- 138 -Mugimba, K. K., A. A. Chengula, S. Wamala, E. D. Mwega, C. J. Kasanga, D. K. Byarugaba, R. H. Mdegela, S. Tal, B. Bornstein, A. Dishon, S. Mutoloki, L. David, Ø. Evensen, H. M. Munang 'andu. 2018. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. J Fish Dis. 41(8): 1181–1189. Nicholson, P., M. A. Fathi, A. Fischer, C. Mohan, E. Schieck, N. Mishra, A. Heinimann, J. Frey, B. Wieland, J. Jores. 2017. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. J Fish Dis. 40 (12):1925–1928. Pumchan, A., S. Krobthong, S. Roytrakul, O. Sawatdichaikul, H. Kondo, I. Hirono, et al. 2020. Novel Chimeric Multiepitope Vaccine for Streptococcosis Disease in Nile Tilapia (Oreochromis niloticusLinn.). Sci. Rep. 10(1): 1–13. Ramos-Espinoza, F. C., V. A. Cueva-Quiroz, J. Yunis-Aguinaga and J. R. E. de Moraes. 2020. A comparison of novel inactivation methods for production of a vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia Oreochromis niloticus. Aquaculture 528: 735484. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2020.735484.Shahin, K., A. P. Shinn, M. Metselaar, J. G. Ramirez-Paredes, S. J. Monaghan, K. D. Thompson, et al. 2019. Efficacy of an inactivated whole-cell injection vaccine for nile tilapia, Oreochromis niloticus (L), against multiple isolates of Francisellanoatunensis subsp. orientalis from diverse geographical regions. Fish Shellfish Immunol. 89: 217–27. Shoemaker, C. A., G. W.Vandenberg, A. Désormeaux, P. H. Klesius and J. J. Evans. 2006. Efficacy of a Streptococcus iniae modified bacterin delivered using Oralject?? technology in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 255(1): 151–6. Su, H., I. A. Yakovlev, A. van Eerde, J. Su and J. L. Clarke. 2021. PlantProduced Vaccines: Future Applications in Aquaculture. Front Plant Sci. 12: 1592. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.718775.
- 139 -Tettelin, H., V. Masignani, M. J. Cieslewicz, J. A. Eisen, S. Peterson, M. R. Wessels, et al. 2002. Complete genome sequence andcomparative genomic analysis of an emerging human pathogen, serotype V Streptococcus agalactiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 99(19): 12391–6.Yao, Y. Y., D. D. Chen, Z. W. Cui, X. Y. Zhang, Y. Y. Zhou, X. Guo, et al. 2019. Oral vaccination of tilapia against Streptococcus agalactiae using Bacillus subtilis spores expressing Sip. Fish Shellfish Immunol. 86: 999–1008. Yue, K. and Y. Shen. 2021. Review article: An overview of disruptive technologies for aquaculture. Aquaculture and Fisheries https://doi.org/10.1016/j.aaf.2021.04.009. Zeng, W., Y. Wang, H. Hu, Q. Wang, S. M. Bergmann, Y. Wang, et al. 2021. Cell Culture-Derived Tilapia Lake Virus-Inactivated Vaccine Containing Montanide Adjuvant Provides High Protection against Viral Challenge for Tilapia. Vaccines 9(2): 86. doi: 10.3390/vaccines9020086. Zhang, Z. 2021. Review: Research advances on tilapia streptococcosis. Pathogens 10(5): 558. doi.org/10.3390/pathogens10050558.Zhu, L., Q. Yang, L. Huang, K. Wang, X. Wang, D. Chen, et al. 2017. Effectivity of o ral recombinant DNA vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia. Dev. Comp. Immunol. 77: 77–87.
