91 การทดลองที่ 6.4 ทดสอบการย่อยแป้ง (Starch hydrolysis) วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาการใช้แป้งในการเจริญของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Broth cultures ประกอบด้ว ย Escherichia coli, Bacillus subtilis และ Pseudomonas aeruginosa เชื้อละ 1 หลอด 2. Starch agar plate 1 plate 3. น้ำยาไอโอดีนสำหรับทดสอบแป้ง 1 ชุด วิธีทำ 1. ใช้ดินสอเขียนแก้วแบ่ง starch agar plate ออกเป็น 3 ส่วน แล้ว streak เชื้อ ดังรูป ส่วนที่ 1 streak เชื้อ Escherichia coli ส่วนที่ 2 streak เชื้อ Bacillus subtilis ส่วนที่ 3 streak เชื้อ Proteus vulgaris 2. นำ plate ไป incubate ในตู้อบ 37 O ซ 24-48 ชั่วโมง 3. นำ plate จากข้อ 2 ไปทดสอบด้วยน้ำยาไอโอดีน แล้วรายงานผลในตารางบันทึกผล การอ่านผล แบคทีเรียที่ย่อยแป้งได้เมื่อราดด้วยน้ำยาไอโอดีนบริเวณที่เชื้อเจริญจะเกิด zone ใส เนื่องจากไม่ มีแป้งเหลืออยู่ ถ้าย่อยแป้งไม่ได้จะเกิดสีน้ำเงินรอบบริเวณที่เชื้อเจริญเมื่อทดสอบด้วยน้ำยาดังกล่าว ชุดสาธิตที่6.4 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.4 P. aeruginosa
92 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.4 เชื้อ Starch hydrolysis Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… คำถามการทดลองที่ 6.4 1. เอ็นไซม์ที่ย่อยแป้งเป็น intracellular enzyme (Endoenzyme) หรือ Extracellular enzyme (Exoenzyme) เพราะเหตุใด ? 2. แบคทีเรียย่อยแป้งเพื่อจุดประสงค์อะไร ? 3. แป้งจัดเป็นคาร์โบไฮเดรทจำพวกใด ? การทดลองที่6.5 ทดสอบ Sugar fermentation วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการทดสอบการใช้น้ำตาลแบบ fermentation วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Broth cultures ประกอบด้วย E. coli, Bacillus subtilis และ Proteus spp เชื้อละ 1 หลอด 2. Fermentation medium ที่มีน้ำตาล Glucose (จุกเขียว), Lactose (จุกแดง) และ Sucrose (จุกขาว) อย่างละ 3 หลอด วิธีทำ 1. ถ่ายเชื้อแต่ละชนิดลงใน Fermentation medium ทั้ง 3 หลอด หลอดละ 1 loop โดยใช้ sterile technique 2. นำหลอดทดลองทั้ง 9 หลอดไป incubate ในตู้อบ 37O ซ 18-24 ชั่วโมง 3. สังเกตการเปลี่ยนสีและก๊าซที่เกิดขึ้นในหลอดดักก๊าซ การอ่านผล แบคทีเรียที่ใช้น้ำตาลได้จะเจริญแบ่งตัวทำให้ media ขุ่นและเกิดกรด ทำให้ phenol red ซึ่งเป็น indicator เปลี่ยนสีจากสีแดงกลายเป็นสีเหลือง และถ้ามี gas เกิดขึ้นด้วยจะสังเกตได้จากหลอดดักก๊าซที่คว่ำ อยู่ใน fermentation medium
93 การสาธิตที่ 6.5 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.5 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.5 เชื้อ Glucose Lactose Sucrose Acid Gas Acid Gas Acid Gas Escherichia coli Bacillus subtilis Proteus spp. แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… คำถามการทดลองที่ 6.5 1. Organic acid และ gas ที่เกิดขึ้นจากขบวนการ Fermentation ที่ท่านทราบมีอะไรบ้าง ? 2. ขบวนการ sugar fermentation ใช้เอ็นไซม์จำพวกใด ?
94 เมแทบอลิซึมของไนโตรเจน (Nitrogen metabolism) การทดลองที่ 6.6 การใช้สารไนเตรท (Nitrate reduction test) วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาการใช้ไนโตรเจนในรูปสารประกอบไนเตรท เพื่อการเจริญ ของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Broth cultures ประกอบด้วย Acinetobacter lowffii, Burkholderia pseudomallei, และ Pseudomonas aeruginosa เชื้อละ 1 หลอด 2. Motile-Nitrate medium (MN) 3 หลอด 3. Dimethyl-alpha naphthylamine solution (solution B) 4. Sulfanilic acid (solution A) 5. ผงสังกะสี(zinc powder) วิธีทำ 1. Stab เชื้อทั้ง 3 ชนิดลงใน Motile Nitrate medium นำไป incubate ที่ 37O ซ 24-48 ชั่วโมง 2. ทดสอบปฏิกิริยา โดยหยด solution A ลงในหลอด 2-3 หยด แล้วหยด solution B อีก 2-3 หยด แล้วรายงานผลในตารางบันทึกผล การอ่านผล แบคทีเรียซึ่งใช้สารประกอบไนเตรทเป็นแหล่งไนโตรเจนได้ จะสร้างเอนไซม์ nitrate reductase เพื่อ reduce ไนเตรทให้กลายเป็นสารประกอบไนไตรท์ ซึ่งเมื่อทดสอบโดยเติม sulphanilic acid (solution A) และ dimethy-alpha naphthylamine(solution B) จะเกิด diazotization ได้สารประกอบเชิงซ้อนสีแดง ในกรณีที่ทดสอบแล้วไม่มีสารประกอบไนไตรท์เกิดขึ้น ให้เติมผงสังกะสี (zinc powder) ลงไป เพื่อ reduce ไนเตรทให้กลายเป็นไนไตรท์ ถ้าเกิดสารประกอบสีแดงขึ้นแสดงว่ายังคงมีไนเตรทเหลืออยู่ใน media ก่อนเติมผงสังกะสี ซึ่งบ่งชี้ว่าแบคทีเรียที่ทดสอบไม่สามารถใช้ไนเตรทเป็นแหล่งของไนโตรเจนได้ แต่ถ้าเติมผง สังกะสีแล้วไม่เกิดสารประกอบสีแดง แสดงว่าแบคทีเรียได้ reduce ไนเตรทเป็นไนไตรท์ แล้ว reduce ต่อจน กลายเป็นก๊าซ N2 หรือ NH3 ขึ้นกับชนิดของแบคทีเรีย ดังนั้นจึงไม่มีทั้งไนเตรทและไนไตรท์เหลืออยู่ใน media การสาธิตที่ 6.6 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.6
95 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.6 เชื้อ Motility Nitrate reduction test Sol.A + Sol.B Zinc powder การแปลผล Burkholderia pseudomallei Acenetobactor lowffii Pseudomonas aeruginosa แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… คำถามการทดลองที่ 6.6 1. ถ้าเติมผงสังกะสีแล้วไม่เกิดสีแดง จะแปลผลการใช้สารไนเตรทอย่างไร ?
96 การทดลองที่ 6.7 การย่อย Urea (Urea hydrolysis) วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาทราบหลักการศึกษาการใช้ไนโตรเจนในรูปของสารประกอบ urea เพื่อการ เจริญของแบคทีเรีย วัสดุอุปกรณ์(สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. Broth cultures ประกอบด้วย E. coli และ Proteus vulgaris เชื้อละ 1 หลอด 2. Urease test medium 2 หลอด วิธีทำ 1. Streak เชื้อลงบนผิวหน้า slant ของ Urease test medium แล้ว incubate ที่ 37O ซ 24-48 ชั่วโมง 2. สังเกตและรายงานผลการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในตารางบันทึกผล การอ่านผล แบคทีเรียที่ใช้ urea เป็นแหล่งไนโตรเจนได้ จะสร้างเอนไซม์ urease เพื่อสลาย urea ให้ กลายเป็นก๊าซ CO2 และ NH3 ได้โดยปฏิกิริยา hydrolysis ทำให้ media มี pH เป็นด่าง ดังนั้น indicator (phenol red) จึงเปลี่ยนจากสีเหลืองเป็นสีแดง ทำให้ media เห็นเป็นสีชมพูบานเย็น NH2 H2O O=C 2NH3 + CO2 NH2 urease การสาธิตที่ 6.7 แสดงผลการทดลอง ให้นักศึกษาอ่านผล บันทึกผลในตารางที่ 6.7 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.7 เชื้อ Urea hydrolysis Escherichia coli Proteus vulgaris แปลผลและสรุปผลการทดลอง…………………………………………..…………………………………………………………………… ………………………………….………………………………………………………………………………..……………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
97 Pyogenic cocci รศ.ดร.จริยา ชมวารินทร์ บทนำ: แบคทีเรียก่อโรคกลุ่ม pyogenic cocci แบ่งออกเป็นกลุ่ม ๆ ตามลักษณะรูปร่าง การเรียงตัว การติดสี และคุณสมบัติเฉพาะ ดังนี้ 1. Gram positive cocci ไ ด ้ แ ก ่ Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (- Streptococcus group A), Streptococcus pneumoniae (pneumococci) เป็นต้น 2. Gram negative cocci ได้แก่ Neisseria gonorrhoeae , Neisseria meningitidis เป็นต้น Gram positive cocci Staphylococcus เป็นแกรมบวกรูปกลม เรียงตัวเป็นกลุ่ม เชื้อเจริญทั้งในภาวะที่มีออกซิเจนและไม่มีออกซิเจน (facultative anaerobe bacteria) เชื้อในสกุลนี้อาศัยอยู่ตามผิวหนังส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย และพบมาก บริเวณจมูก (nasopharynx) เชื้อที่มีความสำคัญทางการแพทย์คือ S. aureus, S. epidermidis และ S. saprophyticus เชื้อ S. aureus พบว่าทำให้เกิดโรคได้ในเกือบทุกระบบของร่างกาย เช่น การติดเชื้อระดับผิวหนังและ เนื้อเยื่อ ได้แก่ การเกิดฝีกุ้งยิง impetigo หรือ pustule ผิวหนังหลุดลอก cellulitis เป็นต้น การติดเชื้อ ระดับลึกลงจากผิวหนัง ได้แก่ septicemia, endocarditis, pneumonia, osteomyelitis และ toxic shock syndrome เป็นต้น และการติดเชื้อในระบบทางเดินอาหาร โดยทำให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ เป็นต้น ส่วน S. epidermidis และ S. saprophyticus มักทำให้เกิดโรคในคนเมื่อร่างกายอ่อนแอ จัดว่าเป็น เชื้อฉวยโอกาสแต่สร้าง coagulase ไม่ได้ เรียกเชื้อกลุ่มนี้ว่า coagulase negative staphylococci (CONS หรือ CNS) การจำแนกเชื้อใช้การย้อมสีแกรม ดูรูปร่าง การเรียงตัวของเชื้อ การทดสอบ catalase การสร้างเอ็นไซม์ coagulase และการเฟอร์เมนต์น้ำตาลแมนนิทอลและกลูโคส Streptoococcus เป็นแกรมบวกรูปกลม เรียงตัวเป็นสาย ยกเว้น S. pneumoniae เรียงตัวเป็นคู่ เชื้อสกุล Streptococcus มีด้วยกันหลายชนิด บางพวกพบในส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย เช่น ลำคอ ลำไส้เป็นต้น เจริญ ได้ในภาวะ facultative anaerobe bacteria การติดเชื้อ Streptococcus มีทั้งเกิดจากการติดเชื้อโดยตรง และโรคแทรกซ้อนที่เกิดขึ้นภายหลังการติดเชื้อ Streptococcus pyogenes ทำให้เกิดโรคในคนได้บ่อยที่สุด ซึ่งได้แก่ pharyngitis, tonsillitis, pyoderma หรือ impetigo, endocarditis, erysipelas, necrotizing fasciitis เป็นต้น การเป็นโรคที่เกิดจาก
98 การติดเชื้อ Streptococci โดยตรง เรียกว่า suppurative diseases และเมื่อเกิดการติดเชื้อดังกล่าวอาจมีโรค แ ท ร ก ซ ้ อ น ข ึ ้ น ภ า ย ห ล ั ง เ ร ี ย ก ว ่ า non-suppurative diseases เ ช ่ น rheumatic fever แ ล ะ glomerulonephritis นอกจากนี้เชื้อยังทำให้เกิด septicemia โรคที่สัมพันธ์กับการสร้าง pyrogenic exotoxins ได้แก่ scarlet fever และ Streptococcal toxic shock-like syndrome Streptococcus pneumoniae (pneumococci) เชื้อเป็นแกรมบวกรูปร่างกลม อยู่เรียงกันเป็นคู่ๆ โดยหันด้านกลมเข้าหากัน (Gram positive diplococci) ทำให้มองเห็นเป็นรูปกระสวย (lancet shape) อาจพบเชื้อได้บ้างบนทางเดินหายใจส่วนบน เชื้อสลายเม็ดเลือดแดงได้ไม่สมบูรณ์ (alpha hemolysis) เชื้อ สร้างแคปซูล โรคที่เกิดจากเชื้อนี้มีด้วยกันหลายโรค ได้แก่ ปอดบวม (pneumonia), ไซนัสอักเสบ (sinusitis), หูชั้นกลางอักเสบ (otitis media) และเยื่อหุ้มสมองอักเสบ (meningitis) เป็นต้น การจำแนกเชื้อใช้การย้อมสีแกรม ดูรูปร่าง การเรียงตัวของเชื้อ การทดสอบ catalase การสลายเม็ด เลือดแดง การทดสอบ optochin หรือ bacitracin sensitivity Gram negative cocci แบคทีเรียในสกุล Neisseria ทุกตัวมีรูปร่างกลม ติดสีแกรมลบ เรียงตัวเป็นคู่ (Gram negative diplococci) เซลล์มีลักษณะคล้ายไตหรือเม็ดกาแฟ (kidney shape) เอาด้านเว้าประกบเข้าหากัน ต้องการ ออกซิเจนในการเจริญ Neisseria หลายชนิด เป็นเชื้อประจำถิ่นในส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย เช่น สามารถพบใน ระบบทางเดินหายใจ ช่องปากและช่องคลอดเป็นต้น เชื้อเหล่านี้ ได้แก่ Neisseria mucosa, N. sicca, N. subflava, Neisseria (Moraxella) catarrhalis เชื้อที่มีความสำคัญทางการแพทย์และก่อโรคในคนคือ สกุล (genus) Neisseria ที่สำคัญมีอยู่ 2 สปีชีส์ (species)คือ Neisseria gonorrhoeae หรือ โกโนคอคไค (gonococci) ทำให้เกิดโรคหนองในและ Neisseria meningitidis หรือ เมนิงโกคอคไค (meningococci) ทำให้เกิดเยื่อหุ้มสมองอักเสบหรือโรคกาฬหลังแอ่น เชื้อ เพาะเลี้ยงได้ยาก อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ทั่วไปคือ chocolate blood agar ที่มี CO2 ประมาณ 5-10% (เช่นใน candle jar) ภายใต้อุณหภูมิ 35 o C -37 o C ใช้เวลาในการเจริญประมาณ 48 ชั่วโมง ส่วน Neisseria ที่ไม่ก่อ โรคสามารถเจริญบนอาหารเลือด (blood agar) ธรรมดาภายใต้สภาวะอากาศปกติ การจำแนกเชื้อใช้การย้อมสีแกรม ดูรูปร่าง การเรียงตัวของเชื้อ การทดสอบ oxidase การใช้น้ำตาล maltose sucrose และ glucose วัตถุประสงค์ 1. รู้จักลักษณะรูปร่าง การติดสีและคุณสมบัติที่สำคัญของแบคทีเรียกลุ่มแบคทีเรียที่ทำให้เกิดหนอง (pyogenic cocci) 2. การจำแนกเชื้อกลุ่ม pyogenic cocci การทดลองที่ 6.8 การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Gram positive cocci
