41 ตัวอย่างแผนภาพการตรวจหาแอนติบอดี โดยวิธี indirect ELISA (เป็น non-competitive ELISA) เอกสารอ้างอิง 1. สุทธิพันธ์สาระสมบัติและคณะ. อิมมูโนวิทยา พิมพ์ครั้งที่ 4. เค.พี.พริ้นติ้ง: กรุงเทพฯ 2537. 2. Immunology. Edited by Roitt IM, Brostoff J, Male D. London : Gower Medical Publishing 1985. 3. Basic and Clinical Immunology. Edited by Stites DP, Stobo JD, Fudenberg HH, Wells JV. 5th ed. Singapore : Maruzen Asia; 1984. 4. Mancini G, Carbonara AO, Herewans JF. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry 1965; 2: 35. 5. Fahey JL, Mckelvey EM. Quantitative determination of serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J Immunol 1965; 94: 80.
42
43 ปฏิบัติการที่ 3 รูปร่างและโครงสร้างของแบคทีเรีย (Morphology and structure of bacteria) ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ ผศ.ดร.ฐิติมา นุตราวงศ์ บทนำ การศึกษารูปร่างและโครงสร้างของเชื้อแบคทีเรีย หมายถึง การศึกษารูปร่าง (shape) ขนาด (size) และการเรียงตัวของแบคทีเรีย (arrangement) ด้วยการย้อมสีแบคทีเรีย ทำให้เห็นรูปร่างและการเรียงตัวของ แบคทีเรียต่าง ๆ ซึ่งเป็นลักษณะจำเพาะของแบคทีเรียแต่ชนิด และ เป็นขั้นตอนแรกในกระบวนการตรวจ วินิจฉัยโรคติดเชื้อจากแบคทีเรียทางห้องปฏิบัติการ รูปร่างของแบคทีเรียแบ่งออกได้เป็น 3 ชนิด คือ 1. Cocci หมายถึง แบคทีเรียที่มีรูปร่างกลมหรือทรงรีมีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1 ไมครอน (1 m) ซึ่งอาจมีการเรียงตัวได้ต่าง ๆ กัน เช่น เป็นสายยาว ๆ เป็นกลุ่ม หรือ เป็นคู่ เช่น Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae 2. Bacilli หมายถึง แบคทีเรียที่มีรูปร่างทรงกระบอกหรือเป็นแท่ง โดยมีขนาดต่าง ๆ กัน การเรียงตัว อาจอยู่เดี่ยว ๆ กระจัดกระจายหรืออยู่เป็นสายก็ได้เช่น Escherichia coli, Bacillus subtilis 3. Spirillum หมายถึง แบคทีเรียที่มีรูปร่างโค้งงอ หรือเป็นเกลียว แบคทีเรียพวกนี้อยู่เดี่ยว ๆ ไม่อยู่ ติดกันเป็นกลุ่มหรือเป็นสาย เช่น Treponema pallidum อย่างไรก็ตาม แบคทีเรียบางชนิด มีรูปร่างและขนาดไม่แน่นอนได้ ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับอาหารและสภาพ สิ่งแวดล้อม แบคทีเรียบางชนิดอาจมีรูปร่างเป็นท่อนสั้น ๆ คล้ายพวก cocci หรือบางครั้ง cocci มีรูปร่างยืดยาว เป็นรูปยาวรีหรือรูปไข่ก็ได้ เรียกรูปร่างแบบนี้ว่า coccobacilli วัตถุประสงค์: 1. เพื่อให้รู้จักรูปร่างโครงสร้าง, การเรียงตัว, การติดสี ของเชื้อแบคทีเรีย 2. เพื่อให้รู้จักและสามารถบอกขั้นตอน, ชื่อและหน้าที่ของสีและสารในกระบวนการย้อมสีแบคทีเรียวิธี ต่างๆ เพื่อศึกษารูปร่างโครงสร้างของแบคทีเรียได้ 3. เพื่อให้สามารถใช้กล้องจุลทรรศน์ได้อย่างถูกต้อง ในการศึกษารูปร่างและลักษณะของแบคทีเรียได้
44 การศึกษารูปร่างของแบคทีเรีย เนื่องจากตัวแบคทีเรียใส ทำให้มองเห็นได้ยาก การศึกษารูปร่างของแบคทีเรีย จึงต้องทำการย้อมสี แบคทีเรียเสียก่อน ส่วนใหญ่สีที่ใช้ย้อมแบคทีเรียได้มาจาก coal tar derivative เรียก aniline dyes โดยสีจะ ไปทำปฏิกิริยาเคมีกับไซโทพลาซึม (cytoplasm) ของแบคทีเรีย ถ้าเซลล์แบคทีเรียยังไม่ตายขั้นตอนในการย้อม สีก็จะทำให้แบคทีเรียตาย เซลล์แบคทีเรียมีกรดนิวคลิอิก (nucleic acid) เป็นจำนวนมาก จึงทำให้แบคทีเรียมีประจุสุทธิ (net charge) เป็นลบ (negative charge) ดังนั้นในการย้อมแบคทีเรียให้ติดสีจะต้องใช้สีที่เป็นประจุบวก ได้แก่ สี ย้อมกลุ่ม basic dyes เช่น methylene blue, crystal violet, basic fuchsin, safranin เป็นต้น การศึกษารูปร่างของแบคทีเรีย ด้วยการย้อมสี มีการย้อม 3 วิธี คือ 1. Simple stain เป็นการย้อมด้วยสีชนิดเดียว การย้อมแบบนี้ทำได้ง่าย สะดวก และรวดเร็ว สีที่ ใช้ย้อม ได้แก่ methylene blue, crystal violet เป็นต้น 2. Differential stain เป็นการย้อมที่ใช้สีมากกว่า 1 ชนิด ทำให้เห็นความแตกต่างของการติดสี ของเซลล์แบคทีเรียตามคุณสมบัติของส่วนประกอบของแบคทีเรีย การย้อมวิธีนี้ และมีการใช้ decolorizing agent ร่วมด้วย วิธีที่ใช้กันมากคือ Gram's stain และ Acid fast stain 3. Negative stain เป็นการย้อมพื้นหลัง (background) ไม่ได้ย้อมเซลล์แบคทีเรีย หลังการย้อม จะเห็นแบคทีเรียใส ไม่ติดสี ทำให้แตกต่าง (contrast) จากพื้นหลัง ช่วยให้เห็นรูปร่างของแบคทีเรียง่ายขึ้น สีที่ ใช้เป็น acidic dye เช่น Nigrosin ซึ่งจะย้อมพื้นหลังเป็นสีดำ ส่วนแบคทีเรียใสไม่ติดสี การย้อมแบบนี้ใช้กันน้อย มักใช้กับแบคทีเรียที่ย้อมติดสียาก นอกจากนี้ยังมีวิธีย้อมพิเศษต่าง ๆ เพื่อศึกษาถึงส่วนประกอบอื่น ๆ ของแบคทีเรีย เช่น การย้อมเพื่อ ศึกษาดู flagella, cell wall, cell membrane, granule และ spore เป็นต้น Gram's stain การย้อม Gram's stain ถูกคิดขึ้นเมื่อ ค.ศ.1884 โดย นักวิทยาศาสตร์ชาวเดนมาร์ก Hans Christian Joachim Gram (1853-1938) ต่อมามีผู้ปรับปรุงวิธีย้อมออกไปหลายแบบ วิธีที่จะใช้ในบทปฏิบัติการนี้เป็นวิธี ซึ่งดัดแปลงโดย Hucker (Hucker modification) โดยมีการใช้สีย้อม 2 สี คือ crystal violet และ safranin ผลของการย้อมสีก็จะให้ผลสีที่แตกต่างกันตามชนิดของแบคทีเรีย วิธีการย้อมสีนี้ จึงจัดเป็น differential stain การย้อม Gram's stain จะจำแนกแบคทีเรียออกเป็น 2 กลุ่ม คือ 1. Gram positive bacteria แบคทีเรียกลุ่มนี้จะติดสีม่วง ของ crystal violet 2. Gram negative bacteria แบคทีเรียกลุ่มนี้จะติดสีชมพูหรือแดงของ safranin
45 ขั้นตอนและหลักการในการย้อม Gram's stain ขั้นตอน หลักการ 1. Smear และ fix 1. ทำให้แบคทีเรียติดกับสไลด์(fix) โดยใช้ความร้อน 2. การย้อมด้วย สี crystal violet 2. Crystal violet เป็นสีแรกที่ใช้ในการย้อมซึ่งทำให้แบคทีเรียติดสี ม่วง เนื่องจาก crystal violet มีประจุเป็นบวก สามารถผ่านผนัง เซลล์ (cell wall) เยื่อหุ้มเซลล์(cell membrane) แบคทีเรียเข้า ไปทำปฏิกิริยาสารในเซลล์แบคทีเรีย ทำให้เซลล์ทั้งหมดติดสีม่วง 3. การย้อมทับด้วย Gram iodine 3. Gram iodine ทำหน้าที่เป็น mordant (สารที่ช่วยทำให้สีย้อมติด) เพราะไอโอดีนมีประจุลบ จึงทำปฏิกิริยากับ crystal violet ที่มี ประจุบวกและติดสีแบคทีเรียอยู่ก่อน จะเกิดเป็น crystal violetiodine complex ป้องกันการหลุดของสีย้อมจากเซลล์แบคทีเรีย 4. Decolorization ด้วย 95% alcohol 4. เป็นการล้างสี crystal violet ออกจากเซลล์แบคทีเรียโดย หลักการที่ แบคทีเรียชนิด Gram positive จะมีส่วนประกอบที่ เป็น peptidoglycan ที่เรียงกันหลายชั้น ทำให้สีที่ติดอยู่ภายใน เซลล์ไม่หลุดออก แต่แบคทีเรียชนิด Gram negative มี ส่วนประกอบที่เป็น peptidoglycan น้อยกว่า และมีไขมันที่ผนัง เซลล์มาก เมื่อล้างด้วยแอลกอฮอล์จะทำให้ไขมันหลุดออกจาก เซลล์ ผนังเซลล์มีรูพรุนขนาดโตพอที่จะให้ crystal violet-iodine complex ที่จับกับเซลล์ที่ย้อมในขั้นตอนแรก ถูกล้างออกจาก เซลล์ได้ง่าย 4.1.ขั้นตอนการทำ decolorization เป็นขั้นตอนที่สำคัญในการ ทำ Gram’s stain เพราะหากทำการล้างนานเกินไป สีที่ติด แบคทีเรียทั้ง Gram positive และ negative หลุดออกจาก เซลล์ หรือหากล้างน้อยเกินไป สีก็ยังคงติดอยู่ในเซลล์ของ แบคทีเรียทั้งสองกลุ่ม ทำให้ไม่สามารถเห็นความแตกต่างได้ 4.2.ขั้นตอนนี้แบคทีเรียแกรมบวกจะติดสีม่วงแต่แบคทีเรียแกรม ลบจะไม่ติดสี 5. การย้อมด้วยสี safranin 5. เป็นขั้นตอนการย้อมทับด้วยสี safranin ซึ่งมีประจุบวก ทำให้เซลล์ แบคทีเรียแกรมลบ ย้อมติดสีแดงของ safranin แต่แบคทีเรียแกรม บวกยังคงติดสีม่วงของ crystal violet-iodine complex
46 Acid fast stain เป็นการย้อมสีเชื้อ Mycobacterium เนื่องจากเชื้อกลุ่มนี้ย้อมสีด้วยวิธีธรรมดา (simple stain หรือ Gram's stain) จะไม่ติดสีหรือติดสียาก เพราะส่วนประกอบของผนังเซลล์มีไขมันสูงจึงติดสีได้ยาก ต้องใช้วิธีย้อม พิเศษที่ต้องอาศัยความร้อนหรือสารเคมีบางอย่างช่วยจึงจะติดสีได้และเมื่อทำให้เชื้อติดสีแล้วล้างสีออกได้ยาก ด้วยวิธีธรรมดา หรือถึงแม้จะใช้ acid alcohol ก็ตาม จึงเรียกแบคทีเรียพวกนี้ซึ่งทนต่อการล้างสีออกด้วย acid alcohol ว่า acid fast bacteria และเรียกวิธีย้อมแบบนี้ว่า acid fast stain วิธีที่นิยมใช้กันมี 2 วิธี คือ Ziehl-Neelsen stain และ Kinyoun stain โดยพวก acid fast bacteria จะติดสีแดงส่วนพวก non-acid fast bacteria ติดสีน้ำเงิน การทดลอง: การศึกษารูปร่าง การเรียงตัว และการติดสีของแบคทีเรีย วัตถุประสงค์: เพื่อให้นักศึกษาสามารถ 1. ทำ smear และ fix เชื้อแบคทีเรียบนสไลด์ได้โดยวิธีที่ถูกต้อง 2. ย้อมสีแบคทีเรียด้วยวิธี Gram’s stain และ Acid fast stain ได้ 3. บอกถึงการติดสี รูปร่างและการเรียงตัวของแบคทีเรียได้ วัสดุอุปกรณ์: 1. สีย้อม Gram's stain 1 ชุด ประกอบด้วย 1.1. Crystal violet 1 ขวด 1.2. Gram's iodine 1 ขวด 1.3. 95 % alcohol 1 ขวด 1.4. Safranin 1 ขวด 1.5. ขวดใส่น้ำประปา 1 ขวด (จัดไว้ตรงบริเวณอ่างล้างมือ) 2. สีย้อม Acid fast stain 1 ชุด ประกอบด้วย 2.1. Kinyoun carbolfuchsin 1 ขวด 2.2. Acid alcohol 1 ขวด 2.3. Methylene blue 1 ขวด (จัดไว้ตรงบริเวณอ่างล้างมือ) 3. ถาดย้อมสีพร้อมแท่งแก้วสำหรับวางสไลด์เวลาย้อมสี 1 ถาด (จัดไว้ตรงบริเวณอ่างล้างมือ) 4. Microscopic glass slide (จัดไว้ตรงโต๊ะกลาง) 5. เชื้อแบคทีเรีย 2 ชนิด (mixed culture) ในอาหารเหลว 1 หลอด Streptococcus pyogenes Escherichia coli
