คู่มือการปฏิบัติงานการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรีย

Division of Vector Borne Disease, Department of Disease Control, Ministry of Public Health. Manual on Standard Operating Procedures for malaria microscope and Quality Control. 1 st edition. Nonthaburi: Department of Disease Control (TH); 2021.

กองโรคติดต่อนําโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข รากนางิตับิฏปอืมู่ค ตรวจวนิจฉัยเชือมาลาเรยด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ISBN : 978-616-11-4610-8 คณะที รกษา : นายแพทย ภอ์ ิชาต วชิรพั ์ธน แพทย ญห์ าดงิ รนทร์ อารย์โชคชัย ดร.แพทย ญห์ านทนัฉงิ ผดุงทศ นางยุพา เอื ว อรติจ รุณ แพทย ญห์ ิงชีวนันท์ เลิศพิรยสุวัฒน์ นางคนึงนิจ คงพ่วง ดัจู้ผะณค ทํา : นางสาวอังคณา แ เ่ซ จ็ง นางจันทร์พร จ านิ นางสาววรรณา ศรสัจจารักษ์ นายเสร สิงห์ทอง นางพัชรดา บุญเดช นางสาวสุนิสา หวังว กดั ลาง นางสาวธุวาพร สุวรรณลา นางอรัญญา ภิญโญรัตนโชติ นายพลวัชร์ เรองศิรรักษ์ นายสมชาย อินทนาคม นางสาวสารณี ศรเทพ นางสาวมาเรยม เลาะลง นางสาวพีรดา คิวเจรญ นายพงษ์รุจน์ รัฐประเสรฐ นางสาวสมวรรณ แก้วแสงทองเจรญ นายวรเชษฐ ์ คันธวังอินทร์ นางสาวจุติกุล แก้วมาลากุล นายมนตร อาสานอก นางสาวสรยา ยังพึง นางสาวเสาวลักษณ์ วงศ์อรุณกชกร พิมพ์ครังที เดือนพฤศจิกายน 2564 จํานวน 500 เล่ม จัดพิมพ์โดย: กองโรคติดต่อนําโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข ถนนติวานนท์จังหว บทนนดั ุร 11000 โทร. 02-590-3128-9 โทรสาร 02 591 3122 พิมพ์ทีบรษัท สแกนด์-มีเดีย คอร์ปอเรชัน จํากัด 211 ซอยประเสรฐมนูกิจ 29 ถนนประเสรฐมนูกิจ แขวงจรเข้บ ตขเ วั ลาดพร้าว กทม. 10230 โทร. 02 943 7166-8

4 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชือมาลา ้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ กิตติกรรมประกาศ การจัดทําค ืมู่ อปฏิบัติงานการตรวจวนิจฉัยเชื ลาเรยด้วยกล้องจุลทรรศน์และการควบคุมคุณภาพ เล่มนีได้รับความร่วมมือจากคณะทีปรกษา คณะอนุกรรมการ และคณะทํางานศูนย์อ้างอิงห้องปฏิบัติการ ตรวจวนิจฉัยมาลาเรยระดับประเทศ พ.ศ. 2563 โดยร่วมดําเนินการพัฒนาและปรับปรุง จนเป ืมู่ค อแนวทาง ทีเป สามารถนําไปใช้ในการปฏิบัติงานได้ในห้องปฏิบัติการทุกระดับ ทีให้บรการตรวจ วนิจฉัยโรคมาลาเรยด้วยกล้องจุลทรรศน์ ขอขอบคุณ ดร.คนึงนิจ คงพ่วง ู้ผเชียวชาญทางด้านการตรวจวนิจฉัยเชื ลาเรย ทีให้คําแนะนํา และเป ทีปรกษาอย กใงา่ ล้ชิด จัดทําร่าง การเข นยี ืมู่ค อพร้อมทังจัดทําเป ภาษาอังกฤษจนประสบความสําเร็จ ขอขอบคุณคณะกรรมการพัฒนาการตรวจวนิจฉัยมาลาเรยมาตรฐานสากล และ อู้ผ ํานวยการกองโรค ติดต่อนําโดยแมลง ทีเห็นความสําคัญ ให้คําแนะนํา ตลอดจนให้การสนับสนุนการดําเนินงาน และการจัด ประชุมร่วมกับคณะ จู้ผ ัดทําค ืมู่ อ ขอขอบคุณ Dr. Maria Dorina Bustos และ Dr. Deyer Gopinath จากองค์การอนามัยโลกประจํา ประเทศไทย ทีสนับสนุนด้านวชาการ คําแนะนําต่าง ๆ ตลอดจนงบประมาณ เพือให้ค ืมู่ อเล่มนีสอดคล้องตาม มาตรฐานทีองค์การอนามัยโลกกําหนด ืมู่ค อเล่มนีจะเป ส่วนหนึงของการผลักดันให้การกําจัดโรคไข าม้ ลาเรย ของประเทศไทยประสบความสําเร็จ ืมู่ค อแนวทางการปฏิบัติงานเล่มนีมีเนื ละขันตอนการปฏิบัติงานอย งา่ ละเอียด ต้องใช้ความตังใจ ความสามารถ ประสบการณ์ และเวลาของทีมงานทุกท่าน รวมทังการสนับสนุนจากผู้เกียวข้องทุกด้าน ตามทีกล่าวมาแล้ว จนทําให้หนังสือเล่มนีสําเร็จลุล่วงด้วยดีคณะ จู้ผ ัดทําต้องขอขอบพระคุณเป ย งา่ สูงมา ณ ทีนี คณะ จู้ผ ัดทํา ศูนย์อ้างอิงทางห้องปฏิบัติการโรคติดต่อนำโดยแมลง พ.ศ. 2564

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5 คานํ ํา คู่มือขันตอนการปฏิบัติงานการตรวจวนิจฉัยมาลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์จัดทาํ ขึ พืห้ทุก หน่วยงานทีห้บร จวนิจฉัยมาลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้นําไปใชใ้นการปฏิบัติงาน โดยทุกขันตอน ต่อไปนถีอืเป ข้อบังคบัทตี ้องปฏบิตั ิตาม สําหรบัห้องปฏบิตั ิการทกุแห่ง ทงัส่วนกลาง ส่วนภมูภิาค โรงพยาบาล รวมทงัสถานบร ทีห้บร จวนิจฉัยมาลาเร ด้วยกลอ้งจุลทรรศน์ตลอดจนมหาว ลัยทมีกีารเร การสอนในเ นีพืห้เป สากลเหมือนกันทุกแห่ง โดยทุกขันตอนการปฏิบัติงานสามารถ ปรบัเปลีด้ก็ต่อเมืผา่นการพจิารณาและรบัรอง จากคณะกรรมการศูนยอ์ ้างอิงมาตรฐานการตรวจวนิจฉัย โรคมาลาเร ท่านัน เน คู่มือนีรบั ปรุงแก้ไขและแปลมาจาก คู่มือพ จวนิจฉัยมาลาเร ด้วย กลอ้งจุลทรรศน์ ทีขยีนโดยผเู้ชีญขององค์การนามยัโลก (Basic malaria microscopy, WHO; 2010) และแนวทางการประกันคุณภาพการตรวจวนิจฉัยมาลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์ (Malaria microscopy quality assurance manual, WHO; 2016) ตลอดจนอ้างอิงจากคู่มือการตรวจวนิจฉัยมาลาเร ด้วย กล้องจุลทรรศน์ทีมีอยู่ในประเทศไทย ทีขียนโดยผู้เชีญทางด้านการตรวจวนิจฉัยมาลาเร พืห้ เหมาะสมและสามารถนําไปปฏิบัติได้จร สําหรบั ใชใ้นประเทศไทย พรอ้มทังเพิมเน บคุม คุณภาพการตรวจวนิจฉัยมาลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์ทกี ําหนดเป บายต้องปฏิบัติตาม เพืสดงถึง ความยงัยืนเ จวนิจฉัยมาลาเร ทีค์การอนามยัโลกกําหนด ในการรบัรองการกําจัด โรคไขม้าลาเร คณะผจู้ัดทาํ ได้แบง่เน ป ส่วน เพืสะดวกสําหรบัผู้ใช้ส่วนทีบด้วยขันตอนการ ปฏิบัติงานมาตรฐานจาํนวน 6 เ กีกับการเตร วสดัุอุปกรณ์และเค มือสําหรบัการตรวจวนิจฉัย เช ลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์ส่วนทีบด้วยขันตอนการปฏิบัติงานมาตรฐานจาํ นวน 9 เร��อง เกีกับการเจาะเลือด เตร ล์มเลือด ยอ้มสีอ่านผล และรายงานผลการตรวจวนิจฉัยเช ลาเร ละ ส่วนทีบด้วยขันตอนการปฏิบตั ิงานมาตรฐานจาํนวน 2 เ กีกับความปลอดภัยและการจดัการ ของเสียจากการตรวจวนิจฉัยเช ลาเร ละส่วนทีบด้วยขันตอนการปฏิบัติงานจาํนวน 3 เ เกีกับระบบรายงานการตรวจสอบซา ล์มเลือดมาลาเร ละการทดสอบความชาํนาญ กองโรคติดต่อนําโดยแมลง กรมควบคุมโรค ได้รบัความอนเุคราะห์จาก คณาจารยจ์ากมหาว ลัย ผู้เชีญมาลาเร จากหน่วยงานทีกีข้องทังในและนอกกระทรวงสาธารณสุข และคณะทีร ษา คณะอนุกรรมการ และคณะทาํงานศูนย์อ้างอิงห้องปฏิบัติการการตรวจวนิจฉัยมาลาเร ดับประเทศ มีประสบการณ์การทาํงานสละเวลามารว่มประชุม เมืวันทีละรว่มกันเขยีนคู่มือ การตรวจวนิจฉัยมาลาเร ลาเร ด้วยกล้องจุลทรรศน์เล่มนี คณะผู้จัดทาํหนังสือเล่มนีวังเป ย่างยิงว่าหนังสือนีจะเป น์แก่ผู้เกีข้องกับงานตรวจ วนิจฉัยโรคมาลาเร ละผู้สนใจทวัไป

