 παρουσιάζει
υψηλότερες συχνότητες στην Ανατολία και στη Μεσοποταμία ενώ μειώνεται προς τα Δυτικά
(Semino et al. 2004).

Σχ.3. Φυλογενετικό δέντρο του χρωμοσώματος-Υ των 1200 Σαρδηνών. Οι κυριότερες ευρωπαϊκές
απλοομάδες αντιπροσωπεύονται από αλφαβητικά γράμματα. Τα χρονικά σημεία των πιο πρόσφατων
προγόνων (Time of Most Recent Ancestors –TMRCA) στους κόμβους εκφράζονται σε χιλιάδες χρόνια. Ο
κόμβος που χρησιμοποιείται για βαθμονόμηση, υποδεικνύεται με αστερίσκο.

Η σούπερ-απλοομάδα K, διαιρείται στους κλάδους R και LT. Η απλοομάδα T (2,5% των
δειγμάτων), που ορίζεται από τη μετάλλαξη M70, εντοπίζεται σε ποικίλες συχνότητες σε
ολόκληρη τη Δυτική Ασία, την Αφρική και την Ευρώπη ενώ η απλοομάδα L (0,5%) είναι
διάσπαρτη σε χαμηλές συχνότητες σε όλη την Ευρώπη μέχρι την Ινδική Υποήπειρο όπου φτάνει
στις υψηλότερες συχνότητες της.
Η απλοομάδα R είναι η δεύτερη μεγαλύτερη στη Σαρδηνία, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 20%
των δειγμάτων. Αυτό συμβαίνει κυρίως στον Δυτικοευρωπαϊκό κλάδο που ορίζεται από τον
δείκτη M269 όμως άλλες τρεις υπο-απλοομάδες (R2a1-L295, R1a1a-M417 και R1b1c-V88)
επίσης εκπροσωπούνται αρκετά. Η υπο-απλοομάδα R2a1-L295 (δείγματα υπ. αρ. 972-981) είναι
κυρίως παρούσα στην Ινδική Υποήπειρο (Sengupta et al. 2006) αλλά και στην Ευρώπη στούς
Τσιγγάνους, ινδικής καταγωγής (Wells et al. 2001). Μερικά άτομα της ομάδας R2 είχαν ήδη
βρεθεί προηγουμένως στην Κορσική (Francalacci et al. 2003) και στη Σαρδηνία (Passarino et al.

49 -63-

Paolo Francalacci, Daria Sanna, AntonelPlaaUosleoli Francalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

2001). Ό υποκλάδος R1a-M17 με περίπου 1% των δειγμάτων στη Σαρδηνία έχει μέγιστη
εμφάνιση στην Ανατολική Ευρώπη με συχνότητες πάνω από 50% μεταξύ των Σλάβων και έχει
συσχετιστεί με την εξάπλωση των ιππέων της εποχής του Χαλκού, που συνδέεται με τον
πολιτισμό του Andronovo από την στέππα της Κεντρικής Ασίας (Keyser et al. 2009), αλλά και με
τη διάδοση μιας πρωτο-ινδοευρωπαϊκής γλώσσας (Underhill et al. 2009). Η πιο κοινή απλοομάδα
R1b1a2-M269 της Δυτικής Ευρώπης, περίπου το 15% των χρωμοσωμάτων Υ της Σαρδηνίας,
παρουσιάζει σταδιακή ύφεση συχνότητας στην Ευρώπη με υψηλότερα ποσοστά στη
Βορειοδυτική Ευρώπη (Rosser et al. 2000).

Το φυλογενετικό δένδρο που λαμβάνεται από την ανάλυση των αλληλουχιών του πλήρους
γονιδιώματος του χρωμοσώματος Υ μπορεί να χρησιμοποιείται σαν ένα μοριακό ρολόι εάν
προσδιοριστεί ένα αξιόπιστο σημείο βαθμονόμησης. Ο εποικισμός του νησιού προσφέρει μια
μεγάλη ευκαιρία για την ποσοτικοποίηση της ποικιλομορφίας που παράγεται μετά από έναν
εποικισμό, ενώ ένας σημαντικός αριθμός γενετικών γενεαλογιών ιδιαίτερος για το συγκεκριμένο
νησί, προσφέρει ένα εξαιρετικό κριτήριο (σημείο) βαθμονόμησης.

Συγκρίνοντας τα δεδομένα μας με άλλα που προέρχονται από δημόσια διαθέσιμη βάση
δεδομένων, τα οποία ελήφθησαν με παρόμοια τεχνολογία πλήρους αλληλούχισης από το
Πρόγραμμα των 1000 γονιδιωμάτων (1000 Genomes Project- Complete Genomes Project) και
συμπεριλαμβάνουν χρωμοσώματα Υ από διάφορους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς (μεταξύ άλλων
και των Ιταλών της ηπειρωτικής χώρας), κατέστη δυνατό να αποσαφηνιστεί ποιο μέρος της
ποικιλομορφίας είναι κοινό με άλλους πληθυσμούς και ποιο διαφέρει και κατά συνέπεια θα
μπορούσε να έχει δημιουργηθεί μετά την εξάπλωση των ανθρώπων στη Σαρδηνία. Ορισμένα
πρόσθετα χρωμοσώματα Υ που προέρχονται από επιλεγμένα άτομα εντασσόμενα σε μία
συγκεκριμένη απλοομάδα και προέρχονται από πληθυσμούς που μπορεί να έχουν συμβάλει στον
εποικισμό της Σαρδηνίας (συμπεριλαμβανομένων των Κορσικανών, Tοσκανών, Βορείων Ιταλών
και Βορείων Ιβήρων) συμπεριλήφθηκαν επίσης στην ανάλυση για να σηματοδοτήσουν την
αρχική εξάπλωση της γενετικής ποικιλομορφίας της Σαρδηνίας, ενδεικτική μιας πληθυσμιακής
εξάπλωσης. Ειδικότερα, ένας Βάσκος που ανήκε στην απλοομάδα I2a1a-M26 βρίσκεται στο
φυλογενετικό δέντρο στη βάση της ιδιαίτερης ποικιλομορφίας της Σαρδηνίας και είναι πιθανό να
αντιπροσωπεύει την προγονική κατάσταση της απλοομάδας των ιδρυτών που εγκαταστάθηκαν
στο νησί στις μεταπαγετώδεις περιόδους.

Η πρώτη άμεση απόδειξη των σύγχρονων ανθρώπινων οικισμών στο νησί βασισμένη στη
χρονολόγηση με 14C που πραγματοποιήθηκε σε απολιθωμένα οστά, ανάγεται στην Προ-νεολιθική
εποχή και ανακαλύφθηκε στο Σπήλαιο του Κορμπέντου (Corbeddu Cave) στην Κεντρική
Σαρδηνία. Οι διαφορές στη μορφολογία μεταξύ των Σαρδηνικών ανθρώπινων απολιθωμάτων και
του σύγχρονου Homo sapiens από την ηπειρωτική χώρα υποδεικνύουν την ανάπτυξη ενός
ενδημικού Πλειστόκαινου πολιτισμού, προσαρμοσμένου στις περιορισμένες συνθήκες του νησιού
και στο κυνήγι των ελαφιών (Spoor and Sondaar, 1986). Μάρτυρας της ανθρώπινης παρουσίας
προς το τέλος της Παλαιολιθικής εποχής είναι επίσης ένα αγαλματίδιο από βασάλτη (ύψους
περίπου 14 εκατοστών), γνωστό ως "Η Αφροδίτη του Μακομέρ", μία από τις πολύτιμες φιγούρες
Mater Mediterranea, που ανακαλύφθηκε σε μια φυσική σπηλιά (Klein Hofmeijer et al. 1987).

Ο τοπικός πληθυσμός αυξήθηκε κατά την Νεολιθική εποχή, πριν περίπου 8.000 με 4.700 χρόνια.
Σ’αυτή την περίοδο υπήρξαν συχνές επαφές μεταξύ των Σαρδινών και άλλων πληθυσμών κυρίως
λόγω των πλουσίων κοιτασμάτων οψιδιανού, (είδος ηφαιστειακού γυαλιού άφθονου στο νησί),
και λόγω του μεγαλιθικού πολιτισμού παρόμοιου με άλλους μεγαλιθικούς πολιτισμούς της
δυτικής Ευρώπης. Κάποια επιρροή από την Ιβηρική χερσόνησο είναι εμφανής ιδιαίτερα στη
Σαρδηνία.

Αρχαιολογικά ευρήματα σε διάφορες περιοχές του νησιού δείχνουν ότι, πριν από 5000 περίπου
χρόνια, διάφοροι πολιτισμοί συνυπήρχαν στη Σαρδηνία. Μεταξύ αυτών συμπεριλαμβάνεται ο
πολιτισμός του "Bell Beaker" κοινός στη Δυτική Μεσόγειο στην εποχή του χαλκού (3500-2500
π.Χ. στην Ευρώπη), του οποίου υπολείμματα αποτελούν οι περίπου 2000 λαξευτοί τάφοι
αυτόχθονης προέλευσης, γνωστοί στους ντόπιους ως Domus de Janas ("Σπίτια μαγισσών"),

-64- 50

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture

καθώς και ένας ανατολίτικης προέλευσης πολιτισμός ίσως Κυκλαδικός ή Μινωικός (III-II
χιλιετία π.Χ.).

Ένας σημαντικός αυτόχθων πολιτισμός, που χαρακτηρίζεται από τα Nuraghe ("Οχυρωματικοί
πύργοι"), αναπτύχθηκε στην Εποχή του Χαλκού περίπου από το 3500 π.Χ. μέχρι το 2400 π.Χ.,
όταν ο τοπικός πληθυσμός υπολογίζεται ότι έφτασε περίπου τους 200.000 - 300.000 κατοίκους
(Lilliu 1982).

Σε αυτό το πλαίσιο, η πρώτη σημαντική ένδειξη της δημογραφικής επέκτασης είναι η αρχή της
Νεολιθικής εποχής. Ως εκ τούτου η ιδιαίτερη γενετική ποικιλότητα της Σαρδηνίας πιθανόν να
έχει παραχθεί σε διάστημα περίπου 8.000 χρόνων. Βαθμονομώντας το γενετικό δενδρόγραμμα με
το υποτιθέμενο αυτό χρονικό εύρος, μπορούμε να υπολογίσουμε το χρόνο του πιο πρόσφατου
κοινού προγόνου (TMRCA Time of Most Recent Ancestor) όλων των δειγμάτων. Λαμβάνοντας
υπόψη ότι ο πληθυσμός της Σαρδηνίας περιλαμβάνει δείγματα που ανήκουν στον αρχαιότερο
κλάδο του ανθρώπινου φυλογενετικού δέντρου (απλοομάδα A), ως επί το πλείστον διαδεδομένα
στην Υποσαχάρια Αφρική, ο κοινός πρόγονος όλων των δειγμάτων της Σαρδηνίας πλησιάζει
εκείνον της ανθρωπότητας. Το μέσο μήκος των επί μέρους διακλαδώσεων κάθε ξεχωριστού
ατόμου του δείγματος είναι μεγαλύτερο από το 20πλάσιο της χαρακτηριστικής ποικιλότητας της
Σαρδηνίας, εύρημα που υποδεικνύει ότι ο χρόνος σύγκλισης (στον πλέον πρόσφατο πρόγονο)
αντιστοιχεί σε περίπου 180.000 έτη. Η ημερομηνία αυτή είναι η μεγαλύτερη για το χρωμόσωμα Υ
από ό, τι είχε αναφερθεί προηγούμενα, εφόσον ο TMRCA για την ανθρωπότητα έχει αδρά
υπολογιστεί περίπου στα 100 -110.000 χρόνια. Ωστόσο, οι χρονικές εκτιμήσεις μας αντιστοιχούν
με την ηλικία 200.000 χρόνων του mtDNA και συμπίπτουν μ’εκείνες που επανεξετάζουν το
ρυθμό μετάλλαξης για το ανθρώπινο μοριακό ρολόι (Scally and Durbin, 2012), όπως συζητήθηκε
σε πρόσφατη μελέτη (Gibbons 2012).

Συμπεράσματα

Η διαμόρφωση ενός πληθυσμού ή ενός πολιτισμού μπορεί να γίνει πλήρως κατανοητή μόνο με
την ολιστική θεώρηση γενετικών, γλωσσικών, ιστορικών, αρχαιολογικών και ανθρωπολογικών
δεδομένων. Υπό το πρίσμα αυτό, η ταχεία διαφοροποίηση του χρωμοσώματος Υ μεταξύ των
πληθυσμών, και η ικανότητά του να διατηρεί στοιχεία της κοινής καταγωγής των προϊστορικών
χρονικών περιόδων, το αναδεικνύουν σαν ένα μοναδικό εργαλείο για τη διερεύνηση των
γεγονότων της μετανάστευσης και του βαθμού σύμμειξης με προϋπάρχοντες πληθυσμούς,
βελτιώνοντας τη γνώση μας για τις γενετικές σχέσεις του πληθυσμού της Σαρδηνίας στο
μεσογειακό πλαίσιο. Αρχαίες γενετικές σχέσεις με την Βόρεια Ιβηρική περιοχή επιβεβαιώθηκαν
επίσης στην ανάλυση μας. Το φυλογενετικό δέντρο που προκύπτει από την ανάλυση αυτή, και η
χρονολόγηση των κλάδων του, προβλέπεται να τελειοποιηθεί σταδιακά με την ανάλυση όλο και
περισσότερων δειγμάτων.

Εν κατακλείδι, η πλήρης αλληλούχηση του μη ανασυνδυαζόμενου τμήματος του Υ
χρωμοσώματος σ’αυτόν τον ιδρυτικό πληθυσμό, σε συνδυασμό με μια συνακόλουθη ιεραρχική
προσέγγιση για την ανίχνευση διαλληλικών δεικτών οδηγεί σε σημαντικά πληρέστερη
πληροφόρηση σχετικά με τη μοριακή εξέλιξη του ανθρώπινου χρωμοσώματος Υ. Μια συγκριτική
μελέτη με την ανάλυση των επωνύμων, με το πλεονέκτημα ότι οι γενετικοί δείκτες είναι
μονοφυλετικοί και καλύπτουν ένα χρονικό διάστημα που εκτείνεται πίσω στην παλαιολιθική
εποχή, θα βελτίωνε επίσης τη γνώση μας για τη σύγχρονη πληθυσμιακή εικόνα της Σαρδηνίας, τη
διαχρονική εξέλιξή της, αλλά και θα αποτελούσε ένα ολοκληρωμένο πρότυπο της εξέλιξης των
νησιωτικών πληθυσμών στο ευρύτερο οικοσύστημά τους.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε θερμά τη Μαρία Χριστίνα Τουσίδου για τη μετάφραση του άρθρου. Η έρευνα
αυτή υποστηρίχθηκε από την Αυτόνομη Περιφέρεια της Σαρδηνίας (περιφερειακός νόμος αριθ.
7/2009) CRP2 επιχορήγηση PF-597.

51 -65-

Paolo Francalacci, Daria Sanna, AntonePllaaUolsoeliFrancalacci, Daria Sanna, Antonella Useli

Αναφορές

1000 Genomes Project Consortium 2010. A map of human genome variation from population-scale
sequencing. Nature 467: 1061-1073.

Alonso S, Flores C, Cabrera V et al. 2005. The place of the Basques in the European Y-chromosome
diversity landscape. European Journal of Human Genetics 13: 1293-1302.

Battaglia V, Fornarino S, Al-zahery1 N et al. 2008. Y-chromosomal evidence of the cultural diffusion of
agriculture in Southeast Europe. European Journal of Human Genetics 17: 820-830.

Bosch E, Calafell F, González-neira A et al. 2006. Paternal and maternal lineages in the Balkans show a
homogeneous landscape over linguistic barriers, except for the isolated Aromuns. Annals of Human
Genetics 70: 459-487.

Bosch E, Calafell F, Comas D et al 2001. High-Resolution Analysis of Human Y-Chromosome Variation
Shows a Sharp Discontinuity and Limited Gene Flow between Northwestern Africa and the Iberian
Peninsula. American Journal of Human Genetics 68: 1019-1029.

Cann RL et al. 1987. Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325: 31-36.
Cinnioğlu C, King RJ, Kivisild T et al. 2004. Excavating Y-chromosome haplotype strata in Anatolia.

Human Genetics 114: 127-148.
Contu D, Morelli L, Santoni F et al. 2008. Y-Chromosome based evidence for pre-Neolithic origin of the

genetically homogeneous but diverse Sardinian population, inference for association scans. PLoS
ONE 3: e1430 doi,101371/ journalpone 0001430.
Cruciani F, Trombetta B, Massaia A et al. 2011. A revised root for the human Y chromosomal phylogenetic
tree - the origin of patrilineal diversity in Africa. American Journal of Human Genetics 88: 814-818.
Francalacci P, Morelli L, Underhill PA et al. 2003. Peopling of three Mediterranean islands (Corsica -
Sardinia and Sicily) inferred by Y-chromosome biallelic variability. American Journal of Physical
Anthropology 121: 270-279.
Francalacci P, Morelli L, Angius A et al. 2013. Low pass DNA sequencing of 1,200 Sardinians reconstructs
European Y chromosome phylogeny. Science 341: 565-569.
Gibbons A 2012. Turning back the clock: slowing the pace of prehistory. Science 338: 189-191.
Hewitt G 2000. The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature 405: 907-913.
Jobling MA and Tyler-Smith C 1995. Fathers and sons: the Y chromosome and human evolution. Trends in
Genetics 11: 449-456.
Karafet TM, Mendez FL, Meilerman MB et al. 2008. New binary polymorphisms reshape and increase
resolution of the human Y chromosomal haplogroup tree. Genome Research 18: 830-838.
Keller A, Graefen A, Ball M et al. 2012. New insights into the Tyrolean Iceman's origin and phenotype as
inferred by whole-genome sequencing. Nature Communications 3: 698, doi, 101038/ncomms1701.
Keyser C, Bouakaze C, Crubézy E et al. 2009. Ancient DNA provides new insights into the history of south
Siberian Kurgan people. Human Genetics 126: 395-410.
Klein hofmeijer G, Sondaar PY, Alderliesten C et al. 1987. Indications of Pleistocene man on Sardinia.
Nuclear Instruments and Methods in Physics Research 29: 166-168.
Li JZ, Absher DM, Tang H et al. 2008. Worldwide human relationships inferred from genome-wide
patterns of variation. Science 319: 1100-1104.
Lilliu G 1982. La civiltà nuragica. Delfino Editore, Sassari.
Novembre J, Johnson T, Bryc K et al. 2008. Genes mirror geography within Europe. Nature 456: 98-101.
Pala M, Achilli A, Olivieri A et al. 2009. Mitochondrial haplogroup U5b3: a distant echo of the
Epipaleolithic in Italy and the legacy of the early Sardinians. American Journal of Human Genetics
84: 814-821.
Passarino G, Underhill PA, Cavalli-Sforza LL et al. 2001. Y chromosome binary markers to study the high
prevalence of males in Sardinian centenarians and the genetic structure of the Sardinian population.
Human Heredity 52: 136-139.
Quintana-Murci L, Veitia R, Fellous M et al. 2003. Genetic structure of Mediterranean populations
revealed by Y-chromosome haplotype analysis. American Journal of Physical Anthropology 121:
157–171.
Rootsi S, Myres NM, Lin AA et al. 2012. Distinguishing the co-ancestries of haplogroup G Y-
chromosomes in the populations of Europe and the Caucasus. European Journal of Human Genetics
doi - 101038/ejhg201286.
Rootsi S, Kivisild T, Benuzzi G et al. 2004. Phylogeography of Y-chromosome haplogroup I reveals
distinct domains of prehistoric gene flow in Europe. American Journal of Human Genetics 75: 128-
137.

