141 3. ใช้ needle เขี่ย spores หรือ mycelium ของเชื้อที่ต้องการขนาดเท่าหัวเข็มหมุด inoculate ลง บนกึ่งกลางด้านทั้ง 4 ของ agar block 4. ใช้forceps คีบ cover glass จุ่ม 95% alcohol แล้วลนไฟเพื่อ sterile ปล่อยให้เย็น แล้ววางทับ บน agar block ที่ inoculate เชื้อแล้วนั้น 5. เท sterile distilled water ลงใน plate เพื่อให้มีความชื้นพอเหมาะ ข้อควรระวังคือ อย่าเทจน ท่วมถึง slide 6. นำ plate ไป incubate ที่อุณหภูมิห้อง 5-7 วัน จะพบ mycelium และ spores ติดอยู่บน cover glass และ slide 7. ใช้ forceps คีบ cover glass ที่มี mycelium เกาะติดมาย้อมด้วย lactophenol cotton blue โดย วางลงบน slide อีกแผ่น ส่วน agar block ที่มีเชื้ออยู่ให้ทิ้งลงใน disinfectant สไลด์ที่เหลือหยด lactophenol cotton blue ปิดด้วย cover glass ก็จะได้ slide culture 2 แผ่นด้วยกัน 8. ปล่อยให้แห้ง แล้วปิดทับขอบ cover glass ด้วยน้ำยาทาเล็บ วัตถุประสงค์ในปฏิบัติการนี้เพื่อให้นักศึกษาทราบวิธีการที่ใช้ในการศึกษาเชื้อราทางห้องปฏิบัติการจุล ชีววิทยา และสามารถอธิบายลักษณะที่สำคัญของเชื้อราทั้งจากธรรมชาติและจากสิ่งส่งตรวจได้ การทดลองที่ 9.1 การศึกษาลักษณะของ yeast โดยวิธี wet mount preparation วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษา 1. สามารถทำ wet mount preparartion สำหรับศึกษาลักษณะของ yeast ได้ 2. บอกความแตกต่างของวิธีการทำ wet mount โดยสี lactophenol cotton blue และ nigrosin ได้ 3. บอกความแตกต่างระหว่าง yeast ชนิด Candida albicans และ Cryptococcus neoformans ได้ วัสดุอุปกรณ์ (สำหรับนักศึกษาแต่ละกลุ่ม) 1. สี lactophenol cotton blue (LPCB) 2. สี nigrosin (nigrosin in formalin) 3. Microscopic slide และ cover glass 4. loop 5. Culture on Sabouraud dextrose agar slant ของเชื้อ Candida albicans และ Cryptococcus neoformans วิธีทำ 1. หยด lactophenol cotton blue ลงบน slide 2 แผ่น แผ่นละ 1 หยด 2. ใช้ sterile loop แตะโคโลนีของเชื้อแต่ละ 1 ชนิด นำมากระจายบนหยดสีแต่ละ slide 3. ปิด cover glass ลงบนหยดสีทั้ง 2 slide นำมาดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ กำลังขยาย 10X และ 40X
142 4. เริ่มทำข้อ 1 ใหม่ แต่ใช้ nigrosin แทน lactophenol cotton blue 5. สังเกตความแตกต่างของเชื้อแต่ละชนิดแล้วบันทึกผลการทดลอง ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 9.1 Species/No. Agar slant/ อายุ ลักษณะโคโลนี วาดรูปและอธิบาย ลักษณะเซลล์จาก Lactophenol cotton blue wet mount(40X) วาดรูปและอธิบาย ลักษณะเซลล์จาก Nigrosin wet mount (40X) 1. Candida albcans หมายเลข agar slant ……………………………. อายุ................................วัน ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… 2 Cryptococcus neoformans หมายเลข agar slant …………………………… อายุ................................วัน ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ……………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… ………………………… อภิปราย...................................................................................................................... ........................................ ........................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .............................................. ............................................................................................................................... ............................................ ........................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. ..............................................