47 6. เชื้อแบคทีเรีย 4 ชนิด บนอาหารแข็ง (blood agar) โดยแยกเป็น plate ละ 2 ชนิด Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Bacillus sp. Neisseria sp. 7. สไลด์เสมหะผู้ป่วยวัณโรค (อบฆ่าเชื้อแล้ว) ซึ่งได้ smear และ fix ให้แล้ว 1 แผ่น อยู่ในกล่อง 8. Inoculating loop วิธีทำ 1. การทำ smear และ fix (ดูภาพที่ 1 ประกอบ) 1.1. การเตรียมสไลด์ ทำความสะอาดสไลด์เพื่อกำจัดไขมันด้วยการล้างด้วยผงซักฟอกและล้างน้ำให้สะอาด เสร็จแล้วเช็ดให้ แห้ง (สไลด์ที่ใช้ในปฏิบัติการนี้ ได้ทำความสะอาดแล้ว พร้อมใช้ได้เลย) 1.2. การทำ smear 1.2.1. กรณีที่ย้อมแบคทีเรียในอาหารเหลว (broth) ให้ใช้ loop ที่ sterile (โดยการเอา loop เผา ไฟจน loop ร้อนแดง แล้วปล่อยให้เย็น) จุ่มลงในอาหารที่มีเชื้อ แล้วยก loop ขึ้นตรง ๆ จะเห็นว่ามีอาหารเหลว ติด loop เป็นฟิล์มบาง ๆ แล้วนำไปป้าย (smear) บนสไลด์ที่เตรียมไว้ เกลี่ยให้เชื้อแผ่เป็นแผ่นฟิล์มบาง ๆ (ถ้า ใช้สไลด์ที่ไม่สะอาดหรือมีไขมันเกาะติดอยู่จะทำให้การ smear ไม่กระจายออกไปเป็นแผ่นบาง ๆ แต่จะได้เป็น หยดน้ำจับกันเป็นกลุ่ม ๆ) 1.2.2. กรณีที่ย้อมแบคทีเรียที่เจริญอยู่ในอาหารแข็ง (agar) ให้นำ loop แตะน้ำลงบนสไลด์ แล้ว จึงนำ loop เผาไฟให้ร้อนแดง รอให้เย็น แล้วไปแตะแบคทีเรียที่อยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อเพียงเล็กน้อย แล้วนำมา เกลี่ยบนหยดน้ำที่อยู่บนสไลด์ ให้เป็นแผ่นฟิล์มบาง ๆ แล้วทิ้งไว้ให้แห้ง 1.3. การ fix เมื่อแผ่นฟิล์มที่ smear เชื้อไว้แห้งแล้วทำการ fix โดยหงายสไลด์ด้านที่มีเชื้อขึ้น แล้วผ่านด้านล่างของ สไลด์ไปมาเหนือเปลวไฟ 3 ครั้ง (heat fix) ซึ่งต้องระวังไม่ให้โดนความร้อนมากเกินไปเพราะจะทำให้เซลล์แตก หรือเสียรูปร่างได้ขั้นตอนนี้จะทำให้แบคทีเรีย fix ติดกับสไลด์เพื่อป้องกันไม่ให้เชื้อหลุดจากสไลด์ในระหว่างการ ย้อมสี
48 ภาพที่ 3.1 ภาพแสดงการเตรียม smear slide เชื้อแบคทีเรีย
49 2. การย้อมสี 2.1. Gram's stain (ดูภาพที่ 2 ประกอบ) 1. วางสไลด์บนแท่งแก้วที่วางอยู่บนถาดย้อมสี แล้วหยดสี crystal violet ลงบนสไลด์ให้ท่วม บริเวณที่ smear เชื้อ ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที 2. เมื่อครบเวลา เทสี crystal violet ทิ้งในถาด แล้วล้างด้วยน้ำ 3. หยด Gram's iodines 2-3 หยด ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที 4. เมื่อครบเวลา เท Gram's iodine ออก แล้วล้างด้วยน้ำ 5. ล้างสีออกด้วย 95% alcohol แล้วล้างน้ำอีกครั้งหนึ่ง 6. หยด safranin 3-4 หยด ทิ้งไว้ 15-30 วินาที เมื่อครบเวลา เทสีออกล้างน้ำ ทิ้งไว้ให้แห้ง แล้วจึงนำไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยใช้กำลังขยาย 100X (oil immersion objective lens) โดยทำ ตามขั้นตอนการใช้กล้องจุลทรรศน์ที่ถูกวิธีบันทึกผลการย้อมสีแกรมในใบรายงานผลการทดลอง โดยระบุ ชื่อเชื้อแบคทีเรีย ชนิดของแกรม รูปร่างและการเรียงตัวของแบคทีเรีย การอ่านผลการทดลอง ผลการย้อมสีแกรม : แบคทีเรียแกรมบวกติดสีม่วง แบคทีเรียแกรมลบติดสีแดง ภาพที่ 3.2 ภาพแสดงการย้อมสีแกรม (Gram's stain)
50 2.2. Acid fast stain วิธีการย้อมแบบ acid fast stain ที่นิยมกันมีอยู่ 2 วิธีคือ 2.2.1. Ziehl Neelsen stain for AFB 1. Smear และ fix เชื้อบนสไลด์ 2. หยดสี carbolfuchsin ให้ท่วมสไลด์แล้วนำไปวางเหนือเปลวไฟ heat จนกระทั่งสีย้อมเริ่ม เดือด ย้อมนาน 5 นาที (ต้องหมั่นเติมสีอยู่เสมอเพื่อไม่ใส่สีแห้งตกตะกอน) 3. เมื่อครบเวลา ล้างด้วยน้ำ 4. ล้างสีออกโดยใช้ acid-alcohol จนกระทั่งน้ำที่ล้างไม่มีสี ล้างด้วยน้ำ 5. ย้อมด้วยสี methylene blue นาน 1 นาที 6. ล้างน้ำ และปล่อยทิ้งไว้ให้แห้ง 2.2.2. Kinyoun stain for AFB (ดูภาพที่ 3 ประกอบ) 1. ทำ smear และ fix เชื้อบนสไลด์ 2. หยดสี carbolfuchsin ให้ท่วมสไลด์ทิ้งไว้นาน 5 นาที 3. เมื่อครบเวลา ล้างสีออกด้วย acid alcohol แล้วล้างด้วยน้ำ 4. ย้อมทับด้วยสี methylene blue นาน 1 นาที 5. ล้างด้วยน้ำ ปล่อยทิ้งให้แห้งแล้วจึงนำไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยใช้กำลังขยาย 100X (oil immersion objective lens) โดยทำตามขั้นตอนการใช้กล้องจุลทรรศน์ที่ถูกวิธี บันทึกผลการย้อมสีแบคทีเรีย ทนกรดในใบรายงานผลการทดลอง โดยระบุชื่อเชื้อแบคทีเรีย รูปร่างและการเรียงตัวของแบคทีเรีย ในการปฏิบัติการนี้ ให้นักศึกษาใช้วิธี Kinyoun stain ภาพที่ 3.3 ภาพแสดงการย้อมสีแบคทีเรียทนกรด (Acid fast stain) ด้วยวิธี Kinyoun stain
51 การอ่านผลการทดลอง ผลการย้อมสีทนกรด: แบคทีเรียทดกรดติดสีแดง (acid fast bacilli positive) แบคทีเรียไม่ทดกรดติดสีน้ำเงิน ** การบันทึกผลการย้อมสีแบคทีเรีย สามารถใช้ทั้งภาพที่ถ่ายโดยตรงจากกล้องจุลทรรศน์ หรือ วาดโดยใช้ปากกาสีตามการติดสีของแบคทีเรียที่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ก็ได้ ** =ให้ส่งผลการทดลองที่บันทึก พร้อมตอบคำถามท้ายบท ก่อนชั่วโมง conference อย่างน้อย 1 วัน= คำถามท้ายบท 1. การ fix สไลด์ที่ smear เชื้อไว้แล้ว จะมีผลต่อการย้อมสีอย่างไร และถ้าเราไม่ทำขั้นตอนนี้จะเป็นอย่างไร 2. Decolorizing agent ที่ใช้ในการย้อมสีแกรม คืออะไร 3. ถ้าย้อมสีแบคทีเรียแกรมบวก แล้วปรากฏว่าได้ผลเป็นแกรมลบ น่าจะมีสาเหตุจากอะไรได้บ้าง 4. ถ้าย้อมสีแบคทีเรียแกรมลบ แล้วปรากฏว่าได้ผลเป็นแกรมบวก น่าจะมีสาเหตุจากอะไรได้บ้าง 5. สารประกอบที่สำคัญในผนังเซลล์ที่ทำให้แบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบติดสีแตกต่างกันคืออะไร 6. เชื้อที่นิยมย้อมด้วยวิธี Acid fast stain คือเชื้ออะไร
52 ภาคผนวก I. Gram's stain (Hucker modification) 1. Crystal violet solution A. Stock crystal violet Crystal violet, 85% dye 20 gm. Ethanol, 95% 100 ml. B. Stock oxalate solution Ammonium oxalate 1 gm. Distilled water 100 ml. Working solution: เจือจาง stock crystal violet solution l:l ด้วยน้ำกลั่น แล้วเติม stock oxalate 4 เท่า ของปริมาตร crystal violet solution ที่เจือจางแล้ว 2. Gram iodine solution Iodine crystals 1 gm. Potassium iodide 2 gm. ละลายในน้ำกลั่น 5 ml. เมื่อละลายหมดแล้วเติมน้ำกลั่น 240 ml. Sodium bicarbonate 5% aqueous solution 60 ml.เก็บในขวดสีน้ำตาล 3. Decolorizer: ใช้ 95% ethanol 4. Safranin Stock safranin Safranin O 2.5 gm. Ethanol, 95% 100 ml. Working solution: เจือจาง stock safranin 1:10 ด้วยน้ำกลั่น II. Ziehl - Neelsen method 1. Carbol fuchsin Basic fuchsin 0.3 gm. Ethanol, 95% 10 ml. ละลายสีในแอลกอฮอล์แล้วเติม Phenol, melted crystal 5 ml. Distilled water 95 ml. 2. Acid alcohol Hydrochloric acid, concentrated 3 ml. Ethanol, 95% 97 ml.
53 III. Kinyoun stain for AFB 1. Kinyoun carbolfuchsin Basic fuchsin 4 gm. Phenol 8 ml. Alcohol, 95 % 20 ml. Distilled water 100 ml. ละลาย basic fuchsin ในแอลกอฮอล์แล้วค่อย ๆ เติมน้ำลงไป อย่างช้า ๆ พร้อมทั้งเขย่าและเติม phenol 8 ml. (ละลาย phenol ใน water bath ที่ 56o C)
54 รูปร่างและโครงสร้างของแบคทีเรีย (Morphology and structure of bacteria) รูปแบคทีเรียที่ท่านย้อมและเห็นจากกล้องจุลทรรศน์ ที่กำลังขยาย 1000x ย้อมด้วยสี........................................................ Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Bacillus sp. ติดสี............................... ติดสี............................... ติดสี............................... ชนิด Gram……………… ชนิด Gram……………… ชนิด Gram……………… รูปร่าง............................. รูปร่าง............................. รูปร่าง............................. การเรียงตัว...................... การเรียงตัว...................... การเรียงตัว...................... Neisseria sp. Mixed culture E. coli Streptococcus pyogenes ติดสี............................... ติดสี............................... ติดสี........................ ชนิด Gram……………… ชนิด Gram……………… ชนิด Gram…………… รูปร่าง............................. รูปร่าง............................ รูปร่าง............................. การเรียงตัว...................... การเรียงตัว.................... การเรียงตัว...................... จากสไลด์เสมหะผู้ป่วยวัณโรค จงวาดรูปแบคทีเรียที่ท่านเห็นจากกล้องจุลทรรศน์ ที่กำลังขยาย 1000x ย้อมด้วยสี........................................................ Mycobacterium tuberculosis ติดสี........................................ รูปร่าง..................................... การเรียงตัว..............................