99 อุปกรณ์ที่ใช้ นักศึกษาแต่ละกลุ่ม จะได้รับอุปกรณ์ดังนี้ 1. เชื้อแบคทีเรีย 2 ชนิดบนอาหาร blood agar 2. ชุดย้อมสีแกรม 3. 3% H2O2 4. ชุดอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ทดสอบประกอบด้วย 4.1 Plasma, PR-manitol, PR-glucose 4.2 blood agar, bacitracin disc 4.3 blood agar, optochin disc ขั้นตอน 1. ย้อมสี Gram เชื้อแบคทีเรียทั้งสองชนิด 2. ทดสอบการสร้างเอนไซม์ catalase โดยใช้ 3% H2O2 3. ถ้าผลการทดสอบ catalase เป็นบวก เพาะเชื้อในอาหารทดสอบชุดที่ 4.1 4. ถ้าผลการทดสอบ catalase เป็นลบ ดูการสลายเม็ดเลือดแดงของเชื้อ − ถ้าเชื้อสลายเม็ดเลือดแดงแบบ beta-hemolysis ให้ใช้วัสดุอุปกรณ์ข้อ 4.2 ทดสอบ − ถ้าเชื้อสลายเม็ดเลือดแดงแบบ alpha-hemolysis ให้ใช้วัสดุอุปกรณ์ข้อ 4.3 ทดสอบ 5. หลังจากเพาะเชื้อในอาหาร 4.1, 4.2 หรือ 4.3 แล้ว นำไปบ่มที่ 37 o C, 24 ชม. บันทึกและรายงาน ผลในตารางบันทึกผล แผนผังการดำเนินการจำแนกเชื้อกลุ่ม Gram positive cocci เป็นไปดังแผนภูมิที่ 6.1
100 วิธีทำ เชื้อ Staphylococcus 1. Gram’s stain เชื้อ Staphylococcus เป็น Gram positive cocci เรียงตัวอยู่เป็นกลุ่ม (clusters) 2. Colonial morphology - S. aureus ลักษณะ colony บน blood agar กลม สีเหลืองทอง, ครีม, เทาหรือขาว - S. epidermidis ลักษณะ colony บน blood agar กลม สีขาว 3. Biochemical test การทดสอบปฏิกิริยาทางชีวเคมี สำหรับเชื้อ Staphylococci มีดังนี้ 3.1 Catalase test เป็นการทดสอบความสามารถในการสร้างเอนไซม์ catalase ของเชื้อ Staphylococci ซึ่งจะ ใช้คุณสมบัติในข้อนี้แยกเชื้อ Staphylococcus จากเชื้อ Streptococcus การทดสอบใช้หลักที่ว่า catalase สามารถย่อยสลาย H2O2 (Hydrogen peroxide) ได้ น้ำ และก๊าซออกซิเจน ดังปฏิกิริยา วิธีทำ 1. หยด 3% H2O2 ลงบนสไลด์สะอาด 1 หยด 2. ใช้ sterile loop แตะเชื้อแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบจากโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อ นำมาแตะกับ H2O2 บนสไลด์ การอ่านผล แบคทีเรียที่สร้าง catalase ได้ เมื่อแตะกับ H2O2 จะมีฟองก๊าซเกิดขึ้นทันที ถ้าเชื้อที่ต้องการ ทดสอบอยู่บน Blood agar เวลาเขี่ยเชื้อต้องระวังไม่ให้ loop แตะเนื้อวุ้นมาด้วย เพราะในเซลล์เม็ด เลือดแดงมีเอนไซม์ catalase จะทำให้อ่านผลผิดพลาดได้ 3.2 Coagulase test เชื้อ Staphylococcus ที่ทำให้เกิดโรคในคน สามารถสร้างเอนไซม์ coagulase ได้ และ เอนไซม์นี้ สามารถทำให้พลาสม่าของคนและกระต่ายแข็งตัว (clot) ได้ วิธีทำ 1. ใช้ sterile citrated plasma ซึ่งบรรจุในหลอดทดลองเล็ก ๆ 1 หลอด ประมาณ 0.5 มล. เป็น อาหารทดสอบ 2. inoculate เชื้อที่จะทดสอบประมาณ 2-3 โคโลนีลงไป 3. นำหลอดทดลองไป incubate ที่อุณหภูมิ 37C นาน ประมาณ 18-24 ชั่วโมง แล้วนำมาอ่านผล การอ่านผล ผลบวก (positive) คือพลาสม่าในหลอดเกิด clot เป็นก้อนแข็งคล้ายวุ้น ส่วนผลลบ (negative) คือ พลาสม่าจะเหลวเหมือนเดิม
101 3.3 Sugar fermentation test เชื้อ Staphylococcus เป็น facultative anaerobic bacteria สามารถเจริญได้ทั้งในสภาวะ ที่มีและไม่มีออกซิเจน และสามารถ ferment น้ำตาลให้กรดเกิดขึ้น ดังนั้น จึงใช้คุณสมบัติในการ ferment น้ำตาลมาใช้ในการทดสอบแยกชนิดของเชื้อ น้ำตาลที่ใช้คือ glucose และ mannitol ผล การทดสอบอ่านตามตารางสรุปผลการทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมีของเชื้อ Staphylococci ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ทดสอบการ ferment น้ำตาล จะมี phenol red เป็น indicator เมื่อ เชื้อสามารถ ferment น้ำตาลได้กรดเกิดขึ้นสี indicator จะเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีเหลือง ถ้าเชื้อชนิดใด ใช้น้ำตาลไม่ได้ก็อาจใช้ peptone ซึ่งผลที่ได้จะเป็นพวกด่าง ทำให้ indicator มีสีแดงเข้มกว่าเดิม การอ่านผล ผลบวก (positive) คืออาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนจากแดงเป็นเหลือง ผลลบ (negative) คืออาหารเลี้ยงเชื้ออาจเปลี่ยนสีเป็นสีส้มหรือสีแดงเข้มกว่าเดิม 3.4 Mannitol salt agar (MSA) เชื้อ S. aureus สามารถเจริญได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีความเข้มข้นของเกลือสูงถึง 7% ดังนั้น จึงใช้ MSA ในการทดสอบแยกเชื้อ S. aureus ออกจากเชื้ออื่น ๆ เพราะใน MSA จะมี NaCl อยู่ 7% และมีน้ำตาล Mannitol ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นและการอ่านผล เหมือนกับ Sugar-fermentation test ตารางสรุปผลการทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมีของเชื้อ Staphylococci เชื้อ Catalase Coagulase PR Mannitol PR Glucose S. aureus + + or - + + S. epidermidis + - - + Micrococcus sp. + - - -
102 เชื้อ Streptococcus 1. Gram’s stain เชื้อ Streptococcus เป็น Gram positive cocci เรียงตัวอยู่เป็นสาย ยกเว้น Streptococcus pneumoniae ซึ่งมักอยู่เป็นคู่ (diplococci) อยู่เดี่ยว ๆ หรือเป็นสายสั้น ๆ 2. Colonial morphology ลักษณะโคโลนีของเชื้อ Streptococcus ที่เจริญบน blood agar ทำให้ แบ่งเชื้อนี้ได้เป็น − Alpha-hemolytic Streptococci เชื้อในกลุ่มนี้รอบ ๆ โคโลนีมีสีเขียวอ่อน ๆ เนื่องจากมีการ แตกสลายของเม็ดเลือดแดงบางส่วน (partial hemolysis) เช่น Streptococcus pneumoniae − Beta-hemolytic Streptococci เชื้อในกลุ่มนี้รอบ ๆ โคโลนีเป็นขอบใส ๆ เนื่องจากมีการ แตกสลายเม็ดเลือดแดงอย่างสมบูรณ์ (complete hemolysis) เช่น -hemolytic Streptococci group A − Gamma-hemolytic Streptococci เชื้อในกลุ่มนี้รอบ ๆ โคโลนีไม่มีการเปลี่ยนแปลง (non hemolysis) 3. Bacitracin sensitivity test เป็นการทดสอบเพื่อแยกชนิดของเชื้อ -hemolytic Streptococci group A จากเชื้อ -hemolytic Streptococci ชนิดอื่น ๆ วิธีทำ 1. Inoculate เชื้อจากโคโลนีที่มีลักษณะ Beta hemolysis ซึ่งสงสัยว่าเป็น -Streptococci group A ลงบน blood agar โดยการ streak เชื้อถี่ ๆ ซ้ำไปมา 2. วาง Bacitracin disc ขนาด 0.04 unit ลงบริเวณที่ streak เชื้อไว้ 3. นำ plate ไป incubate ที่ 37o C เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง การอ่านผล ผลบวก (positive) เกิด inhibition zone รอบ ๆ disc แสดงว่าเชื้อที่ทดสอบเป็น - Streptococci group A ส่วนผลลบ (negative)ไม่เกิด inhibition zone รอบ ๆ disc แสดงว่าเชื้อที่ ทดสอบเป็น -Streptococci group อื่น 4. Optochin sensitivity test เป็นการทดสอบเพื่อแยกเชื้อ pneumococci จากเชื้อ alphahemolytic streptococci อื่น ๆ โดยใช้หลักที่ว่า เชื้อ pneumococci สามารถถูกยับยั้งการเจริญเติบโตได้ ด้วย optochin (ethylhydrocuprine hyprochloride) แต่สารนี้จะไม่ยับยั้งการเจริญของเชื้อ alphahemolytic Streptococci อื่นๆ วิธีทำและการอ่านผลเหมือน bacitracin sensitivity test แต่จะใช้ optochin disc แทนเท่านั้น
103 แผนภูมิที่ 6.1 การศึกษาเชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม pyogenic gram positive cocci น.ศ.ได้เชื้อ Unknown บน Blood agar ย้อม Gram ทดสอบ Catalase positive negative Plasma, PR-manitol, PR-glucose -hemolysis -hemolysis อ่านผลเทียบกับตารางที่ 6.1 Bacitracin test Optochin test sensitive resistance sensitive resistance -strep. gr.A -strep. non gr.A S. pneumoniae -strep อื่นๆ
104 ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 6.8 คุณลักษณะของเชื้อ หมายเลข…………. หมายเลข………….. รูปร่าง(ที่จำเพาะ) การเรียงตัว Catalase Coagulase Ferment PR-manitol Ferment PR-glucose ชนิดของ hemolysis Bacitracin test Optochin test ชนิดของเชื้อนี้คือ……………………………………………………………………. ND = not done (ไม่อยู่ในขั้นตอนที่สมควรทำ) + = การทดสอบให้ผลบวก, ไวต่อยา - = การทดสอบให้ผลลบ, ดื้อต่อยา
105 การทดลองที่ 6.9 การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Gram negative cocci เชื้อ Neisseria ที่ทำให้เกิดโรคในคนมี 2 species ได้แก่ N. gonorrhoeae และ N. meningitidis 1. Gram’s stain เชื้อ Neisseria เป็น Gram negative diplococci รูปร่างคล้ายไตประกบกัน (kidney shape) กรณีย้อม Gram's stain จากหนองของผู้ป่วยหนองในจะพบเชื้อ N. gonorrhoeae อยู่ใน polymorphonuclear leukocyte (intracellular infection) 2. Colonial morphology เชื้อ Neisseria ต้องการ enrichment media เช่นchocolate agar และ ต้องเจริญในบรรยากาศที่มี CO2 5-10% ได้แก่ใน Candle jar ใช้เวลาเจริญเติบโตประมาณ 48 ชั่วโมง จะได้ colony มีลักษณะกลมโค้ง แวววาว สีเทาขาว 3. Biochemical test การทดสอบทางชีวเคมีที่สำคัญสำหรับเชื้อ Neisseria ได้แก่ 3.1 Oxidase test เชื้อ Neisseria สามารถสร้างเอนไซม์ oxidase ได้ ซึ่งสามารถทดสอบได้โดยอาศัยหลักที่ว่า oxidase จะทำปฏิกิริยากับ 1% tetramethyl-phenylenediamine dihydrochloride (Oxidase reagent) ได้สีม่วง เข้ม วิธีทำ ใช้ sterile loop แตะเชื้อที่สงสัย นำไปขีดลงบน Oxidase paper (กระดาษกรองที่ชุบ Oxidase reagent) ถ้าเชื้อแบคทีเรียนั้นสามารถสร้าง oxidase ได้ จะมีสีม่วงเข้มเกิดขึ้นที่รอยขีดนั้น ภายใน 10 วินาที 3.2 Sugar fermentation การแยก species ของเชื้อ N. gonorrhoeae และ N. meningitidis ออกจาก Neisseria species อื่น ๆ ใช้การทดสอบการ ferment น้ำตาล Glucose, Maltose และ Sucrose ได้กรดเกิดขึ้น ดังแสดงไว้ในตาราง สรุปผลการ ferment น้ำตาลของ Neisseria species ต่าง ๆ วิธีทำ ใช้ sterile needle แตะเชื้อที่สงสัยนำมา stab ลงใน CTA glucose, CTA maltose, CTA sucrose และนำไป incubate ที่ 37o C 24-48 ชั่วโมง (CTA=Cystine trypticase agar) การอ่านผล น้ำตาลที่นำมาทดสอบมี phenol red เป็น indicator ถ้ามีการ ferment น้ำตาล จะเกิดกรดขึ้น indicator จะเปลี่ยนจากสีส้มแดงเป็นสีเหลือง
106 ตารางสรุปผลการ ferment น้ำตาลของ Neisseria species ต่าง ๆ เชื้อ Fermentation Glucose Maltose Sucrose N. meningitidis + + - N. gonorrhoeae + - - N. catarrhalis - - - N. sicca, N. mucosa + + + แผนภูมิที่ 6.2 การศึกษาเชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม pyogenic gram negative cocci Gram negative diplococci kidney shape Oxidase test Neisseria PR glucose PR maltose PR sucrose + - - N. gonorrhoeae + + - N. meningitides + + + N. sicca , N. mucosa
107 คำถามเรื่อง pyogenic cocci 1. การย้อมสีแกรมใช้จำแนกเชื้อในกลุ่ม pyogenic cocci ได้อย่างไร โดยเฉพาะการแยกระหว่างเชื้อ Staphylococcus และ Streptococcus 2. การทดสอบทางชีวเคมีที่ใช้แยกระหว่างเชื้อ Staphylococcus และ Streptococcus คือการทดสอบ อะไร 3. เอ็นไซม์ที่ใช้จำแนกเชื้อ Staphylococcus aureus จากเชื้อ Staphylococcus ตัวอื่น ๆคือเอ็นไซม์ อะไร 4. การทดสอบใดที่ใช้บ่งชี้เบื้องต้นว่า เชื้อนั้นคือ Streptococcus pneumonia 5. การเพาะเลี้ยงเชื้อ Neisseria ก่อโรคแตกต่างจาก Neisseria ไม่ก่อโรคอย่างไร เอกสารอ้างอิง 1. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 12th edition. St. Loius : C.V. Mosby, 2007. 2. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger, P. Koneman’ s Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. 6th edition. Philadelphia: Lippincott William & Wilkins, 2006. 3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML. Manual of clinical microbiology. 9th edition. Washington, D.C: ASM Pr, 2007.