-66- 52

The genetic origin of Sardinians: a new pictTuhreegenetic origin of Sardinians: a new picture
Rosser ZH, Zerjal T, Hurles ME et al. 2000. Y-chromosomal diversity in Europe is clinal and influenced

primarily by geography, rather than by language. American Journal of Human Genetics 67: 1526-
15437.
Scally A. and Durbin R 2012. Revising the human mutation rate: implications for understanding human
evolution. Nature Review Genetics 13: 745-753.
Semino O, Magri C, Benuzzi G et al. 2004. Origin, diffusion, and differentiation of Y-chromosome
haplogroups E and J, inferences on the neolithization of Europe and later migratory events in the
Mediterranean area. American Journal of Human Genetics 74: 1023-1034
Semino O, Passarino G, Oefner PJ et al. 2000. The genetic legacy of Palaeolithic Homo sapiens sapiens in
extant Europeans, a Y-chromosome perspective. Science 290: 1155-1159.
Sengupta S, Zhivotovsky LA, King RJ et al. 2006. Polarity and temporality of high-resolution Y-
chromosome distributions in India identify both indigenous and exogenous expansions and reveal
minor genetic influence of Central Asian pastoralists. American Journal of Human Genetics 78: 202-
221.
Spoor CF. and Sondaar PY 1986. Human fossils from the endemic island fauna of Sardinia. Journal
of Human Evolution 15: 399-408.
Tian C, Plenge RM, Ransom M et al. 2008. Analysis and Application of European Genetic Substructure
Using 300 K SNP Information. PLoS Genetics 4: e4 doi -101371/ journalpgen0040004.
Torroni A, Achilli A, Macaulay V et al. 2006. Harvesting the fruit of the human mtDNA tree. Trends in
Genetics 22: 339-345.
Underhill PA, Shen P, Lin AA et al. Y 2000. Chromosome variation and the History of human populations.
Nature Genetics 26: 358-361.
Underhill PA, Myres NM, Rootsi S et al. 2010. Separating the post-Glacial coancestry of European and
Asian Y chromosomes within haplogroup R1a. European Journal of Human Genetics 4: 479-84.
Wei W, Ayub Q, Chen Y et al. 2012. A calibrated human Y-chromosomal phylogeny based on
resequencing. Genome Research 23: 388-395.
Wells RS, Yuldasheva N, Ruzibakiev R et al. 2001. The Eurasian heartland - a continental perspective on
Y-chromosome diversity. Proceedongs of the National Academy of Science USA 98: 10244-10249.
Πόροι Web
ISOGG http://www.isogg.org/
1000 Genomes http://www.1000genomes.org
Complete Genomics http://www.completegenomics.com/

53 -67-



Autosomal geneAtuitcosmomaarlkgeernseti(cSmTaRrkse)rsin(STaRnst)hirnoapntohlroopgoilcoagilcarlerseeseaarrcchh..AAcacseassteudsytuindthyeiPnretfhecetuPrereoffeRcotduoprie(TohfraRcoe,dGorpeeice)
(Thrace, Greece)

Αυτοσωμικοί γενετικοί δείκτες (STRs) στην ανθρωπολογική έρευνα.

Μια περίπτωση μελέτης στο Νομό Ροδόπης (Θράκη-Ελλάδα)

Κάλλη Σιμιτοπούλου-Κοτζαμάνη, PhD

Autosomal genetic markers (STRs) in anthropological research.

A case study in the Prefecture of Rodopi (Thrace, Greece)

Abstract

Microsatellites (STRs = Short Tandem Repeats), are highly polymorphic genetic markers with
extended use in forencic research (especially in human identification) during the last 20 years. In
parallel they are extremely useful markers in Anthropology as they provide information related to
the existence of population structure, allowing comparisons within and between populations.
Due to historical circumstances and successive migrations in the beginning of the 20th century, a
variety of population groups of different religions, languages and cultural traditions coexist in the
area of Thrace. From this point of view the Prefecture of Rodopi is the ideal field for such
comparisons. An analysis of a set of STR markers was applied in order to investigate the
possibility of existence of distinct gene pools caused by the long-lasting mating barriers among
the populations, which had been imposed by the cultural differences.

The data analysis provides strong indications of minimum differentiation between the Christians’
and Muslims’ gene pools, in spite of the long lasting genetic isolation of the two population
groups. This finding supports the aspect that the cultural barriers (mainly religion and language),
as supervening, evolutionary short term characteristics, although they create mating barriers, they
have no influence to the biological profile of the populations in the time depth of this study. Yet, a
comparison with similar data from the Pomacs’ population (Muslims living in the mountainous
Rodopi area) confirms that the long lasting spatial isolation constitutes by far more important
factor of genetic differentiation than the cultural barriers.

Finally, the presence of unique per population group alleles reflects the recent migrations of the
Greek populations from their homelands (Asia Minor, Eastern Thrace, Eastern Romylia, Pontos)
and confirms the locality of the Muslims, who, without moving from their home land for
centuries, probably changed their religion during the islamizations that took place in the Ottoman
period.

Key Words: STRs, Christians, Muslims, Rodopi, Thrace, population structure

Περίληψη

Οι μικροδορυφόροι (STRs = Short Tandem Repeats) αποτελούν μια κατηγορία γενετικών
δεικτών υψηλής πολυμορφικότητας και ως εκ τούτου βρίσκουν εφαρμογή στην ιατροδικαστική
έρευνα (ιδιαίτερα στην ταυτοποίηση προσώπων) εδώ και μία εικοσαετία. Παράλληλα είναι
εξαιρετικά χρήσιμοι δείκτες στην Ανθρωπολογία καθώς παρέχουν πληροφορίες σχετικές με την
πληθυσμιακή δομή, επιτρέποντας συγκρίσεις εντός και μεταξύ πληθυσμών. Δεδομένης της
πληθυσμιακής ποικιλομορφίας στη Θράκη, όπου, λόγω ιστορικών συγκυριών και διαδοχικών
μεταναστεύσεων στις αρχές του 20ου αιώνα συνοικούν ομάδες διαφορετικών θρησκειών,
γλωσσών και παραδόσεων, o Νομός Ροδόπης συνιστά ιδανικό πεδίο τέτοιων συγκρίσεων. Με την
ανάλυση μιάς ομάδας γενετικών δεικτών STRs διερευνήθηκε η δυνατότητα διαμόρφωσης

55 -69-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

διακριτών γενετικών δεξαμενών, λόγω της ύπαρξης μακροχρόνιων γενετικών φραγμών οι οποίοι
επεβλήθησαν από τις πολιτισμικές διαφορές.

Η ανάλυση των δεδομένων δίνει ισχυρές ενδείξεις ελάχιστης διαφοροποίησης των γενετικών
δεξαμενών των Χριστιανών και Μουσουλμάνων του Ν. Ροδόπης κατά τη διάρκεια των ιστορικών
χρόνων παρά τη μακρόχρονη γενετική απομόνωση των δύο πληθυσμών. Το εύρημα επιβεβαιώνει
ότι οι πολιτισμικοί φραγμοί (κυρίως θρησκεία και γλώσσα), ως επιγενόμενα, εξελικτικώς
βραχύβια χαρακτηριστικά, παρά το γεγονός ότι δημιουργούν φραγμούς στις συζεύξεις, δεν
επηρεάζουν σημαντικά τη βιολογική εικόνα των πληθυσμών στο χρονικό βάθος της μελέτης
αυτής. Επίσης από τη σύγκριση των ευρημάτων με αντίστοιχα αφορώντα τον πληθυσμό των
Πομάκων (μουσουλμάνων του ορεινού όγκου της οροσειράς της Ροδόπης), επιβεβαιώνεται ότι η
μακρόχρονη γεωγραφική απομόνωση συνιστά πολύ σημαντικότερο παράγοντα γενετικής
διαφοροποίησης από τους πολιτισμικούς φραγμούς. Τέλος η ανίχνευση μοναδικών ανά
πληθυσμιακή ομάδα αλληλομόρφων, αντικατοπτρίζει τις πρόσφατες μεταναστεύσεις των
ελληνικών πληθυσμών από τις προαιώνιες εστίες τους (κυρίως Μικρά Ασία, Ανατολική Θράκη,
Ανατολική Ρωμυλία, Πόντος), αλλά και πιστοποιεί την εντοπιότητα των μουσουλμανικών
πληθυσμών, επιβεβαιώνοντας τους ιστορικά καταγεγραμμένους εξισλαμισμούς κατά την
Οθωμανική περίοδο.

Λέξεις κλειδιά: STRs πολιτισμικοί φραγμοί γενετικές δεξαμενές, πληυσμιακή δομή

Εικ. 1. Μετακινήσεις πληθυσμών (σε χιλιάδες εκτοπισθέντων ατόμων) μετά τη Συνθήκη της Λωζάννης. Πηγή:
http://www.migrationeducation.org/programme.0.html

Εισαγωγή-Η πληθυσμιακή σύνθεση του Ν. Ροδόπης
Το σημερινό σύνθετο πληθυσμιακό τοπίο στο Ν. Ροδόπης (όπως και ολόκληρης της Θράκης)
διαμορφώνεται στις αρχές του 20ου αιώνα, όταν, οι μεταναστεύσεις πληθυσμών εκατέρωθεν των
υπό διαμόρφωση συνόρων των ομόρων χωρών, αποτελούσαν συνήθη φαινόμενα, καθώς η
περιοχή ήταν θέατρο πολεμικών επιχειρήσεων και διεθνών ανακατατάξεων. (εικ.1) Η συνθήκη
της Λωζάνης (Ιούλιος 1923) απετέλεσε το οριστικό ρυθμιστικό πλαίσιο, βάσει του οποίου
διεξήχθη συντεταγμένη ανταλλαγή πληθυσμών προκειμένου να οριστικοποιηθούν τα σύνορα
μεταξύ των ομόρων χωρών. Σύμφωνα με αυτήν οι Μουσουλμάνοι που ήταν εγκατεστημένοι στη

-70- 56

Autosomal geneAtuictosmomaarlkgeernset(icSmTaRrske)risn(SaTnRst)hirnoapnothlroopgoilcoagilcralerseesaearrcchh..AAcacsae ssteudsytuindtyheinPrethfeectuPrereoffeRcotduorpei (oThfrRacoed, Gorpeiece)
(Thrace, Greece)

Θράκη, εξαιρέθηκαν από την ανταλλαγή, χαρακτηριζόμενοι ως μή ανταλλάξιμοι, ενώ αντίστοιχα
παρέμεινε στην Κωνσταντινούπολη ισάριθμος πληθυσμός Ελλήνων.

Έκτοτε, στην περιοχή συνοικούν πληθυσμιακές ομάδες διαφόρων γεωγραφικών προελεύσεων,
διακριτές αδρά ως πρός το θρήσκευμα σε δύο κατηγορίες, ήτοι μουσουλμάνοι και χριστιανοί, οι
οποίοι διαμένουν σε πόλεις, χωριά και οικισμούς με πληθυσμούς είτε αμιγώς χριστιανικούς ή
αμιγώς μουσουλμανικούς ή και μικτούς. (εικ.2). Χριστιανοί και Μουσουλμάνοι τελούν υπό
καθεστός πλήρους γενετικής απομόνωσης.

Εικ.2. Πόλεις και οικισμοί της Θράκης που κατοικούνται απο Χριστιανούς, Τουρκόφωνους, Πομάκους ή μικτά. Πηγή: -71-
Εμμανουήλ Σαρίδης, http://www.berlin-athen.

Ωστόσο, όπως είναι βιωματικά γνωστό στους κατοίκους της περιοχής αλλά και όπως
πιστοποιείται από άλλες πηγές (ιστορικές, δημογραφικές κλπ.) η αδρή κατηγοριοποίηση σε
χριστιανούς και μουσουλμάνους υπερκαλύπτει την ύπαρξη υποπληθυσμών μικρότερης κλίμακας.
Στο σύνολο των Μουσουλμάνων εντάσσονται οι τουρκόφωνοι των πεδινών περιοχών, οι
Πομάκοι, κάτοικοι του ορεινού όγκου της Ροδόπης με δική τους γλώσσα, (αμφότεροι
εγκατεστημένοι παλαιόθεν στην περιοχή και άρα θεωρούμενοι γηγενείς) και οι Ρωμά
(Tσιγγάνοι), παλαιότερα ομιλούντες τα ρωμανί και σήμερα σε μεγάλο βαθμό τουρκόφωνοι. Ο
χριστιανικός πληθυσμός απαρτίζεται από εντόπιους Έλληνες οι οποίοι διέμεναν στη Θράκη πρό
των αρχών του 20ου αιώνα, (αρκετοί εκ των οποίων έχουν απώτερη καταγωγή από την Ήπειρο)
και πρόσφυγες καταγόμενους από την Ανατολική Θράκη, τα μικρασιατικά παράλια, την
Καππαδοκία, τον Πόντο (περιοχές οι οποίες ανήκουν σήμερα στην Τουρκία) και την ανατολική
Ρωμυλία (σήμερα περιοχή της Βουλγαρίας). Υπάρχουν επίσης Σαρακατσάνοι (νομάδες μέχρι τη
δεκαετία του 1960), και χριστιανοί ελληνόφωνοι Τσιγγάνοι. Το πληθυσμιακό αυτό μωσαϊκό
εμπλουτίζεται από μία ολιγάριθμη αρμενική κοινότητα, καθώς και πρόσφατους (μετά τη δεκαετία
του 1990) ελληνικής καταγωγής μετανάστες από διάφορες χώρες της πρώην Σοβιετικής Ένωσης,
ωστόσο οι πληθυσμοί αυτοί δεν περιλαμβάνονται στην παρούσα έρευνα.

Τα πρότυπα γαμηλιότητας των υποπληθυσμών αυτών διέφεραν μέχρι πρόσφατα. Στη
μουσουλμανική κοινωνία η κοινωνική ιεράρχηση (κατά σειρά κοινωνικού κύρους
τουρκόφωνοι>πομάκοι>ρομά) και η γεωγραφική απομόνωση, συνιστούσαν απαγορευτικούς
φραγμούς συζεύξεων οι οποίοι μόλις πρόσφατα αρχίζουν να αίρονται. Αντίστοιχα, οι
πολιτισμικές διαφορές (κυρίως παραδόσεις, κοινωνικές συμπεριφορές) των χριστιανικών
υποπληθυσμών, οριζόμενες από τη γεωγραφική προέλευση των προσφύγων, απέτρεπαν αρχικά
τις παμμεικτικές συμπεριφορές μεταξύ των μελών τους, αν και η κοινή θρησκεία, γλώσσα και
εθνική συνείδηση πολύ σύντομα λειτούργησαν συνεκτικά προωθώντας τους «μικτούς» γάμους

57

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

μεταξύ προσφύγων διαφορετικών προελεύσεων. Σκοπός της μελέτης είναι η αδρή αποτύπωση
του βιολογικού υποβάθρου των συνοικουσών πληθυσμιακών ομάδων-υποομάδων και η
διερεύνηση της ύπαρξης βιολογικής δομής, λόγω γενετικής απομόνωσης.

Υλικά και μέθοδοι

Η έρευνα βασίζεται σε τυχαίο δείγμα (ολικό αίμα) συνολικού πληθυσμού 390 ατόμων, το οποίο
καλύπτει γεωγραφικά όλο το Ν. Ροδόπης και αποτελείται από 195 Χριστιανούς, 166
Μουσουλμάνους των πεδινών περιοχών και 29 Πομάκους (μουσουλμάνους της ορεινής
Ροδόπης). Η ανάλυση αφορά 15 αυτοσωμικά STRs και συγκεκριμένα τα D10S1248, vWA,
D162539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D221045, D192433, THO1, FGA, D2S441,
D3S1358, D1S1656, D12S391, τα οποία επελέγησαν βάσει μίας σειράς διεθνώς εφαρμοζομένων
κριτηρίων

Λόγοι επιλογής των STRs:

Οι συγκεκριμένοι δείκτες είναι υψηλής πολυμορφικότητας και πληροφοριακού περιεχομένου και
βρίσκουν εφαρμογές τόσο στην ιατροδικαστική όσο και στην ανθρωπολογική έρευνα, όσον
αφορά συγκρίσεις πληθυσμών και αναζήτηση πληθυσμιακής δομής. (Budowle. et al, 2011). Ως
εκ τούτου οι δείκτες είναι επαρκώς τεκμηριωμένοι, καθώς έχουν ελεγχθεί για τον αριθμό και το
είδος των αλληλομόρφων που παρουσιάζουν, για την ύπαρξη σπανίων αλληλομόρφων, για την
επιλεκτική ουδετερότητά τους, τους μεταλλακτικούς ρυθμούς τους και για την πληροφοριακή
αξία τους. Η ανάλυσή τους βασίζεται σε νέα, ευρέως χρησιμοποιούμενα πακέτα αντιδραστηρίων
και διεθνώς εφαρμοζόμενα τυποποιημένα εργαστηριακά πρωτόκολλα, άρα διασφαλίζεται η
επαναληψιμότητά της. Υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με τη συχνότητα εμφάνισης
αλληλομόρφων των δεικτών αυτών σε διάφορους πληθυσμούς, ώστε να επιτρέπονται
πληθυσμιακές συγκρίσεις. Από τη διερεύνηση της σχετικής βιβλιογραφίας συνάγεται η
καταλληλότητά τους για την «οριζόντια» διερεύνηση πληθυσμιακής δομής, η οποία εκτείνεται σε
μικρό βάθος εξελικτικού χρόνου, και αγνοεί τη φυσική επιλογή ως παράμετρο πολυμορφισμού,
ενώ λαμβάνει υπ’ όψιν τη μετανάστευση και την τυχαία γενετική παρέκκλιση ως πιθανά αίτια
πληθυσμιακής διαφοροποίησης. Τα δεδομένα θα μπορούσαν μελλοντικά να ενσωματωθούν σε
ευρύτερες βάσεις αναλόγων δεδομένων, ιατροδικαστικών ή άλλων εφαρμογών.

