คู่มือการปฏิบัติงานด้านมาตรฐานห้องปฏิบัติการ สำหรับห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา

46

10.5.7 นับจำนวนจุลินทรีย์ในแต่ละจานเพาะเช้ือ แล้วแปลผล ความแตกต่าง
ของจำนวนจลุ นิ ทรยี เ์ ฉลีย่ ตามตาราง 2

ตาราง 2 การแปรผลการทดสอบผลการยบั ย้งั เชือ้ (Test for inhibitory residues)

กลมุ่ ทดสอบ คา่ ท่ไี ด้ การแปรผล

A และ B แตกตา่ งกันน้อยกวา่ รอ้ ยละ 15 - น้ำยาที่ใช้ล้างเคร่ืองแก้วมีคุณสมบัติยับย้ัง

A และ C แตกตา่ งกนั มากกวา่ ร้อยละ 15 เชือ้ จลุ นิ ทรยี ์ได้

- วิธี ล้ างเค รื่อ งแ ก้ ว โด ย วิธี ป ก ติ ข อ ง

ห้องปฏิบัติการ สามารถล้างน้ำยาออกได้

หมด

A, B, C และ D แตกต่างกันนอ้ ยกวา่ รอ้ ยละ 15 - น้ำยาที่ใช้ไม่มีผลกระทบหรือยับยั้งการ

เจรญิ ของเช้อื

11. การทดสอบผลการฆ่าเช้ือของอุปกรณ์ต่าง ๆ

การตรวจสอบประสิทธิภาพการฆ่าเชื้อ (Sterility check) ของเครื่องแก้วและอุปกรณ์ที่

เกี่ยวข้องกับการทดสอบ ไม่ว่าจะเป็นถงุ พลาสติกใส่ตัวอย่าง กรรไกร ช้อน ปิเปต หลอดทดลอง ฯลฯ

สามารถทำได้โดยให้นำอุปกรณ์ไปจุ่มลง non – selective broth หรือทดสอบโดยการตรวจหา

จุลินทรีย์บนพ้ืนผิว (swab contract) แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิและเวลาท่ีเหมาะสมตามชนิดของ

เช้ือจุลินทรีย์ เมื่อครบเวลาท่ีกำหนดให้ทำการตรวจสอบผลการทดสอบประสิทธิภาพการฆ่าเชื้อ

(Sterility check) ต้องตรวจไมพ่ บเช้อื จุลนิ ทรีย์ ถ้าตรวจพบเชือ้ จลุ ินทรีย์ต้องทำการทดสอบตัวอยา่ งที่

ใช้อาหารเลย้ี งเชือ้ Batch นน้ั ใหมท่ ้งั หมด

การควบคุมคุณภาพของบคุ ลากร

บุคลากรผู้ที่ทำการทดสอบด้านจุลชีววิทยา จะต้องมีการรักษาความสะอาดอย่างเหมาะสม
เน่ืองจากจะต้องป้องกันตัวอย่างทดสอบจากการปนเป้ือนจากสภาวะแวดล้อมและผู้ทดสอบ เพื่อให้
ได้ผลการทดสอบที่ถูกต้องและแม่นยำ โดยจะตอ้ งมสี ุขลักษณะ ดังน้ี

1. สวมเสื้อกราวนส์ อี อ่ น สะอาด สภาพดี
2. ไม่สวมเส้ือกราวน์ออกนอกบริเวณท่ีปฏิบตั งิ าน
3. สวมหมวกปกคลมุ ผม หากจำเปน็
4. มีการล้างมอื ก่อนและหลังการปฏบิ ตั งิ าน และทันทีท่ีออกจากห้องนำ้
5. หลกี เล่ยี งการพดู คุย ไอ จาม ขณะปฏบิ ัตงิ าน

47

6. หา้ มสบู บุหรี่ กินอาหาร และดม่ื น้ำในบริเวณทท่ี ำการทดสอบ

นอกจากน้ีบุคลากรท่ีทำหน้าที่ในการทดสอบสำหรับการดำเนินงานภายใต้ระบบมาตรฐาน
ISO/IEC 17025: 2005 ต้องมีความรู้ ความสามารถ และมีประสบการณ์ในงานทดสอบนั้น หากไม่มี
จะต้องได้รับการฝึกอบรม เพ่ือให้ได้ผลการทดสอบที่มีคุณภาพ ดังนั้นจึงได้มีการกำหนดให้มีการ
ทดสอบประสิทธิภาพของผู้ทดสอบ อย่างน้อย 1 ครั้ง ภายใน 12 เดือน โดยแบ่งเป็น 3 กลุ่ม ได้แก่
บุคลากรใหม่ บุคลากรเก่า และบุคลากรสับเปล่ียนงาน นอกจากน้ันยังต้องมีการศึกษาหรือฝึกอบรม
เพ่ิมเติม เพือ่ ปรับปรุงประสิทธิภาพในการทำงานได้ดีข้ึน

บุคลากรใหม่และบุคลากรสับเปลี่ยนงานนอกจากจะได้รับการฝึกอบรมข้ัน ตอนการ
ดำเนนิ งานและวธิ ีการทดสอบทเ่ี กี่ยวข้องแล้ว ยังตอ้ งเรียนรจู้ ากการทำงานของบุคลากรเก่า และมกี าร
ประเมินความสามารถโดยผ่านการเฝ้าดูการปฏิบัติงาน เพ่ือให้มั่นใจว่าบุคลากรใหม่และบุคลากร
สับเปล่ียนงาน สามารถปฏิบัติงานได้อย่างถูกต้อง และเข้าใจในขั้นตอนการดำเนินงาน ท้ังน้ีจะต้องมี
การทดสอบประสิทธภิ าพภายในเทียบกับบุคลากรเกา่ ดว้ ย

บุคลากรเก่าต้องมีการพัฒนาความรู้ด้านเทคนิคในการปฏิบัติงานอย่างต่อเน่ือง โดยผ่านการ
อบรมเชิงปฏิบัติการซึ่งได้รับความเห็นชอบจากหัวหน้างาน มีการเข้าร่วมกิจกรรมทดสอบความ
ชำนาญ (Proficiency testing) เป็นประจำทุกปี โดยผลการประเมินจะต้องผ่าน (Z – score ≤
2) และมีการทดสอบประสิทธิภาพภายในทุกปี

การทดสอบประสิทธภิ าพภายใน
การทดสอบประสิทธิภาพภายในของการทดสอบทางจุลชีววิทยา สามารถทำได้ 3 วิธี คือ
ตัวอย่างที่ทราบค่าการปนเป้ือนชัดเจน (Internal QC Sample) ตัวอย่างท่ีมีการปนเป้ือนจากการ
เติมเชื้อจุลินทรีย์ (Spike sample) และตัวอย่างจากกิจกรรมทดสอบความชำนาญ (PT Sample) ซึ่ง
มีวธิ กี ารดงั นี้
1. การทำ Internal QC Sample อย่างน้อยปีละ 1 คร้ัง หรือเมอื่ มีการรับพนักงานใหมเ่ ข้ามา

1.1 ตวั อยา่ งทีใ่ ช้ในการทำการทดสอบมีทัง้ หมด 5 ตวั อยา่ ง
1.2 นำตัวอย่างท่ีได้มาทำการทดสอบตามวิธีทดสอบน้ัน ๆ โดยผู้ที่ทำการทดสอบเป็น
ผูจ้ ัดการวชิ าการหรอื หวั หน้างาน และเจา้ หนา้ ทที่ ดสอบทกุ คน ซึ่งตัวอย่างทใ่ี ชเ้ ป็นตัวอยา่ งเดียวกัน
1.3 เมอ่ื ครบเวลาบ่มเชื้อให้นับจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ในแต่ละตัวอย่าง นำผลของจำนวน
เช้ือจุลินทรีย์ของแต่ละคนมาเปลี่ยนเป็นค่า log10 แล้วนำมาเปรียบเทียบกัน โดยการเปรียบเทียบผล
ของจำนวนเช้อื ตอ้ งต่างกนั ไมเ่ กนิ Precision criterion จงึ ผา่ นการทดสอบ

48

2. การใช้ Spike Sample
2.1 ตัวอย่างที่ใช้ในการทดสอบมีท้ังหมด 5 ตัวอย่าง โดยเป็นตัวอย่างที่ผ่านการ

ตรวจสอบแลว้ วา่ ไม่มีการปนเปื้อนจากธรรมชาติ
2.2 เตรียมเชื้อจุลินทรีย์ตามแต่ละชนิดของการทดสอบ โดยถ่ายเช้ือจำนวน 1 loop

ลงในหลอดอาหาร TSB 9 มิลลิลิตร นำไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 35 ± 1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ช่ัวโมง
จากนั้นมาทำความเจือจางครั้งละ 10 เท่า โดยใช้ phosphate buffer 9 มิลลิลิตร ตั้งแต่ 10- 1 จนถึง
10- 8 ตรวจนับปริมาณเชื้อโดยใช้วิธีมาตรฐาน (Aerobic plate count) เพ่ือให้ทราบปริมาณของเช้ือ
ทเ่ี ตมิ (Spike) ลงไป

2.3 เตรียมตัวอย่างตามวิธีทดสอบน้ัน ๆ แล้วนำหลอดเช้ือท่ีระดับความเจือจางที่
ต้องการ ถ่ายเชื้อจำนวน 1 มิลลิลิตร ใส่ลงในตัวอย่างแล้วผสมให้เข้ากัน แล้วนำไปทดสอบตามวิธี
ทดสอบนั้น ๆ โดยผู้ท่ีทำการทดสอบเป็นผู้จัดการวิชาการหรือหัวหน้างาน และเจ้าหน้าที่ทดสอบทุก
คน และใชต้ ัวอย่างท่ีเปน็ ตัวอยา่ งเดยี วกัน

2.4 เมอ่ื ครบเวลาบ่มเช้ือให้นับจำนวนเชื้อจุลินทรยี ์ในแต่ละตัวอย่าง นำผลของจำนวน
เช้ือจุลินทรีย์ของแต่ละคนมาเปลี่ยนเป็นค่า log10 นำมาเปรียบเทียบกัน โดยการเปรียบเทียบผลของ
จำนวนเชอ้ื ตอ้ งตา่ งกันไมเ่ กนิ Precision criterion จึงผ่านการทดสอบ

3. การใช้ตัวอยา่ งจากกิจกรรมทดสอบความชำนาญ ในการทดสอบ
3.1 ตัวอย่างที่ใช้ในการทดสอบเป็นตัวอย่างจากกิจกรรมทดสอบความชำนาญ และ

เป็นตวั อย่างท่ีผ่านการทดสอบมาแลว้
3.2 นำตัวอย่างท่ีได้มาทำการทดสอบตามวิธีทดสอบนั้น ๆ โดยผู้ท่ีทำการทดสอบเป็น

ผ้จู ัดการวชิ าการหรือหัวหน้างาน และเจ้าหนา้ ทท่ี ดสอบทกุ คน ซง่ึ ตวั อยา่ งท่ีใชเ้ ป็นตวั อย่างเดียวกัน
3.3 เมื่อ ค รบ เว ล าบ่ม เชื้อ ให้ราย งา น ผ ล ก า รท ด ล อ ง แ ล้ว น ำผ ล ที่ได้ม า

เปรียบเทียบกับรายงานผลกิจกรรมทดสอบความชำนาญ โดยนำผลทดสอบของแต่ละคนมา
เปรียบเทียบตามวิธีการของกิจกรรมทดสอบความชำนาญแต่ละชนิด ซึ่งค่า Z – score ≤ 2
จึงผ่านการทดสอบ

49

การควบคุมคุณภาพ และการเกบ็ รกั ษาเช้ือจลุ ินทรีย์อ้างอิง

เชื้อจุลินทรีย์อ้างอิง เป็นสิ่งท่ีมีความสำคัญอย่างย่ิง เนื่องจากมีการใช้ประโยชน์หลายด้าน
ได้แก่ ใช้เป็นมาตรฐานของการทดสอบ ใช้ในการควบคุมคุณภาพอาหารเล้ียงเชื้อ ใช้ในการตรวจสอบ
ความใช้ได้ของวิธีการทดสอบ (Method Validation) และใช้ในการทดสอบประสิทธิภาพภายใน
ดังน้ันจึงต้องมีการเก็บรักษาเช้ือจุลินทรีย์อ้างอิงให้ถูกต้อง เพื่อรักษาคุณสมบัติทางพันธุกรรม และ
อตั ราการรอดของเชอื้ โดยเช้ือจลุ ินทรยี ์อ้างองิ แบง่ ออกเป็น 3 ระดบั ดงั น้ี

1. Master culture เป็นเช้ือจุลินทรีย์ท่ีเป็น Freeze dried ampoule หรือ Deep tube
stock agar หรือ Agar plate ใช้สำหรับการเตรียม Stock culture ท่ีได้รับมาจากหน่วยงานหรือ
องคก์ รตา่ ง ๆ

2. Stock culture เป็นเช้ือจุลินทรีย์ท่ีเก็บอยู่ในรูปของ Frozen glycerol มีอายุการเก็บ
รักษา 2 – 5 ปี ใชส้ ำหรบั การเตรยี ม Working culture

3. Working culture มีอายุการเก็บรักษา 1 – 4 สัปดาห์ ข้ึนกับความถี่ในการใช้งาน และ
ชนดิ ของเชอ้ื ใช้สำหรบั การควบคมุ คุณภาพการทดสอบ

เชื้อจุลินทรีย์อ้างอิงท่ีใช้น้ัน ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ได้มาจากศูนย์จุลินทรีย์ สถาบันวิจัย
วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย หรือกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข
นอกจากน้ีปัจจุบันหน่วยงานราชการและเอกชนหลายแหง่ มกี ารเกบ็ รวบรวมสายพันธุ์จุลนิ ทรยี ์ไว้ เพ่ือ
ใช้ประโยชน์ในหลายด้านด้วยกัน เช่น ใช้ในสถานศึกษา งานวิจัย โรงงานอุตสาหกรรมต่างๆ ใช้ใน
กระบวนการผลิต เป็นต้น ซึ่งจะแยกตามวัตถุประสงค์และลักษณะงานของหน่วยงานน้ัน ๆ เช่น เชื้อ
ก่อโรคในพืชจะเก็บรักษาที่กรมวิชาการเกษตร เช้ือราแมลงจะเก็บรักษาที่ศูนย์พันธุวิศวกรรมและ
เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ เป็นต้น โดยในบทนี้จะกล่าวถึงการเก็บรักษาและควบคุมคุณภาพของ
เชื้อจุลินทรีย์อ้างอิงซ่ึงได้มาจากแหล่งเก็บรวมรวมต่าง ๆ ซ่ึงถือว่าเป็น Master culture ของ
ห้องปฏิบัติการทดสอบ ตามวิธีการของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา สถาบันบริการตรวจสอบคุณภาพ
และมาตรฐานผลติ ภณั ฑ์ มหาวทิ ยาลยั แม่โจ้ ซ่ึงมวี ธิ กี าร ดังนี้

1. การเตรียม Stock culture จาก Master culture
1.1. ก รณี ท่ี เช้ื อ จุ ลิ น ท รีย์อ้ างอิ งระดั บ Master culture อ ยู่ ใน รูป แบ บ ขอ ง

Lyophilized culture จะต้องละลายเชื้อดังกล่าวด้วยอาหารเหลวที่ผา่ นการฆ่าเชื้อก่อนนำไปใช้ หาก
อย่ใู นหลอด Deep tube stock Agar และ slant agar tube สามารถนำไปใช้ไดเ้ ลย

1.2. ถ่ายเช้ือจากหลอด Master culture โดยใช้หว่ งถ่ายเช้ือเขยี่ เชอ้ื ลงในหลอดอาหาร
เหลว ปริมาตร 10 มิลลิลิตร นำไปบ่มที่อุณหภูมิ และระยะเวลาที่เหมาะสมตามคำแนะนำจาก
แหล่งจุลินทรีย์อ้างอิง

50

1.3. นำเชื้อท่ีได้ไป streak ลงบนอาหาร TSA plate นำไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 35 ± 1 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง สำหรับเชื้อ Yeast & Mold ถ่ายเช้ือจากหลอด slant โดยใช้ loop เขี่ย
เชอื้ ลงในอาหาร SDA plate นำไปบ่มทอ่ี ณุ หภูมิ 22-25 องศาเซลเซียสเปน็ เวลา 3-5 วัน

1.4. เมื่อครบเวลานำ plate ของเช้ือออกมาเพื่อทดสอบความบริสุทธิ์ของเชื้อสังเกต
ลักษณะของเชื้อตอ้ งเหมือนกนั ทั้ง plate

1.5. นำไปทดสอบคุณสมบตั ิของเชอื้ ทางด้านชีวเคมีตาม Bergy’s Manual of determinative
bacteriology หรอื ตามวิธีการของชดุ ทดสอบ API ซง่ึ เหมาะสมตามเชื้อจลุ ินทรียแ์ ตล่ ะชนดิ

2. การเตรยี ม Stock culture ของเช้ือจลุ ินทรียอ์ า้ งอิง
2.1. เตรียมหลอดอาหารเลีย้ งเช้ือทเี่ หมาะสมของจุลนิ ทรีย์แต่ละชนดิ
2.2. ถ่ายเชื้อโคโลนีเดี่ยวท่ีผ่านการทดสอบทางชีวเคมีแล้ว จากอาหารแข็ง โดยใช้เข็ม

เข่ียเช้ือลงในหลอดอาหารเหลวที่เหมาะสม นำไปบ่มตามอุณหภูมิและระยะเวลาที่เหมาะสมของ
เชอ้ื จลุ นิ ทรียแ์ ต่ละชนดิ

2.3. ถ่ายเช้ือจุลินทรีย์จากอาหารเหลวปริมาตร 800 มิลลิลิตร ลงในหลอดไมโครทิวป์ท่ี
ผ่านการฆ่าเช้ือแล้ว เติมสารละลายกลีเซอรอล เข้มข้นร้อยละ 80 ปริมาตร 200 มิลลิลิตร ผสมให้เป็น
เนื้อเดยี วกนั โดยใชเ้ คร่ืองเขยา่ สารละลายในหลอดทดสอง ประมาณ 10 วินาที

2.4. เก็บรักษาในตู้เย็นที่อุณหภูมิ - 20 องศาเซลเซียสเป็น Stock Culture ข้างหลอด
บันทกึ ช่อื เชือ้ จลุ นิ ทรยี ์ วนั ทเี่ กบ็

2.5. เช้ือจุลนิ ทรีย์ระดับ Stock culture เม่ือเก็บรกั ษาไว้นาน 2 ปี ให้นำเชื้อออกมา
ทดสอบความบริสุทธิ์ และคุณสมบัติเฉพาะ เม่ือเช้ือจุลินทรีย์ท่ีผ่านการทดสอบให้นำไปทำเป็น
Stock culture เกบ็ ไวใ้ หม่ และทำการทดสอบซำ้ ทกุ ๆ 1 ปี

3. การเตรยี ม Working culture ของเช้ือจลุ นิ ทรียอ์ า้ งองิ
3.1. ถา่ ยเช้ือจลุ นิ ทรีย์จาก Stock culture ลงในหลอดอาหารวนุ้ เอียง (slant)
3.2. นำไปบ่มตามอุณหภมู แิ ละระยะเวลาท่เี หมาะสมของเชื้อจลุ ินทรยี แ์ ตล่ ะชนิด
3.3. เกบ็ รักษาในตู้เย็นท่ีอุณหภูมิ 4 ± 4 องศาเซลเซียส เป็น working culture ข้างหลอด

อาหารบันทกึ ชื่อเชอ้ื จลุ นิ ทรีย์ วันทีเ่ ก็บ วันหมดอายุการเก็บ ซ่ึงมอี ายุการเก็บ รักษา 2 เดือน