143 การทดลองที่ 9.2 การศึกษารูปร่างลักษณะของ opportunistic fungi และ dermatophytes บางชนิด โดยวิธี tease mount technique วัตถุประสงค์ เพื่อให้นักศึกษา 1. สามารถเตรียมตัวอย่างเชื้อราสาย โดยวิธี tease mount tecnique ได้ 2. อธิบายลักษณะสำคัญที่ใช้ในการจำแนกชนิดของเชื้อราสายได้ วัสดุอุปกรณ์ 1. Teasing needle 2. Lactophenol cotton blue (LPCB) 3. Microscopic slides and Cover slips 4. Cultures on SDA slant ของ Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichophyton sp., Microsporum sp., Epidermophyton sp. (ให้กลุ่มละ 1 ชนิด) วิธีทำ 1. ศึกษารูปร่าง ลักษณะ ผิวหน้าของโคโลนี ตลอดจนสีของ pigment ด้านล่าง 2. ทำ wet mount preparation โดยวิธี tease mount tecnique 3. นำมาส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยใช้ low power (10X) และ high dry (40X) objective lens ตรวจหาสปอร์ สายรา และบันทึกผลโดยการวาดรูป ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 9.2 Species/No. Agar plate/ อายุ ลักษณะโคโลนี วาดรูปและอธิบายลักษณะจาก Lactophenol cotton blue wet mount (10Xor40X) ชื่อเชื้อรา ............................................ หมายเลข agar plate ……………………………. อายุ................................วัน …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... …………………………... ลักษณะHyphae:…………………..………………... ....................................................................... ลักษณะSpore:…………..…………………..……... .......................................................................
144 การสาธิตที่ 9.1 ลักษณะที่ใช้ในการระบุชนิดของ Candida albicans วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาสามารถ 1. บอกขั้นตอนที่ใช้ในการระบุชนิดของ Candida albicans ได้ 2. บอกลักษณะที่ใช้ในการระบุชนิดของ Candida albicans ได้ วัสดุอุปกรณ์ 1. Slide บนกล้องจุลทรรศน์ แสดงลักษณะ chlamydospore ของ Candida albicans ที่ได้จากการ เพาะเลี้ยงในอาหารแป้งข้าวโพดผสม tween 80 2. Slide บนกล้องจุลทรรศน์ แสดงลักษณะ germ tube ของ C. albicans ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงใน plasma อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ภายใน 3 ชั่วโมง วิธีการ นักศึกษาทำการศึกษาตัวอย่างของเชื้อราที่ตั้งแสดงด้วยตนเอง และบันทึกลักษณะของเชื้อราที่พบใน ตาราง ตารางบันทึกผลการสาธิตที่ 9.1 ลักษณะ บันทึกลักษณะที่พบ วาดรูปลักษณะที่พบ Chlamydospores Germ tube การสาธิตที่ 9.2 ลักษณะรูปร่างและโครงสร้างของเชื้อราสาย วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาสามารถ 1. บอกลักษณะโครงสร้างทางกายและโครงสร้างสืบพันธุ์ของเชื้อราสายที่ตั้งแสดงได้ 2. บอกชื่อสกุล หรือกลุ่มของราสายที่ตั้งแสดงได้ วัสดุอุปกรณ์ Slide บนกล้องจุลทรรศน์ แสดงลักษณะรูปร่างและโครงสร้างของตัวอย่างเชื้อราสาย 7 ชนิด คือ Aspergillus sp., Penicillium, Rhizopus sp., Cladosporium sp., Trichophyton sp., Microsporum sp., และ Epidermophyton sp. วิธีการ นักศึกษาทำการศึกษาตัวอย่างของเชื้อราที่ตั้งแสดงด้วยตนเอง และบันทึกลักษณะของเชื้อราที่พบใน ตาราง
145 ตารางบันทึกผลการสาธิตที่ 9.2 เชื้อรา ลักษณะโครงสร้างที่พบ วาดรูปโครงสร้างที่พบ Aspergillus sp. Penicillium sp. Rhizopus sp. Cladosporium sp. Trichophyton sp. Microsporum sp. Epidermophyton sp.