Στον πίνακα 1. εμφαίνονται βασικά χαρακτηριστικά των επί μέρους γονιδιακών τόπων, ήτοι ο
συμβολισμός τους, η θέση τους στα αντίστοιχα χρωμοσώματα και το πλήθος των αλληλομόρφων
ενός εκάστου, εκφραζόμενο ως αριθμός των επαναλήψεων του βασικού μοτίβου, όπως
ανιχνεύονται με το σχετικό kit AmpFlSTR® NGM

Το DNA απομονώθηκε σε αυτόματο μηχάνημα απομόνωσης/καθαρισμού (DNA Extractor
Chemagen/ Biopolymer Technologie Aktiengesellschaft) με την τεχνολογία των μαγνητικών
μικροσφαιριδίων. Ακολούθησε επισήμανση και πολλαπλασιασμός των γονιδιακών τόπων με
πολλαπλή PCR, με τη συσκευασία πολλαπλασιασμού (Kit) AmpFlSTR® NGM™ PCR της
Applied Biosystems. Στον πίνακα 2 εμφαίνεται το πρωτόκολλο της αλυσσωτής αντίδρασης
πολυμεράσης. PCR

Τα προϊόντα της PCR διαχωρίστηκαν με την τεχνολογία τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (Capillary)
στον αυτόματο αναλυτή της Applied Biosystems (AB 3730 DNA Analyser), ενώ για τον
προσδιορισμό του μήκους των αλληλομόρφων (ως αριθμός επαναλήψεων της βασικής
αλληλουχίας) εφαρμόστηκε το λογισμικό Genemapper IDX.

Στατιστική επεξεργασία

Οι συχνότητες των αλληλομόρφων ανά γονιδιακό τόπο υπολογίστηκαν για κάθε ένα από τους
μελετηθέντες πληθυσμούς με το ελεύθερο λογισμικό GenAlEx6.(Peakall & Smouse, 2006). Στον
πίνακα 3 δίδονται οι συχνότητες των καταγεγραμμένων αλληλομόρφων κάθε. γονιδιακού τόπου,
για τους Χριστιανούς, τους Μουσουλμάνους των πεδινών περιοχών (τουρκοφωνους) και τους
Πομάκους αντίστοιχα. Για κάθε STR οι αριθμητικές τιμές των συχνοτήτων συνοδεύονται από

-72- 58

Autosomal geneAtiuctomsoamraklegrense(tiScTmRarsk)erisn(SaTnRtsh)rinopanothlorogpiocloaglicraelsreesaeracrchh.. AAccasaessetusdtyuidn ytheinPrtehfeectPurreeoffeRcotudorpei (oTfhrRaoced, oGpreiece)
(Thrace, Greece)

γραφική παράσταση της κατανομής των αλληλομόρφων στους τρεις πληθυσμούς, προκειμένου
να είναι εμφανή τα κοινά χαρακτηριστικά και οι διαφορές τους, όπως περιγράφονται κατωτέρω.
Η δοκιμασία χ2, με τιμές p κυμαινόμενες μεταξύ 0,001 και p < 0,05 πιστοποιεί τη στατιστική
αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Βάσει των συχνοτήτων υπολογίστηκε μία σειρά παραμέτρων
ενδιαφέροντος, όπως γενετικές αποστάσεις (πίνακας 6) και οι τιμές παρατηρούμενης versus
αναμενόμενης ετεροζυγωτίας (δεν εμφανίζονται εδώ), με τα λογισμικά GeneAlΕx6 και
Arlequin.(Excoffier et al., 2005) Σχολιάζονται κατωτέρω μερικά από τα κύρια συμπεράσματα της
επεξεργασίας των δεδομένων.

Πίνακας 1. Περιγραφή αλληλομόρφων των γονιδιακών τόπων

σύμβολο θέση στο αλληλόμορφα (πλήθος επαναλήψεων βασικής αλληλουχίας)
χρωμόσωμα
D10S1248
vWA 10q26.3 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18
D16S539
D2S1338 12p13.31 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24
D8S1179
D21S11 16q24.1 5, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15

D18S51 2q35 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28

D22S1045 8q24.13 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
D19S433
TH01 21q11.2-q21 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34,
FGA 34.2, 35, 35.2, 36, 37, 38

D2S441 18q21.33 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
D3S1358 27
D1S1656
D12S391 22q12.3 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

19q12 9, 10, 11, 12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2

11p15.5 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11, 13.3

4q28 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2,
42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2

2p14 9, 10, 11, 11.3, 12, 13, 14, 15, 16

3p21.31 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

1q42.2 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14.3, 15, 15.3, 16, 16.3, 17, 17.3, 18.3, 19.3, 20.3

12p13.2 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19.3, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27

Πίνακας 2. Πρωτόκολλο PCR

Επώαση Αρ. Κύκλων (29 κύκλοι) Επέκταση Διατήρηση

Διάρκεια επώασης Μετουσίωση Ανασύσταση Διάρκεια
A95 °C 4 °C
Διάρκεια κύκλων Διάρκεια

94 °C 59 °C 60 °C

Περιγραφή και ανάλυση της γονιδιακής δεξαμενής

Τα περισσότερα καταγεγραμμένα στη βιβλιογραφία αλληλόμορφα για όλους τους γονιδιακούς
τόπους εμφανίζονται και στους τρείς υποθετικούς πληθυσμούς στο αναλυθέν δείγμα. Σε
απόλυτους αριθμούς, το πλήθος των αλληλομόρφων (Na) που παρατηρείται σε κάθε ένα από
αυτούς είναι υψηλό. (173 συνολικά είναι τα αλληλόμορφα για τους Χριστιανούς, 165 για τους
Μουσουλμάνους των πεδινών και 128 για το δείγμα των Πομάκων, αν και σημαντικά μικρότερου

59 -73-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

μεγέθους από τα υπόλοιπα δύο. (πίνακας 4). Αν και αυτό οφείλεται στην πολυμορφικότητα των
γενετικών δεικτών, αποτελεί παράλληλα ένδειξη του πλούτου της γονιδιακής δεξαμενής εκάστου
πληθυσμού.

Πίνακας 3. συχνότητες αλληλομόρφων και γραφήματα κατανομής των

Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι Allele Frequency for D10S1248
9 D10S1248
10 0,0000 0,0000 0.4000
11 0,0051 0,0000 0,0000 0.3500
12 0,0026θ 0,0152 0,0345 0.3000
13 0,0077 0,0212 0,0690 0.2500
14 0,0205 0,2091 0,2241 0.2000
15 0,2282 0,2939 0,3448 0.1500
16 0,2974 0,2424 0,1724 0.1000
17 0,2256 0,1667 0,1207 0.0500
18 0,1410 0,0424 0,0345 0.0000
9 0,0692 0,0091 0,0000
10 0,0026 0,0000 0,0000 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
0,0051 0,0000 0,0000 D10S1248
0,0026

Allele Frequency for vWA Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι
11 vWA
0.350 13 0,0000 0,0061 0,0000
0.300 14 0,0129 0,0091 0,0000
0.250 15 0,0799 0,0970 0,0345
0.200 16 0,1005 0,1000 0,1207
0.150 17 0,1907 0,1697 0,2586
0.100 18 0,2809 0,3273 0,3103
0.050 19 0,1933 0,1758 0,1552
0.000 20 0,1186 0,0909 0,1035
0,0232 0,0242 0,0172
110 130 140 150 160 170 180 190 200
vWA

Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι D162539
8 162539
9 0,0239 0,0311 0,0536 0.400
10 0,1250 0,1398 0,1964 0.300
11 0,0718 0,0404 0,0179 0.200
12 0,2766 0,2888 0,2500 0.100
13 0,2713 0,2764 0,3750 0.000
14 0,1995 0,2112 0,0893
0,0239 0,0124 0,0179 80 90 100 110 120 130 140 150
15 0,0000 0,0000 D162539
0,0080

-74- 60

Autosomal geneAtiuctomsoamraklegrense(tiScTmRarsk)erisn(SaTnRtsh)rinopanothlorogpiocloaglicraelsreesaeracrchh.. AAccasaessetusdtyuidn ytheinPrtehfeectPurreeoffeRcotudorpei (oTfhrRaoced, oGpreiece)
(Thrace, Greece)

Locus D8S1179 0,0061 0,0000 D8S1179
8 0,0052 0,0152 0,0172
9 0,0259 0,0849 0,0690 0.450
10 0,0803 0,0636 0,0345 0.400
11 0,0829 0,1091 0,1207 0.350
12 0,0907 0,2939 0,4138 0.300
13 0,3212 0,1970 0,1207 0.250
14 0,2124 0,1606 0,1724 0.200
15 0,1477 0,0606 0,0517 0.150
16 0,0311 0,0061 0,0000 0.100
17 0,0026 0,0030 0,0000 0.050
18 0,0000 0.000
0,2414
0.250 0,1035 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
0.200 0,1035 D8S1179
0.150 0,2241
0.100 D21S11 0,3103 Locus D21S11 0,0000 0,0000
0.050 0,0172 24 0,0026 0,0000 0,0345
0.000 132 0,0000 24.2 0,0000 0,0062 0,0345
240 27 0,0288 0,1667 0,1897
Locus 242 28 0,1780 0,0000 0,0000
6 270 28.2 0,0000 0,2377 0,2241
7 280 29 0,2330 0,0031 0,0172
8 282 29.2 0,0000 0,2068 0,2069
9 290 30 0,2016 0,0586 0,0517
9.3 292 30.2 0,0497 0,0031 0,0000
10 300 30.3 0,0000 0,0525 0,0345
13 302 31 0,0367 0,0926 0,0690
303 31.2 0,1414 0,0093 0,0000
310 32 0,0026 0,1049 0,1379
312 32.2 0,0969 0,0124 0,0000
320 32.3 0,0026 0,0401 0,0000
322 33.2 0,0262 0,0031 0,0000
323 35.2 0,0000 0,0000 0,0000
332 27 0,0026 0,0000 0,0345
352 28 0,0000

D21S11

THO1 0,2423 THO1
0,2932 0,1841
0,1414 0,1196 0.400
0,1257 0,2669 0.300
0,2173 0,1718 0.200
0,1963 0,0153 0.100
0,0236 0,0000 0.000
0,0026
60 70 80 90 93 100 130

THO1

61 -75-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι D2S1338
14 D2S1338
16 0,0000 0,0000 0.300
17 0,0027 0,0346 0,0536 0.250
18 0,0508 0,1918 0,2143 0.200
19 0,2487 0,1415 0,1607 0.150
20 0,0909 0,1541 0,1071 0.100
21 0,1150 0,1572 0,1250 0.050
22 0,1390 0,0252 0,0536 0.000
23 0,0267 0,0503 0,0536
24 0,0348 0,0818 0,0893 140 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 290
25 0,1043 0,0975 0,1071
26 0,1123 0,0566 0,0000 D2S1338
27 0,0695 0,0031 0,0179
29 0,0054 0,0031 0,0179
0,0000 0,0031 0,0000
0,0000

0.600 D221045 Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι
0.500 8 D221045
0.400 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 9 0,0000 0,0000 0,0000
0.300 D221045 10 0,0026 0,0000 0,0000
0.200 11 0,0026 0,0031 0,0000
0.100 12 0,1302 0,0890 0,1035
0.000 13 0,0078 0,0123 0,0172
14 0,0104 0,0092 0,0000
15 0,0547 0,0951 0,0000
16 0,3750 0,3466 0,3793
17 0,2995 0,3497 0,4828
18 0,1016 0,0890 0,0172
19 0,0130 0,0061 0,0000
0,0026 0,0000 0,0000

Locus D3S1358 0,0000 0,0179 D3S1358
12 0,0000 0,0245 0,0179
13 0,0026 0,0644 0,0536 0.3500
14 0,0781 0,2301 0,2321 0.3000
15 0,2292 0,2730 0,3214 0.2500
16 0,2604 0,1841 0,1786 0.2000
17 0,2292 0,2178 0,1607 0.1500
18 0,1745 0,0061 0,0179 0.1000
19 0,0260 0.0500
0.0000

120 130 140 150 160 170 180 190
D3S1358

-76- 62

Autosomal geneAtuictosmomaarlkgeernset(icSmTaRrske)risn(SaTnRst)hirnoapnothlroopgoilcoagilcralerseesaearrcchh..AAcacsae ssteudsytuindtyheinPrethfeectuPrereoffeRcotduorpei (oThfrRacoed, Gorpeiece)
(Thrace, Greece)

Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοιι D192433
10 D192433
11 0,0026 0,0000 0,0000 0.400
12 0,0237 0,0183 0,0000 0.350
12.2 0,0974 0,1006 0,1207 0.300
13 0,0026 0,0000 0,0000 0.250
13.2 0,2711 0,2561 0,3448 0.200
14 0,0105 0,0213 0,0172 0.150
14.2 0,2842 0,3232 0,2069 0.100
15 0,0395 0,0366 0,0517 0.050
15.2 0,1316 0,1311 0,1552 0.000
16 0,0579 0,0427 0,0517
16.2 0,0447 0,0305 0,0345 100 110 120 122 130 132 140 142 150 152 160 162 170 172
17 0,0263 0,0335 0,0172
17.2 0,0053 0,0000 0,0000 D192433
0,0026 0,0061 0,0000

Χριστιανοί Μουσ. Πεδιν. Πομάκοι
D18S51
0.350 D18S51 Locus 0,0042 0,0092 0,0000
0.300 10 0,0212 0,0000 0,0000
0.250 D18S51 11 0,0000 0,0046 0,0000
0.200 100 11.2 0,1271 0,1101 0,1304
0.150 110 12 0,0000 0,0046 0,0000
0.100 112 12.2 0,1653 0,1835 0,3044
0.050 120 13 0,1780 0,1789 0,1522
0.000 122 14 0,1271 0,1330 0,0652
130 15 0,1441 0,1651 0,1522
140 16 0,0848 0,0826 0,0870
150 17 0,0720 0,0826 0,0870
160 18 0,0254 0,0275 0,0000
170 19 0,0254 0,0092 0,0217
180 20 0,0127 0,0092 0,0000
190 21 0,0042 0,0000 0,0000
200 22 0,0042 0,0000 0,0000
210 23 0,0042 0,0000 0,0000
220 24
230
240

*για λόγους σχετικούς με τη μορφή των δεδομένων εισόδου (imput data) στα λογισμικά, ο αριθμός των βασικών επαναλήψεων που

χαρακτηρίζει το κ άθε αλληλόμορφο (οριζόντιος άξονας στα γραφήματα) είναι πολλαπλασιασμένος Χ10

63 -77-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Locus Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι 0.300 FGA
17 FGA 0.250
18 0,0030 0,0066 0,0000
19 0,0089 0,0000 0,0000 0.200
20 0,0446 0,0493 0,0385
21 0,1280 0,1415 0,1154 0.150
21.2 0,2202 0,1118 0,2692
22 0,0030 0,0066 0,0000 0.100
22.2 0,1696 0,1743 0,1346
22.4 0,0030 0,0132 0,0000 0.050
23 0,0030 0,0000 0,0000
23.2 0,1131 0,1842 0,1346 0.000
24 0,0030 0,0066 0,0000 170180190200210212220222224230232240250260270280290320
25 0,1488 0,1612 0,0769
26 0,0923 0,0921 0,1539 FGA
27 0,0446 0,0428 0,0577
28 0,0030 0,0066 0,0000
29 0,0030 0,0033 0,0000
32 0,0089 0,0000 0,0000
0,0000 0,0000 0,0192

0.2500 100 Locus D1S1656 0,0031 0,0000
0.2000 110 10 0,0000 0,1025 0,1482
0.1500 113 11 0,1000 0,0000 0,0000
0.1000 120 11.3 0,0026 0,1149 0,1296
0.0500 130 12 0,1079 0,0776 0,0370
0.0000 140 13 0,0921 0,0497 0,0556
143 14 0,0632 0,0186 0,0000
150 14.3 0,0132 0,1522 0,2037
153 15 0,1579 0,0808 0,0556
160 15.3 0,0632 0,1522 0,0741
163 16 0,1842 0,0559 0,0185
170 16.3 0,0342 0,0311 0,0370
173 17 0,0395 0,0714 0,0741
183 17.3 0,0711 0,0839 0,1482
193 18.3 0,0553 0,0062 0,0185
203 19.3 0,0132 0,0000 0,0000
20.3 0,0026

-78- 64

Autosomal genetic markers (STRs) in anthropological research. A case study in the Prefecture of Rodopi
Autosomal genetic markers (STRs) in a(nTthhrroapcoleo,giGcarlereesceea)rch. A case study in the Prefecture of Rodopi (Thrace, Greece)

Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι

Locus D12S391

15 0,0193 0,0311 0,0179

16 0,0304 0,0342 0,0357 D12S391

17 0,1437 0,1522 0,1429 0.300

18 0,2818 0,1957 0,2321

0,1188 0,1087 0,1071 0.250

19

19.3 0,0304 0,0186 0,0179 0.200

20 0,0829 0,1056 0,1250 0.150

21 0,0912 0,1056 0,1250 0.100

22 0,1022 0,0963 0,1250 0.050

23 0,0470 0,1025 0,0536 0.000

150 160 170 180 190 193 200 210 220 230 240 250 260

24 0,0359 0,0342 0,0179 D12S391

25 0,0138 0,0155 0,0000

26 0,0028 0,0000 0,0000

Χριστιανοί Μουσ. Πομάκοι

Locus D2S441

10 0.1447 0.2012 0.1786

10.3 0.0000 0.0031 0.0000

0.4000 D2S441 11 0.3500 0.2835 0.3214
0.3500 100 103 110 113 120 123 130 133 140 150 160 11.3 0.1000 0.0701 0.0357
0.3000 12 0.0447 0.0579 0.0536
0.2500 12.3 0.0053 0.0031 0.0000
0.2000 13 0.0421 0.0366 0.0893
0.1500 13.3 0.0026 0.0031 0.0000
0.1000 14 0.2711 0.3079 0.3036
0.0500 15 0.0342 0.0335 0.0179
0.0000

D2S441

Locus

16 0.0053 0.0000 0.0000

Σε αδρή σύγκριση, η κατανομή των αλληλομόρφων και στους τρείς πληθυσμούς συνάδει με το
αντίστοιχο γενικό πρότυπο των συχνοτήτων των εν λόγω αλληλομόρφων σε γενικό δείγμα των
Ευρωπαϊκών πληθυσμών. (Budowle. et al, 2011).