51

ตาราง 3 คุณสมบัตทิ างชวี เคมีของเช้อื จุลินทรียอ์ า้ งองิ บางชนดิ

Characteristic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Gram Staining (24 h) - - + + + + ND ND + - - + - +

Oxidase (24 h) - - ND ND - - ND ND d - + - - d

Indole production + + ND ND ----

Methyl red + + ND ND - -+

Voges Proskauer - - ND ND + +-

Simmon's citrate growth - - ND ND ++ - -

H2S production - - ND ND - - -+

Urea hydrolysis - - ND ND +w +w - d+ -

Phenylalanine deaminase - - ND ND --

Lysine decarboxylase + + ND ND +- +

Arginine dihydrolase (-) (-) + + -+ +

Motility (+) (+) (-) (-) - - + (+) + + + +

Gelatin liquefaction (22 C) - - ND ND - ++ -

KCN growth - - ND ND +-

Esculin hydrolysis dd + (-)

Acetate utilization ++ d+

Nitrate reduction ++ ++ d++d+d

Lipase - - (+) (+) - ++ -

Catalase production (24 h) + + - - + + ++++++

Oxidation fermentation F F FF

Coagulase ++ ND

acid production form

D - glucose + + ND ND + + - ++

Gas form D - glucose + + ND ND + +-+-

Lactose ++++++ - + --

Sorbitol + + (+) (+) v + +

L - Arabinose + + ND ND - - ND ND + - -

Salicin d d ND ND - - ND ND + -

Inositol - - ND ND - ND ND + - -

หมายเหตุ

1. หมายเลข 1 – 14 บนหัวตาราง มคี วามหมายดงั นี้

1 หมายถึง Escherichia coli ATCC 25922 (TISTR 887)

2 หมายถึง Escherichia coli ATCC 8739 (TISTR 780)

3 หมายถึง Enterococcus faecalis ATCC 19433 (TISTR 379)

4 หมายถึง Enterococcus faecalis ATCC 29212 (DMST 2860)

52

5 หมายถึง Staphylococcus aureus ATCC 25923 (TISTR 517)
6 หมายถึง Staphylococcus aureus ATCC 6538 (DMST 8013)
7 หมายถึง Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 (TISTR 5774)
8 หมายถึง Aspergillus niger ATCC 16404 (TISTR 3552)
9 หมายถึง Bacillus cereus ATCC 11778 (TISTR 687)
10 หมายถึง Enterobacter aerogenes ATCC 13048 (TISTR 1540)
11 หมายถึง Psuedomonas aeruginosa ATCC 27853 (TISTR 1467)
12 หมายถึง Bacillus subtilis ATCC 6633 (TISTR 008)
13 หมายถึง Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (TISTR 1484)
14 หมายถึง Geobacillus stearothermophillus ATCC 7953

2. ND หมายถงึ ไมต่ ้องทำการทดสอบ หรือไมด่ ำเนนิ การทดสอบ (Not Determined)

การควบคมุ คณุ ภาพของอาหารเล้ียงเช้ือ

ในระบบมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005 ถือวา่ อาหารเล้ยี งเชื้อเปน็ Critical Material ซึ่ง
ต้องมีการทวนสอบก่อนนำไปใช้ในการทดสอบ โดยห้องปฏิบัติการจะต้องมีวิธีการในการดำเนินงาน
เกี่ยวกับการจัดซ้ือ การยอมรบั และการเกบ็ รักษาอาหารเล้ียงเช้ือท่ีเหมาะสมในแต่ละชนิด ซึ่งอาหาร
เลย้ี งเชอ้ื นัน้ สามารถแบง่ ออกเป็นประเภทต่าง ๆ ดงั นี้

1. Non - selective medium หรือ Simple medium
เป็นอาหารเลี้ยงเช้ือท่ัวไปซ่ึงสามารถใช้ในการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ได้หลายชนิด โดย

ประกอบด้วยสารอาหารท่ีจำเป็นต่อการเจริญของจุลินทรีย์ อาหารเลี้ยงเชื้อท่ีจัดอยู่ในกลุ่มนี้ได้แก่
nutrient broth (NB) nutrient agar (NA) หรอื trypticase soy broth เปน็ ต้น

2. Selective medium
เป็นอาหารเลี้ยงเช้ือที่ใช้เพ่ือการคัดเลือกจุลินทรีย์ชนิดท่ีต้องการให้เจริญได้เท่าน้ัน โดย

การเติมสารอาหารท่ีจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการสามารถใช้ได้ดี ในขณะที่จุลินทรีย์อ่ืนไม่สามารถ
ใช้ได้ หรือการเติมสารยับย้ังการเจริญของจุลนิ ทรียช์ นิดอืน่ ๆ อาหารกลมุ่ นี้โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูป
ของอาหารแข็ง ซ่ึงสามารถแบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ Selective Enrichment medium ซึ่งเป็นอาหาร
ท่ีใช้ในการเพ่ิมปริมาณของจุลินทรีย์เฉพาะกลุ่ม และ Differential selective medium ซ่ึงเป็น
อาหารทใ่ี ชใ้ นการคัดเลือกจุลินทรยี ์เฉพาะกลุ่มทสี่ นใจเท่านนั้

3. Biochemical medium

53

เป็นอาหารเลยี้ งเชื้อท่ใี ช้สำหรับทดสอบคุณสมบัติทางชวี เคมีของจุลินทรีย์ เพ่อื นำไปใชใ้ น
การระบุสายพันธจ์ุ ุลนิ ทรีย์

การจัดซ้ือและตรวจรับอาหารเลย้ี งเชอ้ื และสารเคมี
ในการจัดซ้ืออาหารเล้ียงเช้ือและสารเคมีเป็นสิ่งสำคัญ ซ่ึงทางห้องปฏิบัติการจะต้องมั่นใจได้
ว่า ผู้ผลิต/ผู้ขาย (Supplier) มีคุณภาพ โดยจะต้องมีการประเมินและข้ึนทะเบียนผู้จำหน่ายสินค้า/
บริการ ดังนี้
1. ฝ่ายจัดซ้ือหรือผู้ที่เก่ียวข้องรวบรวมข้อมูลการจัดซ้ือสินค้า / บริการ เพ่ือดำเนินการข้ึน
ทะเบยี นผ้จู ำหน่ายสนิ คา้ / บรกิ าร โดยดูจากประวตั กิ ารซ้ือขายท่ผี า่ นมา
2. ขอรายละเอียดเพิ่มเติมจากผู้จำหน่ายสินค้า / บริการ ท่ีได้ขึ้นทะเบียน เช่น ใบจด
ทะเบยี นการค้ากับกระทรวงพาณชิ ย์ ใบจดทะเบียนผูเ้ สียภาษี สำเนาสมุดบัญชีหน้าแรกท่ีมีเลขที่บญั ชี
พร้อมลงลายมอื ช่ือสำเนาถกู ต้อง เพ่ือนำมาประกอบกับแบบประวัติ และเก็บรวมไว้ในแฟ้มผู้จำหน่าย
สนิ คา้ / บรกิ าร รายนน้ั ๆ
3. ทำการประเมินผู้จำหน่ายสนิ ค้าและบริการที่มีผลต่อคุณภาพงานทดสอบปีละ 1 ครงั้ โดยผู้
ท่ผี ่านการประเมนิ จะต้องไดค้ ะแนนไม่ต่ำกวา่ ร้อยละ 60
4. เก็บรักษาบันทึกการประเมินเพื่อคัดเลือกผู้ขาย และบัญชีรายช่ือผู้ส่งมอบที่ได้รับการ
รบั รอง (Approve Vendor Lists)

การตรวจรับอาหารเลย้ี งเช้ือ
1. ตรวจสอบรายละเอียดในใบ Certificate โดยตรวจสอบ Lot No. ให้ตรงกับ Lot No. บน
ฉลากข้างภาชนะบรรจุ ดูวันเดือนปีท่ีหมดอายุ ต้องตรงกัน วันรับเข้าต้องอยู่ในช่วงไม่น้อยกว่าวัน
หมดอายุประมาณ 1 ปี เขียนวนั ที่รบั ไว้ทภ่ี าชนะบรรจุ อาจแต้มสีวันหมดอายุให้เห็นชัดเจน
2. ตรวจสอบสภาพภาชนะบรรจตุ ้องไม่ชำรดุ ฝายงั อย่ใู นสภาพทีป่ ิดผนกึ
3. บนั ทึกข้อมูลชื่ออาหารเล้ยี งเชอ้ื ยี่หอ้ หรือผู้ผลิต Lot no., วันทผี่ ลติ วันหมดอายุ จำนวน
วันทร่ี ับเข้า และผู้รับ
4. ทำการทดสอบอาหารเลย้ี งเชื้อ Lot ใหม่ เปรยี บเทยี บกบั อาหารเลี้ยงเชอื้ อา้ งอิง ดังนี้

4.1. ทำการถ่ายเช้ือจุลินทรีย์อ้างอิงตามตาราง 4 ซึ่งใช้ในการการทดสอบอาหารเล้ียง
เชื้อแต่ละชนิด จำนวน 1 ห่วงถ่ายเชื้อ จาก Working culture ใสล่ งในหลอดอาหาร TSB จำนวน 10
มลิ ลิลิตร นำไปบม่ ท่อี ุณหภมู ิทเี่ หมาะสม

4.2. ทำการเจอื จางเช้อื โดยใช้ BPB จำนวน 9 มิลลลิ ิตร ในระดับการเจือจางทเ่ี หมาะสม

54

4.3. ทำการ Pour plate โดยใช้เช้ือจากข้อ 5.1.4.2. ในระดับการเจือจางท่ีเหมาะสม
บ่มตามอณุ หภูมิและเวลาทเ่ี หมาะสมของเชื้อแต่ละชนดิ อา้ งอิงตามตาราง 1

4.4. เมื่อครบเวลา ทำการนับจำนวนจุลินทรีย์ของท้ังสองกลุ่ม แล้วคำนวณค่า
Productivity และค่า Selectivity จากสตู ร

PR = Ns / No และ SF = Do – Ds

โดย PR คอื Productivity Ratio
SF คอื Selectivity Factor
Ns คือ จำนวนจุลินทรียบ์ นอาหารทดสอบ
No คือ จำนวนจุลินทรีย์บนอาหารอ้างองิ
Do คือ ระดบั ความเจือจางสงู สดุ ที่เชอื้ Non – target เจรญิ ได้บนอาหารอ้างองิ
Ds คือ ระดบั ความเจอื จางสูงสุดที่เชือ้ Non – target เจรญิ ได้บนอาหารเล้ยี งเช้อื ทดสอบ

4.5. อาหารเล้ียงเชื้อ Lot ใหม่ท่ีผลการทดสอบผ่านสามารถรับสินค้าได้ให้นำไปเก็บ
รกั ษาในตู้ท่ีสภาพอากาศเย็นและแห้ง ไม่มีแสงหรือปฏิบัติตามคำแนะนำของบริษัทผู้ผลิต และเม่ือมีการ
เบกิ อาหารเลย้ี งเช้ือให้ทำการบนั ทกึ ไวท้ ุกคร้งั

การตรวจสอบประสทิ ธภิ าพอาหารเลีย้ งเชอ้ื และสารท่ีใช้เจือจาง
(สำหรับใช้ในการทดสอบ)
ทำการทดสอบอาหารเลยี้ งเชื้อ โดยเปรียบเทยี บกับอาหารเล้ียงเช้ืออ้างอิง ดงั น้ี
1. อาหารเล้ียงเชอ้ื ท่เี ป็น Non selective media ชนิดอาหารแขง็

อาหารเลี้ยงเชื้อท่ีเป็น Non selective media ชนิดอาหารแข็งท่ีใช้ในวิธีทดสอบนั้น ๆ
ให้ทำการทดสอบ Productivity Ratio (PR) เปรียบเทียบกับอาหาร TSA โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์อ้างอิง
ตามตาราง 4 มวี ิธกี าร ดังนี้

1.1. เตรยี มเชื้อจลุ นิ ทรียอ์ า้ งองิ Working culture ตามวิธกี ารตรวจรบั อาหารเล้ยี งเชื้อ
1.2. หากค่า PR มากกว่า 0.7 แสดงว่า อาหาร lot น้ัน ผ่านการทดสอบ สามารถนำมาใช้
ได้

2. อาหารเลีย้ งเชื้อทีเ่ ป็น Non selective media ชนิดอาหารเหลว
อาหารเลี้ยงเชื้อท่ีเป็น Non selective media ชนิดอาหารเหลวที่ใช้ในวิธีทดสอบน้ัน ๆ

เปรยี บเทยี บกบั อาหารเลีย้ งเชอ้ื อ้างองิ TSB ด้วยวิธี qualitative โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์อา้ งอิงตามตาราง
4 มวี ธิ ีการ ดงั น้ี

55

2.1. เตรยี มเชอ้ื จลุ นิ ทรียอ์ า้ งองิ Working culture ตามวธิ ีการตรวจรับอาหารเลี้ยงเช้ือ
2.2. เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อทดสอบ และอาหารเลี้ยงเชื้ออ้างอิง TSB หลอดละ 10
มิลลิลิตร
2.3. ถ่ายเชื้อจำนวน 1 ห่วงถ่ายเช้ือ จากข้อ 2.2. ลงในหลอดอาหาร นำไปบ่มที่
อุณหภมู ิและเวลาตามความเหมาะสมของเช้ือจลุ นิ ทรยี ์ (ตาราง 4)

2.3.1 นำหลอดออกมาอา่ นผล และคำนวณ ดังนี้
นบั 2 คะแนน เมื่ออาหารขุน่ ถงึ ขุ่นมาก แสดงวา่ เช้อื เจริญดี
นับ 1 คะแนน เมือ่ อาหารขุ่นน้อย แสดงวา่ เชอื้ เจรญิ ไมด่ ี
นับ 0 คะแนน เมอ่ื อาหารไม่ขนุ่ แสดงวา่ เชือ้ ไม่เจรญิ

2.3.2 เกณฑ์การยอมรับ หลอดอาหารขุ่น และได้ระดับคะแนน 2 อาหารเล้ียง
เชือ้ Lot นนั้ จึงผ่านการทดสอบ และใชง้ านได้

3. อาหารเลย้ี งเชอื้ ทดสอบทเี่ ปน็ อาหารแข็งชนดิ Selective medium
อาหารเล้ียงเช้ือทดสอบที่เป็นอาหารแข็งชนิด Selective medium ให้เปรียบเทียบกับ

อาหารเล้ียงเชื้ออ้างอิง TSA คำนวณหาค่า Productivity และ Selectivity โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ท่ี
เหมาะสมกับอาหารเลี้ยงเชอื้ ทีต่ ้องการทดสอบ ดงั น้ี

3.1. เตรียมเช้อื อา้ งองิ ตามวธิ กี ารตรวจรบั อาหารเลีย้ งเชื้อ
3.2. คำนวณค่า Productivity และค่า Selectivity
3.3. หากค่า PR ท่ีคำนวณได้มากกว่าหรือเท่ากับ 0.5 หรือ 50% และค่า SF ต้องมากกว่า
หรอื เท่ากับ 5 ผลการทดสอบ จงึ ถอื วา่ ผ่านเกณฑ์สามารถนำอาหารเลยี้ งเชอ้ื Lot มาใชง้ านได้

4. อาหารเล้ียงเช้อื ทดสอบทีเ่ ปน็ อาหารเหลวชนิด Selective medium
อาหารเลี้ยงเชื้อทดสอบท่ีเป็นอาหารเหลวชนิด Selective medium แบบมีหลอดดักก๊าซ

ทำการทดสอบแบบ Semi-quantitative ดูการเกิดกา๊ ซและขุ่น มวี ธิ กี าร ดงั น้ี
4.1. เตรยี มเช้ืออ้างอิงตามวธิ กี ารตรวจรบั อาหารเล้ยี งเช้ือ
4.2. เตรยี มอาหารเลี้ยงเช้อื ทต่ี ้องการทดสอบ 10 มลิ ลิลิตร
4.3. Spike เชอื้ ตามตาราง 4 ลงในอาหารเล้ยี งเชื้อ
- เชื้อ Target ให้มปี รมิ าณ 10 – 100 โคโลนตี ่อมลิ ลิลติ ร
- เชอ้ื Non – target ใหม้ ปี รมิ าณ มากกว่า 1,000 โคโลนตี ่อมลิ ลิลิตร
4.4. บ่มตามอุณหภูมแิ ละเวลาตามความเหมาะสมของเช้อื จุลินทรีย์

56

4.5. หลอดเชื้อ Target ต้องมีการเจริญ ขุ่น +2 และเกิดก๊าซ 1/3 ของหลอดดักก๊าซ
และหลอดเชื้อ Non – target ต้องไม่พบการเจริญ จึงถือว่า ผ่านเกณฑ์ สามารถนำอาหารเล้ียงเชื้อ
Lot นนั้ มาใช้ได้

5. สารละลายทีใ่ ชเ้ จอื จาง
5.1. เตรียม Butterfield’s phosphate-buffered dilution water (BPB) โดยใช้

สารเคมี Lot ใหม่ตามขั้นตอนทรี่ ะบุไว้โดยผูผ้ ลติ
5.2. เตรยี มเช้อื อ้างองิ ตามวธิ ีการตรวจรบั อาหารเลย้ี งเช้ือ
5.3. Spike เชือ้ ตามตาราง 4 ลงในสารท่ีใช้เจอื จางทตี่ ้องการทดสอบ โดยทำเป็น 2 ชุด

การทดลอง
- เชือ้ Target ให้มีปรมิ าณ 10 – 100 โคโลนีตอ่ มลิ ลลิ ติ ร
- เชอื้ Non – target ให้มีปริมาณ มากกว่า 1,000 โคโลนีต่อมิลลิลติ ร

5.4. นำไปสารที่ใช้เจือจาง ชุดที่ 1 ไป Spread ลงบน Non – selective medium แล้ว
บ่มตามอณุ หภมู แิ ละเวลาตามความเหมาะสมของเชือ้ นน้ั ๆ (อ้างองิ ตามตาราง 4)

5.4.1 นำไปสารท่ีใช้เจือจาง ชุดที่ 2 ไปบ่มท่ีอุณหภูมิห้อง 45 นาที แล้วนำไป Spread
ลงบน Non – selective medium แล้วบ่มตามอุณหภูมิและเวลาตามความ
เหมาะสมของเช้ือน้ัน ๆ (อา้ งองิ ตามตาราง 4)

5.4.2 ประเมินผล จำนวนโคโลนีของเช้ือ Target และ Non – target ของการ
ทดลองชุดท่ี 1 และ 2 โดยจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ต้องต่างกันไม่เกิน ± 50% จึง
สรุปได้วา่ BPB ทใ่ี ชม้ ีคณุ ภาพในการรักษาสภาพของเชอื้ จุลนิ ทรยี ์

การตรวจสอบประสิทธิภาพการฆา่ เชื้อของอาหารเลี้ยงเช้ือ และสารทใี่ ช้เจอื จาง
การตรวจสอบประสิทธิภาพการฆ่าเช้ือ (Sterility check) ของอาหารเล้ียงเชื้อ และสารท่ีใช้
เจือจาง เป็นการสุ่มอาหารเลี้ยงเช้ือแต่ละ Batch no. และสารที่ใช้เจือจาง แต่ละ Batch no. ที่
ต้องการทดสอบประสิทธิภาพในการฆ่าเชื้อมาตรวจสอบโดยให้ทำการทดสอบพร้อมกับการทดสอบ
ตวั อยา่ ง ดังนี้
1. อาหารเลีย้ งเช้ือชนิดอาหารแข็งทวั่ ไป