ตอนที่2ปร ะโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิล
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 141 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลเร่อืงที่1 บทน ำในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ าของประเทศไทย และประเทศอื่น ๆ ทั่วโลกพบว่ามีการพัฒนาเทคโนโลยีต่าง ๆ มากมาย เพื่อให้การเลี้ยงประสบความส าเร็จ ได้ผลผลิตตามเปา้หมายและมีความปลอดภัยสูงสุดกับผู้บริโภค น ามาซึ่งความยั่งยืนของการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ าและการประกอบอาชีพของเกษตรกรจากรุ่นสู่รุ่นด้วยความมั่นคงและมั่งคั่ง เทคโนโลยีส าคัญ ๆที่ได้รับการพัฒนามาอย่างต่อเนื่อง เช่น การปรับปรุงพันธุ์ของสัตว์น้ าเศรษฐกิจ เทคโนโลยีการเลี้ยงที่เป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม เทคโนโลยีปัญญาประดิษฐ์ (Artificial Intelligence) และเทคโนโลยีการจัดการสุขภาพสัตว์น้ า เป็นต้นการใช้โปรไบโอติกเป็นเทคโนโลยีที่น ามาใช้กับการเลี้ยงสัตว์มาเป็นเวลานาน โดยเฉพาะในสัตว์ปีก สุกร และสัตว์เคี้ยวเอื้อง เช่นเดียวกับการใช้ในสัตว์น้ าซึ่งที่น่าสนใจมากคือเป็นเทคโนโลยีที่ได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่องและมีการใช้กันอย่างแพร่หลายจนปจัจุบัน ด้วยที่เป็นหลักการทางชีวภาพซึ่งมีความปลอดภัยต่อสัตว์น้ าและไม่มีผลเชิงลบต่อผลผลิตและผู้บริโภค รวมทั้งมีประสิทธิภาพที่เป็นประจักษ์กับนักวิชาการและผู้ประกอบการ ท าให้มีการวิจัยพัฒนาเกี่ยวกับโปรไบโอติกมาอย่างต่อเนื่อง ทั้งในระดับประเทศและต่างประเทศ ปจัจุบันการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ ามีการใช้โปรไบโอติกกันอย่างแพร่หลายในหลายรูปแบบ เช่น การผสมอาหาร หรือ การใช้ในบ่อ โดยมีแหล่งของโปรไบโอติกค่อนข้างหลากหลาย เช่น ผลิตภัณฑ์ที่ผลิตโดยภาครัฐ ภาคเอกชนและที่เกษตรกรผลิตเอง ด้วยประโยชน์ที่มีมากมายจึงท าให้การใช้โปรไบโอติกเป็นที่นิยมในการเลี้ยงสัตว์น้ าเศรษฐกิจของประเทศไทยเร่อืงที่2 นิยำมของโปรไบโอติกในปี 2001 องค์การอาหารและการเกษตรแห่งสหประชาชาติ (Food and AgricultureOrganization of the United Nations [FAO]) และองค์การอนามัยโลก (World HealthOrganization [WHO]) มีข้อสังเกตว่า มีการใช้โปรไบโอติกกันมากทั้งในคนและสัตว์เลี้ยงเพื่อให้การใช้มีความถูกต้องในเชิงวิชาการและเกิดประโยชน์สูงสุด หน่วยงานทั้งสองจึงได้ให้ค าจ ากัดความของโปรไบโอติกไว้ดังนี้“live microorganisms which when administeredin adequate amounts confer a health benefit on the host” หมายถึง “จุลินทรีย์มีชีวิตซึ่งเมื่อร่างกายได้รับในปริมาณที่เพียงพอจะเกิดประโยชน์กับสุขภาพ”
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 142 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลจุลินทรีย์ที่นิยมใช้เช่น แบคทีเรียสกุล Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.,Bacillus spp. และยีสต์ในสกุล Saccharomyces spp. เป็นต้น โปรไบโอติกที่นิยมใช้กับการเลี้ยงปลาและกุ้งเป็นแบคทีเรียในสกุล Bacillus เช่น B. subtilis,B. licheniformis, B. amyloliquefaciens และ B. megaterium เป็นต้น ด้วยคุณสมบัติที่สามารถเข้าสปอร์ได้ท าให้เหมาะสมในการผลิต การเก็บรักษา และการใช้งานกลไกส าคัญของโปรไบโอติกคือการสร้างความสมดุลในระบบทางเดินอาหารของสัตว์ ด้วยกิจกรรมของโปรไบโอติกที่สามารถด ารงอยู่ในทางเดินอาหาร ช่วยป้องกันไม่ให้จุลินทรีย์ที่เป็นโทษเจริญเติบโตได้เพราะโปรไบโอติกสามารถยึดครองพื้นที่ในล าไส้ได้ดีกว่า รวมทั้งการสร้างสารบางชนิดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่เป็นโทษได้และส่งเสริมให้จุลินทรีย์ที่เป็นประโยชน์เจริญเติบโตได้ดีนอกจากนี้โปรไบโอติกยังสามารถสร้างเอนไซม์ได้หลายชนิด