คู่มือการปฏิบัติงานด้านมาตรฐานห้องปฏิบัติการ สำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา

ค่มู อื การปฏบิ ัตงิ านด้านมาตรฐานหอ้ งปฏิบัตกิ าร
สำหรับห้องปฏบิ ัติการจลุ ชวี วิทยา

โดย
นางสาวณชิ มน ธรรมรกั ษ์

นักวทิ ยาศาสตร์

งานบริการวชิ าการและวิจัย สำนักงานคณบดี
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลยั แมโ่ จ้
2564

คำนำ

“คู่มือการปฏิบัติงานด้านมาตรฐานห้องปฏิบัติการ สำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา”เล่มนี้
ได้เรียบเรียงและรวบรวมหลักปฏิบัติตามมาตรฐานห้องปฏิบัติการด้านจุลชีววิทยา และมีการนำไปใช้
จ ริ ง ใน ห้ อ ง ป ฏิ บั ติ ก า ร จุ ล ชี ว วิ ท ย า ข อ ง ศู น ย์ บ ริ ก า ร วิ ช า ก า ร ด้ า น วิ ท ย า ศ า ส ต ร์ แ ล ะ เท ค โ น โล ยี
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ในการให้บริการเครื่องมือวิทยาศาสตร์ และวิเคราะห์ทดสอบ
ดา้ นจุลชวี วิทยาให้กับผู้รบั บรกิ าร เชน่ นกั ศกึ ษา คณาจารย์ รวมท้งั หนว่ ยงานภาครัฐและเอกชนตา่ ง ๆ
นอกจากน้ียังได้รวบรวมแนวทางการดำเนินงานสำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา โดยอ้างอิง
ตามแนวปฏิบัติตามระบบมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2017 ด้านจุลชีววิทยา ซึ่งผู้เขียนได้มี
การปฏิบัตจิ ริง และไดร้ ับประสบการณ์และคำแนะนำตา่ ง ๆ จากสำนกั บริหารและรบั รองห้องปฏบิ ตั กิ าร
(บร.) กรมวทิ ยาศาสตรบ์ รกิ าร กระทรวงอดุ มศกึ ษา วิจัย และนวัตกรรม (อว.) และประสบการณ์ในการเป็นท่ี
ปรึกษาและผู้ตรวจประเมินคุณภาพภายในของห้องปฏิบัติการด้านจุลชีววิทยาให้กับหน่วยงานต่าง ๆ เช่น
ศูนย์บริการวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ และห้องปฏิบัติการ
วิเคราะห์คุณภาพอาหาร ศนู ย์วทิ ยาศาสตร์ ฮาลาล มหาวิทยาลัยสงขลานครนิ ทร์ วทิ ยาเขตปัตตานี เป็นต้น
วัตถุประสงค์ในการเรยี บเรยี งคู่มือเล่มนี้ เพ่ือให้เป็นคู่มือการปฏิบัติงานเบ้ืองต้น สำหรับนักศึกษาท้ังระดับ
ปริญญาตรแี ละบัณฑติ ศึกษา นักวทิ ยาศาสตรด์ ้านจลุ ชวี วิทยา คณาจารย์ นกั วจิ ัย รวมถึงผทู้ ี่สนใจตา่ ง ๆ ใน
การเลอื กและดำเนินงานได้อยา่ งเหมาะสม และมีความถูกต้อง

เนื้อหาภายในเล่มประกอบด้วย ความรู้ทั่วไปในปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา การจัดการ
ตัวอย่างทดสอบ การควบคุมคุณภาพ การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ การหาค่าความไม่
แน่นอน การสอบเทียบและทวนสอบเคร่ืองมือ ซ่ึงเป็นแนวปฏิบัติตามระบบมาตรฐาน ISO/IEC
17025: 2017 และการจดั การห้องปฏิบตั ิการตามพระราชบญั ญตั ิเชื้อโรคและพิษจากสัตว์ พ.ศ. 2560

ขอขอบพระคุณ คุณดรุณี วัชราเรืองวิทย์ คุณสมคิด ร่ืนภาควุฒิ ผศ.ดร.กรผกา อรรคนิตย์
คุณนันทวัน เกียรตสิ ุทธากร คุณสตินันท์ เยน็ วารี คณุ ณรงค์ฤทธ์ิ นรมั่ง และคุณอังคณา ไพสิฐเฟ่ืองฟู ที่กรุณา
ใหค้ ำแนะนำ ความรู้ และประสบการณ์ สำหรับนำมาใช้ในการเรียบเรียงคู่มือเล่มน้ี โดยผู้เขียนหวังเป็นอยา่ ง
ยิ่งว่า “คู่มือการปฏิบัติงานด้านมาตรฐานห้องปฏิบัติการ สำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา” เล่มน้ี
จะเปน็ ประโยชนส์ ำหรบั นกั ศึกษา และผู้ปฏิบตั ิงานในหอ้ งปฏิบตั ิการด้านจลุ ชีววทิ ยาได้เป็นอยา่ งดี

ณชิ มน ธรรมรักษ์
มิถนุ ายน 2564

สารบัญ (3)

คำนำ (1)
สารบัญ (3)
สารบญั ตาราง (6)
สารบญั ภาพ (8)
บทท่ี 1 บทนำ 1
2
วัตถุประสงค์ของคู่มือปฏิบตั งิ าน 2
ประโยชน์ทีค่ าดว่าจะได้รบั จากค่มู ือปฏบิ ตั งิ าน 2
ขอบเขตของคู่มอื ปฏิบตั ิงาน 3
บทท่ี 2 ความรู้ทว่ั ไปในปฏบิ ตั ิการทางจลุ ชีววทิ ยา 3
หลกั ปฏบิ ตั ิในการใช้หอ้ งปฏิบตั ิการทางจุลชีววทิ ยา 4
แนะนำการใช้อุปกรณแ์ ละเคร่ืองมือพนื้ ฐานทางจุลชวี วิทยา 17
เทคนิคพ้นื ฐานทางจุลชีววิทยา 27
บทที่ 3 การจัดการตัวอย่างทดสอบเพื่อการวเิ คราะห์ 27
แนวปฏิบตั ใิ นการจดั การตัวอยา่ งทดสอบทางจุลชวี วิทยา 31
บทที่ 4 การควบคุมคุณภาพทางจลุ ชีววิทยา 31
การควบคุมคุณภาพของสถานท่ีและสภาวะแวดล้อม 38
การควบคุมคณุ ภาพของเครื่องมือและอุปกรณ์ 46
การควบคุมคุณภาพของบุคลากร 49
การควบคุมคุณภาพ และการเก็บรกั ษาเช้ือจลุ ินทรียอ์ ้างอิง 52
การควบคุมคุณภาพของอาหารเลี้ยงเชื้อ 61
การควบคมุ คณุ ภาพวธิ ีวเิ คราะห์ทดสอบ 63
การควบคมุ คณุ ภาพตวั อยา่ งทดสอบ

บทที่ 5 การตรวจสอบความใช้ไดข้ องวธิ ีทดสอบทางจลุ ชวี วทิ ยา (4)
แนวทางการวางแผนการตรวจสอบความใช้ได้ของวธิ ที ดสอบ
การตรวจสอบความใชไ้ ดข้ องวิธีทดสอบเชงิ ปริมาณ 64
การตรวจสอบความใช้ไดข้ องวธิ ที ดสอบเชงิ คณุ ภาพ 65
การทวนสอบวธิ ีทดสอบในกรณีท่ีปฏบิ ัตติ ามวิธีมาตรฐาน 66
(Standard method) 68
69
บทที่ 6 การหาค่าความไม่แน่นอนทางจุลชีววทิ ยา
การประมาณค่าความไม่แนน่ อนของการทดสอบจลุ ชีววิทยา 70
71
บทท่ี 7 การสอบเทียบและทวนสอบเครอื่ งมือทางจลุ ชีววทิ ยา 74
ความหมายของการสอบเทยี บ 75
นยิ ามศัพท์ทเ่ี กี่ยวขอ้ งกับการสอบเทียบ 79
แนวปฏบิ ัตสิ ำหรบั การสอบเทียบ 80
แนวทางการประเมินผลการสอบเทยี บ 81
88
บทท่ี 8 ความปลอดภัยในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทางจลุ ชีววทิ ยา 88
ระดบั ความปลอดภยั ทางชีวภาพ 91
การจดั การความปลอดภัยในห้องปฏบิ ัติการทางชวี ภาพ 100
การครอบครองและการขนย้ายเชอื้ จลุ นิ ทรยี ์ 104

บรรณานกุ รม

สารบัญตาราง (5)

ตาราง หนา้

1 การควบคมุ คุณภาพสถานที่และสภาวะแวดลอ้ มทางจลุ ชีววทิ ยา 37
2 การแปรผลการทดสอบผลการยับยงั้ เช้อื (Test for inhibitory residues) 46
3 คณุ สมบัตทิ างชวี เคมขี องเช้ือจุลนิ ทรียอ์ า้ งองิ บางชนดิ 51
4 การทดสอบประสิทธภิ าพอาหารเลีย้ งเชอื้ โดยใช้จลุ นิ ทรีย์อ้างอิง 58
5 ระยะเวลาการเก็บรกั ษาอาหารเล้ยี งเช้อื ท่เี ตรยี มแล้ว 60
6 คุณภาพนำ้ ท่ใี ช้ในการทดสอบทางจลุ ชีววิทยา 61
7 ตัวอยา่ ง Positive / Negative Control Culture 62
8 คา่ Clim 73
9 ปริมาตรและเกณฑ์ความผิดพลาดของ Volumetric Flasks 84
10 ปรมิ าตรและเกณฑค์ วามผิดพลาดของ for Cylinder 85
11 ปรมิ าตรและเกณฑค์ วามผิดพลาดของ Graduated Pipettes 85
12 ปริมาตรและเกณฑค์ วามผดิ พลาดของ Volumetric Pipettes 86
13 คา่ ความผิดพลาดสงู สดุ สำหรับไมโครปเิ ปต 87
14 ระดบั ความปลอดภัยทางชีวภาพท่แี บ่งตามความเสีย่ งของประเภท 88

จุลนิ ทรีย์ 93
15 ชนดิ ต้ปู ลอดเชื้อ 97
16 สารเคมที ใ่ี ช้ในการควบคุมจุลนิ ทรยี ์

สารบัญภาพ (6)

ภาพ หน้า

1 เข็มเข่ียเชื้อปลายตรง (Inoculating Needle) และหว่ งเขีย่ เชื้อ 4
(Inoculating Loop)
5
2 ตะเกียงแอลกอฮอล์ 5
3 จานเพาะเช้อื ชนดิ แกว้ 6
4 หลอดทดลอง หรือหลอดเลย้ี งเชอื้ ชนิดตา่ ง ๆ 6
5 หลอดดกั ก๊าซ 7
6 ชดุ กรองแบคทีเรยี 8
7 อปุ กรณ์ทีใ่ ช้ในการดูดจา่ ยสารละลาย 9
8 หมอ้ น่งึ ฆ่าเชอื้ ภายใต้ความดันไอนำ้ (Autoclave) 9
9 ตบู้ ่มชนิดต่าง ๆ 10
10 ตู้อบความร้อน (Hot air oven) 11
11 หลกั การทำงานของตู้ปลอดเชอื้ Class II 12
12 ตู้ปลอดเชอ้ื และต้เู ขยี่ เชื้อ 13
13 เครอื่ งชง่ั ชนดิ ต่าง ๆ 14
14 เครอ่ื งวัดค่าความเปน็ กรด – ดา่ ง 14
15 อา่ งน้ำควบคุมอุณหภมู ิ (Water bath) ชนดิ ตา่ ง ๆ 15
16 ตเู้ ยน็ และตูแ้ ชแ่ ขง็ ชนิดต่าง ๆ 15
17 เครื่องนบั โคโลนี 16
18 เครื่องตปี ่ันตวั อย่างและอุปกรณ์ 17
19 กลอ้ งจุลทรรศน์แบบใช้แสงพรอ้ มระบบถา่ ยภาพดจิ ิตอล 19
20 ขนั้ ตอนการเพิ่มปริมาณจลุ ินทรยี บ์ ริสุทธ์ิ โดยเทคนิค Streak plate 20
21 ขน้ั ตอนการคดั แยกจลุ นิ ทรีย์ โดยเทคนิค Pour plate 21
22 ข้นั ตอนการคดั แยกจุลินทรีย์บริสทุ ธิ์ โดยเทคนคิ Spread plate

ภาพ (7)

23 ขน้ั ตอนการถ่ายเช้ือจากอาหารวุน้ เอียงหลอดท่ี 1 ไปยังอาหารวนุ้ หน้า
เอยี งหลอดที่ 2
22
24 ขั้นตอนการเทอาหารเลยี้ งเช้อื ใสใ่ นจานอาหาร
25 ขน้ั ตอนการเตรียมรอยเสมียร์ 23
26 ขั้นตอนการยอ้ มสีแบบแกรม 25
27 ป้ายบง่ ช้ตี วั อย่างของศนู ย์บริการวชิ าการด้านวทิ ยาศาสตร์และเทคโนโลยี 26
28
คณะวทิ ยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยแม่โจ้
28 Biological indicator spore strip (Bacillus astrophaeus) 40
29 Geobacillus stearothermophilus spore ampoule 42
30 ลักษณะเทอร์โมมเิ ตอร์ทใี่ ชว้ ัดอุณหภมู ใิ นตเู้ ยน็ หรือตแู้ ช่แขง็ 44
31 ตวั อย่าง triple packaging system สำหรบั เชือ้ จลุ นิ ทรีย์ 102
32 ตัวอย่างการบรรจุสำหรับการขนย้ายระหว่างห้องปฏิบัติการภายใน 103

หน่วยงาน

บทท่ี 1
บทนำ

ศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้
มีภารกิจหลายด้าน และหน่ึงในภารกิจที่สำคัญ คือ การให้บริการเครื่องมือวิทยาศาสตร์ และการ
ให้บริการวิเคราะห์ทดสอบผลิตภัณฑ์อาหาร และสินค้าทางการเกษตรแก่ท้ังหน่วยงานภายในและ
ภายนอกคณะ นอกจากน้ียังทำหน้าท่ีเป็นหน่วยสนับสนุนการเรียนการสอนของคณะ และมหาวิทยาลัย
โดยมีให้บริการเคร่ืองมือวิทยาศาสตร์เพื่อสนับสนุนงานวิจัย การศึกษาด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
ของบุคลากรภายในมหาวิทยาลัยและผู้ท่ีสนใจ โดยมีบุคลากรและเคร่ืองมือท่ีมีประสิทธิภาพอย่างพร้อม
เพรียงในด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี และพร้อมที่จะถ่ายทอดให้แก่ผู้ท่ีสนใจทุกระดับ รวมทั้งการผลิต
งานวจิ ัยทม่ี กี ารค้นคว้า เพอ่ื พฒั นาประสิทธภิ าพของการวิเคราะห์ และการพฒั นาผลติ ภัณฑ์

ปัจจุบันศูนยบ์ ริการวิชาการด้านวทิ ยาศาสตร์และเทคโนโลยี ได้มีการดำเนินงานตามมาตรฐาน
หอ้ งปฏิบัติการต่าง ๆ เช่น มาตรฐานห้องปฏบิ ตั ิการ ISO/IEC 17025: 2017 มาตรฐานความปลอดภัย
ในห้องปฏิบัติการ ESPReL Checklist และกฎหมายต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการดำเนินงานของ
ห้องปฏิบัตกิ าร ท้ังนีไ้ ด้เปิดโอกาสให้นักศึกษาเข้ามาฝึกฝน เรยี นรเู้ กี่ยวกบั การทำงานวเิ คราะห์ทดสอบ
ด้านต่าง ๆ รวมถึงการฝึกฝนทักษะในการใช้เครื่องมือวิทยาศาสตร์ ผ่านการเข้าฝึกงาน การฝึกอบรม
เชิงปฏิบัติการ และการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี รวมทั้งเป็นแหล่งเรียนรู้ด้าน
ห้องปฏบิ ัตกิ ารใหแ้ ก่บุคลากรทั้งภายในและภายนอกของมหาวิทยาลัย

ดังน้ันเพ่ือให้การดำเนินงานเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพ ถูกต้อง เหมาะสม ซ่ึงก่อให้เกิดความ
ถูกต้อง แม่นยำในเครื่องมือวิทยาศาสตร์และผลการวิเคราะห์ทดสอบ เสริมสร้างความเช่ือม่ันให้แก่
ผู้รับบริการ และมีการดำเนินงานในภารกิจต่าง ๆ เป็นไปตามมาตรฐานห้องปฏิบัติการด้านจุลชีววิทยา
จึงได้จัดทำ “คู่มือการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของอาหารและน้ำ” ข้ึน เพื่อให้นักวิทยาศาสตร์ นักวิจัย
คณาจารย์ นักศึกษา และผู้ที่สนใจในงานด้านจุลชีววิทยา สามารถใช้เป็นแนวทางปฏิบัติในการดำเนินงาน
ต่อไปได้