55 ปฏิบัติการบทที่ 4 การเก็บเชื้อจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมและสิ่งส่งตรวจทางคลินิก (Collection of environmental microorganisms and clinical specimens) อ.ดร.ชลทิพย์พิพัฒนาบูรณ์ รศ.ดร.โสรัจสิริ เจริญสุดใจ เชื้อจุลินทรีย์กระจายตัวอยู่ทั่วไปในสิ่งแวดล้อม สิ่งของเครื่องใช้ผิวหนังภายนอกของร่างกาย เนื้อเยื่อ บุอวัยวะภายใน สารน้ำ และสารคัดหลั่งต่าง ๆ ที่อยู่ภายในร่างกาย ซึ่งเชื้อจุลินทรีย์มีทั้งชนิดก่อโรค (pathogenic microorganisms) และไม่ก่อโรค (non-pathogenic microorganisms) จึงต้องมีการศึกษาการ กระจายตัวของเชื้อจุลินทรีย์ทั้งในสิ่งแวดล้อมและสิ่งส่งตรวจที่เก็บมาจากร่างกาย เพื่อให้นักศึกษาตระหนักถึง ความสำคัญในการป้องกันไม่ให้เกิดการปนเปื้อนและการแพร่กระจายเชื้อจุลินทรีย์จากกิจกรรมใน ชีวิตประจำวัน เช่น การสัมผัส การกิน การดื่ม การใช้ของร่วมกัน เป็นต้น รวมทั้งการปฏิบัติงานของบุคลากร ทางการแพทย์ ที่มีความเสี่ยงสูงในการทำงานเกี่ยวข้องกับผู้ป่วยและสิ่งส่งตรวจทางคลินิก ตอนที่ 1 การเก็บเชื้อจุลินทรีย์จากสิ่งแวดล้อม (Collection of environmental microorganisms) เชื้อจุลินทรีย์มีมากมายหลายชนิด สามารถพบได้ทั่วไปในสิ่งแวดล้อมตามธรรมชาติเช่น อากาศ ดิน น้ำ ทะเล ทะเลสาบ ฯลฯ สิ่งของเครื่องใช้ประจำวัน เช่น เสื้อผ้า โทรศัพท์ ธนบัตร เครื่องนอน เครื่องใช้ในครัว ลูกบิดประตูปุ่มกดลิฟท์ฯลฯ รวมทั้งตามส่วนต่าง ๆ ของร่างกายคนและสัตว์เช่น ผิวหนัง มือ ช่องปาก ระบบ ทางเดินอาหาร ระบบหายใจ ระบบสืบพันธุ์ ฯลฯ จำนวนและชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ จะมีความแตกต่างหรือ เปลี่ยนแปลงตามสภาวะของสิ่งแวดล้อม เนื่องจากสภาวะต่าง ๆ ของสิ่งแวดล้อมมีผลต่อการเจริญเติบโตของ เชื้อจุลินทรีย์แต่ละชนิดไม่เหมือนกัน เช่น อุณหภูมิ ความชื้น ความเป็นกรด-ด่าง ปริมาณออกซิเจน ปริมาณ สารอาหาร เป็นต้น เชื้อจุลินทรีย์แบ่งเป็น 2 ประเภท คือ เชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรค (pathogenic microorganisms) และเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อให้เกิดโรค (non-pathogenic microorganisms) ส่วน เชื้อจุลินทรีย์ที่พบตามร่างกาย มักเป็นเชื้อจุลินทรีย์ประจำถิ่น (normal flora) มีทั้งเชื้อจุลินทรีย์ที่พบประจำ (resident flora) และพบชั่วคราว (transient flora) ซึ่ง normal flora มักไม่ทำให้เกิดโรคในสภาวะปกติ บทปฏิบัติการนี้ มีวัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาได้ทำการทดลอง เพื่อพิสูจน์ว่ามีเชื้อจุลินทรีย์อยู่ทั่วไป ในสิ่งแวดล้อมรอบตัว ทั้งในอากาศ พื้นผิวห้องปฏิบัติการ พื้นผิวเครื่องมือและอุปกรณ์และสิ่งของเครื่องใช้ ส่วนตัว รวมถึงตามส่วนต่าง ๆ ร่างกายของเรา เพื่อจะได้เข้าใจถึงการแพร่กระจายของเชื้อจุลินทรีย์ และรู้จัก
56 ป้องกันไม่ให้เกิดการแพร่เชื้อผ่านการสัมผัสโดยตรง หรือการแพร่เชื้อทางอ้อมผ่านสิ่งของเครื่องใช้โดยเฉพาะ บุคลากรทางการแพทย์ที่ทำหน้าที่ในการดูแลและสัมผัสผู้ป่วย จะต้องทำความสะอาดส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย ทั้งก่อนและหลังการปฏิบัติงาน เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการแพร่กระจายของเชื้อจุลินทรีย์ก่อโรค เช่น การล้างมือ ด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อก่อนสัมผัสเด็กทารก หรือผู้ที่มีภูมิคุ้มกันทำงานไม่สมบูรณ์ การล้างมือด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อหลังจาก สัมผัสสิ่งขับถ่ายและสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วย รวมถึงการป้องกันตัวเองจากการรับเชื้อจุลินทรีย์เมื่อสัมผัสกับ เครื่องใช้สอยที่อาจมีการปนเปื้อนของเชื้อก่อโรค หลังจากเก็บตัวอย่างจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมมาเรียบร้อยแล้ว เราสามารถทำการนับจำนวนแบคทีเรียใน อาหาร น้ำ หรือสิ่งส่งตรวจอื่น ๆ ที่เราสนใจศึกษาได้ว่ามีจำนวนแบคทีเรียอยู่เท่าไร และยังเป็นวิธีการหนึ่งที่ใช้ วัดการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียด้วย การนับจำนวนแบคทีเรีย มี2 หลักการ ดังนี้ 1. การนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมด (total count) เป็นการนับทั้งเซลล์ที่มีชีวิตอยู่และเซลล์ที่ ตายแล้ว มี 2 วิธี คือ 1.1 Direct count เป็นการนับจำนวนแบคทีเรียโดยตรงบน hematocytometer ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ 1.2 Turbidity เป็นการนับจำนวนแบคทีเรีย โดยวัดความขุ่นของแบคทีเรียที่อยู่ใน อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลวด้วยการใช้ photometer หรือ spectrophotometer 2. การนับจำนวนแบคทีเรียที่มีชีวิต (viable count) เป็นการนับจำนวนเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่ เท่านั้น การนับจำนวนแบคทีเรียแบบนี้เรียกอีกอย่างหนึ่ง bacterial colony count เป็นการนับจำนวน โคโลนีของแบคทีเรียที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง (agar) โดยอาศัยหลักการที่ว่า แบคทีเรีย 1 เซลล์ จะเพิ่ม จำนวนเซลล์มากพอที่จะเห็นเป็น 1 โคโลนีการนับจำนวนแบคทีเรียที่มีชีวิต จะนำแบคทีเรียในสารละลายไป เจือจางก่อนที่จะนำไปเพาะบนอาหารแข็ง เพื่อให้ได้จำนวนโคโลนีอยู่ในช่วง 30 – 300 โคโลนี มี2 วิธี ได้แก่ 2.1 Pour plate เป็นวิธีการที่ใช้นับจำนวนได้ทั้ง aerobic และ anaerobic bacteria เชื้อสามารถโตได้ทั้งบนและใต้ผิวหน้าของอาหารแข็ง จึงมีความถูกต้องมากกว่าในการนับจำนวน ไม่เสี่ยงต่อ การปนเปื้อน เนื่องจากเทเชื้อและ melted agar ลงไปผสมกันบนภาชนะโดยตรง ไม่ต้องใช้ spreader 2.2 Spread plate เป็นวิธีการที่ใช้นับจำนวน aerobic bacteria เชื้อสามารถโตได้ เฉพาะบนผิวหน้าของอาหารแข็งเท่านั้น ทำได้ง่ายกว่าวิธี pour plate ไม่มีความเสี่ยงในการสัมผัสกับ melted agar ที่มีอุณหภูมิสูงเกินไป ไม่ต้องหมุน plate เพื่อให้เชื้อและอาหารแข็งกระจายตัวได้ดี แต่อาจมีการปนเปื้อน จากขั้นตอนที่เพิ่มขึ้นมา คือ การใช้spreader เกลี่ยให้เชื้อกระจายตัวทั่วผิวหน้าของอาหารแข็ง
57 การทดลองที่ 4.1 การเก็บเชื้อจุลินทรีย์จากสิ่งแวดล้อมและการทำความสะอาดผิวหนัง วัตถุประสงค์ 1. สามารถเก็บตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อม สิ่งของ และผิวหนังภายนอกร่างกาย 2. สามารถตรวจลักษณะโคโลนีและลักษณะของเชื้อจุลินทรีย์ที่เก็บมาจากข้อ 1 ได้ 3. สามารถเปรียบเทียบผลการทำความสะอาดของสารต่าง ๆ ต่อจำนวนแบคทีเรียที่ผิวหนัง วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Nutrient agar (NA) 3 plates 2. Sterile cotton swab 4 อัน 3. Sterile normal saline solution (NSS) 1 tube 4. สบู่ (อยู่ที่อ่างล้างมือ) 5. 70% ethanol (อยู่โต๊ะกลาง) 6. สำลีก้อน (อยู่โต๊ะกลาง) วิธีทำ 1. เขียนชื่อกลุ่ม วันที่ และรายละเอียดของแต่ละ plate เช่น “Plate 1 AIR”, “Plate 2 (แบ่งเป็น 4 ส่วน พร้อมระบุที่เก็บตัวอย่าง)” และ “Plate 3 (แบ่งเป็น 3 ส่วน พร้อมระบุBefore, Soap, 70% alc.)” ที่บริเวณก้น NA plate พยายามเขียนชิดขอบด้านใดด้านหนึ่ง เพื่อให้การเก็บผลจำนวนและ ลักษณะโคโลนีทำได้ง่าย 2. สำหรับ Plate ที่ 1 เปิดฝา plate วางไว้ที่พื้นห้องหรือบริเวณที่มีคนพลุกพล่านนาน 20 นาที แล้วจึง ปิดฝา plate 3. สำหรับ Plate ที่ 2 แบ่งออกเป็น 4 ส่วนเท่า ๆ กัน ส่วนที่ 1 ใช้ sterile cotton swab ชุบ sterile NSS พอหมาด แล้วนำไปเช็ดตามพื้นผิว ห้องปฏิบัติการ เช่น พื้นโต๊ะ หรือ พื้นห้อง แล้วนำมา streak ลงบน plate ส่วนที่ 2 ใช้ sterile cotton swab อันใหม่ชุบ sterile NSS พอหมาด แล้วนำไปเช็ดพื้นผิวบริเวณ ที่มือสัมผัสบ่อยครั้ง เช่น ลูกบิด มือจับ ปุ่มกดลิฟท์เครื่องมือ หรือ อุปกรณ์ต่าง ๆ แล้ว นำมา streak ลงบน plate ส่วนที่ 3 ใช้ sterile cotton swab อันใหม่ชุบ sterile NSS พอหมาด แล้วเช็ดตามพื้นผิวสิ่งของ เครื่องใช้ส่วนตัว เช่น เสื้อผ้า โทรศัพท์มือถือ ธนบัตร เหรียญ ฯลฯ แล้วนำมา streak ลง บน plate ส่วนที่ 4 ใช้ sterile cotton swab อันใหม่ชุบ sterile NSS พอหมาด นำไปเช็ดตามผิวหนังหรือ บริเวณภายนอกในส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย เช่น ริมฝีปาก ไรฟัน ผิวหนัง หนังศีรษะ เส้น ผม แล้วนำมา streak ลงบน plate