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 7 สารบััญ ส่่วนที่่� 1 การเตรี ียมวััสดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่ ่�องมืือ สำำหรับัการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วย กล้้องจุุลทรรศน์์ MM-SOP-01: การทำำความสะอาดและเก็็บรัักษากระจกสไลด์์ 9 MM-SOP-02: การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเข้้มข้้น 12 MM-SOP-03A: การเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 15 MM-SOP-03B: การเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 ด้้วยบััฟเฟอร์์ชนิิดเม็็ด 19 MM-SOP-03C: การควบคุุมคุุณภาพการย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ียด้้วยสีียิิมซ่่า 21 MM-SOP-04: การใช้้ การดููแลรัักษา และการซ่่อมบำรุำุงกล้้องจุุลทรรศน์์ 32 ส่่วนที่่� 2 การเจาะเลืือด เตรี ียมฟิิล์ม์เลืือด ย้้อมสีีอ่่านผล และรายงานผลการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย MM-SOP-05: การเขีียนฉลากฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย 41 MM-SOP-06A: การเจาะเก็็บเลืือดจากปลายนิ้้� วและการเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบาง 43 MM-SOP-06B: การเจาะเลืือดจากเส้้นเลืือดดำำและการเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบางจากเลืือด 48 ในหลอดที่่มี�ีสารกัันเลืือดแข็็ง MM-SOP-07: การเก็็บเลืือดใส่่กระดาษกรอง 53 MM-SOP-08: การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจางสำำหรับัใช้ย้้ ้อมฟิิล์์มเลืือด 56 MM-SOP-09: การย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ียด้้วยสีียิิมซ่่า 60 MM-SOP-10: การตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียในฟิิล์์มหนาและบาง 65 MM-SOP-11: การนัับจำำนวนเชื้้�อมาลาเรี ีย 71 MM-SOP-12: การบัันทึึกและรายงานผลการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ 76 ส่่วนที่่� 3 ความปลอดภััยและการจัดัการของเสีียจากการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย MM-SOP-13: ความปลอดภััยในการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ 80 MM-SOP-14: การจััดการขยะที่่�เกิิดจากการตรวจวินิิิจฉััยโรคไข้้มาลาเรี ีย 84 ส่่วนที่่� 4 การประกัันคุุณภาพการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ MM-SOP-15: ระบบรายงานและแบบรายงานที่่�เกี่่�ยวข้้อง 88 MM-SOP-16: การตรวจสอบซ้ำ ำฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย 102 MM-SOP-17: การทดสอบความชำำนาญด้้านการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย 109 ด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ บทส่่งท้้าย 115

8 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ส่่วนที่่� 1 การเตรี ียมวัสัดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่อ ่� งมืือ สำำหรัับการตรวจวินิิิจฉััยเชื้อ้�มาลาเรี ียด้้วยกล้อ้งจุุลทรรศน์์ ส่่วนที่่� 1 ประกอบด้้วยขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงานมาตรฐานจำำนวน 6 เรื่อ ่� ง ได้้แก่่ MM-SOP-01: การทำ�ความสะอาดและเก็บรักษากระจกสไลด์ MM-SOP-02: การเตร ียมสียิมซ่าเข้มข้น MM-SOP-03A: การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 MM-SOP-03B: การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ด้วยบัฟเฟอร์ชนิดเม็ด MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพการย้อมฟิล์มเลือดมาลาเร ียด้วยสียิมซ่า MM-SOP-04: การใช ก้ ารดูแลรักษา และการซ่อมบำ�รุงกล้องจุลทรรศน์

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 9 การทำำความสะอาดและเก็็บรัักษากระจกสไลด์์ MM-SOP-01 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�อกำำหนดรายละเอีียดขั้้นตอนการ�ทำำความสะอาด การห่่อ และการเก็็บรัักษากระจกสไลด์์ ที่่จ� ะใช้้เตรี ียม ฟิิล์์มเลืือดสำำหรับัการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ 2. หลัักการและเหตุุผล ความสะอาดของกระจกสไลด์์มีีความสำำคััญมากต่่อการเตรี ียมฟิิล์์มเลืือดที่่�มีีคุุณภาพ กระจกสไลด์์ที่่�มีี คราบมัันจะทำำ ให้้ฟิิล์์มเลืือดกระจายตััวไม่่สม่ำำเสมอและฟิิล์์มหนาอาจหลุุดออกขณะย้้อม กระจกสไลด์์ที่่�สกปรกทำำ ให้้ ฟิิล์์มเลืือดมีสิ่่ ี� งปนเปื้้�อนทำำ ให้้อ่่านฟิิล์์มเลืือดยาก กระจกสไลด์์ที่่�ใช้สำ้ ำหรับัการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียจะต้้องเป็็นชนิิด ที่่มี�คุีุณภาพดีี ขอบเรี ียบ มีีฝ้้าที่่�ปลายด้้านหนึ่่�งหรื ือมีบริี ิเวณสำำหรับัเขีียนรายละเอีียดฟิิล์์มเลืือด เช่่น ชื่่�อผู้้ป่่วย รหััสผู้้ป่่วย วัันที่่�เก็็บตััวอย่่างเลืือด สไลด์์คุุณภาพดีีจะต้้องใส ไม่่ขุ่่นมััว ไม่่มีีรอยขีีดข่่วน เรี ียบ ได้้ระนาบ ไม่่โค้้งงอ นอกจากนี้้�สไลด์์ ที่่�แกะออกจากล่่องใหม่่ ถึึงแม้้สไลด์์นั้้�นจะระบุุว่่า “ล้้างแล้้ว (washed)” หรื ือ “ทำำความสะอาดขั้้�นต้้นมาแล้้ว (pre-cleaned)” ก็็ต้้องนำำสไลด์์มาล้้างใหม่่ ทำำ ให้้แห้้ง และเก็็บในที่่�แห้้งให้้เรี ียบร้้อยก่่อนนำำมาเตรี ียมฟิิล์์มเลืือด 3. วัสัดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่อ ่� งมืือ · กระจกสไลด์คุณภาพดี ขนาดประมาณ 25x75 มิลลิเมตร ขอบเร ียบ มีขอบฝ้าทีป่ลายด้านหนึ่งเพอใช้เขียน ื่ หรื ือกระจกสไลด์์ใสธรรมดา สไลด์์ต้้องสะอาดปราศจากไขมัันหรื ือรอยขีีดข่่วน · ภาชนะสำหรับล้างสไลด์อย่างน้อย 2 อัน · น้ำยาล้างทำความสะอาดคุณภาพดี เช่น น้ำยาล้างจาน · ผ้าหร ือฟองน้ำสำหรับการล้างทำความสะอาด · ผ้าไร้ขน สะอาด เช่น ผ้าสำหรับเช็ดเคร ืองแก้ว่ · น้ำสะอาด · แผ่นกระดาษสำหรับห่อสไสด์ทีท่ำความสะอาดแล้ว ตัดขนาดประมาณ 11x15 เซนติเมตร · กล่องกระดาษสำหรับใส่ห่อสไลด์ที่ล้างแล้ว · เทปกาว · ยางรัดของ · ตู้เก็บของหร ือโถดูดความชน (desiccator) ที ื้ มี่สารดูดความชนชนิด activated silica gel (ไม่ใช้ ื้ สาร ดููดความชื้้�นชนิิดโคบอลต์์คลอไรด์์) 4. ข้อ้ควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · สวมถุงมือเพ ื่อป้องกันอุบัติเหตุจากกระจกสไลด์บาดขณะล้างทำความสะอาด · สไลด์แตกต้องทิงใน ้ถังขยะสำหรับทิงของมีคม้

10 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5. วิ ิธีการี 1. นำสไลด์ใหม่ออกจากกล่อง จบั แยกเป็นแผ่น ๆ แช่ในน้ำยาล้างทำ ความสะอาดคราบไขมัน 4 ชัวโมง หร ือแช่ข้ามค ่ืน 2. ถูทำ ความสะอาดสไลด์ทัง้สองด้านด้วยผ้าหร ือฟองน้ำ 3. เม ื่ อสไลด์สะอาดแล้ว ล้างด้วยน้ำสะอาดอย่างน้อย 2 ครัง เพ้ ื่ อล้างคราบน้ำยาล้างทำ ความ สะอาดออกให้หมด 4. เช็ดสไลด์ให้แห้งทีละแผ่นด้วยผ้าไร้ขน ถ้าพบว่าสไลด์มีรอยขูดขีด ให้แยกสไลด์นั้นออกเพ ื่ อ นำ ไปใช้งานอื่ น 5. ห่อสไลด์ด้วยกระดาษสะอาด ห่อละ 10 แผ่น ปิดหัวท้ายให้แน่นด้วยเทปกาว เก็บใส่กล่อง สไลด์เปล่า รัดด้วยยางรัดเพื่อกันสไลด์ตกแตก 6. ถ้ายังไม่ได้ใช้สไลด์ทันที ให้ใส่สารดูดความชน (silica gel) ื้ ลงไปในกล่องสไลด์ด้วย 7. ติดฉลากบนกล่อง ระบุวันที เ่ลขทีก่ล่องสไลด์ จำนวนสไลด์ในกล่อง อักษรตัวแรกของชอผู้ ื่ ล้าง สไลด์ และจดบันทึกลงในสมุดบันทึกการควบคุมคุณภาพ (QC logbook) 8. เก็บกล่องสไลด์ไว้ในตู้เก็บอุปกรณ์หร ือในตู้ป้องกันความชน เพ ื้ ื่อให้แน่ใจว่าสไลด์จะไม่ชนเม ื้ ื่ อ นำ มาใช้งาน การเก็บสไลด์ไว้ในห้องทีมีความช่น ื้ สูง สไลด์จะเกาะติดกันภายใน 2-3 สัปดาห์ ซงึ่ จะต้องนำ มาล้างทำ ความสะอาดและทำ ให้แห้งใหม่ก่อนนำ มาใช้ 6. ข้อ้ควรระวัังที่่�เกี่่�ยวข้อ้งกัับขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงาน · ไม่ควรนำสไลด์เก่าทีใช้แ ่ล้วมาใช้ซ้ำ · ไม่นำสไลด์ทีมีรอยขีดข่วนมาใช้ ่ · ควรเลือกใช้สไลด์ที่ล้างทำความสะอาดแล้วมาใช้ตามลำดับก่อนหลัง · ในที่ชนแ ื้ ละอบอุ่น เชอรา ื้ จะเจร ิญได้ดีบนสไลด์ เลนส์และปร ิซึมของกล้องจุลทรรศน์ ทำให้ไม่สามารถ อ่่านผลฟิิล์์มเลืือด หรื ืออ่่านได้้ยาก การป้้องกัันเชื้้�อราทำำ ได้้โดยการเก็็บรัักษาสไลด์์ และกล้้องจุุลทรรศน์์ ในที่่�แห้้ง 7. การควบคุุมคุุณภาพ - ใช้้ปากกาเขีียนบนกล่่องใส่่กระจกสไลด์์ และบัันทึึกในสมุุดบัันทึึกการควบคุุมคุุณภาพทุุกครั้้ง เ�พื่่�อใช้้ตรวจสอบ หน้้ากล่่องเก็็บสไลด์์ให้้เขีียนข้้อมููลดัังนี้้� สไลด์ทำความสะอาดแล้ว วัน/เดือน/ปี จำ�นวน ............แผ่น ชือ- ่นามสกุล.....(ผู้ทำ�ความสะอาด) รููปที่่� 1: การเขีียนฉลากบนกล่่องบรรจุุสไลด์์ที่ ่� ล้้างแล้้ว

