i คู่มือปฏิบัติการ วิชา MD622 316 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ พิมพ์ครั้งที่ 4: มิถุนายน พ.ศ. 2565 บรรณาธิการ: อ.ดร.อานันต์ นิธิชานน, ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ, ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์, ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์, อ.ดร.ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์ จัดทำโดย: สาขาวิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น อำเภอเมือง จังหวัดขอนแก่น 40002 โทรศัพท์/โทรสาร: 043-348385, 043-363808 พิมพ์ที่: โรงพิมพ์คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น จังหวัดขอนแก่น 40002 โทรศัพท์: 043-202130-4 โทรสาร: 043-202476 รายการบรรณานุกรมสำเร็จรูป (CIP) ของห้องสมุดคณะแพทยศาสตร์ มข. คู่มือปฏิบัติการวิชา MD622 316 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ / บรรณาธิการ อานันต์ นิธิชานน, สุวิน ว่องวัจนะ, สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์, สกาวรัตน์ กันทะวงศ์, ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์. พิมพ์ครั้งที่ 4. ขอนแก่น : สาขาวิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, 2565. 157 หน้า : ภาพประกอบ 1. จุลชีววิทยา - - คู่มือปฏิบัติการ. (1). อานันต์ นิธิชานน, บรรณาธิการ. (2). สุวิน ว่องวัจนะ, บรรณาธิการ. (3). สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์, บรรณาธิการ. (4). สกาวรัตน์ กันทะวงศ์, บรรณาธิการ. (5). ชล ทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์, บรรณาธิการ. (6). มหาวิทยาลัยขอนแก่น คณะแพทยศาสตร์ สาขาวิชาจุลชีววิทยา. [QW25 ค695จภ 2565]
ii คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 1 คู่มือปฏิบัติการวิชา 362 216 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์เล่มนี้ ได้จัดทำขึ้นใหม่โดยแยก จากคู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาศูนย์วิทยาศาสตร์สุขภาพ มหาวิทยาลัยขอนแก่น มาจัดทำ สำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์โดยเฉพาะ ซึ่งได้มีการปรับปรุงเนื้อหาให้ตรงกับหัวข้อปฏิบัติการที่ปฏิบัติจริงให้ มากที่สุด โดยมีเนื้อหาครอบคลุมทั้งทางด้านเทคนิคพื้นฐาน วิธีการปฏิบัติการทางห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา อิมมูโนวิทยา แบคทีเรียวิทยา ไวรัสวิทยา กิณวิทยา รวมทั้งการวิเคราะห์ยาปฏิชีวนะโดยใช้เทคนิคทางด้านจุล ชีววิทยา คณะผู้จัดทำหวังเป็นอย่างยิ่งว่าคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้ จะช่วยให้นักศึกษาได้รับความรู้และฝึกปฏิบัติการ ต่าง ๆ ได้เป็นอย่างดีรวมทั้งเสริมความรู้ด้านบรรยายให้เข้าใจได้มากยิ่งขึ้น บรรณาธิการ ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ ผศ.ดร.อัญชลีตัตตะวะศาสตร์ ผศ.นเรศ วโรภาสตระกูล รศ.นพ.วัลลภ แก้วเกษ มิถุนายน 2554
iii คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 2 คู่มือปฏิบัติการวิชา 362 216 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์เล่มนี้ ได้ทำการปรับปรุงและ เรียบเรียงใหม่ เพื่อให้มีเนื้อหาสอดคล้องกับเนื้อหาในภาคบรรยายและตรงกับหัวข้อปฏิบัติการที่ปฏิบัติจริงให้ มากที่สุด ซึ่งเนื้อหาในคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้จะครอบคลุมทั้งทางด้านเทคนิคพื้นฐาน วิธีการปฏิบัติการทาง ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา อิมมูโนวิทยา แบคทีเรียวิทยา ไวรัสวิทยา กิณวิทยา รวมทั้งการวิเคราะห์ยา ปฏิชีวนะโดยใช้เทคนิคทางด้านจุลชีววิทยา ในส่วนที่เหมาะสมกับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ ซึ่งทางคณะผู้จัดทำหวังเป็นอย่างยิ่งว่าคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้ จะช่วยให้นักศึกษาได้รับความรู้และ ความสามารถในการปฏิบัติการต่าง ๆ ได้เป็นอย่างดีรวมทั้งใช้เป็นข้อมูลเสริมความรู้ในภาคบรรยายให้เข้าใจได้ มากยิ่งขึ้น บรรณาธิการ ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ ผศ.ดร.อัญชลีตัตตะวะศาสตร์ ผศ.นเรศ วโรภาสตระกูล รศ.นพ.วัลลภ แก้วเกษ อ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ มิถุนายน 2556
iv คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 3 คู่มือปฏิบัติการวิชา MD622 316 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์เล่มนี้ ได้ทำการปรับปรุง และเรียบเรียงใหม่ เพื่อให้มีเนื้อหาสอดคล้องกับเนื้อหาในภาคบรรยายและตรงกับหัวข้อปฏิบัติการที่ปฏิบัติจริง ให้มากที่สุด ซึ่งเนื้อหาในคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้จะครอบคลุมทั้งทางด้านเทคนิคพื้นฐาน วิธีการปฏิบัติการทาง ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา อิมมูโนวิทยา แบคทีเรียวิทยา ไวรัสวิทยา กิณวิทยา รวมทั้งการวิเคราะห์ยา ปฏิชีวนะโดยใช้เทคนิคทางด้านจุลชีววิทยา ในส่วนที่เหมาะสมกับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ ซึ่งทางคณะผู้จัดทำหวังเป็นอย่างยิ่งว่าคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้ จะช่วยให้นักศึกษาได้รับความรู้และ ความสามารถในการปฏิบัติการต่าง ๆ ได้เป็นอย่างดี รวมทั้งใช้เป็นข้อมูลเสริมความรู้ในภาคบรรยายให้เข้าใจได้ มากยิ่งขึ้น บรรณาธิการ ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ อ.ดร.ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์ อ.ดร.คณิน ซาเหลา กรกฎาคม 2563
v คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 4 คู่มือปฏิบัติการวิชา MD622 316 จุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์เล่มนี้ ได้ทำการปรับปรุง และเรียบเรียงใหม่ เพื่อให้มีเนื้อหาสอดคล้องกับเนื้อหาในภาคบรรยายและตรงกับหัวข้อปฏิบัติการที่ปฏิบัติจริง ให้เป็นปัจจุบันมากที่สุด ซึ่งเนื้อหาในคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้จะครอบคลุมทั้งทางด้านเทคนิคพื้นฐาน วิธีการ ปฏิบัติการทางห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ภูมิคุ้มกันวิทยา แบคทีเรียวิทยา ไวรัสวิทยา กิณวิทยา รวมทั้งการ วิเคราะห์ยาปฏิชีวนะโดยใช้เทคนิคทางด้านจุลชีววิทยา ในส่วนที่เหมาะสมกับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ ซึ่งทางคณะผู้จัดทำหวังเป็นอย่างยิ่งว่าคู่มือปฏิบัติการเล่มนี้ จะช่วยให้นักศึกษาได้รับความรู้และ ความสามารถในการปฏิบัติการต่าง ๆ ได้เป็นอย่างดี รวมทั้งใช้เป็นข้อมูลเสริมความรู้ในภาคบรรยายให้เข้าใจได้ มากยิ่งขึ้น บรรณาธิการ อ.ดร.อานันต์ นิธิชานน ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ อ.ดร.ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์ มิถุนายน 2565
vi ระเบียบการเข้าเรียนภาคปฏิบัติการวิชาจุลชีววิทยา การเรียนภาคปฏิบัติการจุลชีววิทยาต้องเกี่ยวข้องกับเชื้อจุลินทรีย์หลายชนิดซึ่งบางชนิดสามารถทำให้ เกิดพยาธิสภาพกับคนได้ เพราะฉะนั้นในการทำปฏิบัติการนักศึกษาจะต้องปฏิบัติตามระเบียบต่อไปนี้ 1. อ่านและทำความเข้าใจวิธีการทดลองในหนังสือคู่มือปฏิบัติการทุกครั้งก่อนเข้าเรียน 2. ต้องใส่เสื้อคลุมสำหรับทำปฏิบัติการทุกครั้ง 3. กระเป๋าหนังสือและสิ่งของที่ไม่เกี่ยวกับการทำปฏิบัติการให้เก็บไว้ในตู้ที่จัดไว้ให้ ห้ามนำมาวางบนโต๊ะ ปฏิบัติการ 4. ต้องเข้าเรียนตามตารางเวลาที่กำหนดให้ตรงเวลาและเซ็นชื่อทุกครั้งที่เข้าห้องปฏิบัติการ หากมีความ จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องขาดเรียน ต้องขออนุญาตอาจารย์ผู้รับผิดชอบรายวิชา 5. ห้ามกิน ดื่ม สูบบุหรี่ หรือ เคี้ยวหมากฝรั่งในห้องปฏิบัติการโดยเด็ดขาด 6. ล้างมือให้สะอาดก่อนและหลังการทำปฏิบัติการ 7. เช็ดโต๊ะปฏิบัติการด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ และผ้าที่จัดไว้ให้ทั้งก่อนและหลังการทำปฏิบัติการ กรณีเชื้อหกหรือ หยดบนโต๊ะหรือพื้น ให้ใช้น้ำยาฆ่าเชื้อราด และแจ้งให้อาจารย์ทราบเพื่อขอคำแนะนำต่อไป 8. อุปกรณ์ที่ใช้แล้ว ให้เก็บให้ถูกต้องดังนี้ 8.1 ห้ามวางอุปกรณ์ที่มีเชื้อปนเปื้อนบนโต๊ะปฏิบัติการ 8.2 ปิเปต, สไลด์ ที่ปนเปื้อนให้ทิ้งในถังน้ำยาฆ่าเชื้อ 8.3 Loop, needle ที่มีเชื้อปนเปื้อนต้องทำให้ปราศจากเชื้อก่อน 8.4 ห้ามทิ้งของเหลวที่มีเชื้อปนเปื้อนลงในอ่างน้ำ 8.5 ของที่จะทิ้งลงถังขยะต้องทิ้งให้ถูกต้อง ขยะติดเชื้อต้องทิ้งในถังขยะติดเชื้อเท่านั้น 8.6 อุปกรณ์ประจำโต๊ะให้เก็บไว้ในลิ้นชักโต๊ะ 8.7 อุปกรณ์อื่น ๆ นำไปไว้บนรถเข็นหรือภาชนะที่จัดไว้ให้ 9. ในกรณีที่การทดลองต้องบ่มเชื้อในตู้บ่มเชื้อ นักศึกษาต้องมาติดตามผลการทำปฏิบัติการทุกครั้ง เมื่อ บันทึกผลแล้วให้นำอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมดออกจากตู้บ่มเชื้อ และทิ้งในภาชนะที่จัดไว้ให้ 10. ต้องทำรายงานผลการปฏิบัติการและส่งรายงานตามเวลาที่กำหนด ห้ามลอกรายงานผลการทดลอง
vii รายนามคณาจารย์สาขาวิชาจุลชีววิทยา (ณ วันที่ 1 มิถุนายน 2565) 1. ผศ.ดร.วิเศษ นามวาท Wises Namwat (Ph.D.) รักษาการหัวหน้าสาขาวิชาฯ 2. ผศ.ดร.อุมาพร ยอดประทุม Umaporm Yordpratum (Ph.D.) รักษาการรองหัวหน้าสาขาวิชาฯ 3. ศ.พญ.ทิพยา เอกลักษณานันท์ Tipaya Ekalaksananant (M.D.) 4. รศ.พญ.จุฬาพรรณ อิ้งจะนิล Chulapan Engchanil (M.D.) 5. รศ.ดร.โสรัจสิริ เจริญสุดใจ Sorujsiri Chareonsudjai (Ph.D.) 6. รศ.ดร.เกียรติไชย ฟักศรี Kiatichai Faksri (Ph.D.) 7. ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ Suwin Wongwajana (M.D.) 8. ผศ.ดร.กัญญลักษณ์ ชัยคำภา Kunyaluk Chaicumpar (Dr.Med) 9. ผศ.ดร.ฐิติมา นุตราวงศ์ Thitima Nutravong (Dr.PH) 10. ผศ.ดร.กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์ Kittipan Samerpitak (Ph.D.) 11. ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ Supranee Phanthanawiboon (Ph.D.) 12. ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ Sakawrat Kanthawong (Ph.D.) 13. อ.ดร.คณิน ซาเหลา Kanin Salao (Ph.D.) 14. อ.ดร.ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์ Chonlatip Pipattanaboon (Ph.D.) 15. อ.ดร.สิรินาถ อารมย์เสรี Sirinart Aromseree (Ph.D.) 16. อ.ดร.นพ.มารุต เลาหวิโรจน์ Marut Laohaviroj (Ph.D.) 17. อ.ดร.วิสิฐ์ศักดิ์ โภคสวัสดิ์ Wisitsak Phoksawat (Ph.D.) 18. อ.ดร.อานันต์ นิธิชานน Arnone Nithichanon (Ph.D.) 19. อ.ดร.อรรถวิทย์ ศิริโชติ Auttawit Sirichoat (Ph.D.)