58 4. สำหรับ Plate ที่ 3 แบ่งออกเป็น 3 ส่วนเท่า ๆ กัน ส่วนที่ 1 เปิด plate ด้วยมือซ้าย แล้วแตะปลายนิ้วชี้ของมือขวาลงบน agar ส่วนที่ 1 หลาย ๆ แห่ง ส่วนที่ 2 ล้างมือให้สะอาดด้วยสบู่และน้ำประปา เช็ดให้แห้งแล้วจึงแตะปลายนิ้วชี้ขวาลงบน agar ส่วนที่ 3 ใช้สำลีสะอาดชุบ 70% ethanol เช็ดให้ทั่วบริเวณปลายนิ้วชี้ซ้ายปล่อยให้แห้ง แล้วจึง แตะปลายนิ้วดังกล่าวลงบน agar ส่วนที่ 3 หลาย ๆ แห่ง 5. นำ plate ทั้ง 3 ไปใส่ตู้อบเลี้ยงเชื้อ (incubator) ที่อุณหภูมิ37 °C เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง และ รายงานผลในตาราง 4.1 ให้สมบูรณ์โดยเลือกบรรยายลักษณะของเชื้อจุลินทรีย์ที่พบมากที่สุด พร้อม ทั้งย้อมสีเพื่อดูรูปร่างและการเรียงตัวของเชื้อจุลินทรีย์ที่พบในแต่ละหัวข้อการทดลอง ตารางที่ 4.1 ตารางบันทึกผลการกระจายของเชื้อจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมและการทำความสะอาดผิวหนัง Plate ที่ บริเวณที่เก็บตัวอย่าง จำนวน โคโลนีของ แบคทีเรีย จำนวน โคโลนีของ เชื้อรา รูปร่างลักษณะของเชื้อจุลินทรีย์ ขนาดและสี ของ colony การติดสี Gram และรูปร่าง การเรียงตัว ของเชื้อ 1 อากาศ 2 ส่วนที่ 1 ……………………………….. ส่วนที่ 2 ……………………………….. ส่วนที่ 3 ……………………………….. ส่วนที่ 4 ……………………………….. 3 ส่วนที่ 1 ก่อนทำความสะอาด ส่วนที่ 2 สบู่ ส่วนที่ 3 70% ethanol หมายเหตุ: หากไม่พบโคโลนีของแบคทีเรียหรือเชื้อรา ให้บันทึกว่า ND (not detected)
59 คำถามท้ายบทปฏิบัติการที่ 4.1 1. จงบอกวัตถุประสงค์ของบทปฏิบัติการที่ 4.1 2. เพราะเหตุใด เราจึงต้องใช้สิ่งของที่ทำการ sterile แล้ว ในการทดลองทางจุลชีววิทยา 3. หากใช้ blood agar แทน nutrient agar ในบทปฏิบัติการที่ 4.1 ท่านคิดว่าผลที่ได้จะเหมือนกัน หรือไม่ อย่างไร 4. จงยกตัวอย่างเชื้อจุลินทรีย์ที่มักพบได้ตามฝุ่นละอองในอากาศ 5. เพราะเหตุใด คนส่วนใหญ่จึงไม่เป็นโรค ทั้ง ๆ ที่มีเชื้อจุลินทรีย์มากมายอยู่รอบ ๆ ตัวเรา 6. เพราะเหตุใด หลังจากล้างมือให้สะอาดที่สุดแล้ว ยังคงพบเชื้อจุลินทรีย์ที่บริเวณมือได้อีก 7. 70 % ethanol สามารถกำจัดเชื้อแบคทีเรียได้ทั้งหมดหรือไม่ เพราะเหตุใด
60 การทดลองที่ 4.2 การนับจำนวนแบคทีเรียโดยวิธี pour plate และ spread plate วัตถุประสงค์ 1. สามารถอธิบายหลักการและวิธีการนับจำนวนแบคทีเรียด้วยวิธี pour plate และ spread plate 2. สามารถตรวจนับและคำนวณจำนวนแบคทีเรียโดยอาศัยวิธี pour plate และ spread plate วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. เชื้อแบคทีเรีย (Escherichia coli) ความเข้มข้น 10-3 1 หลอด 2. เชื้อแบคทีเรีย (Escherichia coli) ความเข้มข้น 10-4 1 หลอด 3. Melted nutrient agar ใน water bath อุณหภูมิ 56 o C (tube ละ 20 mL) 2 หลอด 4. Sterile pipette (1 mL) 2 อัน 5. Sterile petri dish 2 plates 6. Nutrient agar 2 plates 7. Grass rod (อยู่โต๊ะกลาง) 8. 95% ethanol (อยู่โต๊ะกลาง) วิธีทำ (ให้นักศึกษาดูภาพที่ 4.1 ประกอบ) 1. Label ที่ petri dish ว่า PP 10-3 และ PP 10-4 พร้อมกับเขียนชื่อกลุ่มและวันที่ 2. Label ที่ nutrient agar (NA) plate ว่า SP 10-3 และ SP 10-4 พร้อมกับเขียนชื่อกลุ่มและวันที่ 3. ใช้ pipette ขนาด 1 mL ดูดเชื้อจาก tube 10-4 จำนวน 0.2 mL ใส่ลงใน petri dish 10-4 จำนวน 0.1 mL และใส่ลงใน NA plate 10-4 จำนวน 0.1 mL 4. สำหรับ tube 10-3 ก็ทำเช่นเดียวกัน 5. สำหรับ pour plate method ให้นำ melted nutrient agar มาเทลงใน petri dish 10-3 และ 10-4 เพลทละ 1 หลอด (ประมาณ 20 mL) แล้วผสมให้เข้ากันโดยการหมุน plate เบา ๆ ไปมาเป็น วงกลมบนพื้นโต๊ะ (ระวังอย่าให้อาหารกระฉอกเปื้อนฝา plate) เพื่อให้แบคทีเรียกระจายออกโดย ทั่ว รอจนอาหารใน plate แข็งตัว 6. สำหรับ spread plate method ให้ใช้ glass rod เกลี่ยเชื้อไปให้ทั่วผิวหน้าของ NA plate จนแห้ง 7. นำเข้าตู้อบเลี้ยงเชื้ออุณหภูมิ 37 o C เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง 8. นับจำนวน colony ของแบคทีเรียที่ขึ้นใน plate เลือกนับ plate ที่มีจำนวนประมาณ 30 - 300 colonies และคำนวณหาจำนวนแบคทีเรียต่อ 1 mL ของหลอดเริ่มต้น (undiluted culture) บันทึกลงในตาราง 4.2
61 เจ้าหน้าที่จัดเตรียมให้: เจือจางแบคทีเรีย ขั้นตอนที่1 – 2: เตรียมและเขียน plate ขั้นตอนที่3 – 6: spread plate และ pour plate ภาพที่4.1 ขั้นตอนในการทำ pour plate และ spread plate วิธีคำนวณ เมื่อนับได้ 50 โคโลนีที่ plate 10-3 ปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร นับจำนวนโคโลนีแบคทีเรียได้ = 50 โคโลนี ถ้าปริมาตร 1 มิลลิลิตร จะมีจำนวนโคโลนีแบคทีเรีย = 50 x 1 = 500 โคโลนี/มิลลิลิตร จำนวนแบคทีเรียที่เจือจาง 10-3 มีแบคทีเรีย = 500 โคโลนี ดังนั้น แบคทีเรียที่ไม่เจือจาง (คิดเป็น 1) จะมีแบคทีเรีย = 500 x1 = 500 x 103 โคโลนี/มิลลิลิตร ดังนั้น แบคทีเรียในหลอดเริ่มต้น มีแบคทีเรีย = 5.0 x 105 CFU/มิลลิลิตร (CFU = colony forming unit) Pour plates (PP) ใช้ sterile petri dish 2 plates Spread plates (SP) ใช้ nutrient agar (NA) 2 plates PP 10-3 PP 10-4 SP 10-3 SP 10-4 Dilution: 10-1 10-2 10-3 10-4 แบคทีเรีย 0.2 0.2 0.2 0.2 mL 1.8 1.8 1.8 1.8 mL Nutrient broth PP 10-3 PP 10-4 SP 10-4 SP 10-3 0.2 mL 10-4 10-3 0.2 mL ใส่nutrient agar ที่หลอม ใช้แท่งแก้วเกลี่ย ใส่nutrient agar ที่หลอม ใช้แท่งแก้วเกลี่ย 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 10-3
62 ตารางที่ 4.2 ตารางบันทึกผลจำนวนแบคทีเรียด้วยวิธี pour plate และ spread plate หมายเหตุ: หากไม่สามารถนับจำนวนโคโลนีได้ให้บันทึกว่า uncountable คำถามท้ายบทปฏิบัติการที่ 4.2 1. นักศึกษาคิดว่าการใช้อาหารแข็ง (nutrient agar) มีความสำคัญต่อการศึกษาชนิดของแบคทีเรีย หรือไม่ เพราะเหตุใด 2. ในการศึกษาเกี่ยวกับจุลินทรีย์กรณีใดควรใช้อาหารแข็ง และกรณีใดควรใช้อาหารเหลว 3. เพราะเหตุใด เราจึงต้องเปลี่ยน pipette ในการดูดสารต่างชนิดและการทำเจือจาง 4. จงเปรียบเทียบข้อดีและข้อเสียในการหาจำนวนแบคทีเรียโดยวิธี pour plate และ spread plate วิธี ความเข้มข้น จำนวนโคโลนี จำนวนโคโลนีต่อ 1 mL (CFU/mL) 1. Pour plate 10-3 10-4 2. Spread plate 10-3 10-4
63 ตอนที่ 2 การเก็บสิ่งส่งตรวจเพื่อวินิจฉัยโรค (Collection of clinical specimens) การตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อให้ถูกต้องจำเป็นต้องอาศัยการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ เพื่อหาเชื้อที่ เป็นสาเหตุของโรค ซึ่งการที่จะได้ผลการวิเคราะห์เชื้อสาเหตุได้อย่างถูกต้องนั้น ต้องอาศัยปัจจัยต่าง ๆ หลาย อย่างประกอบกัน ตั้งแต่การเก็บสิ่งส่งตรวจ การนำส่ง และการวิเคราะห์ทางห้องปฏิบัติการที่ถูกต้องแม่นยำ และรวดเร็ว เป็นต้น หลักการโดยทั่วไปในการเก็บสิ่งส่งตรวจเพื่อเพาะเชื้อ 1. ควรเก็บสิ่งส่งตรวจก่อนให้ยาต้านจุลชีพ (antibiotics) เพราะการที่ผู้ป่วยได้รับยาต้านจุลชีพ อยู่อาจจะทำให้โอกาสแยกเชื้อได้น้อยลง เนื่องจากยานั้นอาจมีผลยับยั้งการเจริญของเชื้อ 2. ต้องคำนึงถึงเวลาของการเก็บสิ่งส่งตรวจให้เหมาะสมกับระยะของโรค เพื่อช่วยให้โอกาสของ การพบเชื้อที่เป็นสาเหตุมีมากขึ้น เช่น ในโรคทัยฟอยด์ ในระยะสัปดาห์แรกที่มีไข้ จะมีโอกาสตรวจพบเชื้อใน กระแสเลือดได้สูง ส่วนในระยะหลัง ๆ เชื้อจะเข้าสู่ reticuloendothelial system (RE system) ซึ่งถ้า ตรวจหาเชื้อจากอุจจาระจะมีโอกาสพบเชื้อได้มากกว่า เป็นต้น 3. เลือกเก็บสิ่งส่งตรวจให้ตรงตำแหน่งหรือส่วนที่จะพบเชื้อได้จำนวนมาก และเก็บให้มีปริมาณ มากเพียงพอ เพื่อที่จะมีโอกาสตรวจพบเชื้อได้ง่ายขึ้น 4. พยายามหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของจุลชีพประจำถิ่น (normal flora) ให้มากที่สุด และใน กรณีที่ให้ผู้ป่วยเก็บสิ่งส่งตรวจเอง ต้องอธิบายขั้นตอนในการเก็บที่ถูกต้องให้ผู้ป่วยเข้าใจเสียก่อน 5. ภาชนะที่ใช้ในการเก็บสิ่งส่งตรวจ ต้องล้างให้สะอาดและปราศจากเชื้อ 6. นำส่งสิ่งส่งตรวจให้ถึงห้องปฏิบัติการโดยเร็วที่สุด เนื่องจากเชื้อบางชนิดจะตายง่ายเมื่ออยู่ นอกร่างกาย ดังนั้นจึงต้องรู้วิธีที่จะทำให้เชื้อมีชีวิตอยู่จนกว่าจะส่งสิ่งส่งตรวจถึงห้องปฏิบัติการ โดยเก็บไว้ใน สภาวะที่เหมาะสม เช่น ใส่ใน transport media หรือการเก็บไว้ในตู้เย็นสำหรับสิ่งส่งตรวจบางชนิด เป็นต้น 7. ใบ request ต้องกรอกรายละเอียดต่าง ๆ ให้สมบูรณ์ชัดเจน รวมทั้งการติดฉลากที่ภาชนะที่ ใช้เก็บสิ่งส่งตรวจ โดยบอกรายละเอียดต่าง ๆ ของสิ่งส่งตรวจอย่างถูกต้องครบถ้วน 8. ต้องใช้เทคนิคปราศจากเชื้อ (aseptic technique) ที่เหมาะสมในการเก็บสิ่งส่งตรวจแต่ละ ชนิด เพราะการเก็บสิ่งส่งตรวจบางชนิดสามารถเป็นทางในการนำเชื้อโรคเข้าสู่ร่างกายของผู้ป่วย ก่อให้เกิดโรค ที่เรียกว่า โรคหมอทำ (iatrogenic) ได้ ชนิดของสิ่งส่งตรวจ สามารถแบ่งตามตำแหน่งที่เก็บได้เป็น 2 ประเภท คือ 1. สิ่งส่งตรวจจากบริเวณที่ปราศจากเชื้อ เช่น เลือด (blood) น้ำไขสันหลัง (CSF) และน้ำที่เจาะ จากส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย เป็นต้น สิ่งส่งตรวจกลุ่มนี้ต้องระวังในเรื่องของการปนเปื้อน (contamination) ให้ มากที่สุด เพราะการตรวจพบเชื้อจากสิ่งส่งตรวจเหล่านี้ แม้เพียงตัวเดียว ก็ถือว่ามีนัยสำคัญพอที่จะบอกได้ว่ามี การติดเชื้อแล้ว