อาหารเล้ียงเช้ือที่ต้องการทดสอบในแต่ละ Batch ก่อนเร่ิมทำการทดสอบให้เทอาหารท่ี
ฆ่าเชื้อแล้วปริมาตร 12 – 15 มิลลิลิตร ใส่ลงในจานเพาะเช้ือเปล่าท่ีผ่านการฆ่าเช้ือแล้ว ที่อุณหภูมิ
170 ± 10 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ช่ัวโมงจำนวน 1 คู่ แล้วนำไปบ่มตามวิธีทดสอบที่ใช้อาหาร
เลีย้ งเชือ้ ชนิดนัน้

57

2. อาหารเล้ียงเช้ือชนิดอาหารเหลว หรืออาหารเล้ยี งเชอื้ ท่ใี ชส้ ำหรบั การทดสอบทางชวี เคมี
เม่ือเตรียมอาหารเล้ียงเช้ือที่ต้องการทดสอบในแต่ละ Batch เสร็จแล้วให้สุ่ม 1 หลอด

หรือจานอาหาร ไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 35 ± 1 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง เพ่ือสังเกตการณ์เจริญของ
เชอ้ื

3. สารที่ใชเ้ จอื จาง
ดูดสารละลาย BPB ปริมาตร 1 มิลลิลิตร จากขวด BPB 450 มิลลิลิตร และหลอด 9

มิลลิลิตร ใน Batch no. ท่ีต้องการตรวจประสิทธิภาพ โดยใช้ปิเปต ขนาด 1 มิลลิลิตร จาก lot การ
อบที่ต้องการตรวจสอบประสิทธิภาพ ใส่ลงในจานเพาะเช้ือเปล่าอย่างละ 2 คู่ แล้วจึงทำตามวิธี
ทดสอบ เรื่อง Aerobic plate count แล้วนำไปบ่มท่ีอุณหภูมิและเวลาท่ีเหมาะสมตามชนิดของ
เชอ้ื จลุ นิ ทรีย์

เมื่อครบเวลาที่กำหนดให้ทำการตรวจสอบผลการทดสอบประสิทธิภาพการฆ่าเชื้อ
(Sterility check) ตอ้ งตรวจไมพ่ บเชือ้ จุลินทรีย์ ถา้ ตรวจพบเชอ้ื จลุ ินทรยี ต์ ้องทำการทดสอบตวั อยา่ งท่ี
ใช้อาหารเลยี้ งเชอื้ หรือสารทใ่ี ช้เจอื จาง Batch นนั้ ใหม่ทัง้ หมด

ตาราง 4 การทดสอบประสทิ ธิภาพอาหารเลย้ี งเชอื้ โดยใชจ้ ุลนิ ทรียอ์ า้ งองิ

ลำดับ อาหารเล้ียงเชอ้ื จุลินทรยี ท์ ดสอบ อณุ หภูมิท่ใี ช้ ผลการทดสอบ
ในการเพาะเล้ียง

1 Plate Count Agar (PCA) Positive culture: Escherichia coli ATCC 8739 or 35 – 37 องศาเซลเซยี ส เกิดโคโลนบี นอาหาร

25922

Bacillus subtilis ATCC 6633

2 Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST PNoesgiatitvivee ccuullttuurree:: -Escherichia coli ATCC 8739 or 35 – 37 องศาเซลเซียส เกิดก๊าซและอาหารขนุ่

25922 ไมเ่ กดิ การเจริญ

3 Brilliant Green Lactose Bile Broth PNoesgiatitvivee cucultluturer:e:EsScthaeprhicyhloiacoccoculis ATauCrCeu8s73A9TCoCr 35 – 37 องศาเซลเซยี ส เกิดก๊าซและอาหารข่นุ
(BGLB) 2255992223
ไม่เกดิ การเจริญ

4 EC broth NPoesgiatitviveecuclutultruer:e:EscShtaeprihchyliaoccooclciuAsTCaCur8eu7s3 A9TCoCr 35 – 37 องศาเซลเซียส เกดิ ก๊าซและอาหารขุน่
2255992223 ไมเ่ กดิ การเจรญิ

5 Eosin Methylene Blue (EMB) Agar NPoesgiatitviveeculctuulrteu:reE:schEenrticehroiaccooclci uAsTCCfa8e7c3a9liosr 2A5T9C2C2 35 – 37 องศาเซลเซยี ส เจริญไดด้ ี, โคโลนขี นาดใหญ่
1N9e4g3a3tive culture: Enterococcus faecalis ATCC
บางสว่ นถูกยับยงั้ การเจริญ

6 Baird-Parker Medium 2P9o2si1t2ive culture: Staphylococcus aureus ATCC 35 – 37 องศาเซลเซียส เกดิ โคโลนีบนอาหาร

25923 ไมพ่ บโคโลนบี นอาหาร

7 MYP agar NPoesgiatitviveecuclutultruer:e:BaEcsicllhuesriccehrieauscoAlTi CACT1C1C7788739 or 35 – 37 องศาเซลเซยี ส เกิดโคโลนสี ชี มพูบนอาหาร
2N5e9g2at2ive culture: Escherichia coli ATCC 8739 or 25922
และมตี ะกอนเกลือ

ไมพ่ บโคโลนบี นอาหาร 58

ตาราง 4 (ต่อ) จลุ นิ ทรียท์ ดสอบ อุณหภมู ิท่ีใช้ ผลการทดสอบ
ในการเพาะเลี้ยง เกิดโคโลนีบนอาหาร
ลำดบั อาหารเลีย้ งเช้ือ Positive culture: Staphylococcus aureus ATCC
8 Trypticase Soy Agar (TSA) 25923 35 – 37 องศาเซลเซยี ส
Negative culture: -
9 Trypticase Soy Broth (TSB)
10 Nutrient Agar (NA) Positive culture: Staphylococcus aureus ATCC 35 – 37 องศาเซลเซียส อาหารขุ่น
25923 35 – 37 องศาเซลเซียส เกดิ โคโลนีบนอาหาร
11 Nutrient Broth (NB) NPoesgiatitvivee ccuullttuurree:: -Escherichia coli ATCC 8739 or
25922 35 – 37 องศาเซลเซยี ส อาหารขุ่น

Bacillus subtilis ATCC 6633
NPoesgiatitvivee ccuullttuurree:: -Escherichia coli ATCC 8739 or
25922

Bacillus subtilis ATCC 6633
Negative culture: -

59

60

การเก็บรักษาอาหารเลยี้ งเช้ือและสารเคมี
ห้องปฏิบัติการควรมีการเก็บรักษาสารเคมี อาหารเลี้ยงเชื้อ สารละลาย สารมาตรฐาน และ
วัสดุอ้างอิงอย่างถูกวิธี โดยบันทึกรายละเอียดต่าง ๆ เช่น ย่ีห้อ วันที่หมดอายุ วันที่รับ วันท่ีเปิดใช้ และ
สถานท่ีเก็บรักษา นอกจากนี้ในข้ันตอนการรับอาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมีที่ซื้อแต่ละรุ่น (Lot) ควร
ตรวจสอบลักษณะภายนอกวา่ ตรงตามทร่ี ะบุไว้ในขอ้ กำหนดหรือไม่ โดยอาหารเลี้ยงเชอื้ สำเรจ็ รูปควรเก็บ
ไว้ในที่เย็นและแห้ง ไม่มีแสง และปฏิบัติตามรายละเอียดการเก็บรักษาเพ่ิมเติมจากผู้ผลิต เช่น เก็บใน
ตู้เย็น ท่ีมืด เป็นต้น โดยหลังจากเปิดใช้งานควรใช้ให้หมดภายใน 6 เดือน หากเป็นอาหารเล้ียงเช้ือท่ีมีสี
เป็นองค์ประกอบควรเก็บในท่ีมืด หรือใช้ขวดสีเข้ม หรือห่อด้วยฟอยล์ พร้อมทั้งจัดทำระบบ Stock และ
มีการบันทึกการนำไปใช้
การเก็บรักษาอาหารเลี้ยงเชื้อท่ีผ่านการฆ่าเชื้อแล้วมีระยะเวลาการเก็บรักษาดังตาราง 5
สำหรับอาหารเล้ียงเช้ือท่ีมีสีเป็นส่วนผสมจะต้องเก็บไว้ในลักษณะที่ไม่ถูกแสง หากสีของอาหารเล้ียง
เช้อื เปลี่ยนแปลงจะตอ้ งไม่นำมาใชง้ าน

ตาราง 5 ระยะเวลาการเกบ็ รักษาอาหารเล้ียงเชื้อทีเ่ ตรียมแล้ว

อาหารเลีย้ งเชื้อ สภาวะในการ ระยะเวลาการ
เก็บรักษา เก็บรกั ษา
อาหารเล้ยี งเชื้อแบบเหลว (broth) ทผ่ี า่ นการฆ่าเชือ้ โดยใช้ 4 0C 96 ชวั่ โมง
membrane filter และเกบ็ ไวใ้ นขวดปดิ ฝาเกลยี ว 4 0C
อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง (agar) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ โดยใช้ 4 0C 2 สัปดาห์
membrane filter และเทเพลทไว้แลว้ โดยมฝี าปิดสนิท
อาหารเล้ียงเชื้อแบบแข็งและแบบเหลวที่เก็บไว้ในหลอดปิด 4 0C 2 สปั ดาห์
ฝาครอบแบบหลวม 4 0C
อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งและแบบเหลวที่เก็บไว้ในหลอดท่ี 3 เดือน
ปิดฝาเกลียว
อาหารเล้ียงเช้ือแข็งท่ีเทใส่จานอาหารแล้ว ปิดฝาครอบ 2 สปั ดาห์
แบบหลวม และเกบ็ ไว้ในถุงพลาสตกิ ทปี่ ดิ ผนกึ ปากถุง
อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งปริมาณมากที่เก็บไว้ในขวดปิดฝา 3 เดอื น
เกลียว

61

คุณภาพน้ำที่ใชใ้ นห้องปฏิบัติการ
คุณภาพน้ำมีผลกระทบต่อการทดสอบและน้ำท่ีได้จากระบบการทำน้ำบริสุทธิ์แต่ละชนิดมี
คุณภาพแตกต่างกัน จึงควรมีการทดสอบคุณภาพน้ำก่อนนำไปใช้งาน ซ่ึงน้ำท่ีใช้ในการทดสอบทาง
จลุ ชีววทิ ยาควรมกี ารตรวจสอบ ดังตาราง 6

ตาราง 6 คุณภาพน้ำที่ใชใ้ นการทดสอบทางจลุ ชีววิทยา

รายการทดสอบ ความถใ่ี นการทดสอบ เกณฑ์การยอมรับ
คา่ การนำไฟฟา้ (conductance) ทกุ วันหรอื ทุกรุน่
< 2 S / cm
ความเป็นกรด-ด่าง ทุกวันหรอื ทุกรุ่น หรอื ค่าความต้านทาน (resistance)
โลหะหนัก (ปริมาณทงั้ หมด) ปีละครง้ั
ปริมาณคลอรนี หลงเหลอื ท้ังหมด ทกุ วันหรอื ทุกรนุ่ > 0.5 M-cm ที่ 25C
ปรมิ าณจุลนิ ทรยี ์ทงั้ หมด เดอื นละคร้ังหรือทกุ รนุ่ 5.5 – 7.5
< 0.10 มลิ ลกิ รัมตอ่ ลิตร
< 0.01 มิลลิกรมั ต่อลติ ร
< 1,000 โคโลนีต่อมิลลลิ ิตร

การควบคมุ คุณภาพวธิ วี ิเคราะห์ทดสอบ

การควบคุมคุณภาพการทดสอบทางจุลชีววิทยา เป็นการประกันคุณภาพผลการทดสอบว่ามี
ความถูกต้อง แม่นยำ และใกล้เคียงจำนวนจุลินทรีย์ท่ีปนเปื้อนอยู่ในตัวอย่าง ซึ่งในห้องปฏิบัติการจุล
ชวี วิทยา มกี ารควบคมุ คณุ ภาพการวเิ คราะหท์ ดสอบ ดังน้ี

1. การใชเ้ ช้ือจุลินทรีย์ควบคมุ (Control culture)
สำหรับห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาสามารถตรวจทวนสอบข้ันตอนการทดสอบ โดย

การเติม (Spike) เชื้อจุลินทรีย์ควบคุมซึ่งมีทั้งเชื้อที่ให้ผลบวกและเช้ือที่ให้ผลลบลง ทั้งนี้เชื้อจุลินทรีย์
ควบคุมท่ีใช้จะต้องมีคุณภาพท่ีดีจึงจะให้ผลการทดสอบที่น่าเชื่อถือ ดังนั้นการเก็บรักษาเชื้อจึงมี
ความสำคัญโดยเช้ือควบคุมท่ีได้รบั การรับรองจะต้องนำมาเล้ียงในอาหารเล้ียงเชื้อท่ีเหมาะสมและเก็บ
รักษาไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และควรเก็บรักษาบันทึกการถ่ายเชื้อใหม่ทุกครั้ง ซ่ึงมีขั้นตอน
ดงั นี้

1.1. เตรียมเช้ือจุลินทรีย์ที่ใช้ในการทดสอบ Positive / Negative Control โดยใช้
เชื้อจุลินทรีย์ตามตาราง 1 ถ่ายเช้ือจากหลอด working culture จำนวน 1 ห่วงถ่ายเชื้อ ใส่ลงใน

62

หลอดอาหารของเชื้อแต่ละชนิด ปริมาตร 10 มิลลิลิตร นำไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 35 ± 1 องศาเซลเซียส
เปน็ เวลา 24 ชัว่ โมง ปรมิ าณเชื้อทไี่ ดป้ ระมาณ 107- 106 โคโลนีต่อมลิ ลิลิตร

1.2. ทำการเจือจางเช้ือจุลินทรีย์คร้ังละ 10 เท่า โดยใช้สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 9
มิลลิลิตร โดยเจือจางเป็นลำดับตั้งแต่ 10-1 จนถึง 10-6 แล้วตรวจนับจำนวนจุลินทรีย์เริ่มต้นด้วยวิธี
ทดสอบ Aerobic plate count

1.3. นำเชื้อจุลินทรีย์ที่มีระดับการปนเปื้อนครอบคลุมช่วงการทดสอบที่ต้องการ Spike ลง
ไปในตัวอย่าง จำนวน 10 – 100 โคโลนีต่อมิลลิลิตร เพ่ือใช้เป็น positive control และจำนวน มากกว่า
1,000 โคโลนีต่อมิลลิลิตร เพื่อใช้เป็น negative control แล้วนำไปดำเนินการทดสอบตามวิธีการทดสอบ
น้นั ๆ

1.4. นับจำนวนเชื้อจุลินทรีย์เปรียบเทียบกับจำนวนจุลินทรีย์ตั้งต้น โดยจำนวน
จุลินทรีย์ทั้งสองชุดต้องต่างกัน ไม่เกิน Pricision criteria หากเป็นการทดสอบเชิงคุณภาพ เชื้อ
Positive culture ตอ้ งตรวจพบจุลนิ ทรีย์ สว่ น Negative culture ต้องตรวจไมพ่ บจลุ นิ ทรีย์

ตาราง 7 ตวั อย่าง Positive / Negative Control Culture (Eaton et. al., 2005)

การทดสอบ Positive culture Negative Culture

โคลิฟอร์มในนำ้ Escherichia coli Staphylococcus aureus

Enterobacter aerogenes Pseudomonas sp.

ฟีคลั โคลฟิ อร์มในน้ำ Escherichia coli Enterobacter aerogenes

Escherichia coli ในนำ้ Escherichia coli Enterobacter faecalis

Total Plate Count Escherichia coli Dilution Buffer

Bacillus subtilis

ที่มา: APHA – AWWA (2005)

2. การกำหนดค่า Precision criteria สำหรับการทำซ้ำ
ในการควรมีการทดสอบซ้ำอย่างน้อยร้อยละ 10 ของจำนวนตัวอย่างที่ทดสอบในแต่ละ

คร้งั โดยกำหนดเกณฑ์ยอมรับของการทำซ้ำ โดยใช้ Precision criteria ซึง่ มีวิธกี ารกำหนดคา่ ดงั น้ี
2.1. ทำการทดสอบตัวอย่าง ตามวิธีทดสอบน้ัน ๆ โดยทำการทดสอบ 2 ซ้ำในแต่ละ

ตัวอย่าง จำนวน 15 ตัวอยา่ ง และผู้ทำการทดสอบตา่ งคนกันในแตล่ ะตัวอยา่ ง
2.2. นับจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ที่ได้ บันทึกผลการทดสอบเป็น D1 และ D2 นับจำนวน

จุลินทรีย์ที่ได้มาแปลงค่าเป็น logarithm ของแต่ละตัวอย่าง ถ้าค่า logarithm ของผลการทดสอบ
นอ้ ยกว่า 1 ไม่ใชค้ ่านนั้ ในการคำนวณ

63

2.3. คำนวณค่า logarithm ท่ีแตกต่างกันของผลการทดสอบท้ัง 2 ซ้ำ เป็นค่า R โดย
ไม่คดิ เครอื่ งหมาย และคำนวณค่าเฉลย่ี R ของทัง้ 20 ตวั อย่างเป็นคา่ R = Rlog / n

2.4. คำนวณคา่ Precision criteria = 3.27 R
2.5. นำค่า Precision Criteria ที่ได้มาตั้งเป็นเกณฑ์การยอมรับในการทำซ้ำร้อยละ 10
ของตัวอย่างท่ีทำการทดสอบประจำวัน โดยค่าความแตกต่างของค่า logarithm ของผลการทดสอบ
ทัง้ สองซำ้ ตอ้ งอยูใ่ นชว่ งทีก่ ำหนดไว้
2.6. ถ้าค่าความแตกต่างของแต่ละการทสอบเกินค่าท่ีกำหนด ให้ทำการวิเคราะห์
ตัวอย่างนั้นซ้ำอีกคร้ัง พร้อมกับวิเคราะห์หาสาเหตุของการเปล่ียนแปลงท่ีเกิดขึ้นก่อนที่จะทำการ
ทดสอบในตัวอย่างตอ่ ไป

การควบคมุ คุณภาพตัวอย่างทดสอบ

ห้องปฏิบตั ิการควรบันทึกรายละเอียดท่ีเกย่ี วข้องกับตัวอย่าง ได้แก่ สถานท่ีสุ่มตัวอย่าง วันที่
และเวลาในการสุ่มและรับตัวอย่าง (โดยเฉพาะอย่างยิ่งตัวอย่างที่เส่ือมสภาพเร็ว) รวมทั้งสภาวะการ
เก็บรักษาตัวอย่าง ควรระมัดระวังไม่ทำให้ตัวอย่างเกิดการปนเปื้อนเน่ืองจากความไม่เหมาะสมของ
อุปกรณ์ที่ใชส้ ุ่มตัวอยา่ ง ภาชนะที่ใชเ้ ก็บรักษา และสภาวะที่ใชข้ นถ่ายตวั อย่าง ห้องปฏบิ ตั ิการควรมี
การจัดการตัวอย่างท่ีดีโดยสามารถป้องกันการเส่ือมสภาพ การสูญหายหรือถูกทำลายในระหว่างการ
เก็บรักษา การขนถ่ายและการเตรียมตัวอย่าง นอกจากน้ีหมายเลขตัวอย่างต้องไม่ซ้ำกัน และมี
ฉลากระบุอย่างชัดเจนเพ่ือให้ม่ันใจว่าสามารถสืบย้อนกลับได้ตลอดทุกขั้นตอนตั้งแต่การสุม่ จนกระทั่ง
กำจัดตัวอย่างออกจากห้องปฏิบัติการ รวมทั้งมั่นใจได้ว่าผลทดสอบที่ได้เป็นของตัวอย่างท่ีนำมา
ทดสอบอย่างแท้จริง ซ่ึงในหัวข้อน้ีจะมีรายละเอียดการดำเนินงานเช่นเดียวกับบทท่ี 3 การจัดการ
ตัวอยา่ งทดสอบเพ่อื การวเิ คราะห์ จึงจะไมข่ อกลา่ วรายละเอียดซำ้ อกี