Δεν παρατηρούνται τοπικά αλληλόμορφα (No. LComm Alleles) με συχνότητα κάτω από 25%,
ενώ τα τοπικά αλληλόμορφα με συχνότητα κάτω από 50% εμφανίζονται σε χαμηλά ποσοστά.

Πίνακας 4. Πρότυπα των αλληλομόρφων ανά πληθυσμό

Population ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

Na 173 165 128

Na Freq. >= 5% 87 89 90

Ne 22 11 4

No. LComm Alleles (<=25%) 0 0 0

No. LComm Alleles (<=50%) 6 6 6

65

-79-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Στον πίνακα 5 εμφανίζονται αντιστοίχως οι μέσες τιμές για όλους τους γονιδιακούς τόπους, το δε
διάγραμμα της εικ. 3 αποδίδει σχηματικά τα πρότυπα των αλληλομόρφων τα οποία εμφανίζονται
παρόμοια για τους τρείς πληθυσμούς.

Πίνακας 5. Μέσες τιμές (για το σύνολο των γονιδιακών τόπων)

Mean values

Population ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

Na 11,533 11,000 8,533

Na Freq. >= 5% 5,800 5,933 6,000

Ne 5,983 6,064 5,402

I 1,923 1,916 1,802

No. Private Alleles 1,467 0,733 0,267

No. LComm Alleles (<=25%) 0,000 0,000 0,000

No. LComm Alleles (<=50%) 0,400 0,400 0,400

He 0,821 0,820 0,796

0 0.5 1 Allelic Patterns across Populations 3 3.5 Na
CHRIS-G 1.5 2 2.5 Na Freq.
12.000 0.820 >= 5%
Mean10.000 0.810 Ne
Heterozygosity0.800I
8.000 0.790 No. Private
6.000 0.780 Alleles
4.000 0.770 He
2.000 0.760
0.000 0.750

MUS-VALLEY POMAK
Populations

Εικ.3. Πρότυπα αλληλομόρφων των τριών πληθυσμιακών ομάδων

Σε κάθε επί μέρους πληθυσμό, Χριστιανοί (CHRIS-G), Μουσουλμάνοι πεδινών περιοχών (MUS-
VALLEY) και Πομάκοι (POMAK) αντιστοιχούν 5 στήλες:

Στήλη Ι. μέσος αριθμός των παρατηρούμενων αλληλομόρφων (Na) είναι παρόμοιος μεταξύ
Χριστιανών – πεδινών Μουσουλμάνων),

Στήλη ΙΙ. Μέσος αριθμός των αλληλομόρφων (Na) που εμφανίζονται σε κάθε πληθυσμό με
συχνότητα μεγαλύτερη του 5% είναι παρόμοιος και στους 3 πληθυσμούς, ανεξάρτητα από το
μέγεθος του δείγματος.

-80- 66

Autosomal geneAtuitcosmomaarlkgeernseti(cSmTaRrkse)rsin(STaRnst)hirnoapntohlroopgoilcoagilcarlerseeseaarrcchh..AAcacseassteudsytuindthyeiPnretfhecetuPrereoffeRcotduoprie(TohfraRcoe,dGorpeeice)
(Thrace, Greece)

Στήλη ΙΙΙ. Ο μέσος δραστικός αριθμός αλληλομόρφων Ne (πράσινες στήλες) παρουσιάζει και
πάλι παρόμοια πρότυπα, ανεξάρτητα από το μέγεθος του δείγματος,

Στήλη ΙV. Το πληροφορικό περιεχόμενο των δεικτών για όλους τους πληθυσμούς εμφανίζεται
ταυτόσημο, (γεγονός που τεκμηριώνει τη σχετική αξιοπιστία των πληροφοριών του δείγματος,
ανεξάρτητα από τη διαφορά μεγέθους των δειγματικών πληθυσμών).

Στήλη VI. Μοναδικά ανά πληθυσμό αλληλόμορφα. Το δείγμα των χριστιανών εμφανίζεται
σαφώς πλουσιότερο σε μοναδικά (μή εμφανιζόμενα στους υπόλοιπους) αλληλόμορφα σε σχέση
με τους δύο άλλους πληθυσμούς με 22 μοναδικά αλληλόμορφα. Αντίστοιχα τα μοναδικά στους
πεδινούς μουσουλμάνους είναι 9 συνολικά και στους πομάκους 3.

Τα μοναδικά ανά πληθυσμό αλληλόμορφα για τον κάθε επί μέρους γονιδιακό τόπο διαφέρουν
από πληθυσμό σε πληθυσμό. Η αναζήτηση των αλληλομόρφων αυτών σε διαθέσιμες βάσεις
δεδομένων από άλλες πηγές βάση δεδομένων του Παν/νιου Muenster (Allelfrequenz-
Datenbank.xls, Skitsa et al. 2003, Kovatsi et al 2006), έδωσε τις κάτωθι πληροφορίες ανά
πληθυσμιακή ομάδα:

Στο Χριστιανικό δείγμα του Ν. Ροδόπης εμφανίζονται:
 τα αλληλόμορφα 9, 10 του γονιδιακού τόπου D10S1248,
 το αλληλόμορφο 15, του D162539, το οποίο απαντάται στην Τουρκία με συχνότητα
0,003 στην Τουρκία (χωρίς αναφορά σε συγκεκριμένη περιοχή)
 το αλληλόμορφο 14 του D2S1338
 το αλληλόμορφο 13.2 του D21S11,
 τα αλληλόμορφα 11,22,23,24 του D18S51, εκ των οποίων τα 11, 23 και 24 απαντώνται
στη Β. Ελλάδα, (Kondopoulou et al 1999) το 11 στην Τουρκία και ειδικότερα στις
περιοχές Μαρμαρά και παραλίων της Μικράς Ασίας, (Cakir et al. 2002) όπου
καταγράφεται και το αλληλόμορφο 23 (Akbasak et al. 2001, Asicioglou et al. 2002, Cakir
et al. 2002)
 τα αλληλόμορφα 9 και 19 του D221045
 τα αλληλόμορφα 10, 12.2 και 17 του D192433. εξ αυτών το 12.2 καταγράφεται στο
Μαρμαρά και τα αιγειακά παράλια της σημερινής Τουρκίας και το 17 στο Μαρμαρά
(Cakir et al. 2002), ενώ το αλληλόμορφο 10 δεν έχει εντοπιστεί σε τουρκικούς
πληθυσμούς.
 το αλληλόμορφο 13 του THO1,
 τα αλληλόμορφα 18, 22.3 και 29 του FGA. Το αλληλόμορφο 18 καταγράφεται στην
Τουρκία και ειδικότερα στις περιοχές Μαρμαρά με συχνότητα 0,009 και παραλίων της
Μικράς Ασίας με συχνότητα 0,015
 το αλληλόμορφο 16 του D2S441
 τα αλληλόμορφα 11.3 και 20.3 του D1S1656
 το αλληλόμορφο 26 του D12S391

Στους πεδινούς Μουσουλμάνους τα μοναδικά αλληλόμορφα που εμφανίζονται είναι συνολικά 9:
 το αλληλόμορφο 11 του vWA
 το αλληλόμορφο 29 του D2S1338
 το αλληλόμορφο 18 του D8S1179
 το αλληλόμορφο 8 του D221045
 τα αλληλόμορφα 30.3 και 35.2 του D21S11
 τα αλληλόμορφα 11.2, 12.2 D18S51

Εξ αυτών τα παρατηρηθέντα αλληλόμορφα 30.3 και 35.2 του γονιδιακού τόπου D21S11, καθώς
και τα αλληλόμορφα 11.2 και 12.2 τού τόπου D18S51, (για τους γονιδιακούς αυτούς τόπους
υπάρχουν αρκετά δεδομένα που αφορούν τουρκικούς πληθυσμούς) δεν εμφανίζονται στο
γεωγραφικό χώρο της σημερινής Τουρκίας, ενώ το αλληλόμορφο 11 του τόπου vWA εμφανίζεται
με πολύ μικρή συχνότητα 0,003 στην περιοχή Μαρμαρά, αλλά και στη Σικελία.

67 -81-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Τέλος, ο πληθυσμός των Πομάκων εμφανίζει μόνο 3 μοναδικά αλληλόμορφα (πιθανότατα λόγω
του σχετικά μικρότερου μεγέθους του δείγματος) ήτοι:

• το αλληλόμορφο 24 του D21S11
• το αλληλόμορφο 32 του FGA
• το αλληλόμορφο 12 του D3S1358

Κανένα από τα μοναδικά αλληλόμορφα των Πομάκων δεν έχει καταγραφεί σε Τουρκικούς
πληθυσμούς. Επίσης τα μοναδικά αλληλόμορφα του δείγματος των Πομάκων δεν έχουν
καταγραφεί σε δημοσιευμένα δεδομένα (Pereira et al. 2009) των ιδίων δεικτών STRs από
Βουλγαρικό δείγμα της περιοχής Φιλιππουπόλεως.

Το περιεχόμενο των επί μέρους γενετικών δεξαμενών αντανακλά τα μεταναστευτικά συμβάντα
στην γονιδιακή δεξαμενή των Χριστιανών, αλλά και την γεωγραφική απομόνωση και ενδογαμία
των ορεινών Πομάκων, ενώ επιβεβαιώνει την ιδιαιτερότητα της γονιδιακής δεξαμενής των
γηγενών πεδινών Μουσουλμάνων, καθώς αυτή διαμορφώθηκε εντός των στενών γεωγραφικών
πλαισίων της και δεν φαίνεται να εμπλουτίστηκε από εισροή Τουρκικών γονιδίων.

Ο αυξημένος ποιοτικά και ποσοτικά γονιδιακός πλούτος της Χριστιανικής ομάδας, ερμηνεύεται
αν ληφθεί υπ’ όψιν ότι ο Χριστιανικός πληθυσμός του Ν. Ροδόπης προέρχεται από τη σύνθεση
ομάδων διαφορετικών γεωγραφικών προελεύσεων. Η υπάρχουσα στις αρχές του 20ου αιώνα
γενετική δεξαμενή των γηγενών Χριστιανών (Κομοτηνή, Ίασμος, Κόσμιο, Μαρώνεια, Γρατινή)
εμπλουτίστηκε από το γονιδιακό απόθεμα των νεοεισελθέντων προσφύγων, των οποίων μοναδικά
αλληλόμορφα ανιχνεύονται και σήμερα στους τόπους καταγωγής τους. Οι πληθυσμιακές αυτές
ομάδες, οι οποίες μετανάστευσαν μαζικά προς τη Δυτική Θράκη στις αρχές της δεκαετίας του
1920, προήρχοντο από διαφορετικές περιοχές. Οι κάτοικοι της Ανατολικής Θράκης, της
Ανατολικής Ρωμυλίας, της Μικρασιατικής ακτής, της Καππαδοκίας, του Ευξείνου Πόντου θα
πρέπει να ήταν γενετικά διαφοροποιημένοι σε σημαντικό βαθμό, καθώς είχαν μικρή πιθανότητα
ανάμειξης πριν από τη μετακίνησή τους στο Ν. Ροδόπης, λόγω της περιορισμένης ακτίνας
γαμηλιότητας, οφειλόμενης στις κοινωνικο-οικονομικές συνθήκες της εποχής. Κατά συνέπεια
είναι αναμενόμενο να συνιστούν και σήμερα υποπληθυσμούς με ιδιαίτερη γενετική σύσταση,
παρά τη σταδιακή μετάβαση σε παμμειτικές συμπεριφορές στις μέρες μας. Επίσης, οι
ενδογαμικοί πληθυσμοί των νομάδων Σαρακατσάνων μόλις μετά τη δεκαετία του 1960
απέκτησαν μόνιμες εγκαταστάσεις σε διάφορα χωριά και οικισμούς του νομού (Γλυκονέρι,
Γλυφάδα, Διαλαμπή κ.τ.λ..) και διατήρησαν μέχρι πρόσφατα τα παραδοσιακά κλειστά πρότυπα
συζεύξεων, ωστόσο συμπεριλαμβάνονται στο παρόν δείγμα και ενδεχομένως συνεισφέρουν σ’
αυτό με μοναδικά αλληλόμορφα.

Από την άλλη μεριά, οι Μουσουλμάνοι των πεδινών, όντας κλειστοί αγροτικοί πληθυσμοί
παλαιόθεν εγκατεστημένοι στην περιοχή, στερούμενοι κοινωνικής κινητικότητας και με
περιορισμένη γεωγραφική ακτίνα εξάπλωσης, συχνά δε αναπαραγόμενοι σε μικρή ακτίνα
γαμηλιότητας, είναι αναμενόμενο να παρουσιάζουν φτωχότερη, ως προς το περιεχόμενο,
γονιδιακή δεξαμενή. Επίσης είναι ερμηνεύσιμο να παρουσιάζουν τοπικά αλληλόμορφα μή
καταγραφέντα στη σημερινή Τουρκία καθώς δεν υπήρξε εξ ανατολών σημαντική εισροή
γονιδίων.

γ) Όσον αφορά τους Πομάκους, είναι τεκμηριωμένη η μακρόχρονη γεωγραφική απομόνωση των
επί μέρους οικισμών λόγω του γεωγραφικού αναγλύφου, όπως και η εκτεταμένη ομογαμία
(Ζαφείρης 2006) και άρα απολύτως αναμενόμενη η διαφοροποιημένη γενετική εικόνα, η οποία
μπορεί να αποδοθεί σε γενετική απομόνωση, επιλεγμένες συζεύξεις, έλλειψη εισροής γονιδίων
(απουσία μεταναστεύσεων προς την περιοχή), αλλά και τυχαία γενετική παρέκκλιση.

Γενετικές αποστάσεις

Με την εφαρμογή των λογισμικών GenAlEx6 και Arlequin υπολογίστηκαν διάφορες εκφράσεις
γενετικών αποστάσεων μεταξύ των τριών μελετώμενων πληθυσμών. (πίνακας 6). Παρά τις
διαφορές των λογισμικών ως προς τους εφαρμοζόμενους αλγόριθμους και τη διαχείριση των
ελλειπουσών τιμών, με αποτέλεσμα τα διαφορετικά αριθμητικά αποτελέσματα, σε όλες τις

-82- 68

Autosomal geneAtuitcosmomaarlkgeernseti(cSmTaRrkse)rsin(STaRnst)hirnoapntohlroopgoilcoagilcarlerseeseaarrcchh..AAcacseassteudsytuindthyeiPnretfhecetuPrereoffeRcotduoprie(TohfraRcoe,dGorpeeice)
(Thrace, Greece)

περιπτώσεις εμφανίζεται σχετικά μεγαλύτερη η γενετική απόσταση των Πομάκων τόσο από τους
Χριστιανούς όσο και από τους Μουσουλμάνους των πεδινών, ενώ οι δύο αυτοί πληθυσμοί
εμφανίζουν πολύ μικρή γενετική απόσταση μεταξύ τους (περίπου υποτριπλάσια).

Πινακας 6. Γενετικές αποστάσεις

Pairwise Population Matrix of Nei Genetic Distance

ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

0,000 ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ

0,016 0,000 ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ.

0,046 0,049 0,000 ΠΟΜΑΚΟΙ

Pairwise Population FST (via Frequency) Values
ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

0,000 ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ

0,002 0,000 ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ.

0,006 0,006 0,000 ΠΟΜΑΚΟΙ

Slatkin linearized FST
ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

0,000 ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ

0,00022 0,000 ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ.

0,00152 0,00089 0,000 ΠΟΜΑΚΟΙ

Delta mu-square distance

ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ. ΠΟΜΑΚΟΙ

0,000 ΧΡΙΣΤΙΑΝΟΙ

1,13817 0,000 ΜΟΥΣ-ΠΕΔΙΝ.

5,10290 4,50993 0,000 ΠΟΜΑΚΟΙ

Αναζήτηση πληθυσμιακής δομής με το λογισμικό STRUCTURE

Το λογισμικό STRUCTURE είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να ανιχνεύει την παρουσία
υποπληθυσμών επεξεργαζόμενο «στα τυφλά» ένα ενοιαίο σύνολο γενετικών δεδομένων,
αναζητώντας, μέσω κυκλικά επαναλαμβανόμενων υπολογισμών βασισμένων σε ειδικούς
αλγορίθμους, τη βέλτιστη λύση ως προς των αριθμό των πιθανόν υπαρχόντων υποπληθυσμών σε
ένα δείγμα. (Pritchard et al. 2000). Τροφοδοτούμενο με το σύνολο των δεδομένων μας έδωσε το
ακόλουθο αποτέλεσμα (Εικ. 4). Οι πληθυσμοί των Χριστιανών, Μουσουλμάνων και Πομάκων
συσσωματώνονται στο κέντρο του διαγράμματος, εμφανίζοντας ελάχιστες διαφοροποιήσεις
μεταξύ τους, ως να ανήκουν σε ενιαίο πληθυσμιακό σύνολο.

Εικ 4. Διαφοροποίηση μεταξύ των τριών πληθυσμών

69 -83-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Τα ανωτέρω ευρήματα συνδυαστικά θεωρούμενα, θα μπορούσαν να υποστηρίξουν την παρακάτω
υπόθεση: Ενδεχομένως, ο ευρύτερος γεωγραφικός χώρος της Θράκης και των παραλίων
κατοικήθηκε παλαιόθεν από πληθυσμούς με κοινή γονιδιακή δεξαμενή, των οποίων διάφορα
πολιτισμικά χαρακτηριστικά τροποποιήθηκαν στο πέρασμα του χρόνου λόγω ιστορικών
συνθηκών, διαμορφώνοντας σταδιακά διαφορετικές κοινωνίες, χωρίς όμως στο χρονικό αυτό
διάστημα να έχει αλλοιωθεί δραματικά το υπάρχον βιολογικό υπόβαθρο. Κατά συνέπεια, οι
πρόσφατες πληθυσμιακές μετακινήσεις, ως χωρική ανακατάταξη της γενετικής πληροφορίας
εντός της ίδιας κοινής δεξαμενής (ΝΑ Βαλκανίων-αιγειακών ακτών) δεν επέφεραν σημαντικές
τροποποιήσεις στο συνολικό ευρύτερο γενετικό τοπίο σε αυτό το χρονικό βάθος. Η
εμπλουτισμένη γονιδιακή δεξαμενή των Χριστιανών του Ν. Ροδόπης με αλληλόμορφα παρόντα
και σήμερα στα αιγειακά παράλια και την περιοχή του Μαρμαρά, ερμηνεύεται απολύτως από τη
μετανάστευση των προσφύγων από τα μέρη αυτά προς τη Δυτική Θράκη. Ωστόσο, τα διακριτά
πρότυπα γαμηλιότητας λόγω πολιτισμικών φραγμών, προϊόντων ενδεχομένως των εξισλαμισμών
κατά το 16ο – 18ο αιώνα, δεν φαίνεται να επηρέασαν το βιολογικό υπόβαθρο των πληθυσμών.
Δεν εντοπίζονται διακριτές γενετικές δεξαμενές ανιχνεύσιμες με τους συγκεκριμένους γενετικούς
δείκτες. Η εξελικτική μορφοποίηση νέων γενετικών προφίλ σε πολιτισμικά (και γενετικά)
διαχωρισμένες πληθυσμιακές ομάδες απαιτεί πολύ μεγαλύτερη χρονική διάρκεια.