viii สารบัญ รายการ หน้า คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 1 ii คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 2 iii คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 3 iv คำนำในการพิมพ์ครั้งที่ 4 v ระเบียบการเข้าเรียนภาคปฏิบัติการวิชาจุลชีววิทยา vi รายนามคณาจารย์สาขาวิชาจุลชีววิทยา (ณ วันที่ 1 มิถุนายน 2565) vii 1. กล้องจุลทรรศน์ เครื่องมือหลัก และเทคนิคในการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา (Microscope, basic apparatus and common techniques in microbiological laboratory work) - ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์และ อ.ดร.คณิน ซาเหลา 1 2. การเจือจางแบบเป็นชุด และปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี (Serial dilution and Antigen-Antibody reaction) - ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ และ อ.ดร.คณิน ซาเหลา 25 3. รูปร่างและโครงสร้างของแบคทีเรีย (Morphology and structure of bacteria) - ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์และ ผศ.ดร.ฐิติมา นุตราวงศ์ 43 4. การเก็บเชื้อจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมและสิ่งส่งตรวจทางคลินิก (Collection of environmental microorganisms and clinical specimens) - อ.ดร.ชลทิพย์ พิพัฒนาบูรณ์และ รศ.ดร.โสรัจสิริ เจริญสุดใจ 55 5. การทำลายเชื้อจุลินทรีย์และการทดสอบความไวของเชื้อจุลินทรีย์ต่อยาต้านจุลชีพ (Destruction of microorganisms and drug susceptibility test) - ผศ.ดร.อุมาพร ยอดประทุม และ อ.ดร.อรรถวิทย์ ศิริโชติ 71 6. เมแทบอลิซึมของแบคทีเรียและเชื้อแบคทีเรียก่อหนองรูปร่างกลม (Metabolism of bacteria and pyogenic cocci) - ผศ.ดร.วิเศษ นามวาท และ ผศ.ดร.อุมาพร ยอดประทุม 85 7. แบคทีเรียก่อโรคชนิดแท่งแกรมลบ และแบคทีเรียปลีกย่อยชนิดอื่น ๆ (Pathogenic gram-negative bacilli and miscellaneous bacteria) - อ.ดร.อานันต์ นิธิชานน และ ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ 109 8. การจำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรีย (Bacterial identification) - ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์และ ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ 133 9. รูปร่างและโครงสร้างของเชื้อรา (Morphology and structure of fungi) - ผศ.ดร.กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์และ อ.ดร.วิสิฐ์ศักดิ์ โภคสวัสดิ์ 139 10. ผลจากการติดเชื้อของไวรัส (Effects of virus on cells) - ศ.พญ.ทิพยา เอกลักษณานันท์และ อ.ดร.สิรินาถ อารมย์เสรี 149 ภาคผนวก - ขั้นตอนในการเรียนการสอนแบบกลุ่มย่อย (Case): Problem based learning (PBL) 157 ภาคผนวก - ขั้นตอนในการเรียนการสอนแบบกลุ่มย่อย (Case): Team based learning (TBL) 158
1 ปฏิบัติการบทที่ 1 กล้องจุลทรรศน์ เครื่องมือหลัก และ เทคนิคในการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา (Microscope, basic apparatus and common techniques in microbiological laboratory work) ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ อ.ดร.คณิน ซาเหลา บทปฏิบัติการนี้มีวัตถุประสงค์ให้นักศึกษามีความคุ้นเคยกับเครื่องมือหลักและได้ฝึกหัดเทคนิคที่ใช้บ่อย ๆ ในการปฏิบัติงานทางด้านจุลชีววิทยา เนื้อหาภายในบท แบ่งออกได้เป็น 3 หัวข้อ คือ 1. กล้องจุลทรรศน์ 2. เครื่องมือหลักในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา 3. เทคนิคในการปฏิบัติงานทางด้านจุลชีววิทยา แต่ละเรื่องจะมีคำอธิบายและภาพประกอบเพื่อช่วยให้เกิดความเข้าใจในเนื้อหามากขึ้น นักศึกษาควร อ่านให้เข้าใจก่อนลงมือทำการทดลองและเมื่อมีข้อสงสัยควรซักถามจากอาจารย์ผู้ควบคุมการปฏิบัติการ กล้องจุลทรรศน์ (The Microscope) เนื่องจากวิชาจุลชีววิทยาเป็นวิชาที่ศึกษาเกี่ยวกับสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กมาก ที่เรียกว่าเชื้อจุลินทรีย์ (Microorganism) ซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าต้องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์จึง เป็นเครื่องมือที่สำคัญมากที่สุดอย่างหนึ่งสำหรับผู้ที่จะศึกษาทางจุลชีววิทยา และจำเป็นอย่างยิ่งที่ทุกคนจะต้อง มีความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ และสามารถใช้กล้องจุลทรรศน์ได้เองอย่างถูกต้อง กล้องจุลทรรศน์แบ่งอย่างกว้าง ๆ ตามแหล่งกำเนิดแสงได้ 2 ประเภท คือ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (light microscope) และกล้องจุลทรรศน์อีเลคตรอน (electron microscope)
2 I. กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Light microscope) 1. Bright - field microscope กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ เป็นกล้องที่พบเห็นได้ทั่วไปตามห้องเรียนหรือห้องปฏิบัติการต่าง ๆ มีลักษณะ สำคัญคือเมื่อส่องดูจะเห็นพื้นภาพ (background) เป็นสีขาว ส่วนตัวเชื้อจะเห็นเป็นสีเข้มกว่า กล้องจุลทรรศน์ ชนิดนี้แบ่งออกได้เป็น 2 แบบ คือ 1. Simple microscope เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ประกอบด้วยเลนส์ขยายภาพ (objective) เพียงอันเดียวหรือชุดเดียว ภาพที่ได้เป็นภาพเสมือนหัวตั้งขนาดใหญ่เกิดไกลกว่าวัตถุ เนื่องจากกล้อง ชนิดนี้มีองค์ประกอบง่ายและมีกำลังขยายต่ำ จึงเรียกว่า simple microscope การใช้กล้องชนิดนี้ จะต้องให้วัตถุที่จะตรวจดูอยู่ในระยะโฟกัสของเลนส์และตาควรอยู่ใกล้เลนส์ด้วย 2. Compound microscope เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่เราใช้กันมากในปัจจุบันซึ่ง ประกอบด้วยเลนส์2 ชุด คือ เลนส์ชุดแรกอยู่ใกล้วัตถุ เรียกว่าเลนส์ใกล้วัตถุ (objective lens) ส่วน เลนส์อีกชุดหนึ่งอยู่ใกล้ตา เรียกว่าเลนส์ใกล้ตา (ocular lens หรือ eyepieces) ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง กล้องจุลทรรศน์ชนิด Compound microscope โดยทั่วไปจะประกอบด้วยระบบการทำงาน 4 ระบบ คือ ระบบโครงสร้างรองรับส่วนประกอบอื่น ระบบแสง ระบบขยายภาพและระบบปรับภาพ 1. ระบบโครงสร้างรองรับส่วนประกอบอื่น (Supporting frame work) เป็นโครงสร้างของกล้องจุลทรรศน์ที่รองรับชิ้นส่วนต่างๆ ของกล้องประกอบด้วย 1.1 Base ฐานของกล้องมีรูปร่างกลม เหลี่ยม รูปเกือกม้า ทำให้กล้องตั้งอยู่ได้ไม่ล้มเอียงหรือพลิก คว่ำ 1.2 Arm เป็นส่วนที่ใช้จับเพื่อใช้ในการเคลื่อนย้ายกล้อง ปลายด้านล่างจะยึดติดกับฐานกล้อง ปลาย ด้านบนจะติดอยู่กับระบบขยายภาพ 1.3 Stage เป็นแป้นสี่เหลี่ยมหรือกลม สำหรับรองรับสไลด์ตัวอย่างวัตถุที่จะตรวจ ตรงกลางมีรูกลม ให้แสงผ่านได้ 1.4 Mechanical stage ส่วนประกอบนี้อยู่ติดบน stage ของกล้อง ทำหน้าที่ช่วยยึดและช่วยเลื่อน สไลด์ไปมาได้สะดวก และแน่นอนกว่าการใช้มือ ซึ่งบางกล้องไม่มีเครื่องมือชนิดนี้ 2. ระบบแสง (Illuminating system) ระบบแสงจัดเป็นระบบที่สำคัญระบบหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์เพราะเป็นตัวช่วยในขบวนการจัดภาพ หรือสร้างภาพ ภาพของวัตถุจะปรากฏให้เห็นในกล้องได้ เมื่อวัตถุนั้นมีขนาดไม่เล็กกว่าครึ่งหนึ่งของความยาว ของคลื่นแสงที่ใช้กับกล้องจุลทรรศน์นั้น แสงที่ใช้กับกล้องจุลทรรศน์ทั่วไปจะเป็นแสงสีขาว (White light) มี ช่วงความยาวคลื่นแสงระหว่าง 4,000 - 7,000 Ao ความยาวของคลื่นแสงขนาดนี้เมื่อนำไปใช้กับกล้องจะไม่เป็น
3 อันตรายต่อสายตาผู้ใช้ อุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องกับระบบแสงของกล้องจุลทรรศน์จะอยู่ใต้แป้นรองรับ (ยกเว้นกล้อง ชนิด inverted microscope) ทำหน้าที่ควบคุมทิศทางและความเข้มของแสง อุปกรณ์ที่ควบคุมระบบแสง ได้แก่ 2.1 แหล่งของแสง (Light source) การที่กล้องรุ่นใหม่ ๆ มีกำลังขยายมากขึ้นนั้นจำเป็นต้องให้มี การรวมแสงที่จะส่งผ่านขึ้นไปสู่เลนส์ได้มากขึ้นด้วย การรวมแสงอาจใช้กระจกเงาสะท้อนแสงหรือกระจกเว้า เพื่อรวมแสงส่งขึ้นไปหรือใช้หลอดไฟส่องขึ้นไปโดยตรงก็ได้ แหล่งของแสงอาจเป็นแสงสว่างจากดวงอาทิตย์ หรือแสงจากหลอดไฟฟ้าก็ได้ 2.2 Condenser ทำหน้าที่รวมแสงที่ผ่านเข้ากล้องเพื่อให้ได้ค่า numerical aperture (NA) ตาม ต้องการส่วนใหญ่ประกอบด้วยเลนส์2 อัน ปรับเลื่อนขึ้น-ลงได้ มีหน้าที่กระจายลำแสงเพื่อให้ลำแสงจากวัตถุ ผ่านเข้ากล้องโดยมีค่าของมุม U ที่เหมาะสม ทำให้ได้ค่า NA ตามต้องการ 2.3 Iris diaphragm ทำหน้าที่ควบคุมปริมาณของแสงที่จะผ่านไปในกล้องให้มากหรือน้อยตามความ ต้องการ 3. ระบบขยายภาพ (Magnification system) เป็นระบบที่สำคัญอีกระบบหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์ ระบบนี้ช่วยทำให้เกิดภาพขยายมากน้อยตาม ต้องการ ระบบนี้ประกอบด้วยส่วนต่าง ๆ คือ 3.1 Revolving nosepiece เป็นแป้นกลมติดอยู่ที่ปลายล่างของ body tube หรือปลายด้านบนของ arm สามารถหมุนไปมาได้ และเป็นที่ติดตั้งของเลนส์ใกล้วัตถุ (objective lens) ซึ่งมีกำลังขยายต่าง ๆ กัน 3.2 Objective lens เป็นชุดของเลนส์ที่อยู่ใกล้วัตถุ ทำหน้าที่ขยายภาพครั้งแรกของวัตถุที่นำมา ตรวจดู กล้องจุลทรรศน์โดยทั่วไปจะมีเลนส์ใกล้วัตถุ 4 อัน ติดอยู่บน revolving nosepiece บนเลนส์ใกล้ วัตถุแต่ละอันจะมีตัวเลขบอกกำลังขยาย และค่าของ N.A. เช่น ที่เลนส์กำลังขยายต่ำ (low power objective lens) ตัวเลข 10/0.25 แสดงว่ามีกำลังขยาย 10 เท่าและมีค่า NA = 0.25 เลนส์กำลังขยายสูง (high power objective lens) มักจะมีตัวเลข 40/0.65 และเลนส์กำลังขยายสูงสุด (oil immersion objective lens) มักจะมีตัวเลข 100/1.25 หรือ 100/1.30 ส่วนเลนส์กำลังขยายต่ำสุด (ซึ่งไม่นิยมใช้ในการดูแบคทีเรีย) มักจะมี ตัวเลข 4/0.10 กำกับอยู่