146 การสาธิตที่ 9.3 ลักษณะของเชื้อราจากสิ่งส่งตรวจบางชนิด วัตถุประสงค์เพื่อให้นักศึกษาสามารถ 1. บอกวิธีการที่ใช้ในการตรวจหาเชื้อจากสิ่งส่งตรวจได้ 2. บอกลักษณะของเชื้อราที่พบจากสิ่งส่งตรวจได้ 3. ระบุกลุ่มของเชื้อราหรือโรคติดเชื้อราได้จากลักษณะของเชื้อราที่พบในสิ่งส่งตรวจ วัสดุอุปกรณ์ 1. Slide บนกล้องจุลทรรศน์ แสดงลักษณะของเชื้อราสาเหตุโรคกลากในสิ่งส่งตรวจที่เป็นสะเก็ดจาก ผิวหนังผู้ป่วยซึ่งผ่านการทำ KOH preparation และย้อมสี lactophenol cotton blue 2. Slide บนกล้องจุลทรรศน์ แสดงลักษณะของเชื้อราสาเหตุโรคเกลื้อนในสิ่งส่งตรวจที่เป็นขุยจากผิวหนัง ผู้ป่วยซึ่งผ่านการทำ KOH preparation และย้อมสี lactophenol cotton blue วิธีการ นักศึกษาทำการศึกษาตัวอย่างของเชื้อราที่ตั้งแสดงด้วยตนเอง และบันทึกลักษณะของเชื้อราที่พบใน ตาราง ตารางบันทึกผลการสาธิตที่ 9.3 สิ่งส่งตรวจ ลักษณะโครงสร้างเชื้อราที่พบ วาดรูปลักษณะที่พบ สะเก็ดผิวหนังผู้ป่วยกลาก ขุยผิวหนังผู้ป่วยเกลื้อน คำถามท้ายบท 1. Asexual spore ของเชื้อ Rhizopus เรียกว่าอะไร ? มีความแตกต่างจาก asexual spore ของ Penicillium และ Aspergillus อย่างไร 2. เปรียบเทียบลักษณะของเชื้อรา Penicillium และ Aspergillus ตามหัวข้อต่อไปนี้ 2.1 โครงสร้างในการสร้างสปอร์ 2.2 ประโยชน์และโทษ
147 3. ลักษณะที่แตกต่างกันของ Microsporum, Epidermophyton และ Trichophyton คืออะไร 4. การดูแคปซูล (capsule) ของเชื้อ Cryptococcus สามารถทำได้โดยวิธีใด 5. การทดสอบที่ใช้แยกเชื้อ Candida albicans ออกจากเชื้อ Candida species อื่นคือการทดสอบใด 6. เชื้อราชนิดใดที่จัดเป็น dematiaceous fungi 7. เหตุผลที่ใช้ KOH สำหรับศึกษาเชื้อรา จากสิ่งส่งตรวจของผู้ป่วยคืออะไร 8. อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในห้องปฏิบัติการทางราวิทยาได้แก่อาหารชนิดใด 9. การใช้ lactophnal cotton blue ในการเตรียมตัวอย่างเชื้อราเพื่อศึกษา มีประโยชน์อย่างไร 10.การเตรียมตัวอย่างเชื้อราประเภท mold เพื่อศึกษาโดยกล้องจุลทรรศน์ วิธีใดที่ให้ผลดีที่สุด เอกสารอ้างอิง 1. กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์. วิทยาเชื้อราพื้นฐาน Basic Mycology. ขอนแก่น : โรงพิมพ์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, 2546. 2. นเรศ วโรภาสตระกูล. ราและการติดเชื้อรา. ใน : เสาวลักษณ์ สุขประเสริฐ, สุวิน ว่องวัจนะ, บรรณาธิการ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาเชื้อโรค Pathogenic Microbiology. Microbiology Laboratory manual. ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, 2536 : 127-135. 3. นเรศ วโรภาสตระกูล. รูปร่างและโครงสร้างของเชื้อรา. ใน : กิตติพันธุ์ เสมอพิทักษ์, กัญญลักษณ์ ชัยคำภา, บรรณาธิการ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยา Microbiology Laboratory Manual.ภาควิชาจุล ชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, 2542 : 10-1 -7.