วตั ถุประสงค์ของคมู่ ือปฏบิ ตั ิงาน

1. เพอ่ื ใช้เป็นแนวทางปฏิบัติของบุคลากรและผใู้ ช้บริการห้องปฏิบตั ิการศูนย์บริการวิชาการ
ดา้ นวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั แมโ่ จ้

2

2. เพื่อใชเ้ ป็นคูม่ ือการปฏบิ ัติงานของนักศึกษา นกั ศึกษาฝกึ งาน นักวิจัย คณาจารย์ และผทู้ ่ี
เข้ามาใช้บริการเครื่องมือทางจุลชวี วิทยา ของห้องปฏิบัติการศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และ
เทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั แม่โจ้

3. เพ่ือเป็นแนวทางให้ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาของหน่วยงานอ่ืน ทั้งภายในและภายนอก
มหาวทิ ยาลัย นำไปประยกุ ต์ใช้ไดอ้ ย่างเหมาะสม

ประโยชน์ทีค่ าดวา่ จะไดร้ บั จากคู่มือปฏิบัติงาน

1. ผปู้ ฏิบัตงิ าน หรือผู้ท่ีสนใจ สามารถเข้าใจระบบมาตรฐานห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา
และเลอื กใช้วิธีการทดสอบและเครือ่ งมือได้อย่างเหมาะสม ถูกต้องตามหลักทางวิชาการ และกฎหมาย

2. ได้ผลการวิเคราะห์ทดสอบท่ีถูกต้อง แม่นยำ สามารถสร้างความเช่ือม่ันแก่ผู้ปฏิบัติงาน
และผูร้ บั บรกิ าร

3. รองรับ การดำเนิ น งาน ตามมาตรฐาน ห้ องป ฏิ บั ติ การ ISO/IEC 17025: 2017
ด้านจุลชวี วทิ ยาของหนว่ ยงาน

4. ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาของหน่วยงานอื่น ท้ังภายในและภายนอกมหาวิทยาลัย
สามารถนำไปประยกุ ต์ใชใ้ ห้เหมาะสม

ขอบเขตของคูม่ ือปฏบิ ตั ิงาน

“ค่มู ือการปฏิบัติงานดา้ นมาตรฐานหอ้ งปฏบิ ัติการ สำหรับหอ้ งปฏิบัตกิ ารจลุ ชีววิทยา” เลม่ น้ี
เป็นคู่มือการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา เพื่อใช้เป็นคู่มือการปฏิบัติงานเบ้ืองต้นในการเลือกและ
ดำเนนิ งานได้อยา่ งเหมาะสม และมีความถกู ตอ้ ง ซง่ึ ครอบคลมุ เน้อื หาหัวข้อตา่ ง ๆ ดงั นี้

ทัง้ นี้สามารถแบง่ เนอ้ื หาได้ ดังน้ี
1. ความร้ทู ว่ั ไปในปฏบิ ัติการทางจลุ ชวี วิทยา
2. แนวทางการปฏิบัติงานด้านจุลชีววิทยา ตามระบบมาตรฐานห้องปฏิบัติการ ISO/IEC
17025: 2005 ได้แก่ การจัดการตัวอย่างทดสอบเพื่อการวิเคราะห์ทดสอบ การควบคุมคุณภาพ การ
ตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ การหาค่าความไม่แน่นอนและการสอบเทียบและทวนสอบ
เครื่องมือ
3. การจดั การห้องปฏบิ ตั กิ ารตามพระราชบัญญัติเช้ือโรคและพษิ จากสตั ว์ พ.ศ. 2560
นอกจากนี้ยังได้รวบรวม กฎหมายที่เกี่ยวข้องกับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาซึ่งสามารถใช้
เป็นแนวทางในการปฏิบัติงานของผู้ที่เกี่ยวข้องได้

บทที่ 2
ความรูท้ ่ัวไปในปฏบิ ตั กิ ารทางจุลชีววิทยา

หลกั ปฏิบตั ใิ นการใชห้ ้องปฏิบตั ิการทางจลุ ชีววิทยา

การปฏิบัติการทางจลุ ชีววิทยาตอ้ งอาศัยหลัก “ปลอดภัยไว้ก่อน (safety first)” เช่นเดียวกับ
การปฏิบัติงานอ่ืนๆ แต่จะต้องเน้นเรื่องความสะอาดและปลอดภัยจากเชื้อจุลินทรีย์ ซึ่งสรุปเป็น
แนวทางปฏิบตั ไิ ด้ดงั น้ี

1. ควรสวมเสื้อคลุมกันเปื้อนสีขาว (เสื้อกราวน์) ทกุ ครง้ั เมอื่ เข้าปฏบิ ตั ิการ
2. ไมน่ ำวัสดุอปุ กรณท์ ีไ่ มจ่ ำเป็น เช่น กระเป๋า หรืออื่น ๆ มาวางไว้ในบริเวณทท่ี ำปฏบิ ตั กิ าร
3. ทำความสะอาดโต๊ะปฏิบัติการ และเช็ดด้วยเอธิลแอลกอฮอล์เข้มขน้ รอ้ ยละ 70 ท้ังก่อน
และหลังปฏิบตั ิการ
4. ล้างมือให้สะอาดด้วยสบู่ และเช็ดมือด้วยเอธิลแอลกอฮอล์เข้มข้น ร้อยละ 70 ก่อนและ
หลงั ปฏิบัตกิ ารทกุ ครัง้
5. ฆ่าเชื้อที่เข็มเขี่ย (needle) หรือห่วงเขี่ยเช้ือ (loop) ก่อนและหลังการเข่ียเชื้อทุกคร้ัง
โดยการเผาไฟบริเวณปลายอุปกรณ์ดังกล่าวให้ร้อนแดงก่อน แล้วเผาเรื่อยมาจนร้อนแดงตลอดความ
ยาวของเส้นลวด และควรเผาให้เลยข้ึนมาถึงด้ามอีกเล็กน้อย ระวังอย่าให้มีเช้ือเหลือติดอยู่บนปลาย
เส้นลวดของอุปกรณ์ดังกล่าวมากเกินไป เพราะเชื้อจะกระเด็นเป้ือนระหว่างการเผา และห้ามวางเข็ม
หรอื หว่ งเขี่ยเช้ือบนพ้ืนโต๊ะปฏบิ ัตกิ าร ควรจดั หาภาชนะสำหรบั ใส่หรอื วาง
6. ใหท้ ้งิ อปุ กรณ์ทปี่ นเปือ้ นเชอ้ื ทุกชนิดในภาชนะที่มนี ้ำยาฆ่าเชือ้
7. ควรเขี่ยเชอ้ื ในบรเิ วณทไ่ี ม่มีลมพดั
8. ถ้าเช้ือหก หรือภาชนะแตกให้รีบกำจัดเช้ือ โดยเทน้ำยาฆ่าเชื้อ แล้วเช็ดออก จากน้ันเช็ด
บริเวณรอบ ๆ ดว้ ยน้ำยาฆ่าเช้อื ด้วยความระมัดระวังและต้องแจง้ ให้เจา้ หน้าทป่ี ระจำห้องปฏิบัตกิ ารทราบ
9. ห้ามนำเชื้อจุลินทรีย์ออกนอกห้องปฏิบัติการ ก่อนได้รับอนุญาตจากเจ้าหน้าที่ประจำ
หอ้ งปฏบิ ตั กิ าร โดยเดด็ ขาด
10. ห้ามใช้ปากหรือลิ้น อม เลีย วัตถุต่างๆ เช่น ปากกา ไม้บรรทัด บุหรี่ ฯลฯ และห้ามด่ืม
หรือรับประทานอาหารหรือสิ่งใดๆ ในห้องปฏิบัติการโดยเด็ดขาด และหลีกเล่ียงการกระทำใดๆ ซ่ึง
อาจทำใหเ้ กดิ การตดิ เช้ือเข้าสู่ร่างกายได้
11. หลอดอาหารหรือจานเพาะเช้ือที่ปลูกเช้ือแล้ว ก่อนนำไปบ่มจะต้องเขียนบันทึก
รายละเอียดท่ีจำเป็นด้วยปากกาหรือดินสอเขียนแก้วไว้บนอุปกรณ์ดังกล่าว หรืออาจเขียนไว้บน

4

แผ่นกระดาษ แล้ววางหรือติดไว้บนอุปกรณ์ดังกล่าว ให้ชัดเจน โดย รายละเอียดที่บันทึก ได้แก่ รหัส
เช้ือ (code number) หรือช่ือเช้ือ อาหารท่ีใช้ทดสอบ อุณหภูมิที่ใช้ วันเดือนปีที่ปลูกเชื้อ วันสิ้นสุด
การทดลอง ผู้ดำเนินการทดลอง เป็นต้น นอกจากนี้อาจระบุหมายเหตุท่ีควรระมัดระวัง เช่น ห้าม
เคลือ่ นยา้ ย หา้ มเปล่ียนอุณหภูมิ หา้ มเขยา่ เปน็ ต้น

12. เช็ดและทำความสะอาดเคร่ืองมือ/อุปกรณ์ท่ีใช้ในห้องปฏิบัติการอย่างสม่ำเสมอ และใช้
วธิ ีการทีถ่ กู ต้องและเหมาะสม

13. ลงบันทึกการใช้งานเครื่องมือ (log book) ทุกเครื่อง และลงบันทึกการเข้า – ออก
หอ้ งปฏบิ ัติการทุกครงั้ และปฏิบตั ติ ามคำแนะนำหรอื กฎระเบยี บของห้องปฏบิ ตั กิ ารอยา่ งเคร่งครัด

14. การท้ิงเศษอาหารท่ีเป็นวุ้น ควรใส่ในถุงพลาสติกแล้วนำไปท้ิงในถังขยะที่จัดให้ ห้ามทิ้ง
เศษอาหารวนุ้ ลงในอา่ งนำ้ โดยเดด็ ขาด

15. เคร่ืองแก้วท่ีบรรจุอาหารเล้ียงเชื้อซึ่งใช้ทดสอบแล้ว ต้องนำไปรวมไว้ในตะกร้าท่ีจัดให้
และควรรอนำไปฆ่าเชื้อพร้อมๆ กัน หากมีเคร่ืองแก้วที่แตกเสียหาย ควรแยกทิ้งในถังขยะท่ีจัดไว้ให้
โดยเฉพาะ และเมือ่ เกดิ การเสยี หายจะตอ้ งรบี แจ้งให้เจ้าหน้าทป่ี ระจำห้องปฏิบัติการ

แนะนำการใชอ้ ุปกรณแ์ ละเคร่อื งมือพน้ื ฐานทางจุลชีววิทยา

1. หว่ งเข่ียเชือ้ และเขม็ เข่ียเชอ้ื (Inoculating loop and needle)
ทั้งสองชนิดน้ีเป็นเครื่องมือท่ีใช้สำหรับการถ่ายเชื้อแบคทีเรียจากภาชนะหน่ึงไปใส่ใน

ภาชนะหน่ึง ทำด้วยลวดที่เป็นตัวนำความร้อนที่ดี เช่น nichrome หรือ platinum มีด้ามถือท่ีเป็น
วสั ดุท่ีไม่นำความร้อน ห่วงเข่ียเชื้อมีลักษณะเปน็ เส้นลวดมีปลายขดเป็นวงกลมขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง
ประมาณ 4 มิลลเิ มตร สว่ นเขม็ เขยี่ เช้ือน้นั ปลายเหยียดตรง เมอ่ื เวลาจะใชเ้ ครอ่ื งมือท้ังสองนี้จะต้องทำ
ให้ปราศจากเชอ้ื โดยการเผาจนกระท่ังลวดร้อนแดงและปลอ่ ยให้เย็นกอ่ นนำมาใช้

ก. ข.

ภาพ 1 เขม็ เข่ียเช้อื ปลายตรง (Inoculating Needle; ก.) และหว่ งเข่ียเช้ือ (Inoculating Loop; ข.)
2. ตะเกยี งแอลกอฮอล์
เป็นตะเกียงแบบที่ใช้แอลกอฮอล์เป็นเชื้อเพลิงเพ่ือให้ได้เปลวเพลิงเพ่ือให้ได้เปลวไฟ ใช้

ประโยชน์เช่นเดียวกับตะเกียงก๊าซในกรณีที่ห้องปฏิบัติการนั้นไม่มีก๊าซ เปลวไฟจากตะเกียงแอลกอฮอล์
ร้อนน้อยกวา่ ตะเกยี งก๊าซ จงึ ตอ้ งใชเ้ วลานานกว่าในการเผาเพื่อให้ปราศจากเช้ือ

5

ภาพ 2 ตะเกียงแอลกอฮอล์
3.จานเพาะเชื้อ (Petri dish)
มลี กั ษณะคล้ายจานทรงกระบอกแบบตนื้ 2 ใบ สวมประกบกันสนทิ โดยปกติทำด้วยแก้ว

หรือพลาสติกที่ทนความร้อน ใช้สำหรับอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง (agar) ทำให้มีบริเวณผิวหน้า
(surface area) กวา้ งเหมาะในการแยกเชื้อแบคทเี รียจากตวั อยา่ งส่งตรวจโดยทว่ั ไป

ภาพ 3 จานเพาะเชื้อชนดิ แก้ว
4. หลอดทดลอง (Test tube) หรอื หลอดเล้ียงเช้ือ (Culture tube)
ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาจำเป็นต้องใช้หลอดทดลองขนาดต่างๆ จำนวนมากเพื่อใช้

ใส่อาหารเลี้ยงเช้ือจุลินทรีย์ หลอดทดลองที่ใช้มีท้ังแบบปิดด้วยจุกเกลียว และแบบธรรมดาซ่ึงใช้สำลี
อุดเป็นจุกแล้วแต่ประเภทของอาหารที่จะใส่ในหลอดน้ัน อาหารเล้ียงเชอ้ื ที่บรรจุในหลอดทดลองมีท้ัง
ชนิดท่ีเป็นอาหารแข็ง และอาหารเหลว เมื่อบรรจุอาหารในหลอดทดลองแล้วจะต้องมีจุกปิดปาก
หลอดไวเ้ พ่อื ปอ้ งกันไม่ให้เช้อื จลุ ินทรยี ์อื่นปนเปื้อน

6

ก. ข.
ภาพ 4 หลอดทดลอง หรือหลอดเล้ียงเชือ้ ชนิดตา่ ง ๆ

ก. หลอดทดลองแบบปดิ ด้วยจกุ เกลียว
ข. หลอดทดลองแบบปดิ ดว้ ยจกุ หรอื สำลี

5. หลอดดักกา๊ ซ (Durham tube)
เปน็ หลอดขนาดเลก็ ประมาณ 5 x 50 มลิ ลิเมตร ใช้คว่ำลงในหลอดทดลองทบ่ี รรจุอาหาร

เลี้ยงเชื้อท่ีต้องการ โดยกา๊ ซที่เกดิ ขึน้ จากกระบวนการเมตาบอลิซึมเปน็ ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2)
จะลอยขึน้ ทำให้มกี า๊ ซจำนวนหน่งึ ดนั ไล่ที่ของของเหลวแล้วถูกขังอยู่ที่ก้นหลอด

ก. ข.
ภาพ 5 หลอดดกั ก๊าซ

ก. หลอดดักกา๊ ซ
ข. ลกั ษณะการดักกา๊ ซภายในหลอดดกั ก๊าซ
6. เคร่อื งกรองแบคทีเรยี (Bacteriological filter)
เคร่ืองกรองแบคทีเรีย ซึ่งจะมีแผ่นกรองแบคทีเรีย (Membrane filter) ซ่ึงแผ่นกรอง
เหล่าน้ีมีรูขนาดเล็กมาก (0.22-0.45 µm) แบคทีเรียไม่สามารถผ่านได้ แต่ไวรัสผ่านได้ ฉะน้ันสารท่ี
ผ่านการกรองแลว้ จะปราศจากแบคทีเรียและส่ิงมีชวี ติ อื่น ๆ ที่มขี นาดใหญก่ วา่ รูของกระดาษกรอง

7

ภาพ 6 ชุดกรองแบคทเี รยี

7. ปิเปตและไมโครปิเปต (Pipette and Micropipette)
เป็นอุปกรณท์ ี่มีความละเอียดและถูกตอ้ งสูงมาก สำหรับตวงของเหลวปรมิ าตรน้อยๆ มี

หลายชนิด คอื
7.1. แบบกระเปาะ (Transfering Pipette) ใชส้ ำหรับตวงของเหลว โดยการตวงแต่ละ

คร้ัง จะได้ปริมาตรเท่ากับปริมาตรท่ีระบุไว้บนปิเปตแต่ละอัน บนปิเปตมีขีดบอกปริมาตรที่ด้านบน
ของกระเปาะเพียงขดี เดียว มีขนาดต้ังแต่ 2, 3, 5, 10, 20, 25, 50 มลิ ลลิ ติ ร

7.2. แบบมีสเกล (Measuring pipette) ใช้สำหรับตวงของเหลวปริมาตรต่างๆ ตามที่
ต้องการได้บนปิเปตมีสเกลแบง่ ย่อยบอกปริมาตร มีขนาดตง้ั แต่ 0.1, 0.2. 0.5, 1, 2, 5, 10 มลิ ลิลติ ร

7.3. ปิเปตอัตโนมัติ (Autopipette) ใช้สำหรับตวงของเหลวปริมาตรน้อยๆ สามารถ
ตวงของเหลวได้ในระดับไมโครลิตร(10 -6 ลิตร) สามารถปรับปริมาตรตามต้องการได้ใรช่วงปริมาตร
ต่างๆ ตามที่ระบุบนปิเปตแต่ละอัน ตั้งแต่ 0.1-2, 0.5-10, 2-20, 20-200, 100-1000 ไมโครลิตร
หรือ 1-5, 1-10 มิลลลิ ติ ร มคี วามละเอียดถูกตอ้ งสงู จงึ นิยมใช้งานวิจัยระดับสงู

การถ่ายเชื้อในสภาพของเหลวหรือสารละลายจำนวนมากจากหลอดทดลอง จำเป็นต้อง
ใช้ปิเปต ในทางจุลชีววิทยาปิเปตที่ใช้มักจะอุดปลายด้านที่สำหรับดูดไว้กรองเช้ือไม่ให้ผ่านอีกช้ันหนึ่ง
และต้องผ่านการอบฆ่าเช้ือแล้ว โดยใส่ไว้ในกระบอกเหล็กเท่าน้ัน ปิเปตที่หยิบออกมาลนไฟที่ปลายปิ
เปตจนถงึ บริเวณทีจ่ ะสมุ่ ในสารละลาย และปลายปเิ ปตหา้ มสัมผัสกบั สงิ่ ใดกอ่ นการดดู สารละลาย

8

ก. ข.