4 Numerical aperture (N.A.) เป็นตัวเลขแสดงประสิทธิภาพของเลนส์ใกล้วัตถุ เลนส์ที่มีค่า N.A. มาก จะมีประสิทธิภาพสูง สามารถตรวจดูรายละเอียดของวัตถุที่นำมาดูได้ดีกว่าเลนส์ที่มีค่า N.A. น้อย ค่า N.A. ของเลนส์ใกล้วัตถุคำนวณได้จากสูตร N.A. = n Sin U เมื่อ n = ค่าดรรชนีหักเหของแสง (refractive index) ของมัชฌิมที่อยู่หน้าเลนส์ใกล้วัตถุ U = ครึ่งของมุมที่แสงผ่านวัตถุเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุ (ดังภาพที่ 1.1) ภาพที่1.1 แสดงมุมที่แสงผ่านวัตถุเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุ จากรูป แสดงค่า Sin U = AB AO จากสูตรจะเห็นได้ว่า เราสามารถเพิ่มค่าของ N.A. ได้โดยการเพิ่มค่า n หรือ Sin U หรือทั้งสองอย่าง อย่างไรก็ตาม การเพิ่มค่า N.A. จะทำได้จำกัด เพราะค่า n จะเพิ่มสูงสุดได้ประมาณ 1.5 (ดังตารางที่ 1.1) และ Sin U จะมีค่าไม่เกิน Sin 90o ซึ่งมีค่าเท่ากับ 1 เพราะฉะนั้น N.A. ของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจะมีค่าสูง ที่สุดประมาณ 1.5 ในการใช้กล้องจุลทรรศน์ ถ้ามัชฌิมที่อยู่หน้าเลนส์ใกล้วัตถุเป็นอากาศ แสงที่ผ่านสไลด์แก้วออกสู่อากาศ จะหักเห เนื่องจากดรรชนีหักเหของมัชฌิมทั้งสองคือสไลด์แก้วและอากาศต่างกัน ดังนั้น ถ้าเราปรับมัชฌิมที่อยู่ หน้าเลนส์ใกล้วัตถุให้มีดรรชนีหักเหของแสงให้เท่ากันหรือใกล้เคียงกับสไลด์แก้ว การหักเหของแสงจะไม่ เกิดขึ้นหรือเกิดน้อยลง ทำให้เห็นภาพดีขึ้น การปรับทำได้โดยหยดสารประกอบประเภทน้ำมันที่มีค่าดรรชนีหัก เหใกล้เคียงกับแก้ว เช่น Cedar oil หรือ immersion oil เชื่อมระหว่างสไลด์กับ Oil immersion objective จะทำให้ได้ค่าของ N.A. เพิ่มขึ้น
5 ตารางที่ 1.1 ค่าดรรชนีหักเหของแสงในมัชฌิมต่าง ๆ ที่ 25oC มัชฌิม ดรรชนีหักเหของแสง อากาศ น้ำ แก้ว Mineral (paraffin) oil Cedar wood oil Sandal wood Shillaber’s immersion oil Balsam Crown oil 1.00 1.33 1.51 1.47 1.51 1.51 1.52 1.53 1.55 3.3. Eyepieces หรือ Ocular lens เป็นชุดของเลนส์ที่อยู่ใกล้ตา สวมอยู่ที่ปลายด้านบนของ ocular tube (body tube) กล้องบางชนิดมี eyepieces อันเดียวเรียกว่ากล้องตาเดียว (Monocular microscope) บางชนิดมีเลนส์ใกล้ตาสองอัน ซึ่งเรียกว่า กล้องสองตา (Binocular microscope) เลนส์ใกล้ตา โดยทั่วไปจะมีกำลังขยาย 10 เท่า และเขียนบอกไว้ว่า 10 การเลือกใช้กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตาให้เหมาะสม กับเลนส์ใกล้วัตถุแต่ละอัน มีข้อจำกัด คือ ถ้าเลือกเลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยายไม่เหมาะสมกับเลนส์ใกล้วัตถุแล้ว จะทำให้เห็นภาพไม่ชัดเจนหรือไม่เห็นเลย การเลือกใช้กำลังขยายมากที่สุดของเลนส์ใกล้ตาให้เหมาะสมกับ เลนส์ใกล้วัตถุแต่ละอัน ทำได้โดยคำนวณจากสูตร กำลังขยายมากที่สุดของเลนส์ใกล้ตา = 1,000 N.A.ของเลนส์ใกล้วัตถุ กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ ตัวอย่าง หากำลังขยายสูงสุดของเลนส์ใกล้ตาของกล้องจุลทรรศน์ซึ่งมีเลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายดังนี้ (ก) 10X, N.A. 0.25 (ข) 100X, N.A. 1.25 ก. เลนส์ใกล้วัตถุขนาด 10X ใช้กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตาได้มากที่สุด = 1,000 0.25 = 25 เท่า 10 ข. เลนส์ใกล้วัตถุขนาด 100X ใช้กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตาได้มากที่สุด = 1,000 1.25 = 12.5 เท่า 100
6 จากตัวอย่างแสดงว่า กำลังขยายและค่า N.A. ของเลนส์ใกล้วัตถุเป็นปฏิภาคกลับกับกำลังขยายของเลนส์ ใกล้ตา กล่าวคือ ถ้าเลนส์ใกล้วัตถุมีกำลังขยายต่ำ (ค่า N.A.น้อย) จะใช้เลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยายสูง (ข้อ ก.) แต่ถ้าเลนส์ใกล้วัตถุนี้กำลังขยายสูง (ค่า N.A. มาก) จะใช้เลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยายต่ำ (ข้อ ข.) ขนาดขยายของภาพนิ่งที่ปรากฏหรือกำลังขยายรวมคำนวณได้จากสูตร กำลังขยายรวม = กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ กำลังขยายของเลนส์ใกล้ตา 3.4 Body tube หรือ Ocular tube เป็นชิ้นส่วนของกล้องที่ปลายด้านล่างมี revolving nosepiece ติดอยู่ และปลายด้านบนเป็นที่รองรับของเลนส์ใกล้ตา โดยปกติจะมีความยาวประมาณ 160 ม.ม. ประสิทธิภาพของกล้อง (Resolving power หรือ Resolution) ประสิทธิภาพของกล้อง หมายถึงความสามารถของกล้องจุลทรรศน์ที่จะแยกภาพของจุด 2 จุด ที่อยู่ใกล้ กันมากที่สุดออกจากกันได้อย่างชัดเจนหรือหมายถึงความสามารถของกล้องจุลทรรศน์ที่จะตรวจดูวัตถุขนาด เล็กที่สุดได้เท่าไร ค่า resolution นี้คำนวณได้จากสูตร r = 0.61 N.A. of objective lens เมื่อ r = resolving power หรือ resolution = ความยาวของคลื่นแสงที่ใช้กับกล้องจุลทรรศน์ N.A. = ประสิทธิภาพของเลนส์ใกล้วัตถุ ตัวอย่าง กล้องจุลทรรศน์กล้องหนึ่งมีเลนส์ใกล้วัตถุ มีค่า N.A. = 1.25 แสงที่ใช้กับกล้องมีความยาวคลื่น แสง 4,000 Ao (violet) กล้องจุลทรรศน์นี้จะสามารถตรวจดูวัตถุมีขนาดเล็กที่สุดได้เท่าไร r = 0.61 4,000 1.25 = 1,952 Ao หรือประมาณ 0.2 ไมครอน ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์นี้ตรวจดูวัตถุได้เล็กที่สุดประมาณ 0.2 ไมครอน กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงธรรมดาโดยทั่วไปจะมีค่า Resolution ประมาณ 0.2 ไมครอน หรือประมาณ ครึ่งหนึ่งของความยาวของคลื่นแสงที่สั้นที่สุดที่ใช้กับกล้องจุลทรรศน์ โดยไม่ทำอันตรายต่อสายตาผู้ใช้ (4000 A o ) Working distance หมายถึงระยะทำงานของเลนส์ใกล้วัตถุ เป็นระยะห่างระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุกับ วัตถุบนสไลด์ที่นำมาตรวจดูหลังจากได้โฟกัสเห็นภาพวัตถุนั้นชัดเจนดีแล้วระยะการทำงานจะแตกต่างกันไป ตามกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ ถ้าเลนส์ใกล้วัตถุมีกำลังขยายต่ำ ระยะทำงานจะยาว แต่ถ้าเลนส์ใกล้วัตถุมี กำลังขยายสูง ระยะการทำงานจะสั้น ฉะนั้นในการโฟกัสหาภาพวัตถุที่นำมาตรวจดูหากใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายสูงแล้วจะต้องมีความ ระมัดระวังเป็นพิเศษ มิฉะนั้นเลนส์ใกล้วัตถุอาจไปกระทบกับสไลด์ทำให้เกิดความเสียหายได้
7 4. ระบบการปรับภาพ (Adjustment system) เป็นระบบที่ใช้ปรับระยะวัตถุเพื่อให้เกิดภาพขึ้นอย่างชัดเจน ประกอบด้วยปุ่มปรับแบบหยาบและแบบ ละเอียด ดังนี้ 4.1 ปุ่มหมุนปรับภาพอย่างหยาบ (Coarse adjustment) เป็นส่วนที่ทำหน้าที่เลื่อนลำกล้อง (body tube) หรือ stage ขึ้น-ลง เพื่อปรับระยะโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุ ให้ได้ภาพที่ชัดเจนปุ่มหมุนอย่างหยาบ นี้จะเลื่อนลำกล้องหรือ stage ให้เคลื่อนที่ไปตามร่องเฟืองได้ค่อนข้างเร็ว ทำให้สามารถปรับและเปลี่ยนโฟกัส ได้อย่างหยาบ ๆ 4.2 ปุ่มหมุนปรับภาพอย่างละเอียด (Fine adjustment) เป็นส่วนที่ทำหน้าที่เช่นเดียวกับปุ่มหมุน อย่างหยาบ แต่ทำให้ตัวกล้องหรือ stage เคลื่อนที่ไปได้อย่างช้า ๆ และเปลี่ยนระยะทางทีละน้อย ซึ่งทำให้ปรับ จุดโฟกัสได้ละเอียดและได้ภาพที่ชัดเจนยิ่งขึ้น การเคลื่อนที่ของปุ่มหมุนอย่างละเอียดมีขีดจำกัดเมื่อถึงจุดหนึ่ง จะไม่สามารถหมุนได้อีกต่อไป ถ้าหมุนถึงจุดนี้จะต้องหยุดและเปลี่ยนไปใช้ปุ่มหมุนอย่างหยาบ อย่าพยายาม หมุนปุ่มหมุนอย่างละเอียดต่อไปอีกเมื่อถึงขีดจำกัดนั้นแล้ว เพราะจะทำให้ฟันเฟืองเสียหายได้
8 2. Dark field microscope กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ จะมีองค์ประกอบส่วนใหญ่เหมือนกับกล้องจุลทรรศน์ bright field แบบ compound microscope ส่วนที่ต่างกันคือเลนส์รวมแสง (dark-field condenser) มีแผ่นทึบแสง (dark ground stop) กั้นไว้ ทำให้แสงผ่านเฉพาะขอบนอกเป็นรูปวงแหวนขึ้นไปยังวัตถุ แสงจาก dark field condenser ที่ผ่านวัตถุแล้วจะสะท้อนออกไปโดยไม่ผ่านเข้าเลนส์ใกล้วัตถุ ดังนั้น ส่วนที่ไม่มีวัตถุหรือรอยขีด ข่วนใด ๆ จะไม่สะท้อนแสงและปรากฏเป็นฉากดำ ในขณะที่วัตถุซึ่งดูดซับแสงไว้แล้วจะสะท้อนแสงผ่านเข้า เลนส์ใกล้วัตถุและปรากฏเป็นรูปร่างที่สว่างท่ามกลางพื้นภาพที่มืดดำ กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้นิยมใช้ศึกษา เชื้อจุลินทรีย์ที่มีขนาดเล็กและมีการสะท้อนแสงได้น้อย ซึ่งเห็นได้ลำบากเมื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา ๆ เช่น การตรวจหาเชื้อซิฟิลิสจากน้ำเหลืองที่แผล เป็นต้น ภาพที่1.2 แสดงลักษณะและส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศน์ bright field แบบ Compound microscope
9 3. Phase contrast microscope Phase contrast microscope เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่นิยมใช้ส่องดูเชื้อจุลินทรีย์ในสิ่งส่งตรวจ (specimens) ที่ยังไม่ได้ย้อมสีเช่น แบคทีเรีย (bacteria) ใน tissue section, parasites ในสิ่งส่งตรวจและ inclusion bodies ของไวรัส (virus) การบังคับแสงโดย condenser ใช้วิธีเบนแสงหรือตัดแสงที่เปลี่ยนทิศทาง แม้เพียงเล็กน้อยออกทำให้วัตถุที่มี density ต่างกันปรากฏเป็นภาพซึ่งสว่างไม่เท่ากัน สามารถแยกแยะ รายละเอียดของโครงสร้างที่แตกต่างกันได้ค่อนข้างชัดเจน 4. Ultraviolet microscope เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงที่มีความยาวช่วงคลื่นสั้นกว่าแสงธรรมดา (Ultraviolet light) และใช้เลนส์ ที่ทำจาก quartz แทนเลนส์แก้วธรรมดา ซึ่งไม่สามารถสะท้อนแสงอุลตราไวโอเลต เนื่องจากแสง Ultraviolet เป็นแสงที่ไม่สามารถมองเห็นด้วยตาเปล่าและเป็นอันตรายต่อสายตาการ บันทึกภาพจึงนิยมทำโดยการถ่ายรูป (photomicrograph) 5. Fluorescence microscope การทำงานของกล้องจุลทรรศน์ Fluorescence อาศัยคุณสมบัติของสีเรืองแสง ซึ่งเมื่อกระทบกับแสงอุล ตราไวโอเลตแล้ว จะสะท้อนออกมาเป็นแสงที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า ทำให้วัตถุที่ย้อมติดสีเรืองแสงมีการเรือง แสงต่างจากส่วนอื่น ๆ กล้องจุลทรรศน์ Fluorescence มีหลักการเหมือนกับกล้องจุลทรรศน์ Dark field แต่ ใช้แสงที่มีความเข้มข้นสูงและใช้เลนส์กรองแสงชนิดต่าง ๆ ที่เหมาะสมกับสีเรืองแสงซึ่งมีอยู่กลายชนิด เช่น auramine o, acridine orange, trypaflavine และอื่น ๆ กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้มีประโยชน์มากในการตรวจหาเชื้อวัณโรคในเสมหะผู้ป่วยเพราะสามารถเห็นเชื้อ ได้ชัดเจน โดยใช้กำลังขยายต่ำกว่าวิธีธรรมดา ทำให้เห็นบริเวณที่ต้องการตรวจสอบได้กว้างขึ้น