บทท่ี 5
การตรวจสอบความใช้ไดข้ องวธิ ที ดสอบทางจุลชีววิทยา

การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ (Method Validation) เป็นกระบวนการหนึ่งท่ีใช้
ตรวจสอบสมรรถนะของวิธีทดสอบ ว่าเหมาะสมกับวัตถุประสงค์ของการใช้งานหรือไม่ เพ่ือให้เกิด
ความมั่นใจว่า วิธกี ารทดสอบที่เลือกใช้รวมถงึ เครื่องมือและอุปกรณ์เหมาะสมต่อการทดสอบ สง่ ผลให้
การทดสอบมีประสิทธภิ าพ ถูกต้อง แม่นยำ เชื่อถือได้ ทำใหเ้ กิดความมั่นใจของผรู้ ับบริการหรือลูกค้า
โดยมีหลกั การดังนี้

1. ความจำเป็นต้องมีการตรวจสอบความใช้ไดข้ องวิธี เมอ่ื วธิ ีทดสอบเป็นดงั น้ี
1.1. วิธีทดสอบที่ใช้ไม่เป็นวิธีมาตรฐาน ไม่มีการยอมรับในระดับนานาชาติ

ห้องปฏิบัติการจำเป็นต้องทำการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธี เพ่ือให้แน่ใจว่าวิธีทดสอบน้ันสามารถ
ให้ผลทถ่ี ูกตอ้ งแมน่ ยำตรงตามวตั ถปุ ระสงค์การใช้งาน

1.2. เป็นวิธีทดสอบที่ห้องปฏิบัติการพัฒนาหรือออกแบบขึ้นเองโดยห้องปฏิบัติการไม่
อา้ งอิงตามวธิ ที ี่เป็นวิธมี าตรฐานซึง่ เป็นทีย่ อมรบั ในระดบั นานาชาติ

1.3. เป็นวิธีมาตรฐานที่ใช้นอกขอบข่ายท่กี ำหนด
1.4. มีการขยายและดัดแปลงวิธีมาตรฐาน เช่น ห้องปฏิบัติการอาจอ้างอิงตามวิธี
มาตรฐานแต่อาจมีบางข้ันตอนในวิธีทดสอบท่ีไม่ปฏิบัติตามวิธีมาตรฐานทุกประการ ซึ่งวิธีทดสอบน้ี
จะต้องมีการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีก่อนนำมาใช้งานเพื่อให้แน่ใจว่าหากมีการเปลี่ยนแปลงวิธี
ทดสอบจากวธิ มี าตรฐานไปบางส่วนผลการทดสอบที่ได้จะยงั คงความน่าเชอื่ ถือ

2. หลกั การสำหรับทำการตรวจสอบความใช้ได้ของวธิ ี
2.1. ครอบคลุมการประยุกต์ใช้ เช่น ห้องปฏิบัติการต้องการวิเคราะห์ปริมาณจุลินทรีย์

ทั้งหมดในขนมปังอยู่ในช่วง 1.0 x 102 ถึง 1.0 x 103 โคโลนีต่อกรัม การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธี
ทดสอบจะต้องครอบคลมุ อยู่ในช่วงดังกล่าวนี้ด้วย

2.2. มบี นั ทึกวธิ กี ารและผลท่ไี ด้จากการตรวจสอบความใช้ไดข้ องวธิ ี
2.3. มีข้อสรปุ บ่งชีว้ ่าวิธีน้ันเหมาะสมกับวตั ถุประสงคก์ ารใช้งาน

โดยเทคนิคที่ใช้ในการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบซ่ึงต้องมีการเปรียบเทียบ หรือ
แสดงให้เห็นว่าสามารถนำไปใช้ทดสอบได้ โดยสามารถดำเนินการตามวิธีต่าง ๆ วิธีหน่ึงหรือหลายวิธี
ตอ่ ไปนี้

1. การเปรยี บเทียบผลทไ่ี ด้กับวิธีอ่นื

65

2. การประเมนิ โดยใช้มาตรฐานอ้างองิ หรอื วสั ดอุ า้ งอิง
3. การเปรียบเทียบผลระหวา่ งหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร
4. การประเมนิ อยา่ งเป็นระบบเกยี่ วกบั ปัจจัยต่างๆท่มี ีอทิ ธพิ ลต่อผลท่ีได้
5. การประเมินค่าความไมแ่ น่นอนของผลที่ได้ตามหลกั วิชาการของวิธแี ละประสบการณ์

ทั้งนี้การตรวจสอบความใช้ได้ของวธิ ีทดสอบทางจุลชีววิทยาและทางเคมี มีความแตกต่างกับ
ประกอบกับในคู่มือเล่มน้ีเก่ียวข้องกับวิธีการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยา ดังนั้นในหัวข้อน้ีจะได้อธิบาย
แนวทางการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีการทดสอบเฉพาะด้านจุลชีววิทยา เพื่อให้แต่ละ
หอ้ งปฏิบตั ิการสามารถนำไปประยุกต์ใชใ้ ห้เหมาะสมต่อไป

แนวทางการวางแผนการตรวจสอบความใช้ได้ของวธิ ีทดสอบ

การตรวจสอบความใช้ไดข้ องวธิ ีทดสอบมแี นวทางกวา้ ง ๆ ดงั นี้
1. เลือกวิธีการทดสอบ โดยผู้ทดสอบต้องเลือกวิธีการทดสอบท่ีเหมาะสมโดยพิจารณาจาก
กฎหมาย หรือระเบียบราชการที่กำหนด เลือกวิธีการท่ีเป็นมาตรฐานฉบับล่าสุด และพิจารณาการ
ดัดแปลงหรือใช้นอกขอบข่ายที่กำหนดในวิธีมาตรฐาน หากเป็นวิธีที่ไม่เป็นมาตรฐาน และวิธีที่
ห้องปฏิบัติการพัฒนาต้องมีการวางแผนและดำเนินการโดยผู้ท่ีมีความสามารถและต้องมีการ
ตรวจสอบความถูกตอ้ งกอ่ นนำมาใช้
2. ผู้ทดสอบต้องจัดทำต้นร่างวิธีการทดสอบเบ้ืองต้น หรือพิจารณาความเหมาะสมกับ
เครื่องมือ/อุปกรณ์ หากมีแนวโน้มว่าสะดวกต่อการปฏิบัติและให้ผลการทดสอบเบ้ืองต้นว่ามีความ
สอดคลอ้ งเหมาะสมตามหลักวชิ าการจงึ ทำการตรวจสอบความใชไ้ ด้ของวิธีทดสอบ หากพบว่า ยากต่อ
การปฏิบัติ หรือไม่เหมาะสมกับเคร่ืองมือ/อุปกรณ์ของห้องปฏิบัติการหรือผลการทดสอบเบ้ืองต้นมี
แนวโน้มว่าไม่เหมาะสม จะได้ทำการเลือกวิธีการทดสอบใหม่ หากเป็นห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ใน
ระบบ ISO/IEC 17025: 2005 เคร่ืองมือท่ีใช้ต้องผ่านการสอบเทียบเคร่ืองมือที่ใช้ในวิธีการทดสอบ
กอ่ น
3. ดำเนินการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีท่ีกำหนด โดยกำหนด Parameter ท่ีต้อง
ตรวจสอบเกณฑ์การยอมรับและประเภทของ sample matrix
4. รายงานสรุปผลการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธี โดยต้องมีข้อมูลจากการตรวจสอบ
Parameter ท่ีกำหนด สรุปความเหมาะสมต่อวัตถุประสงค์การใช้งานและขอบข่ายการนำไปใช้ และ
กำหนดเกณฑ์การทำ Revalidation โดยทวั่ ไปจะไม่กำหนดเป็นระยะเวลาแต่จะกระทำกต็ ่อเมื่อมกี าร
เปลี่ยนแปลงวิธที ่ีแตกต่างไปจากวิธมี าตรฐาน

66

ส่ิงท่ตี ้องตรวจสอบ
1. ความถกู ต้อง (Accuracy)

ความถูกต้อง เป็นการวิเคราะห์ที่ได้ค่าถูกต้องตรงกับค่าท่ีแท้จริง (True value) ซ่ึงใน
การประเมินความถูกตอ้ งนนั้ สามารถทำได้ ดงั นี้

1.1. เปรียบเทียบกับวิธีที่เป็น Definitive method หรือ reference method วิธีนีไ้ ม่
สะดวก สำหรบั ห้องปฏิบัตกิ ารทั่วไป

1.2. วิเคราะห์ Certified reference material (CRM) ท่ีได้มีการวิเคราะห์ และ
กำหนดค่าโดย definitive หรือ reference method นำค่าท่ีวิเคราะห์ได้เปรียบเทียบกับ target
value โดยในห้องปฏิบัตกิ ารจลุ ชีววิทยาของสถาบันบริการตรวจสอบคุณภาพและมาตรฐานผลิตภณั ฑ์
มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ได้เลือกใช้เช้ือจุลินทรีย์อ้างอิงแทน CRM ในทางเคมี ซึ่งใช้วิธีการ Spike ลงใน
ตวั อยา่ ง หรือเลือกใช้ตวั อยา่ งทที่ ราบคา่ พารามเิ ตอร์ทีต่ ้องการทดสอบแลว้

2. ความแม่นยำ (Precision)
ความถูกต้อง เป็นการวิเคราะห์ซ้ำๆกันแล้วได้ค่าที่ใกล้เคียงกัน หรือมีความแปรปรวน

น้อย สามารถทำได้ โดยทำการวิเคราะห์ตัวอย่างซ้ำ ในรอบเดียวกัน แล้วนำมาคำนวณหาค่าเฉลี่ย
(Mean) SD, %coefficient of variation (%CV) จากนั้นเปรียบเทียบเกณฑ์ท่ีกำหนดว่าค่าที่ได้มี
ความแม่นยำอยู่ในเกณฑ์ที่กำหนดหรอื ไม่

การตรวจสอบความใชไ้ ด้ของวธิ ที ดสอบเชิงปรมิ าณ

วิธีการทดสอบเชิงปริมาณ คือ การวิเคราะห์ ทดสอบท่ีมุ่งหาค่าพารามิเตอร์ท่ีต้องการเชิง
ปริมาณ โดยหลังการทดสอบสามารถทราบคา่ เป็นตัวเลขท่ีแน่นอน ซ่ึงมีวิธีการในการตรวจสอบความ
ใช้ได้ของวธิ ีทดสอบ ดังนี้

1. คัดเลือกตัวอย่างที่ใช้ในการทำการทดสอบเป็นตัวอย่างประจำวัน จำนวน 30 ตัวอย่าง โดย
ให้มีจำนวนเชื้ออยู่ในระดับต่ำ ปานกลาง และสูง ครอบคลุมช่วงการทดสอบ หากมีไม่ครบให้นำตัวอย่าง
ท่ีแตกต่างกันมาทำการ spike เชือ้ จลุ ินทรีย์อ้างองิ ตามวิธกี ารทดสอบนั้น ลงไป

2. ทำการทดสอบตามวิธีทดสอบน้ัน ๆ ทั้งหมด 30 ตัวอย่าง โดยแบ่งวิธีการทดสอบตามวิธี
มาตรฐาน (Standard method) และวิธีการทดสอบท่ีมีการดัดแปลงจากวิธีมาตรฐาน (Alternative
method) โดยให้ 1 ตวั อยา่ งทำการทดสอบท้งั 2 วธิ ี พรอ้ มกันโดยใช้ผู้ทดสอบคนเดียวกัน

3. นำผลการทดสอบมาเปลี่ยนเป็นค่า log ฐาน 10 เพ่ือคำนวณหาค่าผลต่างของ log (di)
ผลต่างของ log ยกกำลงั 2 (di2)

4. นำค่าท่ไี ด้มาคำนวณหาคา่ Sd2 และ t – test จากสตู ร

67

 Sd 2 =  di2 − ( di)2 / N t =  di / N
N −1
Sd / N

โดยท่ี di คอื ความแตกตา่ งของผลการวเิ คราะห์โดยวิธีทง้ั สองของแต่ละตวั อย่าง
di2 คอื ความแตกต่างของผลการวเิ คราะห์โดยวธิ ที ง้ั สองของแตล่ ะตวั อย่าง ยก
กำลงั 2
di คือ ผลรวมของความแตกตา่ งของผลการวเิ คราะห์ โดยวิธที ัง้ สองของแตล่ ะตวั อย่าง
N คือ จำนวนตัวอยา่ ง
Sd คือ ความเบยี่ งเบนมาตรฐานของความแตกต่างของผลการวเิ คราะหโ์ ดยวิธีท้งั สอง

5. เปรียบเทียบค่า tcal ที่คำนวณได้กับค่า t – test ที่ได้จากการเปิดตาราง t (ท่ีระดับ
ความเช่อื มั่น รอ้ ยละ 95)

5.1. หากค่า tcal < t – test แสดงว่า ทั้ง 2 วิธีไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ
ท่คี วามเชือ่ มัน่ รอ้ ยละ 95

5.2. หากค่า tcal > t – test แสดงว่า ท้ัง 2 วิธีแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติท่ี
ความเช่ือมั่น รอ้ ยละ 95

6. ทำการหาค่า Repeatability (%RSD) ซึ่งจะต้องไม่เกินค่ามาตรฐานท่ีได้กำหนดไว้ โดย
ทำการทดสอบตัวอย่างเพียงชนิดเดียวซ้ำ อย่างน้อย 5 ครั้ง แล้วนำผลการทดสอบมาเปลี่ยนเป็นค่า
log ฐาน 10 เพื่อคำนวณหาค่าผลต่างของ log (di) ผลต่างของ log ยกกำลัง 2 (di2) ค่าเฉลี่ย
(mean) และคา่ เบี่ยงเบนมาตรฐาน (Sd) จากนนั้ นำคา่ ท่ไี ด้มาคำนวณหาค่า %RSD จากสูตร

%RSD = Sd x100
mean

โดยท่ี mean คือ ค่าเฉลี่ยของผลการทดสอบซ้ำของแตล่ ะตวั อย่าง
Sd คือ ความเบี่ยงเบนมาตรฐานของความแตกต่างของผลการทดสอบซ้ำ

7. จัดทำรายงานผลการตรวจพสิ ูจน์ความถูกต้องของวิธที ดสอบ

68

การตรวจสอบความใชไ้ ด้ของวิธีทดสอบเชิงคุณภาพ

วิธีการทดสอบเชิงคุณภาพ คือ การวิเคราะห์ ทดสอบท่ีมุ่งหาค่าพารามิเตอร์ที่ต้องการเชิง
คุณภาพ โดยหลังการทดสอบไม่สามารถระบุค่าเป็นตัวเลขท่ีแน่นอน แต่สามารถระบุได้เพียง “พบ”
หรอื “ไม่พบ” เทา่ น้นั ซงึ่ มวี ิธีการในการตรวจสอบความใช้ไดข้ องวิธีทดสอบ ดังน้ี

1. คัดเลือกตัวอย่างท่ีใช้ในการทำการทดสอบเป็นตัวอย่างประจำวัน จำนวน 60 ตัวอย่าง
โดยใหม้ ีจำนวนเช้อื อยใู่ นระดบั ต่ำ ปานกลาง และสูง

2. ดำเนินการทดสอบตามวิธีทดสอบนั้น ๆ ทั้งหมด 60 ตัวอย่าง โดยแบ่งวิธีการทดสอบ
ตามวิธีมาตรฐาน (Standard method) และวิธีการทดสอบท่ีมีการดัดแปลงจากวิธีมาตรฐาน
(Alternative method) โดยให้ 1 ตัวอย่างทำการทดสอบทั้ง 2 วิธี พร้อมกันโดยใช้ผู้ทดสอบคน
เดียวกัน

3. นำผลการทดสอบมาคำนวณหาคา่ PA, PD, NA, ND, SE, SP, AC ตามสตู ร

AC = (PA + NA) X 100%, SP = (NA) X 100% และ SE = (PA) X 100%
N -N +N

โดย SE คอื ความไวของการทดสอบ (Relative sensitivity)
SP คอื ความจำเพาะของการทดสอบ (Relative specificity)
AC คอื ความถูกตอ้ งของการทดสอบ (Relative accuracy)
+N คอื จำนวนตวั อย่างที่วธิ ีทางเลอื กให้ผลบวก = (PA + ND)
-N คือ จำนวนตัวอย่างที่วธิ ที างเลอื กให้ผลลบ = (PD + NA)
PA คือ จำนวนตัวอย่างท่ีให้ผลการทดสอบเป็นบวกทั้งวิธีมาตรฐานและวิธีที่ดัดแปลง
จากมาตรฐาน
PD คือ จำนวนตัวอย่างท่ีวิธีทางเลือกให้ผลการทดสอบเป็นบวก ในขณะท่ีวิธีมาตรฐาน
ใหผ้ ลเป็นลบ
NA คือ จำนวนตัวอย่างที่ให้ผลการทดสอบเป็นลบทั้งวิธมี าตรฐานและวิธีท่ีดัดแปลง
จากมาตรฐาน
ND คือ จำนวนตัวอย่างที่วิธีทางเลือกให้ผลการทดสอบเป็นลบ ในขณะท่ีวิธีมาตรฐาน
ให้ผลเป็นบวก

69

4. นำค่า PA, PD, NA, ND, SF, SP, %AC มาคำนวณค่า 2 จากสูตร

2 = ( PD − ND −1)2
PD + ND

4.1. หากค่า 2 < 3.84 แสดงว่า ทั้ง 2 วิธีไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่
ความเช่อื มั่น รอ้ ยละ 95

4.2. หากค่า 2 > 3.84 แสดงว่า ท้ัง 2 วิธแี ตกต่างกนั อยา่ งมนี ยั สำคญั ทางสถิติทค่ี วาม
เชื่อมนั่ รอ้ ยละ 95

การทวนสอบวิธที ดสอบในกรณที ่ีปฏิบตั ติ ามวิธีมาตรฐาน (Standard method)

วธิ ีทดสอบมาตรฐาน (Standard method) คือ วิธกี ารตรวจวิเคราะห์ท่ีตรวจพิสูจน์แลว้ ว่า มี
ความเท่ียงตรง และความแม่นยำ โดยได้รับการรับรองจากองค์กรหรือคณะกรรมการซ่ึงเป็นที่เชื่อถือ
หรอื ยอมรบั ในระดบั ชาติ หรอื นานาชาติ ดังน้นั ในการนำมาใชใ้ นห้องปฏบิ ัตกิ ารจงึ ทำเพียงแคก่ ารทวน
สอบ (Verification) ว่า เครอ่ื งมอื /อุปกรณ์ในห้องปฏิบัตกิ ารสามารถใช้ในปฏิบตั ิการน้ันได้ โดยในการ
ทวนสอบวธิ ีทดสอบ สามารถทำได้ดังนี้

1. คดั เลือกตวั อย่างท่ีใช้ในการทดสอบเป็นตัวอย่างประจำวนั จำนวน 20 ตัวอย่าง โดยให้มี
จำนวนเช้อื อยู่ในระดับต่ำ ปานกลาง และสงู ครอบคลุมช่วงการทดสอบ หากมไี ม่ครบให้นำตวั อย่างท่ี
แตกตา่ งกนั มาทำการ spike เช้ือจลุ ินทรยี ์อ้างอิงตามวิธีการทดสอบน้ัน ๆ ลงไป

2. ทำการทดสอบตามวิธีการทดสอบน้ัน ๆ โดยทดสอบตัวอย่างที่เติมเชื้อจุลินทรีย์
เปรียบเทยี บกบั สารเจือจางทเ่ี ติมจลุ นิ ทรยี ล์ งไป