ค. ง.

ภาพ 7 อุปกรณ์ที่ใชใ้ นการดูดจา่ ยสารละลาย
ก. ปิเปต
ข. ไมโครปิเปต
ค. ลูกยางปเิ ปต
ง. Autopipette

8. หม้อนึ่งฆ่าเช้ือภายใตค้ วามดันไอน้ำ (Autoclave)
เป็นเครื่องมือท่ีใช้ในการฆ่าเช้ือจุลินทรีย์ทุกชนิด เป็นวิธีที่นิยมใช้กันมาก ซ่ึงสามารถฆ่า

เช้ือได้โดยอาศัยความร้อนจากไอน้ำเดือดภายใต้ความดัน ลักษณะของเคร่ืองเป็นภาชนะโลหะรูป
สี่เหลี่ยมหรือรูปทรงกระบอกมีฝาปิดที่แข็งแรง ภายในมีชอ่ งว่าง สำหรบั บรรจุส่ิงของที่ตอ้ งการฆ่าเช้ือ
ในลักษณะเช่นเดียวกับการนึง่ ด้านล่างมีช่องวา่ งสำหรับบรรจุน้ำ ซงึ่ เม่ือต้มให้เดือดจะกลายเป็นไออัด
แนน่ อยู่ภายใน มีอุณหภมู ิสูงถึง 121 องศาเซลเซียส ภายใต้ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิว้ ตามปกติ
ถ้าวัตถุอยู่ภายในสภาพน้ีนาน 10 - 15 นาที จะปราศจากสง่ิ มชี ีวติ ทุกอยา่ ง (sterile) เครอ่ื งมอื น้ีใชก้ ัน
มากในการเตรียมอาหารเลี้ยงเช้ือ และฆ่าเช้ือจากจานอาหาร หลอดทดลอง ตลอดจนใช้ทำให้
เครือ่ งมอื เคร่อื งใชป้ ราศจากเชอื้ จุลินทรีย์

9

ภาพ 8 หม้อนงึ่ ฆ่าเชอื้ ภายใต้ความดันไอน้ำ (Autoclave)
9. ต้บู ่มเชือ้ (Incubator)
เป็นเครื่องมือท่ีมีความเสถียรของอุณหภูมิสูง และมีความเป็นหน่ึงเดียวของอุณหภูมิในช่วง

อุณหภูมิที่ใช้ในการปฏิบัติงาน มีแหล่งทำความร้อนอยู่ในตัวเครื่อง มีแผงควบคุมการทำงานและแสดง
อณุ หภูมิภายในอยู่ด้านหนา้ ของเครื่อง มกี ารตดิ ตง้ั ประตูชั้นในทำด้วยวสั ดใุ ส สามารถมองเห็นภายในตู้ได้
อย่างชัดเจนโดยไม่ทำใหอ้ ุณหภูมภิ ายในตู้เกดิ การแปรผัน

ก. ข. ค.
ภาพ 9 ตบู้ ม่ ชนดิ ตา่ ง ๆ

ก. ตู้บม่ แบบธรรมดา (Incubator)
ข. ตู้เพาะเล้ยี งภายใตส้ ภาวะท่ีมีคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2 Incubator)
ค. ตู้บ่มแบบอุณหภมู ติ ำ่ (Refrigerated Incubator)

10

10. ต้อู บความร้อน (Hot air oven)
เปน็ ตู้อบฆ่าเช้อื โดยใช้ความรอ้ นแห้งที่อณุ หภูมิสูงมาก เช่น อุณหภูมิ 170 องศาเซลเซยี ส

นาน 2 ช่วั โมง เป็นต้น เคร่อื งมอื แบบน้ีเหมาะสำหรบั การทำลายเชื้อจากวตั ถสุ ง่ิ ของท่ีทนความร้อน ไม่
เสื่อมสลายเมื่อสัมผัสกับความร้อนสูงโดยตรง เช่น เครื่องแก้วต่างๆ เพื่อทำให้ปราศจากเช้ือก่อนที่จะ
นำมาใช้ในการทดลองทางจุลชวี วิทยา

ภาพ 10 ตอู้ บความรอ้ น (Hot air oven)

11. ตู้ปลอดเช้ือ (Biological safety cabinet: BSC) และตูเ้ ขี่ยเชือ้ (Laminar flow clean bench)
ตู้ปลอดเช้ือ หรือตู้ไบโอฮาซาร์ด (Biohazard cabinet) สามารถแบ่งเป็น 3 ประเภท

ขึ้นอยู่กับขอบข่ายการใช้งานและความสามารถในการป้องกันผู้ปฏิบัติงาน ตัวอย่าง และส่ิงแวดล้อม
โดยทั่วไปห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาท่ัวไป จะใช้ตู้ปลอดเช้ือชนิด Class I หรือ II ซ่ึงมีหลักการทำงาน
เบ้อื งต้นคลา้ ยกัน ในที่น้ีจะขอกลา่ วถงึ เฉพาะต้ปู ลอดเช้อื ชนดิ Class II เทา่ นัน้

หลักการทำงานของตู้ปลอดเช้ือ Class II คือ อากาศจากภายนอกถูกดูดเข้าไปในเครื่อง
ผา่ นรูตระแกรงดา้ นหนา้ โดยไมผ่ า่ นพน้ื ที่ทำงานด้านใน เข้าไปดา้ นหลังเคร่อื งและถูกกรองโดย HEPA
Filter ท่ีด้านบนของเคร่ืองให้เป็นอากาศสะอาด ไหลลงมาภายในพ้ืนที่ทำงาน การหมุนเวียนของ
อากาศลักษณะนี้ทำให้ตัวอย่างหรืองานที่กำลังทำอยู่ปลอดจากสิ่งปนเป้ือนภายนอก ซึ่งส่วนใหญ่
ทิศทางของอากาศจะเป็นแนวด่ิงว่ิงผ่านจากด้านบนของพ้ืนที่ทำงานลงมาด้านล่าง อากาศท่ีวิ่งผ่าน
พ้ืนที่ทำงานแล้วจะกระจายออกเป็นสองส่วนว่ิงตรงไปท่ีรูตระแกรงด้านหน้าและหลังเคร่ือง โดยไม่มี
ส่วนท่เี ล็ดรอดออกมาทำอันตรายต่อผู้ปฏิบตั ิงานได้เลย ทำใหผ้ ู้ปฏิบัติงานจะได้รับการป้องกันจากงาน
ท่ีเป็นอันตรายต่างๆ เน่ืองจากอากาศจากภายนอกจะถูกดูดผ่านเข้าไปในพ้ืนที่ทำงาน ทำให้สิ่ง
อันตรายเหล่าน้นั ไม่สามารถวง่ิ สวนทางออกมาทำอันตรายกบั ผปู้ ฏบิ ัติงานได้

11

ตู้ปลอดเชื้อชนิดนี้เป็นท่ีนิยมและใช้งานอย่างแพร่หลาย เน่ืองจากความสามารถในการ
ป้องกันท่ีครอบคลุมต้ังแต่ ผู้ปฏิบัติงาน ผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อม เหมาะสำหรับงานที่เก่ียวข้องใน
ระดับ Biosafety Level 1, 2 และ 3

ภาพ 11 หลกั การทำงานของตูป้ ลอดเชอ้ื Class II
ที่มา: บรษิ ทั อีสส์โกไทย เทคโนโลยี จำกัด (2555)

ในขณะท่ีตู้เข่ียเชื้อหรือตู้ลามินาร์ (Laminar Flow Clean Bench) เป็นตู้ปลอดเช้ือที่มี
การใช้แผ่นกรอง HEPA Filter (High Efficiency Particulate Air Filter) เพ่ือกรองเช้ือโรค ส่ิง
ปนเป้ือน รวมทั้งฝุ่นละอองต่างๆ โดยมีจุดประสงค์หลักคือป้องกันตัวอย่างหรืองานที่ทำภายในพื้นท่ี
ทำงานจากการเกิด Cross Contamination จากส่ิงปนเปื้อนภายนอก

หลักการทำงานเบ้ืองต้นของ Laminar Flow Clean Bench คือ อากาศสกปรกภายใน
ห้องที่ใช้งานถูกดูดผ่านเข้าไปในตู้ลามินารโ์ ดยไม่ผ่านพ้ืนที่ทำงานภายในตู้ อากาศสกปรกวิ่งผ่านแผ่น
กรอง HEPA Filter ถูกกรองกลายเป็นอากาศสะอาด และถูกสง่ ผ่านมายงั บริเวณพื้นทีท่ ำงานภายในตู้
และอากาศสะอาดในบริเวณพ้ืนท่ีทำงาน จะเคล่ือนที่ผ่านงานที่เรากำลังทำและถูกพัดออกมาทาง
ด้านหนา้ ของเคร่ืองในที่สดุ

12

ก.

ข.

ภาพ 12 ตู้ปลอดเชือ้ และตู้เขย่ี เช้ือ
ก. ตปู้ ลอดเชื้อ Class II
ข. ตเู้ ขี่ยเชือ้

12. เครอ่ื งชงั่ ไฟฟ้า
เคร่ืองช่ัง เป็นเครื่องมือพ้ืนฐานท่ีมีใช้ในห้องปฏิบัติการทางวิทยาศาสตร์ ในการชั่ง

สารเคมี หรือสิ่งท่ีต้องการตรวจวิเคราะห์ มีความละเอียดถูกต้องสูง สามารถแสดงค่าเป็นตัวเลขได้
ทันที เคร่ืองช่ังแต่ละรุ่นจะมีความสามารถในการรับน้ำหนักสูงสุด (capability) และความไว
(sensitivity) ต่างกัน ดังน้ันต้องเลอื กใช้ให้เหมาะสมกับน้ำหนักของสารท่ีชง่ั โดยแบง่ ออกเป็น 2 ชนิด
ได้แก่

13

12.1. Top - loading Balance เป็นเครื่องชัง่ ท่ีมีความละเอียดในระดับ 0.1 - 0.001 กรัม
12.2. Electronic Analytical Balance มีความละเอียดสูงมาก บางรุ่นมีความละเอียดใน
ระดับ 0.0001 กรัม จนถึงในระดับไมโครกรัม (0.000001 กรมั ) ใช้ในงานวิเคราะห์ที่ต้องการความถูก
มาก มีความไวสูง ต้องเก็บในห้องที่มีการควบคุมอุณหภูมิ และไม่มีลมพัดผ่าน โดยทั่วไปจะมีกระจก
ครอบกันลมขณะช่งั
เน่ืองจากเคร่ืองช่ังมีความไวสูงมากเพ่ือให้ผลที่ได้เป็นค่าที่ถูกต้องมากท่ีสุด การจัดวางเครื่อง
ช่ังจึงต้องวางในแนวระนาบ โดยการปรับความสูงของขาใต้ฐานเคร่ืองชั่งจนกระทั่งลูกน้ำอยู่ใน
ตำแหนง่ ตรงกลางพอดี

ก. ข.
ภาพ 13 เครือ่ งช่ังชนดิ ตา่ ง ๆ

ก. เครอ่ื งชัง่ แบบ Top - loading Balance
ข. เครอ่ื งชงั่ แบบ Electronic Analytical Balance

13. เคร่อื งวัดคา่ ความเปน็ กรด – ดา่ ง
เครอื่ งวัดค่าความเป็นกรด – ด่าง หรือ pH meter เป็นเครื่องมือที่สามารถบอกค่าความ

เป็นกรด – ด่างท่ีมีความถูกต้อง แมน่ ยำ มากกวา่ การใช้กระดาษลิตมัส และกระดาษวดั คา่ pH เคร่ือง
pH meter มีหลายแบบ เช่น แบบปากกาหรือแบบมือถือ (hand held pH meter) ซ่ึงจะเหมาะกับ
งานในภาคสนามท่ีไม่ต้องการความถูกต้องมากนัก ในขณะท่ีแบบต้ังโต๊ะ จะมีความถูกต้องมากกว่า
แบบปากกา เนื่องจากสามารถวัดคา่ ได้ถึงทศนยิ มตำแหน่งที่ 2 หรือ 3

14

ภาพ 14 เคร่ืองวัดคา่ ความเปน็ กรด – ดา่ ง
14. อ่างนำ้ ควบคมุ อณุ หภมู ิ (Water bath)
เป็นอ่างน้ำที่ปรับอุณหภูมิได้ตามความต้องการ สามารถใช้บ่มเพาะเชื้อได้ในกรณีท่ีเลี้ยง

เชื้อในอาหารเหลวหรือในหลอดทดลอง และใช้ในการเตรียมอาหารเล้ียงเชื้อ หรืออุ่นอาหารเล้ียงเชื้อ
ให้มอี ณุ หภมู เิ หมาะสมสำหรบั การทดลอง

ก.

ข.
ภาพ 15 อ่างน้ำควบคมุ อุณหภูมิ (Water bath) ชนดิ ต่าง ๆ

ก. อ่างนำ้ ควบคุมอุณหภูมแิ บบธรรมดา
ข. อา่ งน้ำควบคุมอณุ หภมู ิแบบเขยา่ ได้

15

15. ต้เู ยน็ และตู้แช่แขง็ (Refrigerator and Freezer)
ใช้ในการเก็บอาหารเล้ียงเช้ือท่ียังไม่ต้องการใช้ ตลอดจนสารเคมีและน้ำยาท่ีจำเป็นต้อง

เก็บรักษาในอุณหภูมิต่ำๆ เช่น ยาปฏิชีวนะ พลาสมา เลือด และสารเคมีอื่นๆ รวมทั้งกรณีที่ต้องการ
เก็บรักษาจุลินทรีย์ไว้เป็นเวลานานๆ โดยไม่ต้องการให้แบ่งตัวเพิ่มจำนวนมากอาจเก็บไว้ในตู้เย็นได้
เช่นเดียวกัน ยกเว้นเชื้อบางชนิดทตี่ ายได้ง่ายท่อี ุณหภมู ติ ่ำ ๆ

ก. ข. ค. ง.

ภาพ 16 ตูเ้ ย็นและต้แู ช่แขง็ ชนดิ ตา่ ง ๆ
ก. ต้เู ยน็ แบบมชี ่องแชแ่ ขง็
ข. ต้เู ย็นธรรมดา
ค. ตแู้ ชแ่ ขง็ แบบแนวตง้ั
ง. ตู้แช่แข็ง แบบแนวนอน

16. เคร่ืองนบั โคโลนี
เป็นเคร่ืองที่สามารถทำการตรวจนับจำนวนโคโลนีของจุลินทรีย์ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ

ประเภทต่างๆ ทำให้การนับจำนวนโคโลนีน้ันรวดเร็ว สะดวกและถูกต้องมากข้ึนเหมาะสำหรับการ
ตรวจนบั โคโลนจำนวนมากในการวเิ คราะห์ทดสอบและงานวจิ ัย

ภาพ 17 เครอ่ื งนับโคโลนี

16

17. เครื่องตปี ่ันตวั อย่าง (Stomacher)
เป็นเครื่องที่สามารถตีบดตัวอย่างท่ีเป็นของแข็งผสมกับสารละลายท่ีใช้ในการเจือจาง

โดยเคร่ือง Stomacher จะมีแป้นตี (paddle) 2 แผ่น ซึ่งมีลักษณะโค้งรองรับกับตัวถุงทำหน้าที่ตีบด
ตัวอย่างซ่ึงบรรจุในถุง โดยมีมอเตอร์เป็นตัวขับเคล่ือน ทำให้ตัวอย่างไม่ถูกสัมผัสโดยตรง และไม่เกิด
ความเสียหายต่อเซลล์ หรือเนื้อเยื่อในตัวอย่าง เหมาะสำหรับท่ีจะใช้เมื่อต้องการตรวจวิเคราะห์
ตัวอย่างอาหารคร้ังละหลายๆ ตัวอย่าง เนื่องจากไม่ต้องเสียเวลาฆ่าเช้ือภาชนะสำหรับบรรจุอาหาร
สำหรับตีบดตัวอย่าง เนื่องจากถุงพลาสติกท่ีใช้กับเคร่ือง Stomacher น้ีจะผ่านการฆ่าเชื้อแล้วจาก
โรงงานผผู้ ลติ ในขนาดท่แี ตกต่างๆ กันออกไป

ก. ข.