10 II. กล้องจุลทรรศน์อีเลคตรอน (Electron microscope) กล้องจุลทรรศน์อีเลคตรอนเป็นกล้องที่มีกำลังขยายสูง ตั้งแต่ 2,000-100,000 เท่า ใช้การทำงานของ อนุภาคอีเลคตรอนและสนามแม่เหล็ก แทนการใช้แสงและเลนส์แบบกล้องจุลทรรศน์ธรรม-ดา เมื่อมีการ ประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ขึ้นมา ทำให้สามารถทราบถึงส่วนประกอบต่าง ๆ ของแบคทีเรีย ไวรัส และ รายละเอียดของเซลล์ได้ ปัจจุบันกล้องจุลทรรศน์อีเลคตรอนที่ประดิษฐ์ขึ้นมี 2 ชนิด คือ Scanning electron microscope (SEM) ซึ่งใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายนอกหรือลักษณะผิวของสิ่งต่าง ๆ และ Transmission electron microscope (TEM) ซึ่งใช้ศึกษารายละเอียดภายในภาคตัดขวางของวัตถุ Scanning electron microscope มีกำลังขยายไม่สูงนักเมื่อเปรียบเทียบกับ Transmission electron microscope แต่ภาพที่ได้เป็นภาพสามมิติ ต่างจากภาพที่เกิดจาก Transmission electron microscope ซึ่งเป็นภาพมิติเดียวแต่โฟกัสในระดับความลึก ต่าง ๆ กันได้ การใช้กล้องจุลทรรศน์ Bright field แบบ compound microscope 1. วิธีใช้ 1. ในการเคลื่อนย้ายกล้องจุลทรรศน์ให้ใช้มือขวาจับที่แขนของกล้อง ใช้มือซ้ายรองรับที่ฐานกล้อง และให้ ถือกล้องอยู่ในระดับหน้าอก 2. เมื่อใช้กล้องทุกครั้งต้องวางกล้องให้ตั้งตรง (ห้ามเอียงกล้อง) และให้ตั้งกล้องบนโต๊ะที่แข็งแรงมั่นคง และปราศจากแรงสั่นสะเทือน 3. เปิด switch ไฟแล้ว ตรวจดูว่า low power lens (10X หรือ 4X) อยู่ในตำแหน่งที่ใช้งาน (working position) หรือไม่ ถ้าไม่ ให้หมุน revolving nosepiece จน low power lens อยู่ในตำแหน่ง ดังกล่าว (โดยจะได้ยินเสียง lock ดังกริ๊ก) ในการใช้กล้องจุลทรรศน์ดูภาพทุกครั้ง จะต้องเริ่มจาก low power lens เสมอ เพราะจะทำให้เห็นภาพในพื้นที่ที่กว้างและสามารถเลือกบริเวณของตัวอย่างหรือ สิ่งส่งตรวจบนสไลด์ที่ต้องการดูรายละเอียดได้ง่ายขึ้น 4. จัดแสงให้เข้ากล้องมากหรือน้อยตามความต้องการ โดยการหมุนปรับกระจกเงาใต้ stage หรือการปิดเปิด Iris diaphragm เมื่อใช้ low power lens หรือ high dry objective lens ไม่ควรเปิด diaphragm เต็มที่ เพราะแสงจ้าเกินไป จะทำให้มองไม่เห็นภาพหรือได้ภาพไม่ชัด 5. วางสไลด์ที่ต้องการดูบน stage และยึดให้แน่นด้วย slide holder หรือ mechanical stage จากนั้น เลื่อน stage ขึ้นสูงสุดโดยหมุนปุ่มปรับภาพอย่างหยาบ และระวังอย่าให้สไลด์ชนกับ objective lens จากนั้นมองกล้องทางเลนส์ใกล้ตาพร้อมกับหมุนปุ่มปรับภาพอย่างหยาบให้ stage ค่อยๆ เลื่อนลงจน เห็นภาพ แล้วปรับภาพให้ชัดด้วยปุ่มปรับภาพละเอียด การเลือกบริเวณที่จะดูภาพควรเลือกบริเวณที่มี ตัวอย่างหรือสิ่งสิ่งตรวจกระจายตัวอยู่อย่างไม่หนาแน่นหรือเบาบางจนเกินไป
11 6. ถ้าต้องการดูภาพด้วย high dry objective lens ให้หมุน revolving nosepiece เพื่อเลื่อน high dry objective lens (40X) มาอยู่ใน working position แทน low power lens พร้อมทั้งเปิด iris diaphragm ให้กว้างขึ้นอีกเล็กน้อย แล้วหมุนปุ่มปรับภาพอย่างละเอียดจนเห็นภาพชัดเจน 7. ถ้าต้องการดูภาพโดยใช้ oil immersion objective lens ให้หมุน revolving nosepiece เพื่อให้ high dry objective lens ออกจาก working position แล้วหยด oil ลงบนสไลด์ จากนั้นหมุน revolving nosepiece เพื่อเลื่อน oil immersion objective lens (100X) มาอยู่ใน working position โดย oil immersion lens จะจุ่มลงไปในหยด oil พอดี ปรับภาพโดยหมุนปุ่มหมุนอย่าง ละเอียดจนได้ภาพที่ชัดเจน ห้ามใช้ oil immersion objective lens ดูสไลด์ที่เปียกน้ำหรือ Wet mount หรือ Wet preparation และห้ามใช้ high dry objective lens กับ oil หรือเปื้อน oil โดยเด็ดขาด 8. เมื่อเลิกใช้ oil immersion objective แล้วให้เลื่อน stage ลงก่อนแล้วจึงนำสไลด์ออกจาก stage 2. การเก็บกล้อง 1. ปิด switch ไฟ แล้วเลื่อน stage ลงต่ำสุด โดยหมุนปุ่มปรับภาพอย่างหยาบไฟ แล้วนำสไลด์ออกจาก stage 2. ใช้กระดาษเช็ดเลนส์ (lens paper) เช็ดทำความสะอาด low power lens, high dry objective lens และซับ oil ออกจาก oil immersion objective ให้หมด ห้ามใช้ผ้าหรือกระดาษชนิดอื่นเช็ด เลนส์โดยเด็ดขาด 3. เลื่อน low power objective lens ที่มีกำลังขยายต่ำที่สุดเข้า working position 4. ใช้ผ้านิ่ม ๆ และสะอาดเช็ดหยดน้ำมัน ฝุ่นละอองที่ติดอยู่ตามตัวกล้องทั่วไปออกให้หมด 5. สำหรับ oil immersion objective lens นั้น เมื่อใช้ไปหลาย ๆ ครั้ง ควรใช้กระดาษเช็ดเลนส์ชุบ xylene ไปซับที่เลนส์เพื่อให้ oil ที่ติดค้างอยู่ออกเสีย แต่ไม่ควรใช้ xylene เช็ดล้างหัวเลนส์ทุกครั้งเมื่อ เลิกใช้ oil immersion objective lens เพราะ xylene สามารถละลายสารที่ใช้สำหรับยึด (cement) เลนส์ ทำให้เลนส์หลวมหลุดออกหรือเสียหายได้ 6. ใช้กระดาษเช็ดเลนส์ที่สะอาดเช็ดฝุ่นละอองหรือน้ำมันบนเลนส์ใกล้ตา ห้ามนำเลนส์ใกล้ตาออกจากตัว กล้อง 7. ถอดปลั๊กไฟ ม้วนเก็บสายไฟแล้วคลุมกล้องด้วยถุงคลุม เก็บเข้ากล่องเก็บกล้องหรือเข้าตู้เก็บให้ เรียบร้อย
12 3. ข้อปฏิบัติอื่น ๆ 1. ห้ามนำชิ้นส่วนใด ๆ ของกล้องออกจากตัวกล้อง 2. น้ำมันมีไว้สำหรับใช้กับ oil immersion objective lens เท่านั้น ห้ามนำไปใช้กับ low power หรือ high dry objectives lens 3. ต้องทำความสะอาดเลนส์ของกล้องทุกอันด้วยกระดาษเช็ดเลนส์ทุกครั้งก่อนและหลังใช้กล้อง โดยให้ เช็ดจากเลนส์ที่ไม่ได้สัมผัส oil (low power lens) ก่อนทุกครั้ง เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ oil 4. เมื่อไม่สามารถปรับให้เห็นภาพได้ ควรนึกถึงว่าอาจเนื่องมาจากกรณีดังต่อไปนี้ 4.1. เลนส์ใกล้ตาและเลนส์ใกล้วัตถุสกปรก ให้ทำความสะอาดโดยการใช้กระดาษเช็ดเลนส์ เช็ดให้ สะอาด ถ้าหากยังมัวอยู่อีกแสดงว่ามีน้ำมันติดอยู่บนเลนส์ให้ใช้กระดาษเช็ดเลนส์ชุบ xylene เล็กน้อย เช็ดน้ำมันออกแล้วใช้กระดาษเช็ดเลนส์แผ่นใหม่ที่ไม่เปื้อน xylene ทำความสะอาดอีก ครั้งหนึ่ง สำหรับเลนส์ด้านล่างของเลนส์ใกล้ตาก็ทำความสะอาดเช่นเดียวกัน ส่วนเลนส์ใกล้วัตถุนั้น ทำความสะอาดได้เฉพาะเลนส์ที่อยู่ด้านนอกเท่านั้น ถ้า ปรากฏว่ามีน้ำมันติดอยู่ให้ใช้มุมหนึ่งของกระดาษเช็ดเลนส์จุ่ม xylene เล็กน้อย ช่วยเช็ดรอย น้ำมันนั้นออกไม่ควรใช้ xylene จำนวนมากและบ่อยครั้ง เพราะ xylene สามารถละลาย สารที่ใช้สำหรับยึด (cement) เลนส์ใกล้วัตถุได้ ทำให้เลนส์หลวมหลุดออกหรือเสียหายได้ 4.2. เนื่องจาก high-dry (40X) และ oil immersion (100X) objectives lens มีลักษณะและขนาด ใกล้เคียงกันมาก บางคนเผลอใช้น้ำมันกับหัว high dry objective lens จึงทำให้ไม่เห็นภาพ ฉะนั้น ต้องตรวจดูหัวเลนส์ที่จะใช้ให้ถูกต้องแน่นอนเสียก่อนใช้ 4.3. เลนส์ใกล้วัตถุไม่เข้าที่พอดีต้องเลื่อนให้เสียงดัง "กริ๊ก" จึงจะใช้ได้ 4.4. การปรับแสงไม่เหมาะสม เช่น ใช้ low power lens แต่เปิดแสงจ้าเกินไป ก็จะมองไม่เห็นภาพ หรือเมื่อใช้ oil immersion objective lens แล้วเปิด diaphragm ให้แสงผ่านได้น้อย แสงก็จะ ไม่พอ ทำให้เห็นภาพไม่ชัดหรือการปรับ condenser ให้อยู่ในตำแหน่งที่ไม่เหมาะสม การปรับ เพื่อหาจุดโฟกัสของก็เช่นเดียวกัน ต้องปรับด้วยการหมุนปุ่มปรับภาพอย่างละเอียดเพราะถ้าใช้ ปุ่มหมุนอย่างหยาบ จุดโฟกัสของภาพจะผ่านโดยรวดเร็ว ไม่ทันที่ตาจะจับภาพไว้ได้ 5. กล้องจุลทรรศน์ส่วนมากจะมีโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุทั้ง 3 อันอยู่ใกล้เคียงกัน (par focal) นั่นคือถ้า ปรับภาพจนชัดด้วย low power lens แล้วเลื่อนเลนส์อันอื่น ๆ มาแทน จะปรับด้วยการหมุนปุ่มปรับ ภาพอย่างละเอียดอีกเพียง 1/2 ถึง 1 รอบก็จะเห็นภาพได้ ดังนั้นหากใช้ high dry objective lens แล้วหมุนปุ่มปรับภาพละเอียดหลายรอบ ก็ยังไม่เห็นภาพ ห้ามเปลี่ยนไปใช้ปุ่มปรับภาพอย่างหยาบ โดยเด็ดขาด เพราะจะทำให้สไลด์เบียดหรือกระทบกับเลนส์แตกเสียหายได้ ควรกลับไปหาระยะภาพ และจุดโฟกัสใหม่ด้วย low power lens ถ้ายังไม่เห็นภาพให้สอบถามอาจารย์ที่ควบคุม การใช้กล้องจุลทรรศน์ทุกครั้งให้เริ่มด้วย low power lens (10X หรือ 4X) และปรับให้ได้ ภาพชัดเจนเสียก่อน แล้วจึงเปลี่ยนไปใช้เลนส์อื่น ตามกำลังขยายที่ต้องการ
13 เครื่องมือหลักในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา (Basic apparatus in microbiological laboratory) นอกจากกล้องจุลทรรศน์ซึ่งเป็นเครื่องมือสำคัญในห้องปฎิบัติการจุลชีววิทยาแล้ว ยังมีเครื่องมืออีกหลาย ชนิดที่จัดเป็นเครื่องมือหลักในการปฎิบัติงานทางจุลชีววิทยา เช่น ตู้อบเพาะเชื้อ (Incubator) เป็นตู้อบที่สามารถปรับอุณหภูมิได้ตามความต้องการ มีประโยชน์ในการเพาะเชื้อแบคทีเรียซึ่งส่วนใหญ่ เจริญได้ดีที่อุณหภูมิ 37o C วิธีใช้สะดวกเนื่องจากมีหน้าปัทม์สำหรับหมุนเลือกอุณหภูมิได้ตามที่ต้องการ ภายใน ตู้จะมีระบบปรับการไหลเวียนของอากาศทำให้อุณหภูมิสม่ำเสมอทั่วบริเวณต่าง ๆ ภายในตัวตู้ ตู้เย็น (Refrigerator) ใช้สำหรับเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อที่ยังไม่ต้องการใช้ ตลอดจนสารเคมีและน้ำยาที่จำเป็นต้องเก็บรักษาใน อุณหภูมิต่ำ ๆ เช่น ยาปฎิชีวนะ, serum, plasma เลือดและอื่นๆ ในกรณีที่ต้องการเก็บแบคทีเรียไว้เป็น เวลานาน ๆ โดยไม่ต้องการให้แบ่งตัวเพิ่มจำนวนมากอาจเก็บไว้ในตู้เย็นได้เช่นเดียวกัน (ยกเว้นเชื้อบางชนิดที่ ตายได้ง่ายที่อุณหภูมิต่ำ ๆ) อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) เป็นอ่างน้ำที่ปรับอุณหภูมิได้ตามต้องการ สามารถใช้เป็นตู้อบเพาะเชื้อได้ในกรณีที่เลี้ยงเชื้อในอาหาร เหลวหรือในหลอดทดลองและใช้ในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อหรืออุ่นอาหารเลี้ยงเชื้อให้มีอุณหภูมิเหมาะสม สำหรับการทดลอง หม้อนึ่งฆ่าเชื้อภายใต้ความดันไอน้ำ (Autoclave) เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ทุกชนิด โดยอาศัยความร้อนจากไอน้ำเดือดภายใต้ความดัน ลักษณะของเครื่องเป็นภาชนะโลหะรูปสี่เหลี่ยมหรือรูปทรงกระบอกมีฝาปิดที่แข็งแรงภายในเป็นช่องว่าง (Chamber) สำหรับบรรจุสิ่งของที่ต้องการฆ่าเชื้อในลักษณะเช่นเดียวกับการนึ่ง ด้านล่างมีช่องสำหรับบรรจุน้ำ ซึ่งเมื่อต้มให้เดือดจะกลายเป็นไออัดแน่นอยู่ภายใน มีอุณหภูมิสูงถึง 121o C ภายใต้ความดัน 15 ปอนด์ต่อ ตารางนิ้ว ตามปกติถ้าวัตถุอยู่ภายในสภาพนี้นาน 10-15 นาที จะปราศจากสิ่งมีชีวิตทุกอย่าง (Sterile) เครื่องมือนี้ใช้มากในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (media) และฆ่าเชื้อจากplateทดลอง, หลอดทดลอง ตลอดจน ใช้ทำให้เครื่องมือเครื่องใช้ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ ตู้อบความร้อน (Hot air oven) เป็นตู้อบฆ่าเชื้อโดยใช้ความร้อนแห้ง (dry heat) ที่อุณหภูมิสูงมาก เช่น อุณหภูมิ 160o C นาน 1-2 ชั่วโมง เครื่องมือแบบนี้เหมาะสำหรับการทำลายเชื้อจากวัตถุสิ่งของที่ทนความร้อน เช่น เครื่องแก้วต่าง ๆ เพื่อ ทำให้ปราศจากเชื้อก่อนที่จะนำมาใช้ในการทดลองทางจุลชีววิทยา