เช่น โปรติเอส อะไมเลส และไลเปส ซึ่งจะช่วยในการใช้อาหารของสัตว์ได้ดีขึ้น ท าให้สัตว์มีสมดุลของประชากรจุลินทรีย์ในทางเดินอาหารอย่างต่อเนื่อง ช่วยให้สุขภาพดีมีการใช้อาหารและการดูดซึมและการเจริญเติบโตที่ดีจึงท าให้มีการใช้โปรไบโอติกในการเลี้ยงสัตว์น้ ากันอย่างแพร่หลายจนกระทั่งปัจจุบันเร่อืงที่3 คุณสมบัติของโปรไบโอติกท่ีดี3.1 ควรเป็นจุลินทรีย์ที่เลี้ยงได้ง่าย สามารถเพิ่มจ านวนได้รวดเร็วและไม่ยุ่งยาก ซึ่งเป็นคุณสมบัติส าคัญในการผลิตทางการค้า และการใช้งานในระดับฟาร์ม3.2 จุลินทรีย์ที่สามารถเข้าสปอร์ได้เช่น สกุล Bacillus จะมีข้อได้เปรียบที่สามารถพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ที่เก็บรักษาไว้ได้นาน ส่วนที่เข้าสปอร์ไม่ได้เช่น Lactobacillus ก็สามารถใช้ได้โดยการเตรียมและการใช้ที่เหมาะสม3.3 สามารถเจริญเติบโตได้ดีภายใต้สภาวะต่าง ๆ เช่น อุณหภูมิ ความเค็ม ปริมาณออกซิเจน และความเป็นกรด-ด่าง (พีเอช) เป็นต้น3.4 สามารถทนต่อสภาวะในทางเดินอาหารของสัตว์ เช่น ความเป็นกรด-ด่าง (พีเอช) เอนไซม์และน้ าดีเป็นต้น
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 143 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิล3.5 สามารถมีชีวิตและเจริญเติบโตได้ดีในทางเดินอาหารของสัตว์และสามารถยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ที่เป็นโทษ ด้วยคุณสมบัติต่าง ๆ เช่น การยึดเกาะที่ผนังล าไส้การแข่งขันในการใช้อาหาร/แร่ธาตุหรือการสร้างสารยับยั้ง เช่น สาร bacteriocin กรดอินทรีย์ เช่น กรดแลคติก สามารถส่งเสริมจุลินทรีย์ที่เป็นประโยชน์ท าให้เกิดสมดุลของประชากรจุลินทรีย์ในทางเดินอาหาร3.6 สร้างเอนไซม์ที่เป็นประโยชน์ในการย่อยอาหารของสัตว์เช่น โปรติเอส อะไมเลส และไลเปส3.7 ช่วยกระตุ้นภูมิคุ้มกันของสัตว์ท าให้สัตว์มีความต้านทานต่อเชื้อโรคได้ดีภาพที่62 ลักษณะเซลล์ของบาซิลลัส ที่ติดสีย้อมแกรมบวก เป็นแท่งยาวภาพที่64 การด ารงชีวิตอยู่ในทางเดินอาหารของสัตว์น้ าเป็นคุณสมบัติส าคัญของโปรไบโอติกที่ดีภาพที่63 แสดงคุณสมบัติการเข้าสปอร์ของบาซิลลัส (spored cell) เปรียบเทียบกับเซลล์ปกติ (vegetative cell)
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 144 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลภาพที่65 การทดสอบคุณสมบัติการยับยั้งเชื้อก่อโรคในสัตว์น้ าของโปรไบติกกลุ่มบาซิลลัส(เชื้อในแนวตั้ง คือ เชื้อก่อโรคในสัตว์น้ า; เชื้อในแนวนอน คือ โปรไบโอติกที่ใช้ทดสอบ)เร่อืงที่4 ชนิดของโปรไบโอติกและกำรใช้ในปลำนิลการใช้โปรไบโอติกมีความหลากหลายของชนิดของจุลินทรีย์ซึ่งสรุปได้ดังนี้4.1 แบคทีเรียและที่ไม่ใช่แบคทีเรีย ตัวอย่างของแบคทีเรียที่ใช้เป็นโปรไบโอติก เช่น Bacillus,Lactobacillus, Bifidobacterium และที่ไม่ใช่แบคทีเรีย เช่น ยีสต์ Saccharomyces4.2 แบคทีเรียที่เข้าสปอร์เช่น Bacillus และไม่เข้าสปอร์ เช่น Lactobacillus และ Bifidobacterium ในการเลี้ยงสัตว์น้ านิยมใช้แบคทีเรียที่เข้าสปอร์4.3 ปัจจุบันในการเลี้ยงสัตว์น้ านิยมใช้โปรไบโอติกมากกว่าหนึ่งชนิด โดยเฉพาะBacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium และ B. pumilus เป็นต้น โดยพิจารณาจากคุณสมบัติที่โดดเด่นของบาซิลลัสแต่ละชนิด4.4 โปรไบโอติกที่พบในทางเดินอาหารสัตว์หรือที่น ามาจากแหล่งอื่น ในสัตว์น้ าพบว่าในทางเดินอาหารมีแบคทีเรียที่สามารถน ามาใช้เป็นโปรไบโอติก เช่น Bacillus แล ะ Lactobacillus4.5 หัวเชื้ออีเอ็ม (Effective microorganism [EM]) ประกอบด้วยจุลินทรีย์หลายชนิด นิยมใช้กันในวงการเกษตรและการเลี้ยงสัตว์น้ า4.6 น้ าหมักชีวภาพ ที่ได้จากการหมักหัวเชื้อจุลินทรีย์กับอาหารที่ได้จากวัตถุดิบธรรมชาติในท้องถิ่น