Άλλες παρατηρήσεις συμβατές με την επιτόπια κατάσταση.

Πιθανή πληθυσμιακή δομή εντός του δείγματος Χριστιανών του Ν. Ροδόπης

Σε χριστιανικό δείγμα 150 ατόμων (εξαιρέθηκαν τα δείγματα με ελλείπουσες τιμές) εφαρμόστηκε
το λογισμικό STRUCTURE (admixture model, 20000 burn-ins, 20000 MCMC) προκειμένου να
ανιχνευθεί η παρουσία διακριτών υποπληθυσμών εντός του χριστιανικού συνόλου. Το λογισμικό
ήλεγξε την πιθανότητα ύπαρξης από δύο έως 7 υποπληθυσμών (πιθανές τιμές Κ=2, εως Κ=7). Το
πιθανότερο αποτέλεσμα, αυτό που αντιστοιχεί στην μικρότερη τιμή της παραμέτρου Ln P(D),
αποδίδει Κ=6, δηλαδή πιθανότητα έξι χριστιανικών υποομάδων και απεικονίζεται στην εικ. 5.

Εικ. 5. Αριστερά: Γραφική απεικόνιση (bar plot) της πληθυσμιακής δοριστμής εντός του Χριστιανικού δείγματος, για την
πιθανή παρουσία 6 διακριτών υποπληθυσμών. Κάθε κατακόρυφη γραμμή αντιστοιχεί σε ένα ξεχωριστό άτομο και
αποδίδει την πιθανότητα ένταξής του σε καθένα από τους 6 διαφορετικούς υποπληθυσμούς που συμβολίζονται με
διαφορετικά χρώματα. Δεξιά:απεικόνιση του ιδιου αποτελέσματος με μορφή triagle plot, όπου είναι εμφανής ή διασπορά
του χριστιανικού πληθσμού του δείγματος.

Το ανωτέρω αποτέλεσμα είναι εναρμονισμένο με τη εμπειρική γνώση της σύνθεσης του
δείγματος από άτομα πρερχόμενα από: Ανατολική Θράκη, Ανατολική Ρωμυλία, Μικρασιατικά
παράλια, Καππαδοκία, Πόντο, και ομάδες Σαρακατσάνων. Ωστόσο, η πλήρης τεκμηρίωση του
αποτελέσματος απαιτεί λεπτομερείς γενεαλογικές πληροφορίες, οι οποίες δεν ήταν διαθέσιμες
λόγω της ανωνυμίας των δειγμάτων και της τυχαιότητας της δειγματοληψείας, καθώς και χρήση
γενετικών δεκτών διαφορετικού τύπου. Παρά ταύτα το αποτέλεσμα παρατίθεται ως ενδεικτικό
των δυνατοτήτων του λογισμικού STRUCTURE.

-84- 70

Autosomal geneAtuictosmomaarlkgeernset(icSmTaRrske)risn(SaTnRst)hirnoapnothlroopgoilcoagilcralerseesaearrcchh..AAcacsae ssteudsytuindtyheinPrethfeectuPrereoffeRcotduorpei (oThfrRacoed, Gorpeiece)
(Thrace, Greece)

Πιθανή πληθυσμιακή δομή εντός του δείγματος Μουσουλμάνων του Ν. Ροδόπης

Ένα ακόμη ενδιαφέρον εύρημα με την εφαρμογή μίας παραλλαγής του ανωτέρω λογισμικού
(admixure model, allele frequencies corellated), 50000 burn-ins, 50000 MCMC, migration
probability) η οποία καταδεικνύει πιθανότητα μεταναστεύσεων, απεικονίζεται στην εικόνα 6 και
αφορά το σύνολο των Μουσουλμάνων.

Εικ. 6. Αριστερά:. Γραφική απεικόνιση (bar-plot) αποτελέσματος του STRUCTURE για Κ=4 [Γιακάδες(κόκκινο)-
Κομοτηνή (Πράσινο), Ορεινοί Πομάκοι (μπλε), Πεδινοί Μουσουλμάνοι (κίτρινο]. Διακρίνονται οι 4 πληθυσμιακές
ομάδες και οι πιθανότητες μεταναστεύσεων επί μέρους ατόμων σε κάθε μία από αυτές.Δεξιά:Γραφική απεικόνιση
(triangle plot) αποτελέσματος του STRUCTURE για Κ=4 (Γιακάδες-Κομοτηνή, Ορεινοί, Πεδινοί)

Το δείγμα αποτελείται από 160 άτομα, Μουσουλμάνους με δεδομένα αλληλικών συχνοτήτων για
15 μικροδορυφόρους. Το δείγμα χωρίστηκε σε 4 υποθετικούς υποπληθυσμούς με κριτήριο τον
τόπο διαμονής, καθώς δεν υπήρχαν πληροφορίες περί απώτερης καταγωγής των, ήτοι: 1) Pop1:
18 άτομα από χωριά που βρίσκονται στις νότιες παρυφές του όρους Ροδόπη, γνωστά στο σύνολό
τους ως «Γιακάδες», στα οποία είναι γνωστό ότι υπήρξαν πρόσφατες εγκαταστάσεις Πομάκων.
(GIAKADES), 2) Pop2: 46 άτομα τα οποία δηλώνουν τόπο γέννησης την Κομοτηνή και για τα
οποία δεν υπάρχουν περισσότερα στοιχεία καταγωγής (KOM), 3) Pop3: 26 άτομα καταγόμενα
από τα ορεινά Πομακοχώρια ΒΑ του Ν. Ροδόπης (ORIN) και 4) Pop4: 70 άτομα από πεδινά
αμιγώς μουσουλμανικά χωριά (PEDINOI)

Είναι γνωστό ότι οι ορεινοί Μουσουλμάνοι (Πομάκοι) είναι γενετικά διαφοροποιημένοι από τους
πεδινούς Μουσουλμάνους λόγω: α) μακρόχρονης γεωγραφικής απομόνωσης, καθώς το
ανεπαρκές μέχρι και τη δεκαετία του 1960 οδικό δίκτυο περιόριζε τις μετακινήσεις τόσο μεταξύ
των Πομακικών οικισμών στα ορεινά, όσο και συνολικά των Πομάκων προς τα πεδινά, β)
διαφορετικών κοινωνικών προτύπων (οι ορεινοί είναι κυρίως κτηνοτρόφοι, έχουν ως μητρική
γλώσσα την πομακική, ενώ οι πεδινοί είναι πρωτίστως γεωργοί και έχουν ως μητρική γλώσσα την
τουρκική γλώσσα, παράλληλα δε οι δύο πληθυμοί αποκλίνουν μεταξύ τους ως προς τα
θρησκευτικά δόγματα), και γ) λόγω κοινωνικής ιεράρχησης, καθώς διατηρείται ακόμη μία
υποτιμητική στάση των πεδινών Μουσουλμάνων έναντι των Πομάκων, λόγω της οποίας η
αμοιβαία γαμηλιότητα ήταν πολύ περιορισμένη.
Είναι επίσης γνωστό στους κατοίκους της περιοχής ότι περίπου κατά τη δεκαετία του 1960
υπήρξαν μετακινήσεις Πομάκων προς τα νοτιότερα και πιο εύφορα χωριά και οικισμούς. Σχεδόν
το σύνολο των Πομάκων από τα ΒΔ της Κομοτηνής ορεινά χωριά μετακινήθηκαν νοτιότερα.
Έτσι σήμερα τα χωριά Μελίταινα, Σήμα, Διχάλα, Τρίκορφο, Κάβος, Κερασέα κ.α. είναι σχεδόν
εγκαταλελλειμένα, αφού οι κάτοικοί τους μετακινήθηκαν προς τον Ίασμο (όπου σχεδόν το
σύνολο των Μουσουλμάνων είναι Πομάκοι) αλλά και προς τα χωριά βορείως της Κομοτηνής
(Σώστης, Λινός, Δύμη, Μ. Πιστό κ.α.) γνωστά ως «Γιακάδες» (παρυφές του βουνού).

71 -85-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Η εφαρμογή του λογισμικού STRUCTURE απεικονίζει σαφή διαφοροποίηση μεταξύ των
μουσουλμανικών πληθυσμών από τους Γιακάδες, τα ορεινά και τα πεδινά Η ανάλυση
αποκαλύπτει 4 διακριτούς πληθυσμούς [Γιακάδες, Κομοτηνή, Ορεινοί (Πομάκοι), και Πεδινοί
Μουσουλμάνοι], καθώς και την πιθανότητα μεταναστεύσεων ατόμων από ένα πληθυσμό σε άλλο.
(για παράδειγμα, στην εικ.6, οι κόκκινες γραμμές που εμφανιζονται ένθετα στα γειτονικά πεδία
αντιπροσωπεύουν Πομάκους μετακινηθέντες προς την Κομοτηνή ή τα πεδινά χωριά.

Σχόλια

Η ανάλυση του πληθυσμιακού δείγματος με τους συγκεκριμένους δείκτες δείνει αξιοπρόσεκτες
ενδείξεις περί μη σαφούς διαφοροποίησης των γενετικών δεξαμενών μεταξύ Χριστιανών και
πεδινών Μουσουλμάνων, όπως και ίχνη γονιδιακής ροής (των χριστιανών προσφύγων) πρός το
Νομό Ροδόπης. Ωστόσο, η μικρή γεωγραφική έκταση της έρευνας, και το μικρό από εξελικτική
άποψη χρονικό βάθος της μελέτης, όπως και η τυχαία δειγματοληψεία, η οποία παρά τον τυπικά
επαρκή αριθμό δειγμάτων δεν είναι βέβαιο ότι καλύπτει ικανοποιητικά την ποικιλομορφία ενός
τόσο σύνθετου πληθυσμιακού μωσαϊκού όπως αυτό της Θράκης, επιβάλλουν επιφυλάξεις ως
πρός το απόλυτο των συμπερασμάτων. Ενδελεχέστερη μελέτη του αρχικού ερωτήματος, με τη
χρήση και άλλου τύπου γενετικών δεικτών όπως οι διαλληλικοί δείκτες του χρωμοσώματος Υ
(μονογονεϊκή πατρική κληροδότηση) και του μιτοχονδριακού DNA (μητρική γενεαλογική
γραμμή), ή και η πλήρης αλληλούχιση των μελετώμενων γονιδιωμάτων, θα επέτρεπε
ακριβέστερη ιχνηλάτηση ενδεχόμενων διαφορών. Επί πλέον μία στοχευμένη δειγματοληψεία,
συνοδευόμενη από γενεαλογικές πληροφορίες θα τεκμηρίωνε τις εσωτερικές μετακινήσεις
ατόμων σε μικρή γεωγραφική ακτίνα, οι οποίες αν και είναι γνωστό ότι συμβαίνουν, απαιτούν
επίπονες προσπάθειες για τη γενετική αποτύπωσή τους. Σε κάθε περίπτωση όμως βεβαιώνεται ότι
οι αυτοσωμικοί μικροδορυφόροι είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την αδρή περιγραφή γονιδιακών
δεξαμενών σε περιπτώσεις σύνθετων πληθυσμιακών μοντέλων, ιδιαίτερα εφ’ όσον ο ερευνητής
έχει σαφή γνώση των επιτόπιων συνθηκών.

Αναφορές

Abdin L., Shimada I., Brinkmann B. & Hohoff C. 2003. Analysis of 15 short tandem repeats reveals
significant differences between the Arabian populations from Morocco and Syria. Legal Medicine
5:S150–S155.

Akbasak B.S., Budowle B., Reeder D., Redman J. & Kline M.C. 2001. Turkish population data with the
CODIS multiplex short tandem repeat loci. Forensic Science International 123:227-229.

Alshamali F., Alkhayat A.I. , Budowle B. & Watson N.D. 2003. Allele frequency distributions and other
population genetic parameters for 13 STR loci in a UAE local population from Dubai. International
Congress Series 1239: 249–258.

Alshamali F.H., Alkhayat A.Q., Budowle B. & Watson N.D..2005. STR population diversity in nine ethnic
populations living in Dubai.Forensic Science International 152: 267–279.

Alvarez M., Chiarello A., Dictamen A., Zambrano Y., Escobar F., Arends A., Marrero M. & Ferreira R.
2008. Genetic population data of 15 autosomal loci from the Central Region of Venezuela. Forensic
Science International: Genetics Supplement Series 1, 303–305.

Alves C., Gusmao L., Damasceno A., Soares B. & Amorim A. 2004. Contribution for an African autosomic
STR database (AmpF/STR Identifiler and Powerplex 16 System) and a report on genotypic
variations. Forensic Science International 139: 201–205.

Asicioglou F., Akyuz F., Cetinkaya U. & Ozbek U. 2002. Allele distribution data of nine short tandem
repeat Loci for Turkish population: D3S1378, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818,
D13S317, D7S820. Forensic Science International 129: 75-77.

Ayub Q., Mansoor A, Ismail M. Khaliq S., Mohyuddin A., Hameed A., Mazhar K., Rehman S., Siddiqi A.,
Papaioannou M., Piazza A., Cavalli-Sforza L.L. & Mehdi Q. 2003. Reconstruction of human
evolutionary tree using polymorphic autosomal microsatellites. Am J Phys Anthropology 122:259–
268.

Balazs I., Neuweiler J., Gunn P., Kidd J., Kidd K. Kuh J. & Mingjun L. 1992. Human population genetic
studies using hypervariable loci.Analysis of Assamese, Australian, Cambodian, Caucasian,Chinese
and Melanesian populations. Genetics 131: 191-198.

-86- 72

Autosomal geneAtuictosmomaarlkgeernset(icSmTaRrske)risn(SaTnRst)hirnoapnothlroopgoilcoagilcralerseesaearrcchh..AAcacsae ssteudsytuindtyheinPrethfeectuPrereoffeRcotduorpei (oThfrRacoed, Gorpeiece)
(Thrace, Greece)

Balloux F. & Lugon-Moulin N. 2002. The estimation of population differentiation with microsatellite
markers. Molecular Ecology 11: 155–165.

Barni F., Berti A., Pianese A., Boccellino A., Miller M.P., Caperna A. & Lago G. 2007. Allele frequencies
of 15 autosomal STR loci in the Iraq population with comparisons to other populations from the
middle-eastern region. Forensic Science International 167: 87–92.

Bashiardes E., Manoli P., Budowle B. & Cariolou M.A. 2000. Data on nine STR loci used for forensic and
paternity testing in the Greek Cypriot population of Cyprus. Forensic Science International 123:225-
226.

Bauchet M., McEvoy B., Pearson L.N. et al. 2007.measuring european population stratification with
microarray genotype data. Am. J. Hum. Genet. 80 (5): 948–956.

Beaumont M.A., K.M. Ibrahim, P. Boursot, & M.W. Bruford. 1998. Measuring genetic distance. In A.
Karp et al. (ed.) Molecular tools for screening biodiversity. p. 315–325. Chapman and Hall, London.

Bhoopat T., Leaungsiyakul T. & Steger H.F. 2006. Forensic value of nine STR loci in Northern Thai. Legal
Medicine (8): 198–200.

Bohonak A.J. 1999. Dispersal, gene flow, and population structure. Q. Rev. Biol. 74: 21-45.

Bosch E., Calafell F., Perez-Lezaun A., Clarimon J., Comas D., Mateu E., Martınez-Arias R., Morera B.,
Brakez Z., Akhayat O., Sefiani A., Hariti G., Cambon-Thomsen A. & Bertranpetit J. 2000. Genetic
structure of north-west Africa revealed by STR analysis. European Journal of Human Genetics
8:360–366.

Bouabdellah M., Ouenzar F., Aboukhalid R., Elmzibri M., Squalli D. & Amzazi S.2008. STR data for the
15 AmpFlSTR Identifiler loci in the Moroccan population. Forensic Science International: Genetics
Supplement Series (1): 306–308.

Bowcock A.M. et al. 1994. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites.
Nature 368: 455–457.

Branco C.C., Pacheco P.R., Cabral R., de Fez L., Peixoto B.R. & Mota-Vieira L. 2006. Autosomal
microsatellite analysis of the Azorean population. International Congress Series 1288: 403– 405.

Brinkmann B., Klintschar M., Neuhuber F., Huhne J. & Rolf B. 1998. Mutation rate in human
microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat. Am. J. Hum. Genet.
62:1408–1415.

Brinkmann B., Junge A., Meyer, E. & Wiegand P. 1998. Population genetic diversity in relation to
microsatellite heterogeneity. Hum. Mutat. 11: 135-144.

Brisighelli F., Capelli C., Boschi I., Garagnani P., Lareu MV., Pascali V.L. & Carracedo A. 2009. Allele
frequencies of fifteen STRs in a representative sample of the Italian population. Forensic Science
International, Genetics 3: e29–e30.

Bruford M.W. & Wayne R.K. 1993. Microsatellites and their application to population genetic studies.
Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 939-943.

Budowle B., Ge J., Chakraborty R., Eisenberg A.J., Green R., Mulero J., Lagace R. & Hennessy L. 2001.
Population variation at the CODIS core short tandem repeat loci in Europeans. Legal Medicine 3:
29-33.

Budowle B. & Chakraborty R. 2011. Population Genetic Analyses of the NGM STR loci. Int J. Legal Med.
125 (1):101-9.

Butler J.M., Schoske R., Vallone P.M., Redman J.W. & Kline M. 2003. Allele frequencies for 15 autosomal
STR loci on U.S. Caucasian, African American, and Hispanic populations. J Forensic Sci, 48, (4),
908-911.

Butler J.M., Buel E., Crivellente F. & McCord B.R. 2004. Forensic DNA typing by capillary
electrophoresis using the ABI Prism 310 and 3100 genetic analyzers for STR analysis.
Electrophoresis, 25: 1397–1412.

Butler J.M. 2006. genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci,
51, 2 doi:10.1111/j.1556-4029.2006.00046.x.

Cakir A.H., Celebioglu A.& Altunbas, S. 2002. STR data for the AmpFlSTR SGM Plus from Marmara
region of Turkey. Forensic Sci. Int. 127: 240-242.