64 2. สิ่งส่งตรวจจากบริเวณที่มีจุลชีพประจำถิ่นอยู่ เช่น sputum, throat swab, pus, vaginal swab, urethral swab, cervical swab, urine, feces เป็นต้น สิ่งส่งตรวจในกลุ่มนี้ที่ต้องระวัง คือ เรื่องของ เวลาในการนำส่งห้องปฏิบัติการ เพราะจุลชีพประจำถิ่นจะเพิ่มจำนวนมากขึ้นจนทำให้การแปลผลเพาะเชื้อผิด ผลาดได้ หรืออาจจะสร้างสารบางอย่างมายับยั้งหรือทำลายเชื้อก่อโรค (pathogen) ทำให้ตรวจไม่พบเชื้อก่อ โรคได้ ภาชนะสำหรับใส่สิ่งส่งตรวจ 1. สิ่งส่งตรวจที่ต้องเก็บใส่หลอดแก้ว (tube) ที่มี transport media อยู่ด้วย ได้แก่ throat swab, rectal swab, urethral swab, vaginal swab, cervical swab และ pus swab เป็นต้น 2. สิ่งส่งตรวจที่ต้องเก็บใส่ขวดปากกว้างที่ปราศจากเชื้อ ได้แก่ sputum และ urine เป็นต้น 3. สิ่งส่งตรวจที่เก็บใส่ขวดยาฉีดขนาดเล็กที่ปราศจากเชื้อ ได้แก่ CSF, body fluids, tissue biopsy เป็นต้น 4. สิ่งส่งตรวจที่เก็บใส่ในขวด hemoculture ได้แก่ blood โดยเจาะเลือดใส่ขวด hemoculture (trypticase soy broth, TSB) หรือขวด hemoculture สำเร็จรูป เช่น BACTEC เป็นต้น สำหรับการเก็บสิ่งส่งตรวจเพื่อเพาะเชื้อแบคทีเรีย ในกรณีที่ไม่สามารถนำส่งสิ่งส่งตรวจได้ในทันที ควร เก็บไว้ในภาชนะและอุณหภูมิที่เหมาะสมดังตาราง ตารางที่ 4.3 แสดงการเก็บสิ่งส่งตรวจต่าง ๆ เพื่อการตรวจเพาะเชื้อแบคทีเรีย (จากนรีกุล สุระพัฒน์และคณะบรรณาธิการ, จุลชีววิทยาทางการแพทย์. 2526.) สิ่งส่งตรวจ ควรเก็บใส่ใน หากนำส่งทันทีไม่ได้ควรเก็บที่* 4 oC อุณหภูมิห้อง 37 oC Nasopharyngeal swab, throat swab Transport media ภาชนะที่ปราศจากเชื้อ ใช้ได้ ใช้ได้ - - - - อุจจาระ, rectal swab 1.Transport media 2.Selenite F broth 3.Alkaline peptone water ใช้ได้ - - - ใช้ได้ ใช้ได้ - ดี ดี ปัสสาวะ ภาชนะที่ปราศจากเชื้อ ใช้ได้ - - หนอง Transport media ใช้ได้ - - เลือด Blood culture broth - ใช้ได้ ดี น้ำไขสันหลังและน้ำอื่น ๆ ภาชนะที่ปราศจากเชื้อ - - ใช้ได้ ชิ้นเนื้อ, อวัยวะต่าง ๆ ภาชนะที่ปราศจากเชื้อ ใช้ได้ - - * ให้รีบนำส่งตรวจภายใน 3 - 6 ชั่วโมง
65 การทดลองที่ 4.3 การเก็บสิ่งส่งตรวจจากลำคอ (throat swab) วัตถุประสงค์ 1. สามารถอธิบายหลักการและวิธีการเก็บ throat swab ที่ถูกต้อง 2. สามารถตรวจลักษณะของแบคทีเรียที่ได้จากสิ่งส่งตรวจจากลำคอ วัสดุอุปกรณ์ (2 คนต่อ 1 ชุด) 1. Blood agar plates 2 plates 2. Sterile swabs 2 อัน 3. ไม้กดลิ้น (ถ้ามี) วิธีทำ (ดูรูป 4.2 ประกอบ) 1. ให้เพื่อนนักศึกษาอ้าปากแล้วใช้ไม้กดลิ้นไว้ (ถ้าไม่มีไม้กดลิ้นให้เพื่อนนักศึกษาร้องเสียง "อ้า" แทน ในขณะเก็บ จะช่วยทำให้เก็บสะดวกขึ้น) 2. ใช้ sterile swab ป้ายบริเวณผนังลำคอด้านในหลังลิ้นไก่ (ดูรูป 4.2) หรือบริเวณต่อมทอนซิลทั้งซ้าย และขวา (ในกรณีของผู้ป่วย ให้ป้ายบริเวณที่มีการอักเสบ หรือ มีหนอง หรือ มีแผ่นคราบสีขาว) ในขณะป้ายให้ หมุน swab ไปมา และระวังอย่าให้ swab ไปป้ายถูกน้ำลายหรือส่วนอื่น ๆ ในช่องปาก 3. นำ swab ดังกล่าว มาป้ายลงบน blood agar บริเวณขอบ 1 จุด โดยขณะป้ายให้หมุน swab ไปมา อยู่กับที่ 4. ใช้ loop ทำการ streak ต่อ เพื่อให้ได้โคโลนีเดี่ยว ๆ ออกมา 5. นำ plate บ่มไว้ใน Incubator ที่ 37 O C เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง 6. ในวันต่อมา ให้นำ plate ออกมาดูลักษณะโคโลนีของเชื้อที่ขึ้นบน blood agar เลือกโคโลนีที่มีมาก ที่สุดบนรอย streak จำนวน 2 ชนิด มาย้อม Gram's stain แล้วรายงานผลในตารางที่ 4.4 หมายเหตุ: - การทดลองนี้ให้ทำเป็นคู่ ให้แต่ละคนเป็นคนผลัดกันเก็บสิ่งส่งตรวจจากคอของเพื่อนนักศึกษาอีกคน - ในกรณีของผู้ป่วย ให้ป้ายบริเวณที่มีการอักเสบหรือ มีหนอง หรือมีแผ่นคราบสีขาว
66 ภาพที่4.2 การเก็บสิ่งส่งตรวจจากลำคอ (throat swab) (พยายามป้ายจากบริเวณที่มีการอักเสบ มีหนองหรือ มีแผ่นคราบสีขาว เวลาป้ายให้หมุน swab ไปมาด้วย) ตารางที่ 4.4 ตารางบันทึกการเก็บสิ่งส่งตรวจจากลำคอ (throat swab) Predominant microorganisms ลักษณะโคโลนี Gram's stain การติดสีแกรม รูปร่าง การเรียงตัว โคโลนีที่ 1 โคโลนีที่ 2
67 คำถามท้ายบทปฏิบัติการที่ 4.3 1. จงอธิบายภาชนะที่ใช้เก็บ throat swab และวิธีการนำส่งห้องปฎิบัติการโดยทั่วไป รวมทั้งกรณีที่ไม่ สามารถนำส่งได้ทันที จะต้องทำอย่างไร 2. เพราะเหตุใด จึงต้องระวังไม่ให้ swab ไปถูกน้ำลายหรือส่วนอื่น ๆ ในช่องปาก ในขณะที่ทำ throat swab 3. การเก็บ throat swab จะถูกดำเนินการ เมื่อผู้ป่วยมีข้อบ่งชี้อะไร และมีโรคติดเชื้ออะไรบ้าง การทดลองที่ 4.4 การเก็บตัวอย่างปัสสาวะเพื่อตรวจนับจำนวนเชื้อด้วยวิธีลูปมาตรฐาน (calibrated loop) วัตถุประสงค์ 1. สามารถอธิบายหลักการและวิธีการเก็บตัวอย่างปัสสาวะที่ถูกต้อง 2. สามารถตรวจปริมาณและลักษณะของแบคทีเรียที่ได้จากตัวอย่างปัสสาวะ วัสดุอุปกรณ์ (2 คนต่อ 1 ชุด) 1. ขวดฝาเกลียวปากกว้างที่ sterile แล้ว 1 ใบ 2. Blood agar (BA) 1 plate 3. Calibrated loop ขนาด 0.001 mL 1 อัน วิธีทำ 1. การเก็บปัสสาวะเพื่อส่งตรวจทางจุลชีววิทยาจะเก็บแบบ clean-voided midstream urine ประมาณ 5 - 10 ml ใส่ลงไปในขวดปากกว้าง 2. เขย่าขวดปัสสาวะให้ทั่วโดยหมุนขวดในลักษณะวงกลม 3. จุ่มปัสสาวะโดยใช้ calibrated loop ขนาด 0.001 mL แล้วยกขึ้นในแนวตั้งตรง 4. แตะ loop ตรงจุดกึ่งกลางของ BA plate แล้ว streak เป็นเส้นตรงขึ้นบนและลงล่าง (ภาพที่ 4.3) 5. ใช้ loop เดิม (ไม่ต้องลนไฟ และไม่ต้องจุ่มปัสสาวะเพิ่ม) ทำการ streak ให้ตั้งฉากกับรอย streak ใน ข้อ 2 ถี่ ๆ จนเต็มผิวหน้าของ BA plate (ภาพที่ 4.3) 6. นำ plate ใส่ incubator ที่ 37 ° C เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง 7. ในวันต่อมา ให้นำ plate ออกมานับจำนวนโคโลนีทั้งหมดที่ขึ้นบน BA plate 8. จำนวนโคโลนีที่นับได้ จะคูณด้วย 1,000 (ถ้าใช้ loop ขนาด 0.001 mL) หรือ คูณด้วย 100 (ถ้าใช้ loop ขนาด 0.01 mL) จะเท่ากับจำนวนแบคทีเรียต่อน้ำปัสสาวะ 1 mL (CFU/mL) หรือจะเทียบกับตารางที่ 4.5 9. รายงานผลการทดลองในตารางที่ 4.6
68 ภาพที่4.3 แสดงวิธีการ streak ด้วย calibrated loop ตารางที่ 4.5 การนับจำนวนแบคทีเรียและการรายงานผลด้วยวิธีลูปมาตรฐาน (calibrated loop) จำนวนโคโลนีที่นับได้ จำนวนโคโลนี/mL ถ้าใช้ loop ขนาด 0.001 mL ถ้าใช้ loop ขนาด 0.01 mL < 10 103 102 10 - 100 104 - 105 103 - 104 > 100 > 105 > 104 ตารางที่ 4.6 ตารางบันทึกผลการเก็บตัวอย่างปัสสาวะเพื่อตรวจนับจำนวนเชื้อด้วยวิธีcalibrated loop Predominant microorganisms จำนวนโคโลนี จำนวนเชื้อ ต่อ ปัสสาวะ 1 mL Gram's stain การติดสีแกรม รูปร่าง การเรียงตัว โคโลนีที่ 1 โคโลนีที่ 2
69 การสาธิต ลักษณะสิ่งส่งตรวจทางจุลชีววิทยาและภาชนะที่ใช้แบบต่าง ๆ 1. การเก็บสิ่งส่งตรวจอุจจาระโดยใช้ rectal swab 2. การเก็บสิ่งส่งตรวจจากเลือด (hemoculture) 3. การเก็บสิ่งส่งตรวจจากหนองและบาดแผล 4. การเก็บสิ่งส่งตรวจที่เป็นของเหลวจากอวัยวะภายใน คำถามท้ายบทปฏิบัติการที่ 4.4 1. ปัสสาวะที่ยังไม่สามารถนำลง plate ได้ทันที จะต้องทำอย่างไร 2. ถ้าต้องการเก็บปัสสาวะโดยปราศจากเชื้อจะต้องใช้วิธีใด 3. ส่วนใดของระบบขับถ่ายปัสสาวะที่มี normal flora อาศัยอยู่ สรุปบทปฏิบัติการที่ 4 ***Don’t forget to label group number, date, and sample details at all plates.
