บทที่ 6 เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอ รวม

15/03/65

พนั ธวุ ิศวกรรม (genetic engineering)
เป็ นกระบวนการเปล่ียนแปลงสารพนั ธกุ รรมของสิ่งมีชีวิต
โดยวิธีการตดั ต่อยนี เพ่ือใหไ้ ดส้ ิง่ มีชีวิตใหม่
ท่ีมีคณุ สมบตั ิตามท่ีตอ้ งการ

สง่ิ มีชีวิตดดั แปรพนั ธกุ รรม : GMO
(genetically modified organisms)

ส่งิ มีชีวิตดดั แปรพนั ธกุ รรม : GMO (genetically modified organisms)
หมายถึง สิง่ มีชีวิตท่ีถกู ดดั แปรพนั ธกุ รรม หรือตดั ต่อยนี
ดว้ ยกระบวนการพนั ธวุ ิศวกรรม เพ่ือใหไ้ ดล้ กั ษณะตามความตอ้ งการ
หรอื มีลกั ษณะเปลยี่ นแปลงจากเดิม
เพ่ือนาไปใชป้ ระโยชนต์ ่างๆ



การเพิ่มจานวน DNA เรียกว่า การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning)
และถา้ DNA บรเิ วณดงั กลา่ วเป็ นยนี เรียกว่า การโคลนยนี (gene cloning)

การเพ่ิมปรมิ าณยีน หรอื DNA ที่ตอ้ งการโดยใช้ ดีเอ็นเอพาหะ
หรอื เวกเตอร์ (vector) เชน่ พลาสมิด



ดีเอ็นเอรีคอมบิเนนท์ (recombinant DNA) คือ เสน้ DNA
ที่เกิดจากการนาเอา DNA ของส่ิงมีชีวิตต่างชนิดกนั มาต่อเขา้ ดว้ ยกนั

การตดั ใชเ้ อนไซมต์ ดั จาเพาะ (restriction enzyme)
การต่อใชเ้ อนไซมด์ ีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase)

เอนไซมต์ ดั จาเพาะ (restriction enzyme) จะตดั
พนั ธะฟอสโฟไดเอสเทอรภ์ ายใน DNA ท่ีมีลาดบั นิวคลโี อไทดจ์ าเพาะ
โดยเรยี กลาดบั เบสน้ีว่า บรเิ วณจดจา (recognition site)

เอนไซมต์ ดั จาเพาะแต่ละชนิดมีความจาเพาะต่อลาดบั เบสของ DNA
แตกต่างกนั

เอนไซมต์ ดั จาเพาะสรา้ งจากแบคทีเรีย มีจานวนหลายพนั ชนิด

เม่ือตดั แลว้ จะไดป้ ลายสาย DNA 2 แบบ คือ
- ปลายเหนียว (sticky end)

- ปลายท่ ู (blunt end)



เอนไซมด์ ีเอ็นเอไลเกส สามารถเรง่ ปฏิกิรยิ าการสรา้ ง
พนั ธะฟอสโฟไดเอสเทอรร์ ะหว่างปลายสาย DNA สองสายใหเ้ ชื่อมต่อกนั

ในการสรา้ งรคี อมบิแนนท์ จะตดั DNA สองโมเลกลุ ดว้ ยเอนไซม์
ตดั จาเพาะชนิดเดียวกนั แลว้ เช่ือมต่อดว้ ยเอนไซมด์ ีเอ็นเอไลเกส



- ทาการเพ่ิมจานวน โดยการถ่ายดีเอ็นเอรคี อมบิเนนทเ์ ขา้ สเู่ ซลลแ์ บคทีเรีย
- ทาการเพาะเล้ียงแบคทีเรีย ดีเอ็นเอรีคอมบิเนนทก์ ็จะเพ่ิมจานวนมากข้ึน
- ทาการคดั เลอื กเซลลท์ ่ีตอ้ งการ ดว้ ยการเล้ยี งแบคทีเรียในอาหารเล้ยี งเช้ือ