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 11 · สมุดบันทึกการควบคุมคุณภาพ มีข้อมูลทีต้อง่บันทึกอย่างน้อยดังนี้ วันทีล่้างสไลด์ วัน / เดือน / ปี จำนวน กล่อง จำนวนสไลด์ต่อ 1 กล่อง ชอตัว ื่ บรรจง และลายเซ็น ผู้ทำ ความสะอาดสไลด์ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิิบัติั ิงานที่่�เกี่่�ยวข้อ้ง · MM-SOP-06A: การเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้ วและการเตร ียมฟิล์มหนาและบาง · MM-SOP-06B: การเจาะเลือดจากเส้นเลือดดำและการเตร ียมฟิล์มหนาและบางจากเลือดในหลอดที่ มีีสารกัันเลืือดแข็็ง 9. เอกสารอ้้างอิิง World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press.

12 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การเตร สียมิซา่เข้มขน้ (Giemsa stock solution) MM-SOP-02 1. วัตถุประสงค์ เพืกําหนดรายละเอียดวธกีารเตร สียมิซา่เข้มขน้ (Giemsa stock solution) สําหรบัการยอ้มส ลม์หนา และบาง ในการตรวจวนิจฉัยเช ลาเร 2. หลกัการและเหตุผล สียมิซา่ (Giemsa) เป สีทีสมมากทีย ล์มเลือดเพืจวนิจฉัยเช ลาเร นืจาก จะเห็นการติดสีรูปรา่งลักษณะของเช ลาเร ละเม็ดเลือดได้ดีกว่าสีย ล์มเลือดชนิดอืมีขันตอนการย้อมสี ทงีา่ย สะดวก และรวดเรว็ ปจจุบันมีสียมิซา่เข้มขน้แบบสําเรจร็ูปพรอ้มใช้แต่คุณภาพแตกต่างกันไปตามบรษัทผู้ผลิต ศูนย์อ้างอิงทางห้องปฏิบัติการโรคติดต่อนําโดยแมลง ได้กําหนดคุณสมบัติของสียิมซ่าสําเรจ็รูปทีด้มาตรฐาน (ตามค่มูอกาืรจัดซ วสัดุว สตรส์ ําหรบัการตรวจวนิจฉัยเช ลาเร พืห้การยอ้มส ลม์มาลาเร ด้มาตรฐาน ระดับเดียวกันทัวประเทศ หร ณีทีต้องการควบคุมคุณภาพของสีห้องปฏิบัติการทีจาํเป ต้องเตร สียิมซา่ เข้มขน้เองก็สามารถเตร ด้ตามมาตรฐานขนัตอนการปฏิบัติงานนี 3. วสัดุอุปกรณ์ และเครองมือ ในการเตร สียมิซา่ ปร มิลลิลิตร วสดัุอุปกรณ์ และเค มือทีชป้ระกอบด้วย · ผงสียมิซา่ 3.8 กรมั (เลือกชนิดทมี ีคุณภาพดีและได้มาตรฐาน) · เมทานอลบ สุทธ เกรดิสําหรบัจากอะซ ลลิลิตร · กลีเซอรอลบ สุทธ เกรดิสําหรบัลลิลิตร · องกวนสารละลาย (magnetic stirrer) และแทง่แม่เหล็กกวนสาร · ชอ้นตักสาร · กระดาษชงัส ถ้วยชงัสาร · กระบอกตวง · กรวยพลาส · ขวดแก้วสีชาพรอ้มฝ บ ฝาเกลียว ความจุ 500 มิลลิลิตร (สะอาดและแห้ง) ถ้าไม่มีขวด สีชา ใชข้วดแก้วธรรมดา แล้วห่อด้วยกระดาษสีเขม้เพืกันแสง · องชงัสําหรบัสองตําแหน่ง · กระดาษกรองสาร (เชน่ Whatman No.1) ขนาดเส้นผ่าศูนยก์ลาง 11 เซนติเมตร 4. ขอ้ควรระวงัเพือความปลอดภัย · เมทานอลและสียมิซ่าสามารถติดไฟแล ษสูง เมอส ลีกเลียงการสัมผัส และการสูดดม เมืม่ได้ใชค้วรเก็บในตู้ทปีทลีอ็คได้ · ปฏิบัติตามข้อกําหนดการควบคุมการแพรก่ระจายเชอตามหลักสากล ประกอบด้วย การสวมใส่อุปกรณ์ ป กันอันตรายส่วนบุคคล เชน่ถุงมือ แวน่ตานิรภัย และเส น์ในการปฏิบัติงานทกุครง ั

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 13 5. วิ ิธีการ ี 1. ใส่แท่งแม่เหล็กกวนสาร ลงในขวดสีชา 2. ชังผงยิม่ซ่า 3.8 กรัม เทผงสียิมซ่าผ่านกรวยลงในขวดสีชาทีได้ใ ่ส่แท่งแม่เหล็กกวนสารไว้แล้ว 3. ค่อย ๆ เติมเมทานอล 100 มิลลิลิตร ลงในขวด เทเมทานอลให้ชะล้างผงสีทีติดอยู่ข้างขวด่ลง ไปให้หมด 4. ปิดฝาขวดให้แน่น เปิดเคร ืองกวน่สารละลาย (magnetic stirrer) เพื่ อละลายผงสีให้เข้ากัน ใช้เวลาประมาณ 2-3 นาที 5. เติมกลีเซอรอลทีละน้อยลงไปในขวดทีวาง่บนเคร ืองกวน่สาร จนครบปร ิมาตร 250 มิลลิลิตร ให้เคร ืองกวน่สารละลายต่อเนื่อง ใช้เวลาอีกประมาณ 3-5 นาที 6. เติมเมทานอลทีเห่ลืออีก 150 มิลลิลิตร ลงไปในขวด ให้เมทานอลชะล้างกลีเซอรอลทีติดค้าง่ อยู่ทีกรวย่ลงไปในขวดให้หมด 7. ปิดฝาขวดให้แน่น 8. บ่มสีโดยเปิดเคร ืองกวน่สารละลาย อย่างน้อย 6 ครังต่อวัน ครั้ง้ละ 2-3 นาที เป็นเวลา อย่างน้อย 7 วัน 9. กรองสีทีเตร ียมแ่ล้วด้วยกระดาษกรองลงในขวดสีชา ปิดฝาขวดให้แน่น 10. ติดฉลากที่ขวด ระบุชอ ื่ สารเคมี เลขที่ชุดสีที่เตร ียม (batch number) ชอผู้เตร ียม วันที ื่ ่ เตร ียม และวันทีหมดอายุ ่จดบันทึกลงในสมุดบันทึกการปฏิบัติงานควบคุมคุณภาพ (quality control logbook) 11. ปิดขวดให้แน่นเพื่อป้องกันความชน ื้ จากอากาศ เก็บในทีเย็น ไม่ให้ ่ถูกแสงแดดโดยตรง ตััวอย่่างวิ ิธีเีขีียนฉลาก 6. ข้อ้ควรระวัังที่่�เกี่่�ยวข้อ้งกัับขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงาน · ควรปิดฝาขวดสียิมซ่าให้แน่น เพื่อป้องกันการดูดซับความช ื้ น และการเกิดปฏิกิร ิยากับอากาศ (Oxidation) การเก็็บสีียิิมซ่่าในขวดที่่ทึ�บปิึ ิดสนิิท จะคงสภาพได้้นาน · แบ่งกรองสียิมซ่าที่นำมาใช้งานในแต่ละวัน ใส่ขวดแบ่งสีชามีฝาปิดมิดชิด ปร ิมาตรประมาณ 25-50 มิิลลิิลิิตร เก็็บในที่่�เย็็น แห้้ง อยู่่ในที่่ร่�่ม ห่่างจากแสงแดดส่่องตรง เพื่่�อป้้องกัันการปนเปื้้�อนสีียิิมซ่่าเข้้มข้้น ในขวดใหญ่่ · ห้ามไม่ให้สียิมซ่าเข้มข้นปนเปื้อนน้ำแม้เพียงเล็กน้อยก็ตาม เพราะน้ำจะทำให้สีเสื่อมสภาพ · ห้ามใช้ปิเปตทีเปียกหร ือปนเปื่ ้อนดูดสียิมซ่าเข้มข้น สียิมซ่าเข้มข้น (Giemsa stock solution) Batch number…………………………………. เตร ียมโดย : ชือ- ่นามสกุล วันท ี่ เตร ียม : ว/ด/ป

14 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ · ห้ามเขย่าขวดสียิมซ่าก่อนนำมาใช้งานอย่างน้อย 24 ชัวโมง เพ ่ ื่อป้องกันตะกอนสีลอยขึนปนกั้บสีเมื่ อนำ ไปย้้อม ถ้้ามีีตะกอนสีีติิดบนฟิิล์์มเลืือดที่่ย้�้อม ทำำ ให้้การตรวจวินิิิจฉััยยากขึ้้�น · สีทีผ่สมแล้วให้ใช้ให้หมด ไม่สามารถเก็บไว้ใช้ได้ ห้ามเทคืนขวดสีเข้มข้น ถ้าเหลือให้เททิง ดังนั้ ้นควรผสม สีีเพีียงพอกัับการใช้้งานเท่่านั้้�น 7. การควบคุุมคุุณภาพ 7.1 ตรวจสอบคุุณภาพของสีียิิมซ่่า · สียิมซ่าเข้มข้นทุกชุดทีเตร ียมหร ือ่จัดซื้อมาใหม่ · สียิมซ่าเจือจางทีเตร ียมไว้นานไม่ได้ใช้งาน ก่อนน ่ำมาใช้ย้อมสี · สียิมซ่าที่จะจัดส่งให้ห้องปฏิบัติการต่าง ๆ · สียิมซ่าทีได้รั ่บมาจากส่วนกลาง 7.2 บัันทึึกข้้อมููลการควบคุุมคุุณภาพในสมุุดบัันทึึกการควบคุุมคุุณภาพ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิิบัติั ิงานที่่�เกี่่�ยวข้อ้ง · MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเข้มข้นและสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · MM-SOP-08: การเตร ียมสียิมซ่าเจือจางสำหรับใช้ย้อมฟิล์มเลือด · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชอมา ื้ ลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้้างอิิง Centers for Disease Control and Prevention. (2013). Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria parasites. Retrieved December 14, 2015, from http://www.cdc.gov/dpdx/resources/ pdf/benchAids/ malaria/malaria_staining_benchaid.pdf. Storey J. (2012). Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. (unpublished). World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. กลุุ่มมาตรฐานการตรวจวินิิิจฉััย สำำนัักโรคติิดต่่อนำำ โดยแมลง. คู่่มืือคุุณลัักษณะและมาตรฐานวััสดุุวิ ิทยาศาสตร์์การ แพทย์์; 2550.