108
109 ปฏิบัติการบทที่ 7 แบคทีเรียก่อโรคชนิดแท่งแกรมลบ และแบคทีเรียปลีกย่อยชนิดอื่น ๆ (Pathogenic Gram-Negative Bacilli and Miscellaneous Bacteria) อ.ดร.อานันต์ นิธิชานน ผศ.ดร.สุปราณี พันธุ์ธนวิบูลย์ การศึกษาแบคทีเรียก่อโรค บทนำ: การศึกษาแบคทีเรียก่อโรค จะแบ่งออกเป็นกลุ่ม ๆ ตามลักษณะรูปร่าง การติดสีและคุณสมบัติเฉพาะ ดังนี้ 1. Gram negative cocci เช่น Neisseria gonorrhoeae เป็นต้น 2. Gram positive cocci เช่น Staphylococcus aureus, -Streptococcus group A, Pneumococci เป็นต้น 3. Gram negative bacilli แบ่งเป็น - Gram negative enteric bacilli ได้แก่ Family Enterobacteriaceaeเช่น Escherichiacoli, Salmonella, Shigella,ฯลฯ Family Vibrionaceae เช่น Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus เป็นต้น - Nonfermentative Gram negative bacilli เช่น Pseudomonas aeruginosa เป็นต้น 4. Gram positive bacilli เช่น Corynebacterium diphtheriae, Bacillus เป็นต้น 5. Acid fast bacilli เช่น Mycobacterium tuberculosis 6. Anaerobic bacteria เช่น Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium, Peptococcus, Veillonella เป็นต้น การทดลองในบทนี้จะกล่าวถึงกลุ่มแบคทีเรียรูปแท่งในข้อ 3-6 (ส่วนข้อ 1-2 มีรายละเอียดในบทปฎิบัติ การ 6) โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาได้รู้จัก ลักษณะรูปร่าง การติดสีคุณสมบัติที่สำคัญของแบคทีเรียที่ทำ ให้เกิดโรค (Pathogenic bacteria) แต่ละชนิดและสามารถทดสอบเชื้อทางห้องปฎิบัติการได้โดยเฉพาะเชื้อใน กลุ่มแกรมลบรูปแท่ง (Gram negative enteric bacilli) ใน Family Enterobacteriaceae โดยส่วนใหญ่เป็นการสาธิตลักษณะต่าง ๆ ของแบคทีเรียแต่ละกลุ่ม ให้นักศึกษาทุกคนศึกษาจากสิ่งที่ตั้ง สาธิตไว้
110 การศึกษาเชื้อแบคทีเรียแกรมลบรูปแท่ง หลักการ ในบทปฏิบัติการนี้นักศึกษาทำการทดลองแยกชนิดเชื้อใน Family Enterobacteriaceae และ นักศึกษาศึกษาด้วยตนเองและฝึกวิเคราะห์จากข้อมูลต่างๆ ที่ตั้งแสดงในชุดสาธิต ตอบคำถามใน กระดาษคำตอบ เนื้อหาบทนี้ประกอบด้วย 1. การศึกษาแบคทีเรียก่อโรคกลุ่ม Gram negative bacilli ซึ่งประกอบด้วย 1.1 เชื้อแบคทีเรียใน Family Enterobacteriaceae 1.2 เชื้อแบคทีเรียใน Family Vibrionaceae 1.3 เชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม Non-fermentative Gram negative bacilli 2. การศึกษาแบคทีเรียก่อโรคกลุ่มอื่นๆ ซึ่งประกอบด้วย 2.1 เชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม Gram positive bacilli 2.2 เชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม Anaerobic bacteria 2.3 เชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม Acid fast bacteria แบคทีเรียแกรมลบ รูปแท่ง ที่มีความสำคัญในทางการแพทย์ได้แก่ Famiy Enterobacteriaceae เป็น facultative anaerobic bacteria ประกอบด้วยเชื้อส่วนใหญ่ที่ เป็นเชื้อประจำถิ่น เช่น พบได้ตามลำไส้ของคนและสัตว์ ทางเดินหายใจส่วนต้น ส่วนปลายของท่อทางเดิน ปัสสาวะ ผิวหนัง และบริเวณอื่น ๆ ซึ่งในบางสภาวะเชื้อเหล่านี้เป็นสาเหตุก่อโรคได้เรียกว่า “opportunistic pathogen” แต่มีเชื้อบางชนิดก็มีคุณสมบัติเป็น pathogen ได้ โดยมักพบก่อโรคในระบบทางเดินอาหาร เช่น E. coli (บางสายพันธุ์), Salmonella, Shigella และ Yersinia เป็นต้น Family Vibrionaceae เป็น facultative anaerobic bacteria ประกอบด้วยเชื้อที่มีคุณสมบัติก่อโรค ในทางเดินอาหารที่สำคัญ เช่น V. chlorerae และ V. parahemolyticus และมีบางชนิดพบอยู่ในแหล่งน้ำ เป็นสาเหตุของโรคติดเชื้อตามบาดแผลตามผิวหนังได้ Family Pseudomonaceae เป็น obligate aerobic bacteria ประกอบด้วยเชื้อส่วนใหญ่ที่พบใน ธรรมชาติทั่วไป และยังพบเป็นเชื้อประจำถิ่นในส่วนต่าง ๆ ในคน เชื้อในกลุ่มนี้ที่มีความสำคัญทางการแพทย์คือ P. aeruginosa เป็นสาเหตุสำคัญของโรคติดเชื้อในโรงพยาบาล (nosocomial infection หรือ hospitalacquired infection, HAI) และบางชนิดจัดเป็น pathogen ที่สำคัญเช่น Burkholderia pseudomallei เป็น สาเหตุของโรค melioidosis มักพบเกิดโรคนี้ในผู้ที่มีภูมิต้านทานต่ำ
111 แนวทางการศึกษา ประกอบด้วยหลายวิธีร่วมกัน 1. ดูลักษณะโคโลนี (colony morphology) บนอาหารเลี้ยงเชื้อ เช่น ลักษณะโคโลนีของ Gram negative bacilli ใน family Enterobacteriaceae บน blood agar จะ มีลักษณะเยิ้มมัน สำหรับเชื้อ Proteus จะให้ลักษณะเฉพาะคือแผ่กระจายรอบๆ โคโลนี เรียกลักษณะนี้ว่า swarming เนื่องจากเชื้อสามารถเคลื่อนที่ได้อย่างรวดเร็ว การแยกเชื้อ Gram negative bacilli ทั่วไป นิยมใช้ MacConkey agar ซึ่งเป็น differential media เนื่องจากในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้มีสารที่สามารถไปยับยั้งการเจริญของเชื้อพวก Gram positive bacteria ได้ เช่น bile salts ลักษณะโคโลนีบนอาหาร MacConkey agar สามารถแบ่งเชื้อเป็น 2 กลุ่ม คือ 1. Lactose fermenter หรือ LF (สีชมพู) ลักษณะดังกล่าวมักจะเป็นเชื้อในกลุ่ม coliform bacteria ได้แก่ E. coli, Klebsiella และ Enterobacter เป็นต้น เนื่องจากใน MacConkey agar มีน้ำตาล Lactose และมี neutral red เป็น indicator และเนื่องจากเชื้อในกลุ่มนี้ สามารถ ferment lactose ได้กรด จึงทำให้เปลี่ยนสี indicator เป็นสีชมพู 2. Non lactose fermenter หรือ NLF (สีใสเหมือน media) เป็นกลุ่มเชื้อที่ไม่ ferment lactose (ไม่สร้างกรด) เช่น เชื้อใน Family Enterobacteriaceae (เช่น Proteus, Salmonella แ ล ะ Shigella), Family Vibrionaceae (V. cholera แ ล ะ V. parahemolyticus) และใน Family Pseudomonaceae (P. aeruginosa) เป็นต้น 2. การย้อมสีแกรม (Gram’s stain) จะพบเซลล์ติดสีแดง รูปแท่ง เรียงตัวอยู่กระจาย 3. การทดสอบการผลิต oxidase enzyme ซึ่งสามารถทดสอบได้โดยอาศัยหลักที่ว่า oxidase จะทำปฏิกิริยา กับ 1% tetramethyl-phenylenediamine dihydrochloride (Oxidase reagent) ได้สีม่วงเข้ม วิธีทำ ใช้ sterile loop แตะเชื้อที่สงสัย นำไปขีดลงบน Oxidase paper (กระดาษกรองที่ชุบ Oxidase reagent) ถ้าเชื้อแบคทีเรียนั้นสามารถสร้าง oxidase ได้ จะมีสีม่วงเข้มเกิดขึ้นที่ รอยขีดนั้น ภายใน 10 วินาที
112 4. ทดสอบทางชีวเคมี (Biochemical test) อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดสอบชนิดของเชื้อ (Genus และ Species) ในแต่ละFamily จะแตกต่างกันเช่น − Family Enterobacteriaceae สารที่ใช้ทดสอบได้แก่ Triple Sugar Iron agar (TSI), Motile Indole media (MI), Lysine media (L), Urea-Phenylalanine Agar (UP), Citrate (C) − Family Vibrionaceae สารที่ใช้ทดสอบได้แก่ การทดสอบในอาหารเลี้ยงเชื้อ TSI, MI และ L ทดสอบการใช้น้ำตาลในอาหาร PR Manitol, PR inositol และ PR sucrose ทดสอบการเจริญใน 0%NaCl, 6%NaCl, 10%NaCl − Family Pseudomonaceae สารที่ใช้ทดสอบได้แก่ การเจริญบนอาหาร Motile-Nitrate reduction test (MN test) และ Citrate ทดสอบการใช้น้ำตาลใน OF Glucose, OF Maltose, 10% Lactose broth การทดสอบ Gelatin liquefaction test วิธีการทดสอบ การใส่เชื้อในอาหาร การอ่านและแปลผล ให้ดูใน Appendix
113 การทดลองที่ 7.1 การศึกษาเชื้อแบคทีเรียก่อโรคชนิดแท่งแกรมลบ วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาได้รู้จัก ลักษณะรูปร่าง การติดสี คุณสมบัติที่สำคัญของแบคทีเรียรูปแท่งที่ก่อโรคใน Family Enterobacteriaceae แต่ละชนิด อุปกรณ์ที่ใช้: − เอกสาร และรูปภาพ พร้อมคำอธิบายการทดสอบและแปลผลปฎิกิริยาทางชีวเคมีสำหรับทดสอบเชื้อ แ ก ร ม ล บ ร ู ป แ ท ่ ง ใ น Family Enterobacteriaceae, Family Vibrionaceae แ ล ะ Family Pseudomonaceae − ชุดอาหารเลี้ยงเชื้อพร้อมผลการทดลอง ที่ใช้ในการวินิจฉัยเชื้อ E. coli, P. aeruginosa และ V. parahemolyticus (โดยเตรียม 2 ชุด ตั้งแสดงริมหน้าต่าง)
114 การทดลองที่ 7.2 ศึกษาวิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียแกรมลบรูปแท่ง วัตถุประสงค์ 1. สามารถบอกคุณลักษณะของเชื้อในกลุ่มแกรมลบรูปแท่งได้โดยการทำ Gram’s staining 2. สามารถบอกลักษณะโคโลนีของเชื้อแกรมลบรูปแท่งบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่างๆได้ 3. สามารถจำแนกชนิดของเชื้อโดยการทดสอบทางชีวเคมีตามขั้นตอนการจำแนกเชื้อในห้องปฎิบัติการ อุปกรณ์ที่ใช้ นักศึกษาแต่ละกลุ่ม จะได้รับอุปกรณ์ดังนี้ 1. Plate ที่มีเชื้อให้โคโลนีสีชมพูบน MacConkey agar. 1 plate 2. Plate ที่มีเชื้อให้โคโลนีสีขาวเหลืองบน MacConkey agar 1 plate 3. ชุดทดสอบทางชีวเคมี (เช่น TSI, MI, UP, C และ L หรือเบิกเพิ่ม) 2 ชุด หมายเหตุ: oxidase test จะถูกวางไว้ที่โต๊ะกลาง วิธีทำ 1. ศึกษาลักษณะโคโลนี และสีโคโลนี ของเชื้อบน MacConkey agar แล้วพิจารณากลุ่มของเชื้อ 2. ย้อมสี Gram’stain จาก singleโคโลนีที่อยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อ... 3. ทดสอบ oxidase test จาก singleโคโลนีที่อยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อแล้วพิจารณาชุดทดสอบ 4. ทดสอบทางชีวเคมีโดยเลือกใส่ในชุดสารอาหารสำหรับการทดสอบให้ถูกต้อง การทดสอบสำหรับเชื้อแบคทีเรียแกรมลบรูปแท่งให้ศึกษาวิธีการใส่เชื้อและทดสอบเชื้อในท้าย บทเรียน (Appendix) การอ่านผลการทดลอง ให้บันทึกผลการทดลอง โดยบอกชื่อเชื้อแต่ละชนิด พร้อมทั้งอธิบายลักษณะโคโลนีบนชนิดของอาหาร เลี้ยงเชื้อ รูปร่างและการติดสีแกรม และผลการทดสอบทางชีวเคมี เแบคทีเรีย ลักษณะ โคโลนี การติด สีแกรม Oxidase test ผลการทดสอบทางชีวเคมี (ให้เลือกชนิดของสารที่ทดสอบให้ เหมาะสม สำหรับแต่ละ Family ของเชื้อ) กลุ่มที่............. TSI MI L UP C ชื่อเชื้อ โคโลนีสีชมพู โคโลนีสีขาว