148 Appendix Lactophenol cotton blue Phenol crystals 20.0 gm. Lactic acid 20.0 ml. Glycerol 40.0 ml. Distilled water 20.0 ml. Cotton Blue นำผลึกของ phenol ละลายในน้ำ แล้วเติม Lactic acid คนให้เข้ากันจนละลายให้น้ำร้อนพออุ่นๆ ไม่ ต้องร้อนมากจนเดือด จากนั้นจึงเติมสี Cotton blue (china blue) จนละลายเข้ากัน จึงเติม glycerol เป็น ขั้นสุดท้าย หลังจากเตรียมเสร็จควรกรองด้วยกระดาษกรองอีกครั้งหนึ่ง หมายเหตุกรณีที่ไม่มี Cotton blue อาจใช้ Aniline blue แทนได้ โดยใส่ในปริมาณเท่ากับ Cotton blue KOH Solution KOH 20 gm. Glyceral 20 gm. Distilled H2O 80 gm. ใช้สำหรับตรวจดูเชื้อราที่มาจากสิ่งส่งตรวจที่เป็น ผิวหนัง เล็บและเส้นผม Nigrosin staining solution Nigrosin (granular) 10 gm. Formalin (10%) 100 ml. ใช้สำหรับตรวจหาแคปซูลของเชื้อ Cryptococcus ใน CSF
149 ปฏิบัติการบทที่ 10 ผลจากการติดเชื้อของไวรัส (Effects of virus on cells) ศ.พญ.ทิพยา เอกลักษณานันท์ อ.ดร.สิรินาถ อารมย์เสรี บทนำ: ในชั่วโมงปฏิบัติการนี้นักศึกษาจะได้ศึกษาเกี่ยวกับ การเพิ่มจำนวนของไวรัส การหาปริมาณไวรัส ผลของ ไวรัสต่อเซลล์ และการใช้เซลล์เพาะเลี้ยงสำหรับแยกเชื้อไวรัส การศึกษาคุณสมบัติของไวรัสทางห้องปฏิบัติการ สามารถใช้ได้ทั้ง bacteriophage หรือ phage ซึ่งเป็นไวรัสที่ติดเชื้อในแบคทีเรีย และ animal virus ซึ่งเป็น ไวรัสที่ติดเชื้อในคนและสัตว์ การศึกษาการเพิ่มจำนวนและการหาปริมาณ bacteriophage โดยทั่วไปนิยมใช้ bacteriophage ชนิด T4r ในการศึกษาเกี่ยวกับการเพิ่มจำนวนและการหาปริมาณ ไวรัส และใช้ Escherichia coli เป็นโฮสต์ เมื่อ T4r มีการติดเชื้อใน E. coli แล้ว จะมีการเพิ่มจำนวนจนได้ phages รุ่นลูกออกมามากมาย หลังจากนั้นผนังเซลล์ของแบคทีเรียจะถูกย่อยทำให้เซลล์แบคทีเรียแตก แล้ว ปล่อย phages รุ่นลูกออกมาภายนอก และไปติดเชื้อแบคทีเรียตัวใหม่ต่อไป จำนวนของ phages รุ่นลูกที่ถูก ปล่อยออกมาจากแบคทีเรียหนึ่งเซลล์หลังจากเซลล์แตก เรียกว่า burst size ซึ่งในกรณีของ T4r จะมีประมาณ 150-400 อนุภาคต่อแบคทีเรีย 1 เซลล์
150 การทดลอง: Plaque-forming assay สำหรับ bacteriophage (agar layer plaque technique) วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาผลของไวรัสต่อเซลล์ 2. เพื่อหาปริมาณไวรัส หลักการ เมื่อนำ suspension ของ bacteriophage มาผสมกับแบคทีเรียจำเพาะของไวรัสนั้นใน semisolid agar แล้วเทลงบน nutrient agar (NA) นำไปอบที่อุณหภูมิ37o C ไวรัสจะเข้าไปเพิ่มจำนวนภายในเซลล์ของ แบคทีเรียแล้วออกจากเซลล์โดยทำให้เซลล์แตก ไวรัสรุ่นลูกที่ออกจากเซลล์จะไปเพิ่มจำนวนในแบคทีเรียเซลล์ ใหม่ที่อยู่ในบริเวณนั้น แล้วออกจากเซลล์ทำให้เห็นเป็นจุดใสที่ถูกล้อมรอบด้วยบริเวณขุ่นที่เกิดจากแบคทีเรีย ซึ่งไม่ติดเชื้อไวรัสมีการเพิ่มจำนวน จุดใสดังกล่าวเรียกว่า “plaque” โดยแต่ละจุดใสนั้นเกิดจากไวรัสตั้งต้น 1 อนุภาค