ภาพ 18 เครื่องตีปนั่ ตวั อย่างและอปุ กรณ์
ก. เครอื่ งตปี ั่นตวั อยา่ ง
ข. ถุงสำหรบั ใสต่ ัวอย่าง

18. เทอรโ์ มมเิ ตอร์ (Thermometer)
เป็นอุปกรณ์ที่ใช้สำหรับวัดอุณหภูมิ โดยภายในแท่งแก้วจะมีกระเปาะบรรจุปรอท

สำหรับเป็นตัวชี้อุณหภูมิ มีหน่วยเป็นองศาเซลเซียส มีสเกลวัดอุณหภูมิได้ตั้งแต่ 0 - 100 องศา
เซลเซียส หรอื อาจวัดได้ในช่วง 50 - 220 องศาเซลเซียส หรือช่วงอ่ืนๆ ข้ึนกับบริษัทผู้ผลิต ดังนั้น จึง
ควรเลอื กใช้ใหเ้ หมาะสมกับชว่ งอุณหภมู ทิ ตี่ อ้ งการวัด

19. กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Light microscope)
กล้องจุลทรรศน์ เป็นเครื่องมือสำคัญของนักจุลชีววิทยา เพราะกล้องจุลทรรศน์ช่วยให้

ศึกษาโครงสร้างและส่วนประกอบของเซลล์และส่ิงมีชีวิตเล็กท่ีไม่สามารถเห็นได้ด้วยตาเปล่าได้ กล้อง

17

จุลทรรศน์ท่ัวไปสามารถขยายภาพได้ 10 - 1,000 เท่า โดยกล้องจุลทรรศน์ท่ีใช้ในห้องปฏิบัติการกัน
อย่างแพร่หลายเป็นแบบเชิงซ้อน (Compound light microscope) ท่ีใช้แสงและมีระบบเลนส์ที่ทำ
หน้าท่ีขยายภาพ 2 ชุด มีการขยายภาพ 2 คร้ัง กล้องจุลทรรศน์เชิงซ้อนมีหลายชนิด แต่ชนิดที่ใช้ใน
การส่องดูส่ิงต่าง ๆ ท่ัวไปเป็นชนิด bright field microscope เมื่อศึกษาด้วยกล้องชนิดนี้จะพบว่า
พืน้ ท่รี อบ ๆ ตวั อย่างจะสวา่ ง ส่วนตวั อยา่ งหรอื วตั ถุทน่ี ำมาสอ่ งจะดมู ืดทึบกว่า

ภาพ 19 กลอ้ งจลุ ทรรศน์แบบใชแ้ สงพร้อมระบบถ่ายภาพดิจิตอล

20. ชดุ ย้อมสี (Staining set)
โดยปกติจะประกอบด้วยขวดสีต่างๆ หลายชนิด สำหรับการย้อมสไลด์แบบ Gram’s

stain, Acid fast stain หรือ Simple stain อื่นๆ โดยมากนิยมใช้ขวดสีชาเพ่ือกันแสง เน่ืองจาก
สารเคมีหลายชนิดเปล่ียนสภาพไดง้ ่ายเมอ่ื ถูกแสงสว่าง

เทคนิคพืน้ ฐานทางจุลชีววิทยา
เทคนิค Streak plate
เทคนิค Streak plate เป็นวิธีการที่ใช้สำหรับการเตรียมจุลินทรีย์บริสุทธ์ิให้มีความพร้อม
ก่อนที่จะนำไปขยายในอาหารเหลว เพื่อใช้ในงานด้านต่างๆ ต่อไป โดยเป็นการลากเช้ือจุลินทรีย์บน
ผวิ หนา้ อาหารด้วย loop เพ่ือให้เชอ้ื เจริญตามแนวท่ีลาก เทคนิค streak ไว้แบ่งเปน็
1. การ streak เพื่อให้เช้ือจุลินทรีย์เจริญบนผิวหน้าอาหาร โดยการเผา loopให้แดงปล่อย
ใหเ้ ย็นในอากาศใช้ loop ไปเขี่ยเชื้อจากหลอดเช้ือมาลากลงบนผิวหนา้ อาหารหลอดที่เป็น slant ลาก
จากก้นหลอดขึ้นมาปากหลอดลากวนไปมาอย่าให้รอยทับกัน ถ้าเป็นบนผิวหน้าอาหารที่เป็น plate
ให้เลอื กขอบใดขอบหน่ึงของ plate ลาก loop เบา ๆ บนผิวหนา้ ว้นุ วนไปมาจนท่วั ทง้ั ผวิ หนา้ อาหาร
2. การ cross streak เพอ่ื ใชใ้ นการแยกเชื้อจุลนิ ทรยี ใ์ ห้บริสทุ ธ์ิ โดยปฏิบัติดังนี้

18

2.1. ใช้ loop ที่เผาให้แดงและปล่อยให้เย็นในอากาศ เขี่ยเชื้อมาแตะที่ผิววุ้นใกล้ ๆ
ขอบใดขอบหน่งึ ของ plate ลาก loop เบา ๆ บนผิววุ้นไปมา 4-5 เสน้ โดยใชด้ ้านแบนของปลายลวด
แตะแผ่ว ๆ แต่ละเส้นท่ีลากควรให้ใกล้กันท่ีสุดเท่าที่จะทำได้ระวังอย่าให้ลวดเข่ียเชื้อฝังลงไปในวุ้น
เสร็จแล้วปิดฝา plate

2.2. เผา loop ใหแ้ ดงปลอ่ ยใหเ้ ย็นในอากาศ
2.3. หมุนจานเล็กน้อยให้เหมาะและถนัดในการ streak ครั้งท่ี 2 โดยลากลวดเขี่ยเช้ือ
ผ่านเชื้อทีแ่ ตะไว้ครง้ั แรก ลากไปมาบนผิววุ้น 5-6 เสน้ ใหเ้ ส้นถ่ีหรือใกลก้ นั ทส่ี ุด
2.4. ทำเช่นเดียวกันในคร้ังท่ี 3 และท่ี 4 โดยอาจไม่ต้องเผา loop ระวังอย่าให้ loop
ไปแตะเชอ้ื ท่ไี ด้ streak ไวก้ ่อนมากเกินไปตามไปภาพในภาคผนวก

เทคนิค Pour plate
เทคนิคการ Pour plate หรือ shake plate เป็นวิธีการเพ่ือให้จุลินทรีย์และอาหารเลี้ยงเชื้อ
ใน plate ผสมคลุกเคล้ากันโดยท่ัวถึงและสม่ำเสมอในขณะที่วุ้นซ่ึงผสมอยู่ด้วยยังอยู่ในสภาพเหลว
โดยการใช้มือจับจานเลี้ยงเช้ือวนเป็นวงในแนวราบของพื้นโต๊ะไปในทิศทวนเข็มนาฬิกา และตามเข็ม
นาฬกิ า เล่อื นไปขา้ งหน้าและกลบั ถอยมา ขา้ งหลงั อย่างละหลาย ๆ คร้งั อยา่ งประณีต

เทคนคิ Spread plate
เทคนิคการ spread plate เป็นเทคนิคการกระจายเช้ือในตัวอย่างบนผิวหน้าอาหารแข็งใน
plate โดยการใช้แท่ง spreader เกลี่ยสารละลายตัวอย่างวนไปมาบนผิวหน้าอาหารให้ท่ัวจนรู้สึกว่า
ผวิ หนา้ อาหารฝดื อย่าออกแรงมากเกินไปจะทำให้อาหารเล้ียงเชื้อแตก อย่าเกลย่ี สารละลายตัวอยา่ งไป
ชิดขอบ plate มากเกินเพราะมผี ลกบั จำนวนเชอ้ื จลุ ินทรยี ท์ ี่ตรวจพบ

19

เผาห่วงถ่ายเช้ือใหร้ อ้ นแดง เพื่อฆา่ เชอ้ื

ใช้มือทงั้ สองข้างช่วยเปิดจกุ หลอดเพาะเชอื้ ใหอ้ อกจากกัน แลว้ ลนไฟเผาบริเวณปากหลอด
เพ่อื ฆ่าเช้ือ จากนั้นนำหว่ งถา่ ยเชื้อไปแตะเอาจุลนิ ทรีย์ในหลอดเพาะเช้ือ

นำเชือ้ ไปลากบนจานอาหาร
นำจานไปบ่มเพาะเชือ้ ท่ีอณุ หภูมทิ เ่ี หมาะสม เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง

จะพบจุลินทรยี เ์ ติบโตตามแนวท่ลี ากไวอ้ าจเห็นโคโลนีเดย่ี วๆ ในแนวที่ 3 และ 4
ภาพ 20 ขน้ั ตอนการเพม่ิ ปริมาณจลุ นิ ทรียบ์ ริสุทธิ์ โดยเทคนคิ Streak plate

20

ใสต่ วั อยา่ งท่ีเจือจางแล้วลงในจานเพาะเช้ือ

เปิดฝาขวดอาหาร แลว้ ลนไฟเผาบรเิ วณปากขวดเพื่อฆา่ เชื้อ

เทอาหารเล้ียงเช้ือลงในจานอาหารทีผ่ ่านการอบฆา่ เช้ือแลว้
ลงในจานที่ 1 (ด้านล่างสดุ ) และไล่ขน้ึ ไปจนถึงจานทอ่ี ยบู่ นสดุ
หมุนวนจานอาหารไปทางซา้ ย ทางขวา ขึน้ ด้านบน และลงด้านล่าง อยา่ งละ 5 รอบ

วางท้ิงไวจ้ นได้อาหารแข็งดังรูป
ภาพ 21 ขั้นตอนการคัดแยกจลุ นิ ทรยี ์ โดยเทคนิค Pour plate

21

เทอาหารเลี้ยงเช้ือลงในจานอาหารทีผ่ า่ นการอบฆา่ เชื้อแล้ว
ลงในจานที่ 1 (ด้านล่างสุด) และไลข่ ้ึนไปจนถึงจานท่อี ย่บู นสดุ แล้ววางทิ้งไวอ้ าหารแขง็

ใส่ตัวอย่างท่ีเจือจางแลว้ ลงในจานเพาะเชอื้ ทเี่ ทอาหารแข็งไว้ และทำใหผ้ ิวหน้าแห้งแล้ว

กระจายตวั อย่างให้ท่วั บริเวณผิวหน้าด้วยแทง่ แก้ว (Spreader) ทฆ่ี า่ เช้อื ด้วยการเผาไฟ
วางท้งิ ไวจ้ นผวิ หน้าอาหารแห้ง หรอื ตวั อยา่ งซึมลงไปในอาหารแขง็

ภาพ 22 ข้นั ตอนการคดั แยกจุลนิ ทรยี บ์ ริสุทธิ์ โดยเทคนิค Spread plate

22

เผาห่วงถา่ ยเชอ้ื ใหร้ ้อนแดง เพอื่ ฆ่าเชอื้

ใช้มือท้ังสองข้างชว่ ยเปิดจกุ หลอด แลว้ ลนไฟบริเวณปากหลอด เพื่อฆ่าเช้ือ
ใช้หว่ งถา่ ยเชือ้ จมุ่ เช้อื ในหลอดจำนวน 1 ห่วง และนำห่วงออกจากหลอด
จากนนั้ หยบิ หลอดอาหารหลอดใหม่ แล้วเปิดฝาหลอดดว้ ยวิธเี ดียวกนั

ใสเ่ ชือ้ ลงในหลอดอาหาร แล้วนำหว่ งถ่ายเชอ้ื ออกจากหลอด
จากนั้นลนไฟเผาปากหลอดและปิดฝาหลอด แล้วเผาห่วงถ่ายเช้อื ให้ร้อนแดง เพ่ือฆ่าเชอื้

จากน้นั นำจานไปบ่มเพาะเชื้อที่อณุ หภูมิทเี่ หมาะสม เป็นเวลา 24-48 ชัว่ โมง

จะพบเชื้อเจรญิ บนผิวหน้าของอาหาร
ภาพ 23 ข้นั ตอนการถ่ายเชอ้ื จากอาหารวุน้ เอยี งหลอดท่ี 1 ไปยงั อาหารวนุ้ เอียงหลอดที่ 2

23

เปิดฝาขวดอาหาร แล้วลนไฟเผาบรเิ วณปากขวดเพ่อื ฆา่ เช้ือ แลว้ เทอาหารเลย้ี งเช้อื ลงในจานอาหารที่
ผ่านการอบฆา่ เชอื้ แลว้ ลงในจานท่ี 1 (ดา้ นลา่ งสุด) และไล่ขึ้นไปจนถึงจานที่อยบู่ นสดุ

วางท้งิ ไวจ้ นได้อาหารแขง็ ดังรูป
ภาพ 24 ข้ันตอนการเทอาหารเล้ยี งเชอื้ ใส่ในจานอาหาร

การยอ้ มสแี บบแกรม
การย้อมสีแบบแกรม (Gram’s staining) เป็นวิธีการเบ้ืองต้นในการจำแนกแบคทีเรีย
ออกเป็น 2 กลุ่ม ได้แก่แบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบ การย้อมนี้จัดเป็นการย้อมแบบ
differential staining ซ่ึงหมายถึงการใช้สีย้อมต้ังแต่ 2 ชนิดขึ้นไปสีย้อมแรกเรียก primary stain
ได้แก่ สี crystal violet ส่วนสีท่ีสองเรียกว่า counter stain หรือ secondary stain สีที่ใช้คือ safranin
O แบคทีเรียท่ีย้อมติดสีแรกเป็นแบคทีเรียแกรมบวก ส่วนแบคทีเรียที่ติดสีท่ีสองเป็นแบคทีเรียแกรมลบ
ซ่ึงมขี น้ั ตอนดงั นี้
1. การเตรียมรอยสเมียร์

การเตรียมสเมียร์จากเช้ือท่ีเพาะเล้ียงบนอาหารแข็ง ทำโดยใช้ loop จุ่มน้ำแตะลงบน
สไลด์ 1-2 loopเผาไฟเพื่อฆ่าเชื้ออ่ืนแล้วรอให้เย็น เข่ียเช้ือท่เี จรญิ บนอาหารแขง็ ให้ติด loop มาเพียง
เล็กน้อยแตะเช้ือลงบนหยดน้ำ แล้วละเลงเชื้อโดยใช้ loop ให้กระจายเป็นวงเล็ก ๆ ท้ิงไว้ให้รอยส
เมียรแ์ ห้งเอง รอยสเมียรท์ ด่ี จี ะตอ้ งบางมีเชอ้ื แผก่ ระจายอยา่ งสม่ำเสมอ

หากต้องการเตรียมสเมียร์จากเชื้อท่ีเพาะเล้ียงในอาหารเหลว เช้ือที่เจริญอยู่ในอาหาร
เหลวจะไม่หนาแน่นเหมือนเชื้อที่เจริญบนอาหารแข็งจึงต้องใช้เช้อื หลาย loop เผาไฟทงิ้ ใหเ้ ย็นจุ่มเช้ือ

24

2-3 loop มาแตะบนสไลด์ท่สี ะอาดแลว้ ละเลงแผเ่ ช้ือให้กระจายเป็นวงเลก็ ๆ แล้วทง้ิ ไวใ้ หร้ อยสเมยี ร์
แหง้

จากน้ันทำการตรึงรอยสเมียร์ (fixing of the smear) หมายถึง การทำให้เซลล์ของ
แบคทีเรียติดแน่นกับสไลด์เพราะเวลาย้อมสีจะต้องผ่านขั้นตอนการล้างสี อาจทำให้เซลล์ของ
แบคทีเรยี หลุดได้ การตรึงรอยสเมียร์ทำโดยนำสไลด์ที่รอยสเมียร์ที่แห้งแล้วมาลนผ่านเหมือนเปลวไฟ
(heat fix) โดยให้เปลวไฟผ่านใต้สไลด์ตรงรอยสเมียร์ ให้ลนผ่านเปลวไฟอย่างค่อนข้างรวดเร็ว 1 - 3
คร้ัง เพราะไม่ต้องการให้ร้อนจนเกินไป โดยนำมาแตะหลังมือแล้วยังพอทนได้ การผ่านเปลวไฟเป็น
การดงึ นำ้ ออกจากเซลล์จงึ ทำใหเ้ ซลลต์ ิดแนน่ กับสไลด์