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 15 การเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 MM-SOP-03A 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิบิายขั้้นตอนการเต�รี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 สำำหรับัใช้้เจืือจางสีียิิมซ่่าเข้้มข้้น เพื่่�อใช้้ ย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย 2. หลัักการและเหตุุผล การย้้อมสีียิิมซ่่าที่่ถู�ูกต้้องจะทำำ ให้้มองเห็็นเชื้้�อมาลาเรี ียได้้ชััดเจนภายใต้้กล้้องจุุลทรรศน์์ การเตรี ียมสีียิิมซ่่า เจืือจางเพื่่�อใช้ย้้ ้อมจะต้้องใช้ส้ารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์ที่่ ์มี�ีค่่า pH ถููกต้้อง (pH 7.2) ซึ่่�งจะมีีผลอย่่างมากต่่อคุุณภาพ การติิดสีีของเชื้้�อมาลาเรี ีย ขั้้นตอนการปฏิิ�บััติิงานมาตรฐานนี้้�ประกอบด้้วย 3 ส่่วน คืือ · การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 · การเตร ียมสารละลายเพ ื่อใช้ปรับค่า pH (2% correcting fluid) · การตรวจสอบและการปรับ pH ของสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH เป็็นค่่าที่่�แสดงความเป็็นกรดหรื ือด่่างของสารเคมีีที่่�อยู่่ในน้ำ ำ มีีค่่าอยู่่ระหว่่าง 0 (เป็็นกรดมาก) ถึึง 14 (เป็็นด่่างมาก) ของเหลวที่่�เป็็นกลางจะมีีค่่า pH เท่่ากัับ 7 การวััดค่่า pH สามารถใช้้เครื่่�องวััดที่่�เรี ียกว่่า pH meter หรื ือ ใช้้เครื่่�องมืือวััดค่่าสีี เช่่น Lovibond comparator หรื ือใช้้กระดาษเทีียบสีี การปรับัความเป็็นกรดและด่่างของน้ำ ำ จะใช้ส้ารเคมีีที่่�เป็็นเกลืือบางชนิิดที่่�เรี ียกว่่าเกลืือบััฟเฟอร์์ ปััจจุุบัันมีี บััฟเฟอร์สำ์ ำเร็จรู็ ูปชนิิดเม็็ดจำำหน่่าย สามารถนำำมาละลายน้ำ ำ แล้้วได้้สารละลายที่่มี�ีค่่า pH ตามที่่กำ�ำหนด 3. วัสัดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่อ ่� งมืือ 3.1 การเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 · เคร ืองชั่ง่สำหรับงานวิเคราะห์ ทศนิยมสองตำแหน่ง · กระดาษกรอง ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 11 เซนติเมตร · ขวดปร ิมาตรแก้วรูปทรงกรวย ขนาดความจุ 1 ลิตร · บีกเกอร์แก้ว ขนาดความจุ 250 มิลลิลิตร · ช้อนตักสารสำหรับชัง่ · น้ำกลั่นหร ือน้ำปราศจากไอออน ปร ิมาตร 1 ลิตร · โพแทสเซียม ไดไฮโดรเจน ฟอสเฟต (KH2 PO4 ) ชนิดแอนไฮดรัส (anhydrous) · ไดโซเดียม ไฮโดรเจน ฟอสเฟต (Na2 HPO4) ชนิดแอนไฮดรัส (anhydrous) · ขวดที่สะอาดและแห้งมีฝาปิด ควรเป็นชนิดฝาเกลียว ความจุ 1 ลิตร หร ือ 500 มิลลิลิตร · แท่งแก้วคนสาร · เคร ืองวัด pH ่ · ฉลากสำหรับติดข้างขวด 3.2 การเตรี ียมสารละลายสำำหรับั ปรับค่ั ่า pH (2% correcting fluid) · เคร ืองชั่ง่สำหรับงานวิเคราะห์ ทศนิยมสองตำแหน่ง · กระดาษกรอง ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 11 เซนติเมตร · ขวดแก้วพร้อมจุก ขนาด 100 หร ือ 150 มิลลิลิตร จำนวน 2 ขวด · โพแทสเซียม ไดไฮโดรเจน ฟอสเฟต (KH2 PO4 ) ชนิดแอนไฮดรัส (anhydrous) · ไดโซเดียม ไฮโดรเจน ฟอสเฟต (Na2 HPO4) ชนิดแอนไฮดรัส (anhydrous) · น้ำกลั่นหร ือน้ำปราศจากไอออน ปร ิมาตร 200 มิลลิลิตร

16 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ · ช้อนตักสารสำหรับชัง่ · บีกเกอร์ขนาดความจุ 250 มิลลิลิตร จำนวน 2 ใบ · กระบอกตวงขนาด 100 มิลลิลิตร จำนวน 1 ใบ · ฉลากสำหรับติดข้างขวด 3.3 การวััดและการปรับค่ั ่า pH ของสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ · สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · สารละลายสำหรับปรับค่า pH · เคร ืองวัดค่า pH (ชนิดพกพา) หร ือกระดา่ษวัดค่า pH 4. ข้อ้ควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · ปฏิบัติตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชอตามห ื้ ลักสากล ประกอบด้วย การสวมใส่อุปกรณ์ ป้้องกัันอัันตรายส่่วนบุุคคล เช่่น ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย และเสื้้�อกาวน์์ในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้้ง � 5. วิ ิธีการ ี 5.1 การเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 1. ชัง่สาร potassium dihydrogen phosphate (KH2 PO4, anhydrous) 0.7 กรัม เทลงใน บีกเกอร์แก้ว 2. เติมน้ำกลั่น 150 มิลลิลิตร คนให้ละลายเข้ากันด้วยแท่งแก้วคนสารที่สะอาด 3. ชัง่สาร disodium hydrogen phosphate (Na2 HPO4, anhydrous) 1 กรัม เทลงใน บีกเกอร์ทีได้เตร ียม ่สารละลาย KH2 PO4 ไว้แล้ว คนให้สารละลายเข้ากัน 4. เทสารละลายลงในขวดรูปกรวย เติมน้ำจนครบ 1 ลิตร คนให้สารละลายเข้ากันดี 5. เทสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ทีได้ ่ลงในขวดขนาด 1 ลิตร ติดฉลากกำ กับข้างขวด ระบุชอ ื่ สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ วันทีเตร ียม วันที่หมดอายุ ช่อผู้เตร ียม แ ื่ ละจดบันทึกลงใน สมุดบันทึกการควบคุมคุณภาพ 6. เก็บสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ในขวดสีชา ปิดจุกแน่น และเก็บในทีเย็น ห่าง่จาก แสงแดด สารละลายนี้เก็บได้นานที่สุด 7 วัน 5.2 การเตรี ียมสารละลายสำำ�หรัับปรัับค่่า pH (2% correcting fluid) 5.2.1 การเตรี ียมสารละลาย ไดโซเดีียมไฮโดรเจนฟอสเฟส 2% Na2 HPO4 1. ชัง่สาร Na2 HPO4 2 กรัม เทลงในบีกเกอร์แก้วที่สะอาด 2. เติมน้ำสะอาด 100 มิลลิลิตร คนด้วยแท่งแก้วคนสารจนละลายหมด 3. เทสารละลายทีเตร ียมได้ ่ลงในขวดแก้วขนาด 100-150 มิลลิลิตร ติดฉลากทีข้างขวด ระ่บุชอ ื่ สารละลาย วันทีเตร ียม แ่ละชอผู้เตร ียม ื่ 4. เก็บสารละลาย 2% Na2 HPO4 ในทีเย็น ห่าง่จากแสงแดด

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจ นิจฉัยเชือมาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 17 5.2.2 การเตร สารละลาย โมโนโพแทสเซยีม ฟอสเฟส 2% KH2 PO4 1. ชังสาร KH2 PO4 2 กรมัเทลงในบกีเกอรแ์ก้วทีะอาด 2. เติมน ะอาด 100 มิลลิลิตร คนด้วยแทง่แก้วคนสารจนละลายหมด 3. เทสารละลายที ลงในขวดแก้วขนาด 100-150 มิลลิลิตร ติดฉลากทีขา้งขวด ระบุชอ สารละลาย วนัทีละช 4. เก็บขวดสารละลาย 2% KH2 PO4 ในทีเยน็ห่างจากแสงแดด 5.3 การตรวจสอบและปรบคั ่า pH ของสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ จะต้องตรวจสอบค่า pH ของสารละลายบัฟเฟอรก์ ่อนใชง้าน การปรบคั ่า pH ทาํ โดย ถ้าสารละลายบัฟเฟอร์ มีค่า pH ตากวา่ 7.2 (เป ห้เติมสารละลาย 2% Na2 HPO4 หร ติมสารละลาย 2% KH2 PO4 ถ้า pH สูงกวา่ 7.2 (เป ด่าง) วธวีดัและปรบคั ่า pH ของบัฟเฟอร์โดยใชเ้ค มีดังนี 5.3.1 การใชเ้ค วดัpH แบบพกพา • การวดัค่าและการปรับค่า pH ของสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 1. ล้างอิเล็กโทรด (electrode) ด้วยน กลัน ซบั ให้แห้งด้วยกระดาษทชิชู 2. ใช้บกีเกอรข์นาด 100 มิลลิลิตรที ะอาดและแห้ง ใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอรท์ตี ้องการวดัค่า pH ลลิลิตร 3. จุม่อิเล็กโทรดลงในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรท์ ีต้องการวัด ให้ส่วนปลายของอิเล็กโทรด จมอยูใ่นสารละลาย ระวงัอยา่ ให้อิเล็กโทรดจมลึกเกินไป 4. รอจนกระทังตัวเลขทีปรากฏบนหน้าจ องวดัคงที อ่านค่า pH หากค่า pH ที�วัดได้ ต�ากว่า 7.2 (เป�นกรด) ให้ปรับค่า pH โดยการเติมสารละลาย 2% Na2 HPO4 หากค่า pH ที�วัดได้ส บค่า pH โดยการเติมสารละลาย 2% KH2PO4 ปรับ จนกระทังได้ �สารละลายบัฟเฟอรท์ มีค่า pH 7.2 ี 5. อง ล้างหัวอิเ ล็กโทรดด้วยน กลัน ซับให้แห้งด้วยกระดา ษ ฝาครอบหัว อิเล็กโทรด • การสอบเทยีบ องวดัpH แบบ two-point calibration ส่วนมากจะสอบเทียบโดยใช้standard solution pH 4.0 และ pH 7.0 ถ้าสารละลายทีต้องการ วัดค่า pH มีค่า pH มากกวา่ 8 การสอบเทียบจะใช้standard solution pH 8.0 และ pH 10.0 การสอบเทียบ เค วดัpH ให้ทาํตามคําแนะนําในคู่มือของเค วดัpH แต่ละชนิดทีมีในห้องปฏิบัติการแต่ละแห่ง