3. นำผลการวเิ คราะห์มาประเมิน ดงั นี้
3.1. ประเมนิ ผลโดยใช้ ANOVA
3.2. คำนวณคา่ %RSD จะตอ้ งไมม่ ากเกินท่ีวธิ มี าตรฐานได้รายงานไว้
3.3. คำนวณค่า SD แลว้ ใช้ F – test ในการประเมิน precision ของค่า SD ตามสตู ร

บทท่ี 6
การหาคา่ ความไม่แน่นอนทางจุลชีววิทยา

ใน ก า ร วิ เค ร า ะ ห์ ท ด ส อ บ มี ปั จ จั ย ห ล า ย ป ร ะ ก า ร ที่ ส่ ง ผ ล กั บ คุ ณ ภ า พ ก า ร ท ด ส อ บ ใน
ห้องปฏิบัติการ ไม่ว่าจะเป็นมาตรฐานการจัดการของห้องปฏิบัติการ ประสิทธิภาพของเคร่ืองมือท่ีใช้
เทคนิคและวิธีการท่ีใช้ในการวิเคราะห์ทดสอบ การวิเคราะห์ข้อมูลในการทดสอบ หรือกระท่ังตัว
ผู้ปฏิบตั งิ านในการวิเคราะห์ทดสอบเอง ดังนั้นการท่ีจะได้มาซ่ึงผลการวิเคราะห์ทดสอบที่ถูกต้อง
น่าเชอ่ื ถือ และสามารถนำไปใช้ประโยชนต์ ่อได้ ผู้ปฏบิ ตั ิงานในดา้ นการวเิ คราะห์ทดสอบจำเป็นจะต้อง
มคี วามรู้ ความเข้าใจ ถึงหลักการในการควบคมุ คณุ ภาพการทดสอบในห้องปฏิบตั ิการ เปน็ อย่างดี

สำหรับหัวข้อนี้ จะได้อธิบายแนวทางการหาค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบ
ทางจุลชีววิทยา ของศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์
มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เพื่อให้แต่ละห้องปฏิบัติการสามารถนำไปประยุกต์ใช้ให้เหมาะสมต่อไป
โ ด ย ยึ ด ห ลั ก ป ฏิ บั ติ ต า ม ISO/TS 19036:2006 แ ล ะ ISO/TS 19036:2006/Amd.1:2009
(Amendment 1: Measurement uncertainty for low counts) รวมท้ังการฝึกปฏิบัติการหาค่า
ความไมแ่ นน่ อนฯ เพอ่ื เปน็ การสร้างความชำนาญให้เพ่ิมมากยิง่ ข้นึ

แหล่งที่ก่อใหเ้ กดิ ความไม่แน่นอนของการวดั ตามวธิ ีการท่ีใช้ประจำ (Routine method) มี 2
แหล่งด้วยกนั ได้แก่

1. ความไม่แน่นอนทเ่ี กิดจากค่าของตวั เลขท่ีอ่านไดต้ ามเครื่องมือวดั (System error)
ความไม่แน่นอนท่ีเกิดข้ึนน้ีจะมีการประมาณโดยผู้ผลติ หรือขายเครื่องมอื วัด หรือกำหนด

โดยหอ้ งปฏิบตั ิการเองหากเครือ่ งมือวัดดังกล่าวมาจากในห้องปฏบิ ัตกิ าร โดยวิธกี ารในการประเมนิ หา
ความไม่แน่นอนของเครื่องมือวัดน้ันจะขึ้นอยู่กับวิธีการที่ใช้ในการประเมิน ทั้งนี้ในปัจจุบันมี
บรษิ ทั ผูผ้ ลิตเพียงไมก่ ่ีแหง่ เท่าน้ันที่สามารถแสดงค่าความไมแ่ น่นอนจากเคร่ืองมอื วัดไดต้ ามท่ตี ้องการ

2. ความไม่แน่นอนที่เก่ียวข้องกบั ค่าของผลท่ีได้เนื่องจากความผิดพลาดแบบสุ่ม (Random
error) ทีเ่ กดิ ขึ้นในการทดสอบโดยทวั่ ไป

71

การประมาณค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบจลุ ชีววิทยา

การหาค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบทางจุลชีววิทยาน้นั ตาม ISO/TS 19036: 2006 เปน็ การ
ประเมินค่าความไม่แน่นอนของการวัดโดยใช้ค่าส่วนเบี่ยงเบนของการทำซ้ำ (Standard deviation
of reproducibility) ของการทดสอบที่เรียกว่า top down ซึ่งเป็นการเก็บค่าข้อมูลหลาย ๆ คร้ัง ซ่ึง
ในทางจุลชีววิทยาจะมีความเหมาะสมมากกว่าการประมาณค่าจากทุกขั้นตอนของการทดสอบ (แบบ
ก้างปลา) ท่ีใช้กับวิธีการทดสอบทางเคมี ทำให้การประมาณค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบเชิง
ปริมาณทางจลุ ชีววิทยาใหถ้ ูกต้องเปน็ ไปได้ยาก เน่อื งจากจลุ ินทรยี ์ที่ทดสอบเป็นส่ิงมีชวี ติ ทำให้มสี ภาวะท่ี
หลากหลาย และมคี วามแตกต่างของสายพันธุ์อีกดว้ ย

สำหรับวิธีการตรวจนับเชิงปริมาณของเช้ือจุลินทรีย์การทดสอบเชิงปริมาณแบบ Most
Probable Number (MPN) คา่ ความไมแ่ น่นอนของการทดสอบเป็นค่า Confidence limit ซ่งึ อา้ งอิง
ทางสถิติจาก McCrady’s Table ท่ไี ดจ้ ากผลการทดสอบท่ีระดับความเช่ือมน่ั ร้อยละ 95 ไมต่ ้องหา
ค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบ แต่ให้ใช้ค่า Confidence limit จากตารางท่ีใช้ในการรายงาน
ผลทดสอบนัน้

วิธีการหาค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบทางจุลชีววิทยา แบบ Global intra –
laboratory reproducibility นั้น ตัวอย่างที่ใช้ในการหาค่าความไม่แน่นอน นิยมใช้ตัวอย่างท่ีมีการ
ปนเปื้อนตามธรรมชาติ หรือหากหาตัวอย่างที่มีการปนเปื้อนตามธรรมชาติไม่ได้ให้คัดเลือกตัวอย่าง
แล้วทำการ Spike เชื้อท่ีต้องการทดสอบลงไปในตัวอย่าง จำนวน 20 ตัวอย่าง โดยให้ครอบคลุมเชื้อ
ในการทดสอบ 3 ระดบั ดังนี้

ระดบั ท่ี 1 ไม่พบ (Negative)
ระดับที่ 2 ระดับท่มี กี ารปนเป้อื นตามธรรมชาตขิ องตวั อย่าง
ระดบั ที่ 3 ระดับท่ีมีการปนเปื้อนสงู กว่าระดับธรรมชาติ

โดย 1 ตัวอย่าง ทำการทดสอบ 2 ซ้ำในแต่ละซ้ำให้มีปัจจัยต่างกันมากที่สุด เช่น บุคลากร
เครื่องมอื อาหารเลย้ี งเช้อื สารละลาย เปน็ ต้น แล้วทำการทดสอบโดยมขี ั้นตอน ดังนี้

1. ทำการทดสอบตามวิธีการทดสอบนั้น ๆ ในการทดสอบตัวอย่างซ้ำแรกให้เจ้าหน้าที่
ทดสอบคนหน่ึงทำ และในการทดสอบตัวอย่างซ้ำท่ีสองให้ทำการทดสอบในเวลาใกล้เคียงกันโดยให้ผู้
ทดสอบอีกคนทำ ใช้อาหารต่าง Batch No. กัน และท้ัง 20 ตัวอย่างทำการทดสอบที่ปัจจัยที่มีผลต่อ
การทดสอบที่แตกต่างกันท้ังหมด และต้องควบคุมให้อยู่ในช่วงท่ีกำหนด ทำการทดสอบที่เวลาต่างกัน
ยกเวน้ ใช้ตบู้ ม่ เพาะเชอ้ื ตูเ้ ดยี วกัน

2. นำผลของจำนวนเชอ้ื จุลินทรยี ์จากการทดสอบมาเปลยี่ นเปน็ คา่ log ฐาน 10

72

ในกรณีทผี่ ลรวมโคโลนีทีน่ บั ไดจ้ ากทุกจานเพาะเชอ้ื นอ้ ยกวา่ 10 โคโลนี ไม่ต้องนำผลการ
ทดสอบน้ันมาใช้ในการประมาณค่าความไม่แน่นอนของการวัด ตามหลักการของ Intermediate
precision

ในกรณีทีผ่ ลรวมโคโลนที ่นี บั ได้จากทกุ จานเพาะเช้อื อย่รู ะหว่าง 10 – 30 โคโลนี ให้นำผล
การทดสอบนน้ั มาใชใ้ นการคำนวณ

3. นำผลการทดสอบ ค่า log ฐาน 10 มาหาค่าผลต่างของ log (di) ผลต่างของ log ยก
กำลัง 2 (di2) เพ่ือนำมาคำนวณหาค่า Standard deviation of reproducibility จากสตู ร

SR = 1 n (yiA − yiB )2
2n

i=1

โดยท่ี yiA คอื ค่า log ผลการทดสอบของแตล่ ะตัวอยา่ งของผทู้ ดสอบคนแรก
yiB คือ ค่า log ผลการทดสอบของแตล่ ะตวั อยา่ งของผู้ทดสอบคนที่สอง
n คือ จำนวนของตัวอย่างทใ่ี ช้ในการทดสอบ
SR คอื คา่ Standard deviation of reproducibility

4. คำนวณหาค่า Limit value จากสูตร หรอื จากตาราง Clim (ตาราง 8)

Clim = 1.75
SR2

โดยที่ Clim คือ ค่า Limit value
SR2 คือ คา่ Standard deviation of reproducibility ยกกำลงั 2

73

ตาราง 8 คา่ Clim Clim
Standard deviation of reproducibility
144
0.11 121
0.12 103
0.13 89
0.14 78
0.15 68
0.16 60
0.17 54
0.18 48
0.19 44
0.20 40
0.21 36
0.22 33
0.23 30
0.24

5. เมื่อต้องการให้รายงานค่าความไม่แน่นอนให้เปรียบเทียบผลรวมของจำนวนเชื้อจากทุก

ซ้ำการทดลอง (C) กับค่า Clim เพ่ือคำนวณค่าความไม่แน่นอนของการทดสอบ (Uncertainty: U)
จากสูตร

สตู รท่ี 1 U = 2SR เมอื่ C > Clim

สตู รท่ี 2 U = 2 S2R + 0.18861 เมอื่ C < Clim

C

โดยที่ Clim คือ คา่ Limit value
SR2 คือ คา่ Standard deviation of reproducibility ยกกำลงั 2

C คือ ผลรวมของจำนวนเช้ือจุลนิ ทรยี ์จากทุกซำ้ การทดลอง
U คอื คา่ ความไม่แน่นอนของการทดสอบ (Uncertainty)

6. เปล่ียนค่าความไม่แน่นอนซ่ึงอยู่ในรูปของ log ฐาน 10 เป็นค่าในหน่วยที่ใช้ในการรายงาน
ผลการทดสอบตามแต่ละวิธีการทดสอบน้ัน ๆ โดยให้รายงานค่าความไม่แน่นอน เป็น C(C-U), (C+U) เม่ือ
C คอื ผลทดสอบทีไ่ ด้จากการวิเคราะห์ และ U คือ ความไม่แน่นอนของการทดสอบ

บทที่ 7
การสอบเทียบและทวนสอบเคร่ืองมอื ทางจลุ ชวี วิทยา

เนื่องจากเคร่ืองมือวัดที่ใช้ในห้องปฏิบัติการส่งผลกระทบต่อความแม่นยำและเช่ือถือได้ของ
ผลการทดสอบ จึงจำเป็นต้องดำเนินการให้แน่ใจว่า เคร่ืองมือวัดที่ใช้ในการทดสอบสามารถให้ผลการ
วัดท่ีแม่นยำตามความต้องการ การสอบเทียบ (Calibration) จึงเป็นกิจกรรมที่จำเป็นสำหรับ การ
สรา้ งความม่ันใจว่า เคร่ืองมือเหลา่ นน้ั ยังสามารถทำงานได้อย่างแม่นยำตามทต่ี ้องการ

ผลจากการสอบเทียบเม่ือนำมาวิเคราะห์จะทำให้สามารถกำหนดได้ว่าเคร่ืองมือวัดใน
ห้องปฏิบัติการควรจะใช้ต่อไปหรือจำเป็นต้องปรับแต่ง ผลจากการสอบเทียบทำให้ห้องปฏิบัติการ
สามารถม่ันใจได้ว่าเครื่องวัดท่ีใช้ประกอบการทดสอบ หรือการวิเคราะห์ยังคงทำงานได้อย่างแม่นยำ
และเชื่อถือได้ ผลการสอบเทียบหลายๆ คร้ังยังแสดงให้เห็นคุณลักษณะทางด้านความเสถียร
(Stability) ของเคร่ืองมอื วัดในห้องปฏิบตั ิการ ซ่งึ จะเห็นได้ว่า การสอบเทียบมคี วามสำคัญหลายอย่าง
ได้แก่

1. เพอื่ ตรวจสอบคา่ การวัดของเคร่อื งมือ
2. เพ่อื ให้บรรลุข้อกำหนดมาตรฐานตา่ ง ๆ
3. ทำให้ผลการวัดแม่นยำ และเช่ือถือได้ ส่งผลให้ผลการวัด การทดสอบ การวิเคราะห์เป็น
ท่ียอมรบั
4. เพอื่ คงไว้ซึง่ มาตรฐานการทดสอบทีส่ ่งผลตอ่ คุณภาพผลการทดสอบ
5. เพอื่ เปน็ การเฝ้าระวังด้านความปลอดภยั
6. เพอ่ื ใหส้ ามารถตรวจสอบย้อนกลับไดใ้ นทางมาตรวทิ ยา
7. ผลการสอบเทียบนำมาประยุกต์ใช้เป็นค่าปรับแก้ (correction) เพ่ือชดเชยค่าความ
คลาดเคลอื่ นของคา่ อ่านของเครื่องมือวัดทำใหผ้ ลการวดั แมน่ ยำขนึ้

ดังนั้นในบทน้ีจะกล่าวถึง ความหมายของการสอบเทียบ และแนวทางการประเมินผลการ
สอบเทียบ เพ่ือเป็นข้อมูลให้ผู้สนใจได้นำไปประยุกต์ใช้ในการจัดการสอบเทียบเครื่องมือให้เหมาะสม
ตอ่ ไป

75

ความหมายของการสอบเทียบ

การสอบเทียบ หมายถึง ชุดของปฏิบัติการท่ีจัดทำข้ึนภายใต้สภาวะเฉพาะ เพ่ือหา
ความสมั พันธ์ระหว่างค่าทอี่ า่ นไดจ้ ากเครอ่ื งมือวัด หรือระบบการวดั หรอื ค่าท่ีแสดงโดยเครื่องวดั ทเ่ี ป็น
วสั ดุ เม่ือเปรียบเทียบกับคา่ ของปริมาณทไ่ี ดจ้ ากมาตรฐานที่ใชอ้ ้างองิ

ในขณะที่การทวนสอบ เป็นการยืนยันโดยการตรวจสอบและมีหลักฐานว่าเป็นไปตาม
ข้อกำหนดที่ระบุ เช่น การใช้วัสดุอ้างอิงรับรอง (CRM) ในการตรวจสอบการวัดของเคร่ืองมือ การ
ตรวจสอบผลการสอบเทียบจากใบรายงานผลการสอบเทียบวา่ อยูใ่ นช่วงค่าผดิ พลาดสงู สดุ ทยี่ อมรบั ได้

สว่ นการตรวจสอบระหว่างใช้งาน (Intermediated check) หมายถึง การตรวจสอบระหว่าง
ใชง้ านหรือก่อนใช้งาน เพ่ือยืนยันว่าเครื่องมอื /มาตรฐานอ้างองิ เป็นไปตามข้อกำหนดท่ีระบุสามารถใช้
งานได้

ระบบมาตรวิทยาการวดั
มาตรวิทยา หมายถึง วิชาที่ว่าด้วยเร่ืองของการวัดไม่ว่าจะเป็นสาขาใดก็ตาม เป็นการวัดที่
รวมเอาทั้งทฤษฎีและทุกมิติของการปฏิบัติมาประยุกต์ใช้ เพื่อให้สามารถวัดได้อย่างถูกต้องตามความ
ต้องการ และสามารถรายงานค่าของผลการวัดได้ โดยการรายงานน้ันได้รวมเอาการประเมินความไม่
แนน่ อนของการวดั ไว้ด้วย
ทั้งนี้มาตรวิทยาได้รวมถึงการกำหนดให้มีหน่วยของการวัด โดยการทำให้เป็นจริงข้ึนจาก
นิยามด้วยวิธีทางวิทยาศาสตร์ เช่น การทำหน่วยเมตร โดยใช้ปรากฏการณ์ของแสงท่ีเคล่ือนท่ีใน
สุญญากาศ นอกจากน้ียังรวมปึงการจัดให้มีโซ่ของความสามารถสอบกลับได้ของการวัด
(Traceability) โดยการสอบเทียบ (Calibration) และการทำเอกสารท่ีแสดงค่าที่ได้จากการวัดพร้อม
กบั ความไม่แน่นอน (Uncertainty) ของการวัดอกี ดว้ ย

การดำเนนิ การเกยี่ วกับมาตรฐานการวดั
1. การถ่ายทอดความถูกต้อง การดำเนินการเกี่ยวกับมาตรฐานการวัดนี้ เป็นการถ่ายทอด
ความถูกต้องของมาตรฐานอ้างอิง เริ่มต้นจากต้นแบบ หรือหน่วยมาตรฐานจากองค์กรการระหว่าง
ประเทศ (BIPM) หรอื เรียกวา่ สอบเทียบความถกู ต้องระหวา่ งมาตรฐานอ้างองิ ของ BIPM กับของแต่ละ
ประเทศสมาชิก ประเทศสมาชิกจะมีมาตรฐานอ้างอิงเรียกว่า มาตรฐานอ้างอิงของชาติไว้สำหรับการ
สอบเทียบความถูกต้องกับมาตรฐานที่ใช้งานอยู่ภายในประเทศของตน ข้อแตกต่างระหว่างมาตรฐาน
อ้างอิงกับมาตรฐานที่ใช้งานอยู่ภายในประเทศของตน ข้อแตกต่างระหว่างมาตรฐานอ้างอิงกับ
มาตรฐานอ้างอิงระหว่างชาติท่ี BIPM เครื่องมือท่ีใช้สำหรับเป็นมาตรฐานอ้างอิงของชาตินี้จึงมีราคา
แพงมาก แต่ละประเทศควรมีไว้เพียงแห่งเดียวในแต่ละเรื่อง ส่วนมาตรฐานที่ใช้งานทั่วไปน้ัน มีค่า

76

ความถูกต้องต่ำกว่าอาจมีได้หลายระดับ ค่าความถกู ต้องของมาตรฐานท่ีใช้ในโรงงานไม่จำเป็นจะต้อง
มคี ่าความถูกต้องสูงมากนัก แต่ที่สำคญั ก็คอื ตอ้ งมีการสอบเทียบตามกำหนดเวลาเท่าน้นั ท้ังน้ีเพ่ือการ
ประหยดั งบประมาณในการซอ้ื เครอื่ งมอื ที่มรี าคาแพงเกินความจำเป็น