115 การทดลองที่ 7.3 ศึกษาเป็นกลุ่ม ตามจุดที่ได้ตั้งแสดงไว้ (10 จุด) วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษาได้เรียนรู้เกี่ยวกับลักษณะรูปร่างของเชื้อแบคทีเรียชนิดอื่นๆ ที่มีโอกาสในการตรวจ จำแนกในห้องปฎิบัติการทั่วไปได้ยาก เช่น − Gram positive bacilli เชื้อที่ทำให้เกิดโรคในกลุ่มนี้ที่ควรรู้จัก คือ Corynebacterium diphtheriae เป็นสาเหตุของโรคคอตีบ − Anaerobic bacteria เป็นเชื้อแบคทีเรียที่ไม่ต้องการออกซิเจนในการเจริญเติบโตและถ้าสัมผัสกับ ออกซิเจนในอากาศนานเกินไปมันจะตาย ดังนั้น เชื้อ Anaerobic bacteria จึงไม่สามารถเจริญได้ใน บรรยากาศธรรมดาทั่วไป ซึ่งมีออกซิเจนประมาณ 18% − Acid fast bacteria ได้แก่เชื้อในสกุล Mycobacterium ซึ่งในกลุ่มนี้เชื้อที่ทำให้เกิดโรคในคนและ พบเสมอในประเทศไทย ได้แก่ M. tuberculosis ทำให้เกิดวัณโรค, M. leprae ทำให้เกิดโรคเรื้อน วิธีทำ − ศึกษารุปร่าง การติดสี ลักษณะโคโลนี บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่างๆของเชื้อ − ตอบคำถามในแต่ละจุด
116 สรุปท้ายการทดลอง ตัวอย่างเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ 2. ย้อมสีแกรม Gram negative bacilli 3. Oxidase test Positive (+ve) 4.1 TSI test Motile Indole test Lysine test Urea-Phenylalanine test Citrate tests Suspected: Psuedomonas, Burkholderia + OF glucose + OF maltose + Nitrate reduction + 10% lactose Suspected: Vibrio, Aeromonas + PR Mannitol + PR Inositol + Sucrose + 0, 6, 10% NaCl Negative (-ve) 4.2 TSI test Motile Indole test Lysine test Urea-Phenylalanine test Citrate tests 1. สังเกตุลักษณะ รูปร่าง และ สี ตารางที่ 7.3 ตารางที่ 7.4 ตารางที่ 7.5
117 เอกสารอ้างอิง 1. วีระพงศ์ ลุลิตานนท์. การเก็บสิ่งส่งตรวจทางจุลชีววิทยา (Collection of specimens for microbiolgic examination) ใน: กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์, คู่มือปฎิบัติการจุลชีววิทยา (Microbiology Laboratory Manual) สำหรับนักศึกษาพยาบาลศาสตร์ นักศึกษาสาธารณสุขศาสตร์ นักศึกษาทันต แพทยศาสตร์ นักศึกษาเภสัชศาสตร์, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, ปี พ.ศ. 2540 หน้า 7-1 ถึง 7-82. 2. อัญชลี ตัตตะวะศาสตร์ จริยา ชมวารินทร์ นเรศ วโรภาสตระกูล และวีระพงศ์ ลุลิตานนท์. แบคทีเรีย ก่อโรค (Pathogenic bacteria) ใน: กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์, คู่มือปฎิบัติการจุลชีววิทยา (Microbiology Laboratory Manual) สำหรับนักศึกษาพยาบาลศาสตร์ นักศึกษาสาธารณสุขศาสตร์ นักศึกษาทันตแพทยศาสตร์ นักศึกษาเภสัชศาสตร์, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, ปี พ.ศ. 2540 หน้า 8-1 ถึง 8-19
118 บทที่ 7 (Appendix) การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Gram negative enteric bacilli แบคทีเรียกลุ่มนี้ส่วนใหญ่เป็นเชื้อประจำถิ่น (normal flora) อยู่ในลำไส้ของคนและสัตว์ แต่สามารถทำ ให้เกิดโรคติดเชื้อในระบบต่าง ๆ ได้ เช่น ระบบทางเดินปัสสาวะ หรือ ระบบทางเดินหายใจ เป็นต้น นอกจากนี้ยังมีชนิดที่เป็นเชื้อก่อโรคของระบบทางเดินอาหาร ได้แก่ Salmonella หรือ Shigella เป็นต้น การ วินิจฉัยแยกชนิดเชื้อก่อโรคในกลุ่มดังกล่าวมีขั้นตอน ดังนี้ 1. Gram’s stain พบเป็น Gram negative bacilli เรียงตัวกระจัดกระจายไม่แน่นอนอาจอยู่เป็นกลุ่ม หรือเดี่ยว ๆ ลักษณะ Gram’s stain ของแบคทีเรียกลุ่มนี้คล้ายกันทุกชนิด ดังนั้นจึงไม่สามารถใช้แยกความ แตกต่างของเชื้อในกลุ่มนี้ออกจากกันได้ 2. Colonial morphology − ลักษณะโคโลนีของ Gram negative bacilli ใน Enterobacteriaceae บน blood agar จะมี ลักษณะเยิ้ม มัน − ลักษณะโคโลนีบน MacConkey agar ซึ่งเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีน้ำตาล lactose และมี neutral red เป็น indicator เชื้อแบคทีเรียที่เจริญบนอาหารชนิดนี้ได้จะถูกแบ่งเชื้อเป็น 2 กลุ่ม คือ o Non lactose fermenter (NLF) เป็นเชื้อที่ไม่ ferment น้ำตาล lactose โคโลนีจะใส ไม่มีสี เช่น Salmonella, Shigella, Proteus เป็นต้น o Lactose fermenter (LF) พวกนี้โคโลนีจะมีสีชมพู เช่น E. coli หรือ Klebsiella ซึ่งเชื้อ พวกนี้สามารถ ferment น้ำตาล lactose ได้และให้กรดจึงเปลี่ยนสี indicator เป็นสี ชมพู ในการแยกเชื้อ Gram negative bacilli ทั่วไป นิยมใช้ MacConkay agar เนื่องจากใน อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้มีสารที่สามารถไปยับยั้งการเจริญของเชื้อพวก Gram positive bacteria ได้ เช่น bile salts − ลักษณะโคโลนีของเชื้อ Salmonella และ Shigella บน Salmonella-shigella agar (SS agar) จะมีลักษณะกลม และใส SS agar เป็น selective media สำหรับเชื้อ Salmonella และ Shigella โดยจะยับยั้งการเจริญของ Gram negative bacilli อื่น ๆ
119 3. การทดสอบการผลิต oxidase enzyme ซึ่งสามารถทดสอบได้โดยอาศัยหลักที่ว่า oxidase จะ ทำปฏิกิริยากับ 1% tetramethyl-phenylenediamine dihydrochloride (Oxidase reagent) ได้สีม่วงเข้ม วิธีทำ: ใช้ sterile loop แตะเชื้อที่สงสัย นำไปขีดลงบน Oxidase paper (กระดาษกรองที่ชุบ Oxidase reagent) ถ้าเชื้อแบคทีเรียนั้นสามารถสร้าง oxidase ได้ จะมีสีม่วงเข้มเกิดขึ้นที่รอยขีดนั้น ภายใน 10 วินาที 4. Biochemical test อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดสอบทางชีวเคมีเพื่อแยกชนิด Gram negative bacilli พวก Enterobacteriaceae ออกจากกัน ได้แก่Triple Sugar Iron agar (TSI), Motile Indole media (MI), Lysine media (L), Urea-Phenylalanine Agar (UP), Citrate (C) วิธีทดสอบ biochemical test ตารางที่ 7.1 แสดงวิธีการ inoculate แบคทีเรียในอาหารที่ใช้ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีต่าง ๆ Biochemical media สีปกติของ media Method of inoculation 1. Triple Sugar Iron Agar (TSI) แสดแดง ใช้ neddle ที่แตะเชื้อแล้ว stab ลงไปจนถึงก้น tube แล้ว streak บนผิว slant 2. Motile-Indole (MI) ใส Stab ให้เป็นเส้นตรงจนถึงถึงก้น tube 3. Lysine (L) ม่วง Stab ให้เป็นเส้นตรงจนถึงถึงก้น tube 4. Urea-Phenylalanine Agar (UP) เหลืองอ่อน Streak บนผิว slant 5. Citrate (C) เขียว Streak บนผิว slant จากนั้นนำหลอดอาหารที่มีเชื้อแล้วไป incubate ที่ 37 O C นาน 18-24 ชั่วโมง แล้วนำมาอ่านผลจาก ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นตาม ตารางที่ 7.2 ซึ่ง Gram negative bacilli กลุ่ม Enterobacteriaceae จะให้ผลต่างกัน ตามชนิดดังแสดงไว้ใน ตารางที่ 7.3
120 ตารางที่ 7.2 แสดงปฏิกิริยาและผลจากการเลี้ยงเชื้อใน Biochemical media Media or Tests Reactions Results Positive Negative 1. TSI ดูคำอธิบายนอกตาราง ดูคำอธิบายนอกตาราง ดูคำอธิบายนอกตาราง 2. MI (*) - Motile - Indole เชื้อที่มี flagella สามารถเคลื่อนที่กระจายออกจากรอย stab และเจริญไปทั่วบริเวณทำให้ media ขุ่น เชื้อที่มีเอ็มไซม์ tryptophanase สามารถแยกส่วนของ indole ออกจากโมเลกุลของ tryptophane ได้เมื่อ indole ทำปฏิกิริยา กับ Kovac's Reagent ที่เติมลงไปจะได้สารชมพูแดง เห็นรอยแพร่กระจาย หรือทำให้ media ขุ่น (cloudy) เติม kovac's reagent แล้วได้สีชมพูแดงที่ผิว บน media เชื้อเจริญเฉพาะรอย stab เติม Kovac's reagent แล้วสีไม่เปลี่ยน 3. Lysine ในช่วง 10-12 ชม.แรก เชื้อจะ ferment น้ำตาล glucose ใน media และได้ acidic product ออกมาทำให้ media เปลี่ยน จากสีม่วงเป็นสีเหลือง ถ้าเชื้อนั้นสามารถสร้างเอนไซม์ lysine decarboxylase ได้ ก็จะถูกกระตุ้นให้สร้างขึ้นตอนนี้เพราะว่ามี สภาวะที่พอเหมาะ คือ เป็นกรดพอสมควรและค่อนข้างจะเป็น anaerobic, เอนไซม์ดังกล่าวจะเร่งปฏิกิริยา decarboxylation ของ lysine ทำให้ได้สาร amine จึงทำให้เกิดภาวะเป็นด่างขึ้น และเปลี่ยนสีของ media จากเหลืองกลับเป็นม่วงอย่างเดิม, ถ้า เชื้อไม่สามารถสร้างเอนไซม์ได้ก็จะยังเห็น media เป็นสีเหลือง ม่วง (ดูเฉพาะส่วน butt เท่านั้น) เหลือง (ดูเฉพาะส่วน butt เท่านั้น) 4. UP (**) - Urea - Phenylalanine เชื้อสร้างเอนไซม์ urease ซึ่งจะไปย่อยสาร urea ได้ 2 โมเลกุล ของ NH3 ทำให้ media สภาวะเป็นด่างซึ่งจะเปลี่ยนสีของ indicator คือ phenol red ให้เป็นสีชมพู เชื้อที่มีเอนไซม์ phenylalanine deaminase จะ deaminate สาร phenylalanine ได้เป็น phenylpyruvic acid ซึ่งเมื่อทำ ปฏิกิริยากับ FeCl3 ที่เติมลงไปจะได้สาร complex สีเขียวแก่- น้ำเงิน ชมพูเข้ม เมื่อหยด FeCl3 แล้ว2- 3 หยด จะทำให้ผิว slant เปลี่ยนเป็นสี เขียวแกมน้ำเงิน ไม่เปลี่ยน เมื่อหยด FeCl3 แล้ว 2-3 หยด จะไม่มีการ เปลี่ยนสีที่ผิว slant 5. Citrate เชื้อที่สามารถใช้ citrate เป็นแหล่งอาหารประเภทคาร์บอน (carbon source) ก็สามารถที่จะใช้ ammonium salt เป็น แหล่งอาหารประเภทไนโตรเจน (Nitrogen source) ได้เมื่อ ammonium salt ถูก break down จะได้ NH3 ซึ่งจะทำให้ media มีสภาวะเป็นด่างทำให้ indicator (Bromthymol blue) เปลี่ยนจากสีเขียวเป็นสีน้ำเงิน น้ำเงิน เขียว * การอ่าน MI ให้อ่าน motile ตามวิธีการข้างต้นก่อน แล้วบันทึกผลไว้ จากนั้น จึงหยด Kovac's Reagent (p-Dimethylaminobenzaldehyde) ลงไป 3-5 หยด เพื่อทดสอบ indole โดยค่อย ๆ เขย่า tube ไปมา ** การอ่าน UP ให้อ่าน Urease test ก่อน แล้วจึงทดสอบ Phenylalanine deaminase โดยการหยด 10% FeCl3 ลงไป 3-5 หยด ค่อย ๆ หมุน tube ไปมา อ่านผลภายใน 1-2 นาที