ดังนั้นในการหาปริมาณไวรัสจะคำนวณออกมาเป็นหน่วย plaque forming unit (PFU) และถือว่า 1 จุดใส = 1 PFU อุปกรณ์ 1. แบคทีเรียชนิด E. coli ATCC 25922 อายุ4 ชั่วโมง จำนวน 2 ml 1 หลอด 2. ไวรัส bacteriophage ที่มีdilution 1:106 จำนวน 2 ml 1 หลอด 3. ไวรัส bacteriophage ที่มีdilution 1:107 จำนวน 2 ml 1 หลอด 4. melted 0.7% salt agar จำนวน 3 ml 3 หลอด 5. nutrient agar plate 3 เพลท 6. sterile test tube ขนาด 13 x 100 mm พร้อมจุก 2 หลอด 7. sterile pipette ขนาด 1 ml 6 อัน
151 วิธีทำ 1. label “10-6 ” และ “10-7 ” ที่หลอดทดลอง 2 หลอดตามลำดับ 2. label “10-6 ”, “10-7 ” และ “control” ที่ NA plate ทั้ง 3 เพลทตามลำดับ 3. ใช้sterile pipette ดูด suspension ของแบคทีเรียและไวรัสลงในหลอดทดลองตามตาราง หลอดที่ ปริมาตรที่ใช้(ml) E.coli Phage 1:106 Phage 1:107 1 (10-6 ) 0.2 0.2 - 2 (10-7 ) 0.2 - 0.2 4. เขย่าหลอดเบาๆ ให้ส่วนผสมเข้ากันดี 5. นำ melted 0.7% salt agar ออกจาก water bath จำนวน 1 หลอด (ให้หยิบมาใช้ทีละหลอด เพราะถ้า นศ. ทำช้า วุ้นจะแข็งตัวก่อน) 6. ดูดส่วนผสมในหลอดที่ 1 จำนวน 0.2 ml ใส่ลงใน melted 0.7% salt agar 7. ผสมให้เข้ากันโดยการคว่ำหงายหลอด 4-5 ครั้ง ระวัง! อย่าให้เกิดฟองอากาศ แล้วเทส่วนผสมลงใน NA plate ที่ label “10-6 ” หยิบ NA plate ขึ้นมาเอียงไปมาให้ส่วนผสมเคลือบไปบนผิว NA อย่างทั่วถึง แล้ว วางลง อย่าขยับเพลทอีกจนกว่าวุ้นจะแข็งตัว 8. ทำขั้นตอนที่ 5-7 ซ้ำ โดยใช้ส่วนผสมในหลอดที่ 2 สำหรับ NA plate ที่ label “10 -7 ” 9. เตรียม control plate โดยดูด E. coli จำนวน 0.2 ml ใส่ลงใน melted 0.7% salt agar อีกหลอด หนึ่ง ผสมให้เข้ากัน แล้วเทส่วนผสมลงใน NA plate ที่ label “control” หยิบ NA plate ขึ้นมาเอียงไปมาให้ ส่วนผสมเคลือบไปบนผิว NA อย่างทั่วถึง แล้ววางลง อย่าขยับเพลทอีกจนกว่าวุ้นจะแข็งตัว 10. รอให้0.7% salt agar แข็งตัว แล้วนำเพลททั้งสามเข้า incubator เป็นเวลา 24 ชั่วโมง 11. นำเพลททั้งสามออกจาก incubator สังเกตการแตกสลายของแบคทีเรีย และนับจำนวน plaque รายงานผลว่ามีปริมาณ bacteriophage ตั้งต้นกี่ PFU/ml การศึกษาผลของไวรัสต่อเซลล์ (Effects of viruses on cells) เมื่อ animal virus ติดเชื้อในเซลล์จะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างภายในเซลล์ การ เปลี่ยนแปลงบางอย่างสามารถสังเกตได้ เช่น การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ที่ติดเชื้อ หรือเรียกว่าการเกิด cytopathic effect (CPE) ลักษณะ CPE จะแตกต่างกันไปตามชนิดของไวรัส และไวรัสหลายชนิดก็มี CPE ที่ เหมือนกันได้ นอกจากนี้ไวรัสอาจทำให้เกิด inclusion body ภายในเซลล์ ซึ่งตำแหน่งที่พบ inclusion body อาจอยู่ในนิวเคลียส หรือไซโตพลาสมของเซลล์ก็ได้แล้วแต่ชนิดของไวรัส การสาธิต:
152 1. การเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่ติดเชื้อ herpes simplex virus ลักษณะของเซลล์ที่ติดเชื้อ herpes simplex virus เป็นเซลล์ที่มีขนาดใหญ่ ซึ่งเกิดจากเซลล์ที่ติดเชื้อมี การหลอมรวม (fusion) กับเซลล์ข้างเคียง ทำให้เห็นนิวเคลียสหลายอันภายในเซลล์ เรียกเซลล์นี้ว่า multinucleated giant cell หรือ syncytial cell จำนวนนิวเคลียสจะขึ้นอยู่กับจำนวนเซลล์ที่หลวมรวมกัน อย่างไรก็ตามบางครั้งนิวเคลียสหลาย ๆนิวเคลียสก็อาจหลอมรวมกันได้ทำให้เห็นเป็นนิวเคลียสเดียว การวินิจฉัยรอยโรคที่ผิวหนังที่มีลักษณะเป็นตุ่มน้ำใส (vesicle) ของผู้ป่วยโรคเริม โรคอีสุกอีใส และโรค งูสวัด ทำโดยขูดเอาเซลล์ที่ฐานของตุ่มน้ำใส (vesicular scrape) ของผู้ป่วย แล้ว smear เซลล์บนสไลด์ นำ สไลด์มาย้อมสี Giemsa หรือสี Wright เรียกวิธีการนี้ว่า Tzanck test หรือ Tzanck smear จะพบ multinucleated giant cells เหมือนกันทั้ง 3 โรค 2. การสาธิตการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่ติดเชื้อ rabies virus เซลล์ที่ติดเชื้อ rabies virus จะมี inclusion body อยู่ในไซโตพลาสม เรียกว่า intracytoplasmic inclusion body หรือ Negri’s body การย้อมเซลล์ด้วยสี hematoxylin and eosin (H&E) จะเห็นนิวเคลียส ติดสีม่วง ส่วน inclusion body มีลักษณะกลมหรือรี ขนาดเล็กกว่านิวเคลียส และติดสีชมพู ในสมัยก่อนการวินิจฉัยโรคพิษสุนัขบ้าจะนำชิ้นเนื้อสมองของสุนัขมา smear บนสไลด์ แล้วย้อมด้วยสี H&E เพื่อตรวจดู Negri’s body แต่วิธีนี้มีความจำเพาะต่ำเนื่องจากอาจพบ intracytoplasmic inclusion body ได้ในเซลล์ประสาทของสุนัขที่ไม่ได้เป็นโรคพิษสุนัขบ้า ปัจจุบันจึงใช้วิธีอื่นที่มีความจำเพาะสูงกว่า 3. เซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้สำหรับการแยกเชื้อไวรัส (animal virus) การแยกเชื้อไวรัสจัดเป็น gold standard สำหรับการวินิจฉัยโรคติดเชื้อไวรัส โฮสต์ที่ใช้สำหรับแยกเชื้อ ไวรัสได้แก่ เซลล์เพาะเลี้ยง (cell culture) ไข่ฟัก (embryonated egg) และสัตว์ทดลอง (laboratory animal) โดยทั่วไปนิยมใช้เซลล์เพาะเลี้ยง ไวรัสบางชนิดสามารถเพาะเลี้ยงได้ในเซลล์เพาะเลี้ยงโดยจะต้อง เลือกชนิดของเซลล์เพาะเลี้ยงให้เหมาะสมกับไวรัสที่ต้องการแยกเชื้อ เพราะไวรัสมีความจำเพาะกับเซลล์โฮสต์ ต้นกำเนิดของเซลล์เพาะเลี้ยงอาจได้มาจากเนื้อเยื่อปกติ หรือเนื้อเยื่อมะเร็งของสัตว์ และคนก็ได้ ตัวอย่างเซลล์เพาะเลี้ยงที่นำมาให้นักศึกษาดูนี้มีชื่อว่า Vero cell line ซึ่งมีต้นกำเนิดจากเซลล์ไตของลิง (African green money kidney cell) เมื่อเลี้ยงในขวดสำหรับเลี้ยงเซลล์ (tissue culture flask) เซลล์จะ เจริญแบ่งตัวออกไปในระนาบเดียว จะไม่เห็นการเจริญซ้อนทับกันหลายชั้น ลักษณะนี้เรียกว่า monolayer การดูลักษณะรูปร่างของเซลล์เพาะเลี้ยงที่อยู่ใน flask ต้องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ชนิด inverted microscope ซึ่งตำแหน่งของ objective lens จะอยู่ใต้ stage เมื่อไวรัสติดเชื้อและเพิ่มจำนวนในเซลล์เพาะเลี้ยงอาจทำให้เซลล์มีลักษณะรูปร่างเปลี่ยนไปจากเดิม เรียกว่าเกิด cytopathic effect (CPE) จากลักษณะ CPE พอจะบอกได้ว่าเกิดจากไวรัสชนิดใดแต่อาจจะไม่ ถูกต้องเพราะเป็นว่าวิธีที่ไม่จำเพาะ วิธีที่บอกได้แน่นอนว่าเซลล์เพาะเลี้ยงติดเชื้อไวรัสชนิดใดคือวิธี immunofluorescence ซึ่งเป็นการย้อมเซลล์ที่ติดเชื้อด้วยแอนติบอดีต่อไวรัสชนิดที่สงสัย