Cakir H.A., Celebioglu A. & Simsek, F. 2002. STR data for the AmpFlSTR SGM Plus from Aegean region
of Turkey. Forensic Sci. Int. 129: 137-139.

Calafell F., Shuster A., Speed W.C., Kidd J.R. & Kidd K.K. 1998. Short tandem repeat polymorphism
evolution in humans. European Journal of Human Genetics 6: 38–49.

Cavalli-Sforza L.L., Menozzi P. & Piazza A. 1994. The History and Geography of Human Genes. Princeton
University Press, NJ, ISBN 0-691-08750-4.

73 -87-

Kally Simitopoulou-Kotzamani Kally Simitopoulou-Kotzamani

Decorte R., Müslümanoglu M.H., Mahieu F., Gilissen A., Cilinger O., Ataman C., Artan S., Xiao F.-X.,
Basaran N. & Cassiman, J. 2000. STR (autosomal and Y-chromosomal) analysis reveals geographic
differences in the Turkish population. Progr. Forensic Genet. 8: 215-217.

Deka R., Shriver M.D., Yu L.M., Ferrell R.E. & Chakraborty R. 1995. Intra- and inter-population diversity
at short tandem repeat loci in diverse populations of the world. Electrophoresis 16:1659-1664.

Deligiannidis P., Triantaphyllidis C., Psaroulis D. & Koyvatsi A. 2006. Forensic evaluation of 13 STR loci
in the Roma population (Gypsies) of Greece. Forensic Sci. International 157:198-200.

Dos Santos S.E.B., Ribeiro-Rodrigues E.M., Ribeiro-dos-Santos A.K.C., Hutz M.H., Tovo-Rodrigues L.,
Salzano F.M. & Callegari-Jacques S.M. 2009. Autosomal STR analyses in native Amazonian tribes
suggest a population structure driven by isolation by distance.Human Biology 81(1):71-88.

Dubey B., Meganathan P.R., Eaaswarkhanth M., Vasulu T.S. & Haque I. 2009. Forensic STR profile of two
endogamous populations of Madhya Pradesh, India. Leg Med 11(1):41-44
Evett I.W., Gill P.D., Lambert J.A., Oldroyd N., Frazier R., Watson S., Panchal S., Connolly A. & Kimpton

C. 1997. Statistical analysis of data for three British ethnic groups from a new STR multiplex. Int J
Legal Med 110:5-9.
Evett I.W., Gill P.D., Scrange J.K., Weir B.S. 1996. Establishing the robustness of short-tandem-repeat
statistics for forensic applications. Am J Hum Genet. 59(6):1398-400.
Excoffier L. 2001. Analysis of population subdivision. p. 271-307. In: Balding D.J., Bishop M., and
Cannings C.,(eds). Handbook of statistical genetics. Chichester (UK): John Wiley & Sons.
Excoffier L., Laval G. & Schneider S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for
population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1:47-50.
Goldstein D.B., Linares A.R., Cavalli-Sforza L.L. & Feldman M.W. 1995. An evaluation of genetic
distances for use with microsatellite loci. Genetics 139: 463-471.
Goldstein D.B., Roemer G.W., Smith D.A., Reich D.E., Bergman A. & Wayne R.K. 1999. The use of
microsatellite variation to infer population structure and demographic history in a natural model
system. Genetics 151: 797–801.

Goodman, S.J. 1997. RST Calc: a collection of computer-programs for calculating estimates of genetic
differentiation from microsatellite data and determining their significance. Mol. Ecol. 6: 881-885.

Hatzaki a., Loukopoulos H. Spiliopoulou H. & Koutselinis A. 1995. A study of five variable number of
tandem repeat (VNTR) loci in the Greek population. Molecular and cellular probes 9: 129-133.

Jeffreys A. J., Wilson V. & Thein S. L. 1985. Hypervariable ‘minisatellite’ regions in human DNA. Nature
314: 67–73.

Jin L., Underhill P.A., Lam C.T., Sun B.,& Cavalli-Sforza L.L. 1996. Reconstructing the phylogeny of
human populations using microsatellite loci. Stanford University School of Medicine, Stanford,
California USA Reprint Notes

Kimpton C.P., Gill P., Walton A., Urquhart A., Millican E.S. & Adams M. 1993. Automated DNA profiling
employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. Genome Res. 3: 13-22.

King R., DiCristofano J, Kouvatsi A., Triantafyllidis C., Scheidel W., Myres N., Lin A.A., Eissautier A.,
Mitchell M., Binder D., Semino O., Novelleto A., Underhill P.A. & Chiaroni J. 2011. The coming of
the Greeks to Provence and Corsica: Y-chromosome models of archaic Greek colonisation of the
western Mediterranean. BMC Evolutionary Biology:11:69

Kondopoulou H., Loftus R., Kouvatsi A. & Triantaphyllidis C. 1999. Genetic studies in 5 Greek population
samples using 12 highly polymorphic DNA loci. Human biology 71: 27-42

Kondopoulou H., Kouvatsi, A. & Triantaphyllidis, C. 2001. Forensic evaluation of 10 STR and two
microsatellite loci in the Greek population. Forensic Sci. Int. 124: 228-230.

Kovatsi L., Parsons T.J., Just R.S. & Irwin J.A. 2006. Genetic variation for 15 autosomal STR loci
(PowerPlex 16).in a population sample from northern Greece. Forensic Sci. International 159:61-63

Luikart G., & P.R. England. 1999. Statistical analysis of microsatellite data. Trends Ecol. Evol. 14: 253-
256.

Michalakis Y. & Excoffier L. 1996. A generic estimation of population subdivision using distances between
alleles with special reference for microsatellite loci. Genetics 142: 1061-1064.

Nei M. 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist 106: 283-392.
Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. Natl. Acad. Sci. 70:3321–3323.
Peakall R. & Smouse P.E. 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for

teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295.
Pereira J., Baltova S., Scheil H.G., Schmidt H.D. & Huckenbeck W. 2009. Allele frequencies for twelve

STR loci in two Bulgarian populations: Bulgarians and Karakachani. Anthrop. Anz. 67:37-44.
Perez-Miranda A., Alfonso-Sánchez M.A., Pena J.A. de Pancorbo M.M. & Herrera R.J. 2005. Genetic

polymorphisms at 13 STR loci in autochthonous Basques from the province of Alava (Spain). Legal

-88- 74

Autosomal geneAtiuctomsoamraklegrense(tiScTmRarsk)erisn(SaTnRtsh)rinopanothlorogpiocloaglicraelsreesaeracrchh.. AAccasaessetusdtyuidn ytheinPrtehfeectPurreeoffeRcotudorpei (oTfhrRaoced, oGpreiece)
(Thrace, Greece)

Medicine 7: 58-61.
Pritchard J.K., Stephensa M. & Donnellya P. 2000. Inference of population structure using multilocus

genotype data. Genetics 155: 945-959.
Rowold D.J. & Herrera R.J. 2005. On human STR sub-population structure. Forensic Science International

151:59–69.
Ruzzante D.E. 1998. A comparison of several measures of genetic distance and population structure with

microsatellite data - bias and sampling variance. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 55: 1-14.
Sahoo S. & Kashyap V.K.2005. Influence of language and ancestry on genetic structure of contiguous

populations: A microsatellite based study on populations of Oriss.BMC Genetics, 6:4,
doi:10.1186/1471-2156-6-4.
Sánchez-Diz, P., Lareu, M.V., Bríon, M., Skitsa, I. & Carracedo, A. 2002. STR data for the AmpFlSTR
Profiler Plus loci from Greece. Forensic Sci. Int. 126: 265-266.
Sánchez-Diza P., Menounos P.G., Carracedoa A. & Skitsa I. 2008. 16 STR data of a Greek population.
Elsevier Ireland Ltd.
Shriver M.D., Jin L., Boerwinkle E., Deka R., Ferrell R.E. & Chakraborty R. 1995. A novel measure of
genetic distance for highly polymorphic tandem repeat loci. Mol. Biol. Evol. 12(5):9 14-920.
Skitsa I., Salas A., Lareu M.V., Carracedo A. 2003. STR-CODIS typing in Greece. Forensic Science
International 137: 104-106.
Slatkin M. 1995. A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics
139::457-462.
Sun J.X., Mullikin J.C., Patterson N. & Reich D.E. 2009. Microsatellites are molecular clocks that support
accurate inferences about history. Mol. Biol. Evol. 26 (5):1017–1027.
Urquhart A., Kimpton C.R. Downes T.J. & Gill R. 1994. Variation in Short Tandem Repeat sequences a
survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers. Int J Leg Med 107: 13-
20.
Witherspoon D.J., Wooding S.,Rogers A.R., Marchani E.E., Watkins W.S., Batzer M.A. & Jorde L.B.
2007. Genetic Similarities Within and Between Human Populations. Genetics 176: 351–359.
Zhivotovsky L.A. & Feldmant M.W. 1995. Microsatellite variability and genetic distances. PNAS
92:11549-11552.
Zhivotovsky L.A., Malyarchuk B.A., Derenko M.V.& Wozniak C. 2009. Developing STR databases on
structured populations: The native South Siberian population versus the Russian population.
Forensic Science International: Genetics 3 e111–e116
Zlojutro M., Apraiz A.G., Roy R. & Palikij, J. 2006. Autosomal STR Variation in a Basque Population:
Vizcaya Province. Human Biol 78:. 599-618.
Κοτζαμάνης Β. 2006. Θράκη, μια Εβδομηκονταετία Έντονων Πληθυσμιακών Ανακατατάξεων (1928 -
2001).Πρακτικά Συνεδρίου. Η Κομοτηνή και ο Ευρύτερος Χώρος. Εταιρεία Παιδαγωγικών
Επιστημών Κομοτηνής. Κομοτηνή.
Ζαφείρης, Κ. Ν. &. Ξηροτύρης N. I. 2002.Οι Roma του Αράτου. Δημογραφική και Γενεαλογική Μελέτη. Στο:
Οι Roma στην Ελλάδα. Ελληνική Εταιρεία Εθνολογίας. Αθήνα’
Ζαφείρης, Κ. Ν. 2006.Συγκριτική Ανάλυση των Βιολογικών και Κοινωνικών Δομών Απομονωμένων
Πληθυσμών του Ν. Ροδόπης .Τμήμα Ιστορίας και Εθνολογίας. Εργαστήριο Ανθρωπολογίας. Δ.Π.Θ.
(Διδακτορική Διατριβή)
Ζαφείρης, Κ. Ν. &. Ξηροτύρης N. I. 2007. H Θράκη και ο πληθυσμός της από την ενσωμάτωσή της στην
Ελλάδα μέχρι σήμερα. Στο Αφιέρωμα στον Πατριάρχη Βαρθολομαίο. Εκδ. Δ.Π.Θ.

75 -89-



A survey on the next generation sequAesunrcvienygontethcehnnexotlgoegnieerastiionn gseeqnueonmcinicg treechsneoalorgcihes in genomic research

Επισκόπηση των τεχνολογιών αλληλούχησης επόμενης γενεάς στη
γονιδιωματική έρευνα

A survey on the next generation sequencing technologies in genomic research

Konstantinos Lilakos

researcher, ANTISEL SA

Abstract

The sequence of nucleic acids has been a field of interplay between chemistry, engineering,
molecular biology and informatics in the quest for information retrieval and functional
association. Following Fred Sanger’s seminal discoveries and applying ground-breaking physical
mapping approaches, reference sequences of model organisms were made available to the
community by means of fluorescence-based DNA sequencers. The quest for wider, easier, faster
and affordable nucleic acid sequence determination has given space to inspiring innovators who
pushed genomic technology to new frontiers giving unprecedented performance and data
generation capacity while setting the pace for innovation and development in the field of genomic
research. Here we attempt a historical review of technical approaches to nucleic sequencing, to
the “next generation” and providing a glimpse into the third generation approached already
breaking ground

Key words:genomic reseach, new technologies, next generation sequencing

Περίληψη

Η ανάλυση των αλληλουχιών του ανθρωπίνου γονιδιώματος, σε συνδυασμό με τη ραγδαία
πρόοδο στις τεχνολογίες των μικροσυστοιχιών (microarrays) και των υπολογιστικών
διαδικασιών, οδήγησε στην αυγή της γονιδιωματικής εποχής της εξατομικευμένης ιατρικής. Ήδη
η επόμενη γενεά της γονιδιωματικής αφορά τεχνολογίες παράλληλης αλληλούχισης σε μαζική
κλίμακα, οι οποίες επιτρέπουν την ανάγνωση αλληλουχιών - πλήρων γονιδιωμάτων,
συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπινου, σε κλάσμα του προηγουμένως απαιτούμενου χρόνου
και κόστους. Πέραν του γονιδιωματικού DNA οι συσκευές αλληλούχισης επόμενης γενεάς
μπορούν να αναγνώσουν τις αλληλουχίες των βάσεων σε μεταγραφείς RNA, να προσδιορίσουν
απλοτύπους (haplotypes) σημειακών πολυμορφισμών, όρια εξονίων (exons), δομικές διαφορές
του γενετικού υλικού καθώς και λειτουργικές τροποποιήσεις χρωματινικών περιοχών. Στο
κείμενο που ακολουθεί γίνεται μια σύντομη ιστορική ανασκόπηση των νέων αυτών τεχνολογιών.

Λέξεις κλειδιά: γονιδιωματική έρευνα, νέες τεχνολογίες, αλληλούχηση επόμενης γενιάς

Εισαγωγή

Οι εργαστηριακές πλατφόρμες αλληλούχισης DNA, αποτελούν κομψή συνέργεια εξελίξεων
στους τομείς της χημείας, μηχανολογίας, μοριακής βιολογίας και της πληροφορικής, βασιζόμενες
στην πρωταρχική ανακάλυψη του Fred Sanger, ο οποίος επέτυχε την αλληλούχιση του
γονιδιώματος μέσω δι-δεοξυνουκλεοτιδίων. Οι πλατφόρμες αλληλούχισης στις οποίες
εφαρμόστηκε η τεχνική ανίχνευσης με φθορίζουσες χρωστικές, σε συνδυασμό με τεχνικές
φυσικής χαρτογράφησης του γονιδιωματικού DNΑ, που επέτρεψαν την ανεύρεση σχέσεων
μεταξύ απομακρυσμένων περιοχών του μακρομορίου αυτού, οδήγησαν στην αλληλούχιση
γονιδιωμάτων αναφοράς σε οργανισμούς-μοντέλα όπως Escherichia coli, Drosophila
melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Arabidopsis thaliana, Zea mays), καθώς
και στην αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αρχής γενομένης το 2005, νέοι τύποι
εργαστηριακών οργάνων αλληλούχισης του DNA διατέθηκαν στην αγορά, διευκολύνοντας τη
ραγδαία αύξηση του ρυθμού παραγωγής γονιδιωματικών δεδομένων και επιτυγχάνοντας μέχρι
και την αλληλούχιση ενός πλήρους ανθρώπινου γονιδιώματος σε λιγότερο από 5 ημέρες.
Παρέχοντας μια ιστορική αναδρομή διά μέσου των τεχνολογικών εξελίξεων που επέτρεψαν τη
ραγδαία ανάπτυξη της γονιδιωματικής θα εξετάσουμε τη λειτουργία και τις εφαρμογές των

77 -91-

Konstantinos Lilakos Konstantinos Lilakos

τεχνολογιών μαζικά παράλληλης αλληλούχισης καθώς και τις πλέον σύγχρονες εξελίξεις του
χώρου.

Τα πρώτα βήματα...

Η αλληλούχιση του DNA, ως σημαντικότερο εργαλείο της γονιδιωματικής αποτελεί μια σχετικά
πρόσφατη εφαρμογή με τις σημαντικότερες τεχνολογικές εξελίξεις να συμβαίνουν τη δεκαετία
του 1950. Το εργαστήριο του Dr Frederick Sanger στο Cambridge ξεκίνησε έρευνες αναφορικά
με την αλληλούχιση DNA στις αρχές του ’70, έχοντας ήδη επιδείξει μεθόδους αλληλούχισης του
RNA στα τέλη της δεκαετίας του 1960. Η κύρια δημοσίευση από τον Sanger και συνεργάτες το
1977 περιγράφει τη μέθοδο «εξαναγκασμού» της DNA πολυμεράσης ώστε να ενσωματώνει
τροποποιημένα νουκλεοτίδια – αντικαθιστώντας το 3’ υδροξύλιο με άτομο υδρογόνου και
καθιστώντας έτσι αδύνατη την περαιτέρω ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων πέραν του
τροποποιημένου. Όταν αναμιγνύονται διαλύματα τα οποία περιέχουν τα 4 νουκλεοτίδια και τα 4
τροποποιημένα διδεοξυνουκλεοτίδια είναι δυνατή η παραγωγή τμημάτων DNA τα οποία
καταλήγουν σε τέτοια τροποποιημένα νουκλεοτίδια. Τα τμήματα αυτά διαχωρίζονται σε πηκτή
πολυακρυλαμιδίου, με την κάθε αντίδραση που περιέχει τροποποιημένα A,C,G,T να
ηλεκτροφορείται σε διπλανές διαδρομές. (Εικ. 1). Ο εντοπισμός των τμημάτων γίνεται με χρήση
σημασμένου με 32P dATP. Στέγνωμα της πηκτής και αυτοραδιογραφία σε φιλμ οδηγεί σε
αποκάλυψη των σημασμένων θραυσμάτων DNA και ανάγνωση της αλληλουχίας από το κάτω
προς το άνω μέρος του φιλμ (μικρά έως μεγαλύτερα τμήματα).

Εικ.1: Περιγραφή της αρχής αλληλούχισης κατά Sanger

Η ανάγνωση των αλληλουχιών με ραδιοϊσότοπα βελτιώθηκε μέσω της ανακάλυψης μεθόδων και
συσκευών σύνθεσης DNA που έκανε δυνατή τη σύνθεση των εκκινητών της διαδικασίας
αλληλούχισης (primers), βελτιωμένων ενζύμων για την ενσωμάτωση των τροποποιημένων
διδεοξυνουκλεοτιδίων (πέραν του θραύσματος Klenow που αρχικά χρησιμοποιήθηκε), χρήση του
32S έναντι 32P-dATP καθώς και χρήση βελτιωμένων πηκτών πολυακρυλαμιδίου. Παρότι έγιναν
-92- 78

A survey on the next generation sequAesnucrvienygontetchehnneoxltoggenieersatinongseeqnuoenmciincgrteecshenaolrocghies in genomic research

προσπάθειες για την περαιτέρω αυτοματοποίηση της μεθόδου αναφορικά με την προετοιμασία -93-
του δείγματος και την ανάγνωση της αυτοραδιογραφίας αυτές δεν ήταν αρκετές ώστε να κάνουν
τη μέθοδο υψηλής παραγωγικότητας.