2. หยดสี Crystal violet บรเิ วณทเี่ กล่ียเช้อื ให้ท่วม ท้ิงไว้ 1 นาที แลว้ เทท้ิง
3. หยดสารละลาย Lugol,s iodine บริเวณที่เกลี่ยเชื้อ วางทิ้งไว้ 1 นาที แล้วเท
ท้ิง สารละลายไอโอดีนจะทำหนา้ ทีเ่ ปน็ mordant ชว่ ยให้เซลลต์ ดิ สยี อ้ มได้ดีข้นึ
4. ลา้ งสีออกดว้ ยเอทธิลแอลกอฮอล์ เข้มขน้ ร้อยละ 95 หรือใช้สารละลายผสมระหว่างเอธิล
แอลกอฮอล์และอะซีโตน อัตราส่วน 1 ต่อ 1 โดยให้ไหลผ่านบริเวณที่เกล่ียเช้ือ จนไม่มีสีของ crystal
violet ออกมา (ไมเ่ กนิ 15 วนิ าที) แลว้ ล้างออกด้วยนำ้ กลนั่
5. หยดสีซาฟรานิน (Safranin) บริเวณที่เกลี่ยเชื้อ ทิ้งไว้ประมาณ 15 - 30 วินาที ล้างด้วย
น้ำกลั่น ซับให้แห้งแล้วนำไปตรวจดูด้วยกลอ้ งจลุ ทรรศน์

ผลการย้อมสีแบคทีเรียจะเกี่ยวข้องกับโครงสร้างและองค์ประกอบของผนังเซลล์ โดย
แบคทีเรียแกรมลบซ่ึงมีไขมันเกาะท่ีผนังเซลล์มากกว่าและมีผนังเซลล์ชั้นนอกบางกว่าแบคทีเรียแก
รมบวก ทำให้เม่ือล้างด้วยแอลกอฮอล์จะไปละลายไขมันทำให้รูเปิดท่ีผนังเซลล์กว้างขึ้น ส่งผลให้สี
คริสตลั ไวโอเลตหลุดออกมาจงึ ตดิ สแี ดงของซาฟรานิน (Safranin)

ในขณะท่ีแบคทีเรียแกรมบวกมีไขมันท่ีผนังเซลล์และความซับซ้อนขององค์ประกอบท่ีผนัง
เซลลน์ ้อยกว่า เมื่อล้างสีด้วยแอลกอฮอล์จะทำให้เซลลเ์ หี่ยว เน่ืองจากการการสญู เสยี น้ำ ทำให้เยื่อหุ้ม
เซลล์มีขนาดเล็กลง โมเลกุลของสารสีไม่สามารถละลายออกมาได้ ทำให้เซลล์ยังคงติดสีม่วง และเมื่อ
ยอ้ มทบั ดว้ ยสีซาฟรานนิ เซลลจ์ งึ ไม่ติดสแี ดง

25

เขยี นวงกลมบนแผน่ สไลด์
แลว้ หยดน้ำลงในวงกลม

เขีย่ เชือ้ จากอาหารแข็งแลว้ เขี่ยใหก้ ระจายทวั่ วงกลม (Smear)
วางทง้ิ ไวใ้ ห้แหง้ (Air dry)

นำกระจกสไลด์มาลนบนเปลวไฟเล็กน้อย (Heat fix)
ภาพ 25 ขัน้ ตอนการเตรียมรอยเสมียร์

26

หยดสคี รสิ ตัล ไวโอเลต (Crystal violet) ใหท้ ่วมรอยเชือ้ ทิ้งไว้ 1 นาที แล้วล้างออกดว้ ยน้ำกลั่น
หยดสารละลาย Lugol’s Iodine ให้ท่วมรอยเชื้อ ท้ิงไว้ 1 นาที แลว้ ลา้ งออกดว้ ยน้ำกลัน่
ล้างสีออกดว้ ย Decolorizer (เอทธลิ แอลกอฮอล์ หรือเอทธิลแอลกอฮอล์ + อะซโี ตน)
หยดสซี าฟรานนิ ให้ท่วมรอยเชอ้ื ท้ิงไว้ 1 นาที แลว้ ล้างออกดว้ ยน้ำกลั่น

ทิ้งไว้ให้แหง้ แล้วซบั น้ำด้วยกระดาษทชิ ชู
ภาพ 26 ขนั้ ตอนการย้อมสแี บบแกรม

บทที่ 3
การจัดการตัวอยา่ งทดสอบเพื่อการวเิ คราะห์

การจัดการตัวอย่าง เป็นกระบวนการหน่ึงท่ีมีผลต่อการทดสอบ โดยเฉพาะการทดสอบทางจุล
ชวี วิทยา ห้องปฏิบัติการควรมีการจัดการตัวอยา่ งท่ีดี เพ่ือให้สามารถป้องกันการเส่ือมสภาพ การสูญ
หายหรือถูกทำลายในระหว่างการเก็บรักษา การขนถ่ายและการเตรียมตัวอย่าง และสามารถทวน
สอบกลับได้ตลอดทุกขั้นตอน ต้ังแต่การรับตัวอย่างจนถึงกำจัดตัวอย่างออกจากห้องปฏิบัติการ และ
สร้างความม่ันใจได้ว่า ผลทดสอบที่ได้เป็นของตัวอย่างท่ีนำมาทดสอบอย่างแท้จริง โดยเจ้าหน้าที่รับ
ตวั อยา่ งจะตอ้ งสามารถแยกลกั ษณะของตวั อย่างทม่ี ีสภาพปกติ และสภาพไม่ปกติได้

โดยตัวอย่างที่มีสภาพปกติ คือ ถุงหรือภาชนะท่ีบรรจุตัวอย่างต้องไม่ฉีกขาดหรือมีรอยร่ัวท่ี
เห็นชัดเจน ตัวอย่างไม่มีการปนเป้ือนจากส่ิงปลอมปนอื่น ๆ หากเป็นอาหารแช่แข็งตัวอย่างจะต้องไม่
ละลาย ในขณะท่ีตัวอย่างที่มีสภาพไม่ปกติ คือ ถุงหรือภาชนะท่ีบรรจุตัวอย่างฉีกขาดหรือมีรอยร่ัว
เห็นชัดเจน รวมท้ังอาหารแช่งแข็งที่เกิดการละลายแล้ว นอกจากนกี้ ารจัดการตวั อย่างยงั รวมถงึ การช้ี
บง่ ตัวอย่างให้ชดั เจน เพือ่ ป้องการการสบั สนของผู้ทดสอบอีกด้วย

โดยในหัวข้อน้ีจะได้อธิบายแนวทางการจัดการตัวอย่างทดสอบทางจุลชีววิทยาที่เหมาะสม
โดยยกตัวอย่างแนวปฏิบัติของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และ
เทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เพ่ือให้แต่ละห้องปฏิบัติการสามารถนำไป
ประยุกต์ใชใ้ ห้เหมาะสมตอ่ ไป

แนวปฏิบัตใิ นการจัดการตวั อย่างทดสอบทางจุลชวี วิทยา

สำหรบั ตัวอย่างท่ีต้องทดสอบทางจลุ ชีววทิ ยาน้ันควรทำการทดสอบทันที ไม่ควรเก็บตัวอย่าง
ไว้รอทดสอบ หากผู้รับนำส่งตัวอย่างแล้วยังไม่สามารถทดสอบได้ ให้เก็บรักษาตัวอย่างไว้ในห้องเก็บ
และรกั ษาตวั อยา่ งตามสภาวะเดิมของตวั อย่าง ดงั น้ี

1. อาหารแช่เเข็ง เก็บท่ีอุณหภมู ิ – 20 องศาเซลเซียส
2. อาหารแช่เย็น เกบ็ ที่อุณหภูมิ 2 – 8 องศาเซลเซียส และต้องทำการทดสอบภายใน 36
ชัว่ โมง
3. ตัวอย่างน้ำ เก็บท่ีอุณหภูมิ 2 – 8 องศาเซลเซียส และต้องทำการทดสอบภายใน 24
ชวั่ โมง
4. อาหารกระป๋องและอาหารแห้ง เก็บท่ีอุณหภูมิห้อง (25 – 27 องศาเซลเซียส) และต้อง
ทำการทดสอบภายใน 24 ช่ัวโมง

28

เจ้าหน้าท่ีรับตัวอย่างและผู้ทดสอบควรบันทึกสถานะและสภาพของตัวอย่างให้ชัดเจน เช่น
อยู่ระหว่างการทดสอบ หรือรอจำหน่าย สภาวะในการเก็บรักษา เป็นต้น โดยอาจมีการจัดทำเป็น
ปา้ ยบง่ ช้ีสถานะของตวั อย่างใหช้ ัดเจน (ภาพ 20) ท้งั นี้ควรมีการบง่ ช้ีประเภทการทดสอบใหช้ ัดเจนว่า
มีการทดสอบเฉพาะทางจุลชีววิทยา หรอื มีการทดสอบทางเคมีรว่ มด้วย ในกรณีที่ตัวอย่างต้องทำการ
ทดสอบทั้งทางเคมีวิเคราะห์และจุลชีววิทยา ให้ทำการทดสอบทางด้านจุลชีววิทยาก่อน และเก็บไว้
ท่ีห้องเก็บและรักษาตัวอย่าง เพ่ือรอการทดสอบทางเคมีต่อไป

Sci.MJU ปา้ ยแสดงสถานะตวั อยา่ ง หมายเลขปฏิบตั ิการ
ช่ือตัวอยา่ ง

□ ขอรบั ตัวอย่างคืน สถานที่เกบ็ สถานะ วันท่.ี ................
แผนก □ Room Temp □ รอการทดสอบ วนั ท่ี.................
□ เคมี □ 3-5 C □ กำลังทดสอบ วันท่.ี ................
□ จลุ ชวี วิทยา □ - 20 C □ รอการจำหน่าย

ภาพ 27 ป้ายบ่งชี้ตัวอย่างของศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
คณะวทิ ยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยแมโ่ จ้

ตัวอย่างการบ่งชี้ตัวอย่าง โดยการกำหนดเลขที่ใบคำขอรับบริการทดสอบและหมายเลข
ปฏบิ ตั ิการโดยมีหลกั เกณฑด์ งั ตอ่ ไปน้ี

1. เลขทใ่ี บคำขอรับบรกิ ารทดสอบ T XXX/ปี พ.ศ. เช่น T001/2564
T ย่อมาจาก Testing ซงึ่ เป็นประเภทการให้บรกิ ารวเิ คราะหท์ ดสอบ
XXXX หมายถงึ ลำดับ เลขที่ ใบ คำขอรับ บ ริการท ดสอบ โดยเร่ิ มนั บ ใน
ปีงบประมาณนั้นๆ มีจำนวน 4 หลัก เช่น 0001, 0002, 0003,
…….., XXXX
ปี พ.ศ. หมายถงึ ปีงบประมาณ (เริ่มนับวันที่ 1 ตุลาคม ปีก่อนหน้า ถึงวันที่ 30
กันยายน ในปีน้ัน ๆ) เช่น ปีงบประมาณ 2564 (1 ตุลาคม 2563 – 30
กนั ยายน 2564)

29

2. หมายเลขปฏิบัติการ เชน่ ปี พ.ศ. /C หรอื M หรือ T – XXXXX เชน่ 64/M - 00001
ปี พ.ศ. หมายถงึ ปีงบประมาณ (เร่ิมนับวันท่ี 1 ตุลาคม ปีก่อนหน้า ถึงวันที่ 30
กันยายน ในปีน้ัน ๆ) เช่น ปีงบประมาณ 2564 (1 ตุลาคม 2563 – 30
กนั ยายน 2564)
C หมายถงึ ประเภทตวั อยา่ งทีต่ รวจวเิ คราะหท์ างเคมี (Chemistry)
M หมายถึง ประเภทตวั อย่างท่ตี รวจวิเคราะห์ทางชีวโมเลกุลและจลุ ชวี วิทยา
(Microbiology)
T หมายถึง ประเภทตวั อยา่ งทตี่ รวจวิเคราะหท์ ง้ั ทางเคมี และชวี โมเลกุลและ
จุลชวี วิทยา (Total)
XXXXX หมายถึง เลขลำดับตัวอย่างท่ีเข้าในปีงบประมาณน้ันๆ มีจำนวน 5 หลัก
เช่น 00001, 00002, 00003, ………, XXXXX

การป้องกันในการเก็บรักษาตัวอย่างต้องไม่เก็บตัวอย่างในสภาวะแวดล้อมที่มีความร้อนสูง
หรือต่ำเกินไป เช่น ไม่วางตวั อยา่ งใกลเ้ คร่ืองมอื ทดสอบ ไม่วางไว้ในที่มแี สงแดด หรือมีอุณหภูมิสูง ไม่
เก็บตัวอย่างในที่มีความชื้นสูง ไม่เก็บตัวอย่างในสภาวะแวดล้อมท่ีสกปรก มีจุลินทรีย์สูง หรอื มีฝุ่น
ละอองมาก ไม่เก็บตัวอย่างในที่มีไอกรด และไอสารเคมีต่าง ๆ เป็นต้น ทั้งน้ีให้ดำเนินการเฝ้าระวัง
สภาวะการเก็บรกั ษาตวั อยา่ ง โดยบนั ทึกอุณหภมู ิเปน็ ประจำทกุ วัน

ตัวอย่างที่ทำการทดสอบแล้ว ให้ทำการบ่งช้ีสถานะตัวอย่างที่ป้ายแสดงสถานะตัวอย่างเพื่อ
ทำลาย หลังออกรายงานผล และออกรายงานผลการทดสอบแล้ว ให้บันทึกวันที่ส่งผลทดสอบ
พร้อมกำหนดวันท่ีสามารถทำลายตัวอย่างได้นับจากวันท่ีส่งผลทดสอบไปแล้ว ให้ชัดเจน
ซึง่ ห้องปฏิบตั ิการจุลชีววิทยาของศูนย์ฯ กำหนดไว้ท่ี 30 วัน สำหรับตัวอย่างทางจุลชีววิทยาหากผลการ
ทดสอบมีข้อสงสัย ลกู ค้าจะต้องทำการส่งตัวอย่างใหม่ เน่ืองจากปรมิ าณจลุ ินทรียใ์ นตัวอย่างมโี อกาสที่
จะเปลีย่ นแปลงได้ตลอดเวลาหากเกบ็ ไว้นานเกนิ ระยะเวลาทดสอบ

การทำลายตัวอย่าง โดยตัวอย่างท่ีครบกำหนดการทำลายให้นำออกมาจากตู้เก็บตัวอย่างรอ
ทำลาย ใช้กรรไกรตัดปากถุงพลาสติกเทตัวอย่างให้ลงในถุงพลาสติกขนาดใหญ่ ซ่ึงแยกตามชนิดของ
ตัวอย่าง และบันทกึ การทำลายตัวอย่างหลังการทดสอบใหช้ ดั เจน โดยวธิ ีการกำจัดของเสีย มดี ังน้ี

1. เครื่องแก้วและอาหารเล้ียงเช้ือท่ีผ่านการทดสอบให้ใส่ถุงพลาสติกแล้ว นำไปฆ่าเชื้อในหม้อ
น่ึงความดันไอน้ำ (autoclave) ท่ีอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางน้ิว เป็น
เวลา 30 นาที จากน้ันนำไปล้างด้วยสารฆ่าเชื้อท่ีเป็นน้ำยาล้างจาน 1 คร้ัง ล้างด้วยน้ำเปล่า 2 ครั้ง และ
กลัว้ ดว้ ยนำ้ กลนั่ 1 ครง้ั คว่ำใหแ้ ห้งนำเข้าตู้อบเพื่อฆ่าเช้ือที่อุณหภูมิ 170 ± 10 องศาเซลเซยี ส

30

2. ปิเปต กรรไกร อุปกรณ์ท่ีใช้งานแล้วให้แช่อยู่ในสารฆ่าเชื้อหลังจากใช้งานเสร็จแล้วนำมา
ล้างดว้ ยสารฆา่ เชื้อทเ่ี ปน็ น้ำยาล้างจาน 1 ครั้ง ลา้ งดว้ ยน้ำเปล่า 2 คร้ัง และกล้วั ด้วยนำ้ กล่นั 1 ครั้ง