153 รายงานปฏิบัติการไวรัสวิทยา (Effect of virus on cell) กลุ่มที่ _____ชื่อ ___________________________ รหัส _________________ คณะ _______________ ชื่อ ___________________________ รหัส _________________ ชื่อ ___________________________ รหัส _________________ ชื่อ ___________________________ รหัส _________________ ผลการทดลอง: plaque-forming assay สำหรับ bacteriophage (agar layer plaque technique) 1. บอกลักษณะที่พบบนเพลททั้งสามหลังจาก incubate ครบ 24 ชั่วโมง ลักษณะที่พบนั้นเกิดจากอะไร _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 2. คำนวณปริมาณ bacteriophage ตั้งต้น (ก่อนทำการเจือจางเป็น 1:106 และ 1:107 ) เพลทที่ จำนวน plaque ที่นับได้(PFU) จำนวน bacteriophage ตั้งต้น (PFU/ml) 1 (10-6 ) 2 (10-7 ) 3. จากการทดลองนี้ผลของไวรัสที่มีต่อเซลล์โฮสต์คือ _____________________________________________________ จากการสาธิต 4. CPE (cytopathic effect) หมายถึง _____________________________________________________________________________ 5. บอกลักษณะของ CPE ที่เกิดจาก herpes simplex virus _____________________________________________________________________________ 6. Tzanck’s test คือ _____________________________________________________________________________ 7. Negri’ body คือ _____________________________________________________________________________
154
155 ภาคผนวก ขั้นตอนในการเรียนการสอนแบบกลุ่มย่อย (Case) รายวิชาจุลชีววิทยาสำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์ชั้นปีที่ 2
156 Problem based learning (PBL) Step 1: Term clarifying หาความหมายของคำ /วลี/ ศัพท์การแพทย์ต่าง ๆ ที่ไม่ เข้าใจ หรือเข้าใจไม่ตรงกัน (ควรนำ Dictionary ที่ มาตรฐาน หรือ ตำรา textbook ต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้อง เข้า ไปในห้องด้วยเสมอ) Step 2: Problem listing ตั้งคำถามจากโจทย์ ได้แก่ ปรากฏการณ์หรือเหตุการณ์ ใด ๆ ในโจทย์ที่นักศึกษาอธิบายไม่ได้ Step 3: Brainstorming ระดมความคิด/คำตอบ โดยใช้พื้นฐานความรู้เดิม หรือ การลองคิดระดมคำตอบที่อาจเป็นไปได้เพื่อตอบคำถาม ที่ตั้งไว้ใน step 2 Step 4: Hypothesis setting ตั้งสมมุติฐานในการอธิบายโจทย์ โดยนำข้อมูลต่าง ๆ ที่ ได้ร่วมกันคิดและอภิปรายใน step 3 มาเขียน สมมุติฐาน (การเขียนสมมุติฐานให้นักศึกษาเขียนเป็น แผนภูมิ (diagram) จากเหตุไปผล Step 5: Learning objective identification