14 ตะเกียงก๊าซ (Bunsen burner) เป็นตะเกียงที่ใช้ก๊าซหุงต้มทำให้เกิดเปลวไฟสำหรับใช้เผาฆ่าเชื้อที่ติดอยู่กับเครื่องมือบางอย่าง เช่น เข็ม เขี่ยเชื้อ, ปิเปต, หลอดทดลอง, ปากคีบ เป็นเครื่องมือที่ใช้กันมากในการถ่ายเชื้อ ตะเกียงแอลกอฮอล์ เป็นตะเกียงแบบที่ใช้แอลกอฮอล์เป็นเชื้อเพลิงเพื่อให้ได้เปลวไฟ ใช้ประโยชน์เช่นเดียวกับตะเกียงก๊าซใน กรณีที่ห้องปฎิบัติการนั้นไม่มีก๊าซ เปลวไฟจากตะเกียงแอลกอฮอล์ร้อนน้อยกว่าจากตะเกียงก๊าซมาก จึงต้องใช้ เวลานานกว่าในการเผาเพื่อทำให้ปราศจากเชื้อ เข็มเขี่ยเชื้อ (Inoculating loop and needle) ทั้งสองชนิดเป็นเครื่องมือที่ใช้สำหรับถ่ายเชื้อแบคทีเรียจากภาชนะหนึ่งไปใส่ในภาชนะหนึ่ง ทำด้วยลวด ที่เป็นตัวนำความร้อนที่ดี เช่น nichrome หรือ platinum มีด้ามถือเป็นวัสดุที่ไม่นำความร้อน loop มีลักษณะ เป็นเส้นลวดมีปลายขดเป็นวงกลมขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 4 มม. ส่วน Needle นั้นปลายเหยียดตรง เมื่อเวลาจะใช้เครื่องมือทั้งสองนี้จะต้องทำให้ปราศจากเชื้อโดยการเผาจนกระทั่งลวดร้อนแดงและปล่อยให้เย็น ก่อนนำมาใช้ จานเพาะเชื้อ (Petri dish) มีลักษณะคล้ายจานทรงกระบอกแบบตื้น 2 ใบ สวมประกบกันสนิท โดยปกติทำด้วยแก้วหรือพลาสติก ทนความร้อน ใช้สำหรับใส่อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง (agar) ทำให้มีบริเวณเนื้อที่ผิว (surface area) กว้างเหมาะ ในการแยกเชื้อแบคทีเรียจากตัวอย่างส่งตรวจโดยทั่วไป จานเพาะเชื้อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อบรรจุอยู่นิยมเรียกว่า Agar plate หลอดเลี้ยงเชื้อ (Culture tube) ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาจำเป็นต้องใช้หลอดทดลอง (test tube) ขนาดต่าง ๆ จำนวนมากเพื่อใช้ใส่ อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ทั้งหลายและหลอดทดลองที่ใช้มีทั้งแบบปิดด้วยจุกเกลียว (screw cap test tube) และแบบธรรมดาซึ่งใช้สำลีอุดเป็นจุกแล้วแต่ประเภทของอาหารที่จะใส่ในหลอดนั้น อาหารเลี้ยงเชื้อที่บรรจุใน หลอดทดลองมีทั้งชนิดที่เป็นอาหารแข็งประเภทวุ้น (agar) และอาหารเหลว (broth) เมื่อบรรจุอาหารในหลอด ทดลองแล้วจะต้องมีจุกปิดปากหลอดไว้เพื่อป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์อื่นปนเปื้อน หลอดดักก๊าซ (Durham tube) เป็นหลอดทดลองขนาดเล็กประมาณ 5 50 มม. ใช้สำหรับใส่คว่ำลงในหลอดทดลองขนาดปกติที่บรรจุอาหาร เลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบความสามารถในการใช้น้ำตาลแล้วให้กรดและก๊าซ CO2 ก๊าซที่เกิดขึ้นจะลอยขึ้น จึง ทำให้มีก๊าซจำนวนหนึ่งดันไล่ที่ของเหลวและถูกขังอยู่ที่ก้นหลอดดักก๊าซ
15 ปิเปต (Pipette) การถ่ายเชื้อในสภาพของเหลวหรือสารละลายจำนวนมากจากหลอดทดลอง จำเป็นต้องใช้ปิเปต ในทาง จุลชีววิทยาปิเปตที่ใช้มักจะอุดปลายด้านที่สำหรับดูดไว้กรองเชื้อไม่ให้ผ่านเข้าปากและป้องกันเชื้อจากปากผ่าน ลงสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ ชุดย้อมสี (Staining set) โดยปกติจะประกอบด้วยขวดสีต่าง ๆ หลายชนิด สำหรับการย้อมสไลด์แบบ Gram's stain, Acid-fast stain และ Simple stain อื่น ๆ โดยมากนิยมใช้ขวดสีชาเพื่อกันแสงเนื่องจากสารเคมีหลายชนิดเปลี่ยนสภาพ ได้ง่ายเมื่อถูกแสงสว่าง เครื่องกรองแบคทีเรีย (Bacteriological filter) เครื่องกรองแบคทีเรีย ซึ่งมีแผ่นกรองแบคทีเรีย (membrane filter) ซึ่งแผ่นกรองเหล่านี้มีรูขนาดเล็ก มาก (0.22-0.45 m) จนกระทั่งตัวแบคทีเรียไม่สามารถผ่านไปได้ (แต่ไวรัสผ่านได้) ฉะนั้นสารที่ผ่านการกรอง แล้วจะปราศจากแบคทีเรียและสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่มีขนาดใหญ่กว่ารูของกระดาษกรอง
16 เทคนิคในการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา (Common techniques in microbiological laboratory) การปฎิบัติงานทางจุลชีววิทยาจำเป็นต้องมีความระมัดระวังการกระจายของเชื้อเป็นอย่างมาก ถ้า ผู้ปฏิบัติงานประมาทเลินเล่ออาจทำให้เกิดการติดเชื้อแก่บุคคลอื่น ๆ หรือตนเองได้ เทคนิคที่ใช้บ่อย ๆ ในการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา ได้แก่ การถ่ายเชื้อ, การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์, การทำ ให้เจือจางและการนับจำนวนแบคทีเรียในอาหารเหลว การถ่ายเชื้อ (Transfer culture) การถ่ายเชื้อจากภาชนะหนึ่งไปยังอีกภาชนะหนึ่งเป็นงานที่พึงระวัง อย่าให้เชื้ออื่นเข้าไปปนเปื้อน (contaminate) เพราะรอบ ๆ ตัวเรานั้นเต็มไปด้วยเชื้อจุลินทรีย์ วิธีการถ่ายเชื้อต้องทำโดยใช้เทคนิคที่ ปราศจากการปนเปื้อน (Sterile techniques) เครื่องมือที่สำคัญในการถ่ายเชื้อคือ loop, needle หรือ pipette ก่อนการลงมือปฎิบัติการถ่ายเชื้อผู้ปฎิบัติควรเขียน (label) ชื่อเชื้อ, วันที่ และรายละเอียดต่าง ๆ ไว้ ข้างหลอดทดลองหรือที่ก้นของจานเพาะเชื้อเพื่อป้องกันความสับสนเมื่อมีการถ่ายเชื้อหลายชนิด หากเป็นการ ถ่ายเชื้อจากสิ่งส่งตรวจผู้ป่วยจะต้องเขียนชื่อ นามสกุลของผู้ป่วย ชนิดของสิ่งส่งตรวจ เช่น เสมหะ ปัสสาวะ และวัน เดือน ปี ที่ทำการถ่ายเชื้อทุกครั้ง อาหารเลี้ยงเชื้อ (media) ที่ใช้มี 3 แบบ คือ อาหารเหลว (broth), อาหารแข็ง (agar) และอาหารกึ่งแข็ง (semi-solid media) การถ่ายเชื้อจากอาหารเหลวทำโดยใช้ sterile loop จุ่มลงไป เมื่อยก loop ขึ้นมาดูจะ เห็นว่ามีแผ่นฟิล์มบาง ๆ ติดอยู่ ซึ่งเพียงพอสำหรับการถ่ายเชื้อแบคทีเรียไปยังหลอดอื่น ๆ ส่วนในกรณีที่เชื้ออยู่ บนอาหารแข็งเชื้อจะเกาะติดอยู่ผิวหน้าของอาหารเป็นจุดกลม แต่ละจุดเรียกว่าโคโลนี การถ่ายเชื้อใช้ sterile loop หรือ sterile needle แตะเฉพาะบริเวณผิวหน้าของโคโลนีเพียงเล็กน้อยก็จะได้แบคทีเรียจำนวนมากมาย ไม่ควรขูดเอาเนื้อวุ้นติดมาด้วย ในกรณีที่ต้องการให้แบคทีเรียเจริญลึกเข้าไปในเนื้อวุ้นเช่น ในการเลี้ยงเชื้อใน semisolid media TSI, OF หรือ MI medium นิยมใช้ sterile needle แตะเชื้อมาแล้วแทงตรง ๆ ลงในเนื้อ Agar ซึ่งเรียกว่าการ stab (รูป 1.3) ส่วนการใช้ loop แตะเชื้อแล้วลากผ่านผิวหน้า agar เป็นเส้นติดต่อกัน เรียกว่าการ streak ซึ่งนิยมใช้ในการเพาะเชื้อแบคทีเรียและยีสต์บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง ภาพที่1.3 แสดงการ streak และ stab เชื้อลงในอาหารชนิดแข็งที่มีผิวหน้าเอียง (agar slant) Streak Stab
17 เทคนิคการถ่ายเชื้อ โดยใช้ Sterile technique 1. การถ่ายเชื้อแบคทีเรียจากอาหารเหลวในหลอดทดลองไปยังอาหารเหลวหลอดใหม่ โดยใช้ loop 1. จับ loop ด้วยมือขวาโดยใช้นิ้วหัวแม่มือ นิ้วชี้และนิ้วกลางจับที่ด้าม loop ลนไฟจนร้อนแดงตลอด ส่วนที่เป็นเส้นลวด ปล่อยให้เย็น 10-15 วินาที (ห้ามวาง loop ลงกับพื้นโต๊ะอีก ให้ถือไว้ตลอดเวลา) 2. จับหลอดเลี้ยงเชื้อด้วยมือซ้าย เปิดจุกของหลอด (ซึ่งเป็นจุกสำลีหรือจุกเกลียว) ด้วยนิ้วก้อย นิ้วนาง กับอุ้งมือขวา (ห้ามวางจุกลงบนพื้นโต๊ะ ต้องถือไว้ตลอดเวลา) 3. ลนเผา (flame) ปากหลอดเลี้ยงเชื้อ (ที่เปิดจุกแล้ว) บนเปลวไฟจนร้อนพอที่จะทำให้บริเวณปาก หลอดปราศจากเชื้อ 4. ใช้ sterile loop สอดเข้าไปในหลอดเพื่อแตะเชื้อแบคทีเรียขึ้นมา ซึ่งจะเห็นเป็นแผ่นฟิล์มบางๆ 5. ลนปากหลอดเลี้ยงเชื้ออีกครั้งหนึ่งบนเปลวไฟ ปิดจุกหลอดเลี้ยงเชื้อแล้ววางหลอดทดลองลง 6. หยิบหลอดใหม่ (ด้วยมือซ้ายเช่นเดียวกัน) เปิดจุก (ทำตามข้อ 2) ลนปากหลอดบนเปลวไฟ แล้วจุ่ม loop ที่แตะเชื้อแล้วลงไปในอาหารเหลว โดยให้จุ่ม loop ลงไปในอาหารบริเวณใกล้รอยต่อกับอากาศเพื่อให้ เชื้อหลุดไป แล้วสั่นข้อมือ 4-5 ครั้ง โดยทั่วไปจะเรียกการใส่เชื้อลงไปในอาหารว่า inoculation 7. ลนไฟที่ปากหลอด ปิดจุกก่อนวางหลอดลง 8. เผา loop จนร้อนแดงอีกครั้งเพื่อฆ่าเชื้อก่อนเก็บ หมายเหตุโปรดสังเกตว่านับแต่เริ่มถ่ายเชื้อ จะไม่มีการวาง loop หรือจุกหลอดลงบนพื้นเลยจะวาง loop ก็ ต่อเมื่อเสร็จเรียบร้อยแล้ว และก่อนวาง loop ต้องลนไปจนร้อนแดงทุกครั้ง 2. การถ่ายเชื้อแบคทีเรียจากหลอดอาหารเหลวไปยังจานเพาะเชื้อใหม่ที่มีอาหารแข็ง (agar plate) 1. ใช้ loop แตะเชื้อจากหลอดทดลอง (ทำเหมือนกับวิธีที่กล่าวมาแล้วในหัวข้อ I ข้อ 1 ถึง 5) 2. ใช้มือซ้ายเปิดฝาจานเพาะเชื้อให้เผยอออกพอที่จะสอด sterile loop เข้าไปภายในได้ (ระวังอย่าให้ ปลาย loop ถูกกับบริเวณผิวรอบนอกของจานเพาะเชื้อ) หรืออาจทำโดยยกจานเพาะเชื้อที่มีวุ้นขึ้นมาในแนวตั้ง แล้ว streak เชื้อโดยวิธีลาก loop ผ่านไปบนเนื้ออาหารเบา ๆ โดยไม่ให้ทิ่มแทงลงไปในเนื้ออาหาร 3. เผา loop จนร้อนแดงเพื่อฆ่าเชื้อก่อนเก็บ 3. การถ่ายเชื้อจากหลอดอาหารเหลวไปยังหลอดอาหารเหลวใหม่ด้วยปิเปต (ภาพที่ 1.4) การถ่ายเชื้อด้วยปิเปตใช้ในกรณีที่ต้องการถ่ายเชื้อจำนวนมากหรือต้องการควบคุมปริมาณ เช่นในการทำ ให้เจือจาง (dilution) การใช้ปิเปตต้องระวังไม่ให้เชื้ออื่นลงปนเปื้อน ปิเปตที่ใช้จึงต้องผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (sterile pipette) และมีจุกสำลีอุดอยู่ที่ปลายบน ห้ามดึงสำลีออก sterile pipette อาจบรรจุอยู่ในกระป๋อง หรือห่อกระดาษ ให้เปิดกระป๋องหรือฉีกกระดาษทางด้านปลายที่ใช้ดูดค่อย ๆ เอียงกระป๋องหรือซองกระดาษ