Βελτιώσεις στις εργαστηριακές τεχολογίες

Μεγάλη αλλαγή στην τεχνολογία αλληλούχισης DNA συνέβη το 1986 όταν η εταιρία Applied
Biosystems Incorporated διέθεσε εμπορικά την πρώτη συσκευή αλληλούχισης DNA με χρήση
φθοριοχρωμάτων, μια εφεύρεση του εργαστηρίου του Leroy Hood στο CalTech. Η
αντικατάσταση του ραδιοσημασμένου dATP με εκκινητές σημασμένους με φθοριοχρώματα
κατήργησε την ανάγκη ξήρανσης και έκθεσης της πηκτής σε αυτοραδιογραφία καθώς και τη
χειροκίνητη ανάγνωση των αλληλουχιών. Χρησιμοποιώντας μια δέσμη LASER για τη γραμμική
σάρωση της πηκτής ηλεκτροφόρησης, τα φθοριοχρώματα διεγείρονται και εκπέμπουν σε ειδικό
μήκος κύματος το οποίο ανιχνεύεται από ειδικό ανιχνευτή, αποκαλύπτοντας έτσι τη θέση των
θραυσμάτων DNA σε πραγματικό χρόνο, κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Ήδη, με τις
αρχικές εκδόσεις της πλατφόρμας έγινε δυνατή η σημαντική αύξηση της παραγωγικότητας και η
ελάττωση λαθών. Ερευνητές παρείχαν περαιτέρω βελτιώσεις στη μέθοδο, κύρια στο ενζυμικό της
σκέλος εισάγοντας τη χρήση θερμοανθεκτικών ενζύμων (Taq polymerase) όπως αυτά
περιγράφηκαν από τον Karry Mullis κατά την περιγραφή της τεχνικής PCR (polymerase chain
reaction) το 1988.

Με την εισαγωγή της επαναλαμβανόμενης κυκλικής ενίσχυσης οριοθετημένων θραυσμάτων του
DNA, ήταν δυνατή η αλληλούχιση ξεκινώντας από εξαιρετικά μικρή ποσότητα DNA, με πολύ
πιο ομοιόμορφα αποτελέσματα. Περαιτέρω εξέλιξη αποτέλεσε η εφεύρεση επισημασμένων
διδεοξυνουκλεοτιδίων (τα οποία εισήλθαν στην αγορά ως terminators). Δεδομένου ότι το
νουκλεοτίδιο τερματισμού μπορούσε να ανιχνευθεί διά μέσου του συνδεδεμένου
φθοριοχρώματος, ήταν δυνατή η συν-ηλεκτροφόρηση και των τεσσάρων αντιδράσεων
τερματισμού σε μια μόνο διαδρομή ηλεκτροφόρησης, κάτι το οποίο κατέστησε δυνατή την
ταυτόχρονη ηλεκτροφόρηση και αλληλούχιση 96 ως και 384 δειγμάτων, αυξάνοντας δραστικά
την παραγωγικότητα και κάνοντας δυνατή την αλληλούχιση γονιδιωμάτων αναφοράς διαφόρων
οργανισμών. Πλέον, ο περιοριστικός παράγοντας αφορούσε μόνο την επίπονη διαδικασία της
προετοιμασίας της πηκτής ηλεκτροφόρησης και της φόρτωσης των αντιδράσεων από το χειριστή.

Η αυτοματοποίηση της διαδικασίας

Το 1998, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά η λύση στη χειροκίνητη αυτή διαδικασία με την
παρουσίαση των πλατφορμών αλληλούχισης MegaBACE από τη Molecular Dynamics και 3700
από την Applied Biosystems. Τα όργανα αυτά έλυσαν το πρόβλημα φορτώματος πηκτών
πολυακρυλαμίδης, χρησιμοποιώντας για το διαχωρισμό των θραυσμάτων πολυμερές υλικό σε
τριχοειδές σωληνάριο (capilary), το οποίο παρείχε διακριτική ικανότητα μικρότερη του ενός
νουκλεοτιδίου. Τα δείγματα ήταν δυνατό να φορτωθούν μέσω ηλεκτροκινητικής έγχυσης
αυτόματα, χωρίς την ανθρώπινη παρέμβαση, απευθείας από το φορέα τους στο τριχοειδές
σωληνάριο. Μετά το διαχωρισμό των θραυσμάτων εντός του τριχοειδούς αναλόγως του μεγέθους
των, το πολυμερές αντικαθίσταται αυτόματα με χρήση αντλιών. Η παρακολούθηση της
ηλεκτροφόρησης γίνεται αυτόματα δεδομένου ότι τα τριχοειδή είναι σταθερά οπότε η διέγερση
και απεικόνιση των σημασμένων μορίων διευκολύνεται και γίνεται ταχύτερη. Η συσκευή 3700
καθώς και η εξέλιξη της ABI3730 αποτέλεσαν τις κύριες πλατφόρμες για την αλληλούχιση των
γονιδιωμάτων του ανθρώπου και του ποντικού μεταξύ άλλων, αλλά επέτρεψαν και πρόσβαση σε
υπηρεσίες αλληλούχισης σε μεγάλο μέρος της επιστημονικής κοινότητας. Τα σύνολα δεδομένων
που αποκτήθηκαν από τις πλατφόρμες τριχοειδούς αλληλούχισης (capillary sequencing)
αποτέλεσαν και το έναυσμα για την ανάπτυξη των τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενεάς
(next generation sequencing).

Περαιτέρω τεχνολογικές καινοτομίες

Έως το 2005, η παραδοσιακή μεθοδολογία αλληλούχισης κατά Sanger είχε ήδη ευρεία εφαρμογή
και επέτρεψε τη φυσική χαρτογράφηση γονιδιωμάτων με αλληλούχιση μικρότερων αρχικά
τμημάτων μέσω κλωνοποίησής τους, ανεύρεσης των επικαλυπτόμενων μερών τους και

79

Konstantinos Lilakos Konstantinos Lilakos

συναρμολόγησης ενός μεγαλύτερου κλώνου μέχρι και την συναρμολόγηση ολόκληρων
χρωμοσωμάτων. Έναντι της μεθοδολογίας αυτής και της ανάγκης για κλωνοποίηση των επί
μέρους τμημάτων DNA, οι τεχνολογίες επόμενης γενεάς δεν έχουν τέτοια απαίτηση. Το DNA
κατακερματίζεται και στα άκρα των θραυσμάτων συνδέονται ενιαίες αλληλουχίες πρόσδεσης
(adapters) με γνωστή αλληλουχία, οπότε και προκύπτει μια βιβλιοθήκη θραυσμάτων με γνωστά
Άκρα, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια για την ενίσχυση (amplification) ή
άλλο χειρισμό τους. Στις προσεγγίσεις αλληλούχισης επόμενης γενεάς, τα δείγματα δεν
παρέχονται όπως παλαιότερα σε φορέα, αλλά η ενίσχυση τους γίνεται επί τόπου σε σταθερό
υπόστρωμα, είτε στην επιφάνεια σφαιριδίου είτε στην επιφάνεια γυάλινης πλάκας για το σύνολο
των μορίων. Η ενίσχυση αυτή έχει ψηφιακή λογική, δεδομένου ότι κάθε μόριο της βιβλιοθήκης
θραυσμάτων οφείλει να αποτελέσει μια ανεξάρτητη θέση διεξαγωγής της αντίδρασης
αλληλούχισης διατηρώντας την λογική της κλωνικής ενίσχυσης. Η ενίσχυση απαιτείται ώστε η
ποσότητα του DNA να είναι επαρκής για τη μέτρηση του σήματος που οδηγεί στην αποκάλυψη
της αλληλουχίας. Το κύριο χαρακτηριστικό της αλληλούχισης επόμενης γενεάς είναι η μαζικά
παράλληλη φύση της, και η οποία αναδεικνύεται από τη διαδικασία που ακολουθείται μετά την
καθήλωση και κλωνική ενίσχυση των θραυσμάτων DNA. Σε αντιδιαστολή με την κατά Sanger
αλληλούχιση, όπου διαχωρίζεται η διαδικασία σήμανσης των μορίων από τη διαδικασία
προσδιορισμού της αλληλουχίας ανά αντίδραση, στη μαζικά παράλληλη αλληλούχιση η συνολική
πορεία αφορά μια επαλληλία συμβάντων:

• προσθήκη του νουκλεοτιδίου / μείγματος νουκλεοτιδίων

• ανίχνευση των νουκλεοτιδίων που ενσωματωθήκαν για κάθε θραύσμα

• έκπλυση των επισημασμένων νουκλεοτιδίων

Ουσιαστικά στις συσκευές αλληλούχισης επόμενης γενεάς, η αντίδραση αλληλούχισης και η
ανίχνευση της γίνονται παράλληλα πάρα σε επαλληλία.

Σαφή διαφορά μεταξύ των τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενεάς και της αλληλούχισης
κατά Sanger συνιστά το μήκος της προς ανάγνωση αλληλουχίας. Στη χημεία κατά Sanger ο
κύριος περιοριστικός παράγοντας αφορούσε τη χημική σύσταση της πηκτής, το μήκος του
τριχοειδούς και τις φυσικοχημικές παραμέτρους ηλεκτροφόρησης. Κατά την αλληλούχιση
επόμενης γενεάς ο κύριος παράγοντας είναι ο λόγος σήματος/θορύβου, ο οποίος διαφοροποιείται
ανάλογα με την προσέγγιση. Ο λόγος αυτός οδηγεί και στο γενικά μικρότερο μήκος ανάγνωσης
στις συσκευές αλληλούχισης επόμενης γενεάς.

Το μικρότερο μήκος ανάγνωσης όμως οδηγεί σε μια ακόμη διαφοροποίηση. Η συναρμολόγηση
των μικρών αλληλουχιών βασίζεται σε ομοιότητες μεταξύ τους, και αυτές μπορούν να
συναρμολογηθούν με τη λογική των αναγνώσεων κατά Sanger. Δεδομένου όμως ότι μια
μικρότερη αλληλουχία μπορεί να ταυτίζεται με περισσότερες από μία περιοχές του γονιδιώματος,
το μικρό μέγεθος είναι δυνατόν να θέτει περιορισμούς ως προς το μήκος της ενιαίας αλληλουχίας
που μπορεί να συναρμολογηθεί. Ο περιορισμός αυτός εξαρτάται επίσης από το μέγεθος και την
πολυπλοκότητα του γονιδιώματος αναφοράς. Ένα γονιδίωμα της τάξης του ανθρωπίνου (περί τα
3Gb με περί τα 48% επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών) ουσιαστικά δεν μπορεί να
συναρμολογηθεί μόνο με μικρές αλληλουχίες από συσκευές αλληλούχισης επόμενης γενεάς. Πιο
αποδοτική είναι η χρήση των αναγνώσεων μικρών τμημάτων αλληλουχιών σε σύγκριση και
συσχέτιση με αλληλουχίες αναφοράς. Βελτιωτικά αναπτύσσονται αλγόριθμοι, οι οποίοι
αξιολογούν την πιθανότητα ταύτισης μιας συγκεκριμένης ανάγνωσης αλληλουχιών με ευρύτερες
περιοχές του γονιδιώματος. Μεγαλύτερη πιθανότητα ταύτισης, ειδικά σε επαναλαμβανόμενες
περιοχές, μπορεί να διασφαλισθεί με τη χρήση μεγαλύτερου μήκους ανάγνωσης, κατεύθυνση την
οποία έχουν ήδη ακολουθήσει πολλές πλατφόρμες αλληλούχισης επόμενης γενεάς. Προς την
βελτίωση της απόδοσης της αλληλούχισης χρησιμοποιούνται επίσης αναγνώσεις και των δυο
άκρων των τμημάτων της βιβλιοθήκης DNA (paired-end) είτε τμημάτων με συγκεκριμένη
απόσταση μεταξύ τους (mate-pair). (εικ. 2)

Στις βιβλιοθήκες paired-end ένα θραύσμα DNA με μήκος λιγότερο του 1 kb φέρει στα άκρα του
διαφορετικές αλληλουχίες πρόσδεσης. Η αλληλούχιση γίνεται αρχικά κατά τη μια φορά και

-94- 80

A survey on the next generation sequAesunrcvienygontethcehnnexotlgoegnieerastiionn gseeqnueonmcinicg treechsneoalorgcihes in genomic research

ακολούθως, με σύνδεση εκκινητή στο άλλο άκρο, κατά τη άλλη φορά. Τα διαβάσματα αυτά
παραμένουν συσχετισμένα κατά ζεύγη κατά τη διάρκεια της αντιστοίχησης με την αλληλουχία
αναφοράς, προσφέροντας έτσι μεγαλύτερη πιθανότητα ταύτισης. Αλγόριθμοι επίσης λαμβάνουν
υπόψιν την απόσταση μεταξύ των αναγνώσεων των μικρών αλληλουχιών αυξάνοντας την
απόδοση κατά την ταύτιση. Στις βιβλιοθήκες mate-pair τα θραύσματα DNA είναι μεγαλυτέρα του
1kb και δεν συνδέονται με δύο νουκλεοτίδια πρόσδεσης στα δύο άκρα. Στην περίπτωση αυτή το
θραύσμα DNA γίνεται κυκλικό εκατέρωθεν μιας αλληλουχίας πρόσδεσης. Το κυκλικό αυτό
μόριο υφίσταται επεξεργασία έτσι ώστε το DNA-στόχος να αφαιρεθεί και να παραμείνουν μόνο
τμήματα τα οποία να είναι πλησίον του μορίου πρόσδεσης, τα οποία όμως απέχουν δεδομένη
γενετική απόσταση. Ο συνδυασμός βιβλιοθηκών paired-end και mate-paired μπορεί να
χρησιμοποιηθεί ώστε να προκύψουν αναγνώσεις αλληλουχιών τμημάτων τα οποία θα μπορούν να
συναρμολογηθούν διατηρώντας συγκριμένη απόσταση στο γονιδίωμα αναφοράς, ξεπερνώντας
έτσι μια ενδογενή αβεβαιότητα λόγω μικρού μήκους ανάγνωσης.

Τα δεδομένα αλληλούχισης από πλατφόρμες επόμενης γενεάς, είναι εκ φύσεως ψηφιακά,
δεδομένου ότι κάθε ανάγνωση προέρχεται από ενίσχυση ενός μορίου της βιβλιοθήκης. Η
ψηφιακή φύση του δεδομένου επιτρέπει την ποσοτική εκτίμηση παρουσίας της αλληλουχίας,
ενδιαφέρουσα παράμετρο κατά τη μελέτη βιολογικών συστημάτων. Για παράδειγμα,
χρωμοσωμικές ενισχύσεις συχνές σε νεοπλασίες μπορούν να μελετηθούν όσον αφορά τον αριθμό
των χρωμοσωμάτων. Ακόμα ο αριθμός διαβασμάτων σε μια βιβλιοθήκη RNA μπορεί να δώσει
πληροφορία για το επίπεδο έκφρασης μεταγράφου. Σε μελέτες πληθυσμών και
μεταγονιδιωματικής είναι δυνατή η αξιολόγηση της εκπροσώπησης ενός γονιδιώματος επί του
συνόλου.

Ο κύριος παράγοντας περιορισμού του μήκους αλληλουχίας στις πλατφόρμες επόμενης γενεάς
δεν είναι οι φυσικοχημικές παράμετροι της ηλεκτροφόρησης όπως στην αλληλούχιση κατά
Sanger, αλλά ο λόγος σήματος / θορύβου. Ανάλογα με την πλατφόρμα, οι παράγοντες θορύβου
ποικίλουν έχοντας επίπτωση και στον τύπο και κατανομή των λαθών στην αλληλούχιση. Η
συνύπαρξη τέτοιων παραγόντων κύρια αναφέρεται ως μοντέλο λάθους και είναι στενά
συνδεδεμένο με τα χαρακτηριστικά και τη χημεία κάθε πλατφόρμας. Τυπικά για την αξιολόγηση
τέτοιων παραμέτρων αλληλουχείται ένα γονιδίωμα αναφοράς και συγκρίνεται με μια αλληλουχία
αναφοράς υψηλής ποιότητας. Με αυτή την προσέγγιση, μπορούν να αναδειχθούν διαφορετικοί
τύποι λάθους και να εξαχθεί το μοντέλο λάθους, διαχωρίζοντας το τυχαίο από το συστηματικό
λάθος. Επίσης είναι δυνατή η ανάδειξη τυχόν παρεκκλίσεων όσον αφορά την εκπροσώπηση
αλληλουχιών που ενδέχεται να σχετίζονται με περιεχόμενο σε G-C, τη χρήση της PCR ή άλλων
ενζυμικών διαδικασιών και να οδηγούν σε συστημικό λάθος κατά την προετοιμασία
βιβλιοθηκών. Χρήση βελτιωμένων ενζύμων ή ελαχιστοποίηση εφαρμογής της PCR μπορεί να
περιορίσει την εμφάνιση τέτοιων παρατηρήσεων.

Πέραν του λάθους οφειλόμενου σε διαδικασίες, πηγές λάθους μπορούν να είναι ενδογενείς στην
πλατφόρμα και αφορούν κύρια το θόρυβο που συσσωρεύεται κατά τη διαδικασία αλληλούχισης,
λόγω κυρίως του μεγάλου αριθμού μορίων τα οποία αλληλουχούνται παράλληλα. Η αύξηση αυτή
του θορύβου είναι και ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει το μήκος ανάγνωσης όταν το σήμα
αληθούς αλληλούχισης επισκιάζεται από συμβάντα λανθασμένης ενσωμάτωσης βάσεων, ή μη
αποδοτική απομάκρυνση των μερών της προηγούμενης αντίδρασης .

Σε μια σύντομη ανασκόπηση των συστημάτων μαζικά παράλληλης αλληλούχισης μπορούμε να
παρατηρήσουμε μια πληθώρα προσεγγίσεων με ποικίλη απήχηση και εφαρμογή, εκ των οποίων
ως εμπορικά διαθέσιμη στην παρούσα περίοδο έχει παραμείνει μια μικρή ομάδα, ενώ πολλές
χημκές διαδικασίες και μεθοδολογικές προσεγγίσεις βρίσκονται τόσο σε φάση απόσυρσης όσο
και διαδικασίας εισόδου στην αγορά.