70
71 ปฏิบัติการบทที่ 5 การทำลายเชื้อจุลินทรีย์และการทดสอบความไวของเชื้อจุลินทรีย์ต่อยาต้านจุลชีพ (Destruction of microorganisms and drug susceptibility test) ผศ.ดร.อุมาพร ยอดประทุม อ.ดร.อรรถวิทย์ ศิริโชติ การทำลายเชื้อจุลินทรีย์ บทนำ: การทำลายหรือการกำจัดเชื้อจุลินทรีย์นับว่ามีความสำคัญมากในวิชาจุลชีววิทยาทางการแพทย์ เชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ได้เป็นตัวก่อโรค (non-pathogens) อาจปะปน (contaminate) ในอาหารเลี้ยงเชื้อหรือ ภาชนะต่าง ๆ ที่เราไม่ต้องการปนเปื้อนจากสิ่งที่มีชีวิตใด ๆ ส่วนเชื้อจุลินทรีย์ที่เป็นตัวก่อโรค (pathogens) นั้น จะต้องถูกกำจัดอย่างเด็ดขาดไม่ไห้เหลืออยู่เลย ทั้งนี้ เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการแพร่กระจายของโรคติดเชื้อ ไม่ว่าจากแพทย์ พยาบาล หรือผู้ที่ทำงานเกี่ยวข้องกับผู้ป่วย ไปยังผู้ป่วย หรือจากผู้ป่วยมายังแพทย์ พยาบาล หรือผู้ที่ทำงานเกี่ยวข้องกับผู้ป่วย การทำลายเชื้อจุลินทรีย์มี 2 ประเภท คือ 1. Sterilization หมายถึง การทำลายเชื้อจุลินทรีย์ทุกชนิดให้หมดสิ้นไป ไม่ว่าจะเป็นตัวก่อโรคหรือไม่ก็ ตาม ทั้งนี้รวมทั้งการทำลายสปอร์ของแบคทีเรียด้วย 2. Disinfection หมายถึง การทำลายเชื้อจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรค ส่วนมากจะใช้สารเคมีที่มีความ เข้มข้นสูง แต่วิธีนี้ไม่สามารถทำลายสปอร์ของแบคทีเรียได้ สารเคมีที่ใช้ในการทำลายเชื้อจุลินทรีย์ เรียกว่า disinfectant หรือ antiseptic ซึ่งคำทั้งสองคำนี้ แตกต่างกันที่ความเข้มข้นของสารเคมีและวิธีใช้สารเคมีนั้น ๆ Antiseptic หมายถึง สารเคมีที่มีความเข้มข้นต่ำที่สามารถทำลายหรือยับยั้งการเจริญเติบโตของ เชื้อจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคโดยไม่ทำให้เกิดการระคายเคืองต่อเนื้อเยื่อ ส่วนใหญ่ใช้กับผิวหนังและเยื่อเมือกต่าง ๆ Disinfectant หมายถึง สารเคมีที่มีความเข้มข้นสูงเมื่อเทียบกับ antiseptic ที่สามารถทำลาย เชื้อจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรค และจะใช้กับสิ่งที่ไม่มีชีวิตเท่านั้น วัตถุประสงค์ของบทปฏิบัติการต่อไปนี้ เพื่อให้นักศึกษาได้ทราบและเข้าใจถึงการทำลายเชื้อด้วยวิธีต่าง ๆ พร้อมทั้งสามารถปฏิบัติการได้ด้วยตนเอง เพื่อเป็นการควบคุมและป้องกันการเกิดโรคติดเชื้อ โดยการทดลอง ครั้งนี้ จะเป็นการทำลายเชื้อจุลินทรีย์โดยวิธีทางกายภาพและสารเคมี
72 การทดลองที่5.1 การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยใช้ไอน้ำอิ่มตัวภายใต้การเพิ่มความดัน (steam under increased pressure) โดยใช้หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave) วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาทราบผลของวิธีฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยใช้ไอน้ำอิ่มตัวภายใต้การเพิ่มความดันโดยใช้ หม้อนึ่งความดันไอ วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Nutrient agar 3 plates 2. Bacterial cultures ประกอบด้วย Bacillus subtilis, Escherichia coli และ Staphylococcus aureus วิธีทำ (ใช้ sterile techniques) 1. แบ่ง Nutrient agar ทั้ง 3 plates ออกเป็นสองส่วนเท่า ๆ กัน ส่วนหนึ่งเขียนว่า "ก่อน" อีกส่วนหนึ่ง เขียนว่า "หลัง" พร้อมกับเขียน B (Bacillus), E (Escherichia) และ S (Staphylococcus) ลงบน plate ที่ 1, 2 และ 3 ตามลำดับ ดังภาพ 2. Streak เชื้อ B. subtilis, E. coli และ S. aureus ลงใน Nutrient agar ส่วนที่เขียนว่า "ก่อน" ของ plate B, E และ S ตามลำดับ 3. นำหลอดที่ใส่แบคทีเรียทั้ง 3 ชนิด เข้าไปนึ่งในหม้อนึ่งความดันไอ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121C ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เวลา 15 นาที 4. เมื่อนึ่งเสร็จแล้ว นำมาทำเช่นเดียวกับข้อ 2 แต่ streak ลงในส่วนที่เขียนว่า "หลัง" 5. นำทั้ง 3 plate ไปบ่ม ที่ 37C ดูผลภายใน 24-48 ชั่วโมง รายงานผลการทดลองว่ามีการ เจริญเติบโตของเชื้อหรือไม่ ในตารางที่ 5.1 ตารางการรายงานผลการทดลองที่ 5.1 ชนิดของแบคทีเรีย ก่อน autoclave หลัง autoclave Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus
73 การทดลองที่5.2 การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยการต้มเดือด วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาทราบผลของการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยวิธีต้มเดือด วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Nutrient agar จำนวน 3 plates 2. Bacterial cultures ประกอบด้วย B. subtilis, E. coli และ S. aureus วิธีทำ (ใช้ sterile techniques) 1. แบ่ง Nutrient agar ทั้ง 3 plates ออกเป็น 6 ส่วนเท่า ๆ กันแต่ละส่วนเขียนว่า C (control), U (uninoculate), 5, 10, 15 และ 30 พร้อมกับเขียน B, E และ S, ลงบน plate ที่ 1, 2 และ 3 ตามลำดับ ดัง ภาพ 2. Streak เชื้อ B. subtilis, E. coli และ S. aureus ลงบนส่วนที่เขียน "C" ของ plate B, E และ S ตามลำดับ 3. นำหลอดที่ใส่แบคทีเรียทั้ง 3 ชนิด ไปแช่ในหม้อต้มที่กำลังเดือดเป็นเวลา 5 นาที นำขึ้นจากหม้อต้ม, เขย่าหลอด แล้ว streak แบคทีเรียทั้ง 3 ชนิดลงในส่วนที่เขียนว่า "5" ของ plate B, E และ S ตามลำดับ 4. นำหลอดที่ใส่แบคทีเรียทั้ง 3 ชนิดไปต้มต่อจนครบเวลา 10, 15 และ 30 นาที นับตั้งแต่เริ่มต้นต้มครั้ง แรก เมื่อครบเวลาแต่ละครั้งก็ให้นำไป streak บน plate เช่นเดียวกับข้อ 3 ตามลำดับ 5. ส่วนที่เขียนว่า "U" ไม่ต้อง streak เชื้อใด ๆ 6. นำทั้ง 3 plate ไปบ่ม ที่ 37C แล้วดูผลภายใน 24-48 ชั่วโมง รายงานผลการทดลองว่ามีการ เจริญเติบโตของเชื้อหรือไม่ ในตารางที่ 5.2 ตารางการรายงานผลการทดลองที่ 5.2 ชนิดแบคทีเรีย C U 5 นาที 10 นาที 15 นาที 30 นาที Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus
74 การทดลองที่ 5.3 การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยใช้สารเคมี วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาทราบผลของการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยใช้สารเคมีชนิดต่าง วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Bacterial cultures ประกอบด้วย B. subtilis, E. coli และ S. aureus 2. Nutrient agar 3 plates 3. Sterile pipette 10 ml 1 อัน 4. Antiseptics หรือ Disinfectants (แต่ละกลุ่มจะได้รับเพียงชนิดเดียว) ได้แก่ - 2% Lysol (Liquor cresolis saponatus) - 0.5% Hibitane (Chlorhexidine) - 1:100 Savlon (15% Cetrimide + 1.5%Chlorhexidine) - Providine (Polyvinyl pyrrolidone - iodine) วิธีทำ 1. แบ่ง Nutrient agar ทั้ง 3 plate ออกเป็น 6 ส่วนเท่า ๆ กันและแต่ละส่วนเขียนว่า C (control), U (uninoculate), 5, 10, 15 และ 30 พร้อมกับเขียน B, E และ S ลงบน plate ที่ 1, 2 และ 3 ตามลำดับ 2. Streak เชื้อ B. subtilis, E. coli และ S. aureus ลงบนส่วนที่เขียน "C" ของ plate B, E และ S ตามลำดับ 3. ใช้ sterile pipette 10 ml ดูด antiseptic หรือ disinfectant ใส่ลงไปใน bacterial culture ทั้ง 3 หลอด ๆ ละ 2 ml เขย่าหลอด 4. ทิ้งไว้ 5 นาที นำ sterile loop แตะเชื้อในแต่ละหลอดทั้งสาม streak ลงบนแต่ละ plate ที่เขียนว่า "5" 5. ทิ้งไว้จนครบ 10, 15 และ 30 นาที ตามลำดับ เมื่อครบเวลาแต่ละครั้งก็นำไป streak ลงบน plate เช่นเดียวกับข้อ 4 ตามลำดับ 6. ส่วนที่เขียน "U" ไม่ต้อง streak เชื้ออะไรลงไป
75 7. นำทั้ง 3 plate ไปบ่ม ที่ 37C แล้วดูผลใน 24-48 ชั่วโมง รายงานผลการทดลองว่ามีการเจริญเติบโต ของเชื้อหรือไม่ ในตารางที่ 5.3 ตารางการรายงานผลการทดลองที่ 5.3 ชนิดของ Antiseptic หรือ disinfectant ............................................. ชนิดแบคทีเรีย C U 5 นาที 10 นาที 15 นาที 30 นาที Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus คำถามการทดลองที่ 5.1, 5.2 และ 5.3 1. จากการทดลองครั้งนี้ ท่านคิดว่าวิธีไหนที่จะทำลายเชื้อในอาหารเหลวได้ดีที่สุด 2. จากการทดลองทั้งหมดนี้ แบคทีเรียชนิดไหนทนต่อความร้อนและ antiseptics หรือ disinfectant ได้ดีที่สุด เพราะเหตุใด 3. ก่อนฉีดยาคนไข้ท่านจะต้องทำความสะอาดผิวหนังบริเวณนั้นอย่างไร 4. เมื่ออุจจาระของคนไข้ที่เป็นไทฟอยด์หกอยู่ที่พื้น จะทำอย่างไร 5. สารเคมีต่อไปนี้มีวัตถุประสงค์ในการใช้อย่างไร ก. 70% alcohol ข. 3% hydrogen peroxide ค. 1% silver nitrate ง. 0.05% chlorhexidine in 70% alcohol จ. 0.2% chlorhexidine gluconate ฉ. 1:10,000 KMnO4 ช. 1% gentian violet
76 การทดสอบความไวของเชื้อจุลินทรีย์ที่มีต่อยาต้านจุลชีพ (Drug susceptibility test) ยาต้านจุลชีพประกอบด้วยยาที่เป็นสารเคมีที่สังเคราะห์ขึ้นและยาปฏิชีวนะ โดย ยาปฏิชีวนะ หมายถึง สารที่เชื้อจุลินทรีย์ชนิดหนึ่งสร้างขึ้นมา และมีฤทธิ์กำจัด หรือยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ชนิดอื่น ฤทธิ์ของยาต้านจุลชีพในการทำลายเชื้อจุลินทรีย์นั้น สามารถแบ่งออกได้เป็น 2 แบบ ตามความสามารถ ในการทำลาย คือ Bacteriostatic หมายถึง ฤทธิ์ของยาต้านจุลชีพที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ เชื้อจุลินทรีย์ และ Bactericidal หมายถึง ฤทธิ์ของยาต้านจุลชีพที่สามารถฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ ปัจจัยหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับผลของยาต้านจุลชีพในการทำลายเชื้อจุลินทรีย์ ได้แก่ 1. ระยะของการเจริญเติบโต (the phase of growth) 2. อัตราการเจริญเติบโต (the rate of growth) 3. อาหารเลี้ยงเชื้อ (the nature of the growth medium) 4. ความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพ (the concentration of the antibiotic) 5. ความหนาแน่นของเชื้อจุลินทรีย์ (the population density) 6. อัตราการเกิดการผ่าเหล่าของเชื้อจุลินทรีย์ (the rate at which resistant mutants arise) ดังนั้น จึงเป็นสิ่งจำเป็นมากที่จะต้องควบคุมปัจจัยต่าง ๆ เหล่านี้ให้พอเหมาะในการทดสอบ ความสามารถของยาต้านจุลชีพในการทำลายเชื้อจุลินทรีย์ ซึ่งวิธีทดสอบความสามารถของยาต้านจุลชีพในการ ทำลายเชื้อนั้นมีด้วยกันหลายวิธี ได้แก่ 1. Disk agar diffusion method วิธีนี้ใช้วิธี Kirby-Bauer sensitivity test ซึ่งนิยมใช้อย่างกว้างขวาง เหมาะที่จะใช้ในงานประจำ (routine work) เพราะว่าเป็นวิธีที่ประหยัด สะดวก สิ้นเปลืองเวลาน้อย เชื้อจุลินทรีย์ที่ต้องการจะทดสอบ ความไวต่อยาต้านจุลชีพ ควรมีความหนาแน่นประมาณ 1.5x108 CFU/ml ทั้งนี้โดยเทียบความขุ่นให้เท่ากับ ความขุ่นของ McFarland No. 0.5 สำหรับ Disk นั้น ก็คือกระดาษกรองที่ชุบยาต้านจุลชีพชนิดต่าง ๆ ไว้ด้วย ความเข้มข้นที่แน่นอนซึ่งจะซึม (diffuse) เข้าไปตามเนื้อของ agar เพื่อออกปฏิกิริยาทำลายเชื้อจุลินทรีย์ รายงานผลจากการวัดขนาดวงใส หรือ inhibition zone โดยเปรียบเทียบกับค่ามาตรฐานที่กำหนดโดย สถาบัน ห้องปฏิบัติการทางวิทยาศาสตร์และการแพทย์ (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) วิธีการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาปฏิชีวนะที่อาศัยหลักการแพร่ของยาปฏิชีวนนะบนอาหารวุ้น ที่ สามารถบอกค่าความเข้มข้นของยาที่ต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ (Minimal Inhibitory Concentration: MIC) ได้ คือวิธี E-test โดยในแผ่นยาทดสอบจะมีการเจือจางยาบนแถบ ทำให้สามารถอ่าน ค่า MIC ได้