18 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 6. ข้อ้ควรระวัังที่่�เกี่่�ยวข้อ้งกัับขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงาน · เคร ืองวัดค่า pH มีห่ลายชนิด ผู้ใช้งานควรเร ียนรู้วิธีใช้เคร ืองม่ือทีมีอยู่ในห้องป ่ฏิบัติการของตนเอง · บัฟเฟอร์ทีเตร ียมไว้ใช้งาน ควรเก็ ่บไว้ในทีเย็นแ่ละห่างจากแสงแดดส่องโดยตรง โดยปิดฝาขวดให้แน่น ใส่่ขวดทึึบแสง หรื ือขวดแก้้วที่่�ห่่อด้้วยกระดาษสีีน้ำ ำ ตาล เพื่่�อป้้องกัันการเจริญิของแบคทีีเรี ียและ เชื้้�อรา · ตรวจสอบการปนเปื้อนอยู่เสมอ · ไม่ควรเก็บบัฟเฟอร์ที่เตร ียมไว้ใช้งานนานเกิน 7 วัน เพื่ อหลีกเลี่ยงการเปลี่ยนแปลงค่า pH และการ ปนเปื้้�อน · ตรวจสอบค่า pH ของบัฟเฟอร์เป็นประจำก่อนใช้งาน และบันทึกลงในสมุดบันทึกการควบคุมคุณภาพ 7. การควบคุุมคุุณภาพ · ตรวจสอบคุณภาพทุกครังที้ ่เตร ียมบัฟเฟอร์ใหม่และก่อนการใช้งานทุกครัง แ้ล้วบันทึกข้อมูลลงในสมุด บัันทึึกการควบคุุมคุุณภาพ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิิบัติั ิงานที่่�เกี่่�ยวข้อ้ง · MM-SOP-03B: การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ด้วยบัฟเฟอร์ชนิดเม็ด · MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเข้มข้นและสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชอมา ื้ ลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้้างอิิง World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press.

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 19 การเตรี ียมสารละลายบััฟเฟอร์์ pH 7.2 ด้้วยบััฟเฟอร์ชนิ์ ิดเม็ ็ ด MM-SOP-03B 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิบิายขั้้นตอนการเต�รี ียมสารละลายฟอสเฟสบัฟัเฟอร์์ pH 7.2 จากบัฟัเฟอร์์ชนิิดเม็็ด สำำหรับัใช้้เจืือจาง สีียิิมซ่่าเข้้มข้้น เพื่่�อใช้ย้้ ้อมสีีฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย 2. หลัักการและเหตุุผล การย้้อมสีียิิมซ่่าที่่ถู�ูกต้้องจะทำำ ให้้มองเห็็นเชื้้�อมาลาเรี ียได้้ชััดเจนภายใต้้กล้้องจุุลทรรศน์์ สารละลายฟอสเฟต บััฟเฟอร์์ pH 7.2 ที่่�ใช้้เจืือจางสีีย้้อมมีีผลอย่่างมากต่่อการย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือด pH เป็็นค่่าที่่�แสดงความเป็็นกรดหรื ือด่่าง ของสารเคมีีที่่�อยู่่ในน้ำ ำ มีีค่่าอยู่่ระหว่่าง 0 (เป็็นกรดมาก) ถึึง 14 (เป็็นด่่างมาก) ของเหลวที่่�เป็็นกลางจะมีี pH เท่่ากัับ 7 ใน SOP นี้้�จะอธิบิายการเตรี ียมสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์จ์ากบััฟเฟอร์สำ์ ำเร็จรู็ ูปชนิิดเม็็ด สามารถนำำมาละลายน้ำ ำ ปริ ิมาณตามที่่�ระบุุ เช่่น 1 ลิิตร โดยไม่่ต้้องชั่่ง�สารให้้ยุ่่งยากเหมาะสำำหรับัใช้้ในห้้องปฏิิบััติิการที่่�ไม่่มีีเครื่่�องมืือวััดค่่า pH 3. วัสัดุุ อุุปกรณ์์และเครื่อ ่� งมืือ · ฟอสเฟตบัฟเฟอร์เม็ด pH 7.2 สำหรับน้ำ 1 ลิตร · น้ำกลั่นหร ือน้ำปราศจากไอออน ปร ิมาตร 1 ลิตร · กระบอกตวงขนาดความจุ 1 ลิตร · ขวดปร ิมาตรทรงกรวยหร ือบีกเกอร์ ขนาดความจุ 1 ลิตร · ขวดแก้วมีฝาปิดที่สะอาดและแห้ง ควรใช้ชนิดฝาเกลียว ขนาดความจุ 1,000 หร ือ 500 มิลลิลิตร · คีมคีบ · เคร ือง pH meter หร ือกระดา่ษวัดค่า pH 4. ข้อ้ควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · ปฏิบัติตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชอตามห ื้ ลักสากล ประกอบด้วยการสวมใส่อุปกรณ์ ป้้องกัันอัันตรายส่่วนบุุคคล เช่่น ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย และเสื้้�อกาวน์์ ในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้้ง � 5. วิ ิธีการี 1. ตวงน้ำกลั่นหร ือน้ำปราศจากไอออน ปร ิมาตร 1 ลิตร ใส่ในขวดแก้ว 2. ใช้คีมคีบจบั เม็ดฟอสเฟตบัฟเฟอร์ใส่ขวด ระวังอย่าให้มือสัมผัสกับเม็ดบัฟเฟอร์ ปิดฝาขวดให้ แน่น 3. เขย่าเบา ๆ จนเม็ดบัฟเฟอร์ละลายหมด 4. วัดความเป็นกรด-ด่าง ด้วยกระดาษวัดค่า pH หร ือ เคร ือง pH meter ( ่ถ้ามี) 5. ติดฉลากข้างขวดฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ระบุชอ ื่ สาร: บัฟเฟอร์ pH 7.2 วันทีเตร ียม วันที่หมดอายุ ่ ชอผู้เตร ียม แ ื่ ละบันทึกในสมุดหร ือแบบฟอร์มการควบคุมคุณภาพ ตััวอย่่างฉลาก: บััฟเฟอร์์ pH 7.2 วัันที่่�เตรี ียม 17 สิิงหาคม 2015 วัันหมดอายุุ 24 สิิงหาคม 2015 ผู้้เตรี ียม .....................................

20 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 6. ข้อ้ควรระวัังที่่�เกี่่�ยวข้อ้งกัับขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงาน · บฟัเฟอร์ชนิดเม็ด (pH 7.2) ต้องเก็บในภาชนะทีอากาศเข้าไม่ได้ ห่าง ่จากแสงแดดและความชน ื้ บฟัเฟอร์ ชนิิดเม็็ดที่่ถู�ูกความชื้้�นจะไม่่สามารถนำำ มาใช้้ได้้ ดัังนั้้�น ในภาชนะที่่บ�รรจุุบัฟัเฟอร์์ชนิิดเม็็ดจะต้้องมีีสารดููด ความชื้้�นหรื ือซิิลิิก้้าเจลบรรจุุอยู่่ด้้วย แต่่ไม่่ใช้ซิ้ ิลิิก้้าเจลชนิิดที่่มี� ีโคบอลต์์ คลอไรด์์ · ควรตรวจวันหมดอายุของบัฟเฟอร์ชนิดเม็ด ก่อนนำมาใช้งาน · เม ื่อเตร ียมสารละลายบฟัเฟอร์แล้ว ให้เก็บในทีเย็น ห่าง่จากแสงแดด โดยเก็บสารละลายบฟัเฟอร์ในขวด ทึบึแสง ถ้้าเป็็นขวดแก้้วใส่่ ให้้ห่่อด้้วยกระดาษสีีน้ำ ำ ตาล เพื่่�อป้้องกัันการเจริญิของแบคทีีเรี ียและเชื้้�อรา และต้้องใช้ภ้ ายใน 7 วััน ถ้้าเหลืือให้้เททิ้้ง �ห้้ามใช้้ · หมั่นตรวจสอบการปนเปื้อนของสารละลายบัฟเฟอร์ · ปฏิบัติตามคำแนะนำของบร ิษัทผู้ผลิตเร ืองการใช้แ ่ละการเก็บรักษา · ตรวจสอบค่า pH ของสารละลายบัฟเฟอร์ก่อนใช้ทุกครัง แ้ละจดบันทึกค่าในสมุดบันทึกการควบคุม คุุณภาพ 7. การควบคุุมคุุณภาพ · ดำเนินการตรวจสอบคุณภาพทุกครังที้เตร ียม่สารละลายบัฟเฟอร์ใหม่ และก่อนการใช้งาน ทุกครัง แ้ละ บัันทึึกผลการควบคุุมคุุณภาพ ลงในสมุุดบัันทึึกการควบคุุมคุุณภาพ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิิบัติั ิงานที่่�เกี่่�ยวข้อ้ง · MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเข้มข้นและสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชอมา ื้ ลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้้างอิิง World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press.