2. การดำเนินงานในระดับพื้นภูมิภาค ดังได้กล่าวมาแล้วว่าการดำเนินการเก่ียวกับ
มาตรฐานการวัดน้ีเป็นการถ่ายทอด หรือสอบเทียบค่าความถูกต้องกับมาตรฐานอ้างอิงขององค์การ
ระหว่างประเทศหรือของโลก และเน่ืองจากความเจริญอย่างรวดเร็วทางด้านวิทยาศาสตร์และ
เทคโนโลยีในด้านการวัดน้ี ประเทศที่พัฒนาแลว้ กบั ประเทศที่ยงั ด้อยพัฒนาจึงมีความแตกต่างกันมาก
ในทางวิชาการ กลุ่มประเทศในเครือจักรภพกลุ่มประเทศอาเซยี น และกลุ่มประเทศในภาคพ้ืนแปซฟิ ิก
จึงไดร้ วมตัวกนั ขน้ึ ต้ังแตป่ ี พ.ศ. 220 เป็นโครงการร่วมมือด้านมาตรฐานการวดั เรียกว่า Asia/Pacific
Metrology Program ปัจจุบันมีประเทศที่เข้าร่วมโครงการ 17 ประเทศคือ ออสเตรเลีย บังคลาเทศ
จีน ฟิจิ ฮ่องกง อินเดีย อินโดนีเซีย เกาหลี มาเลเซีย เนปาล นิวซีแลนด์ ฟิลิปปินส์ ปากีสถาน ปาปัว
กินี สิงคโปร์ ศรีลงั กา และไทย

โครงการความร่วมมือนี้ มีจุดประสงค์เพื่อช่วยเหลือซึ่งกันและกันระหว่างประเทศที่มี
ความเจริญแล้วกับประเทศที่ยังไม่ได้พัฒนา โดยเน้นหนักในเรื่อง การบริหารข่าวสารเกี่ยวกับระบบ
การวัดของชาติ การบริการทางด้านการฝึกอบรมเจ้าหน้าที่ และการบริการการสอบเทียบมาตรฐาน
ระหวา่ งพนื้ ภูมภิ าค

การดำเนินงานโครงการเอเชียและแปซิฟิกเมทโทรโลยีโปรแกรมนี้ ดำเนินงานโดยมี
คณะกรรมการดำเนินงาน ปัจจุบันมีประเทศเกาหลีเป็นผู้ประสานงาน มีการสอบเทียบมาตรฐาน
ระหว่างพ้ืนที่ภมู ภิ าคมาแลว้ หลายเรื่อง ไดแ้ ก่

- โวลต์เตจและเคอรเ์ รนต์ไฟฟา้ กระแสสลับ (AC. Voltage and Current)
- เสยี ง (Acoustics)
- ความตา้ นทานไฟฟ้ากระแสตรง (DC. Resistance)
- โวลตเ์ ตจกระแสไฟฟา้ ตรงกบั ชนิดแบตเตอร่ี (DC. Voltage, Standard Cell)
- โวลต์เตจกระแสไฟฟา้ ตรงชนดิ อิเล็กทรอนกิ ส์ (DC. Voltage, Electronic Reference)
- ความยาว (Length)
- นำ้ หนัก (Mass)
- แสง (Photometry)
- อุณหภูมิ (Temperature)
- เวลาและความถ่ี (Time and Frequency)

77

ในการปฏิบัติแตล่ ะเรอ่ื งนั้น ประเทศที่เป็นแกนกลาง (Coordinatingation) จะสรา้ งหรือ
ได้รับตัวมาตรฐานท่ีเรียกว่า Traveling Standards แล้วส่งไปตามประเทศต่าง ๆ ท่ีร่วมในโครงการ
เพ่ือการสอบเทียบกบั มาตรฐานอ้างอิงของชาติอยูใ่ นระดับเดยี วกนั ทั้งน้โี ดยไดร้ ับความช่วยเหลืออย่าง
ใกล้ชิดจาก National Measurement Laboratory (NML) แห่ ง Commonwealth Scientific
Industrial Research Organization (CSIRO) ประเทศออสเตรเลีย National Physics Laboratory
(NPL) ประเทศอังกฤษ, BIPM และ UNESCO

ค ว า ม จ ำ เป็ น ท่ี จ ะ ต้ อ ง มี ม า ต ร ฐ า น ข อ ง ก า ร วั ด เพื่ อ ให้ ก า ร วั ด ไม่ ว่ า จ ะ ท ำ ก า ร วั ด ที่
ห้องปฏิบตั ิการใดกต็ าม ใหผ้ ลถูกตอ้ งตรงกนั โดยมาตรฐานของการวัดแบง่ ไดเ้ ปน็ 4 ระดบั ไดแ้ ก่

2.1. มาตรฐานระหว่างประเทศ (International Standards)
กำหนดโดย International Bureau of Weights and Measures (BIPM) ซ่ึงถือ

ได้ว่าเป็นมาตรฐานท่ีความถูกต้องสูงสุด ส่วนมาตรฐานระดับอ่ืน ๆ จะมีความถูกต้องรองลงมา
ตามลำดับ โดยมาตรฐานเหล่าน้ันจะต้องสอบกลับได้ (Traceability) ถึงมาตรฐานระหว่างประเทศ
ดังนั้นการวัดโดยใช้เคร่ืองมืออุปกรณ์ที่ได้รับการสอบเทียบและสอบย้อนกลับได้ถึงมาตรฐานระหว่าง
ประเทศ ไม่ว่าจะวัด ณ ท่ีใดจะให้ผลที่ถูกต้องตรงกันหมด BIPM เป็นหน่วยงานสากลท่ีทำหน้าที่เก็บ
รักษามาตรฐานระหว่างประเทศ เพื่อการวัดปริมาณและเป็นหน่วยงานที่กำหนดคำนิยามของระบบ
หน่วยระหว่างประเทศ (The International System of Unit or SI) ได้กำหนดคำนิยามของระบบ
หนว่ ยรากฐาน (Base Units) ดงั น้ี

2.1.1 เมตร คือ ระยะทางท่ีแสงเคล่ือนท่ีสุญญากาศในระยะเวลา 1/299 792
วนิ าที

2.1.2 กิโลกรัม คือ หน่วยของมวล ซึ่งเท่ากับมวลแบบประถมระหว่างประเทศ
ของกิโลกรมั

2.1.3 วนิ าที คือ ระยะเวลาเท่ากับ 9,192,631,770 คาบกับการแผ่รังสีที่สมนัย
กบั การเปล่ียนระดบั ไอเปอร์ไฟนส์ องระดับของอะตอมซเี ซ่ียม -133 ในสถานะพ้ืนฐาน

2.1.4 แอมแปร์ คือ ปริมาณกระแสไฟฟ้าซึ่งถ้ารักษาให้คงที่อยู่ในตัวนำ 2 เส้น ท่ีมี
ความยาวอนันต์มีพื้นที่ภาคตัดขวางกลมเล็กมาก จนไม่จำเป็นต้องคำนึงและวางอยู่คู่ขนานห่างกัน 1
เมตร ในสุญญากาศแล้วจึงทำให้เกิดแรงระหว่างตัวนำท้ังสองเท่ากับ 2 ×10-7 นิวตันต่อความยาว 1
เมตร

2.1.5 เคลวิน คือ หน่วยของอุณหภูมิทางเทอร์โมไดโนนามิกส์ ซ่ึงเท่ากับ
1/273.15 ของอุณหภมู ิทางเทอร์โมไดนามกิ สข์ องจุดสามสภาวะของนำ้

2.1.6 โมล คือ ปริมาณสารของระบบที่ประกอบด้วยองค์ประกอบของมูลฐาน
ซึ่งมีจำนวนเท่ากับจำนวนอะตอมใน 0.012 กิโลกรัมของคาร์บอน -12 เม่ือใช้โมลต้องระบุ

78

องค์ประกอบมูลฐาน ซึ่งอาจจะเป็นอะตอม โมเลกุล ไอออน อิเล็กตรอน อนุภาคอ่ืน ๆ หรือกลุ่มของ
อนภุ าคตามทกี่ ำหนด

2.1.7 แคนเดลา คือ ความเข้มแห่งการส่องสว่างในทิศทางท่ีกำหนดให้ของ
แหล่งกำเนิดซึ่งแผ่รังสีเอกรงค์ด้วยความถ่ี 540 × 1012 เฮิรตซ์ และมีความเข้มการแผ่รังสีในทิศทาง
นนั้ เท่ากับ 1/683 วตั ต์ต่อสเตอเรเดียน

2.2. มาตรฐานแห่งชาติ (National Standards)
เป็นมาตรฐานของการวัดที่มีค่าความละเอียดถูกต้องสงู สุดของประเทศ ซึ่งจะต้อง

มหี น่วยงานที่รับผดิ ชอบในการจัดหาดูแลรักษา และให้บริการถ่ายทอดความถูกตอ้ งไปให้มาตรฐานข้ัน
รองและข้ันใช้งานต่อไป เนื่องจากเครื่องมือมาตรฐานแห่งชาติจะต้องเป็นเคร่ืองมือท่ีมีความละเอียด
ถกู ตอ้ งสูงสุดของประเทศ การท่ีจะลงทุนซือ้ เคร่อื งมอื มาตรฐานใหมท่ ั้งหมดเป็นการลงทนุ ท่ีสูงมาก จึง
จำเป็นท่ีจะต้องสร้างระบบเครือข่ายเคร่ืองมือฐาน ให้เป็นระบบเครื่องมาตรฐานของชาติที่ตะต้อง
ร่วมมือประสานงานและร่วมกันรับผิดชอบ ตลอดจนจะต้องมีการประสานงานกันอย่างใกล้ชิดกับ
ต่างประเทศซ่ึงระบบดังกล่าวนี้กรมวิทยาศาสตร์จะเป็นหน่วยประสานงาน เพ่ือให้การดำเนินการ
เป็นไปอยา่ งประหยดั และมปี ระสทิ ธิภาพสงู

สำหรับบัญชีเคร่ืองมาตรฐานแห่งชาติ ได้มีการจัดทำขึ้นโดยคณะอนุกรรมการ
แห่งชาติว่าด้วยมาตรวิทยา ตามที่ได้รับมอบหมายจากคณะกรรมการแห่งชาติว่าด้วยมาตรวิทยาและ
การรบั รองมาตรฐานหอ้ งปฏบิ ตั ิการ และคณะกรรมการแห่งชาติฯ ได้พจิ ารณาเสรจ็ เรยี บรอ้ ยแลว้ โดย
ท่ีคณะกรรมการแห่งชาติชุดนี้ได้รับการแต่งต้ังตามมติคณะรัฐมนตรี เพื่อทำหน้าท่ีตามโครงการการ
พฒั นาระบบมาตรวิทยา

2.3. มาตรฐานขั้นรอง (Secondary Standards)
เป็นมาตรฐานของการวัดที่มีค่าความละเอียดถูกต้อง รองลงมาจากมาตรฐาน

แห่งชาติตามลำดับ โดยที่ห้องปฏิบัติการท่ีทำหน้าที่ให้บริการในการสอบเทียบปรับต้ังเครื่องมือวัดจะ
เก็บรักษามาตรฐานข้นั รอง

2.4. มาตรฐานข้นั ใช้งาน (Working Standards)
เป็นมาตรฐานข้ันใช้งานส่วนใหญ่จะเกี่ยวข้องกับหอ้ งปฏิบัติการ ที่ทำหน้าท่ใี นการ

ให้บรกิ ารการวดั และการวิเคราะห์ทดสอบมักจะเก็บรกั ษามาตรฐานขน้ั ใช้งาน เพ่ือใช้ในการสอบเทยี บ
ตรวจสอบเครื่องมือวัดที่ใช้งานอยู่ ซ่ึงความละเอียดถูกต้องของมาตรฐานขั้นใช้งานน้ีจะไม่เท่า
มาตรฐานขน้ั รอง

79

นยิ ามศัพทท์ เี่ กี่ยวข้องกับการสอบเทียบ

1. Error หมายถึง คา่ ผดิ พลาดของเคร่ืองมือทีต่ ้องการทราบคา่ เทา่ กับ คา่ ที่วดั ได้ – คา่ มาตรฐาน
2. Correction หมายถงึ คา่ ปรับแก้ โดยหาไดจ้ าก คา่ มาตรฐาน – ค่าท่ีวัดได้
3. Uncertainty หมายถึง ค่าความไม่แน่นอนของการวดั ในกระบวนการสอบเทยี บ
4. Unit Under Calibration (UUC) หมายถึงเครื่องมือวัดท่ีได้รับการสอบเทียบ หรือ
เครื่องมอื วัดท่ถี ูกสอบเทียบ
5. UUC reading หมายถึง ค่าท่ีเคร่ืองมือวัดท่ีได้รับการสอบเทียบอ่าน เม่ือถูกป้อนด้วยค่า
มาตรฐานการวัดท่ีสอบกลับได้ ค่าน้ีเกิดจากค่ามาตรฐานท่ีป้อนรวมกับค่าความผิดพลาดเชิงระบบ
และคา่ ความผิดพลาดทค่ี าดเดาไม่ได้ของเครอ่ื งมือวัด
6. Tolerance ในทางมาตรวิทยา หมายถึง ขอบเขตของค่าความผิดพลาดโดยรวมของผล
การวดั ท่ยี อมรับได้ เมือ่ เทียบค่าทีก่ ำหนด
7. Confidence level ระดับความเช่ือม่ัน ตัวอย่างเช่นค่าความไม่แน่นอนของการวัดมี
ระดับความเช่ือม่ันประมาณ 95% หมายความว่า ในการวัดหน่ึงร้อยครั้งจะมีอยู่ห้าครั้งท่ีค่าความไม่
แน่นอนท่รี ายงานไม่มน่ั ใจจะเปน็ ไปตามทีร่ ายงาน
8. Repeatability ความทวนซ้ำได้ของเครื่องวัด ความสามารถของเครื่องวัดท่ีให้ผลการ
ตอบสนองเหมือนกนั ท่สี ุด สำหรับการใช้ส่ิงเรา้ เดียวกันภายใตภ้ าวะที่กำหนดของการใช้
9. Traceability หมายถึงสมบัติของผลการวัด ท่ีสามารถหาความสัมพันธ์กับมาตรฐานท่ี
เหมาะสม ซึ่งโดยท่ัวไปได้แก่มาตรฐานระหว่างประเทศ หรือมาตรฐานแห่งชาติ โดยการสอบเทียบ
ตอ่ เนอื่ งกนั เปน็ ลกู โซ่ และแตล่ ะช่วงจะต้องระบคุ า่ ความไม่แน่นอนของการวัด
10. Uniformity คุณลักษณะของความเป็นรูปแบบ เช่นกรณีตู้อบร้อนอุณหภูมิ ณ จุดต่างๆ
ภายในตมู้ ีลักษณะของความเปน็ รปู แบบอย่างไร
11. วสั ดอุ ้างองิ ท่ไี ด้รับการรบั รองแลว้ (Certified reference material หรอื CRM) คือ วัสดุ
อ้างองิ ท่ีมใี บรบั รองกำกับ มคี า่ สมบัติหน่ึงอยา่ งหรือมากกว่า ทไี่ ด้รบั การรับรองโดยวธิ ีดำเนินการซึ่งทำ
ให้สอบกลับได้สู่หน่วยวัดท่ีทำให้เป็นจริงได้อย่างถูกต้องท่ีค่าสมบัติท่ีแสดง ซึ่งค่ารับรองแต่ละค่าจะ
กำกบั ด้วยความไมแ่ น่นอนทร่ี ะดับความเชอ่ื มัน่ อันหน่ึง
12. วัสดุอ้างอิง (Reference material หรือ RM) คือ วัสดุหรือสารที่มีค่าสมบัติอย่างหน่ึง
หรือมากกว่า ทม่ี ีความเป็นเนื้อเดียวกัน และถูกจดั เตรยี มมาอยา่ งดีสำหรับใช้สอบเทียบอปุ กรณ์สำเร็จ
ใช้ประเมินวิธีวัด หรือกำหนดค่าให้กับวัสดุ ซ่ึงอาจอยู่ในรูปของก๊าซบริสุทธิ์หรือก๊าซผสม ของเหลว
หรือของแข็ง

80

แนวปฏิบตั สิ ำหรับการสอบเทยี บ

การสอบเทียบภายใน เจ้าหน้าท่ีห้องปฏิบัติการสามารถสอบเทียบได้เอง สำหรับเครื่องมือวัด
บางชนิดหากจะสอบเทียบมาตรฐานเองผู้สอบเทียบควรจะได้รับการฝึกอบรมในการสอบเทียบในงาน
ประเภทต่าง ๆ ก่อนท่ีจะทำการสอบเทียบเอง ในกรณีที่เคร่ืองมือวัดมีความซับซ้อนในการสอบเทียบ
สามารถส่งไปสอบเทียบมาตรฐานยังแหล่งให้บริการสอบเทียบภายนอกห้องปฏิบัติการได้ ส่วนการสอบ
เทยี บภายนอกมแี นวทางการปฏิบัติทสี่ ำคญั ได้แก่

1. กำหนดแผนการสอบเทยี บ ซงึ่ ต้องระบใุ หช้ ดั ว่าเคร่ืองมือวัดใดต้องสอบเทียบ และสอบ
เทียบเมื่อใด

2. กำหนดจดุ และ/หรือย่านการวดั ทต่ี ้องการให้ห้องปฏิบตั กิ ารภายนอกบรกิ ารสอบเทียบ
ให้ครอบคลมุ ช่วงการใช้งานของเคร่ืองมือวดั น้นั

3. เลอื กหอ้ งปฏบิ ัติการสอบเทียบ และแจง้ ความต้องการสอบเทียบ
4. ส่งเคร่อื งมอื วัดไปสอบเทยี บ
5. นำเคร่อื งมือวัดกลับและตรวจสอบผลการสอบเทยี บมาตรฐาน
6. บนั ทกึ ผลการสอบเทยี บมาตรฐาน และปรบั ปรงุ คา่ แก้ให้ทนั สมัย

การเลือกห้องปฏบิ ัติการสอบเทียบ
การเลือกห้องปฏิบัติการสอบเทียบเป็นส่ิงที่สำคัญอย่างยิ่ง การเลือกห้องปฏิบัติการภายนอก
ควรเลือกห้องปฏิบัติการที่มีความสามารถสอบเทียบเครื่องมือวัดของเราได้ และต้องเป็น
ห้องปฏิบัติการที่สามารถแสดงออกถึงความสามารถในการสอบเทียบได้ และที่สำคัญต้องเป็น
ห้องปฏิบัติการท่ีการวัดสามารถสอบกลับได้ถึงมาตรฐานหน่วยวัดสากล วิธีการที่ควรพิจารณาก็คือ
ควรเลอื กหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทไ่ี ด้รับการรับรองความสามารถตามมาตรฐาน มอก.17025-2548
หอ้ งปฏิบัติการที่ผ่านการรบั รองความสามารถดังกล่าวถอื ได้ว่ามคี วามสามารถ และสอบกลับ
ได้ถึงมาตรฐานหน่วยวัดสากล ห้องปฏิบัติการสามารถตรวจสอบรายช่ือห้องปฏิบัติการสอบเทียบท่ี
ไดร้ บั การรับรองความสามารถในเวบไซต์ www.tisi.go.th
หลังจากเลือกห้องปฏิบัติการสอบเทียบได้แล้ว ก็แจ้งความต้องการในการสอบเทียบไปยัง
ห้องปฏิบัติการ บางห้องปฏิบัติการต้องมีการจองคิวล่วงหน้า เน่ืองจากห้องปฏิบัติการสอบเทียบท่ีได้
รบั รองความสามารถในขณะนี้มีไม่มากนัก คิวจึงค่อนข้างยาว และใช้เวลาในการสอบเทียบมาตรฐาน
นานพอสมควร หากห้องปฏิบัติการต้องการจะสอบเทียบเครื่องมือวัดจะต้องวางแผนล่วงหน้า และ
ติดต่อลว่ งหนา้ แต่เน่ิน ๆ
เมื่อได้รับคิวการสอบเทียบหรือกำหนดนัดหมายจากห้องปฏิบัติการสอบเทียบแล้ว ก็ให้นำ
เครื่องมือวัดไปส่งห้องปฏิบัติการสอบเทียบตามเวลาที่กำหนด การขอใช้บริการสอบเทียบน้ีส่วนใหญ่