121 การอ่านผลเนื่องจากปฏิกิริยาของเชื้อบน TSI TSI จัดเป็น differential media ซึ่งสามารถจ ำ แน กแ บ คท ีเ รียโ ดย เ ฉ พา ะ พว ก family Enterobacteriaceae ออกเป็นกลุ่ม ๆ โดยอาศัยดูความสามารถของแบคทีเรียในการใช้สารต่างๆ ใน media เช่น การ ferment น้ำตาลใน media, การมีก๊าซต่างๆ หรือ ก๊าซ H2S เกิดขึ้น ใน media จะประกอบด้วยน้ำตาล 3 ชนิดคือ glucose 0.1%, lactose 1%, sucrose 1% ซึ่งเป็น แหล่งอาหารประเภทคาร์บอน นอกจากนี้ยังมีสารพวก peptones ซึ่งเป็นแหล่งอาหารประเภทไนโตรเจน ลักษณะของ media จะใส่ไว้ใน tube โดยทำให้มีผิวหน้าเอียงเรียก slant ส่วนก้น tube เรียก butt ปฏิกิริยาชีวเคมีที่เกี่ยวข้อง พวกแบคทีเรียใน family Enterobacteriaceae ทุกชนิดสามารถ ferment glucose ได้ ส่วนน้ำตาลตัวอื่น บางชนิดเท่านั้นที่สามารถนำมาใช้ได้ ซึ่งขึ้นอยู่กับระบบเอนไซม์ที่มีในแต่ละชนิด ในส่วนของ slant จะมีสภาวะเป็นแบบ aerobic น้ำตาล glucose จะถูกแบคทีเรียย่อย สลายอย่างสมบูรณ์ได้ CO2 + H2O + พลังงานในท้ายที่สุด ส่วน lactose และ sucrose ซึ่ง เป็น disaccharide จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์ที่เฉพาะเจาะจงได้เป็น monosaccharide ก่อน ดังนี้ lactose -------> glucose + galactose, sucrose -------> glucose + fructose จากนั้น monosaccharide ต่าง ๆ นี้จึงจะถูกย่อยสลายอย่างสมบูรณ์ได้ CO2 + H2O + พลังงาน ในท้ายที่สุดเช่นกัน ในส่วนของ butt จะมีสภาวะเป็นแบบ anaerobic น้ำตาล glucose และน้ำตาลตัวอื่น ๆ จะถูกย่อยสลายแบบไม่สมบูรณ์ ได้ end products เป็นกรดอินทรีย์ต่าง ๆ, และ/หรือก๊าซ ต่าง ๆ กับพลังงานออกมา ซึ่ง end products จากแบคทีเรียต่างชนิดกันก็จะต่างกันออกไป นอกจากการใช้น้ำตาลแล้ว แบคทีเรียยังสามารถใช้ peptone ใน TSI เป็นแหล่งอาหารประเภท ไนโตรเจนสำหรับการเจริญเติบโตได้อีกด้วย โดยสามารถเกิดได้ทั้งภาวะ aerobic และ anaerobic เมื่อ peptone ถูกย่อยสลายจะได้ NH3 ซึ่งจะทำให้ media มีสภาวะเป็นด่าง
122 ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบน TSI สามารถแบ่งได้เป็น 3 กลุ่ม ดังนี้ 1. Fermentation of Glucose Only แบคทีเรียที่สามารถ ferment glucose ได้อย่างเดียวจะให้ปฏิกิริยาบน TSI เป็นแบบ alkaline slant (Red) และ acid butt (Yellow) ซึ่งเขียนแทนว่า K/A (Alkaline slant/Acid butt) เนื่องจากภายใน 12 ชั่วโมงแรก จะมีการใช้ glucose ทั้งในส่วนของ slant และ butt ซึ่งจะให้กรด ออกมาและจะเปลี่ยนสีของ indicator คือ phenol red เป็น สีเหลืองทั้ง tube แต่อัตราในการใช้ glucose ในส่วนของ slant จะเร็วกว่าใน butt เพราะมี aerobic ดังนั้น glucose จะถูกใช้หมดก่อน เมื่อแบคทีเรียใช้ lactose หรือ sucrose ไม่ได้ ก็จะใช้ peptone แทนและได้สาร NH3 ออกมา ทำให้สภาวะเป็นด่าง ดังนั้น ในเวลาต่อมาในส่วนของ slant จึงมีสีแดง (หลัง incubate ครบ 18-24 ชั่วโมง) เพราะ indicator คือ phenol red ในสภาวะเป็นด่างจะมีสีแดง ในส่วนของ butt การ ferment น้ำตาลจะได้ stable acid products ซึ่งสะสมไว้มากทำให้ส่วนนี้ยังคงเป็นสีเหลือง 2. Fermentation of Glucose and Lactose or Sucrose แบคทีเรียสามารถ ferment น้ำตาลได้ทั้ง glucose และ lactose หรือ sucrose และให้ปฏิกิริยาบน TSI เป็นแบบ acid slant (Yellow) และ acid butt ซึ่งเขียนแทนว่า A/A (Acid slant/Acid butt) เนื่องจากน้ำตาล lactose มีปริมาณมากกว่า glucose ถึง 10 เท่า เมื่อเชื้อใช้น้ำตาล glucose หมดก็ จะหันมาใช้น้ำตาล lactose จึงทำให้ media มีสภาวะเป็นกรดตลอดเวลาในช่วง 18-24 ชั่วโมง ดังนั้น media จึงมีสีเหลืองตลอดเวลา แต่ถ้าอ่านผลหลัง 48 ชั่วโมงหรือนานกว่านั้น ปฏิกิริยาจะกลายเป็น K/A เพราะ เมื่อ lactose ถูกใช้หมด เชื้อก็จะหันมาใช้ peptone ทำให้ส่วนของ slant เป็นด่าง จึงมีสีแดง จะเห็นว่าเชื้อแบคทีเรียที่เป็น lactose fermenter จะให้ปฏิกิริยาบน TSI เป็นแบบ A/A เสมอ ในทาง กลับกัน ถ้าปฏิกิริยาบน TSI เป็นแบบ A/A เราจะบอกว่าเชื้อนั้นเป็นพวก lactose fermenter เสมอไปไม่ได้ เพราะเชื้อที่เป็นพวก non lactose fermenter แต่ถ้าสามารถใช้น้ำตาล sucrose (มีปริมาณ 1%) ก็จะให้ TSI เป็นแบบ A/A เช่นกัน เช่นเชื้อ V. cholerae etc. 3. No Fermentation of Carbohydrates เชื้อแบคทีเรียบางพวกโดยเฉพาะพวก Gram negative nonenteric bacilli จะไม่สามารถ ferment glucose, lactose หรือ sucrose ได้ แต่จะสามารถใช้ peptone ใน media ได้ ซึ่งการใช้อาจจะเป็นแบบ aerobic หรือ anaerobic ก็ได้ ถ้าใช้ peptone แบบ aerobic อย่างเดียว จะทำให้เฉพาะส่วนของ slant เป็นด่าง แต่ในส่วนของ butt จะไม่มีการเปลี่ยนแปลง ดังนั้นปฏิกิริยาบน TSI จะเป็นแบบ alkaline slant และ Neutral (No change) ในส่วนของ butt เขียนแทนได้เป็น K/N (Alkaline slant/Neutral)
123 ถ้าใช้ peptone ทั้ง aerobic และ anaerobic ก็จะทำให้ทั้ง tube มี สภาวะเป็นด่างปฏิกิริยาบน TSI จะเป็นแบบ alkaline slant/Alkaline butt (K/K) นอกจากจะดูความสามารถของเชื้อในการใช้น้ำตาลต่าง ๆ กันแล้ว ยังสามารถจะดูว่าการใช้น้ำ-ตาลต่าง ๆ นั้น จะให้ก๊าซเป็น end product หรือไม่ ก๊าซที่ได้จากการใช้น้ำตาลคือ CO2 + H2 พวกที่สามารถให้ก๊าซ (aerogenic) จะสังเกตได้จากการที่เกิดรอยแตกแยก หรือในกรณีที่เชื้อให้ก๊าซมาก ๆ อาจจะเห็น media ถูก ดันลอยขึ้นจาก butt ได้ ส่วนพวกที่ไม่ให้ก๊าซ (anaerogenic) ก็จะไม่พบลักษณะดังกล่าวเกิดขึ้น นอกจากนี้ใน media ยังมีสารที่ช่วยบอกว่า เชื้อสามารถให้ก๊าซ H2S ได้หรือไม่ ซึ่งสารดังกล่าวได้แก่ Sodium thiosulfate (Na2S2O3 ) และ Ferrous sulfate (FeSO4 ) โดยปฏิกิริยาที่เกิดจะเป็นดังนี้ acid environment Bacteria + Na2S2O3 H2S FeS (insoluble black precipitate) H2S + FeSO4 เนื่องจากก๊าซ H2S ที่เกิดขึ้นจะไม่มีสี จึงต้องมีสาร FeSO4 ใน media ด้วย เพื่อจะเป็น indicator ที่จะ บอกว่าเชื้อนั้นสามารถให้ก๊าซ H2S ออกมา โดยดูในส่วนของ butt จะเห็นเป็นตะกอนสีดำ ในกรณีที่เชื้อให้ก๊าซ H2S มาก ๆ ตะกอนที่เกิดขึ้นก็จะมีมากจนอาจจะทำให้ดูสีเหลืองของ acid butt ไม่ชัดเจน โดยทั่วไปแล้ว เชื้อที่ สามารถ produce H2S ได้ ก็มักจะให้ก๊าซ CO2 + H2 จากการ ferment น้ำตาลด้วย สัญญลักษณ์ที่เขียนแทน reaction ของ TSI A/A = Acid slant, Acid butt, no gas, no H2S A/AG = Acid slant, Acid butt, with gas, no H2S A/AG+ = Acid slant, Acid butt, with gas, H2S produced K/A = Alkaline slant, acid butt, no gas, no H2S K/AG = Alkaline slant, acid butt, with gas, no H2S K/AG+ = Alkaline slant, acid butt, with gas, H2S produced K/N = Alkaline slant, Neutral butt (No change)
124 ตารางที่7.3แสดงคุณสมบัติทางชีวเคมีของเชื้อ Gram negative bacteria ใน family Enterobacteriaceae TSI MI L UP Citrate Organisms Motile Indole Lysine Urease Phenyl A/A or A/AG +(-) + - + + - - + +(-) -(+) + - - -(+w ) + w + w (-) - - - - - + + + Escherichia coli Enterobacter spp. Klebsiella spp. Citrobacter diversus A/A+ or A/AG+ + + + + + - - - - - + - + + - + w (-) + + - - -(+) +(-) + + Proteus vulgaris Proteus mirabilis Arizona hinshawii Citrobacter freundil K/A or K/AG + + + + +(-) - + + + + + + + -(+) - - - - - - +(-) - + - + + - + w (-) - - -(+w ) - + + + - - - - - + - + + - - +(-) -(+) Proteus rettgerii Proteus morganii Providencia spp. Citrobacter diversus Escherichia coli Shigella spp. Enterobacter spp. Salmonella paratyphi K/A+ or K/AG+ + + + + + + - + - - - - + - + + + - + w (-) - + + - - - -(+) +(-) - + + Proteus vulgaris Proteus mirabilis Edwardsiella tarda Citrobacter freundii Salmonella-Arizona * +(-) = ส่วนใหญ่ให้ผล +Ve ส่วนน้อยให้ผล -Ve , -(+) = ส่วนใหญ่ให้ผล -Ve ส่วนน้อยให้ผล +Ve , +w = Weakly positive * = แยกโดยการทำ Malonate Test : Salmonella (-) ; Arizona (+)
125 การศึกษาคุณสมบัติของเชื้อใน Family Vibrionaceae เชื้อก่อโรคใน family นี้ที่ควรรู้จักได้แก่ Vibio cholerae ทำให้เกิดอหิวาตกโรค, Vibio parahaemolyticus ทำให้เกิด Gastroenteritis 1. Gram’s stain เชื้อ Vibrio เป็น gram negative รูปร่างเป็นแท่งโค้งเล็กน้อย 2. Colonial morphology อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้แยกเชื้อ Vibrio ได้แก่ TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar) ลักษณะโคโลนีของเชื้อ V. cholerae บน media นี้ จะมีสีเหลืองเรียบ ตรงกลางทึบ ขอบใส เส้นผ่าศูนย์กลาง 2-3 มม. ส่วนลักษณะโคโลนีของเชื้อ V. parahaemolyticus จะมีสีเขียวขนาดจะ ใหญ่กว่าของ V. cholerae TCBS เป็น selective media ของเชื้อ Vibrio โดย media นี้จะมีความเข้มข้นของ sodium ion สูง, มี oxgall และมี pH ที่เป็นด่าง (pH 8.8) ทำให้สามารถยับยั้งการเจริญของพวก Gram negative enteric bacteria อื่น แต่เชื้อ Vibrio เจริญได้ดี นอกจากนี้ใน media ยังมีน้ำตาล sucrose และมี bromthymol blue เป็น pH indicator ด้วย 3. Biochemical test การทดสอบทางชีวเคมีของเชื้อในกลุ่ม Vibrio ได้แก่ - Oxidase test เชื้อ Vibrio จะให้ oxidase test positive - การเจริญบนอาหาร TSI, MI, L - การใช้น้ำตาลในอาหาร PR Mannitol, PR Inositol, PR sucrose - การเจริญใน 0% NaCl, 6% NaCl, 10% NaCl ตารางที่ 7.4 แสดงผลการทดสอบทางชีวเคมีของเชื้อ Vibrio Test Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Aeromonas hydrophila Plesiomonas shigelloides Oxidase TSI Motile Indole Lysine PR Mannitol PR Inositol Sucrose 0% NaCl 6% NaCl 10% NaCl + A/A + + + + - + + - - + K/A + + + + - - - + - + A/A, K/A + + - + - + + - - + K/A + + + - + - + - -