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 145 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลในการเลี้ยงปลานิลของประเทศไทยพบว่ามีการใช้โปรไบโอติกจากหลายแหล่ง โดยส่วนใหญ่เป็นบาซิลลัสในรูปของสปอร์ที่ได้จากผลิตภัณฑ์ทางการค้า และของภาครัฐ (กรมประมง) รวมถึงหัวเชื้ออีเอ็ม เกษตรกรต้องการลดต้นทุนก็จะเตรียมเชื้อเอง ส่วนที่นิยมในกลุ่มเกษตรกรผู้เลี้ยงปลานิลบางแห่งคือ การใช้น้ าหมักชีวภาพโดยใช้หัวเชื้อโปรไบโอติก เช่น บาซิลลัส หรืออีเอ็ม หมักกับอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้จากท้องถิ่น เช่น กล้วย และ ดอกกระเจี๊ยบเป็นต้น จากข้อมูลที่ได้จากโครงการปราชญ์ปลานิล พบว่าตรวจพบเชื้อบาซิลลัสจากน้ าหมักเหล่านี้แต่มักจะมีปริมาณเชื้อน้อย ซึ่งการใช้เทคนิคแบบนี้นอกจากจะช่วยในการลดต้นทุนแล้วยังสามารถน าวัสดุท้องถิ่นมาใช้ประโยชน์ได้นอกจากการใช้ผสมอาหารยังพบว่ามีการใช้จุลินทรีย์โปรไบโอติกลงในบ่อ เช่น บ่ออนุบาล/บ่อช าปลานิล เพื่อรักษาสภาพพื้นบ่อ เพราะโปรไบโอติกหลายชนิดสามารถใช้สารอินทรีย์ได้ดีทั้งในสภาพที่มีและไม่มีออกซิเจน ซึ่งก็จะท าให้สามารถควบคุมปริมาณเลนพื้นบ่อได้และท าให้คุณภาพน้ าในภาพรวมของบ่อมีความเหมาะสมในการอนุบาลหรือเลี้ยงปลานิลไปด้วย อย่างไรก็ตาม ในการใช้โปรไบโอติกให้ได้ประโยชน์กับปลา ควรพิจารณาในประเด็นต่าง ๆ เช่น•การใช้ผลิตภัณฑ์ทางการค้า ต้องเลือกใช้สินค้าที่น่าเชื่อถือ และมีการขึ้นทะเบียนกับหน่วยงานภาครัฐ•ควรเป็นจุลินทรีย์ที่มีคุณสมบัติที่ดีของโปรไบโอติก (ตามข้างต้น)•ควรมีปริมาณจุลินทรีย์ในระดับที่เหมาะสม ผลิตภัณฑ์โปรไบโอติกส่วนใหญ่ระบุว่ามีปริมาณเชื้อประมาณ 109 ถึง 1012 CFU/กรัม การผสมอาหารให้ปลากินยังไม่มีรายงานว่าควรจะต้องมีปริมาณเชื้อเท่าไรเพื่อให้เกิดประสิทธิผลอย่างชัดเจนในไก่เนื้อพบว่าในอาหารไก่ที่มีโปรไบ โอติกผสมอยู่ที่ 108 CFU/กก. ไม ่มีผลต ่อประชากรจุลินทรีย์ที่ตรวจพบในมูลไก่แต่ที่ 109 CFU/กก. พบว่าปริมาณเชื้อในกลุ่มโคลิฟอร์มในมูลจะลดลงอย่างมีนัยส าคัญ•การใช้จุลินทรีย์น้ าหมัก ควรให้แน่ใจว่ามีปริมาณโปรไบโอติกพอในการน าไปให้ปลา และไม่มีเชื้อที่เป็นโทษต่อปลาหรือผู้บริโภค•การเตรียมน้ าหมักชีวภาพ ควรใช้หัวเชื้อโปรไบโอติก (ผลิตภัณฑ์ทางการค้า ภาครัฐ หรือ อีเอ็ม) ร่วมด้วย เพื่อให้แน่ใจว่าได้ปริมาณโปรไบโอติกที่เหมาะสมในผลผลิตน้ าหมักก่อนน าไปใช้ผสมอาหารเลี้ยงปลา•ควรเลี้ยงปลานิลด้วยอาหารผสมโปรไบโอติกอย่างต่อเนื่องเพื่อให้ได้รับในปริมาณที่เพียงพอและเกิดประโยชน์กับปลา เช่น ให้สัปดาห์ละครั้ง
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 146 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลเร่อืงที่5 กำรแยกโปรไบโอติกจำกสัตว์น ้ำการแยก (isolation) โปรไบโอติกจากสัตว์น้ า สามารถแยกได้จากล าไส้ของสัตว์น้ า หรือจากสิ่งแวดล้อม จากดิน จากน้ า โดยทั่วไปแล้วมักจะแยกโปรไบโอติกจากล าไส้ของสัตว์น้ าเจ้าบ้าน และสิ่งแวดล้อมที่เลี้ยงสัตว์น้ าภายในสัตว์น้ ากลุ่มเดียวกัน เพื่อใช้ในสัตว์น้ าชนิดนั้น ๆเช่น การแยกเชื้อ Rummeliibacillus sp. จากล าไส้ของปลานิลเพื่อใช้เป็นโปรไบโอติกในปลานิล (Tan et al., 2019) การแยกเชื้อ Bacillus spp. จากล าไส้และ ดินในบ่อเลี้ยงกุ้งกุลาด าเพื่อใช้เป็นโปรไบโอติกในกุ้งกุลาด า และ กุ้งขาว เป็นต้น นอกจากนี้ยังมีการพยายามใช้ประโยชน์จากเชื้อในแหล่งน้ าธรรมชาติเช่น การแยกเชื้อแบคทีเรียกลุ่มผลิตกรดแลคติก(Lactic Acid Bacteria; LAB) (Hamdan et al., 2016) และ แบคทีเรียกลุ่มที่ทนต่ออุณหภูมิต่ า (psychrotolerant bacteria) (Makled et al., 2017) จากตัวอย่างตะกอนน้ าทะเล สาหร่าย ฟองน้ า และปะการังจากชายฝ่งัทะเล มาใช้เป็นโปรไบโอติกในปลานิลอีกด้วยขั้นตอนการแยกเชื้อจากล าไส้ปลานิล ท าการสุ่มเก็บตัวอย่างปลานิลที่มีสุขภาพดีอดอาหารเป็นเวลา 72 ชั่วโมงก่อนผ่าหน้าท้อง