3. เศษตัวอยา่ ง วสั ดอุ ุปกรณ์ต่าง ๆ ใหท้ ง้ิ ลงในถังขยะท่ัวไป
4. ของเสียต่าง ๆ ถูกรวมลงในถุงขยะ มัดปากถุงแล้วระบุชนิดของของเสีย เช่น ขยะทั่วไป
ขยะติดเชื้อ เป็นต้น และนำไปทง้ิ ทุกวนั
5. วัสดุอุปกรณ์ท่ีใช้กับเช้ือจุลินทรีย์อ้างอิงต้องนำไปฆ่าเช้ือที่ฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศา
เซลเซยี ส ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางน้ิว เปน็ เวลา 30 นาที ก่อนลา้ งทำความสะอาด หรอื ท้ิง

บทท่ี 4
การควบคมุ คณุ ภาพทางชีววทิ ยา

การควบคุมคุณภาพ (Quality Control: QC) เป็นกระบวนการหนึ่งที่ได้กำหนดกิจกรรมต่าง ๆ ซ่ึง
ห้องปฏิบัติการจัดทำข้ึน เพ่ือให้เกิดความม่ันใจว่ามีการปฏิบัติงานท่ีถูกต้อง และสามารถสร้างความ
นา่ เชื่อถอื ในกระบวนการวิเคราะหท์ ดสอบใหแ้ ก่ผรู้ บั บริการหรือลูกคา้ ได้

โดยปกติแล้วห้องปฏิบัติการทุกแห่งจะมีแนวทางปฏิบัติในการควบคุมภายในอยู่แล้ว โดย
อาศัยสามัญสำนึกและหลักการของการทดลอง เพื่อลดความผิดพลาดของการวิเคราะห์ทดสอบ
(รวิวรรณ, 2554) แต่ในการจัดทำระบบมาตรฐานห้องปฏิบัติการ ISO/IEC 17025: 2005 ด้านจุล
ชวี วิทยานั้น ห้องปฏบิ ัติการจำเป็นจะตอ้ งนำเอาระบบการควบคุมคุณภาพเข้ามาใชอ้ ยา่ งจริงจงั และมี
การแสดงให้เห็นอย่างชัดเจน เพ่ือให้สามารถสร้างความม่ันใจและความเชอ่ื ถือในผลของการวิเคราะห์
ทดสอบ รวมไปถึงการทวนสอบ หรือตรวจสอบย้อนกลับในกรณีที่เกิดความผิดพลาด หรอื ข้อสงสยั ใน
ผลการทดสอบแต่ละครั้ง ซึ่งปัจจัยที่จะทำให้เกิดความถูกต้องและได้รับความเชื่อถือ ได้แก่ วิธีการ
วิเคราะห์ทดสอบที่ถูกต้อง อาหารเล้ียงเช้ือที่มีประสิทธิภาพและคุณภาพที่ดี บุคลากรท่ีมีความ
เช่ยี วชาญ และเคร่อื งมือหรืออปุ กรณท์ ม่ี ีประสทิ ธิภาพและความแมน่ ยำ

ดังนั้นในหัวข้อนี้จะได้อธิบายแนวทางการควบคุมคุณภาพในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาที่
เก่ยี วข้อง เพือ่ ใหแ้ ต่ละหอ้ งปฏิบัติการสามารถนำไปประยุกต์ใชใ้ ห้เหมาะสมตอ่ ไป

การควบคมุ คณุ ภาพของสถานท่แี ละสภาวะแวดล้อม

พื้นท่ีภายในห้องปฏิบัติการเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องได้รับการควบคุม เน่ืองจากเป็นบริเวณที่
ต้องเก่ียวข้องกับการทดสอบโดยตรง ไม่ว่าจะเป็นผนังและพื้น พื้นท่ีหรือโต๊ะปฏิบัติการ และอากาศ
ภายในห้องปฏิบัติการ จำเป็นจะต้องได้รับการควบคุมและดูแลให้เกิดความสะอาดอย่างสม่ำเสมอ
เพื่อเป็นการลดโอกาสท่ีจะเกิดการปนเป้ือนของเช้ือจุลินทรีย์จากภายนอกไปสู่ตัวอย่างทดสอบ ทำ
ให้ผลการทดสอบถูกตอ้ งและเป็นจรงิ มากทสี่ ดุ

การควบคุมพน้ื ท่ีและสภาวะแวดลอ้ มน้ันได้มีแนวทางปฏิบัตกิ ันอย่างหลากหลายขึ้นอยูก่ ับแต่
ละห้องปฏิบัติการจะเลือกมาประยุกต์ใช้ให้เหมาะสมกับการทดสอบ และลักษณะของห้องปฏิบัติการ
แต่ละแห่ง โดยห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ของสถาบันบริการตรวจสอบคุณภาพและมาตรฐาน
ผลิตภณั ฑ์ มหาวทิ ยาลัยแม่โจ้ ไดน้ ำเอามาตรฐานมาประยกุ ตใ์ ช้ จำนวน 3 ฉบับ ได้แก่

34

1. ISO 7218: Microbiology of food and animal feeding stuff – General
requirements and guidance for microbiological examinations, ISO, 3rd ed., 2007.

2. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, APHA,
AWWA & WEF, 21st ed., 2005, part 9020.

3. Richard B. Smittle and Anita J. Okrend,: Laboratory Quality Assurance,
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4th ed.,
Chapter 1

ผนงั และพ้นื
ผนังและพ้ืนของห้องปฏิบัติการควรจะมีผิวเรียบเพ่ือให้ง่ายต่อการทำความสะอาด อาจทำ
ด้วยพลาสติกชนิดไวนิล กระเบ้ืองยาง หรือวัสดุอื่นที่ง่ายต่อการล้างทำความสะอาด และน้ำซึมผ่าน
ไม่ได้ โดยให้มีรอยต่อน้อยที่สุดหรือมีการปิด (Seal) รอยต่อทั้งหมด นอกจากนี้ภายในห้องปฏิบัติการ
ไม่ควรมีมู่ล่ี หากต้องการลดแสงแดดควรติดฟิล์มกรองแสงแทน และอาศัยแสงจากหลอดไฟอย่าง
เพยี งพอ ท้ังนี้ควรมพี ืน้ ท่ใี ชส้ อยอย่างเพียงพอต่อการทำงาน

พน้ื ที่ในการปฏิบตั ิงาน
พื้นท่ีในการปฏิบัติงานควรการแยกจากกิจกรรมอื่น ๆ และจำกัดการเข้า - ออกอย่างชัดเจน
เช่น แยกบรเิ วณทดสอบ ออกจากบรเิ วณท่ีเตรยี มตัวอย่าง เตรียมอาหารเล้ียงเช้อื บริเวณท่รี บั ตัวอย่าง
เป็นต้น เพื่อลดการปนเป้ือนขณะที่ทำการทดสอบ นอกจากน้ียังต้องมีการรักษาความสะอาดอย่าง
เหมาะสม มกี ารจัดวางเครือ่ งมอื ให้มีพ้นื ท่ีเพยี งพอต่อการปฏิบตั งิ าน
ในส่วนของโต๊ะปฏิบัติการควรมีความยาวอย่างน้อย 2 เมตรต่อผู้ทดสอบ 1 คน มีความสูง
และความลึกพอเหมาะต่อการน่ังทำงาน วัสดุที่ใช้ควรทำด้วยสแตนเลส พลาสติกชนิดอีพอกซี
(Epoxy) หรือพ้ืนผิวเรียบท่ีง่ายต่อการทำความสะอาด นำ้ ไม่สามารถซมึ ผ่านได้ อีกท้ังยังต้องคงทนต่อ
การกัดกร่อน และมีรอยต่อน้อยที่สุด รวมถึงมีแสงสว่างที่เพียงพอประมาณ 1,000 ลักซ์ หรือ 100
แรงเทยี น และกระจายอย่างท่ัวถึงและสมำ่ เสมอ (รววิ รรณ, 2554)

การรกั ษาความสะอาด
ในส่วนของการรักษาความสะอาดของห้องปฏิบัติการจะต้องทำเป็นประจำอย่างสม่ำเสมอ โดย
ต้องจัดทำเป็นเอกสารหรือวิธีการปฏิบัติงานให้ชัดเจน และมีการตรวจสอบเป็นประจำ การทำความ
สะอาดนัน้ จะต้องใช้น้ำยาฆ่าเช้ือ เชน่ แอลกอฮอล์ โซเดียมไฮโปคลอไรต์ เป็นต้น โดยต้องมีการฆ่าเช้ือ
ก่อนและหลังการปฏิบัติงาน นอกจากน้ีในการทำความสะอาดพื้นไม่ควรใช้ไม้กวาดหรือถูด้วยผ้าแห้ง

35

เพราะจะทำให้เกิดการฟุ้งกระจายของฝุ่น หรือจุลินทรีย์ในอากาศได้ และควรให้ความสนใจในบริเวณที่
ทำความสะอาดได้ยาก เช่น มุมหอ้ ง หลังตู้ เปน็ ตน้

สภาวะแวดล้อม
ในส่วนของสภาวะแวดล้อมห้องปฏิบัติการจะต้องมีระบบระบายอากาศเพ่ือลดการปนเปื้อน
เช่น พัดลมดูดอากาศ เป็นต้น นอกจากน้ีบางห้องปฏิบัติการอาจมีเครื่องฟอกอากาศ หรือเครื่องฆ่า
เช้ือ รวมทั้งอาจมีการติดต้ังหลอดอุลตร้าไวโอเลต (UV) ไว้สำหรับฆ่าเชื้อในห้องปฏิบัติการหลังการ
ปฏิบตั ิงาน ซ่งึ ขึ้นอยู่กบั ความเหมาะสมและงบประมาณของแตล่ ะห้องปฏิบตั กิ าร
ทัง้ น้หี อ้ งปฏิบัติการควรจัดให้มีเครื่องปรับอากาศ เพื่อใช้ในการควบคุมความชืน้ และอณุ หภมู ิ
ซึ่งส่วนใหญ่จะควบคุมให้มีอุณหภูมิระหว่าง 18 – 27 องศาเซลเซียส และความช้ืนสัมพัทธ์ระหว่าง
รอ้ ยละ 45 – 50

การตรวจสอบสถานที่และสภาวะแวดล้อม
เพ่ือให้การควบคุมคุณภาพสถานที่และสภาวะแวดล้อมในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาเป็นไป
อย่างมีประสิทธิภาพ ลดโอกาสท่ีจะเกิดการปนเปื้อนของเช้ือจุลินทรีย์จากภายนอกไปสู่ตัวอย่าง
ทดสอบ ทำให้ผลการทดสอบถูกต้องและเป็นจริงมากท่ีสุด จึงต้องมีการตรวจสอบสถานที่และสภาวะ
แวดลอ้ มอยา่ งสมำ่ เสมอ ซงึ่ มีวิธกี ารควบคุมและตรวจสอบดังน้ี
1. ห้องปฏิบัติการจุลชวี วิทยาต้องแยกออกจากกิจกรรมอ่นื ๆ ภายในห้องปฏิบัติการจัดเป็น
ส่วนแยกจากกันโดยเฉพาะ มีการจำกัดการเข้าออกของบุคคลซึ่งสามารถเข้า – ออกได้โดยไม่ต้องขอ
อนญุ าต ดงั น้ี

1.1. นักวิทยาศาสตร์ประจำห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา หรือเจ้าหน้าที่ที่ได้รับ
มอบหมายให้ปฏบิ ัตงิ านในห้องปฏบิ ัติการจลุ ชีววิทยา

1.2. หัวหน้าห้องปฏิบัติการ และผู้บริหารของหน่วยงาน หากมีการดำเนินงานภายใต้
ระบบมาตรฐานห้องปฏิบัติการ ISO/IEC 17025: 2005 อาจรวมถึงผู้จัดการวิชาการ และผู้จัดการ
คุณภาพ

1.3. บุคคลอื่นนอกเหนือจากนั้นต้องมีการขออนุญาตเป็นกรณีไป โดยมีเอกสารเป็น
ลายลักษณ์อกั ษร

2. ผู้ท่เี ขา้ ไปปฏิบตั ิงานในหอ้ งปฏบิ ัตกิ ารจลุ ชีววทิ ยา ตอ้ งปฏบิ ตั ิ ดงั นี้
2.1. เปลีย่ นรองเทา้ กอ่ นเขา้ ห้อง
2.2. เปลี่ยนหรือสวมเส้อื กราวน์ใหเ้ รียบร้อยก่อนเข้าห้อง
2.3. ลา้ งมือทกุ คร้งั กอ่ นและหลังการปฏิบัติงาน

36

2.4. ห้ามสวมเสื้อกราวน์และรองเท้าของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ออกมาภายนอก
ห้องปฏิบัติการ

3. ห้องปฏบิ ตั กิ ารจลุ ชีววทิ ยา ควรแบง่ พน้ื ที่ออกเปน็ สว่ นตา่ ง ๆ หรือหอ้ งย่อย ดังน้ี
3.1. บริเวณท่ใี ช้สำหรบั เปล่ียนเสือ้ กราวน์ รองเทา้ รวมถึงการรบั ตวั อยา่ ง
3.2. บริเวณที่ใช้เตรียมตัวอย่าง และอาหารเล้ียงเชื้อ โดยเป็นท่ีต้ังของเครื่องชั่ง ตู้เก็บ

สารเคมี ตู้เก็บเครอ่ื งแก้ว และตู้เย็นสำหรับเก็บสารเคมีต่าง ๆ หากมีพ้ืนที่จำกัดอาจมีการกำหนดใช้
ช่วงเวลาที่ตา่ งกนั ในแตล่ ะกิจกรรม

3.3. บริเวณที่ใช้ในการปฏิบัติงานทดสอบ และอ่านผลการทดสอบ โดยเป็นท่ีตั้งของตู้
ปลอดเช้อื ตบู้ ่ม ตเู้ ย็นสำหรบั เก็บอาหารเลยี้ งเชื้อที่เตรียมแลว้ และตเู้ กบ็ อุปกรณ์ท่ีผ่านการฆ่าเช้ือแล้ว
ทงั้ นี้หากมพี ื้นทม่ี ากพออาจแยกต้องสำหรับตู้บม่ ต่าง ๆ

3.4. บริเวณที่ใช้สำหรับการฆ่าเชื้ออุปกรณ์ และอาหารเล้ียงเชื้อก่อนการทดสอบ และ
ทำลายอาหารเล้ียงเชือ้ ที่ผ่านการทดสอบแล้ว โดยเปน็ ที่ตั้งของตู้อบ หม้อน่ึงฆ่าเชื้อ และอ่างสำหรับล้าง
ของทผ่ี ่านการฆ่าเชอ้ื แลว้

ท้ังนี้เคร่อื งมือและอุปกรณ์ที่ใช้งานให้จัดวางในตำแหน่งท่ีสะดวกต่อการใช้งาน ให้มีพ้ืนท่ี
การทำงานทเ่ี หมาะสม ง่ายต่อการทำความสะอาด และไมก่ ่อให้เกิดการปนเป้ือน โดยมีการตรวจสอบ
พ้นื ท่ีอย่างสม่ำเสมอ ดังตาราง 1

3.5. การรกั ษาความสะอาดในหอ้ งปฏิบัติการจลุ ชีววทิ ยาให้ปฏบิ ัติ ดงั นี้
3.5.1. การทำความสะอาดโต๊ะและพ้ืนที่ทำงาน
หลังจากการปฏิบัติงานเสร็จให้ใช้ผ้าชุบน้ำหมาดเช็ดทำความสะอาด 1

ครั้ง จากน้ันใช้ผ้าชุบน้ำยาฆ่าเชื้อทำความสะอาดอีกครั้ง โดยทำการปฏิบัติทุกวันหลังจากปฏิบัติงาน
เสร็จ โดยนกั วทิ ยาศาสตรป์ ระจำห้องปฏบิ ัติการ หรอื เจ้าหนา้ ที่ทไี่ ด้รบั มอบหมาย

3.5.2. การทำความสะอาดพื้น
การทำความสะอาดพ้ืนให้ใช้ผ้าหมาดเชด็ เศษตัวอย่าง ฝุ่นละอองกอ่ น จากน้ันใช้

ไม้ถูพื้นสำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ชุบน้ำพอหมาดถูบริเวณพื้นให้สะอาด และใช้ไม้ถูพื้นชุบน้ำยาฆ่า
เช้ือพอหมาดถูทำความสะอาดอีกคร้งั โดยทำการปฏิบตั ิทุกวันหลังจากปฏบิ ัติงานเสร็จ

3.5.3. ผ้าที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ ควรมีการฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งฆ่าเชื้อ เป็น
ประจำ หรือทุกคร้ังท่ีนำไปเช็ดบริเวณท่ีมีเชื้ออยู่

37

นอกจากน้ียังมีแนวทางปลีกย่อยท่ีเหมาะสมต่อการทำงาน การรักษาความสะอาดใน
ห้องปฏิบตั ิการ และไม่ก่อใหเ้ กดิ การปนเป้อื น ดงั น้ี

1. การขณะที่ปฏบิ ัตงิ านทดสอบให้มีการเปิดประตูเข้า – ออก เม่ือจำเป็นเท่านั้น ห้ามมี
การเปดิ ประตทู งิ้ ไว้