126 การศึกษาคุณสมบัติเชื้อ Pseudomonas aeruginosa และ Burkholderia pseudomallei 1. Gram’s stain ทั้ง 2 ชนิดเป็น Gram negative bacilli แต่ B. pseudomallei จะติดสีแบบ bipolar staining ลักษณะคล้ายเข็มกลัดซ่อนปลาย (safety pin) 2. Colonial morphology ลักษณะโคโลนีของเชื้อ P. aeruginosa บน Blood agar จะมีลักษณะ เยิ้ม สีเขียว เนื่องจากสามารถสร้างรงควัตถุ (pigment) ชื่อ pyocyanin ได้ ส่วน B. pseudomallei ลักษณะ โคโลนีบน Blood agar หรือ Chocolate blood agar เมื่อเพาะเลี้ยงครบ 24 ชั่วโมง จะมีรูปร่างกลมนูนขนาด เล็ก สีเทานวล แต่เมื่ออายุมากกว่า 24 ชั่วโมง โคโลนี จะหยาบ ผิวหน้าเหี่ยวย่น สีน้ำตาลขุ่น มีกลิ่นคล้ายดิน หลังฝนตกใหม่ 3. Biochemical test การทดสอบทางชีวเคมีที่ใช้ในการแยกเชื้อ Pseudomonas, Burkholderia และ non fermentative gram negative bacilli ตัวอื่น ได้แก่ Oxidase test, การเจริญบนอาหาร MotileNitrate reduction test (MN test), OF Glucose, OF Maltose, 10% Lactose broth, Citrate และการ ทดสอบ Gelatin liquefaction test 3.1 MN test วัสดุอุปกรณ์ 1. Trypticase-nitrate medium 2. 0.8% sulfanilic acid solution (solution A) 3. 0.6% dimethyl-alpha-naphthylamine solution (solution B) 4. Zinc dust วิธีทำ 1. inoculate (Stab) เชื้อที่ต้องการทดสอบลงใน trypticase nitrate medium 2. นำไป incubate ที่ 37C นาน 48 ชั่วโมง 3. ครบเวลา อ่าผลการเคลื่อนที่ (motile) ของเชื้อก่อน แล้วนำมาเติม Solution A 2-3 หยด และเติม solution B 2-3 หยด เขย่าให้เข้ากัน สังเกตการเปลี่ยนแปลงสี การอ่านผล 1. สังเกตการเคลื่อนที่ (motile) โดยดูการกระจายของเชื้อออกจากรอย stab ถ้ามีเชื้อกระจาย ออกไปได้ทั่ว ๆ หลอด แสดงว่าเชื้อเคลื่อนที่ได้ (ควรจะสังเกตการเคลื่อนที่ก่อนที่จะทดสอบ nitrate reduction) 2. การใช้ไนเตรต หลังจากเติม solutoin A และ B
127 − ถ้ามีสีแดงเกิดขึ้น แสดงว่ามี nitrite อยู่ นั่นคือ nitrate ในอาหารถูกแบคทีเรีย reduce เปลี่ยนเป็น nitrite (positive nitrate reduction) − ไม่มีสี ยังสรุปไม่ได้ว่า nitrate ไม่ถูก reduce เพราะ nitrate อาจถูก reduce เป็น nitrite และ nitrite ถูก reduce ต่อ ไปเป็นแอมโมเนีย (ammonia) หรือก๊าซ ไนโตรเจน (nitrogen gas) ดังนั้น ในกรณีนี้ต้องทดสอบต่อ โดยเติมผงสังกะสีลงไป เล็กน้อย แล้วเขย่าให้ผสมกัน ถ้ามีสีแดงเกิดขึ้นแสดงว่ามี nitrate เหลืออยู่ในอาหารและ nitrate ถูก reduce ไปเป็น nitrite โดยผงสังกะสี เพราะฉะนั้นอ่านผลเป็น negative nitrate reduction. ถ้าไม่มีสีแสดงว่าไม่มี nitrate เหลืออยู่ในอาหาร อ่านผลเป็น positive nitrate reduction 3.2 การเจริญในอาหาร oxidative-fermentative (OF) Glucose และ OF Maltose test วิธีทำ 1. Inoculate เชื้อที่ต้องการทดสอบโดย stab ลงไปใน OF Maltose และ OF Glucose medium 2. นำไป incubate ที่ 37C 24 ชั่วโมง แล้วนำมาอ่านผล โดยดูการเปลี่ยนสีของอาหารและการ เกิดก๊าซ การอ่านผล − ถ้าแบคทีเรียสามารถใช้น้ำตาลโดยการ oxidation สีของอาหารเลี้ยงเชื้อจะเปลี่ยนจากสีเขียว เป็นเหลือง เฉพาะในส่วนบนของหลอด อ่านผลเป็น positive glucose oxidation หรือ positive maltose oxidation และ negative fermentation − ถ้าแบคทีเรียสามารถใช้น้ำตาลโดยการ fermentation สีของอาหารเลี้ยงเชื้อจะเปลี่ยนจากสี เขียวเป็นเหลืองทั่วทั้งหลอด อ่านผลเป็น positive fermentation − ถ้าแบคทีเรียไม่สามารถใช้น้ำตาลได้เลย สีของอาหารเลี้ยงเชื้อจะไม่มีการเปลี่ยนแปลงเกิด negative oxidation และ negative fermentation 3.3 การเจริญในอาหาร 10% Lactose broth เชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม non-fermentative Gram negative bacilli บางตัวสามารถเจริญได้ใน อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีน้ำตาลในความเข้มข้นสูง ๆ ได้ เช่น Burkholderia pseudomallei (Pseudomonas pseudomallei) จึงใช้การทดสอบนี้ในการแยกชนิดของเชื้อดังกล่าว วิธีทำและการดู ผล ทำเหมือนการทดสอบ OF test
128 ตารางที่ 7.5 Diagram of identification of non-fermentative bacteria การทดลอง ชนิดของเชื้อ Oxidase test Motility Nitrate Reduction Oxidation of Glucose Oxidation of Maltose 10% Lactose Citrate Pseudomonas aeruginosa + + + + - - + Burkholderia pseudomallei + + + + + + + B. mallei + - - + + -/+ - B. ceptacia +/+W + - + + + +/- P. fluorescens + + - + +/- +/- + Acinetobacter anitatum - - - + - + + A. iwoffi - - - - - - -/+ Alaldigenes faecalis + + - - - - + +/- = most culture positive, some strain negative, -/+ = most culture negative, some strain positive, +W = weakly positive
129 การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Gram positive bacilli เชื้อที่ทำให้เกิดโรคในกลุ่มนี้ที่ควรรู้จัก คือ Corynebacterium diphtheriae สาเหตุของโรคคอตีบ 1. Gram’s stain เชื้อ Corynebacterium เป็น Gram positive bacilli ติดสีไม่สม่ำเสมอและมี ลักษณะเฉพาะคือ รูปร่างเป็นกระบอง (club shape) โดยปลายข้างหนึ่งจะพองโตกว่าปลายอีกข้างหนึ่ง ลักษณะเหมือนกระบอง การเรียงตัวของเชื้อ C. diphtheriae มักจะเรียงตัวทำมุมกัน ทำให้คล้ายตัวอักษรจีน (chinese letter) 2. Colonial morphology ลักษณะโคโลนีของเชื้อ C. diphtheriae บน blood agar ไม่มี ลักษณะเฉพาะ ส่วนลักษณะโคโลนีบน cystine tellurite blood agar จะมีสีเทาดำ เนื่องจากเชื้อ C. diphtheriae สามารถ reduce สาร tellurite ในอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ ได้สาร tellurium ซึ่งมีสีดำ ทำให้โคโลนี ของเชื้อมีสีเทาดำ 3. Biochemical test การแยกเชื้อ C. diphtheriae จากเชื้ออื่น ๆ ในสกุลเดียวกัน อาศัยคุณสมบัติ การ ferment น้ำตาลที่แตกต่างกัน ดังแสดงในตารางที่ 5 ตารางที่ 7.6 แสดงคุณสมบัติในการ ferment น้ำตาลของเชื้อ Corynebacterium เชื้อ Carbohydrates Glucose Maltose Sucrose C. diphtheriae + + - C. xerosis + - + C. hofmanii - - -
130 การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Anaerobic bacteria Anaerobic bacteria เป็นเชื้อแบคทีเรียที่ไม่ต้องการออกซิเจนในการเจริญเติบโตและถ้าสัมผัสกับ ออกซิเจนในอากาศนานเกินไปมันจะตาย ดังนั้น เชื้อ Anaerobic bacteria จึงไม่สามารถเจริญได้ใน บรรยากาศธรรมดาทั่วไป ซึ่งมีออกซิเจนประมาณ 18% ปกติ anaerobic bacteria เป็น normal flora อยู่ในระบบต่าง ๆ ของร่างกาย เช่น ทางเดินอาหาร, ช่องปาก, ช่องคลอด และบนผิวหนัง เป็นต้น โดยอยู่ในปริมาณที่มากกว่า aerobic bacteria เช่น ในลำไส้ใหญ่ มี anaerobe มากกว่า aerobe ประมาณ 1,000 เท่า ในช่องปากและช่องคลอดมี anaerobe มากกว่า aerobe ประมาณ 10 เท่า เชื้อเหล่านี้ในภาวะปกติจะไม่ทำให้เกิดโรค แต่ถ้าร่างกายมีภูมิต้านทานโรคต่ำลง หรือมีสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการเจริญของมัน เชื้อ anaerobe ก็จะกลับเป็นเชื้อทำให้เกิดโรคขึ้นได้ เช่น มี การทะลุของลำไส้ใหญ่เชื้อในลำไส้ซึ่งมี anaerobe อยู่เป็นจำนวนมากเข้าไปอยู่ในช่องท้อง ทำให้เกิดเยื่อบุช่อง ท้องอักเสบ (peritonitis) เป็นต้น 1. Gram’s stain เป็นการตรวจทางห้องปฏิบัติการ ที่ง่ายที่สุดที่ช่วยในการวินิจฉัย anaerobic infection อย่างคร่าว ๆ โดยดูรูปร่างและการติดสีดังนี้ Gram negative bacilli เช่น Bacteroides fragilis เป็นท่อนหัวท้ายมน และพบรูปร่าง pleomorphic Fusobacterium เป็นท่อนเรียว หัวท้ายแหลม Gram positive bacilli เช่น Clostridium tetani มี terminal spore Clostridium perfringens ไม่ค่อยพบ spore Gram positive cocci เช่น Peptostreptococcus และ Peptococcus 2. Cultivation and Colonial morphology เชื้อ anaerobic bacteria ต้องเพาะเลี้ยงในสภาวะที่ไม่มีออกซิเจนเช่น ใน Anaerobic jar (Gas pak system, Anaerobic incubator เป็นต้น) หลักการของ Anaerobic jar (Gas pak system) ใช้สารเคมีในการทำให้เกิดสภาวะ anaerobiosis โดยใน Gas pak จะมีสารเคมี ได้แก่ NaBH4 , CoCl2 , C3H5O (COOH)3 และ NaHCO3 เมื่อเติมน้ำลงไป 10 มล. จะเกิดปฏิกิริยา ดังนี้ NaBH4 + 2H20 -------> NaBO2 + 4 H2 C3H5O (COOH)3 + 3NaHCO3 -------> 3CO2 + 3H2O + C3H5O (COONa)3 ส่วน O2 ที่ยังมีเหลืออยู่บ้างจะรวมกับ H2 โดยมี palladium เป็นตัวเร่ง
131 ลักษณะโคโลนี - โคโลนีของ Bacteroides melaninogenicus บน blood agar จะมีโคโลนีสีดำ - โคโลนีของ Clostridium perfringens บน blood agar เห็น double zone of hemolysis - โคโลนีของ Clostridium บน egg yolk medium ซึ่งใช้ทดสอบความสามารถในการสร้างเอนไซม์ lipase และ lecithinase การศึกษาเชื้อในกลุ่ม Acid fast bacteria แบคทีเรียที่จัดเป็น Acid fast bacteria ได้แก่ เชื้อใน สกุล Mycobacterium ซึ่งในกลุ่มนี้เชื้อที่ทำให้ เกิดโรคในคน และพบเสมอในประเทศไทย ได้แก่ M. tuberculosis ทำให้เกิดวัณโรค, M. leprae ทำให้เกิด โรคเรื้อน 1. Acid fast stain เชื้อ Mycobacterium นี้ ผนังเซลล์มีไขมันอยู่เป็นจำนวนมาก ย้อม Gram stain จะติด ยาก ต้องใช้วิธี Acid fast stain (ดูบทที่ 3) ซึ่งโดยวิธีนี้จะเห็นเชื้อ Mycobacterium ติดสีแดง ส่วน Non-acid fast bacteria จะติดสีน้ำเงิน ให้นักศึกษาดูลักษณะรูปร่างของเชื้อ M. tuberculosis, M. leprae จากกล้องจุลทรรศน์ที่ตั้งไว้ 2. Colonial morphology เชื้อ M. tuberculosis สามารถเพาะเลี้ยงได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อพิเศษชื่อ Lowenstein Jensen medium โดยใช้เวลาในการเจริญนานประมาณ 2-3 อาทิตย์ ลักษณะโคโลนีที่ได้มีลักษณะเป็นก้อนสีเหลืองผิว ขรุขระ สำหรับ M. leprae ไม่สามารถเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมในห้องปฏิบัติการ เนื่องจากเป็น Obligate intracellular parasite การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการสามารถทำได้โดยการย้อมสี acid fast จากสิ่งส่งตรวจที่ได้จากการขูด ผิวหนังในชั้น corium และจาก mucous membrane (โดยเฉพาะ nasal septum) ของคนไข้ที่เป็นโรคเรื้อน ชนิด lepromatous type โดยจะเห็นเชื้ออัดกันอยู่ใน lepra cell ลักษณะเป็นมัดขนานกัน (parallel bundle) ซึ่งเรียก globi หรือ cigar-like bundle ส่วนในโรคเรื้อนชนิด tuberculoid type มักจะหาเชื้อได้ ยากหรือไม่พบเชื้อการวินิจฉัยอาศัยอาการทางคลินิกเป็นสำคัญ