ด้วยเทคนิคปลอดเชื้อ ผ่าตัดน าล าไส้มาบดให้เป็นเนื้อเดียวในสารละลายที่มีคุณสมบัติเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อ หรือ saline solution และท าการบ่มที่อุณหภูมิ28°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อเพิ่มจ านวนแบคทีเรียทั้งหมด จากนั้นท าการแยกเชื้อแบคทีเรียที่มีคุณสมบัติเป็นโปรไบโอติก ด้วยวิธีการหลากหลาย ขึ้นอยู่กับกลุ่มแบคทีเรียโปรไบโอติกที่ต้องการ ดังนี้1. การช็อกด้วยความร้อนและความเย็น (heat and cold shock) ท าได้โดยการแช่หลอดทดลองที่มีสารละลายแบคทีเรียรวม ลงในอ่างน้ าควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิ80 °Cเป็นเวลา 20 นาที (Hamdan et al., 2016; Makled et al., 2017; Reda et al.,2018; Tan et al., 2019) หรือ 75–80 °C เป็นเวลา 10–15 นาที (Song et al., 2011) และท าให้เย็นลงทันที (on ice) 1 – 2 นาที (Sookchaiyaporn et al., 2020) เพื่อลดจ านวนแบคทีเรียที่ไม่มีคุณสมบัติสร้างเอนโดสปอร์จากนั้นน า supernatant มาท าให้เชื้อกระจายในจานเพาะเชื้อ (spread plate) และ ท าการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ด้วยการเขี่ยเชื้อในจานเพาะเชื้อ (streak plate) เพื่อน าไปทดสอบคุณสมบัติในขั้นตอนต่อไป
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 147 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิล2. การแช่เยือกแข็ง (cryo-culture) คือ การใช้ความเย็นที่อุณหภูมิระดับแช่เชือกแข็งในการแยกแบคทีเรียกลุ่มที่มีคุณสมบัติในการทนต่อความเย็นจัดได้ซึ่งอาจมีคุณสมบัติในการสร้างหรือไม่สร้างเอนโดสปอร์ก็ได้ ท าได้โดยการเก็บรักษาล าไส้ หรือ สารละลายล าไส้ ในหลอดแช่แข็ง (cryo-vial) ที่อุณหภูมิ-80 °C จากนั้นจึงใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลเพื่อท าการจ าแนกชนิดของเชื้อแบคทีเรีย (Wanka et al., 2018)3. การเพาะเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบคัดเลือก (selective media) เป็นการแยกเชื้อจากคุณสมบัติเฉพาะของเชื้อที่จะสามารถเจริญได้บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด selective media เฉพาะชนิด เช่น การแยกเชื้อแบคทีเรีย Lactobacillus spp. โดยการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ MRS(De Man, Rogosa and Sharpe) (Hamdan et al., 2016) การแยกเชื้อแบคทีเรียกลุ่มที่ทนต่อความเค็ม (halotolerant bacteria) โดยการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ marine medium (Makled et al., 2017; Wanka et al., 2018) เป็นต้น4. การเลี้ยงเชื้อภายใต้อุณหภูมิต่ า (low-temperature cultivation) เป็นวิธีส าหรับแยกเชื้อแบคทีเรียในกลุ่มที่ทนต่อความเย็น และเจริญได้ดีในอุณหภูมิต่ า (psychrotolerantbacteria) ท าได้โดยการบ่มตัวอย่าง (ในรูปของสารละลายที่อยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ) ที่อุณหภูมิ5 °C นาน 7 – 10 วัน จากนั้นน า supernatant มาท าให้เชื้อกระจายในจานเพาะเชื้อ และท าการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์และน าไปทดสอบคุณสมบัติการทนต่ออุณหภูมิอีกครั้งที่ช่วงอุณหภูมิระหว่าง 5 – 40 °C หรือ คุณสมบัติอื่น ๆ ด้วย เช่น การทนต่อช่วงความเค็ม 0 – 10 % NaCl และ ช่วง pH 4.0 – 9.0 (Makled et al., 2017)เมื่อท าการแยกเชื้อที่ต้องการได้แล้ว น าเชื้อที่ผ่านการท าให้บริสุทธิ์แล้วมาท าการจ าแนกชนิดของเชื้อที่แยกได้ด้วยการตรวจสอบลักษณะสัณฐาน การทดสอบทางจุลชีววิทยา การทดสอบทางชีวเคมีและระบุชนิดของแบคทีเรียด้วยวิธีทางชีวโมเลกุลโดยการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของยีน 16S rRNA ในแบคทีเรีย ด้วยไพรเมอร์สากล (universal primer) และวิเคราะห์ล าดับเบส (DNA sequencing analysis) และน าไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลล าดับเบสใน GenBank โดยใช้ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)นอกจากการระบุชนิดของเชื้อแล้ว ในการแยกและจัดจ าแนกเชื้อเพื่อน าไปใช้ประโยชน์เป็นโปรไบโอติก ควรต้องมีการประเมินคุณสมบัติด้านอื่น ๆ ของเชื้อที่แยกได้ด้วย เช่น การทดสอบความเป็นพิษต่อสัตว์น้ า การประเมินการผลิตสารพิษ ความสามารถในการเจริญในทางเดินอาหารของสัตว์น้ า ความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ (Hamdan et al., 2016) ความต้านทานทางเคมีกายภาพระหว่างการผลิต (physicochemical stresses during production) และ ความเสถียรระหว่างการผลิตและการเก็บรักษา (Mingmongkolchai and Panbangret, 2018) การทนต่อระดับ pH และ เกลือน้ าดี(bile salts tolerance) (Sookchaiyaporn et al., 2020) เป็นต้น
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 148 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลการใช้โปรไบโอติกในปลานิล มีการศึกษาวิจัยอย่างแพร่หลายต่อเนื่อง มีการศึกษาผลของการใช้โปรไบโอติกในปลานิลหลากหลายสายพันธุ์ ในสกุล Oreochromis sp. หรือ ในสายพันธุ์ลูกผสม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Oreochromis niloticus ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ส าคัญและนิยมเลี้ยงมากที่สุด รูปแบบและวิธีการใช้โปรไบโอติกในปลานิลส่วนใหญ่เป็นการให้ผ่านการเสริมในอาหาร (dietary supplementation) ทั้งการใช้โปรไบโอติกเพียงชนิดเดียว หรือ แบบผสมตั้งแต่สองชนิดขึ้นไป จากโปรไบโอติกสายพันธุ์ที่แยกได้เอง หรือ สายพันธุ์ทางการค้า ทั้งนี้อาจมีการใช้โปรไบโอติกร่วมกับพรีไบโอติก หรือ สารอื่น ๆ ที่มีคุณสมบัติช่วยกระตุ้นภูมิคุ้มกันมีการศึกษาอัตราการใช้ระยะเวลาการใช้ซึ่งผลจากการใช้โปรไบโอติกดังกล่าวส่งผลต่อปลานิลทั้งในด้าน การเจริญเติบโต ภูมิคุ้มกัน ความต้านทานโรค ปริมาณเชื้อในล าไส้และกิจกรรมของเอนไซม์ในล าไส้โดยได้รวบรวมผลงานวิจัยที่มีการตีพิมพ์เมื่อไม่นานมานี้ดังแสดงในตารางที่13เร่อืงที่6 งำนว ิจัยโปรไบโอติกกับปลำนิลตารางที่ 13 ผลงานวิจัยการใช้โปรไบโอติกในปลานิล
บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 149 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิลตารางที่ 13 ผลงานวิจัยการใช้โปรไบโอติกในปลานิล (ต่อ)
ตารางที่ 13 ผลงานวิจัยการใช้โปรไบโอติกในปลานิล (ต่อ)บทที่ 4 เ ท ค โ น โ ล ยี แ ล ะ น วั ต ก ร ร ม - 150 - ตอนที่ 2 ประโยชน์ของโปรไบโอติกในการเลี้ยงปลานิล
- 151 -เอกสำรอ้ำงอิงDawood, M. A. O., F. I. Magouz, M. F. I. Salem and H. A. Abdel-Daim. 2019. Modulation of digestive enzyme activity, blood health, oxidative responses and growth-related gene expression in GIFT by heatkilled Lactobacillus plantarum (L-137). Aquaculture 505:127–136.Dawood, M. A. O., F. I. Magouz, M. F. I. Salem, Z. I. Elbialy and H. A. AbdelDaim. 2020. Synergetic Effects of Lactobacillus plantarum and beta-Glucan on Digestive Enzyme Activity, Intestinal Morphology, Growth, Fatty Acid, and Glucose-Related Gene Expression of Genetically Improved Farmed Tilapia. Probiotics and Antimicrobial Proteins 12(2):389–399.Gobi, N., B. Vaseeharan, J. C. Chen, R. Rekha, S. Vijayakumar, M. Anjugamand A. Iswarya. 2018. Dietary supplementation of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 improves growth performance, mucus and serum immune parameters, antioxidant enzyme activity as well as resistance against Aeromonas hydrophila in tilapia Oreochromis mossambicus. Fish and Shellfish Immunology 74:501–508.Guimarães, M. C., A. I. C. da Silva Guimarães, M. M. Natori, M. F. F. Alarcon, D. d. C. Dias, C. M. Ishikawa, S. Tapia-Paniagua, M. Á. Moriñigo, F. J. Moyano and L. Tachibana. 