18 ให้ปลาย pipette ยื่นออกมาแล้วจึงดึง pipette ออกมาใช้ (ห้ามใช้มือล้วงเข้าไปในกระป๋องหรือซองกระดาษ เพื่อหยิบปิเปต) วิธีใช้ปิเปต 1. จับปลายบนของปิเปตด้วยนิ้วหัวแม่มือและนิ้วกลางของมือขวา ใช้นิ้วนางและนิ้วก้อย ประคองให้อยู่ในแนวนอน ส่วนนิ้วชี้ให้ปิดไว้เบา ๆ บนปลายด้านที่จะใช้ดูด (ในกรณีที่ไม่ใช้ลูกยาง) 2. ลนปิเปตผ่านเปลวไฟตลอดความยาว 2-3 ครั้ง (ยกเว้นปิเปตที่เปียก) 3. ใช้มือซ้ายจับหลอดเลี้ยงเชื้อเปิดจุก ลนไฟที่ปากหลอด (ทำเหมือนข้อ 2 และ 3) ของการถ่ายเชื้อจาก หลอดทดลอง 4. ดูดเชื้อในอาหารเหลวขึ้นมา แล้วใช้นิ้วชี้ปรับปริมาตรให้ได้ตามต้องการ พลิกข้อมือให้ปิเปตอยู่ใน แนวนอน 5. ลนปากหลอดบนเปลวไฟ ปิดจุก แล้ววางหลอดลง 6. ใช้มือซ้ายหยิบหลอดอาหารใหม่เปิดจุกด้วยนิ้วก้อยและอุ้งมือขวา ลนปากหลอดบนเปลวไฟ (ทำเหมือนข้อ 3) 7. ปล่อยเชื้อในปิเปตลงในหลอดอาหารใหม่โดยให้ปิเปตอยู่ในแนวดิ่ง ปลายปิเปตแตะที่ด้านข้างของ หลอดแล้วค่อยๆ ปล่อยเชื้อลงด้านข้างของหลอดทดลอง ระวังอย่าให้ปลายปิเปตจุ่มลงในอาหารของหลอดใหม่ 8. ลนปากหลอด, ปิดจุกแล้วทิ้งปิเปตในภาชนะที่ใส่น้ำยาฆ่าเชื้อไว้ หมายเหตุ ถ้าต้องการถ่ายเชื้อลงในจานเพาะเชื้อ ให้แง้มฝา Plate ด้วยมือซ้ายให้กว้างพอที่ปลายปิเปตจะสอด เข้าไปได้ (ระวังอย่าให้ปลายปิเปตแตะกับผิวด้านนอกของจานเพาะเชื้อ) แล้วปล่อยเชื้อลงในจานเพาะเชื้อ ดัง ภาพที่ 1.5 ปิเปตที่ใช้แล้วต้องทิ้งในภาชนะใส่น้ำยาฆ่าเชื้อ ภาพที่1.4 แสดงการถ่ายเชื้อจากปิเปตลงหลอดอาหารเหลว ภาพที่1.5 แสดงการถ่ายสารละลายจาก pipette ลงใน Petri dish
19 การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ (Isolation of pure culture) การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์มีความสำคัญในการปฎิบัติการทางจุลชีววิทยาเป็นอย่างมาก เนื่องจากสิ่งแวดล้อม ต่าง ๆ เช่น อากาศ, น้ำ, พื้นห้องหรือแม้แต่ร่างกายของเราก็มีเชื้อจุลินทรีย์อยู่หลายชนิดที่อาจปนเปื้อนอยู่ใน หลอดเพาะเชื้อ ในทางการแพทย์เมื่อเวลาเก็บสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยก็อาจมีการปนเปื้อนของเชื้อตามร่างกายได้ จึงมีความจำเป็นต้องแยกให้ได้เชื้อบริสุทธิ์แต่ละชนิด (pure culture) ที่เป็นสาเหตุทำให้เกิดโรค การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์จะต้องแยกให้ได้ colony เดี่ยว ๆ (single colony) จำนวนมาก จากนั้นจึงนำไป ศึกษารูปร่างและคุณสมบัติต่าง ๆ เพื่อให้ทราบว่าเป็นเชื้อชนิดใด เทคนิคที่นิยมใช้คือ การ streak plate ซึ่งทำ ได้โดยใช้ loop ถ่ายเชื้อด้วยวิธี streak ลงจานเพาะเชื้อที่มีอาหารแข็ง ( agar plate)ให้ได้หลายระนาบ (plane) ซึ่งต้อง streak ให้ได้ 4 หรือ 5 plane ดังภาพที่ 1.6 Streak แบบ 4 planes Streak แบบ 5 planes ภาพที่1.6 แสดงการ streak plate เพื่อแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ ในการ streak จะใช้ loop แตะเชื้อจากหลอดหรือจานเพาะเชื้อ หรือจากสิ่งส่งตรวจที่ต้องการแยกเชื้อ ให้บริสุทธิ์ มา streak ใน plane แรกเท่านั้น ส่วนใน plane ที่เหลือจะใช้การขีดเชื้อจากส่วนปลายของรอย streak ใน plane ก่อนที่ทำเสร็จแล้ว ไป streak เป็น plane ใหม่ตามลำดับ โดยก่อนที่จะใช้ loop ขีดเชื้อจาก plane เก่า มา streak เป็น plane ใหม่ ควรเผาไฟ loop ให้ร้อนแดงก่อนทุกครั้งเพื่อกำจัดเชื้อส่วนเกินที่ติดอยู่ บน loop ช่วยทำให้มีโอกาสได้ colony เดี่ยวๆของเชื้อบริสุทธิ์มากขึ้น 1 2 3 4 1 2 3 4 5
20 การศึกษาเรื่องกล้องจุลทรรศน์ การทดลองที่ 1.1 การศึกษาโดยใช้ low power objective lens และ high dry objective lens วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษา 1. สามารถใช้ low power objective lens และ high dry objective lens ของกล้องจุลทรรศน์ใน การตรวจดูตัวอย่างจุลินทรีย์ได้อย่างถูกต้อง 2. สามารถเตรียมสไลด์ตัวอย่างสดเพื่อตรวจดูรูปร่างของจุลินทรีย์ได้ วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. สไลด์ที่ล้างสะอาด 2 แผ่น 2. Cover slip 2 แผ่น 3. Cell suspension of yeast 4. Cell suspension of Bacillus sp. 5. กล้องจุลทรรศน์ วิธีทำ 1. นำสไลด์ที่สะอาดมา 1 แผ่น พร้อมดัวย cover slip แล้วใช้ dropper หยด cell suspension 1 หยด บนสไลด์ค่อย ๆ วาง cover slip ให้แตะตรงบริเวณของหยดน้ำแล้วจึงค่อย ๆ ปล่อยให้ cover slip ปิดทับหยด น้ำ 2. นำสไลด์ที่เตรียมนี้ไปวางบน stage ของกล้องจุลทรรศน์ 3. ปรับภาพด้วย low power lens ให้ได้ภาพที่ชัดเจนแล้วจึงใช้ high dry objective lens ตรวจดู รูปร่างของจุลินทรีย์ การบันทึกผล ให้ผู้ทำการทดลองบันทึกผลการทดลองและกำลังขยายของกล้อง (magnification) พร้อมทั้งวาดภาพ เซลล์ที่เห็นจาก low power lens และ high-dry objective lens ไว้ ถ้ามีข้อสงสัยให้สอบถามอาจารย์ผู้ ควบคุมปฎิบัติการ
21 การทดลองที่ 1.2 การศึกษาโดยใช้ Oil immersion objective lens วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาสามารถใช้ Oil immersion objective lens ของกล้องจุลทรรศน์ในการตรวจดู ตัวอย่างของจุลินทรีย์ได้อย่างถูกต้อง วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. สไลด์เชื้อจุลินทรีย์ชนิดต่าง ๆ 4 ชนิด 2. Oil immersion 3. กล้องจุลทรรศน์ วิธีทำ 1. นำสไลด์แบคทีเรีย 1 แผ่น วางบน stage ของกล้อง 2. ใช้ low power lens และ high-dry power objective lens ปรับภาพให้เห็นชัดเสียก่อนแล้วจึง หมุน high dry objective lens ออกจาก working position หยดน้ำมัน 1 หยด ตรงบริเวณที่ส่องดูแล้วจึง เลื่อนหัว oil immersion objective lens ให้อยู่ใน working position และจะจุ่มอยู่ในน้ำมันปรับให้เห็นภาพ ชัด โดยการหมุนปุ่มปรับภาพอย่างละเอียด การบันทึกผล ให้ผู้ทำการทดลองบันทึกผลการทดลองและกำลังขยายของกล้อง พร้อมทั้งวาดภาพที่เห็นจากกล้อง
22 เทคนิคในการปฎิบัติงานด้านจุลชีววิทยา การทดลองที่ 1.3 การถ่ายเชื้อ วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาสามารถถ่ายเชื้อโดยใช้ loop และ pipette ด้วยวิธี sterile techniques ได้ อย่างถูกต้อง วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละคน) 1. Culture tube 1 tube 2. Nutrient broth 1 tube 3. Nutrient agar plate 1 plate 4. Pipette 1 อัน 5. ตะเกียงแอลกอฮอล์ วิธีทำ ให้นักศึกษาทุกคนฝึกหัตการถ่ายเชื้อจากหลอดอาหารไปยังหลอดอาหารใหม่หรือจานเพาะเชื้อที่มี อาหารแข็ง โดยใช้ loop และ pipette จนชำนาญโดยมีอาจารย์คอยแนะนำให้ใช้ "sterile techniques" อย่าง ถูกต้อง การทดลองที่ 1.4 การ Streak plate วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาสามารถแยกเชื้อบริสุทธิ์ (pure culture) ได้โดยใช้การ streak plate อย่าง ถูกต้อง วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละคน) 1. Nutrient agar (NA) 4 plate 2. Mixed culture tube (สำหรับแต่ละกลุ่ม) 1 tube 3. Loop 4. ตะเกียงแอลกอฮอล์ วิธีทำ ให้นักศึกษาทุกคนใช้ loop จุ่มเชื้อจากหลอดอาหารเหลวที่มีเชื้อหลายชนิด (mixed culture tube) แล้วนำมา streak plate ให้ได้ 4 plane ตามภาพประกอบในภาพที่ 1.6 (ต้องใช้ sterile technique เสมอ)
23 การสาธิตเครื่องมือหลักในห้องปฏิบัติการ ให้ศึกษาเครื่องมือต่าง ๆ ที่ตั้งแสดงไว้ในห้องปฏิบัติการ สำหรับเครื่องนึ่งฆ่าเชื้อด้วยความดันไอ (Autoclave) และเครื่องมือหลักอื่น ๆ อาจารย์ประจำกลุ่มจะเป็นผู้นำไปชม คำถามท้ายบท 1. จำเป็นหรือไม่ว่า Single colony ที่ streak plate ในครั้งเดียวจะต้องมาจากชนิดเดียวกันเท่านั้น
24
25 ปฏิบัติการบทที่ 2 การเจือจางแบบเป็นชุดและปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี (Serial dilution and Antigen-Antibody reaction) ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ อ.ดร.คณิน ซาเหลา การเจือจางแบบเป็นชุด (serial dilution) บทนำ: การเจือจางแบบเป็นชุด (serial dilution) เป็นการเจือจางสารละลาย เช่น ยา ซีรั่ม สารเคมี หรือเชื้อ โรคต่าง ๆ ในลักษณะของการเจือจางแบบเป็นจำนวนเท่า ที่เท่า ๆ กัน เช่นทีละ 2 เท่า (2-fold), 5 เท่า (5- fold) หรือ 10 เท่า (10-fold) เป็นต้น ถ้าเจือจางแบบ 2-fold serial dilution ก็จะได้ค่าความเจือจางเป็น 1:2, 1:4, 1:8, 1:16….. ถ้าเจือจางแบบ 5-fold serial dilution ก็จะได้ค่าความเจือจางเป็น 1:5, 1:25, 1:125, 1:625….. ถ้าเจือจางแบบ 10-fold serial dilution ก็จะได้ค่าความเจือจางเป็น 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000….. การทดลองที่ 2.1 การเจือจางแบบเป็นชุด (2-fold serial dilution) วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษา 1. สามารถใช้ sterile technique ในการทำ serial dilution ได้อย่างถูกต้อง 2. สามารถคำนวณค่า dilution ของแต่ละหลอดได้อย่างถูกต้อง วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. น้ำสี (Methylene blue solution), 3 ml 1 หลอด 2. Sterile test tube 16 หลอด 3. Sterile pipette 1 ml 16 อัน 3. Sterile pipette 5 ml 4 อัน 5. Sterile distilled water (10 ml) 1 หลอด 6. ตะเกียงแอลกอฮอล์ 7. ลูกยางแดงสำหรับดูด pipette
26 วิธีทำ ให้นักศึกษาแต่ละคนทำการเจือจางแบบ 2-fold serial dilution คนละ 4 หลอด โดยใช้ sterile technique ตลอดการทดลอง (ดูแผนภูมิ 2.1 ประกอบ) 1. ใช้ปากกาเขียนแก้วเขียนเลข 1 ถึง 4 ลงบน sterile test tube ทั้ง 4 หลอด แล้วเรียงลงใน rack 2. ใช้ pipette ขนาด 5 ml ดูดน้ำกลั่น (ทำหน้าที่เป็นตัวเจือจาง = diluent) ใส่ลงใน tube ที่ 1 ถึง 4 หลอดละ 0.5 ml 3. ใช้ pipette ขนาด 1 ml อันที่ 1 ดูดน้ำสีมา 0.5 ml. ใส่ลงในหลอดที่ 1 โดยไม่ให้ปลาย pipette จุ่ม ลงไปในน้ำกลั่นที่อยู่ในหลอด จากนั้นทิ้ง pipette อันที่ 1 ลงในภาชนะสำหรับใส่ pipette ที่ใช้แล้ว 4. ใช้ pipette 1 ml อันที่ 2 ดูดผสมของเหลวในหลอดที่ 1 โดยใช้วิธีดูด-ปล่อย 5-6 ครั้ง (ระวังอย่าดูด เป่าให้สารละลายเป็นฟอง) เพื่อให้สารละลายผสมให้เข้ากัน แล้วดูดมา 0.5 ml ใส่ลงในหลอดที่ 2 โดยไม่ให้ ปลาย pipette จุ่มลงในน้ำกลั่นที่อยู่ในหลอดที่ 2 (วิธีการทำเช่นเดียวกับข้อ 3) แล้วทิ้ง pipette ลงในภาชนะ สำหรับใส่ pipette 5. ใช้ pipette อันที่ 3 ดูดผสมของเหลวในหลอดที่ 2 โดยวิธีดูด-ปล่อย 5-6 ครั้ง (ระวังอย่าดูดเป่าให้ สารละลายเป็นฟอง) เพื่อให้เข้ากัน แล้วดูดมา 0.5 ml. ใส่ลงในหลอดที่ 3 (วิธีการเช่นเดียวกับข้อ 3-4) 6. ทำการเจือจางเช่นเดียวกันในหลอดที่ 4 7. ถ้าต้องการเจือจางในจำนวนหลอดที่มากกว่านี้ ก็สามารถทำในลักษณะเดียวกันในหลอดต่อไปได้เรื่อย ๆ แผนภูมิที่ 2.1 ขั้นตอนในการทำ 2-fold serial dilution