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 21 การควบคุุมคุุณภาพการย้อ้มฟิล์ิ ์มเลือดืมาลาเรี ียด้้วยสีียิิมซ่่า MM-SOP-03C 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิบิายขั้้�นตอนการประเมิินผลการควบคุุมคุุณภาพของสีียิิมซ่่าเข้้มข้้นและสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 สำำหรับัใช้ย้้ ้อมสีีฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย (วิธีิีการในมาตรฐานการปฏิิบััติิงานนี้้�ใช้้ได้้ทั้้ง�กัับสีียิิมซ่่าเข้้มข้้นที่่�เตรี ียมขึ้้�น ใช้้เองและที่่จำ�ำหน่่ายเป็็นชุุดสำำเร็จรู็ ูป) 2. หลัักการและเหตุุผล การควบคุุมคุุณภาพของสีียิิมซ่่าและสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 เป็็นส่่วนหนึ่่�งของการควบคุุม คุุณภาพภายในของการตรวจวินิิ ิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ เพื่่�อให้้ผลการตรวจวินิิ ิจฉััยโรคไข้้มาลาเรี ีย ถููกต้้อง ฟิิล์์มเลืือดที่่�ใช้้ตรวจต้้องย้้อมด้้วยสียิี ิมซ่่าที่่�เตรี ียมอย่่างถููกต้้อง มีีการทดสอบก่่อนใช้้ และมีีการตรวจสอบคุุณภาพ การตรวจสอบคุุณภาพการย้้อมสีีควรตรวจสอบจากเชื้้�อมาลาเรี ียในฟิิล์์มบาง เชื้้�อมาลาเรี ียที่่�ใช้้ทดสอบควร เป็็นชนิิด Plasmodium vivax เพื่่�อใช้้ตรวจสอบการติิดสีีของ Schüffner’s dot ควรตรวจสอบการติิดสีีของ เม็็ดเลืือดแดงและเม็็ดเลืือดขาวด้้วย และตรวจสอบทั้้งการ�ย้้อมด้้วยสีียิิมซ่่าทั้้งแ�บบที่่�ผสม 3% และ 10% เพื่่�อปรับัเวลา ที่่จ� ะใช้ย้้ ้อมสีีให้้เหมาะสม 3. วัสัดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่อ ่� งมืือ · สียิมซ่า ทีต้องการตรว่จสอบคุณภาพ · ฟอสเฟตบัพเฟอร์ ทีต้องการตรว่จสอบคุณภาพ · สารดูดความชน ื้ · กล่องพลาสติก หร ือถุงซิปล็อค · กระจกสไลด์คุณภาพดี ขนาดประมาณ 25x75 มิลลิเมตร ขอบเร ียบ มีขอบฝ้าทีป่ลายด้านหนึ่งเพอใช้เขียน ื่ หรื ือกระจกสไลด์์ใสธรรมดา สไลด์์ต้้องสะอาดปราศจากไขมััน หรื ือรอยขีีดข่่วน · กล่องกระดาษแข็งสำหรับใส่สไลด์ · ตู้เย็น -20 องศาเซลเซียส หร ือ -70 องศาเซลเซียส 4. ข้อ้ควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · เมทานอลและสียิมซ่าสามารถติดไฟและมีความเป็นพิษสูงเม ื่ อสูดดมหร ือกินเข้าไป หลีกเลี่ยงการสัมผัส และการสููดดม เมื่่�อไม่่ได้้ใช้้ ควรเก็็บในตู้้ที่่ส�ามารถล็็อคได้้ · ปฏิบัติตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชอตามห ื้ ลักสากล ประกอบด้วย การสวมใส่อุปกรณ์ ป้้องกัันอัันตรายส่่วนบุุคคล เช่่น ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย และเสื้้�อกาวน์์ ในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้้ง � 5. วิ ิธีการ ี สีียิิมซ่่าและสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 ที่่�เตรี ียมตามมาตรฐานจะส่่งผลให้้เมื่่�อใช้ย้้ ้อมฟิิล์์มเลืือด มาลาเรี ียแล้้ว จะได้้ฟิิล์์มเลืือดที่่มี�ีคุุณภาพดีี การตรวจสอบคุุณภาพฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ียประกอบด้้วยวิธีิีการดัังต่่อไปนี้้� 5.1 การเตรี ียมฟิิล์์มเลืือดที่่�พบเชื้้�อมาลาเรี ียเพื่่�อใช้้ตรวจสอบคุุณภาพ

22 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 1. เตร ียมฟิล์มเลือดให้ปฏิบัติตาม MM-SOP-06A: การเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วและ การเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบาง หรื ือ MM-SOP-06B: การเจาะเลืือดจากเส้้นเลืือดดำำและ การเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบางจากเลืือดในหลอดที่่�มีีสารกัันเลืือดแข็็ง โดยผู้้ป่่วยพบเชื้้�อ P. falciparum หรื ือ P. vivax ควรเป็็นฟิิล์์มเลืือดที่่�พบเชื้้�อระยะ developing หรื ือ mature trophozoites ถ้้าเป็็น P. vivax ควรพบระยะ gametocyte หรื ือ schizonts ด้้วย เมื่่�อทำำ ฟิิล์์มเลืือดแล้้วรอให้้ฟิิล์์มเลืือดแห้้ง 2. ตร ึงฟิล์มบางด้วยเมทานอล ตามขั้นตอนใน MM-SOP-09: การย้อมฟิล์มเลือดด้วยสียิมซ่า และรอให้้แห้้ง โดยยัังไม่่ต้้องย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือด 3. เก็บสไลด์ลงในกล่องสไลด์ ติดฉลาก โดยระบุชนิดและระยะของเชอมา ื้ ลาเร ียที่พบ จำนวน สไลด์์ วัันที่่�เตรี ียม และชื่่�อผู้้เตรี ียม 4. เก็บกล่องสไลด์ในกล่องพลาสติกหร ือถุงซิปล็อคอีกชันหนึ้ ่ง ใส่สารดูดความชน ื้ ลงในกล่อง พลาสติิกหรื ือถุุงซิิปล็็อคด้้วย เพื่่�อป้้องกัันความชื้้�น สารดููดความชื้้�นต้้องไม่่เป็็นชนิิดโคบอลต์์ คลอไรด์์ 5. เม ื่อต้องการนำสไลด์ออกมาใช้ ให้นำออกมาเฉพาะแผ่นที่ต้องการ วางทิงไว้ที ้ ่อุณหภูมิห้อง โดยใส่่ในโถดููดความชื้้�น (desiccator) 6. ทำการย้อมสีฟิล์มเลือดเม ื่อต้องการทดสอบ ตามขั้นตอนใน MM-SOP-09: การย้อมฟิล์ม เลืือดด้้วยสีียิิมซ่่า 5.2 ลัักษณะเฉพาะของเชื้้�อมาลาเรี ียเมื่่�อการย้้อมสีีมีีคุุณภาพตามมาตรฐาน ตัวอย่างรปเชืูอม้ าลาเร ีย ลักษณะเชือม้ าลาเร ียและเม็ดเลือดแดง ที่ติดเชือม้ าลาเร ีย P. falciparum • เม็ดเลือดแดงทีติดเช่อมีขนาดแ ื้ ละสีปกติ • P. falciparum ระยะ trophozoite รูปร่าง ring form มีไซโตพลาสซึมสีน้ำเงิน และมีโครมาติน สีแดงขนาดเล็ก 1 หร ือ 2 อัน • อาจเห็น Maurer’s clefts (dots) เป็นจุดสีน้ำเงิน หยาบ ลักษณะคล้ายเคร ืองหมาย comma อยู่่บน ผิวของเม็ดเลือดแดงทีติดเช่อ ื้

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 23 P. vivax • เม็ดเลือดแดงทีติดเช่ อมีขนาดให ื้ ญ่ขึน แ้ละติด สีจางลง • P. vivax ระยะ trophozoite รูปร่าง ring form มีโครมาตินสีแดงขนาดใหญ่ ไซโตพลาสซึมสีน้ำเงิน ซงเมึ่ ื่ อเจร ิญขึน้จะเห็นเป็น amoeboid form อาจเห็น pigment สีน้ำตาลเหลือง • Schüffner’s dots เป็นจุดสีแดง ละเอียด พบบน ผิวของเม็ดเลือดแดงทีติดเช่อ ื้ P. malariae • เม็ดเลือดแดงทีติดเช่อมีขนาดปกติ หร ือเ ื้ ล็กลง และติดสีเข้มขึนเ้ล็กน้อย • P. malariae trophozoites มีไซโตพลาสซึม สีน้ำเงิน ลักษณะแน่น มีโครมาตินสีแดงขนาด ใหญ่ อาจพบมีลักษณะเป็น band forms และมี pigment หยาบ สีน้ำตาลเข้ม • Ziemann’s dots อาจเห็นได้ถ้าย้อมพิเศษ ลักษณะเป็นจุดเล็ก ๆ สีชมพูอ่อน คล้ายฝุ่น P. ovalae • เม็ดเลือดแดงมีขนาดใหญ่ขึน ติด้สีจางลง • ประมาณร้อยละ 20 ของเม็ดเลือดแดงทีติดเช่อมี ื้ รูปร่างร ี ทีขอ่บมีปลายเป็นแฉก ๆ • P. ovale trophozoites มีโครมาติดสีแดงขนาด ใหญ่ และมีไซโตพลาสซึมสีน้ำเงินขนาดใหญ่ อาจ พบมีลักษณะเป็น amoeboid form • Jame’s dots มีลักษณะคล้าย Schüffner’s dot แต่พบหนาแน่นกว่าทีพ่บในเม็ดเลือดแดงทีติดเช่อ ื้ P. vivax.