2021. Oral administration of Bacillus subtilis and Lactobacillus plantarum modulates the gutmicrobiota and increases the amylase activity of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture International 29(1):91–104.Hamdan, A. M., A. F. El-Sayed and M. M. Mahmoud. 2016. Effects of a novel marine probiotic, Lactobacillus plantarum AH 78, on growth performance and immune response of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of Applied Microbiology 120(4):1061–1073.Li, H., Y. Zhou, H. Ling, L. Luo, D. Qi and L. Feng. 2019. The effect of dietary supplementation with Clostridium butyricum on the growth performance, immunity, intestinal microbiota and disease resistance of tilapia (Oreochromis niloticus). PLoS ONE 14(12):e0223428 .https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0223428.
- 152 -Liu, H., S. Wang, Y. Cai, X. Guo, Z. Cao, Y. Zhang, S. Liu, W. Yuan, W. Zhu, Y. Zheng, Z. Xie, W. Guo and Y. Zhou. 2017. Dietary administration of Bacillus subtilis HAINUP40 enhances growth, digestive enzyme activities, innate immune responses and disease resistance of tilapia, Oreochromis niloticus. Fish and Shellfish Immunology 60:326–333.Makled, S. O., A. M. Hamdan, A. M. El-Sayed and E. E. Hafez. 2017. Evaluation of marine psychrophile, Psychrobacter namhaensisSO89, as a probiotic in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) diets. Fish and Shellfish Immunology 61:194–200.Mingmongkolchai, S. and W. Panbangred. 2018. Bacillus probiotics: an alternative to antibiotics for livestock production. Journal of Applied Microbiology 124(6):1334–1346.Opiyo, M. A., J. Jumbe, C. C. Ngugi and H. Charo-Karisa. 2019. Dietary administration of probiotics modulates non-specific immunity and gut microbiota of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) cultured in low input ponds. International Journal of Veterinary Science and Medicine 7(1):1–9.Reda, R. M., K. M. Selim, H. M. El-Sayed and M. A. El-Hady. 2018. InVitro Selection and Identification of Potential Probiotics Isolated from the Gastrointestinal Tract of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus. Probiotics and Antimicrobial Proteins 10(4):692–703.Sewaka, M., C. Trullas, A. Chotiko, C. Rodkhum, N. Chansue, S. Boonanuntanasarn and N. Pirarat. 2019. Efficacy of synbioticJerusalem artichoke and Lactobacillus rhamnosus GG-supplemented diets on growth performance, serum biochemical parameters, intestinal morphology, immune parameters and protection against Aeromonas veronii in juvenile red tilapia (Oreochromisspp.). Fish and Shellfish Immunology 86:260–268.Song, Z. F., J. An, G. H. Fu and X. L. Yang. 2011. Isolation and characterization of an aerobic denitrifying Bacillus sp. YX-6from shrimp culture ponds. Aquaculture 319(1-2):188–193.Sookchaiyaporn, N., P. Srisapoome, S. Unajak and N. Areechon. 2020. Efficacy of Bacillus spp. isolated from Nile tilapia Oreochromis niloticus Linn. on its growth and immunity, and control ofpathogenic bacteria. Fisheries Science 86(2):353–365.