2. บริเวณท่ีทำการทดสอบต้องไม่มีวัสดุอุปกรณ์ เอกสารหรือส่ิงอ่ืน ๆ ที่ไม่จำเป็นใน
การทดสอบวางอยู่ เพอ่ื ใหส้ ะดวกต่อการทำงาน

3. มีการควบคุมอุณหภูมิของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาให้มีค่าอยู่ระหว่าง 18 –
27 องศาเซลเซียส โดยทำการตรวจสอบอุณหภูมิทุกวนั จากเทอร์โมมิเตอร์ภายในห้อง และลงบันทึก
เกบ็ ไว้

4. มีการควบคุมความชื้นของห้องปฏิบัติการโดยทำการตรวจสอบความชื้นทุกวันจาก
ไฮโกรมิเตอรภ์ ายในห้อง และลงบนั ทกึ เกบ็ ไว้

ตาราง 1 การควบคมุ คุณภาพสถานท่ีและสภาวะแวดลอ้ มทางจุลชวี วทิ ยา

สถานท่ี รายการตรวจสอบ ความถ่ี เกณฑก์ ารยอมรับ
เดือนละ 1 ครั้ง ไม่เกิน 100 โคโลนีต่อ 50 ตาราง
ห้ อ ง เต รี ย ม พน้ื ท่ีปฏิบตั งิ าน
เซนตเิ มตร
อ าห ารเลี้ ย ง (Swab test) เดอื นละ 1 ครั้ง ไม่เกิน 15 โคโลนี ต่อ 1 จานอาหาร

เชือ้ อากาศในพื้นที่ปฏิบตั งิ าน ในเวลา 15 นาที
เดือนละ 1 ครั้ง ไม่เกิน 100 โคโลนีต่อ 50 ตาราง
(Air test)
เซนติเมตร
ห้องทดสอบ พ้ืนที่ปฏิบัติงาน สปั ดาหล์ ะ ไม่เกิน 15 โคโลนี ต่อ 1 จานอาหาร

(Swab test) 1 ครง้ั ในเวลา 15 นาที
เดือนละ 1 คร้ัง ไม่พบแบคทเี รีย ในเวลา 1 ชว่ั โมง
อากาศในพ้ืนที่ปฏบิ ตั งิ าน
สัปดาหล์ ะ ไม่เกิน 15 โคโลนี ต่อ 1 จานอาหาร
(Air test) 1 ครั้ง ในเวลา 15 นาที

ตู้ปลอดเชื้อ อากาศในพื้นที่ปฏิบัติงาน

(Air test)

ตบู้ ่มเชอ้ื อากาศในพ้ืนที่ปฏบิ ตั ิงาน

(Air test)

38

การควบคมุ คุณภาพของเครื่องมอื และอปุ กรณ์

เครื่องมือและอุปกรณ์เป็นสิ่งสำคัญท่ีจะต้องได้รับการควบคุมคุณภาพ เน่ืองจากมีความ
เกี่ยวข้องโดยตรงกับการทดสอบ เพ่ือให้ได้ผลการทดสอบถูกต้องและเป็นจริงมากที่สุด โดยการ
ควบคุมคุณภาพของเครื่องมือมีแนวปฏิบัติท่ีเหมือนกัน คือ มีคู่มือการใช้งาน มีบันทึกการใช้งาน
ประจำวัน (log book) มีบันทึกการบำรุงรักษาและซ่อมเครื่องมือ และมีการจัดทำประวัติการสอบ
เทียบและทวนสอบเคร่ืองมือ ในหัวข้อนี้จะได้กล่าวถึงแนวทางในการควบคุมคุณภาพของเคร่ืองมือ
ของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา สถาบันบริการตรวจสอบคุณภาพและมาตรฐานผลิตภั ณฑ์
มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ซ่ึงได้มีการประยุกต์ใช้จากมาตรฐานต่าง ๆ ให้เข้ากับการปฏิบัติงานจริงของ
หน่วยงาน

1. ตบู้ ่ม (Incubator)
การใชง้ านตู้บม่ ควรเปดิ ใช้และตั้งค่าอุณหภมู ิของตู้บม่ ก่อนการใช้งานอย่างนอ้ ย 30 นาที

เพ่ือให้อุณหภูมิภายในตู้บ่มมีอุณหภูมิตามที่ต้ังค่าไว้ แล้งจึงใส่จานเพาะเช้ือ เข้าไปในตู้บ่มนั้น โดยไม่
ควรวางจานเพาะเชื้อซ้อนกันเกิน 6 ชั้น และควรวางห่างจากผนังตู้และห่างจากกองอื่นๆ อย่างน้อย
25 มิลลเิ มตร

อุณหภูมิภายในตู้บ่มควรคงที่และเท่ากันทุกจุด โดยควรตรวจสอบและบันทึกอุณหภูมิ
ณ ช้ันที่มกี ารใช้งานทุกวัน โดยใช้เทอรโ์ มมเิ ตอร์ที่มคี วามถกู ตอ้ งซ่ึงสามารถสอบกลับไปถึง NIST ได้ ถ้า
ใช้เทอร์โมมิเตอร์ชนิดแก้ว ให้จุ่มเทอร์โมมิเตอร์ไว้ในน้ำหรือ กลีเซอรีนให้ท่วมขีดที่กำหนดของ
เทอร์โมมิเตอร์นั้น และควรตั้งตู้บ่มไว้ในห้องที่มีอุณหภูมิต่ำกว่าเกณฑ์ใช้งานประมาณ 5 องศา
เซลเซียส และควรมีการดูแลรักษาเครื่องทุกสัปดาห์

นอกจากนี้ยังควรจะตรวจสอบความแม่นยำหรือ Intermidiate check โดยใช้
Thermocouples ทผ่ี า่ นการสอบเทยี บวดั อุณหภูมิ ณ จดุ ใชง้ าน ทำเดือนละ 1 ครง้ั และบนั ทึกเก็บไว้
และมีการสอบเทียบกับหน่วยงานภายนอกอย่างน้อย 1 ครั้ง ภายใน 12 เดือน ในกรณีที่สอบเทียบไม่
ผา่ นใหท้ ำการทวนสอบอุณหภมู ิทุกจุดทีใ่ ช้งาน โดยใช้ Thermocouples ที่ผ่านการสอบเทียบ และทำ
การประเมินความเหมาะสมในการนำมาใช้งาน โดยการทำ Control chart จะทำการเก็บข้อมูลทุก 30
นาที หรือ 1 ช่ัวโมง อยา่ งน้อย 30 คา่ และจัดทำเป็นกราฟ Control chart

การทำความสะอาดภายในตู้โดยใช้ผา้ ชุบน้ำยาฆ่าเชื้อหมาดเช็ดบรเิ วณภายในตู้ทุกครั้งท่ี
มีการนำจานเพาะเช้ือออกมาตรวจนับจำนวนโคโลนี และทำความสะอาดประจำเดือน โดยการปิด
เคร่ือง ใชผ้ ้าชุบนำ้ หมาดเช็ด และใชผ้ า้ ชบุ น้ำยาฆา่ เชือ้ หมาดเชด็ อีกคร้ังทั้งภายใน และภายนอก

39

2. อ่างนำ้ ควบคมุ อณุ หภมู ิ (Water bath)
ควรใช้อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ ท่ีมีระบบการไหลเวียนของน้ำ (ถ้าเป็นไปได้) และปิดฝา

เพ่ือลดการสูญเสียน้ำและความร้อน และรักษาระดับอุณหภูมิ โดยระดับน้ำภายในอ่างน้ำควบคุม
อุณหภูมิควรสูงกว่าระดับสารละลายในหลอดทดลองท่ีแช่อยู่ภายใน ควรตรวจเช็คระดับน้ำในอ่าง
ก่อนเร่ิมใช้งาน โดยน้ำจะต้องสูงกว่าระดับน้ำที่ต่ำที่สุด (minimum water level) หากมีน้ำน้อยกว่า
ระดับท่กี ำหนดไวค้ วรใชน้ ้ำกลั่นเตมิ และควรมกี ารดแู ลรกั ษาเคร่อื งทกุ สปั ดาห์

ทั้งน้ีควรตรวจสอบและบันทึกอุณหภูมิทุกวันทใี่ ชง้ าน และบันทึกอณุ หภูมิทั้งชว่ งเช้าและ
บ่าย โดยใช้เทอร์โมมิเตอร์ท่ีมีความถูกต้องซึ่งสามารถสอบกลับไปถึง NIST ได้ นอกจากนี้ยังควรจะ
ตรวจสอบความแม่นยำหรือ Intermidiate check โดยใช้ Thermocouples ท่ีผ่านการสอบเทียบวัด
อุณหภูมิ ณ จุดใช้งาน ทำเดือนละ 1 ครั้ง และบันทึกเก็บไว้ และมีการสอบเทียบกับหน่วยงาน
ภายนอกอยา่ งน้อย 1 ครัง้ ภายใน 12 เดือน

การบำรุงรักษาและการทำความสะอาด ควรเปลี่ยนถ่ายน้ำในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ
เม่ือสังเกตพบความสกปรก โดยหลังจากถ่ายน้ำออกแล้วให้ใช้น้ำยาฆ่าเชื้อแช่ไว้ในอ่างประมาณคร่ึง
ชั่วโมง แล้วทำการถ่ายน้ำยาฆ่าเชื้อท้ิง ตามด้วยน้ำจนสะอาด และเติมน้ำกล่ันเข้าไปใหม่ ส่วนการทำ
ความสะอาดภายนอกทุกวันโดยใช้ผ้าชุบน้ำหมาดเช็ด และตามด้วยผ้าชุบน้ำยาฆ่าเชื้อหมาดเช็ดอีก
คร้ัง

3. ตอู้ บลมรอ้ น (Hot air oven หรอื dry oven)
การใช้งานส่วนใหญ่ใช้อบเคร่ืองแก้วหรืออุปกรณ์ที่ทนความร้อนได้สูง เพื่อทำลาย

เชื้อจุลินทรีย์ปนเป้ือน ในการอบฆ่าเช้ือให้บรรจุเครื่องแก้วหรืออุปกรณ์อ่ืนลงในกระบอกเหล็กกล้าไร้
สนิม (Stainless can) ปิดฝากล่อง ติดกระบอกด้วยเทปสำหรับสภาพปลอดเช้ือ (Heat – indicating
tape) โดยเขยี นวันท่ปี ฏิบัติงาน แล้วนำเขา้ อบในตู้อบความรอ้ นแหง้ กรณีการอบสารเคมหี รือตัวอย่าง
ให้บรรจุสารเคมีหรือตัวอย่างลงในภาชนะที่ทนความร้อน แล้วนำเข้าตู้อบในตู้อบความร้อนแห้ง ปิด
ประตูตู้อบให้สนิท เมื่อครบเวลาจึงนำอุปกรณ์ออกและบนั ทึกเวลาและอณุ หภมู ทิ ่ีใช้

การตรวจสอบและบันทึกอุณหภูมิทกุ วันท่ีใช้งาน และบันทึกอุณหภูมิทั้งชว่ งเช้าและบ่าย
โดยใช้เทอร์โมมเิ ตอร์ที่มีความถูกต้องซ่ึงสามารถสอบกลับไปถงึ NIST ได้ มีการทวนสอบทกุ ครั้งเมือ่ ใช้
ตู้ในการอบเพ่ือฆ่าเชื้อ โดยใช้ Heat – indicating tape และมีการสอบเทียบกับหน่วยงานภายนอก
อยา่ งน้อย 1 ครง้ั ภายใน 12 เดอื น

นอกจากนี้ยงั ควรจะตรวจสอบความแมน่ ยำหรือ Intermediate check ทัง้ ทางกายภาพ
และชวี ภาพ ดงั น้ี

40

3.1. วิธีทางกายภาพ ให้ใช้ Thermocouple หรือ Maximum Thermometer ท่ีได้รับ
การสอบเทยี บแล้ว ตาม ISO/IEC 17025 ในการทวนสอบท่ีอุณหภูมิ 170  10 องศาเซลเซียส

3.2. วิ ธี ท า ง ชี ว ภ า พ ใ ห้ ใ ช้ Biological indicator spore strip (Bacillus
astrophaeus) โดยทำการตรวจสอบอย่างน้อยเดือนละ 1 คร้ัง โดยหลังจากบ่ม Strip ท่ีอุณหภูมิ 30
– 35 องศาเซลเซียสแล้ว พบว่า อาหารที่ใช้ในการบ่มมีความขุ่นเพิ่มข้ึน แสดงว่า ไม่ผ่าน หากอาหาร
ยังคงใสอยู่ แสดงว่า ผ่าน

การทำความสะอาดโดยผ้าชุบน้ำหมาด ๆ เช็คทำความสะอาดทุกครั้งหลังเลิกใช้
งาน และทำความสะอาดภายนอกอย่างนอ้ ยสปั ดาหล์ ะ 1 ครงั้

ก. ข. ค.
ภาพ 30 Biological indicator spore strip (Bacillus astrophaeus)

ก. Biological indicator spore strip (Bacillus astrophaeus)
ข. Biological indicator spore strip (Bacillus astrophaeus) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อท่ี

อณุ หภูมิ 170 องศาเซลเซียส นาน 2 ชวั่ โมง (ขวา) ไม่ผา่ นการฆ่าเชือ้
ค. Biological indicator spore strip (Bacillus astrophaeus); ทไี่ ม่ผา่ นการฆา่ เช้ือ

4. หมอ้ นง่ึ ฆ่าเชือ้ ความดนั ไอ (Autoclave)
ในการใชง้ านควรตรวจดูระดบั น้ำภายในหม้อ หากระดับน้ำมนี ้อยเกนิ ไปทำการเติมน้ำลง

ในหม้อน่ึง (น้ำท่ีใช้ควรเป็นน้ำกล่ันหรือน้ำสะอาดท่ีไม่มีตะกอน) จนกระท่ังมองเห็นน้ำบริเวณตรง
กลางหม้อนึ่ง พร้อมทั้งตรวจเช็คระดับน้ำในถังพลาสติกรับไอน้ำ ท่ีอยู่ด้านล่างของเคร่ือง โดยน้ำที่ใช้
เติมลงในถังน้ีทำหนา้ ทล่ี ดความร้อนทีอ่ อกมาจากหม้อนึง่ ซง่ึ สามารถนำน้ำประปามาเตมิ ได้

ตัวอย่างท่ีต้องการฆ่าเช้ือลงในหม้อน่ึง การวางภาชนะ อาหารเลี้ยงเช้ือ หรือสารเคมีท่ี
ต้องการฆ่าเช้ือ ควรจัดใส่ในตะกร้าที่มีมากับเครื่อง ควรวางให้มีที่ว่างห่างกัน และมีการทดสอบ
Sterility โดยใช้ heat- indicating tape ทุกครั้งท่ีมีการใช้งาน และมีการบันทึกชนิดตัวอย่าง เวลา
เร่มิ ใช้งาน ชว่ งเวลาฆา่ เช้อื อณุ หภมู ใิ ชง้ าน เวลาแลว้ เสร็จ และผล Sterility test โดยอาหารเล้ียงเชื้อ

41

ควรได้รับการฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิและระยะเวลาที่กำหนด ส่วนของเสียจากห้องปฏิบัติการทางจุล
ชีววิทยาต้องได้รับการฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที และต้องแยก
ระหว่างของดีกับของเสียในการฆ่าเช้ือ

การสอบเทียบกับหน่วยงานภายนอกควรดำเนินการอย่างน้อย 1 คร้ัง ภายใน 12 เดือน
และมีการตรวจสอบ Intermediate check สามารถทำได้ทงั้ ทางกายภาพและชีวภาพ ดังนี้

4.1. วิธีทางกายภาพ ให้ใช้ Maximum Thermometer ที่ได้รับการสอบเทียบแล้ว
ตาม ISO/IEC 17025: 2005 ในการทวนสอบสัปดาห์ละ 1 ครัง้

4.2. วิธีทางชีวภาพ ให้ใช้ Geobacillus stearothermophilus spore ampoule
อย่างนอ้ ยเดอื นละ 1 ครงั้ โดยนำหลอดของเชอื้ มา 2 หลอด ดงั น้ี

หลอดที่ 1 นำไปผา่ นการฆ่าเชอ้ื ท่ีอุณหภมู ิ 121 องศาเซลเซยี ส เป็นเวลา 15 นาที
หลอดท่ี 2 ไมผ่ า่ นการฆา่ เชอื้ ใชเ้ ปน็ ชุดควบคุม

จากนั้นนำท้ังสองหลอดไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 60 ± 2 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48
ช่ัวโมง โดยสังเกตการเปล่ียนสีของหลอดเช้ือที่เป็นชุดควบคุมจะเปล่ียนจากสีม่วงแดงเป็นสีเหลือง
แสดงว่าผ่านการประเมิน ส่วนหลอดเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อสมบูรณ์ไม่เกิดการเปล่ียนสี (สีม่วงแดง
เหมือนเดมิ ) แสดงวา่ ไม่ผ่านการประเมนิ

การบำรุงรักษาเครื่องมือและการทำความสะอาดน้ัน ในการใช้งานแต่ละคร้ังให้
ตรวจสอบปรมิ าณน้ำในเครอื่ งกอ่ นการใช้งานทุกคร้งั ระดับน้ำตอ้ งอยใู่ นเกณฑ์ท่ีกำหนด มีการเปล่ียน
ถ่ายน้ำในเคร่ืองทุกสัปดาห์ โดยใช้น้ำกลั่นเท่านั้น และทำความสะอาดเคร่ืองทุกวันโดยใช้ผ้าชุบน้ำ
หมาดเช็ด และตามดว้ ยผา้ ชบุ นำ้ ยาฆ่าเชือ้ หมาดเชด็ อกี คร้งั

เมื่อฆ่าเช้ือในของเสียแล้วต้องทำการล้างหม้อนึ่งฆ่าเช้ือทุกครั้ง โดยให้ปล่อยน้ำภายใน
เคร่ืองออกให้หมด แล้วทำการล้างด้วยน้ำยาทำความสะอาด 1 รอบ ล้างตามด้วยน้ำสะอาดหลายๆ
รอบจนหมดฟอง แลว้ ล้างดว้ ยนำ้ ยาฆ่าเช้อื 1 รอบให้ท่วั ภายในหม้อ ล้างตามด้วยน้ำสะอาด

42

ก. ข.