24 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5.3 กรณีีที่่�ไม่่สามารถหาฟิิล์์มเลืือดที่่�พบเชื้้�อมาลาเรี ีย สามารถควบคุุมคุุณภาพของฟิิล์์มเลืือดได้้โดยดููจากการ ติิดสีีของเม็็ดเลืือดแดงและเม็็ดเลืือดขาวในฟิิล์์มเลืือด ดัังนี้้� ตัวอย่างรปภูาพ การติดสีของเม็ดเลือดแดงและเม็ดเลือดขาว เมื่อย้อมด้วยสียิมซ่า เม็ดเลือดแดง • ขนาด 7-8 ไมครอน ลักษณะค่อนข้างกลม เว้า บร ิเวณตรงกลาง คล้ายโดนัท ไม่มีนิวเคลียส ย้อมติดสีชมพู Neutrophil • นิวเคลียส: สีน้ำเงินม่วง • ไซโตพลาสซึม: สีชมพู • แกรนูล: สีชมพู ลักษณะละเอียด Eosinophil • นิวเคลียส: สีน้ำเงินม่วง • ไซโตพลาสซึม: ชมพู • แกรนูล: ขนาดใหญ่ สีแดงส้ม เร ียงตัวสม่ำเสมอ Basophil • นิวเคลียส: สีน้ำเงินม่วง • ไซโตพลาสซึม: สีชมพู • แกรนูล: ขนาดใหญ่ หยาบ สีน้ำเงินม่วง เร ียงตัวกระจัดกระจาย

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 25 Lymphocyte • นิวเคลียส: สีน้ำเงินม่วง • ไซโตพลาสซึม: สีฟ้า • ไม่มีแกรนูล Monocyte • นิวเคลียส: สีน้ำเงินม่วง • ไซโตพลาสซึม: สีฟ้า • ไม่มีแกรนูล 5.4 ปัญัหาที่่มั�ักพบในการควบคุุมคุุณภาพการย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือดและแนวทางการแก้้ไข ปัญหาที่พบ สาเหตุท ี่เป็นไปได้ข้อแนะนำ� 1. เม ื่ อดูฟิล์มบางด้วยตา เปล่า พบว่าฟิล์มเลือด ติดสีชมพูแดง • pH ของสารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ทีนำ่มา เจือจางสียิมซ่าเข้มข้น ต่ำกว่า 7.2 (เป็นกรด) • ตรวจสอบค่า pH ของสารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ และปรับให้ได้ 7.2 หร ือเตร ียมใหม่ • ถ้าค่า pH สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ เท่ากับ 7.2 ให้ตรวจสอบความสะอาด ของเคร ืองแก้ว ครา่บน้ำยาล้างทีติดอยู่่ อาจทำ ให้ค่า pH เปลี่ยนแปลง ก่อน นำ เคร ืองแก้วมาใช้เตร ียม ่สารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ให้ล้างด้วยน้ำสะอาด ก่อน • น้ำทีใช้ ่ล้างฟิล์มเลือดหลัง การย้อมสี เป็นกรดมาก เกินไป • ใช้สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ล้างฟิล์มเลือดหลังการย้อมสี

26 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ปัญหาที่พบ สาเหตุท ี่เป็นไปได้ข้อแนะนำ� 2. ในฟิล์มเลือดบาง พบ เซลล์เม็ดเลือดแดง แตกทังหมด หร ือแตก้ บางส่วน • ฟิล์มบางถูกตร ึงด้วย เมทานอลไม่เพียงพอ เน ื่ องจากเมทานอลเสื่อม คุณภาพ • ใช้เมทานอลทีมีคุณ่ภาพสูงเท่านั้น • เปลี่ยนเมทานอลใหม่ • เก็บเมทานอลในขวดทีปิด่สนิทเพื่ อ หลีกเลี่ยงเมทานอลระเหยออกสู่อากาศ ภายนอก 3. เซลล์เม็ดเลือดแดงใน ฟิล์มหนาไม่แตก • เม็ดเลือดแดงถูกตร ึง ด้วยเมทานอล • เกิด auto-fixation จากความร้อนหร ือ ความชนเป็นเว ื้ ลานาน หร ือจากการทำ ให้แห้ง ด้วยวิธีทีไม่ ่ถูกต้อง เช่น ใช้เคร ืองเป่าผม หร ือ่ วางบน hot plate • ขณะตร ึงฟิล์มบาง ระวังไม่ให้ฟิล์มหนา สัมผัสโดนเมทานอลหร ือไอระเหยของ เมทานอล • หากไม่สามารถย้อมฟิล์มหนาทันที ควร เก็บในโถดูดความชนที ื้ ใ่ส่ซลิ ิกาเจลชนิด ทีไม่มีโค ่บอลต์ คลอไรด์ • หากต้องการให้ฟิล์มแห้งเร็ว ใช้เคร ือง่ เป่าผมความร้อนเพียงอุ่นๆ ห่างจาก สไลด์ 30 เซนติเมตร 4. คุณภาพการย้อมสีฟิล์ม เลือดไม่ดี • การเตร ียมสียิมซ่าเข้มข้น หร ือสียิมซ่าเจือจางไม่ถูก ต้อง • ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการเตร ียมสียิมซ่า ทำถูกต้อง • การชังผง่สียิมซ่าให้ใช้เคร ืองชั่ง่สำ หรับ งานวิเคราะห์ และการตวงของเหลวให้ ใช้กระบองตวงทีมีขีด่บอกปร ิมาตร ถูกต้อง

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 27 ปัญหาที่พบ สาเหตุท ี่เป็นไปได้ข้อแนะนำ� 5. ฟิล์มเลือดทีย้อม่สีแล้ว มีตะกอนมาก • ใช้สีย้อมคุณภาพต่ำ • ใช้สีย้อมทีศูนย์อ้างอิงทางห้องป่ฏบิ ัติการ กองโรคติดต่อนำ โดยแมลง แนะนำ หร ือ จัดหาให้ • ใช้เมทานอลหร ือกลีเซอรอล คุณภาพต่ำ • ใช้เฉพาะเมทานอลและกลีเซอรอล คุณภาพสูงเท่านั้น • ไม่ได้กรองสียิมซ่าเข้มข้น • กรองสียิมซ่าเข้มข้นปร ิมาณเล็กน้อย ทันทีก่อนเตร ียมสียิมซ่าเจือจาง • การเก็บรักษาสียิมซ่า เข้มข้นไม่ถูกต้อง • เก็บสียิมซ่าเข้มข้นในขวดสีชา และเก็บ ไว้ในทีเย็น ห่าง่จากแสงแดด • ปิดฝาให้สนิทเพื่อป้องกันการดูดซบั ความชน ื้ จากอากาศ • ห้ามเขย่าขวดสียิมซ่าเข้มข้นอย่างน้อย 24 ชัวโมงก่อนการใช้งาน เพ ่ ื่ อหลีกเลี่ยง ไม่ให้ตะกอนฟุ้งขึนมา้ • สียิมซ่าเข้มข้นอาจปน เปื้อนน้ำ • แบ่งสียิมซ่าเข้มข้นเก็บในขวดขนาดเล็ก สำ หรับการใช้งานประจำ วัน เพื่ อหลีก เลี่ยงการปนเปื้อนในขวดใหญ่ • ไม่จุ่มปิเปตทีเปียกหร ือปนเปื่ ้อนลงในสี ยิมซ่าเข้มข้น • ห้ามเทสีกลับลงไปในขวดสียิมซ่าเข้ม ข้นหร ือขวดสียิมซ่าทีเ่จือจางแล้ว เมื่ อ เตร ียมสียิมซ่าเจือจางแล้วต้องใช้ทันที ส่วนทีเห่ลือให้เททิงไป ้ • การล้างสีบนฟิล์มเลือด หลังย้อม ไม่ถูกต้อง • ให้ใช้วิธีเทน้ำเพ ื่อไล่สีและฝ้าทีอยู่่บน ผิวหน้าของสีย้อมออกให้หมด ก่อนยก สไลด์ขึน ้ • ใช้สียิมซ่าเจือจาง ทีผ่สมไว้ นานเกิน 30 นาที • สีที่จะใช้ย้อมต้องเตร ียมใหม่ และใช้ ย้อมทันที หากเหลือให้เททิง ้ 6. ฟิล์มเลือดทีย้อมแ่ล้ว ติดสีซีดจาง • เวลาทีใช้ย้อม ่สีไม่เพียงพอ • เพิ่ มเวลาย้อม • ทดสอบเวลาย้อมสีทีเหมาะ่สมทุกครังที้ ่ เปลี่ยนสีย้อมใหม่ชุดใหม่ • กรองสียิมซ่าเจือจางก่อน ย้อม • ห้ามกรองสียิมซ่าทีผ่สมเจือจางก่อน ย้อม การกรองสีย้อมให้กรองเฉพาะสี ยิมซ่าเข้มข้น 7. ฟิล์มเลือดทีย้อมแ่ล้ว ติดสีเข้มเกินไป • ย้อมสีนานเกินไป • ลดเวลาย้อมสี • ทดสอบเวลาย้อมสีทีเหมาะ่สมใหม่ ทุกครังที้เป่ลี่ยนสีย้อมใหม่ชุดใหม่

28 คมู่อืปฏบิ ัติงานการตรวจ นิจฉยัเชือมาลา้วยกล้องจลุทรรศน์และการควบคมุคณุภาพ าท บ สาเหตุท นไปได้ข้อแนะนํา 8. เมด็เลือดแดงตดิสแีดง ลียสของ เซลลเ์มด็เลือดขาวไม่ ตดิสีน pH ของสียอ้มต กวา่ 7.2 ตรวจสอบคา่ pH ของสารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์และปรับใหไ้ด้7.2 ถา้คา่ pH สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ เทา่กับ 7.2 ใหต้รวจสอบความสะอาด องแกว้ (คราบน ยาลา้งทีตดิอยู่ อาจทําใหค้า่ pHเปลียนแปลง กอ่นนํา สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรใ์ห้ลา้ง ดว้ยน กลันกอ่น) น ทีใช้ลา้งฟลม์เลือด ใช้สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 7.2 ลา้งฟลม์เลือดแทนน เปล่า 9. ไมเ่หน็ Schüffner Maurer cleft pH ของสียอ้มไม่ถกูตอ้ง ตรวจสอบคา่ pH ของสารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์และปรับใหไ้ด้7.2 ถา้คา่ pH สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ เทา่กับ 7.2 ใหต้รวจสอบความสะอาด องแกว้ (คราบน ยาลา้งทตีดิ อยูอ่าจทําใหค้า่ pHเปลียนแปลง กอ่น นํา สารละลาย ฟอสเฟตบัฟเฟอรใ์ห้ลา้งดว้ยน กลัน กอ่น) 10. พบสิงแปลกปล สิอนอยูใ่นฟล์ม เลือด ฟลม์เลือดอาจ อน สิงตา่ง ๆ ดงันี ฟลม์เลือดมรีาขึน ส สรดอกไม้ สิงสกปรกและแบ สารละลายฟอสเฟต บัฟเฟ อน เก็บสไลด์สะอาดที บรอ้ยแล้ว ในทีแหง้ ลม์หนาทียังไม่ยอ้มทนัทีให้ทาํ dehemoglobinization กอ่น แล้ว เก็บในทีแหง้ ตากฟลม์เลือดใหแ้หง้ในถาดทีมีฝ ทําความสะอาดนิวของคนไข้ก่อนเจาะ เลือด เก็บสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรใ์นขวด ทึบแสง แล ฝาขวดให้สนทิเก็บขวด ในทีเยน็ห่างจากแสงแดด ้าจาํน น ด น ประปาแทนสารละลายฟอสเฟต บัฟเฟอร์ต้องแน่ใจ ะอาด