81

ผู้ใช้เคร่ืองมือวัด ต้องเป็นผู้นำเครื่องมือวัดไปส่งยังห้องปฏิบัติการเอง ยกเว้นห้องปฏิบัติการบางแห่ง
อาจจะมีการให้บริการขนส่งเคร่ืองมือวัดของผู้ขอใช้บริการซ่ึงจะต้องมีค่าใช้จ่ายเพิ่มเติมบ้าง ข้อควร
ระวังอยา่ งยง่ิ ก็คือ เครื่องมือวัดเปน็ เคร่ืองมอื ทต่ี อ้ งระมดั ระวงั เรอ่ื งความสะเทอื น การกระแทก การตก
หล่น หรือกระทบความร้อนสูงหรือความช้ืนสูง การขนส่งเครื่องมือวัดจึงต้องทำการบรรจุกล่องท่ี
สามารถป้องกันการกระเทือนที่ดี และในการขนส่งจะต้องกำชับแก่ผู้ท่ีขนส่งให้ทราบถึงความสำคัญ
ของเคร่อื งมือวัด และขอ้ ควรระวังในการขนย้ายเครอ่ื งมอื วดั ให้ปลอดภัย

หลังจากท่ีเคร่ืองมือวัดผ่านการสอบเทียบเรียบร้อยแล้ว และนำกลับมาใช้ในห้องปฏิบัติการ
เจ้าหน้าที่ผู้รับผิดชอบเครื่องมือวัดของห้องปฏิบัติการ ควรจะต้องตรวจสอบสภาพของเครื่องมือวัด
และประเมินผลการสอบเทียบจากรายงานผลการสอบเทยี บ

แนวทางการประเมินผลการสอบเทียบ

หลกั เกณฑก์ ารประเมนิ เคร่ืองมอื สามารถประเมนิ ได้ 3 วิธี ดงั นี้
1. ทำการประเมินเครื่องโดยนำค่า Error มารวมกับค่า Uncertainty โดยนำค่าท่ีได้มา
เปรยี บเทียบกับเกณฑ์ท่ีได้กำหนดไว้ ถ้านอ้ ยกว่าเกณฑถ์ ือว่าการประเมนิ เครอื่ งมือน้ันสามารถนำมาใช้
งานได้
2. ทำการประเมินเคร่ืองโดยนำค่า Error มารวมกับค่า Uncertainty โดยนำค่าที่ได้มา
เปรียบเทียบกบั เกณฑ์ท่ีได้กำหนดไว้ ถ้ามากกว่าเกณฑ์ถือวา่ การประเมินเครือ่ งมือนั้นไม่เหมาะกับการ
ใชง้ าน
3. ทำการประเมินเคร่ืองโดยนำค่า Error รวมกับค่า Uncertainty โดยนำค่าท่ีได้มา
เปรียบเทียบกับเกณฑ์ท่ีได้กำหนดไว้ ถ้ามากกว่าเกณฑ์ ให้นำค่าแก้มาปรับใช้กับเคร่ืองมือสามารถทำ
การปรบั ได้ และทำการประเมินกับเกณฑ์ของเคร่ืองมือ ถา้ น้อยเกณฑส์ ามารถนำเครื่องมาใชง้ านได้

การประเมินเครื่อง Thermometer, เตาเผา, pH meter และ Conductivity meter
สามารถทำการประเมินเครื่องโดยนำค่า Error มารวมกับค่า Uncertainty โดยนำค่าที่ได้มา
เปรยี บเทียบกับเกณฑท์ ่ีได้กำหนดไว้ ถ้าน้อยกว่าเกณฑ์ถือวา่ การประเมินเครอื่ งมอื น้ันสามารถนำมาใช้
งานได้

82

ตวั อย่าง การประเมิน Thermometer เกณฑ์กำหนด 90 ± 1 OC

Immersion UUC Reading Standard Correction Uncertainty
Depth (OC) Reading Value (OC)
(mm) (OC)
(OC)  0.58
 0.58
45 0 0.01 + 0.01  0.58

95 90 90.31 + 0.31

15 120 120.01 + 0.01

การประเมินให้นำค่า Correction รวมกับค่า Uncertainty นำค่าที่ได้ไปทำการประเมินกับ
เกณฑ์กำหนด เทา่ กบั 0.31 + 0.58 = 0.81

การประเมิน สรุปท่ีอุณหภูมิ 90OC สามารถนำไปใช้งานได้ เพราะผลการสอบเทียบมีค่าน้อย
กว่าเกณฑก์ ำหนด

การประเมนิ เครื่องมือควบคมุ อุณหภมู ิ เชน่ Hot Air Oven, Incubator และ Water Bath
การประเมินประสิทธิภาพของเคร่ืองมือนั้นข้ึนอยู่กับการใช้งาน ของเคร่ืองมือน้ันๆ ถ้า
ห้องปฏิบัติการมีการใช้งานเฉพาะจุดใน Working space ให้พิจารณาถึงค่า Error รวมกับค่า
Uncertainty นำไปเปรียบเทียบกับเกณฑ์ท่ีจุดนั้น แต่ถ้าห้องปฏิบัติการใช้พื้นที่ท้ัง working space
ให้พิจารณาทั้ง ค่า Error รวมกับค่า Uncertainty และค่า Uniformity แล้วนำไปเปรียบเทียบกับ
เกณฑห์ ากไม่ผา่ นเกณฑ์สามารถใช้คา่ ปรับแก้ในการปรบั เครื่องมือได้โดยนำค่าแกม้ าทำการปรบั เครือ่ ง
ค่า Uncertainty ที่ระบุในใบรับรองการสอบเทียบเคร่ืองมือด้านอุณหภูมิ เช่น Hot Air
Oven, Incubator, Water Bath ไม่ได้รวมค่า Uniformity ด้วย เนื่องจากมีการสอบเทียบหลายจุด
ใน working space และในแต่ละจุดมคี า่ uncertainty อยู่แลว้

ตวั อยา่ ง การประเมนิ เครอ่ื งมอื Incubator เกณฑก์ ำหนด 30 ± 1OC
Calibration point: 30oC

Standard Reading at Position (C)
123456789
30.87 30.95 30.89 31.14 31.16 31.13 30.97 31.06 30.97

Temperature Distribution

UUC Setting UUC Reading Average Std. Correction Stability Uniformity Overall Uncertainty
(C) (C) (C) (C) ± (C) ± (C) Variation ±(C)
± (C)
30 30 31.02 + 1.02 0.11 0.14 0.15
0.21

83

วธิ ีการประเมิน
1. การใช้งานเฉพาะจุดใน Working space ให้พิจารณาถึงค่า Error/Correction รวมกับ
ค่า Uncertainty (เท่ากับ 0.15 C) แล้วนำไปเปรียบเทียบกับเกณฑ์ทจี่ ุดนั้น เชน่ ใช้งานในตำแหน่ง
ที่ 9 ทำการประเมินเครื่องหาค่า Correction จุดท่ี 9 (30.97 - 30 = 0.97 C) ค่าที่ใช้ในการ
ประเมนิ เท่ากบั 0.97 + 0.15 = 1.12 C

ผลการประเมินเฉพาะจุดใช้งาน ไม่สามารถนำเครื่องมือไปใช้งานได้ ต้องนำค่าแก้ไป
ปรับแก้ โดยทำการ Set ค่าที่เคร่ืองมือ 29C เพ่ือให้ UUC Reading อ่านค่าได้ 29C ให้อุณหภูมิ
ภายในตู้ลดต่ำลง 1C อุณหภูมิ ณ จุดท่ี 9 จะได้ประมาณ 29.97 OC หาค่า Correction เท่ากับ
29.97 - 30 = -0.03 C ทำให้ค่าท่ีใชก้ ารประเมินเคร่ือง เท่ากับ 0.12 C (-0.03 + 0.15 = 0.12C)
เครอ่ื งมอื น้นั จงึ จะผ่านเกณฑก์ ารประเมนิ สามารถใช้งานได้

2. การใช้พ้ืนที่ทั้ง working space ให้พิจารณาค่า Error รวมกับค่า Uncertainty และค่า
Uniformity ถ้าไม่เกินเกณฑ์ท่ีกำหนดสามารถนำไปใช้งานได้ค่าเกินเกณฑ์สามารถใช้ค่าปรับแก้นำมา
ปรับเคร่ืองมือได้ โดยนำค่าแก้มาทำการปรับเคร่ือง และให้พิจารณาค่า Uniformity ร่วมด้วย โดย
การนำค่าแก้ไปทำการปรับแก้ 1 องศาเซลเซียส โดย ทำการ Set เคร่ืองท่ี 29 องศาเซลเซียส เท่ากับ
0.31 องศาเซลเซียส (0.02+0.15+0.14)

การประเมินเคร่ือง สามารถนำเครื่องมือไปใช้งานได้ ในกรณีท่ีเคร่ืองมือมีค่าUniformity
มาก ทำให้การประเมินเคร่ืองไม่ผ่านเกณฑ์ท่ีต้ังไว้ ให้ทำการประเมินเครื่องมือในแต่ละจุด โดยดูค่าท่ี
ไดใ้ นแต่ละจดุ รวมกับคา่ Uncertainty เปรียบเทียบกับเกณฑ์ประเมนิ

การประเมนิ เคร่อื งแก้ว
สามารถประเมินเครื่องโดยนำค่า Error มารวมกับค่า Uncertainty โดยนำค่าที่ได้มา
เปรียบเทียบกับ ค่า Limit of Error ที่ได้กำหนดไว้ของเคร่ืองแก้วแต่ละชนิดและแต่ละ Class ตาม
ตาราง 1 ถึง 6 วา่ มากหรอื น้อยกว่าเกณฑ์ท่ีกำหนด ถ้ามากกวา่ เกณฑ์กำหนดใน Class A ให้พิจารณา
วา่ มากหรือน้อยกว่า Class B ถ้าน้อยกว่าการเกณฑ์ให้ประเมินเคร่ืองแก้วน้ันเป็นเครื่องแก้ว Class B
และถ้ามากกว่า เกณฑ์การประเมิน Class B ให้ประเมินเคร่ืองแก้วนั้นไม่ผ่านเกณฑ์และไม่เหมาะกับ
การใชง้ าน

การประเมนิ ไมโครปเิ ปต (Micropipette)
การประเมินผลการสอบเทียบ Micropipette ต้องผ่านท้ัง Systematic error และ
Random error จงึ จะถอื วา่ เคร่อื งมอื นั้นผา่ น โดยให้ประเมนิ ดังนี้

84

1. ค่าความผิดพลาดเชิงระบบสูงสุดท่ียอมรับได้ (Systematic error) ให้นำค่า error มา
รวมกับ uncertainty แล้วนำไปเทียบกับเกณฑ์กำหนด (%A) โดยก่อนรวมต้องทำให้อยู่ในหน่วย
เดียวกันก่อน (% หรอื ul)

2. ค่าความผิดพลาดเชงิ สมุ่ สูงสุดทีย่ อมรับได้ (Random error) ส่วนมากนิยมรายงานในรูป
ของ %CV (Coefficient of Variation) ให้นำค่าในใบรายงานผลการสอบเทียบกับเกณฑ์กำหนดโดย
ไม่ต้องรวมกบั ค่า Uncertainty

ตาราง 9 ปริมาตรและเกณฑค์ วามผดิ พลาดของ Volumetric Flasks

Nominal capacity Limit of Error ( ml)
(ml)
Class A Class B
1
2 0.025 0.050
5
10 0.025 0.050
20
25 0.025 0.050
50
100 0.025 0.050
200
250 0.040 0.080
500
1000 0.040 0.080
2000
ทม่ี า: ISO 1042: 1998(E) 0.060 0.120

0.100 0.200

0.150 0.300

0.150 0.300

0.250 0.500

0.400 0.800

0.600 1.200

85

ตาราง 10 ปริมาตรและเกณฑค์ วามผิดพลาดของ for Cylinder

Nominal capacity (ml) Limit of Error ( ml)

Class A Class B

5 0.05 0.10

10 0.10 0.20

25 0.17 0.34

50 0.25 0.50

100 0.50 1.00

250 1.00 2.00

500 2.00 4.00

1000 3.00 6.00

ทมี่ า : ASTM International (2007), E 1272

ตาราง 11 ปริมาตรและเกณฑค์ วามผดิ พลาดของ Graduated Pipettes

Nominal capacity Limit of Error ( ml)
(ml)
Class A Class B
0.5
1 0.005 -
2
5 0.006 0.01
10
25 0.01 0.02
ทมี่ า: ISO 835/1-1981(E)
0.03 0.05

0.05 0.1

0.1 0.2

86

ตาราง 12 ปรมิ าตรและเกณฑค์ วามผดิ พลาดของ Volumetric Pipettes

Nominal capacity Limit of Error ( ml)

(ml) Class A Class B

0.5 0.006 0.012

1 0.006 0.012

2 0.006 0.012

3 0.01 0.02

4 0.01 0.02

5 0.01 0.02

6 0.01 0.03

7 0.01 0.03

8 0.02 0.04

9 0.02 0.04

10 0.02 0.04

15 0.03 0.06

20 0.03 0.06

25 0.03 0.06

30 0.03 -

40 0.05 -

50 0.05 0.10

100 0.08 0.16

ท่มี า : ASTM International (2007), E 969 - 95

ตาราง 13 คา่ ความผดิ พลาดสงู สุดสำหรับไมโครปเิ ปต 87

ปรมิ าตรปกติ ค่าความผิดพลาดเชงิ ระบบสูงสดุ คา่ ความผดิ พลาดเชิงสุ่มสูงสุด
ที่ยอมรับได้ (± CV%)
(ไมโครลิตร) ทีย่ อมรับได้ (± A%) 5.0
2.0
1 5.0 1.5
0.8
2 4.0 0.5
0.4
5 2.5 0.3d
0.3d
10 1.2 0.3
0.3
20 1.0 0.3
0.3
50 1.0 0.3

100 0.8

200 0.8

500 0.8

1000 0.8

2000 0.8

5000 0.8

10000 0.6

ทมี่ า: ISO 8655-2:2002(E)

บทท่ี 8
ความปลอดภัยในห้องปฏบิ ัตกิ ารทางจุลชีววทิ ยา

การปฏบิ ัติงานในห้องปฏิบัติการดา้ นจลุ ชีววิทยาของศนู ย์บรกิ ารวิชาการด้านวทิ ยาศาสตร์และ
เทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เจ้าหน้าท่ีผู้ปฏิบัติงานควรมีความรู้ความเข้าใจ
ในข้อพึงปฏิบัติ และเครื่องมือที่เก่ียวข้องกับความปลอดภัยทางชีวภาพ เพื่อความปลอดภัยของ
ผู้ปฏบิ ัติงานเอง และลดความเสี่ยงจากเชอื้ จลุ นิ ทรยี ์ก่อโรคที่อาจแพร่กระจายสู่สิง่ แวดล้อมได้

ระดบั ความปลอดภัยทางชีวภาพ
แบ่งตามความเสี่ยงของประเภทจลุ ินทรียเ์ ป็น 4 ระดบั ดังตารางท่ี 14

ตาราง 14 ระดบั ความปลอดภยั ทางชวี ภาพที่แบ่งตามความเส่ียงของประเภทจลุ นิ ทรีย์

ระดบั ความปลอดภัย ประเภทของจลุ ินทรยี ์* ลกั ษณะห้องปฏบิ ตั กิ าร**
ทางชีวภาพ

ระดบั ท่ี 1: กล่มุ เสย่ี งท่ี 1 : - ห้องปฏิบัติการพื้นฐานท่ดี ำเนนิ การ

biosafety level 1, ไม่มีหรือมีความเสี่ยงต่ำต่อมนุษย์และ เกี่ยวกับเชื้อจุลินทรีย์ท่ีไม่ก่อโรคใน

BSL1 ชุมชน ได้แก่ เช้ือที่มักไม่เป็นสาเหตุ ภาวะปกติตัวอย่างทดสอบ และ

กอ่ โรคทั้งในมนษุ ย์และสัตว์ วัสดุท่ีปนเป้ือนเชื้อท่ีมีความเส่ียง

ในระดับที่ 1

- ไม่จ ำเป็ น ต้อ งมี การออกแบ บ

ลักษณะพิเศษ

- มโี ตะ๊ ปฏบิ ัตกิ าร และอ่างล้างมอื

- ควรมีตู้ปลอดเชื้อและระบบฆ่าเช้ือ

ด้วยหมอ้ น่ึงฆา่ เชื้อ

- ควรมีการฝึกอบรมบุคลากรด้าน

เทคนิคการปฏิ บัติ การท างจุล

ชีววิทยา

89

ตาราง 14 (ต่อ) ประเภทของจุลนิ ทรีย์* ลกั ษณะห้องปฏบิ ตั ิการ**
ระดับความปลอดภัย
กลมุ่ เสยี่ งท่ี 2 : - ห้ อ งป ฏิ บั ติ ก ารที่ ด ำเนิ น ก าร
ทางชวี ภาพ มีความเส่ียงปานกลางต่อมนุษย์และมี เกี่ ย ว กั บ เช้ื อ จุ ลิ น ท รีย์ ก่ อ โรค
ระดับท่ี 2: ความเส่ียงต่ำต่อการเกิดโรคระบาดใน ตั ว อ ย่ า งท ด ส อ บ แ ล ะ วั ส ดุ ท่ี
biosafety level 2, ชุมชน ได้แก่ เช้ือทสี่ ามารถเป็นสาเหตุ ปนเป้ือนเชื้อทมี่ ีความเส่ยี งในระดับ
ของโรคในมนุษย์และสัตว์แต่มักไม่ ท่ี 2
BSL2 เป็ น อั น ต ร า ย ต่ อ บุ ค ล า ก ร ใ น
ห้องปฏิบัติการ ชุมชน ปศุสัตว์หรือ - มโี ตะ๊ ปฏิบัตกิ าร และอ่างล้างมอื
ส่ิ ง แ ว ด ล้ อ ม ห า ก ได้ รั บ เชื้ อ ใน - มีตปู้ ลอดเช้ือ class I หรอื II
ห้องปฏิบัติการอาจทำให้เกิดการติด - มีระบบฆ่าเชื้อด้วยหมอ้ นง่ึ ฆ่าเชอ้ื
เชื้อรุนแรง แต่มีวิธีรักษาหรือป้องกัน - มีการฝึกอบรมบคุ ลากรด้านเทคนิค
โรคที่มีประสทิ ธิภาพ และมีความเส่ียง
ต่ำในการแพร่กระจายของเชื้อ การปฏบิ ัตกิ ารทางจลุ ชวี วทิ ยา
- ต้องมีอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล

และอุปกรณ์ พ้ืน ฐาน (primary
barrier) เช่ น เสื้ อ ก าว น์ ถุ งมื อ
แว่นตา หน้ากากป้องกัน ตู้ปลอด
เชือ้
- ควรมีมาตรการเข้มงวดในการ
อนญุ าตบคุ คลภายนอกเข้า-ออก

90

ตาราง 14 (ตอ่ ) ประเภทของจุลนิ ทรยี ์* ลกั ษณะห้องปฏิบตั ิการ**
ระดบั ความปลอดภัย
กล่มุ เสี่ยงที่ 3 : - ห้องปฏิบัติการที่ดำเนินการเกี่ยวกับ
ทางชวี ภาพ มีความเส่ียงสูงต่อมนุษย์แต่มี เชื้อจุลินทรีย์ก่อโรค ตัวอย่างทดสอบ
ระดับท่ี 3: ค ว า ม เสี่ ย ง ต่ ำ ต่ อ ก า ร เกิ ด โ ร ค และวัสดุที่ปนเป้ือนเชื้อทม่ี ีความเสี่ยง
biosafety level 3, ระบาดในชุมชน ได้แก่ เชื้อที่มัก ในระดับท่ี 3
เป็นสาเหตุของโรครุนแรงในคน
BSL3 และสัตว์แต่มักไม่ค่อยแพร่จาก - มีโต๊ะปฏิบัติการ และอ่างล้างมอื
คนที่ติดเชื้อไปสู่คนอ่ืน และมีวิธี - มีตูป้ ลอดเช้ือ class II หรือ III
รัก ษ าห รือ ป้ อ งกั น โรค ที่ มี - มรี ะบบฆา่ เช้อื ดว้ ยหม้อนง่ึ ฆา่ เชอ้ื
ประสทิ ธิภาพ - มีการฝึกอบรมบุคลากรด้านเทคนิค