ที่มียาปฏชิ ีวนะ





การเพ่ิมจานวนของ DNA ในหลอดทดลองดว้ ยเทคนิค
พอลิเมอเรสเชนรเี อกชนั หรอื พีซีอาร์
(polymerase chain reaction ; PCR)
ดว้ ยเครอ่ื งเทอรม์ ลั ไซเคลอร์ (thermal cycler)

ตอ้ งใชเ้ อนไซมด์ ีเอ็นเอพอลิเมอเรส ที่สามารถ
ทนอณุ หภมู ิสงู ได้ โดยสกดั จากแบคทีเรียที่อาศยั อยใู่ น
น้าพรุ อ้ น

Kary B. Mullis

ส่ิงที่ใชใ้ นหลอดทดลอง ไดแ้ ก่
1. ดีเอ็นเอแมแ่ บบ (DNA template) คือ สว่ นของ DNA ท่ีตอ้ งการโคลน
2. ไพเมอร์ (primer) คือ DNA สายสนั้ ๆ เป็ นจดุ เริม่ ตน้ ของ
การสงั เคราะหส์ าย DNA
3. นิวคลโี อไทดท์ งั้ 4 ชนิด
4. เอนไซมด์ ีเอ็นเอพอลิเมอเรส

โดยสารทงั้ หมดจะละลายอยใู่ นสารละลายบพั เฟอร์
เพ่ือควบคมุ ใหอ้ ยใู่ นภาวะท่ีเหมาะสมต่อการเกิดปฏกิ ริ ยิ า



ขน้ั ตอนการเพ่ิมปรมิ าณ DNA โดยเทคนิค PCR

1. เพิ่มอณุ หภมู ิของเครอื่ งใหส้ งู 95 องศาเซลเซียส
เพื่อให้ DNA แมแ่ บบสองสายแยกออกเป็ นสายเดี่ยว

2. ลดอณุ หภมู ิลงที่ประมาณ 50-60 องศาเซลเซียส
ทาให้ DNA ไพรเมอรจ์ บั กบั DNA แม่แบบ

3. ปรบั อณุ หภมู ิใหเ้ หมาะสมกบั การทางานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส
ที่ประมาณ 72 องศาเซลเซียส

4. เริ่มกระบวนการในขนั้ ตอนที่ 1 ใหม่ จะได้ DNA สายค่ ู
2 สาย เพิ่มเป็ น 4 สาย เพิ่มแบบทวีคณู



6.2.1 การหาขนาด DNA ดว้ ยเทคนคิ เจลอิเล็กโทรฟอรีซิส

การหาขนาด DNA สามารถทาไดโ้ ดยใชเ้ ทคนิคท่ีเรยี กว่า
เจลอิเลก็ โทรฟอรซี ิส (gel electrophoresis)

เจลอิเลก็ โทรฟอรซี ิส (gel electrophoresis)

- เป็ นการแยกโมเลกลุ ของ DNA ภายใตส้ นามไฟฟ้ า
- โดยให้ DNA เคลือ่ นท่ีผา่ นตวั กลางที่เป็ นแผน่ วนุ้ ท่ีมีรพู รนุ

เช่น อะกาโรสเจล (agarose gel) และ พอลิอะครลิ าไมดเ์ จล (polyacrylamide gel)
- โมเลกลุ ของ DNA ท่ีมีขนาดแตกต่างกนั จะแยกออกจากกนั



1. ใสต่ วั อยา่ ง DNA ลงในช่อง
บนแผน่ วนุ้ อะกาโรสเจล

2. เปิ ดเครอื่ งให้ DNA
เคล่อื นที่ผา่ นเจล

3. DNA แยกออกจากกนั ตามขนาด

- โมเลกลุ DNA ที่มีประจลุ บ จะเคล่อื นท่ีเขา้ หาขว้ั บวก
- โมเลกลุ DNA ที่มีขนาดใหญ่จะเคลอ่ื นที่ชา้ กว่าโมเลกลุ ท่ีมีขนาดเลก็
- โมเลกลุ DNA ท่ีมีขนาดเดียวกนั จะเคลอื่ นท่ีไดร้ ะยะทางเท่ากนั
- สามารถสงั เกตเห็นเป็ นแถบ (band)