ภาพ 29 Geobacillus stearothermophilus spore ampoule
ก. Geobacillus stearothermophilus spore ampoule ทีไ่ ม่ไดฆ้ ่าเชือ้
ข. Geobacillus stearothermophilus spore ampoule ที่ผ่านการฆ่าเช้ือที่อุณหภูมิ
121 องศาเซลเซียส ความดนั 15 ปอนดต์ ่อตารางน้ิว นาน 15 นาที

5. เครอื่ งวัดความเป็นกรด – ด่าง (pH meter)
ก่อนการใช้งานทุกคร้ังควรทำ Internal Calibration และการใช้งานเครื่องวัดความเป็นกรด -

ด่าง โดยใช้ pH buffer ที่สามารถสอบกลับไปถึง NIST ได้ และจะต้องเริ่มจากค่า pH เท่ากับ 7.00
ก่อน จากน้ันจึงตามด้วยคา่ 4.00 หรือ 10.00 และมกี ารสอบเทียบกับหนว่ ยงานภายนอกอย่างนอ้ ย 1
คร้ัง ภายใน 12 เดอื น

ในการใช้งานไม่ควรนำ Electrode ไปกวนในสารละลาย หรือวาง Electrode กระแทกกับ
ภาชนะท่ีวัดค่า เพราะจะทำให้หัววัดชำรุด และควรจุ่ม Electrode ให้ระดับโพแทสเซียมคลอไรด์
(KCl) อยู่สงู กว่าระดับสารละลายที่ต้องการวัด ประมาณ 2 เซนตเิ มตร ท้ังนี้เพ่ือให้เกิดแรงดนั สามารถ
ดันให้โพแทสเซียมคลอไรด์ไหลออกได้ แต่ถ้าระดับโพแทสเซียมคลอไรด์ อยู่ต่ำกว่าสารละลายอาจทำ
ให้สารละลายไหลเขา้ ขัว้ ไฟฟ้า และทำให้ปลาย Electrode อุดตนั ได้

หลังจากใช้งานแล้วให้ทำความสะอาด Electrode ทุกคร้ัง โดยใช้น้ำกลั่นฉีดล้าง
Electrode เท่านั้น และใช้กระดาษทชิ ชูซบั น้ำท่ีปลาย Electrode เบาๆ หลังการใช้งานทุกครงั้ (ห้าม
สัมผัสกระเปาะแก้ว) เมื่อค่าท่ีอ่านได้เปลี่ยนไปจากเดิมมาก เนื่องจากอาจจะมีคราบน้ำมัน หรือไขมัน
ให้เตรียมผงซักฟอกผสมน้ำแล้วแช่ Electrode ประมาณ 20 – 30 นาที แล้วล้างด้วยน้ำกลั่น หากมีการ
สะสมของผลึกเกลือ ให้จุ่ม Electrode ลงในน้ำประปาประมาณ 10 – 15 นาที แล้วฉีดด้วยน้ำกล่ัน หรือ
ให้ใช้ H2SO4 เข้มข้นร้อยละ 0.01 หรือ HCl เข้มข้นร้อยละ 0.01 แช่ electrode เป็นเวลาไม่เกิน 5
นาที เพื่อขจัดคราบต่างๆ ออก และทำการล้างด้วยน้ำกลั่นให้สะอาดซับให้แห้ง และเก็บ electrode
โดยการแช่ไวใ้ นสารละลายโพแทสเซยี มคลอไรด์ เข้มข้น 3 โมลาร์

43

6. เคร่อื งช่ัง
ก่อนการใช้งานเคร่ืองชั่งควรตรวจสอบลูกน้ำว่าอยู่ในตำแหน่งตรงกลางระดับน้ำหรือไม่

ถ้าไม่อยู่ตรงกลางให้ปรับเคร่ืองช่ังให้อยู่ในแนวระนาบ โดยหมุนขาตั้งเคร่ืองช่ังซึ่งอยู่ท่ีมุมท้ังซ้ายขวา
ทางด้านหลังเคร่ืองช่ัง แล้วทำการเปิดเคร่ืองและอุ่นเคร่ืองทิ้งไว้อย่างน้อย 20 นาที และทำการ
ตรวจสอบน้ำหนัก (Daily check) ก่อนใช้งานด้วยตุ้มน้ำหนักมาตรฐานที่สอบกลับได้ถึง NIST ให้
ครอบคลุมจดุ ที่ใช้งาน เมื่อทำการชั่งเสร็จแล้ว และต้องการเลิกการทำงานให้ถอดปล๊ักเคร่ือง และทำ
ความ สะอาดเครอ่ื งช่งั ให้พรอ้ มท่จี ะทำงานในครงั้ ตอ่ ไป

การทวนสอบเคร่ืองช่ังด้วยการทำ daily check น้ันให้เก็บค่าข้อมูลที่ได้มาทำ control
chart ตามช่วงน้ำหนักมาตรฐานการใช้งาน จำนวนไม่น้อยกว่า 20 วัน นำข้อมูลมาคำนวณหา x ,
SD, 2SD แล้วสร้างเป็น Control chart เม่ือทำการ daily check ในแต่ละวัน ให้เทียบน้ำหนักท่ีอ่าน
ได้กับ Control chart ถ้าเกิน +2SD หรือ -2SD แสดงวา่ เครือ่ งชั่งมีปัญหาไม่ให้ใช้เคร่ืองชั่ง ณ จุดใช้
งานน้ัน และทำ full calibration check ให้ดำเนินการส่งซ่อมและส่งสอบเทียบต่อไป และการสอบ
เทยี บกบั หน่วยงานภายนอกนัน้ จะต้องดำเนนิ การอย่างน้อย 1 ครง้ั ภายใน 12 เดือน

7. ตู้ปลอดเชอ้ื (Laminar air flow หรอื Biological safety cabinet)
กอ่ นเริ่มใช้งาน ต้องทำความสะอาดโดยเปิดไฟ UV ทิ้งไว้อย่างน้อย 20 นาที แล้วเช็ดทำ

ความสะอาดพ้ืนผิวภายในตู้ด้วยแอลกอฮอล์ 70% ให้ทั่ว แล้วจึงเร่ิมใช้งานตู้ปลอดเชื้อ และหลังจาก
ใช้งานตู้ปลอดเชื้อแล้ว ให้ปิดสวิทซไ์ ฟภายในตู้ และสวิทซ์พัดลมของส่วนกรองอากาศภายในตู้ให้หยุด
ทำงาน และเช็ดทำความสะอาดพ้ืนผิวภายในตู้ด้วยแอลกอฮอล์ 70% เล่ือนประตูของตู้ปลอดเชื้อลง
เพื่อปิด แล้วเปิดไฟ UV ท้ิงไว้ 30 – 60 นาที และลงบันทึกการใช้งานประจำวัน นอกจากนี้ยังควรทำ
ความสะอาดหลอดไฟ UV เดือนละ 1 คร้ัง ด้วยสำลีชุบแอลกอฮอล์ 70% และทำความสะอาด
ภายนอกตู้ทุกวันหลังเลิกงานโดยใชผ้ า้ ชุบนำ้ หมาดเชด็ และใชผ้ ้าชุบนำ้ ยาฆา่ เช้ือหมาดเชด็ อีกครง้ั

ในการควบคุมคุณภาพของตู้ปลอดเชื้อ ควรตรวจสอบการทำงานของ Filters จากบริษัท
ผขู้ าย ปีละ 1 คร้ัง และมีการทดสอบประสทิ ธิภาพของหลอด UV ทกุ 3 – 4 เดือน ดังน้ี

7.1. เตรียมเช้ือ Enterobacter aerogenes ที่มีปริมาณเช้ืออยู่ระหว่าง 2.0 - 2.5 x 103
โคโลนีต่อมิลลลิ ติ ร

7.2. ถ่ายเชื้อปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร ลงบนจานอาหารแข็ง PCA แล้วทำการ
spread plate

7.3. นำจานเพาะเช้อื ทไ่ี ดไ้ ปวางรับแสง UV ภายในตู้ปลอดเช้ือเป็นเวลา 2 นาที
7.4. นำไปบ่มท่อี ุณหภมู ิ 35 ± 1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ± 2 ช่ัวโมง

44

7.5. นบั จำนวนเช้ือ โดยหลอด UV ต้องทำลายเช้ือไม่น้อยกว่า 99% (เหลือจำนวนเชื้อ
ประมาณ 2 - 3 โคโลนี ต่อ 1 จานเพาะเชอ้ื )

8. ตูเ้ ย็นและตแู้ ชแ่ ข็ง (Refrigerator and Freezer)
ควรมีการแยกตเู้ ยน็ และตู้แช่แขง็ สำหรบั เก็บตวั อยา่ ง สารมาตรฐาน และเช้ืออ้างอิง

ภายในตูต้ ้องมีเทอร์โมมิเตอรท์ ี่ผ่านการสอบเทียบแลว้ วางไว้ในตูเ้ พ่ือใชใ้ นการตรวจสอบและบนั ทึก
อุณหภูมิทุกวนั โดยมีการบันทึกอุณหภมู วิ นั ละ 2 ครั้ง เชา้ และบ่าย

9. เทอร์โมมเิ ตอร์
เทอรโ์ มมเิ ตอร์ทีใ่ ช้งานทั่วไปให้ใชช้ นิดที่มีความละเอียด 1 องศาเซลเซียส ในกรณีท่ีใชว้ ัด

อณุ หภมู ิภายในตู้บ่มและตู้เย็น ใหจ้ ุ่มเทอร์โมมิเตอรไ์ ว้ในน้ำหรือกลีเซอรอล กรณีใช้วัดอุณหภูมภิ ายใน
ตู้แช่แข็ง ให้จุ่มไว้ในกลีเซอรอลซ่ึงบรรจุในขวดปิดผนึก สำหรบั การวัดอุณหภูมิภายในอ่างน้ำควบคุม
อุณหภูมิท่ี 44.5 องศาเซลเซียส ให้ใช้เทอร์โมมิเตอร์ชนิดท่ีมีความละเอียด 0.2 องศาเซลเซียส หรือ
Thermocouple และควรสอบเทียบกับเทอร์โมมิเตอร์ท่ีสามารถสอบกลบั ความถูกตอ้ งไปยัง NIST ได้
ปีละคร้ัง

ภาพ 30 ลักษณะเทอร์โมมิเตอรท์ ใ่ี ช้วัดอณุ หภูมใิ นตู้เยน็ หรอื ตูแ้ ชแ่ ข็ง

10. เคร่อื งแก้ว
เครื่องแก้วที่ใช้ในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาควรทำจากวัสดุคุณภาพสูงชนิด low –

alkali borosilicate เพื่อป้องกันการชะล้างของ alkali ที่ผิวหน้าของแกว้ โดยจะต้องมีลักษณะเรียบ
และไมม่ รี อยขดี ขว่ น ในการลา้ งเครอ่ื งแก้วแตล่ ะชนดิ ควรปฏบิ ัตดิ งั นี้

10.1. จานเพาะเช้ือหรือหลอดทดลองซ่ึงผ่านการทดสอบแล้ว หรือมีอาหารเล้ียงเช้ือท่ี
ปนเปื้อนอยู่ ใหท้ ำการฆา่ เชอื้ กอ่ น แล้วแยกเอาอาหารเลยี้ งเช้อื ออก

45

10.2. ปิเปตท่ีใช้ในการทดสอบแล้ว ให้แช่ในสารฆา่ เชื้อหลังจากใช้งานเสร็จแล้วนำมาแช่
สารฆ่าเชื้อนาน 10 – 20 นาที แล้วล้างด้วยน้ำยาล้างจาน 1 ครั้ง น้ำเปล่า 2 คร้ัง และกล้ัวด้วยน้ำ
กลั่น 1 คร้ัง หากปิเปตมีอาหารแข็งติดอยู่ด้านปลาย ให้ทำการจุ่มปลายท่ีมีเศษอาหารในน้ำกลั่นที่
อณุ หภูมิประมาณ 80 องศาเซลเซียส จนกวา่ อาหารแข็งจะละลาย แลว้ จงึ นำไปล้างต่อไป

10.3. เครื่องแก้วที่ใช้ในการเตรียมอาหารเล้ียงเชื้อและสารละลายเจือจาง สามารถนำไปล้าง
ได้ทันที

10.4. การตรวจสอบประสิทธิภาพในการล้างเคร่ืองแก้วให้ตรวจสอบความเป็นกรด – ด่าง
เพื่อดูความสะอาดของเครื่องแก้วว่ามีกรดหรือด่างตกค้างโดยหยด 0.04% Bromthymol blue
(BTB) จำนวน 2 - 3 หยด บนเคร่ืองแก้วทุกชนิดสังเกตการเปลี่ยนสีของ BTB ในช่วงสภาวะที่เป็น
กลาง (pH 6.0 – 7.6) จะเกิดสีเขียวแกมน้ำเงิน ในช่วงสภาวะเป็นกรดจะเกิดสีเหลือง ในช่วงสภาวะ
เป็นด่างจะเกิดสีน้ำเงิน ทำการตรวจสอบหลังการล้างทุกคร้ัง โดยการสุ่มตรวจร้อยละ 10 ของเคร่ือง
แกว้ แตล่ ะชนิดทลี่ า้ ง

10.5. นอกจากน้ียังต้องทดสอบผลการยับยั้งเชื้อ (Test for inhibitory residues) ทำ
การทดสอบเม่อื มกี ารเปลีย่ นนำ้ ยาท่ใี ช้ล้าง ซง่ึ สามารถดำเนนิ การไดด้ ังนี้

10.5.1 แบ่งจานเพาะเช้อื ชนดิ แก้ว ออกเป็น 4 กลมุ่ A, B, C และ D ตามวธิ กี ารล้าง ดังน้ี
- กลุ่ม A ล้างแบบปกติ (อัตราส่วน 1 ต่อ 10) และกล้ัวด้วยน้ำกล่ัน โดยปฏิบัติ
ตามวธิ ีการลา้ งปกติจำนวน 6 คู่
- กลุ่ม B ล้างแบบปกติ และกล้วั ดว้ ยน้ำกลัน่ 12 ครงั้ จำนวน 6 คู่
- กลุ่ม C ล้างแบบปกติ แล้วกลั้วด้วยน้ำยาท่ีใช้ล้าง (ใช้น้ำยาท่ีเข้มข้น) และ
ปลอ่ ยใหแ้ ห้ง จำนวน 6 คู่
- กลมุ่ D เป็นจานเพาะเชอ้ื ชนดิ พลาสติก

10.5.2 นำจานเพาะเชือ้ ในกลมุ่ A, B, C ไปอบฆา่ เชือ้ ตามปกติของหอ้ งปฏิบัติการ
10.5.3 เตรียมเชือ้ Enterobacter aerogencs จำนวน 50 – 150 โคโลนตี อ่ มิลลิลติ ร
10.5.4 ถ่ายเชื้อ Enterobacter aerogenes ปริมาณ 0.1 มิลลิลิตร ลงในจาน
เพาะเชื้อ ท้งั 4 กลมุ่ โดยแต่ละกลุม่ ใช้จานเพาะเชื้อจำนวน 3 คู่
10.5.5 ถ่ายเช้ือ Enterobacter aerogenes ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ลงในจาน
เพาะเช้ือ ทั้ง 4 กล่มุ โดยแต่ละกลมุ่ ใชจ้ านเพาะเช้อื จำนวน 3 คู่
10.5.6 ทำการ Pour plate โดยใช้อาหารแข็ง PCA แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 
1 องศาเซลเซียส นาน 48  2 ช่ัวโมง