81 -95-

Konstantinos Lilakos Konstantinos Lilakos

Εικ. 2: Περιγραφή της διαδικασίας κατασκευής βιβλιοθηκών a) paired end b) mate-paired

Η αλληλούχιση επόμενης γενεάς με χρήση αναστρέψιμων μορίων τερματισμού (reversible dye
terminators) αναπτύχθηκε το 2007 από την εταιρία SOLEXA και έγινε εμπορική από την
ILLUMINA. Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης περιλαμβάνει τα συνήθη βήματα όπως
αναφέρθηκαν:

• κατακερματισμό του μεγαλομοριακού DNA
• ενζυμική επεξεργασία
• προσθήκη –Α στα άκρα των θραυσμάτων
• πρόσδεση νουκλεοτιδίων σύνδεσης (adapters)

Τα μόρια της βιβλιοθήκης ακολούθως καθηλώνονται σε ένα γυάλινο φορέα ο οποίος αποτελεί
μέρος συσκευής μικρο-ρευστών, με αυστηρά υπολογισμένη συγκέντρωση ώστε να
δημιουργήσουν τις θέσεις όπου θα συμβεί η αλληλούχιση (clusters). Ακολούθως το ένα τμήμα
του θραύσματος αφαιρείται ενζυμικά ώστε να είναι δυνατή η πρόσδεση εκκινητή ο οποίος μπορεί
να επιμηκυνθεί. Κατά τη διάρκεια της αλληλούχισης, τέσσερα σημασμένα νουκλεοτίδια
προστίθενται και δεσμεύονται κατά την επιμήκυνση του εκκινητή ανάλογα με την αλληλουχία

-96- 82

A survey on the next generation sequAesnurcvienygontethcehnneoxtlogegnieersatiionngseeqnuoenmciincg rteecshenaolrocghies in genomic research

του θραύσματος. Τα νουκλεοτίδια έχουν φραγή του 3’ υδροξυλίου άρα είναι δυνατή η
ενσωμάτωση μόνο ενός νουκλεοτιδίου. Τα μη συνδεδεμένα νουκλεοτίδια αφαιρούνται και γίνεται
η απεικόνιση της επιφάνειας, οπότε και αναδεικνύονται τα νουκλεοτίδια που παρέμειναν σε κάθε
θέση αλληλούχισης. Ακολούθως η φραγή του 3’ –OH αφαιρείται και είναι δυνατή η διεξαγωγή
του επόμενου κύκλου αλληλούχισης. Έτσι είναι δυνατή η επιμήκυνση και ανάγνωση περί των
150 νουκλεοτιδίων ενώ είναι δυνατή και η αλληλούχιση περί των 300 νουκλεοτιδίων ανάλογα με
την πλατφόρμα και τα χημικά αντιδραστήρια. Για την αλληλούχιση του άλλου κλώνου της
βιβλιοθήκης, η συσκευή αφαιρεί τον συντεθέντα κλώνο ενζυμικά και επανασυνθέτει το cluster
μέσω πρόσδεσης της άλλης άκρης του τμήματος της βιβλιοθήκης. Με σύνδεση εκκινητή που
αναγνωρίζει τον άλλο κλώνο είναι δυνατή η αλληλούχιση κατά την άλλη φορά ενώ τα
διαβάσματα από το ίδιο cluster παραμένουν συσχετισμένα στο λογισμικό ώστε να είναι δυνατή η
ανάλυση τους ανά ζεύγη. Με την εξέλιξη της χημείας οδηγούμαστε σε αύξηση της παραγόμενης
αλληλουχίας τόσο με διασφάλιση μεγαλύτερων μηκών ανάγνωσης όσο και με τη δυνατότητα
καθήλωσης μεγαλύτερης συγκέντρωσης μορίων βιβλιοθήκης στην επιφάνεια αλληλούχισης.

Εικ.3: α) Αρχή κατασκευής βιβλιοθηκών για την πλατφόρμα Illumina b) κατασκευή clusters μέσω bridge - amplification
c) αρχή αλληλούχισης με μόρια αναστρέψιμου τερματισμού.

Δραστικά διαφορετική αρχή στην μαζικά παράλληλη αλληλούχιση αποτέλεσε η εμφάνιση
συσκευών οι οποίες προσδιορίζουν την σειρά των νουλεοτιδίων της επιμηκυνόμενης αλληλουχίας
μέσω της μέτρησης αλλαγής του pH, προκαλούμενη από την έκλυση ενός ιόντος υδρογόνου κατά
την πρόσδεση ενός ολιγονουκλεοτιδίου. Η πλατφόρμα παρουσιάστηκε από την εταιρία Ion
Torrent το 2010 και αγοράστηκε από τη Life Technologies. (Εικ. 4.)

83 -97-

Konstantinos Lilakos Konstantinos Lilakos

Εικ. 4. a) δομή της συστοιχίας ημιαγωγού Ion Torrent b) αρχή αλληλούχισης μέσω παρακολούθησης μεταβολής του pH.

Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης περιλαμβάνει κατακερματισμό του DNA και επιδιόρθωση των
άκρων του και πρόσδεση των adapters. Η ενίσχυση των μορίων της βιβλιοθήκης γίνεται με PCR
σε γαλάκτωμα. Σε αυτή τη διαδικασία αναμιγνύεται αυστηρά καθορισμένος αριθμός μορίων
βιβλιοθήκης με σφαιρίδια πολυστυρενίου και αντιδραστήρια για PCR εντός περιβάλλοντος
ελαίου. Η ανάμειξη οδηγεί σε μικύλλια εντός του ελαίου στα οποία περιέχονται μόρια
βιβλιοθήκης και σφαιρίδια σε ιδεατή αναλογία 1:1. Το διάλυμα εισέρχεται σε ειδική συσκευή
οπότε διεξάγεται PCR στο περιβάλλον κάθε μικυλλίου και τα σφαιρίδια καλύπτονται κλωνικά με
αντίγραφα του μορίου βιβλιοθήκης με το οποίο συνυπήρχαν. Κατόπιν ακολουθεί διάρρηξη του
γαλακτώματος και εμπλουτισμός του επακόλουθου μείγματος σφαιριδίων με εκείνα τα σφαιρίδια
τα οποία φέρουν μόρια βιβλιοθήκης. Αυτά αναγνωρίζονται από τη σήμανση τους με βιοτίνη, την
οποία έχει ενσωματώσει η διαδικασία της PCR, η οποία προσδένεται σε παραμαγνητικά
σφαιρίδια στρεπταβιδίνης.

Στη συνέχεια τα σφαιρίδια που φέρουν μόρια βιβλιοθήκης στην επιφάνεια τους καθηλώνονται σε
μικρο-συστοιχίες ημιαγωγών, οι οποίοι φέρουν διατάξεις προσδιορισμού μεταβολών του pH. Οι
μικρο-συστοιχίες φέρουν διάταξη η οποία υποδέχεται το σφαιρίδιο και αποτελεί το χώρο
διεξαγωγής της αντίδρασης επιμήκυνσης παρουσία εκκινητή, πολυμεράσης και επάλληλης
προσθήκης των τεσσάρων φυσικών δεοξυνουκλεοτιδίων. Οι βάσεις προστίθενται σε επαλληλία,
δεδομένου ότι η απουσία σήμανσης δεν επιτρέπει την διαπίστωση της βάσης η οποία προστίθεται
στην σχηματιζόμενη αλληλουχία. Επιτυχής ενσωμάτωση βάσης οδηγεί στην έκλυση ιόντος
υδρογόνου άρα και στη μεταβολή του pH η οποία προσδιορίζεται από την διάταξη του
ημιαγωγού και μετατρέπεται σε ψηφιακό σήμα.

Η απουσία σήμανσης των νουκλεοτιδίων οδηγεί σε αποφυγή οπτικού θορύβου ή ανάγκη
διόρθωσης και διακρίβωσης οπτικών μερών. Η πηγή θορύβου είναι κυρίως η μη απόλυτη
κλωνική ενίσχυση των μορίων βιβλιοθήκης στην επιφάνεια των σφαιριδίων και η γραμμικότητα
ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων και μεταβολής του pH κατά την ανάγνωση μονονουκλεοτιδίων
επαναλήψεων.

Κατά την ανάπτυξη της τεχνολογίας, το ελαττωμένο προφίλ θορύβου έχει δώσει δυνατότητα σε
ανάγνωση μήκους άνω των 400 βάσεων, ενώ η ενδογενής επεκτασιμότητα και δυνατότητα για
συρρίκνωση των ημιαγωγών έχει καταστήσει δυνατή την ανάγνωση δεδομένων άνω των 20Gb σε
χρονικό ορίζοντα κάτω των 4 ωρών. Η ταχύτητα και επεκτασιμότητα της χημικής διεργασίας, σε
συνδυασμό με το χαμηλό κόστος, την αναδεικνύει ως κύριο φορέα ανάπτυξης της αλληλούχισης
επόμενης γενεάς με άμεση μάλιστα την εμπορική διάθεση πλατφόρμας που είναι σε θέση να

-98- 84

A survey on the next generation sequAesnurcvienygontethcehnneoxtlogegnieersatiionngseeqnuoenmciincg rteecshenaolrocghies in genomic research

παράγει 90Gb αλληλουχίας εντός 4 ωρών.

Παρ΄όλη τη ραγδαία ανάπτυξη των τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενεάς, παραμένουν
δυσκολίες αναφορικά με την αλληλούχιση κατόπιν ενίσχυσης της βιβλιοθήκης, κυρίως λόγω
λαθών οφειλόμενων στη δράση της πολυμεράσης, ή ανισορροπίας της ενίσχυσης, οφειλόμενης
στην αλληλουχία των θραυσμάτων DNA.

Επιπλέον, τροποποιήσεις στο DNA, όπως π.χ. η μεθυλίωση, δεν είναι δυνατόν να
προσδιορισθούν, δεδομένου ότι η ενίσχυση απλώς αντιγράφει αλληλουχία βάσεων. Τα παραπάνω
κατέστησαν αναγκαία την ανάπτυξη μεθόδων αλληλούχισης οι οποίες θα επέτρεπαν αναίρεση
των παραπάνω αδυναμιών, με κύρια προσέγγιση την αλληλούχιση DNA σε επίπεδο μοναδιαίου
μορίου. Οι ενδογενείς δυσκολίες παραμένουν κυρίως στο επίπεδο του λόγου σήματος / θορύβου,
καθώς και στην ανάπτυξη αισθητήρων με ευαισθησία τέτοια που να καθιστά ανιχνεύσιμο το
σήμα από την αλληλούχιση ενός μόνο μορίου DNA. Το υψηλό ποσοστό λάθους το οποίο
παρατηρείται στην αλληλούχιση μοναδιαίων μορίων φαίνεται να ξεπερνάται από την παράλληλα
αλληλούχιση μεγάλου αριθμού έτσι ώστε να εξάγεται στατιστικά μεγαλύτερης ακρίβειας
αλληλουχία.

Εικ. 5. Aρχή αλληλούχισης μέσω Zero Mode Waveguides - Pacific Biosciences SMRT

Το 2010 η εταιρεία Pacific Biosciences, διέθεσε εμπορικά μια νέα διάταξη συνδυάζοντας τη -99-
νανοτεχνολογία, τη μοριακή βιολογία και εξαιρετικά ευαίσθητες μεθόδους ανίχνευσης. Η
νανοτεχνολογική προσέγγιση αφορά το Zero Mode Waveguide (ZMW). (εικ.5). Η οπτική αυτή
διάταξη μπορεί να παραχθεί σε συστοιχία πυριτίου σε αριθμούς της τάξης των δεκάδων χιλιάδων.
Απαιτεί επίσης μόρια DNA πολυμεράσης με χαμηλό ρυθμό ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων καθώς
και τη δυνατότητα πολυμερισμού σημασμένων νουκλεοτιδίων. Η διάταξη αποσκοπεί στην
ενσωμάτωση σημασμένων DNA νουκλεοτιδίων και την παρακολούθηση και προσδιορισμό της
ενσωμάτωσης σε πραγματικό χρόνο. Έτσι τα μόρια της βιβλιοθήκης δεσμεύονται σε μόρια DNA
πολυμεράσης και καθηλώνονται στο εσωτερικό των ZMWs. Ακολούθως παρέχονται τα
σημασμένα νουκλεοτίδια ενώ η ενσωμάτωση σε κάθε μόριο παρακολουθείται από οπτική
διάταξη στον πυθμένα της ZMW, όπου και βρίσκεται προσδεδεμένη η πολυμεράση, οπότε και
ανιχνεύεται ο φθορισμός κάθε νουκλεοτιδίου μετά από διέγερση με LASER.

Παρόλη την αλληλούχιση σε πραγματικό χρόνο και κατά μοναδιαίο μόριο, η προετοιμασία της
βιβλιοθήκης ομοιάζει με τις εναλλακτικές πλατφόρμες περιλαμβάνοντας κατακερματισμό και
επιδιόρθωση των άκρων του DNA, και πρόσδεση adapters, οι οποίοι έχουν τη μορφή φούρκας
και οδηγούν σε κυκλικά μόρια DNA. Τα κυκλικά μόρια DNA αναμειγνύονται με τα μόρια της
DNA πολυμεράσης σε συγκεκριμένη αναλογία και καθηλώνονται στην επιφάνεια των ZMWs
(SMRT Cell). Η διάταξη περιλαμβάνει περί τα 150.000 ZMWs οπότε και προστίθενται τα
επισημασμένα νουκλεοτίδια. Ανάλογα με το μέγεθος της DNA βιβλιοθήκης μπορούν να
εξαχθούν αναγνώσεις DNA που υπερβαίνουν τις 10Kb. Λόγω της πιθανότητας μη ενσωμάτωσης

85

Konstantinos Lilakos Konstantinos Lilakos

βάσης στη ZMW ή ποικιλότητας στο χρόνο παραμονής της βάσης προς ενσωμάτωση ώστε να
ανιχνευθεί, το προφίλ λάθους της προσέγγισης παραμένει υψηλό, ενώ λαμβάνοντας υπόψιν
μεγάλο αριθμό αναγνώσεων του ιδίου μορίου μπορεί στατιστικά να βελτιωθεί. Πέραν της
αλληλούχισης DNA έχει αποδειχθεί ότι η ZMW μπορεί να προσδιορίσει την ύπαρξη
μεθυλιωμένων βάσεων στο DNA, την ριβοσωμική επεξεργασία του mRNA , ακόμη και τη δομή
πρωτεϊνικών υποδοχέων.

Συμπερασματικά:

Η ραγδαία πρόοδος των τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενεάς βασιζόμενη στην εντατική
επιστημονική παραγωγή των προηγούμενων δεκαετιών έχει οδηγήσει σε σαφή ελάττωση του
κόστους παραδοσιακών προσεγγίσεων στη γονιδιωματική έρευνα και σε επαναπροσδιορισμό των
χρονικών και τεχνικών απαιτήσεων για την διερεύνηση επιστημονικών ερωτημάτων. Ερευνητικές
συμπράξεις εφαρμόζουν τις τεχνικές εξελίξεις αναφορικά με τη συσχέτιση νόσων με βλάβες του
γονιδιώματος, την ανεύρεση ρυθμιστικών περιοχών των γονιδιωμάτων, την αποκάλυψη των
συμβιώσεων πολύπλοκων μικροβιακών πληθυσμών, καθώς και την ανίχνευση της γενετικής
ποικιλομορφίας και της εξελικτικής πορείας πληθυσμών.

Περαιτέρω εξελίξεις στον τομέα αναμένονται με την είσοδο στην αγορά εναλλακτικών
τεχνολογιών βασιζόμενων στην τεχνολογία των μικροβιακών νανοπόρων, της μοριακής
μικροσκοπίας, ενώ προσπάθειες γίνονται για την περαιτέρω αυτοματοποίηση των εργαστηριακών
εσόδων με σκοπό την αύξηση της παραγωγικότητας και τον καλύτερο έλεγχο ποιότητας.

Η διαθεσιμότητα των τεχνολογιών πέραν της σαφούς αλλαγής στην πειραματική προσέγγιση,
οδηγεί και σε νέο κύκλο προκλήσεων αναφορικά με τις νέες και μεγάλες ανάγκες αποθήκευσης
του όγκου των δεδομένων παραγόμενων από τις πλατφόρμες αλληλούχισης επόμενης γενεάς, τις
ανάγκες υπολογιστικής ισχύος για την ανάλυση των δεδομένων αλλά και την ανάγκη για
ανάπτυξη μεθόδων τόσο αξιολόγησης του τεχνικού λάθους όσο και επιβεβαίωσης του μεγάλου
όγκου δεδομένων που παράγεται. Τέλος, η πρόσβαση σε μέχρι πρότινος μη εφικτά διαθέσιμη
γονιδιωματική πληροφορία εγείρει νέου τύπου βιοηθικά ερωτήματα και ανάγκη για
παρακολούθηση τόσο της ποιότητας όσο και της διαχείρισης της πληροφορίας αυτής.

Βιβλιογραφία

Abubucker S, Segata N, Goll J, Schubert AM, Izard J, et al. 2012. Metabolic reconstruction for
metagenomic data and its application to the human microbiome. PLoS Comput. Biol. 8:e1002358

Barrell BG, Sanger F. 1969. The sequence of phenylalanine tRNA from E. coli FEBS Lett. 3:275–78
Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, et al. 2008. Accurate whole human

genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456:53–59
Bernstein BE, Birney E, Dunham I, Green ED, Gunter C, Snyder M. 2012. An integrated encyclopedia of

DNA elements in the human genome. Nature 489:57–74
Brownlee GG, Sanger F, Barrell BG. 1967. Nucleotide sequence of 5S-ribosomal RNA from Escherichia

coli. Nature 215:735–36
DressmanD, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B. 2003. Transforming single DNAmolecules

into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100:8817–22
Eid J, Fehr A, Gray J, Luong K, Lyle J, et al. 2009. Real-time DNA sequencing from single polymerase
molecules. Science 323:133–38
Fulton LL, Wilson RK. 1994. Variations on cycle sequencing. Biotechniques 17:298–301
Gait MJ, Matthes HW, Singh M, Sproat BS, Titmas RC. 1982. Rapid synthesis of
oligodeoxyribonucleotides. VII. Solid phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides by a continuous
flow phosphotriester method on a kieselguhr–polyamide support. Nucleic Acids Res. 10:6243–54
Gait MJ, Sheppard RC. 1977. Rapid synthesis of oligodeoxyribonucleotides: a new solid-phase
method.Nucleic Acids Res. 4:1135–58
Gevers D, Knight R, Petrosino JF, Huang K, McGuire AL, et al. 2012. The human microbiome project: a
community resource for the healthy human microbiome. PLoS Biol. 10:e1001377
Gnerre S, Maccallum I, Przybylski D, Ribeiro FJ, Burton JN, et al. 2011. High-quality draft assemblies of
mammalian genomes from massively parallel sequence data. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:1513–

-100- 86