132
133 ปฏิบัติการบทที่ 8 การจำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรีย (Bacterial identification) ผศ.ดร.สกาวรัตน์ กันทะวงศ์ ผศ.นพ.สุวิน ว่องวัจนะ บทนำ: ในบทปฏิบัติการต่าง ๆ ที่ผ่านมา นักศึกษาได้ศึกษาลักษณะของเชื้อแบคทีเรีย รวมทั้งผลของสิ่งแวดล้อม ต่าง ๆ ที่มีต่อแบคทีเรีย โดยอาศัย เชื้อบริสุทธิ์ (pure culture) แต่ในสภาพความเป็นจริงแบคทีเรียส่วนใหญ่ ในร่างกาย มักจะอยู่ร่วมกับแบคทีเรียอื่น ๆ อีกหลายชนิด เช่น แบคทีเรียที่อาศัยอยู่ในลำคอของผู้ป่วยที่เจ็บคอ จะพบทั้งแบคทีเรียที่เป็นเชื้อประจำถิ่น (normal flora) และเชื้อแบคทีเรียสาเหตุเช่น beta-streptococci group A ดังนั้นถ้าต้องการจะทราบถึงสาเหตุของการติดเชื้อ หรือว่ามีแบคทีเรียอะไรบ้างในสิ่งส่งตรวจ ตลอดจนการหาตัวยาที่เหมาะสมในการรักษาผู้ป่วย ต้องทำการแยกเชื้อ (isolation) เพื่อให้ได้เชื้อบริสุทธิ์ (pure culture) และทำการจำแนกชนิดของเชื้อแบคทีเรียจากสิ่งส่งตรวจ โดยสิ่งส่งตรวจที่ได้จากผู้ป่วยเพื่อส่ง เพาะเชื้อจำเป็นต้องมีการเก็บ และนำส่งอย่างถูกต้อง เพื่อการแปลผลของเชื้อที่เจริญเติบโตขึ้นมาได้อย่าง แม่นยำ (รายละเอียดตามเนื้อหาได้เรียนในบทปฏิบัติการก่อนหน้านี้) โดยหลักการเบื้องต้นก็คือ ต้องคำนึงถึง ตำแหน่งหรือ บริเวณที่จะเก็บให้ถูกต้องสอดคล้องกับโรคมากที่สุด เช่น ในกรณีที่สงสัยปอดบวมจากเชื้อ แบคทีเรีย สิ่งส่งตรวจที่ควรเก็บคือเสมหะ ปริมาณของสิ่งส่งตรวจจะต้องมากเพียงพอ ภาชนะที่ใช้จะต้อง ปราศจากเชื้อ และพยายามอย่าให้มีเชื้อจากที่อื่นปะปนเข้ามา จากนั้นจึงดำเนินการตามขั้นตอนต่าง ๆ ที่ใช้กัน ทั่วไปในงานจุลชีววิทยาทางการแพทย์ ได้สรุปไว้ในภาพที่ 1 ภาพที่ 8.1 การตรวจวิเคราะห์สิ่งส่งตรวจตามวิธีทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์
134 โดยในขั้นตอนต่างๆ จะมีรายละเอียด ดังนี้ การตรวจสิ่งส่งตรวจโดยตรง (Direct examination) เมื่อได้รับสิ่งส่งตรวจมา ควรตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อเป็นแนวทางอย่างคร่าว ๆ วิธีที่ใช้กัน โดยทั่วไป ได้แก่ การย้อมสีแกรม หรือกรณีที่สงสัยว่าเป็นเชื้อวัณโรค เช่น เสมหะ จะต้องย้อมด้วยวิธี Acidfast stain ซึ่งถ้าพบเชื้อสาเหตุก็จะเป็นการช่วยย่นระยะเวลาวินิจฉัย บางครั้งอาจจะต้องดูการเคลื่อนที่ของ เชื้อ เช่น พวก Leptospira เป็นต้น การแยกเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (Isolation on differential/selective media) ในการเพาะแยกเชื้อจากสิ่งส่งตรวจนั้น จำเป็นต้องใช้อาหารเลี้ยงเชื้อให้เหมาะสมเพื่อที่เชื้อสาเหตุจะได้ เจริญเติบโตได้ดี หรือในกรณีที่สิ่งส่งตรวจเก็บจากตำแหน่งที่มีเชื้อประจำถิ่น (normal flora) อาหารเลี้ยงเชื้อ ที่เหมาะสมจะช่วยลดปริมาณเชื้อเหล่านี้ลงได้ นอกจากนี้อาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิดอาจจะช่วยแยกเชื้อ แบคทีเรียเฉพาะแกรมลบให้เจริญได้ดี ส่วนพวกแกรมบวกจะถูกยับยั้งไม่ให้เจริญ ทั้งนี้การเลือกใช้อาหารเลี้ยง เชื้อที่เป็น selective media ก็ดีหรือ differential media ก็ดี ขึ้นกับสิ่งส่งตรวจว่าเป็นอะไร และสงสัยเชื้อ อะไร ยกตัวอย่างเช่น ผู้ป่วยอุจจาระร่วง (เชื้อสาเหตุที่ทำให้อุจจาระร่วงมีหลายชนิด เช่น Vibrio, Salmonella, Shigella) เมื่อเก็บอุจจาระจากผู้ป่วยได้แล้วนำไป streak ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เป็น Primary isolation ได้แก่ - Blood agar: อาหารชนิดนี้เป็น enrichment media เชื้อแบคทีเรียเกือบทุกชนิดเจริญได้ดี และใช้ดู การ hemolysis (, , ) ของแบคทีเรียบางชนิดได้ด้วย - Mac Conkey agar: จะยอมให้เชื้อที่เป็น Gram negative bacilli เจริญได้ดีและสามารถจำแนก (differential) เชื้อแบคทีเรียเป็น 2 กลุ่ม คือ กลุ่ม lactose fermenter ซึ่งโคโลนีจะมีสีชมพู และnonlactose fermenter ซึ่งโคโลนีจะเป็นสีใส ๆ จากตัวอย่างอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่าง ๆ ข้างต้น จะทำให้เราสามารถแยกเชื้อเป็นโคโลนีเดี่ยวๆ (isolate colony) ได้ซึ่งในความเป็นจริงเราจะไม่ทราบว่าเชื้อที่แยกได้นั้นคือเชื้อแบคทีเรียชนิดใด จึงจำเป็นต้องมีการ จำแนกชนิดของเชื้อแบคทีเรีย (Bacterial identification)โดยการศึกษาถึงคุณสมบัติและความแตกต่างของ แบคทีเรียแต่ละชนิดโดยอาศัย ด้วยวิธีการดังต่อไปนี้ 1. ลักษณะรูปร่างและโครงสร้าง (morphology and structure) ดูจากรูปร่าง ขนาด การเรียงตัว การมีแคปซูล (capsule) การมีสปอร์ของแบคทีเรียแต่ละชนิด รวมทั้ง การเคลื่อนไหวของแบคทีเรียที่มี flagella และที่สำคัญคือ การติดสีแกรม ซึ่งสามารถแบ่งแบคทีเรียออกเป็น 2 กลุ่มใหญ่ คือ แกรมบวก (Gram-positive bacteria) และ แกรมลบ (Gram-negative bacteria) 2. ลักษณะการเจริญของแบคทีเรีย (culture characteristics) ดูคุณสมบัติและลักษณะของแบคทีเรียที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ทั้งที่เป็นอาหารเหลว (broth) และ อาหารแข็ง (agar) เช่น ดูความขุ่น ความหนาแน่นของเชื้อบริเวณผิวบนของอาหารเหลว หรือบริเวณก้น หลอด ในกรณีที่เป็นอาหารแข็ง ดูลักษณะ ขนาด สีของโคโลนี ตลอดจนดูการเกิดhemolysis รอบ ๆ โคโลนี
135 (colonial morphology) ของแบคทีเรียบน blood agar รวมถึงการสร้าง pigment และกลิ่นของเชื้อบาง ชนิดด้วย 3. คุณสมบัติทางชีวเคมี (biochemical characteristics) คุณสมบัติทางชีวเคมีที่เกี่ยวกับเมแทบอลิซึม (metabolism) ของแบคทีเรียได้แก่การ ferment น้ำตาล ต่าง ๆ กัน ดูการสร้างเอนไซม์บางชนิดเช่น urease, tryptophanase, citratase เป็นต้น ในบางครั้งการ จำแนกชนิด (identify) เชื้อแบคทีเรียอาจจะดูถึงรูปแบบ (pattern) ของความไวหรือดื้อต่อยาปฏิชีวนะ เช่น bacitracin, optochin ด้วย 4. คุณสมบัติทางวิทยาภูมิคุ้มกัน (immunological characteristics) เชื้อแบคทีเรียบางชนิดจะมีการจัดแบ่งย่อยต่อจากระดับชนิด (species) ลงไปอีกเป็น serotype หรือ serogroup โดยอาศัยปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนของตัวแบคทีเรียกับแอนติบอดี้ ซึ่งร่างกายสร้างขึ้นต่อต้าน แบคทีเรียนั้น ปฏิกิริยาเหล่านี้ อาจจะแสดงในรูปของการเกาะกลุ่ม (agglutination) การตกตะกอน (precipitation) neutralization หรือ complement fixation เป็นต้น เมื่อสามารถบ่งชี้ชนิดของเชื้อแบคทีเรียก่อโรคได้แล้ว ก็จะดำเนินการตรวจสอบความไวของเชื้อ แบคทีเรียชนิดนั้นๆ ต่อยาปฏิชีวนะ เพื่อประโยชน์ในการเลือกใช้ยาปฏิชีวนะในการรักษาผู้ป่วยต่อไป การทดลองที่ 8 การจัดจำแนกชนิดของแบคทีเรีย (Bacterial identification) วัตถุประสงค์ของปฏิบัติการนี้เพื่อให้นักศึกษา 1. คุ้นเคยกับขั้นตอนในการจำแนกชนิด (identify) เชื้อแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางการแพทย์ 2. สามารถเลือกใช้ปฏิกิริยาทางชีวเคมีในการจำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรีย ในการปฏิบัติการครั้งนี้ จะจำลองการตรวจวิเคราะห์สิ่งส่งตรวจที่มีเชื้อแบคทีเรียที่ไม่ทราบชนิด (unknown) นักศึกษาแต่ละกลุ่มจะได้รับเชื้อ unknown จำนวนกลุ่มละ 2 ตัวอย่าง เป็นเชื้อ Gram-positive cocci ในกลุ่ม pyogenic cocci และ Gram-negative bacilli ใน family Enterobacteriaceae โดยจะมี หมายเลขรหัสติดอยู่ ให้นักศึกษาจดหมายเลขของ unknown แต่ละตัวอย่าง ลงในใบ report การจำแนกชนิด ที่จะแจกให้แต่ละกลุ่ม ให้นักศึกษานำเชื้อ unknown ที่ได้นำมาย้อม Gram’s stain เพื่อแยกชนิดของแกรม จากนั้นให้ทำการ จำแนกชนิดของเชื้อตามกระบวนการที่ได้เรียนมาในบทปฏิบัติการที่ 6 เชื้อ Gram-positive cocci ในกลุ่ม pyogenic cocci และ บทปฏิบัติการที่ 7 เชื้อ Gram-negative bacilli ใน family Enterobacteriaceae แล้ว บันทึกผลลงในแบบฟอร์ม (ถ้ามีการทดสอบที่ต้องบ่มเชื้อข้ามคืน ให้มาเก็บผลในวันถัดไป)
136 การทดลองที่ 8.1 การจำแนกชนิด Gram positive cocci (ดูขั้นตอนตามภาพที่ 2 และดูรายละเอียดเชื้อในกลุ่ม Gram-positive cocci เพิ่มเติมในบทที่ 6) อุปกรณ์ที่ใช้ นักศึกษาแต่ละกลุ่มจะได้รับเชื้อแบคทีเรีย unknown บน BA 1 ตัวอย่าง วิธีทำ วันที่ 1 ย้อมสีแกรมเชื้อ unknown จาก blood agar (BA) ถ้าพบว่าเป็น Gram positive cocci ให้ทำ การจำแนกชนิดขั้นต่อไป คือ การทดสอบ catalase 1. ถ้าทดสอบ catalase ได้ผลลบ: ให้พิจารณาดูลักษณะการ hemolysis ของเชื้อบน BA ว่าเป็นแบบ ใด แล้วจึงพิจารณาเลือกการทดสอบที่เหมาะสมต่อตามภาพที่ 2 ถ้าโคโลนีมีลักษณะ beta hemolysis จะต้องทำการทดสอบ Bacitracin sensitivity test ถ้าโคโลนีมี ลักษณะ alpha-hemolytic จะต้องทำการทดสอบ Optochin sensitivity test และถ้าโคโลนีมีลักษณะ gamma hemolysis จะต้องทำการทดสอบความสามารถของเชื้อในการเจริญใน 6.5% NaCl broth อนึ่ง ในการที่จะทำการทดสอบต่าง ๆ ต่อ นักศึกษาจะต้องไปเบิก media ที่ใช้ในการทดสอบจาก เจ้าหน้าที่ที่เคาเตอร์เบิก media การเบิกขอให้นักศึกษาเบิก media เท่าที่จำเป็นสำหรับใช้ในการจำแนกชนิด เท่านั้น ถ้านักศึกษาเบิก media เกินความจำเป็นจะถูกหักคะแนน 2. ถ้าทดสอบ catalase ได้ผลบวก: วิธีการทดสอบของเชื้อในกลุ่มนี้จะต่างจากกลุ่ม catalase ลบ โดย ที่นักศึกษาไม่จำเป็นต้องดูการ hemolysis บน BA เพราะไม่ได้มีส่วนช่วยในการจำแนกชนิดเลย การทดสอบที่ จำเป็นสำหรับเชื้อในกลุ่มนี้คือการทำ coagulase test การเจริญในอาหาร PR glucose และ PR mannitol วันที่ 2 ดูผลการทดสอบที่ทำไว้ในวันที่ 1 วิธีการอ่านผลให้ดูรายละเอียดในบทที่ 6 และ 7 และภาพที่ 2 ช่วย เพื่อสรุปผลว่า เชื้อแบคทีเรียที่ได้เป็นเชื้อชนิด (species) ใด แล้วบันทึกผลการทดสอบและชื่อชนิดของ เชื้อที่ได้ ลงในแบบฟอร์มการจำแนกชนิดให้สมบูรณ์