การปฏบิ ตั ิการทางจลุ ชีววิทยา
- มีการอาบน้ำ เปลี่ยนเสื้อผ้าก่อนเข้า-

ออกหอ้ งปฏิบตั กิ าร
- ต้องมีอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล ที่

เห ม าะสมและมิดชิด เช่น สวม
รองเท้าหุ้มมิดชิด สวมถุงมือ 2 ชั้น
ใส่หน้ากากอนามัย และใช้หมวกคลุม
ผม รวมทั้งอุปกรณ์อื่น ๆ ที่มีใช้ใน
หอ้ งปฏบิ ัตกิ ารระดับที่ 2
- มีมาตรการเข้มงวดในการอนุญาต
บคุ คลภายนอกเขา้ -ออก
- มี ก า ร ค ว บ คุ ม แ ล ะ ป้ อ ง กั น
สภาพแวดล้อม (second barrier)
ได้ แ ก่ ก ารค ว บ คุ ม ทิ ศ ท างก าร
ไหลเวียนของอากาศแบบ negative
pressure
- การควบคุมอากาศแบบไหลเข้าห้อง
ในทิศทางเดียว และผ่านการกรอง
ด้วย HEPA filter ก่อนออกจากห้อง
โดยไม่มกี ารหมุนเวยี นกลับมาใชซ้ ้ำ

91

ตาราง 14 (ต่อ)

ระดับความปลอดภยั ประเภทของจุลินทรีย์* ลกั ษณะห้องปฏบิ ัติการ**
ทางชวี ภาพ

ระดบั ที่ 4: กลุ่มเส่ียงท่ี 4 : - ใช้กับห้องปฏิบัติการซึ่งมีการดำเนินการ

biosafety level 4, มีความเส่ียงสูงทั้งต่อมนุษย์และ เก่ียวกับเช้ือจุลินทรีย์ก่อโรค ตัวอย่าง

BSL4 มีความเสี่ยงสูงต่อการเกิดโรค ทดสอบและวัสดุท่ี ปนเปื้อนเชื้อที่มีความ

ระบาดในชุมชน ได้แก่ เช้ือท่ี เสยี่ งในระดบั ท่ี 4

เป็นสาเหตุของโรครุนแรงใน - จัดให้มีความปลอดภัยระดับสูงสุด จึงมี

มนุษย์และสัตว์และสามารถ ราคาค่าก่อสร้างและการดูแลรักษาสูง

แพร่ได้ง่ายจากคนหนึ่งไปสู่อีก มาก

ค น ห นึ่ ง ท้ั ง ท า ง ต ร ง แ ล ะ - ถ้าเกดิ อุบตั ิการณ์ของเช้ือท่ีมีความเสี่ยง

ทางอ้อม และไม่มีวิธีรักษา หรือ ระดบั 4 ในประเทศไทยต้องส่งตัวอย่าง

ป้องกนั โรคที่มปี ระสทิ ธภิ าพ ไปตรวจยัง ตา่ งประเทศ

จากการสำรวจห้องปฏิบัติการด้านจุลชีววิทยาของศูนย์บริการวิชาการด้านวิทยาศาสตร์และ
เทคโนโลยี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ พบว่า ปฏิบัติงานกับเชื้อจุลินทรีย์ในกลุ่มเสี่ยงท่ี 2
ดงั น้ันห้องปฏิบัตกิ ารศูนย์บริการวชิ าการด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ต้องมีการจัดการตามระดับ
ความปลอดภัยทางชีวภาพ ระดบั ท่ี 2

การจดั การความปลอดภัยในห้องปฏิบตั กิ ารทางชีวภาพ

1. สถานที่และสง่ิ แวดล้อม
1.1. ห้องปฏบิ ัติการทางจุลชวี วิทยาต้องแยกพนื้ ท่ีกจิ กรรมที่ไม่สามารถดำเนินการรว่ มกันได้
1.2. ผนัง เพดาน พื้นผิวในบริเวณปฏิบัติการและเฟอร์นิเจอร์ต้องเป็นชนิดท่ีไม่ซึมซับน้ำ
และต้องทำความสะอาดได้งา่ ย
1.3. ประตูห้องปฏบิ ตั ิการควรเปน็ ประตแู บบปิดกลบั อัตโนมตั ิและควรปดิ อยเู่ สมอ
1.4. มเี คร่ืองหมายเตือนอนั ตรายทางชีวภาพ (ภาพ 32) ติดไวท้ ่ปี ระตูหอ้ งปฏิบัติการทม่ี ีการ
ปฏบิ ตั งิ านกบั เชอ้ื จุลนิ ทรีย์ในกลุ่มเสยี่ งที่ 2 ขน้ึ ไป
1.5. ตดิ ตง้ั ทแ่ี ขวนเส้ือกาวน์เฉพาะบรเิ วณใกล้ทางออกหอ้ งปฏิบตั ิการ
1.6. มีอปุ กรณ์สำหรับลา้ งมือทมี่ กี อ๊ กแบบไมต่ ้องใชม้ ือเปิด และควรตดิ ตง้ั ใกลท้ างออก
1.7. ห้ามบคุ คลภายนอกท่ไี ม ไ่ ดร้ ับอนุญาตเข้า-ออก หอ้ งปฏิบัติการ

92

2. การควบคุมและการปอ้ งกนั
เจา้ หนา้ ที่ผปู้ ฏิบัตงิ านตอ้ ง

2.1. สวมเสอ้ื กาวนท์ กุ ครั้งขณะทำงานในห้องปฏิบัตกิ าร
2.2. เปลย่ี นรองเทา้ ท่ีใชเ้ ฉพาะในห้องปฏบิ ตั ิการ และห้ามสวมออกจากห้องปฏิบตั กิ าร
2.3. สวมถุงมือให้เหมาะสมกับงานท่ีทำเมื่อต้องสัมผัสกับเชื้อหรือวัสดุติดเชื้อ หลังใช้ถุงมือ

จะตอ้ งถอดถงุ มอื ท้ิง และตอ้ งลา้ งมอื ทกุ คร้งั
2.4. ล้างมือทัง้ หลังสมั ผัสวสั ดุติดเชอื้ และก่อนทจ่ี ะออกจากห้องปฏบิ ัตกิ าร
2.5. สวมแว่นตานิรภัยให้เหมาะสมกับงานท่ีทำในกรณีท่ีอาจเกิดการกระเด็นของเช้ือ หรือ

เม่ือต้องทำงานกบั แสงอัลตราไวโอเลต
2.6. ห้ามใส่เสอื้ กาวนห์ รอื อุปกรณป์ ้องกนั สว่ นบุคคลออกไปภายนอกห้องปฏิบัติการ
2.7. ห้ามรับประทานอาหาร ดื่มเคร่ืองดื่ม สูบบุหรี่ แต่งเคร่ืองสำอาง และสวมใส่คอนแทค

เลนส์ในห้องปฏบิ ัติการ
2.8. หา้ มเก็บอาหารและเคร่อื งดมื่ ไว้ภายในหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร
2.9. มีการจัดทำข้ันตอนการทดสอบ การใช้งานเครื่องมือ อุปกรณ์ และมีการตรวจสอบ

ประสิทธภิ าพการใช้งานและการบำรงุ รกั ษาเครื่องมืออย่างสม่ำเสมอ
2.10. ปฏิบัติงานโดยใช้เทคนิคปลอดเช้ือ เพ่ือป้องกันการปนเป้ือน โดยคำนึงถึงหลัก

3 ประการ คอื
2.10.1. ต้องเก็บ จับหรือถือภาชนะที่มีจุลินทรีย์ด้วยความระมัดระวัง อย่าให้หก
ตก หล่น หรือให้จุลินทรีย์สัมผัสกับอากาศโดยไม่มีส่ิงปกปิด หลีกเลี่ยงการ
ตดิ เชื้อจากการถูกท่ิมแทงจากของมีคม เชน่ เข็มและเศษแก้ว
2.10.2. วัสดุ อุปกรณ์และอาหารเลี้ยงเช้ือท่ีสัมผัสกับจุลินทรีย์จะต้องปราศจากเช้ือ
ทงั้ กอ่ นและหลังจากใชง้ านเสรจ็ แลว้
2.10.3. ควรปฏิบัติงานในตู้ปลอดเช้ือเม่ือต้องปฏิบัติงานกับเชื้อโรคท่ีก่อให้เกิด
อันตราย

3. การใช้เครื่องมอื และอปุ กรณ์ทางจลุ ชวี วทิ ยา
3.1. การใช้ปเิ ปตและเคร่อื งดูดปล่อยของเหลว
3.1.1. เลือกชนิดและขนาดของปิเปตให้เหมาะกับปริมาตรท่ีต้องการ และอุด
ปลายปเิ ปตด้วยสำลเี พือ่ ลดหรือปอ้ งกันการปนเป้ือน

93

3.1.2. ใช้เคร่ืองดดู ปล่อยของเหลว ห้ามใชป้ ากดูดและเป่าปเิ ปตโดยตรงและไม่ควร
ดันของเหลวออกจากปิเปตอย่างรุนแรง เพราะอาจทำให้เกิดการฟุ้ง
กระจายของละอองของเหลว

3.1.3. ปิเปตที่ใช้แล้วควรแช่ในน้ำที่ผสมน้ำยาฆ่าเช้ือ เพ่ือช่วยให้สารละลาย
เศษอาหารไมแ่ หง้ ตดิ ภายใน ทำให้สะดวกและปลอดภยั ในการทำความสะอาด

3.2. ตู้ปลอดเชอื้ (biosafety cabinet)
ตู้ปลอดเชื้อประกอบด้วยแผ่นกรองอากาศประสิทธิภาพสูง (high-efficiency

particulate air, HEPA, filter)สามารถดักจับอนุภาคขนาด0.3ไมครอนได้ถึงร้อยละ99.97และดักจับ
อนุภาคทข่ี นาดใหญก่ ว่านี้ได้ถงึ ร้อยละ 99.99 ต้ปู ลอดเชื้อแบง่ ไดเ้ ปน็ 3 ชนิด ดังตาราง 15

ตาราง 15 ชนิดตปู้ ลอดเชอื้

ตู้ปลอดเช้อื คุณลกั ษณะ คุณสมบัติ การประยกุ ตใ์ ช้

class I อากาศจะถูกดูดผ่าน สามารถป้องกันอันตรายต่อ จุลินทรีย์กลุ่มเส่ียงที่ 1

ช่องเปิดด้านหน้าและ ผู้ปฏิบัติงานและสิ่งแวดล้อม และ 2

ผ่านแผน่ กรอง HEPA แต่ตู้ประเภทน้ีไม่อาจป้องกัน

กอ่ นออกสู่ภายนอก ตัวอย่างจากการเกิ ด การ

ปนเป้ือนได้

class II อาก าศ จะผ่ าน แ ผ่ น สามารถป้องกันการปนเปื้อน จุลินทรีย์กลุ่มเสี่ยงท่ี 2

ก ร อ ง HEPA ไ ป ยั ง ต่อผู้ปฏิบัติงาน ส่ิงแวดล้อม และ 3

พ้ืนท่ีปฏบิ ัติงาน และตวั อยา่ งได้

class III อากาศเข้าผ่ านแผ่น ตปู้ ลอดเชอ้ื ประเภทนใี้ หค้ วาม จลุ นิ ทรียก์ ลมุ่ เสีย่ งที่ 3

ก ร อ ง HEPA แ ล ะ ปลอดภัยต่อผู้ปฏิบัติงานมาก และ 4

อากาศเสียผ่านแผ่น ที่สุดและใชส้ ำหรบั เชอื้ ในกลุ่ม

ก ร อ ง HEPA 2 ชั้ น เส่ียงท่ี 4 ผู้ปฏิบัติงานต้อง

อากาศภ ายน อก ถูก สอดมือผ่านถุงมือแบบหนาท่ี

ควบคุมเพ่ือรักษาความ ตดิ กบั ตู้

ดันที่เป็นลบภายในตู้

ปลอดเชอื้

94

ขอ้ ปฏบิ ัติในการใช้ตปู้ ลอดเชอ้ื มีดงั นี้
3.2.1. สวมเส้ือกาวน์ถุงมือ และจัดเตรียมวัสดุอุปกรณ์ต่าง ๆ ท่ีจำเป็นในการใช้
งานวางในตู้ให้ครบก่อนเริ่มปฏิบตั ิงาน
3.2.2. ทำความสะอาดกอ่ นและหลงั การใช้งานทุกคร้ัง
3.2.3. จัดแยกบรเิ วณสว่ นที่มีเชื้อและไม่มเี ช้อื
3.2.4. จดั เตรียมภาชนะสำหรับทง้ิ ขยะประเภทต่าง ๆ ไว้ในตำแหน่งที่ท้ิงไดส้ ะดวก
และไมก่ ดี ขวางการทำงาน
3.2.5. ใช้เอทิลแอลกอฮอล์(ethyl alcohol) ความเข้มขน้ ร้อยละ 70 หรอื น้ำยาฆ่า
เชือ้ ฉีดพ่น หรอื เช็ดให้ทวั่ บรเิ วณทำงาน
3.2.6. ปิดประตตู ู้และเปดิ หลอดไฟ UV ท้งิ ไว้ 15 นาที
3.2.7. ปิดหลอดไฟ UV แล้วเปิดหลอดไฟฟลูออเรสเซนต์ (fluorescence) และ
ระบบกรองอากาศภายในตู้ไวอ้ ยา่ งน้อย 5 นาทกี ่อนปฏบิ ตั ิงาน
3.2.8. เม่ือเสร็จงานปิดตะเกียง ปิดแก๊สและทำความสะอาดบริเวณทำงานด้วย
เอทิลแอลกอฮอล์ ความเข้มข้นร้อยละ70 หรือน้ำยาฆ่าเชื้อ ปิดระบบกรอง
อากาศและหลอดไฟฟลูออเรสเซนต์เก็บวัสดุอุปกรณ์ต่างๆให้เข้าท่ีแล้วปิด
ประตตู ใู้ ห้สนทิ
3.2.9. ไม่ควรจุดไฟไว้ตลอดเวลาเพราะความร้อนจากเปลวไฟจะทำให้ระบบกรอง
อากาศเสอื่ มเร็ว
3.2.10. ไม่ควรใหบ้ คุ คลอื่นเดินผ่านตู้ขณะทำงาน
3.2.11. ควรทดสอบประสิทธิภาพของหลอด UV ทุก3 - 4 เดือนโดยใช้ UV light
meter หรือใช้วิธีเพาะเช้ือโดยใส่เช้ือปริมาณ 200 - 250 โคโลนีบนจาน
เพาะเชื้อโดยวิธีspread plate วางรับแสง UV นาน 2 นาที นำไปบ่มเพาะ
เชื้อ หากพบว่า UV สามารถทำลายเชื้อไม่น้อยกว่าร้อยละ 99 แสดงว่า
หลอด UV มีประสิทธภิ าพ

3.3. เคร่ืองทำใหเ้ ปน็ เนอ้ื เดยี วกัน เครอ่ื งเขยา่ เครอื่ งปนั่ และ sonicator
3.3.1. ใช้เคร่ืองป่ันสำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการเท่านั้น หากใช้เครื่องป่ันกับเชื้อใน
กลมุ่ เสย่ี งท่ี 3 ควรใสห่ รือเทวสั ดุตดิ เชอื้ ในตู้ปลอดเช้อื เทา่ นนั้
3.3.2. ใช้เครื่อง sonicator ในตู้ปลอดเชื้อเท่านั้น เนื่องจากอาจทำให้เกิดละออง
ของเหลวและควรสวมใส่อุปกรณ์ป้องกันใบหน้าและดวงตาขณะปฏิบัติงาน
และต้องทำความสะอาดและฆ่าเช้อื เครือ่ งมือหลังใชง้ านทกุ คร้ัง

95

3.4. หม้อนงึ่ ฆ่าเชอ้ื
ใช้หลักการฆ่าเช้ือโดยใช้ไอน้ำเดือดภายใต้ความดันสูง สามารถทำลายเช้ือจุลินทรีย์

ทุกชนิด นิยมใช้ฆ่าเชื้ออุปกรณ์อาหารเลี้ยงเชื้อ โดยปกติใช้อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 15 - 30 นาทีภายใตค้ วามดนั 15 ปอนด์ต่อตารางน้ิว มีวธิ กี ารที่สำคญั ดงั น้ี

3.4.1. บันทึก อณุ หภูมิและเวลาท่ีใชท้ ำลายเชอ้ื ทกุ ครั้ง
3.4.2. ใช้ heat - indicating tape ทุกคร้งั
3.4.3. ใช้หลอดหรอื แถบทดสอบทางชีวภาพ (biological indicator vialor strip)

ทกุ คร้ังทใ่ี ช้เครอ่ื ง หรอื อยา่ งนอ้ ยเดอื นละครั้ง
3.4.4. ควรเปลยี่ นน้ำภายในเครอ่ื งทุกสัปดาห์
3.4.5. ควรตรวจสอบรอยรั่วของไอน้ำตามบรเิ วณฝาปิด และ safety valve

4. การลดการปนเป้อื นเช้อื
การลดการปนเปื้อนเชื้อเป็นการควบคุมจุลินทรีย์ที่สามารถทำได้ทั้งวิธีทางกายภาพ ทางเคมีหรือ

ทั้งสองวิธีร่วมกัน การที่จะเลือกใช้วิธีการใดน้ันขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์และข้อจ ำกัดของ
ส่ิงท่ีจะควบคุม โดยคำนึงถึง ชนิดของเช้ือจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคความเข้มข้นของเช้ือการสัมผัสเช้ือ
และผลทีจ่ ะเกิดตอ่ ผลงาน วัสดุสง่ิ แวดลอ้ ม และบุคลากร วธิ ที น่ี ิยมใช้ทั่วไป ไดแ้ ก่

4.1.1. วธิ ีการทางกายภาพ
1) การใชค้ วามร้อน โดยคำนึงถึงอุณหภมู ิระยะเวลา ความสามารถในการ

ทนความร้อนของอุปกรณ์ที่เก่ียวข้องจำนวน ชนิดและความสามารถในการทนความร้อนของ
จุลินทรยี ค์ วามร้อนทใ่ี ชม้ ี 2 แบบ คือความร้อนแหง้ (dry heat) และความร้อนชื้น (moist heat)

1.1) การใช้ความร้อนแหง้
- การเผาในเปลวไฟโดยตรง (direct flame) นิยมใช้กับการ
เผา loop, needle การเผาซากสัตว์ทดลองหรือวัสดุ
อุปกรณท์ ี่ตดิ เชือ้
- การใช้ตู้อบความร้อน (hot air oven) ใช้อบด้วยไอร้อน
อุณหภูมิ 160 – 180 องศาเซลเซียส นาน 1-2 ชั่วโมง
นิยมใช้กับจานเพาะเชื้อ หลอดทดลอง ปิเปต เคร่ืองแก้ว
และภาชนะโลหะต่าง ๆ

1.2) การใชค้ วามรอ้ นชน้ื
- การต้มเดือด ท่ีอุณหภูมิ100 องศาเซลเซยี ส นาน 10 นาที
เป็นวิธีที่ง่ายและสะดวกสามารถทำลายเซลล์ปกติของ