- 153 -Srisapoome, P. and N. Areechon. 2017. Efficacy of viable Bacillus pumilus isolated from farmed fish on immune responses and increased disease resistance in Nile tilapia (Oreochromis niloticus): Laboratory and on-farm trials. Fish and Shellfish Immunology 67:199–210.Tachibana, L., G.S. Telli, D. de Carla Dias, G. S. Gonçalves, C. M. Ishikawa, R. B. Cavalcante, M. M. Natori, S. B. Hamed and M. J. T. Ranzani-Paiva. 2020. Effect of feeding strategy of probiotic Enterococcus faecium on growth performance, hematologic, biochemical parameters and non-specific immune response of Nile tilapia. Aquaculture Reports.16:100277.Tan, H.Y, S. W. Chen and S. Y. Hu. 2019. Improvements in the growth performance, immunity, disease resistance, and gut microbiota by the probiotic Rummeliibacillus stabekisii in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Fish and Shellfish Immunology 92:265–275.Van Doan, H., S. H. Hoseinifar, M. A. O. Dawood, C. Chitmanat and K. Tayyamath. 2017. Effects of Cordyceps militaris spent mushroom substrate and Lactobacillus plantarum on mucosal, serum immunology and growth performance of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Fish and Shellfish Immunology 70:87–94.Van Doan, H., S. H. Hoseinifar, W. Tapingkae, M. Seel-Audom, S. Jaturasitha, M. A. O. Dawood, S. Wongmaneeprateep, T. N. N. Thu and M. A. Esteban. 2020. Boosted Growth Performance, Mucosal and Serum Immunity, and Disease Resistance Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Fingerlings Using Corncob-Derived Xylooligosaccharide and Lactobacillus plantarum CR1T5. Probiotics and Antimicrobial Proteins 12(2):400–411.Van Nguyen, N., S. Onoda, T. Van Khanh, P. D. Hai, N. T. Trung, L. Hoang and S. Koshio. 2019. Evaluation of dietary Heat-killed Lactobacillus plantarum strain L-137 supplementation on growth performance, immunity and stress resistance of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 498:371–379.Wanka, K.M., T. Damerau, B. Costas, A. Krueger, C. Schulz and S. Wuertz. 2018. Isolation and characterization of native probiotics for fish farming. BMC Microbiology 18(1):119.
Won, S., A. Hamidoghli, W. Choi, Y. Park, W. J. Jang, I. S. Kong and S. C. Bai. 2020. Effects of Bacillus subtilis WB60 and Lactococcus lactis on Growth, Immune Responses, Histology and Gene Expression in Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Microorganisms 8, 67; doi:10.3390/microorganisms8010067.Xia, Y., M. Lu, G. Chen, J. Cao, F. Gao, M. Wang, Z. Liu, D. Zhang, H. Zhu and M. Yi. 2018. Effects of dietary Lactobacillus rhamnosusJCM1136 and Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805 on the growth, intestinal microbiota, morphology, immune response and disease resistance of juvenile Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Fish and Shellfish Immunology 76:368–379.Zhang, D., Y. Gao, X. Ke, M. Yi, Z. Liu, X. Han, C. Shi and M. Lu. 2019. Bacillus velezensis LF01: in vitro antimicrobial activity against fish pathogens, growth performance enhancement, and disease resistance against streptococcosis in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Applied Microbiology and Biotechnology. 103(21-22):9023–9035.Zhai, Q., H. Wang, F. Tian, J. Zhao, H. Zhang and W. Chen. Dietary Lactobacillus plantarum supplementation decreases tissue lead accumulation and alleviates lead toxicity in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture Research 48(9):5094–5103..- 154 -
TILAPIA CULTUREการเพา ะเล้ียงปลานิลกรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ์Department of Fisheries. Ministry of Agriculture and Cooperativesคณะประมง มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์Faculty of Fisheries. Kasetsart University