137 ภาพที่ 8.2 ขั้นตอนในการ identify เชื้อในกลุ่ม Gram-positive cocci การทดลองที่ 8.2 การจำแนกชนิด Gram-negative bacilli ใน family Enterobacteriaceae (ดูรายละเอียดเชื้อในกลุ่ม Gram-negative bacilli เพิ่มเติมในบทที่ 7) อุปกรณ์ที่ใช้ นักศึกษาแต่ละกลุ่มจะได้รับเชื้อแบคทีเรีย unknown บน BA 1 ตัวอย่าง วิธีทำ วันที่ 1 ย้อมสีแกรมเชื้อ unknown จาก Mac Conkey agar ถ้าพบว่าเป็น Gram-negative bacilli ให้ทำการจำแนกชนิดขั้นต่อไป คือ การทดสอบ oxidase ถ้าให้ผล oxidase เป็นลบ ให้ทำการจำแนกชนิดเชื้อกลุ่ม Enterobacteriaceae โดยใช้ sterile needle แตะเชื้อจากโคโลนีบน Mac Conkey agar แล้วเพาะเลี้ยงลงใน media ต่าง ๆ (พยายามใช้เชื้อจาก colony เดียว) ตามรายละเอียดในตารางที่ 1 จากนั้นนำไป incubate ที่ 37C นาน 18-24 ชั่วโมง แล้วนำมาอ่านผล จากนั้น นำผลที่ได้ไปเทียบ ผลในตารางที่ 2 เพื่อดูว่าเชื้อ unknown นั้นเป็นเชื้อในชนิดใด บันทึกผลการทดสอบและชนิดของเชื้อที่ได้ใน แบบฟอร์มการจำแนกชนิดให้สมบูรณ์
138 ตารางที่ 8.1 Media ที่ใช้จำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรียกลุ่ม Enterobacteriaceae และวิธีการ inoculation Media สีของ media Method of Inoculation 1. Triple Sugar Iron Agar (TSI) แสดแดง ใช้ needle ที่แตะเชื้อแล้วstab ลงไปจนถึงก้น tube แล้ว streak บนผิว slant 2. Motile-Indole (MI) ใส stab ให้เป็นเส้นตรงจนถึงก้น tube 3. Lysine (L) ม่วง stab ให้เป็นเส้นตรงจนถึงก้น tube 4. Urea-Phenylalanine Agar (UP) เหลืองอ่อน streak บนผิว slant 5. Citrate (C) เขียว streak บนผิว slant ตารางที่ 8.2 ตารางการจำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรีย Gram negative bacilli ใน family Enterobacteriaceae TSI MI L UP Citrate Organisms Motile Indole Lysine Urease Phenyl A/A or A/AG +(-) + - + + - - + +(-) -(+) + - - -(+w ) + w + w (-) - - - - - + + + Escherichia coli Enterobacter spp. Klebsiella spp. Citrobacter diversus A/A+ or A/AG+ + + + + + - - - - - + - + + - + w (-) + + - - -(+) +(-) + + Proteus vulgaris Proteus mirabilis Arizona hinshawii Citrobacter freundil K/A or K/AG + + + + +(-) - + + + + + + + -(+) - - - - - - +(-) - + - + + - + w (-) - - -(+w ) - + + + - - - - - + - + + - - +(-) -(+) Proteus rettgerii Proteus morganii Providencia spp. Citrobacter diversus Escherichia coli Shigella spp. Enterobacter spp. Salmonella paratyphi K/A+ or K/AG+ + + + + + + - + - - - - + - + + + - + w (-) - + + - - - -(+) +(-) - + + Proteus vulgaris Proteus mirabilis Edwardsiella tarda Citrobacter freundii Salmonella-Arizona * +(-) = ส่วนใหญ่ให้ผล +Ve ส่วนน้อยให้ผล -Ve -(+) = ส่วนใหญ่ให้ผล -Ve ส่วนน้อยให้ผล +Ve + w = Weakly positive * = แยกโดยการทำ Malonate Test : Salmonella (-) ; Arizona (+)
139 ปฏิบัติการบทที่ 9 รูปร่างและโครงสร้างของเชื้อรา (Morphology and structure of fungi) ผศ.ดร.กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์ อ.ดร.วิสิฐ์ศักดิ์ โภคสวัสดิ์ บทนำ: การศึกษาเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคในมนุษย์และสัตว์ (pathogenic fungi) โดยทั่วไป มีหลักการคล้ายกับ การศึกษาเชื้อแบคทีเรีย ซึ่งจะต้องใช้ sterile techniques เพื่อความปลอดภัยของผู้ทำปฏิบัติการเองและ ผู้ร่วมงานที่ใช้ห้องปฏิบัติการเดียวกัน อุปกรณ์ต่าง ๆ จะต้องผ่านการทำให้ปราศจากเชื้อ (sterilization) เพื่อ ป้องกัน การปนเปื้อนทั้งจากแบคทีเรียและ saprophytic fungi อื่น ๆ สิ่งที่แตกต่างจากการศึกษาแบคทีเรีย คือ needle ที่ใช้ในการถ่ายเชื้อ โดยเฉพาะเชื้อราสาย จะมีขนาด ใหญ่กว่า needle สำหรับถ่ายเชื้อแบคทีเรีย ขนาดที่พอเหมาะคือลวด nichrome No.22 ซึ่งนำมาหักปลายให้ งอเป็นตะขอ เพื่อความสะดวกในการเขี่ย mycelium หรือ hyphae ของเชื้อรา ส่วนกรณีที่เป็น yeast อาจใช้ loop หรือ needle ขนาดเดียวกันกับที่ใช้ในการศึกษาแบคทีเรียก็ได้ ในส่วนการเพาะเลี้ยงเชื้อราเพื่อดูลักษณะโคโลนี นิยมใช้อาหารแข็ง ทั้งใน petri dish และใน test tube โดยการเลี้ยงใน test tube จะสะดวกและป้องกันการปนเปื้อนจากเชื้ออื่น ๆ ได้ดีกว่า petri dish แต่มีข้อเสีย ที่ว่าผิวหน้าของ slant ใน test tube จะน้อยกว่าใน petri dish ทำให้เห็นลักษณะของ colony ได้ไม่ชัดเจน แต่อาจแก้ไขได้โดยการใช้หลอดทดลองขนาดใหญ่ (25 150 mm) หรือใช้ขวดแบนแบบ hemoculture ซึ่ง จะทำให้ได้ผิวหน้าของ slant มากพอ และยังทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อไม่แห้งเร็วจนเกินไป ช่วยให้เชื้อราบางชนิด ที่เจริญช้า สามารถเจริญได้เต็มที่ นอกจากนี้ยังพบว่า test tube ที่ใช้สำลีอุดปากหลอดจะดีกว่าที่ใช้ screw cap เพราะผิวหน้าของอาหารจะแห้ง เหมาะแก่การสร้าง mycelium และ pigment ทุกครั้งที่ลงมือทำปฏิบัติการเกี่ยวกับเชื้อรา จะต้องระลึกถึงการป้องกันการติดเชื้อทั้งจากตนเองและ ผู้ร่วมงานเสมอ เพราะสปอร์ของเชื้อรานั้นมีขนาดเล็กและเบามาก สามารถปลิวหรือหลุดจากโคโลนีไปปะปน อยู่ในอากาศได้ ดังนั้นการถ่ายเชื้อราก่อโรคควรทำในที่ ๆ มิดชิด และสามารถควบคุมการใหลเวียนของอากาศ ได้ เช่น chamber หรือ larminar airflow และนอกจากนี้ก่อนที่จะทำการศึกษา infected material หรือ fungal culture ให้ใช้กระดาษซับหรือผ้าชุบน้ำยาฆ่าเชื้อ (disinfectant) 2% savlon ปูรองพื้นโต๊ะ โดยใช้ ตะเกียงบุนเสนวางทับไว้ ขณะถ่ายเชื้อราจากสิ่งส่งตรวจหรือจาก pure culture ให้ทำเหนือบริเวณที่ปูผ้าไว้ ทั้งนี้เพื่อกำจัดสปอร์ที่อาจตกลงไปบนพื้น การเผา loop, needle ที่มีเศษชิ้นส่วนของสิ่งส่งตรวจเปียก ๆ ไม่ควรเผาตรงบริเวณกลางเปลวไฟ เพราะอาจเกิดปฏิกิริยาเผาไหม้รุนแรง ทำให้เศษของสิ่งส่งตรวจที่เปียกนั้นกระเด็นกลายเป็นละอองเล็ก ๆ ขึ้น แต่ควรเผาบริเวณขอบ ๆ ของเปลวไฟ จน loop หรือ needle ค่อย ๆ ร้อนแดงอย่างช้า ๆ
140 Slide หลังจากใช้เสร็จแล้ว ควรนำแช่ใน 2% Lysol เพื่อฆ่าเชื้อ หลอดหรือจานเลี้ยงเชื้อที่ใช้แล้ว ให้ นำมารวมกันในถาดหรือถังที่มีฝาปิดมิดชิด เพื่อรวบรวมไปทำลายเชื้อด้วย autoclave ต่อไป หลังจาก การศึกษาเสร็จสิ้นแต่ละครั้ง ควรเช็ดบริเวณพื้นโต๊ะที่ทำการทดลองอีกครั้งด้วย disinfectant ถ้าบังเอิญเชื้อไป ถูกมือ ให้รีบล้างมือทันทีแล้วถูด้วยสบู่หลาย ๆ ครั้ง ถ้าเชื้อกระเด็นเข้าตาให้แจ้งผู้ควบคุมทราบ การเตรียม slide เพื่อศึกษาเชื้อรา การศึกษาเกี่ยวกับเชื้อรามักอาศัยรูปร่าง โครงสร้างเป็นสำคัญ ฉะนั้นการเตรียม slide จึงมุ่งในแง่ การรักษาสภาพตัวเชื้อราให้เหมือนกับสภาพในธรรมชาติให้มากที่สุด โดยวิธีการเตรียม slide เพื่อตรวจดูด้วย กล้องจุลทรรศน์ มีด้วยกัน 3 วิธี คือ tease mount technique, scotch tape technique, และ slide culture technique ซึ่งแต่ละวิธีก็มีข้อดีและข้อเสียแตกต่างกันไป ดังจะได้กล่าวต่อไป 1. Tease mount technique วิธีนี้นิยมใช้ศึกษาเชื้อราสาย ทำได้โดยการใช้เข็มเขี่ยเชื้อรา ซึ่งมี ลักษณะเป็น needle หักปลายให้เป็นตะขอในแนวตั้งฉาก นำมาเขี่ยสายราบนผิวของโคโลนีจำนวนเล็กน้อย แล้ววางลงบน slide ที่หยด Lactophenol cotton blue (LPCB) ไว้แล้ว ทั้งนี้อาจใช้ needle อีกอันมาช่วย กระจายเชื้อ จากนั้นใช้ cover glass ปิดทับก็พร้อมที่จะตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ LPCB ไม่เพียงแต่จะช่วย ย้อมสีของเชื้อราให้ติดสีน้ำเงินเท่านั้น ยังช่วยฆ่าและรักษาสภาพของเชื้อ (preserve) ได้อีกด้วย วิธีนี้แม้จะทำ ได้รวดเร็วก็จริง แต่ลักษณะการเรียงตัวของสปอร์และก้านชูสปอร์มักจะเสียไปในระหว่างกระจายหรือเขี่ยเชื้อ 2. Scotch tape technique ใช้ scotch tape No.800 ซึ่งเป็นชนิดใสและบาง เหมาะต่อการตรวจดู ด้วยกล้องจุลทรรศน์ เริ่มจากตัด scotch tape ให้มีความยาวประมาณ 4 ซม. ใช้นิ้วชี้และนิ้วหัวแม่มือแตะ ปลายด้านเหนียวของเทปทั้ง 2 ปลาย ทำให้ tape โค้งออกโดยมีด้านเหนียวอยู่ข้างนอก จากนั้นใช้ด้านเหนียว แตะเชื้อกดเล็กน้อยลงบนโคโลนีเชื้อราโดยเฉพาะราสาย แล้วนำ tape ที่ได้ไปวางบนหยด LPCB ที่อยู่บน slide จากนั้นหยด LPCB เพิ่มอีก 1 หยด ทับลงบน tape ด้านไม่เหนียว แล้วปิดด้วย cover glass วิธีนี้ สามารถพบลักษณะการเรียงตัวของสปอร์และก้านชูสปอร์ได้ดีกว่าวิธีแรก แต่ไม่เหมาะสำหรับศึกษาเชื้อราที่มี serial mycelium สั้น ๆ หรือ yeast colony และไม่สามารถเก็บไว้ได้นานเนื่องจากสารเหนียว ๆ ที่ฉาบอยู่ใน แผ่น cellophane จะละลายและขุ่นมากขึ้นตามระยะเวลา โดยปกติแล้วควรศึกษาให้เสร็จภายในระยะเวลา ไม่เกิน 5 ชั่วโมง 3. Slide culture technique วิธีนี้จะใช้อุปกรณ์เพิ่มขึ้นและเสียเวลามาก มีข้อดีคือสามารถศึกษา ส่วนต่าง ๆ ของเชื้อราได้ชัดเจน การเรียงตัวของก้านชูสปอร์สวยงามและทำเป็นสไลด์ถาวร(permanent slide) เก็บไว้ได้นาน ๆ ได้ โดยขั้นตอนในการทำมีดังนี้ 1. ทำ agar block โดยตัด Sabouraud dextrose agar (SDA) หรือ Potato dextrose agar (PDA) ให้เป็นสี่เหลี่ยมยาวด้านละ 1 ซม. 2. ใช้ needle นำ agar block วางลงบน slide ใน sterile petri dish ซึ่งวางอยู่บนแท่งแก้วรูปตัว V โดยวางค่อนไปทางด้านใดด้านหนึ่งของ slide