77 2. Broth tube dilution method วิธีนี้ทำโดยนำยาต้านจุลชีพมาทำให้เจือจางลงเป็น Serial dilution จากความเข้มข้นสูงไปสู่ความเข้มข้น ต่ำใน Mueller Hinton broth แล้วนำเอาเชื้อจุลินทรีย์ที่ต้องการจะทดสอบความไวของเชื้อต่อยาต้าน จุลชีพนั้นมาใส่ (inoculate) ลงในหลอดที่บรรจุยาต้านจุลชีพไว้แล้วด้วยความเข้มข้นต่าง ๆ กัน สำหรับ control tube จะมีเฉพาะเชื้อจุลินทรีย์กับอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลว (broth) เท่านั้น นำหลอดทดลองทุก หลอดไปบ่มที่ 37C 24 ชั่วโมง แล้วจึงนำมาอ่านผลโดยดูความขุ่นในแต่ละหลอด หลอดที่แสดงค่า MIC (Minimal Inhibitory Concentration) ของยาต้านจุลชีพ ได้แก่ หลอดที่มีความ เข้มข้นของยาต้านจุลชีพต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ได้ สังเกตได้โดยหลอดนั้นจะ ใสไม่มีเชื้อขึ้น จากวิธีนี้ เราสามารถหาค่า MBC (Minimal Bactericidal Concentration) ของยาต้านจุลชีพได้ด้วย โดยนำเอาน้ำเลี้ยงเชื้อในหลอดที่เป็นค่า MIC และในหลอดที่ใส ซึ่งมีความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพสูงกว่าค่า MIC ถัด ๆ ไป มาเพาะเลี้ยง โดย streak ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง แล้วนำไปบ่มที่ 37C 24 ชั่วโมง วันรุ่งขึ้น สังเกตดูการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็งนั้น จานที่ไม่มีโคโลนีของ เชื้อจุลินทรีย์ขึ้นเลยและมีความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพต่ำที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับจานที่ไม่มีโคโลนีของเชื้อแต่ มีความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพสูงกว่า ให้ถือว่าความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพในหลอดที่นำเอาน้ำเลี้ยงเชื้อนั้น มาเพาะเลี้ยงต่อเป็นค่า MBC ของยาต้านจุลชีพนั้น ปกติยาต้านจุลชีพที่มีฤทธิ์เป็น Bactericidal จะมีค่า MIC และ MBC ใกล้เคียงกัน แต่ถ้ามีฤทธิ์เป็น bacteriostatic ค่า MIC และ MBC จะแตกต่างกันมากหรือไม่มีค่า MBC เลย การหาค่า MIC เป็นวิธีที่ทำให้ ทราบถึงปริมาณของยาที่แท้จริง ซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ แต่ใช้เวลามากและ สิ้นเปลือง ไม่เหมาะในงานประจำ (routine work) จะเลือกใช้ในกรณีที่สำคัญและจำเป็น เช่น ในการรักษา subacute bacterial endocarditis ซึ่งรักษาหายยาก หรือใช้ในการทำงานวิจัย 3. Agar plate dilution method วิธีนี้มีหลักการคล้ายกับวิธีที่ 2 ต่างกันตรงที่ว่าวิธีนี้ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง (Mueller Hinton agar) แทนที่จะเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลว (Mueller Hinton broth) ขั้นแรกเตรียม serial dilution ของยาต้านจุลชีพก่อน แล้วใช้ melted Mueller Hinton agar ซึ่งแช่ไว้ ใน water bath อุณหภูมิ 50-60C มาเทผสมกับยาต้านจุลชีพที่มีความเข้มข้นต่าง ๆ กัน แล้วจึงเทของผสม นั้นลงใน sterile Petri dish (pour plate) ก็จะได้ agar plate ที่มียาต้านจุลชีพในความเข้มข้นต่าง ๆ กัน ตั้งแต่ความเข้มข้นสูงไปหาความเข้มข้นต่ำ ปล่อยให้ agar ที่ผสมยาต้านจุลชีพแข็งตัวแล้ว inoculate เชื้อโดย การ streak ลงไปบนพื้นผิวของ agar โดยเชื้อจุลินทรีย์จะต้องมีขนาดของ inoculums ประมาณ 106 cells/ml (เทียบเท่ากับความขุ่นของ McFarland No. 0.5) นำ plate ไปบ่มที่ 37C 24 ชั่วโมง
78 วันรุ่งขึ้น สังเกตดูการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ Plate ใดที่ไม่มีโคโลนีของเชื้อจุลินทรีย์เลย และเป็น ความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพที่ต่ำที่สุด เรียกค่าความเข้มข้นของยานั้นว่า MIC วัตถุประสงค์ของปฏิบัติการต่อไปนี้ เพื่อให้นักศึกษาเข้าใจหลักการของวิธีการทดสอบความไวของ เชื้อจุลินทรีย์ต่อยาต้านจุลชีพและสามารถอ่านผลของยาต้านจุลชีพในการฆ่าหรือยับยั้งการเจริญเติบโตของ เชื้อจุลินทรีย์ได้เพื่อแพทย์จะได้เลือกใช้ยาให้ถูกต้องในการรักษาโรค การทดลองที่ 5.4 Disk agar diffusion method วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษารู้จักหลักการทดสอบความไวของเชื้อจุลินทรีย์ต่อยาโดยวิธี Disk agar diffusion method วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Mueller Hinton agar 2 plates 2. Sterile normal saline solution (NSS) 1 flask 3. McFarland No. 0.5 1 หลอด 4. Sterile swab 2 อัน 5. Forceps 1 อัน 6. Bacterial cultures ประกอบด้วย Staphylococcus aureus หรือ Salmonella Typhi หรือ Klebsiella pneumoniae หรือ Pseudomonas aeruginosa หรือ Escherichia coli 7. Antibiotic paper disk ประกอบด้วย Ampicillin (AM) 10 g, Chloramphenicol (C) 30 g, Gentamicin (GM) 10 g, Kanamicin (K) 30 g, Methicillin (M) 5 g, Penicillin G (P) 10 Units, Tetracycline (Te) 30 g, Tobramycin (NN) 10 g วิธีทำ 1. ใช้ loop แตะเชื้อ 3-4 โคโลนี ที่เพาะไว้ในจานเลี้ยงเชื้อตอนแรกถ่ายลงในหลอดแก้วทดลองซึ่งบรรจุ tryptose phosphate หรือ trypticase soy broth 4 ml (อาหารทั้ง 2 ชนิดนี้จะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียส่วนใหญ่ ให้ขึ้นได้) 2. นำหลอดแก้วทดลองที่ถ่ายเชื้อแล้วเข้าตู้อบเลี้ยงเชื้อนาน 2-5 ชั่วโมง ให้ได้ความขุ่นปานกลาง 3. ใช้น้ำเกลือ (NSS) ที่ปราศจากเชื้อมาเจือจางความขุ่นของแบคทีเรียให้เท่ากับความขุ่นของ McFarland No. 0.5 (เติม 1% BaCl2 0.5 ml ลงใน 1% H2SO4 (0.36 N) 99.5 ml) 4. ในการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาต้านจุลชีพ ควรใช้ Mueller-Hinton agar (หนา 5-6 ซ.ม.) ก่อน ลงเชื้อควรนำ Plate ออกจากตู้เย็นมาทำให้ผิว agar แห้งประมาณ 30 นาที 5. ใช้ sterile swab จุ่มลงใน broth (ข้อ 3) และนำมาป้ายบน plate โดยป้ายเป็น 3 ระนาบให้ทั่ว ผิวหน้า ก่อนป้ายควรแตะและหมุนปลาย swab ที่ข้างหลอดทดลองเสียก่อน
79 6. ปล่อยให้ plate ที่ลงเชื้อแล้วแห้ง 3-5 นาที แล้วจึงวาง disk ลงบน agar โดยใช้ปากคีบ (forceps) ที่ ทำให้ปราศจากเชื้อโดยจ่อในเปลวไฟ แล้วใช้ปลายปากคีบกด disk เบา ๆ ให้ติดแน่นกับผิว agar 7. นำ plate เข้าตู้อบเลี้ยงเชื้อที่ 37C เป็นเวลา 14-18 ชั่วโมง 8. วัดเส้นผ่าศูนย์กลางของ inhibition zone (รวมทั้งการวัดคร่อม disc ด้วย) แล้วนำไปเปรียบเทียบกับ ตาราง Zone size interpretative chart 9. รายงานผลการทดลองลงในตารางที่ 5.4 ตารางรายงานผลการทดลองที่ 5.4 ชนิดของแบคทีเรีย P AM C K M NN Te GM Staphylococcus aureus Salmonella Typhi Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
80 ตารางการแปลผลการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาปฏิชีวนะด้วยวิธี Disk agar diffusion (Zone size interpretative chart) Antibiotic or Chemotherapeutic Agent Disk potency mm. Inhibition Zone Diameter To nearest mm. Resistant Intermediat e Sensitive Ampicillin - Gram negative and Enterococci 10 g 11 or less 12-13 14 or more - Staphylococci and highly penicillin sensitive organisms - Hemophilus 10 g 20 or less 21-28 29 or more 20 or more Bacitracin 10 U 8 or less 9-12 13 or more Cephaloridine 30 g 11 or less 12-15 16 or more Cephalothin 30 g 14 or less 15-17 18 or more Chloramphenicol 30 g 12 or less 13-17 18 or more Colistin 10 g 8 or less 9-10 11 or more Erythromycin 15 g 13 or less 14-17 18 or more Gentamicin 10 g 13 or more Kanamycin 30 g 13 or less 14-17 18 or more Lincomycin 2 g 9 or less 10-14 15 or more Methicillin 5 g 9 or less 10-13 14 or more Nafcillin and Oxacillin 1 g 10 or less 11-12 13 or more
81 Nalidixic acid 30 g 13 or less 14-18 19 or more Novobiocin 30 g 17 or less 18-21 22 or more Nitrofurantion 300 g 14 or less 15-16 17 or more Oleandomycin 15 g 11 or less 12-16 17 or more Penicillin-G - Staphylococci 10 U 20 or less 21-28 29 or more - Other organisms 10 U 11 or less 12-21 22 or more Polymyxin-B 300 U 8 or less 9-11 12 or more Streptomycin 10 g 11 or less 12-14 15 or more Sulfonamides 300 g 12 or less 13-16 17 or more Tetracycline 30 g 14 or less 15-18 19 or more Tobramycin 10 g 11 or less 12-13 14 or more Vancomycin 30 g 9 or less 10-11 12 or more
82 การรายงานผล การอ่านผลการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาปฏิชีวนะอาศัยหลักของ (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) คือ รายงานว่า "sensitive or susceptible (S)" หรือ “intermediate sensitive (IS)" หรือ “resistant (R)"โดยแต่ละคำมีความหมาย ดังนี้ Sensitive หรือ susceptible หมายถึง การที่เชื้อจุลินทรีย์ถูกทำลายหรือถูกยับยั้งการเจริญเติบโตโดย ยาต้านจุลชีพ ซึ่งจะปรากฏเห็นเป็น clear zone (ไม่มีเชื้อขึ้น) รอบ ๆ disk นั้น clear zone ที่เกิดขึ้นนี้เรียกว่า inhibition zone ซึ่งจะแคบหรือกว้าง ขึ้นอยู่กับชนิดของยาและการ sensitive หรือ resist ของเชื้อต่อยานั้น Intermediate sensitive หมายถึง การที่เชื้อจุลินทรีย์ไวต่อยาต้านจุลชีพในขนาดธรรมดา และใช้ยา นั้นเฉพาะที่ (local application) แต่ถ้าจะใช้ยานั้นรักษาการติดเชื้อที่เป็นแบบ systemic infection จะต้อง เพิ่มขนาดของยาให้สูงกว่าขนาดการรักษาธรรมดาจึงจะได้ผล Resistant หมายถึง การที่เชื้อจุลินทรีย์ดื้อต่อยาต้านจุลชีพซึ่งจะสังเกตเห็นว่ามีโคโลนีของเชื้อขึ้นอยู่ รอบ ๆ disk นั้นหรือแม้แต่จะมี inhibition zone (clear zone) เกิดขึ้นแต่ขนาดของเส้นผ่าศูนย์กลางของ clear zone เมื่อเทียบกับตารางแล้วยังอยู่ในเกณฑ์ resistant ดังนั้น หากใช้ยาชนิดนั้น ๆ รักษาก็จะไม่ได้ผล การทดลองที่ 5.5 Broth tube dilution method วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษารู้จักหลักการทดสอบความไวของเชื้อจุลินทรีย์ต่อยาโดยวิธี Broth tube dilution method วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Mueller Hinton broth 1 flask 2. Sterile normal saline solution (NSS) 1 flask 3. McFarland No. 0.5 1 หลอด 4. Sterile test tube 6 tubes 5. Sterile pipette 5 ml 6 อัน 6. Sterile pipette 1 ml 1 อัน 7. Overnight bacterial culture ของ Staphylococcus aureus หรือ Salmonella Typhi หรือ Klebsiella pneumoniae หรือ Pseudomonas aeruginosa หรือ Escherichia coli 8. สารละลายยาต้านจุลชีพของ Ampicillin, Gentamicin, Penicillin G