27 วิธีการคำนวณ ใช้สมการ N1V1 = N2V2 คำนวณหา dilution ได้ตามสูตร โดย N1 = ความเข้มข้นของสารในหลอดที่ดูดมา (dilution) V1 = ปริมาตรของสารที่ดูดมา N2 = ความเข้มข้นของสารในหลอดที่คำนวณ (dilution) V2 = ปริมาตรสุดท้ายของสารในหลอดที่คำนวณ (=ปริมาตรของสารที่ดูดมา (V1) + ปริมาตรเริ่มต้นในหลอดที่ คำนวณ) เช่น N2 = N1V1 V2 Dilution ของหลอดที่ 1 = 1(undiluted) X 0.5 ml = 1 X 0.5 = 1/2 = 1:2 (0.5+0.5 ml) 1 Dilution ของหลอดที่ 2 = ½ X 0.5 ml = ½ X 0.5 = 1/4 = 1:4 (0.5+0.5 ml) 1 Dilution ของหลอดที่ 3 = ¼ X 0.5 ml = ¼ X 0.5 = 1/8 = 1:8 (0.5+0.5 ml) 1 คำถามท้ายการทดลองที่ 2.1 1.ถ้าทำการเจือจางแบบ 3-fold serial dilution หลอดที่ 7 จะมีค่าความเจือจางเท่ากับเท่าไร 2.ถ้าทำการเจือจางแบบ 10-fold serial dilution หลอดที่ 5 จะมีค่าความเจือจางเท่ากับเท่าไร
28 ปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี(Antigen-Antibody reaction) บทนำ: เมื่อแอนติเจน (Ag) กับแอนติบอดี (Ab) ที่มีความเฉพาะเจาะจงมาพบกันก็จะเกิดการทำปฏิกิริยาซึ่งกัน และกันให้ผลเป็น agglutination หรือ precipitation ซึ่งทั้งนี้จะขึ้นอยู่กับชนิดของ Ag ถ้า Ag มีลักษณะเป็น อนุภาค (particle) เช่น เซลล์แบคทีเรียหรือพวกเม็ดเลือดแดง ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นจะเป็นแบบ agglutination โดย Ag จะมีการเกาะกลุ่มกันเกิดขึ้น แต่ถ้า Ag มีลักษณะเป็นสารละลาย เช่น albumin ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นก็จะ เป็นแบบ precipitation โดย Ag กับ Ab จะจับกันเป็นตะกอนก้อนใหญ่มองเห็นด้วยตาเปล่าได้ การทดลองที่ 2.2: การตรวจหมู่เลือด (Blood grouping) การตรวจหมู่เลือดจัดเป็นปฏิกิริยา agglutination ชนิดหนึ่งที่ทำบนแผ่นกระจกสไลด์ (slide agglutination test) เป็นการตรวจหาหมู่เลือด ABO โดยการหยดแอนติบอดีลงไปทำปฏิกิริยากับแอนติเจน ของหมู่เลือด ABO ที่อยู่บนผิวของเม็ดเลือดแดง แล้วเกิดปฏิกิริยา agglutination ให้เห็นได้ วัตถุประสงค์: เพื่อให้นักศึกษา 1. เข้าใจหลักการการเกิด agglutination 2. สามารถตรวจหมู่เลือดและอธิบายผลการตรวจหมู่เลือดได้ วัสดุอุปกรณ์: (จะตั้งไว้ที่โต๊ะกลางทั้งหมด) 1. Anti-A serum 1 ขวด 2. Anti-B serum 1 ขวด 3. ปากกาเจาะเลือดพร้อมเข็ม หรือ lancets 1 กล่อง 4. 70 % Ethanol 1 ขวด 5. สำลีก้อน 1 กระป๋อง 6. ไม้จิ้มฟัน 1 กล่อง 7. ปากกาเขียนแก้ว 1 แท่ง 8. Microscopic glass slides 1 กล่อง วิธีทำ: (ให้นักศึกษาทุกคนตรวจหมู่เลือดของตนเอง โดยการจับคู่กันแล้วผลัดกันตรวจ) 1. เขียนวงกลมสองวงบนด้านหลังของแผ่นสไลด์ ให้มีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1.5-2 ซ.ม. และ เขียนที่ใต้วงหนึ่งว่า A และอีกวงหนึ่งว่า B 2. ทำความสะอาดปลายนิ้วแล้วเช็ดปลายนิ้วด้วย 70% ethanol ทิ้งไว้ให้แห้ง 3. เจาะเลือดที่ปลายนิ้วนั้นด้วยปากกาเจาะเลือด หรือ lancet ที่จัดไว้ (ใช้ sterile technique)
29 4. หยดเลือดลงบนตรงกลางวงกลมข้างละหนึ่งหยด 5. หยด Anti-A ลงในวง A และ anti-B ลงในวง B 6. ใช้ปลายข้างหนึ่งของไม้จิ้มฟันช่วยผสมให้หยดเลือดและแอนติบอดีด้าน A เข้ากันและอีกปลาย ข้างหนึ่งสำหรับด้าน B (หรือใช้ไม้จิ้มฟันอันใหม่ ห้ามใช้ด้านเดียวกันทั้ง 2 วง) 7. เอียงสไลด์เป็นรูปเลข 8 (figure of 8) ไปมา 3-4 ครั้ง 8. สังเกตดูการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง (agglutination) ภายในเวลา 1 นาที 9. บันทึกผลการทดลองลงในตารางด้านล่าง พร้อมทั้งแปลผลการทดสอบหมู่เลือดของนักศึกษาแต่ละ คน *****หมายเหตุ: นักศึกษาต้องทิ้งอุปกรณ์ทุกอย่างลงในภาชนะที่จัดไว้ให้เท่านั้น (ภาชนะสำหรับทิ้งของมี คม ภาชนะสำหรับทิ้งของที่มีการปนเปื้อนเลือด เป็นต้น)**** การแปลผล ถ้าเกิด agglutination ทางด้าน A เท่านั้น แสดงว่าเป็นเลือดหมู่ A ถ้าเกิด agglutination ทางด้าน B เท่านั้น แสดงว่าเป็นหมู่เลือด B ถ้าเกิด agglutination ทั้งสองด้าน แสดงว่าเป็นหมู่เลือด AB ถ้าไม่เกิด agglutination ทั้งสองด้าน แสดงว่าเป็นหมู่เลือด O ตารางบันทึกผลหมู่เลือดของนักศึกษา จากการทดสอบโดยวิธี slide agglutination test No. ชื่อนักศึกษา ผลการทำปฏิกิริยากับ หมู่เลือด Anti-A Anti-B 1 2 3 4 + = เกิด agglutination, - = ไม่เกิด agglutination คำถามท้ายการทดลองที่ 2.2 1. Pro-zone คืออะไร 2. การตรวจหาหมู่เลือด ABO มีประโยชน์อะไรบ้าง 3. การทำ cross matching คืออะไร
30 การทดลองที่ 2.3: Immunodiffusion test (Double immunodiffusion, Ouchterlony’s method) Immunodiffusion test จัดเป็นการทดสอบปฏิกิริยา precipitation อย่างหนึ่ง แต่จะแตกต่างจากการ ทำ tube precipitation test ตรงตัวกลางที่ Ag และ Ab ใช้ในการทำปฏิกิริยากัน โดย immunodiffusion ปฏิกิริยาจะเกิดในตัวกลางที่เป็นของกึ่งแข็งกึ่งเหลว เช่น วุ้น แต่ tube precipitation test จะเกิดในตัวกลางที่ เป็นของเหลว ในปฏิกิริยา immunodiffusion จะอาศัยคุณสมบัติในการแพร่ (diffuse) ของสาร และความจำเพาะเจาะจง ระหว่าง Ag กับ Ab ในการทำปฏิกิริยากัน ทำให้สามารถมองเห็นเส้นตะกอนที่เกิดขึ้นในเนื้อวุ้นได้ ดังภาพ The immunodiffusion. แสดงการแพร่ของแอนติเจนและ แอนติบอดีในลักษณะวงกลม เข้าหากัน ที่ตำแหน่งที่มีความ เข้มข้นที่เหมาะสม (equivalent zone) จะเกิดเส้นตะกอน (precipitin line) ปรากฏให้เห็น ถ้าใช้Ag หลาย ๆ ชนิดในการทดสอบ โดยการหยอด Ag แต่ละตัวลงในแต่ละหลุม ก็สามารถที่จะบอก ความเหมือนหรือความแตกต่างระหว่าง Ag หลาย ๆ ชนิดนั้นได้ โดยดูจากลักษณะของเส้นตะกอนที่เกิดขึ้น ดัง ภาพที่แสดง
31 วัตถุประสงค์: เพื่อให้นักศึกษา 1. รู้หลักการและสามารถทำการทดสอบ immunodiffusion ได้ 2. สามารถอธิบายความสัมพันธ์ทางโครงสร้างของแอนติเจนที่ทดสอบได้โดยอาศัยผลจากการทำ immunodiffusion วัสดุอุปกรณ์: (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. 1% Agar-coated microscopic slide 2 แผ่น (สไลด์นี้ได้เจาะหลุมเรียบร้อยแล้ว แต่ละอันจะวางอยู่ใน petri dish ซึ่งมีสำลีชุบน้ำเพื่อให้เกิด ความชื้นตลอดเวลา) 2. Capillary tube 4 หลอด 3. Ag1 solution 1 หลอด 4. Ag2 solution 1 หลอด 5. Ag3 solution 1 หลอด 6. Antibody solution 1 หลอด 7. Automatic pipette พร้อม tip 1 ชุด วิธีทำ: 1. ฝึกหัดหยอดสารละลายลงในหลุม โดยใช้น้ำสีหยอดใส่หลุมใน agar slide แผ่นที่ 1ให้เกิดความ ชำนาญ โดยด้านหนึ่งฝึกหยอดโดยใช้ capillary tube ส่วน อีกด้านหนึ่งฝึกหยอดโดยใช้ automatic pipette 2. เริ่มหยอดสารละลายชนิดต่าง ๆ ลงในตำแหน่ง ตามรูปที่แสดง - ในการหยอดสารละลาย ให้ใช้ capillary tube 1 อัน ต่อ 1 สารละลายเท่านั้นห้ามใช้ปะปนกัน - การดูดสารละลายเข้า capillary tube ให้เอียงหลอดใส่สารละลาย สารละลายจะไหลเข้าไปเอง เมื่อสารละลายเข้าไปแล้วใช้ปลายนิ้วปิดปลายบนของ capillary tube แล้วนำไปใส่ในหลุม โดยให้ ปลาย capillary tube แตะกับก้นหลุม แล้วปล่อยนิ้วออกจากปลายบนของ capillary tube สารละลายจะ ไหลลงไปในหลุม กะประมาณให้สารละลายลงไปพอดีเต็มหลุม (อย่าใส่น้อยไปหรือมากจนล้นออกมา) แล้วจึงใช้ นิ้วอุดที่ปลายบนของ capillary tube หมายเหตุ: ให้ศึกษาวิธีการใช้ automatic pipette จากอาจารย์ประจำกลุ่มและหยอดสารต่าง ๆ ตาม รูปภาพ โดยใช้ปริมาตรหลุมละ 10 µl
32 1. แผ่นที่ 1 ใช้ฝึกซ้อม ด้านซ้ายใช้ capillary tube ด้านขวาใช้ automatic pipette 2. แผ่นที่ 2 ให้หยอดจริงตามรูปภาพ การหยอด Ag และ Ab ลงในหลุมต่าง ๆ หยอด Ag1 ในหลุมที่ 1,4 หยอด Ag2 ในหลุมที่ 2,5 หยอด Ag3 ในหลุมที่ 3,6 หยอด Ab ในหลุมที่ 7 3. เมื่อใส่สารละลายต่าง ๆ ครบตามหลุมที่กำหนด เอาแผ่นสไลด์ดังกล่าวใส่ petri dish เขียนชื่อกลุ่มและวันที่ ที่ทดลอง ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 4. มาดูผลวันรุ่งขึ้น วาดรูป precipitin band ที่เกิด และอธิบายว่าทำไมจึงเกิด precipitin band ใน ลักษณะเช่นนั้น คำถามท้ายการทดลองที่ 2.3 1. จากการทดสอบ immunodiffusion ปัจจัยอะไรบ้างที่มีผลต่อ ตำแหน่ง และรูปร่างของเส้นตะกอน และ มีผลอย่างไร 1 2 3 6 4 5 7 1 2 3 6 4 5 7
33 การทดลองที่ 2.4: การตรวจการตั้งครรภ์โดยใช้เทคนิค immunochromatography (Lateral flow immunoassay) การตรวจการตั้งครรภ์ สามารถใช้วิธีการตรวจหาฮอร์โมน Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) ในปัสสาวะของหญิงที่ตั้งครรภ์ได้ โดย HCG จะสร้างจากรกแล้วขับออกมาในปัสสาวะ วิธีการตรวจที่สะดวก รวดเร็วและนิยมกันในปัจจุบัน จะเป็นวิธีimmunochromatography (Lateral flow immunoassay) ซึ่ง สามารถซื้อมาตรวจเองได้โดยจะเป็นการตรวจหา -HCG (-subunit จะมีความจำเพาะกับ HCG แต่ถ้าตรวจ -subunit จะมี cross reaction กับ hormone อื่น ๆ ได้) หลักการของการทดสอบก็คือ ใช้nitrocellulose strip เป็นแถบทดสอบ โดยอาศัย capillary action เป็นตัวช่วยทำให้สารต่าง ๆ เคลื่อนที่ วิธีนี้จะใช้specific antibodies ต่อ antigen จำนวน 2 ตัว โดย antibody ตัวแรกจะเป็น monoclonal anibody (mAb) ที่ถูก label ด้วย colloidal gold ซึ่งรวมเรียกว่า gold conjugate และจะถูกดูดซับอยู่ในส่วนที่เรียกว่า sample pad ซึ่ง gold conjugate นี้จะเคลื่อนที่ได้เมื่อจุ่มลงในปัสสาวะ ส่วน antibody ตัวที่สองจะถูกตรึงไม่ให้มีการ เคลื่อนที่ซึ่งจะตรึงอยู่บน strip ในส่วนที่เรียกว่า “test line” และจะมี antibody ต่อ monoclonal Ab (anti-mAb) อีก 1 ตัวที่ใช้เพื่อเป็นตัวควบคุมผลการทดสอบ โดย anti-mAb จะถูกตรึงไม่ให้มีการเคลื่อนที่ (ใน บริเวณที่อยู่ถัดจาก specific antibody ที่ตรีงไว้ตัวแรก) ที่บริเวณที่เรียกว่า control line เมื่อจุ่มปัสสาวะลง ใน sample pad สารต่างๆ ก็จะเคลื่อนที่ไปยังส่วนปลายของ membrane จนถึง control line จะเกิดแถบสี ม่วงแดงให้เห็นที่ control line และ/หรือ test line ในการทดสอบการตั้งครรภ์ เมื่อจุ่ม strip ลงในปัสสาวะทางด้าน sample pad จะทำให้HCG ที่อยู่ใน ปัสสาวะเคลื่อนที่มาจับกับ gold conjugate (monoclonal antibody-collodal gold conjugate) ที่อยู่ใน sample pad เกิดเป็น immune complex แล้วเคลื่อนที่ตาม capillary action มาพร้อม ๆ กับ gold conjugate ส่วนที่เหลือที่ยังไม่ได้จับกับ HCG, เมื่อถึงบริเวณ test line ซึ่งมีAb ที่จำเพาะต่อ HCG ตรึงอยู่ ก็จะจับกับ Ag ที่อยู่ใน immune complex เป็นลักษณะของ sandwich ทำให้มีการสะสม gold บริเวณนี้มาก ขึ้นจนเห็นเป็นแถบสีม่วงแดง ส่วน gold conjugate ที่ไม่ถูกจับที่ test line ก็จะเคลื่อนที่ไปถึงบริเวณ control line ซึ่งมี anti-mAb ตรึงอยู่ก็จะจับกับ mAbใน gold conjugate ทำให้เกิดการสะสมของ colloidal gold ที่บริเวณนี้จนเป็นแถบสีม่วงแดง ดังนั้นถ้าเห็นแถบสีม่วงแดง 2 แถบ แสดงว่าให้ผลบวก ถ้าเห็นแถบเดียวที่ control line แสดงว่าให้ผลลบ กรณีที่ไม่มีแถบแถบสีม่วงแดงใด ๆ เกิดขึ้นหรือมีแถบสีม่วงแดงเกิดที่ test line เท่านั้น แปลว่าการทดสอบนี้แปลผลไม่ได้ (invalid) ต้องทำการทดสอบใหม่ หรือหาสาเหตุว่าเป็นเพราะอะไร