- DNA ท่ีอยใู่ นสารละลายจะใส ไมม่ ีสี สงั เกตยาก
- ตอ้ งยอ้ มสี เชน่ อีธิเดียมโบรไมด์ (ethidium bromide)
- และนาไปสอ่ งดว้ ยแสงอลั ตราไวเลตจะเกิดการเรอื งแสงเห็นเป็ นแถบ

- การหาขนาด DNA ทาไดโ้ ดยเปรียบเทียบกบั
โมเลกลุ ดีเอ็นเอมาตรฐาน หรือ DNA marker ; M

- DNA marker ประกอบดว้ ยช้ิน DNA
ที่ทราบขนาดเป็ นจานวนค่เู บส

- ทาใหท้ ราบขนาดโมเลกลุ ของ DNA
ท่ีตอ้ งการศึกษา

6.2.2 การหาลาดบั นวิ คลีโอไทด์

- การหาลาดบั นิวคลีโอไทด์ = การหาลาดบั ดีเอ็นเอ (DNA sequencing)
- คือการหาลาดบั เบสท่ีเป็ นองคป์ ระกอบในสาย DNA
- โดยเครือ่ งหาลาดบั นิวคลโี อไทดแ์ บบอตั โนมตั ิ

(automated sequencer)

เครอื่ งหาลาดบั นิวคลีโอไทดแ์ บบอตั โนมตั ิ (automated sequencer)
ซึ่งพฒั นาเทคนิคและซอฟตแ์ วร์ ใหส้ ามารถอ่านผลในรปู ของลาดบั เบส

ไดอ้ ยา่ งรวดเรว็



การบา้ น

1. กรณีศึกษาหนา้ 130 -131 โดยเขียนแต่แผน่ ภาพเจลหนา้ 131
2. ใหร้ ะบขุ นาดตวั อยา่ ง DNA หมายเลข 1 – 5 ในภาพ

โดยการเทียบกบั DNA marker (M) ท่ีกาหนดให้ (ไมต่ อ้ งวาดภาพ)









ผลิตโกรทฮอรโ์ มน
(growth hormone)

ผลิตวคั ซีนป้ องกนั
ไวรสั ตบั อกั เสบ บี

- โดยหาลาดบั นิวคลโี อไทดข์ องแอลลลี กอ่ โรค ดว้ ยการทา PCR



- ถ่ายแอลลีลที่ปกติเขา้ ไปในเซลลห์ รอื เน้ือเยอ่ื ท่ีผิดปกติ
- โดยใชไ้ วรสั บางชนิดเป็ นตวั นายนี
- ใหย้ ีนนน้ั แทรกตวั เขา้ สจู่ ีโนมของมนษุ ย์
- ควบคมุ ใหย้ นี นนั้ มีการแสดงออก

และสรา้ งโปรตีนท่ีปกติ
- ชว่ ยบรรเทาหรอื รกั ษา

อาการผดิ ปกติที่เกิดข้ึนได้





การตรวจแกไ้ ขจีโนม (genome editing) การปลกู ถ่ายไขกระดกู
โดยแกไ้ ขมิวเทชนั ในยนี เป้ าหมาย ในการรกั ษาโรคมะเรง็ เม็ดเลอื ดขาว
เฉพาะตาแหนง่ ที่ผิดปกติในจีโนม

CRISPR/Cas9

ใชก้ ารตรวจหาเครอ่ื งหมายโมเลกลุ (molecular marker) เพ่ือคดั เลือก
พืชและสตั วท์ ่ีมีลกั ษณะที่ตอ้ งการ เช่น พืชทนเค็ม



การสรา้ งสิ่งมีชีวิตดดั แปรพนั ธกุ รรม (GMO)

- ใหม้ ีลกั ษณะท่ีตอ้ งการ - เพิ่มมลู ค่า

- ลดค่าใชจ้ ่ายในกระบวนการผลิต - ยืดอายผุ ลผลติ

ขา้ วโพด BT

ถวั่ เหลอื งตา้ นทาน มะละกอตา้ นทานโรค
ยาปราบศตั รพู ืช พืชใบด่างจดุ วงแหวาน