ให้นักศึกษากำหนดเนื้อหาที่ต้องศึกษาเพื่อทดสอบ สมมุติฐานที่ตั้งใน step 4 ว่าถูกต้องหรือไม่อย่างไร วัตถุประสงค์ของการทำกลุ่มย่อย o ฝึกการคิดอย่างเป็นระบบและครอบคลุม o สร้างทักษะให้สามารถประยุกต์ใช้ความรู้ในการ แก้ปัญหา o สร้างทักษะในการประเมินตนเอง “ตนเองยังไม่รู้ อะไรบ้าง” บทบาทของ tutor o ครูเป็นเพียงผู้ช่วยในกระบวนการการเรียนรู้ของ นักศึกษา และจะไม่ทำ mini-lecture ในกลุ่มย่อย Step 6: Analysis แก้ไขสมมุติฐานใน step 4 ให้ถูกต้องโดยใช้ความรู้ที่ได้ จากการศึกษาด้วยตนเองหรือการพบ resource person Step 7: Synthesis สรุปรวบยอดเกี่ยวกับเนื้อหาที่ได้เรียนรู้จากการใช้ บทเรียนนี้ (case) เป็นแบบจำลอง ความรู้ที่ได้นี้ นักศึกษาต้องสามารถประยุกต์ใช้ในการอธิบายหรือ แก้ปัญหาในสถานการณ์ที่เปลี่ยนไปได้ด้วย หมายเหตุ: Step 1-5 เกิดขึ้นใน Small group ครั้งที่ 1(SG1) Step 6-7 เกิดขึ้นใน Small group ครั้งที่ 2(SG2) สำหรับนักศึกษาเภสัชศาสตร์นั้น (Mini-case) • เนื่องจากว่า มีการเรียนการสอนเพียง 1 ครั้งต่อ 1 case ดังนั้นจะไม่มี step 6-7 • ประธาน case จะสรุป case ให้ฟัง เมื่อจบ step 5 ซึ่งขั้นตอนใน step 6-7 นักศึกษาควรจะไปศึกษา เพิ่มเติมด้วยตนเองต่อไป ข้อตกลงเบื้องต้นที่ต้องปฏิบัติ o การเรียนรู้เป็นความรับผิดชอบของผู้เรียนโดยตรง o มาตรงเวลา เพราะทุกคนเป็นส่วนหนึ่งของ กระบวนการทำงานกลุ่ม o ทุกคนต้องมีส่วนร่วมในการทำงานกลุ่ม o รู้จักรับฟังความคิดเห็นที่แตกต่าง o ไม่ผูกขาดบทบาทในการทำกลุ่ม o การทำกลุ่มย่อยเป็นการอภิปรายถกเถียงไม่ใช่การ ทำ mini-lecture
157 Team based learning (TBL) สัดส่วนคะแนน - 50% from IRAT (10%), TRAT (20%), AppEx (20%) - 50% from tutors, friends “นักศึกษาต้องอ่านเนื้อหาหลัง midterm มาทั้งหมด” ห้ามเข้าเรียนสาย!!!! 1. Orientation - ใช้เวลาประมาณ 5 นาที - อาจารย์กรรมการหลัก ประจำเป็นผู้ชี้แจง รายละเอียดการทำกลุ่ม และเกณฑ์การประเมิน 2. Individual readiness test (IRAT) - เวลา 15 นาที - ข้อสอบรายบุคคลทั้งหมด 10 ข้อ โดย eQuiz - ไม่อนุญาตให้สืบค้นข้อมูล 3.Team readiness test (TRAT) - เวลา 30 นาที - ข้อสอบรายกลุ่ม ทั้งหมด 10 ข้อ ทำโดยการขูดกระดาษคำตอบ Scratch card - อาจารย์ประจำกลุ่มเป็นผู้ สังเกตการณ์/ ประเมินคะแนน รายกลุ่มช่วงที่ 1 10% 20% 4. เฉลย/อภิปรายคำตอบ - เวลา 45 นาที - อาจารย์กรรมการหลักเป็นผู้ดำเนินการเฉลยคำตอบร่วมกับ โดยใช้คำถามชี้นำและเปิดให้นศ.ร่วมอภิปราย พัก 10 นาที 5. Application exercise (AppEx) - เวลา 30 นาที - ข้อสอบ 5 ข้อ ให้เวลาข้อละ 6 นาที - ตอบคำถามโดยใช้ mobile application - อาจารย์ประจำกลุ่มเป็นผู้สังเกตการณ์/ ประเมินคะแนนรายกลุ่มช่วงที่ 2 - อนุญาตให้สืบค้นข้อมูลได้ 20% 7. สรุปเนื้อหา และ 6. เฉลย/อภิปรายคำตอบ ตอบข้อซักถาม - เวลา 10 นาที - ประธาน case อย่าลืม!!! ทำแบบประเมิน (เพื่อนประเมินเพื่อน) ใน e-learning