34 วัตถุประสงค์ 1. เพื่อให้นักศึกษารู้จักหลักการเบื้องต้นของ Immunochromatography 2. เพื่อให้นักศึกษามีประสบการณ์ในการทดสอบการตั้งครรภ์จากปัสสาวะ โดยวิธี immunochromatography อุปกรณ์ นักศึกษาแต่ละกลุ่ม จะได้รับอุปกรณ์ดังนี้ 1. ขวดปัสสาวะ 1 ขวด 2. -HCG test strip จำนวน 1 ชุด 3. Petri dish 1 plate วิธีทำ 1. ฉีกซองใส่ -HCG test strip ซึ่งภายในจะมี strip อยู่ 1 อัน และสารดูดความชื้น 1 ซอง 2. จับปลายด้านบน strip แล้วนำปลายด้านล่างจุ่มลงในปัสสาวะที่เก็บมาโดยอย่าจุ่มเกินกว่าขีดที่ กำหนด นานประมาณ 30-60 วินาที 3. วาง strip ลงบนฝา Petri dish ในแนวระนาบ แล้วอ่านผลภายใน 5 นาที
35 การอ่านผลการทดลอง ผลบวก - จะเกิดแถบสีม่วงแดง 2 แถบที่ test line 1 แถบและที่ control line 1 แถบ ผลลบ - จะพบแถบสีม่วงแดง 1 แถบที่ control line เท่านั้น แปลผลไม่ได้ (invalid) - ไม่มีแถบแถบสีม่วงแดงใด ๆ เกิดขึ้น - หรือมีแถบสีม่วงแดงเกิดที่ test line เท่านั้น คำถามท้ายการทดลองที่ 2.4 1. ทำไมจึงห้ามจุ่มปัสสาวะเกินขีดที่กำหนด 2.จงยกตัวอย่างการตรวจหาสารชนิดอื่นมาอย่างน้อย 2 ชนิด ที่ใช้หลักการ immunochromatography
36 การสาธิตที่ 2.1: Tube precipitation test วัตถุประสงค์: เพื่อให้นักศึกษา 1. รู้หลักการของการเกิด precipitation 2. สามารถทำและอ่านผลปฏิกิริยา precipitation ได้ 3. เข้าใจความหมายของคำว่า titer วัสดุอุปกรณ์: 1. แอนติบอดี(Ab) = Rabbit anti-normal human serum albumin 1 หลอด 2. แอนติเจน (Ag) = Human serum albumin (HSA) 1 หลอด 3. Normal saline solution (NSS) 1 หลอด 4. pipette 1 ml. 8 อัน 5. pipette 5 ml. 2 อัน 6. test tube ขนาด 13 X 100 mm. 8 หลอด 7. parafilm 8 ชิ้น 8. ลูกยางแดงสำหรับดูด pipette 1 ลูก วิธีทำ: ดูแผนภูมิภาพประกอบ 1. เรียง test tube ลงใน rack พร้อมกับเขียนข้างหลอด 1 ถึง 8 ตามลำดับ 2. ใช้ pipette 5 ml. เติม NSS หลอดละ 0.5 ml ทุกหลอด 3. ใช้ pipette 1 ml. อันที่ 1 ดูด Ab 0.5 ml. ลงในหลอดที่ 1 โดยระวังไม่ให้ปลาย pipette จุ่มลงใน NSS แล้วทิ้ง pipette อันที่ 1 นี้ลงในภาชนะสำหรับใส่ pipette 4. ใช้ pipette 1 ml. อันที่ 2 ดูดผสมสารละลายในหลอดที่ 1 โดยดูด-ปล่อย 5-6 ครั้ง (ระวังอย่าดูดเป่า ให้สารละลายเป็นฟอง) เมื่อผสมดีแล้ว ดูดสารละลายมา 0.5 ml. ใส่ในหลอดที่ 2 โดยไม่ให้ปลาย pipette จุ่ม ลงใน NSS แล้วทิ้ง pipette ลงในภาชนะสำหรับใส่ pipette 5. สำหรับหลอดต่อไปให้ทำเหมือนกับหลอดที่ 1 และ 2 จนถึงหลอดที่ 7 ใช้ pipette 1 ml. อันใหม่ดูด สารละลายทิ้ง 0.5 ml. ส่วนหลอดที่ 8 นั้น ไม่ต้องทำอะไร 6. ใช้ pipette 1 ml. เติม Ag ลงไปตั้งแต่หลอดที่ 1 ถึง 8 หลอดละ 1 หยด 7. ปิดปากหลอดด้วย parafilm เขย่า rack ที่มีหลอดอยู่เบา ๆ หลาย ๆ ครั้ง 8. นำไปแช่ใน water bath ที่ 37o C 1 ชั่วโมง 9. ครบเวลาแล้ว นำไปใส่ตู้เย็น 1 คืน รุ่งเช้าจึงมาดูผลการทดลอง 10. อ่านผลโดยการดูตะกอนที่ก้นหลอดอ่านผลเป็น +4, +3, +2, +1 ตามลำดับความมากน้อยของ ตะกอน
37 แผนภูมิ แสดงขั้นตอนในการทำ tube precipitation ส่วนการหา titer ของ Ab นั้น จะถือเอาหลอดที่มี dilution สูงสุดของ Ab ที่ยังเกิดตะกอนให้เห็นได้ โดยตอบเป็นค่าส่วนกลับของ dilution ของหลอดนั้น เช่น จากการทำ tube precipitation test พบว่า เกิด ตะกอนขึ้นตั้งแต่หลอดที่ 1 ถึงหลอดที่ 4 ดังนั้น titer ของ Ab จะเท่ากับ 16 (เพราะหลอดที่ 4 มีค่า dilution 1:16 และเป็นหลอดที่มีค่า dilution สูงสุดที่เกิดตะกอน) หรืออาจจะตอบค่า titer โดยใช้ค่าของ dilution ก็ได้ ซึ่งเท่ากับ 1:16
38 การสาธิตที่ 2.2: Immunoelectrophoresis (IEP) บทนำ: อาศัยหลักการที่ protein หรือ particle ที่มีประจุต่างกันจะเคลื่อนที่ไปด้วยความเร็วต่างกันภายใต้ อิทธิพลของสนามไฟฟ้า เราสามารถแยกสารต่าง ๆ ที่ผสมกันอยู่ออกจากกันได้ ซึ่งวิธีที่ใช้เรียกว่า electrophoresis และอาศัยคุณสมบัติในการเกิด precipitation ระหว่าง antigen กับ specific antibody ในเนื้อวุ้นที่เรียกว่า immnodiffusion. Grabar และ Williams ได้พัฒนาวิธีการที่จะวิเคราะห์หา antigen หลาย ๆ ชนิดที่รวมกันอยู่เป็นสารผสม โดยอาศัยหลักการทั้งสองอย่างที่กล่าวมารวมกัน ตั้งชื่อวิธีที่ใช้ว่า immunoelectrophoresis โดยจะมีขั้นตอนการแยกแอนติเจนออกจากกันตามประจุด้วยกระแสไฟฟ้า ก่อน (electrophoresis) หลังจากนั้น จึงให้แอนติเจนที่แยกด้วยกระแสไฟฟ้านี้แล้ว ทำปฏิกิริยากับแอนติบอดี ต่อไปแบบ immunodiffusion วัตถุประสงค์: เพื่อศึกษา technique และการแปลผลการทดลอง immunoelectrophoresis ขั้นตอนการทดสอบโดยวิธี immunoelectrophoresis (IEP) มีดังนี้ 1. เจาะหลุมบนแผ่นสไลด์ที่มีวุ้นเคลือบอยู่ แล้วใส่แอนติเจนลงไป จากนั้นจึงผ่าน กระแสไฟฟ้า 2. หลังจากนั้นเจาะหลุมยาว (trough) แล้ว เติมแอนติบอดี 3. เมื่อตั้งทิ้งไว้ให้เกิดปฏิกิริยาก็จะเกิดเส้น ตะกอนระหว่างแอนติบอดีกับแอนติเจน (ที่ ถูกแยกด้วยกระแสไฟฟ้าไว้ก่อนแล้ว) 4. รูปแสดงของจริงในเนื้อวุ้น คำถามท้ายการสาธิตที่ 2.2. 1. จงยกตัวอย่างการทดสอบที่ใช้หลักการของวิธี immunoelectrophoresis มา 1 การทดสอบ 2. วิธีimmunoelectrophoresis เป็นวิธีที่มีการแยกแอนติเจนตามคุณสมบัติอะไร ก่อนที่จะมาทำปฏิกิริยา กับแอนติบอดี
39 การสาธิตที่ 2.3: Single radial immunodiffusion (SRID) (Mancini’s method) บทนำ: Single radial immunodiffusion. วิธีนี้เป็นการทำปฏิกิริยาในเนื้อวุ้นที่ผสมแอนติบอดีไว้ก่อนแล้ว และตั้งทิ้งไว้ให้แข็งตัวบนกระจกสไลด์ มีการเจาะหลุมหลาย ๆ หลุม สำหรับใส่แอนติเจนมาตรฐาน (standard antigen) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ และใส่สิ่งส่งตรวจที่ต้องการหาปริมาณของแอนติเจน เมื่อตั้งทิ้งไว้แอนติเจนจะ แพร่ผ่านเนื้อวุ้นเป็นวงออกจากหลุม เข้ามาทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีในเนื้อวุ้น เมื่อถึงตำแหน่งที่มีความเข้มข้น ที่เหมาะสมก็จะปรากฏวงตะกอน (precipitin ring) ให้เห็นดังรูป ก. และเมื่อนำเส้นผ่าศูนย์กลางของวงตะกอน ยกกำลังสอง ไปเขียนกราฟเทียบกับความเข้มข้นของแอนติเจนมาตรฐานบนกระดาษ semi-log ก็สามารถสร้าง กราฟมาตรฐานเพื่อใช้หาปริมาณของแอนติเจนในสิ่งส่งตรวจได้ ดังรูป วัตถุประสงค์: เพื่อศึกษา technique และการแปลผลการทดลอง single radial immunodiffusion Single radial immunodiffusion ร ู ป ก. แ ส ด ง ก า ร แ พ ร ่ ข อ ง แอนติเจนในลักษณะวงกลมในเนื้อ วุ้น และเมื่อถึงตำแหน่งที่มีความ เข้มข้นที่เหมาะสมกับแอนติบอดี (equivalent zone) จ ะ เ ก ิ ด ว ง ตะกอน (precipitin ring) ปรากฏ ให้เห็น รูป ข. แสดงกราฟมาตรฐาน สำหรับหาปริมาณของแอนติเจน ใน unknown sample
40 การสาธิตที่ 2.4: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) บทนำ: ELISA เป็นวิธีการทดสอบหาแอนติเจนหรือแอนติบอดีที่อาศัยหลักการของการทำปฎิกิริยาระหว่าง แอนติเจนและแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อกัน เช่นเดียวกับวิธีอื่น ๆ ที่กล่าวมา ต่างกันตรงที่ว่าในการ ทดสอบวิธีนี้ เราใช้ enzymatic reaction เป็นตัวบอกว่ามี antigen-antibody reaction เกิดขึ้นโดยการนำ enzyme นั้นไปติดฉลากกับแอนติเจนหรือแอนติบอดี เมื่อมีปฏิกิริยา Ag-Ab เกิดขึ้น enzyme นั้นก็จะ สามารถเปลี่ยนสีของ substrate ได้ วิธี ELISA นั้น แบ่งออกเป็นชนิดใหญ่ ๆ ได้ 2 ชนิดคือ competitive และ non-competitive ELISA 1. Competitive ELISA เป็นวิธีทดสอบที่อาศัยหลักการให้แอนติเจน (หรือแอนติบอดี) ที่ต้องการหา ปริมาณแย่งกับแอนติเจน (หรือแอนติบอดี) ชนิดเดียวกันนั้นซึ่งได้ติดฉลากไว้ด้วยเอ็นซัยม์ ในการจับกับ แอนติบอดี (หรือแอนติเจน) ที่จำเพาะ ซึ่งเกาะติดอยู่กับพื้นผิวพลาสติกหรือแก้ว (solid matrix) ถ้าแอนติเจนที่ ทดสอบมีมากก็จะแย่งจับกับแอนติบอดีได้มาก ทำให้แอนติเจนที่มีเอ็นซัยม์จับอยู่กับแอนติบอดีบนพื้นผิว พลาสติกได้น้อย ดังนั้นก็มีเอ็นซัยม์ติดอยู่กับพื้นผิวพลาสติกนั้นน้อยด้วย เมื่อเติม substrate การเปลี่ยนสีของ substrate ที่เกิดขึ้นจะเป็นสัดส่วนผกผันกับปริมาณของแอนติเจนที่ต้องการทดสอบนั้น 2. Non-competitive ELISA การทดสอบนี้จะใช้สำหรับหาปริมาณของแอนติเจนหรือแอนติบอดีก็ได้ สมมุติต้องการหาแอนติเจน (โดยวิธี double antibody sandwich ELISA) ก็ให้แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ แอนติเจนนั้นเกาะติดกับ solid matrix แล้วใส่สารที่ต้องการทดสอบลงไป เพื่อให้แอนติเจนที่มีอยู่ทำปฏิกิริยา กับแอนติบอดีแล้วล้าง antigen ส่วนเกิน (excess) ออก เติมแอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยเอ็นซัยม์ลงไป ซึ่ง แอนติบอดีตัวนี้จะไปจับกับ antigen ที่เกาะติดกับแอนติบอดีตัวแรก (ดังนั้นก็จะมีเอ็นซัยม์ติดอยู่กับแอนติเจน ด้วย) เมื่อเติม substrate ลงไป การเปลี่ยนสีของ substrate ที่เกิดขึ้นจะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของ แอนติเจนใน สิ่งส่งตรวจนั้น ๆ วัตถุประสงค์: เพื่อให้เข้าใจหลักการของการทดสอบ ELISA และเห็นลักษณะการเปลี่ยนแปลงสีของ substrate เมื่อทำปฏิกิริยากับเอ็นซัยม์ คำถามท้ายการสาธิตที่ 2.4. 1. Substrate ที่ใช้ในวิธี ELISA นี้เป็นชนิดอะไร (ละลายน้ำ หรือไม่ละลายน้ำ) 2. วิธี ELISA สามารถใช้ตรวจหาสารอะไรได้บ้าง (Ag หรือ Ab)