83 วิธีทำ 1. เจือจางเชื้อจุลินทรีย์ด้วยน้ำเกลือ (NSS) ที่ปราศจากเชื้อให้มีความขุ่นเท่ากับความขุ่นของ McFarland No.0.5 2. เจือจางสารละลายของยาต้านจุลชีพด้วย Mueller Hinton broth แบบ twofold serial dilution ให้ได้ความเข้มข้นดังต่อไปนี้ Ampicillin 32, 16, 8, 4, 2, 1 g/ml Gentamicin 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 g/ml Penicillin G 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 g/ml 3. ใช้ Pipette ขนาด 1 ml pipette เชื้อลงในสารละลายของยาต้านจุลชีพที่เจือจางไว้ tube ละ 1 หยด 4. บ่มที่ 37C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง 5. อ่านค่า MIC จาก tube ที่มีความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพต่ำที่สุดซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญเติบโต ของเชื้อจุลินทรีย์ได้(tubeใส คือ tube ที่ไม่มีเชื้อขึ้น) บันทึกผลในตาราง 5.5
84 ตารางรายงานผลการทดลองที่ 5.5 ชนิดแบคทีเรีย MIC (g/ml) Ampicillin Gentamicin Penicillin Staphylococcus aureus Salmonella Typhi Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli คำถามการทดลองที่ 5.4 และ 5.5 1. จากการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาด้วยวิธี Disk agar diffusion method ครั้งนี้ แบคทีเรียชนิดไหน sensitive ต่อยามากที่สุดและแบคทีเรียชนิดไหน resist ต่อยามากที่สุด 2. คนไข้คนหนึ่งติดเชื้อด้วย แบคทีเรีย A จากการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาแล้วปรากฏว่าแบคทีเรีย A sensitive ต่อยาหลายชนิด ในการวินิจฉัยว่าจะใช้ยาอะไรนั้น ท่านถือหลักอะไรบ้าง 3. อธิบายคำว่า bacteriostatic และ bactericidal และยกตัวอย่างยาที่ออกฤทธิ์เป็นแบบ bacteriostatic และ bactericidal 4. อธิบายคำว่า broad spectrum antibiotics พร้อมทั้งยกตัวอย่างยามา 2 ชื่อ 5. ในการทดสอบความไวของเชื้อต่อยาด้วยวิธี Broth tube dilution การพิจารณาว่าเชื้อแต่ละชนิด resist หรือ sensitive ต่อยาต้านจุลชีพที่นำมาทดสอบหรือไม่ ท่านถือหลักอะไร
85 ปฏิบัติการบทที่ 6 เมแทบอลิซึมของแบคทีเรียและเชื้อแบคทีเรียก่อหนองรูปร่างกลม (Metabolism of bacteria and pyogenic cocci) ผศ.ดร.วิเศษ นามวาท ผศ.ดร.อุมาพร ยอดประทุม เมแทบอลิซึมของแบคทีเรีย ( Metabolism of bacteria ) บทนำ: ขบวนการทางชีวเคมีที่เกิดขึ้นภายในตัวแบคทีเรียเพื่อเปลี่ยนแปลงสารอาหารที่ถูกลำเลียงเข้ามาในเซลล์ ให้กลายเป็นสิ่งที่แบคทีเรียต้องการในการดำรงชีพและการเจริญ รวมเรียกว่า เมแทบอลิซึม (metabolism) ซึ่ง แบ่งได้เป็น 2 ขบวนการควบคู่กันไป คือ 1. ขบวนการสร้าง (Anabolism) เป็นการสร้างสารโมเลกุลใหญ่เพื่อเป็นส่วนประกอบของเซลล์ 2. ขบวนการสลาย (Catabolism) เป็นการสลายสารอาหารโมเลกุลใหญ่ให้กลายเป็นสารโมเลกุลเล็ก ๆ เพื่อให้ได้พลังงานออกมาสะสมไว้ในรูปของ ATP แบคทีเรียต่างชนิดกันอาจจะให้ปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่แตกต่างกัน เพราะขบวนการเมแทบอลิซึมจะถูก ควบคุมโดยลักษณะทางพันธุกรรม อย่างไรก็ตาม สิ่งแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ ออกซิเจน ความเป็นกรดหรือด่าง อาจมีผลทำให้ปฏิกิริยาต่าง ๆ ในขบวนการเมแทบอลิซึมของแบคทีเรียชนิดเดียวกันแตกต่างกันออกไป วัตถุประสงค์ของปฏิบัติการต่อไปนี้ เพื่อให้นักศึกษาได้ศึกษาผลของสิ่งแวดล้อมที่มีการเจริญของ แบคทีเรียและศึกษาขบวนการเมแทบอลิซึมของแบคทีเรียโดยอาศัยปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่เกิดขึ้นจากการกระทำ ของแบคทีเรียในรูปแบบต่าง ๆ กัน
86 ผลของสิ่งแวดล้อมต่อการเจริญของแบคทีเรีย (Environment effect of bacterial growth) การทดลองที่ 6.1 ผลของอุณหภูมิ (Effect of temperature) เมื่อเพาะเชื้อแบคทีเรียชนิดเดียวกันในอุณหภูมิที่ใช้แตกต่างกัน เชื้อจะเจริญได้ดีที่สุดในอุณหภูมิที่ เหมาะสม(optimum temperature) และไม่เจริญในอุณหภูมิที่สูงหรือต่ำเกินไป วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาผลของอุณหภูมิต่อการเจริญของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Broth culture of Escherichia coli (E. coli) 1 หลอด 2. Nutrient broth 3 หลอด วิธีทำ 1. ถ่ายเชื้อ E. coli 1 loop ลงใน Nutrient broth (NB) แต่ละหลอด (ทำทั้ง 3 หลอดโดยใช้ sterile technique) 2. นำแต่ละหลอดไป บ่ม (incubate) ไว้ที่อุณหภูมิต่าง ๆ กัน คือ หลอดที่ 1 เก็บในตู้เย็น อุณหภูมิ 4 O ซ หลอดที่ 2 เก็บในตู้อบ อุณหภูมิ 37 O ซ หลอดที่ 3 เก็บในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิที่ 60 O ซ 3. อ่านผลหลังจาก incubate ไว้แล้ว 18-24 ชั่วโมง 4. การรายงานผลให้รายงานความขุ่นของ broth โดยใช้เครื่องหมาย + เช่น +4, +3, +2, +1 และ 0 ตามลำดับความขุ่นมาก---->น้อย---->ไม่ขุ่น ลงในตารางบันทึกผล การสาธิตที่ 6.1 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.1 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.1 อุณหภูมิ 4 oC 37 oC 60 oC เชื้อแบคทีเรีย Escherichia coli แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
87 คำถามการทดลองที่ 6.1 1. หลังจากการ incubate ถ้านำเชื้อจากหลอดทั้ง 3 มา streak บน Nutrient agar plate ท่านคิดว่าหลอด ใดจะมีเชื้อซึ่งยังมีชีวิตอยู่ในแต่ละหลอด ทำได้โดยวิธีใด ? 2. การนับจำนวนเชื้อซึ่งยังมีชีวิตอยู่ในแต่ละหลอดทำได้โดยวิธีใด ? การทดลองที่6.2 ผลของออกซิเจน (Effect of oxygen) แบคทีเรียประเภท aerobes, facultative anaerobes และ anaerobes มีความต้องการ O2 ใน ขบวนการเมแทบอลิซึมแตกต่างกัน เมื่อนำมาเพาะเลี้ยงในสภาวะที่มีและไม่มี O2 จะสามารถบอกได้ว่าเป็น แบคทีเรียประเภทใด วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาผลของออกซิเจนต่อการเจริญของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์ 1. Broth cultures ประกอบด้วย Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas spp. และ Clostridium spp. เชื้อละ 1 หลอด 2. Thioglycollate medium (THIO) 4 หลอด 3. Brain Heart Infusion broth (BHI) 8 หลอด วิธีทำ 1. นำหลอด Thioglycollate medium (THIO) ทั้ง 4 มาต้มไล่ O2 ประมาณ 5-10 นาที แล้วปิดจุกให้ แน่น ปล่อยให้เย็นลงแล้วจึงถ่ายเชื้อทั้ง 4 ชนิด ใส่ลงในหลอดแต่ละหลอด (การถ่ายเชื้อต้องทำอย่าง รวดเร็วเพื่อลดจำนวน O2 ซึ่งอาจจะปนเข้าไปในระหว่างการเปิดจุกหลอดทดลอง) 2. นำหลอดทั้ง 4 ไป incubate ไว้ในตู้อบที่ 37 O ซ 3. ถ่ายเชื้อทั้ง 4 ชนิดลงใน BHI เชื้อละ 2 หลอด ชุดแรกนำไป Incubate ไว้ที่ 37 O ซ อีกชุดหนึ่งให้นำมา รวมไว้ที่โต๊ะกลาง เพื่อรวบรวมเข้าตู้อบชนิดไร้ออกซิเจน (Anaerobic incubator) หรือ Anaerobic jar 4. อ่านผลหลังจาก incubate ไว้แล้ว 24 ชั่วโมง โดยรายงานผลจากความขุ่นที่ปรากฏ เช่นเดียวกับการ ทดลองที่ 6.1 บันทึกผลในตาราง การสาธิตที่ 6.2 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.2
88 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.2 เชื้อแบคทีเรีย Thioglycollate broth BHI Aerobic Anaerobic Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Clostridium perfringens แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… คำถามการทดลองที่ 6.2 1. ทำไมจึงไม่จำเป็นต้อง incubate เชื้อใน THIO medium ไว้ในสภาพไร้ออกซิเจน(Anaerobic condition) 2. เปรียบเทียบข้อดีและข้อเสียของการใช้ THIO medium, ตู้อบไร้ออกซิเจนและ Anaerobic jar 3. ในการทดลองนี้ แบคทีเรียชนิดใดเป็น Strictly aerobe? ชนิดใดเป็น Anaerobe ? 4. Facultative anaerobe ต่างจาก Obligate anaerobes อย่างไร?
89 เมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรท (Carbohydrate metabolism) การทดลองที่ 6.3 Oxidation-Fermentation Test วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาการใช้น้ำตาลแบบ oxidation และ fermentation ของ เชื้อแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม 1. Broth cultures ประกอบด้วย Escherichia coli, Acinetobacter lowffii, และ Pseudomonas aeruginosa เชื้อละ 1 หลอด 2. Glucose OF medium 6 หลอด 3. Sterile paraffin 5 ml 1 หลอด 4. Sterile pipette 5 ml 1 อัน วิธีทำ 1. ใช้ sterile needle เขี่ยเชื้อแต่ละชนิด แล้วแทง (stab) ลงใน Glucose OF medium เชื้อละ 2 หลอด หลอดที่ 1 เขียนคำว่า "Open" หรือ O กำกับ หลอดที่ 2 เขียนคำว่า "Cover" หรือ C กำกับ 2. เติม sterile paraffin ใส่ลงในทั้ง 3 หลอด ที่มีคำว่า "Cover" หรือ C หลอดละ 1.5 ml. โดยใช้ pipette 3. นำหลอดทั้ง 6 หลอดไป incubate ไว้ในตู้อบ อุณหภูมิ 37O ซ เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง 4. สังเกตและรายงานผลการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในแต่ละหลอด บันทึกผลในตาราง การอ่านผล แบคทีเรียที่ใช้น้ำตาล glucose ได้แบบ fermentation จะทำให้ media เปลี่ยนสีจากเขียวเป็น เหลืองได้ ทั้งในหลอดที่เทและไม่เทปิดด้วย paraffin ส่วนแบคทีเรียที่ใช้ glucose แบบ oxidation จะทำให้ เฉพาะส่วนบนของ media ในหลอดที่ไม่เทปิดด้วย paraffin เท่านั้นที่เปลี่ยนเป็นสีเหลือง การสาธิตที่ 6.3 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล และบันทึกผลในตารางที่ 6.3
90 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.3 เชื้อ OF medium Open OF medium Cover การแปลผล Escherichia coli Acinetobacter lowffii Pseudomonas aeruginosa แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… คำถามการทดลองที่ 6.3 1. ขบวนการ Fermentation และ Oxidation ต่างกันอย่างไร 2. สารที่ใช้เป็น pH indicator ใน Glucose OF medium คืออะไร? มีสีอะไรในสภาพ pH ต่าง ๆ