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 29 6. ข้อ้ควรระวัังที่่�เกี่่�ยวข้อ้งกัับขั้นต้�อนการปฏิิบัติั ิงาน · การปรับเวลาทีใช้ในการย้อม ่สีให้เหมาะสม สามารถทำพร้อมกันได้ แต่ใช้เวลาต่างกัน เช่น ถ้าย้อมแบบเร็ว (ด้้วยสีียิิมซ่่า 10%) ให้้ย้้อมสไลด์์ 3 สไลด์์พร้้อมกััน แต่่ใช้้เวลาต่่างกััน 8, 9, และ 10 นาทีี แล้้วดููผลว่่าเวลาที่่� ย้้อมเวลาไหนที่่�ให้้ผลการย้้อมดีีที่่�สุุด ก็็ให้้เลืือกใช้้เวลาย้้อมนั้้�น สำำหรับสีั ีชุุดนั้้�น 7. การควบคุุมคุุณภาพ บัันทึึกการควบคุุมคุุณภาพในแบบฟอร์์มการควบคุุมคุุณภาพดัังต่่อไปนี้้� แบบฟอร์์มต่่าง ๆ แสดงอยู่่ในข้้อ 10 ภาคผนวก · แบบบันทึกการควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเข้มข้น สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 · แบบบันทึกการควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเจือจาง 10% ประจำวัน · แบบบันทึกการควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเจือจาง 3% ประจำวัน · แบบบันทึกการควบคุมคุณภาพการย้อมสียิมซ่าประจำวัน 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิิบัติั ิงานที่่�เกี่่�ยวข้อ้ง · MM-SOP-02: การเตร ียมสียิมซ่าเข้มข้น · MM-SOP-03A: การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 · MM-SOP-03B: การเตร ียมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ด้วยบัฟเฟอร์ชนิดเม็ด · MM-SOP-06A: การเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้ วและการเตร ียมฟิล์มหนาและบาง · MM-SOP-08: การเตร ียมสารละลายสียิมซ่าเจือจางสำหรับใช้ย้อมฟิล์มเลือด · MM-SOP-09: การย้อมฟิล์มเลือดมาลาเร ียด้วยสียิมซ่า · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชอมา ื้ ลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้้างอิิง World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. Storey J. (2012). Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. (Unpublished).

30 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 10. ภาคผนวก แบบบันทกึการควบคุมคุณภาพสียมิซา่เข้มขน้สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร pH์ 7.2 แล ล์มเลือด วนัททดีสอบ/ วตัถุประสงค์วนั / เดื การควบคุมคุณภาพ สียอ้ม บัฟเฟอร์และ ฟล์มเลือด หมายเลขรุน่วนัทเตรี วนั /เดื วนัทหมดอายีุ วนั /เดื วธยีอ้ม/ระยะ เวลายอ้ม ชนิดเชอมาล และสิงทพีบ ผลการควบคุมคุณภาพ / การดําเนินการแก้ไข้ ชอ นามสกุล และลายเซ็น ของผู้ดําเนิน การควบคุม คุณภาพ ตัวอยา่ง 18/10/2559 เปลียน Lot ......................... Stock Giemsa Buffer pH 7.2 Blood films 2559-023 18/10/2559 ............. ............ 25/10/2561 ............. ............. 3% 10% ระยะเวลายอ้ม 45 นาที ................ PV PF สิงทพีบ: ไม่เห็น invisible และการ ติดสีจางเล็กน้อย ผ่าน ไม่ผ่าน การดําเนินการ : เพิมระยะเวลายอ้ม ตรวจสอบ pH ของ phosphate buffer solution ชอื นามสกุล ลายเซน็ แบบบันทึกการควบคุมคุณภาพสียมิซา่เจอืจาง 10% ประจาวํนั ชอืห้องปฏิบัติการ:.....................................................................................เดือน.................................................ป ทาํเค องหมาย หรอเขยีนลงในชองต่รงกับวันททีดี ําเนินการควบคุมคุณภาพ รายการทตรวีจสอบ วนัที 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1. เม็ดเลือด/เชอติดสีถูกต้อง 2. ไม่มีตะกอนสีสิอน 3. เวลาทใีชย้อ้ม (นาท)ี 4. คุณภาพสียอ้มสามารถใชง้านได้ 5. ผู้ดําเนินการควบคุมคุณภาพ หมายเหตุ: · เม็ดเลือด/เชอืติดสีถูกต้อง หมายถึง ลักษณะของเม็ดเลือดและเชอืมาล สีตามลักษณะทมี ีคุณภาพดี ของเม็ดเลือดแดงและเชืลาเรยทดีูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ทกี ําลังขยาย 1000 เทา่ · ไม่มีตะกอนสีสิอน หมายถึง ไม่มีตะกอนฝน ขยะ เศษสีเชอรา เมอดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ทกี ําลัง ขยาย 1000 เทา่ · คณุภาพสียอ้มสามารถใชง้านได้หมายถึง คณุภาพโดยรวมของสียอ้มทใีช จจุบนัมีคณุภาพดีสามารถ ใชง้านได้ตามปกติ · ผู้ดําเนินการควบคุมคุณภาพใชอ้ ักษรยอ่ กรณี ใชบ้ ัฟเฟอรเ์ม็ด ให้บันทกึหมายเลขรุน่ตามทระีบุบนขวด ถ บนัทกึหมายเล ธขีองห้องปฏิบัติการ Schuffner's dots

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 31 แบบบันทกึการควบคุมคุณภาพสียมิซา่เจอืจาง 3% ประจาวํ ัน ชืห้องปฏิบัติการ:.....................................................................................เดือน.................................................ป ทาํเค หร ขยีนลงในชอ่งตรงกับวันททีดี ําเนินการควบคุมคุณภาพ รายการทตรวีจสอบ วนัที 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1. เม็ดเลือด/เชอติดสีถูกต้อง 2. ไม่มีตะกอนสีสิอน 3. เวลาทใีชย้อ้ม (นาท)ี 4. คุณภาพสียอ้มสามารถใชง้านได้ 5. ผู้ดําเนินการควบคุมคุณภาพ หมายเหตุ: · เม็ดเลือด/เชอติดสีถูกต้อง หมายถึง ลักษณะของเม็ดเลือดและเชอมาล สีตามลักษณะทมี ีคุณภาพดี ของเม็ดเลือดแดงและเช ลาเร ทดีูภายใต้กลอ้งจุลทรรศน์ทกี ําลังขยาย 1000 เท่า · ไม่มีตะกอนสีสิอน หมายถึง ไม่มีตะกอนฝ ษสีเชอรา เมอดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ทกี ําลัง ขยาย 1000 เท่า · คณุภาพสียอ้มสามารถใชง้านได้หมายถึง คณุภาพโดยรวมของสียอ้มทีจจุบนัมีคณุภาพดีสามารถ ใชง้านได้ตามปกติ · ผู้ดําเนินการควบคุมคุณภาพใชอ้ ักษรยอ่ แบบบันทกึการควบคุมคุณภาพการยอ้มสียมิซา่ ประจาวํ ัน วนั /เดืจาํนวนฟล์ม เลือดทยีอ้ม หมายเลขรุน่ Methanol หมายเลขรุน่สี ยมิซา่เขม้ขน้ หมายเลขรุน่ phosphate buffer pH 7.2 ความเขม้ขน้ของ สียมิซา่เจอืจาง ทใีชย้อ้ม (%) ชอ นามสกุลของ ผู้ดําเนินการยอ้ม

32 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การใช้้ การดููแลรัักษา และการซ่่อมบำรุำุงกล้อ้งจุุลทรรศน์์ MM-SOP-04 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิบิายวิธีิพื้ี ้�นฐานของการใช้้ การดููแลรัักษา และซ่่อมบำรุำุงกล้้องจุุลทรรศน์์ที่่�ใช้้ในงานตรวจวินิิ ิจฉััย เชื้้�อมาลาเรี ีย 2. หลัักการและเหตุุผล ความถููกต้้องของการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียขึ้้�นอยู่่กัับคุุณภาพและการใช้้งานกล้้องจุุลทรรศน์์ ควรปรับั กล้้องจุุลทรรศน์์ให้้มีีสมรรถนะการใช้้งานที่่ถู�ูกต้้อง มีีระบบการป้้องกัันความเสีียหาย ใช้้งานอย่่างเหมาะสมเพื่่�อความ ปลอดภััยต่่อสุุขภาพของผู้้ใช้้งาน และต้้องได้้รับัการบำรุำุงรัักษาสม่ำำเสมอ ในกรณีีที่่�กล้้องชำรุำุดต้้องได้้รับั การซ่่อมแซม โดยช่่างซ่่อมกล้้องจุุลทรรศน์์โดยเฉพาะ การตรวจวินิิ ิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย ใช้้กล้้องจุุลทรรศน์์เชิิงซ้้อนแบบสองตา (compound binocular light microscope) เลนส์์ตา (eye lens) เป็็นชนิิดเห็็นภาพกว้้าง (wide field) มีีกำำลััง ขยายไม่่น้้อยกว่่า 10 เท่่า 1 คู่่ และเคลืือบสารป้้องกัันเชื้้�อรา มีีวงแหวนสำำหรับั ปรับัชดเชยค่่าสายตา (Diopter) อยู่่ที่่� เลนส์์ตา สำำหรับัเลนส์์วััตถุุ (objective lens) เป็็นระบบ Infinity เหมาะสำำหรับดูั ูฟิิล์์มเลืือดหนาบนแผ่่นกระจกสไลด์์ และเป็็นชนิิดของเลนส์์เป็็น Plan Achromatic ที่่�เคลืือบสารป้้องกัันเชื้้�อรา 3. วัสัดุุ อุุปกรณ์์ และเครื่อ ่� งมืือ · กล้องจุลทรรศน์เชิงซ้อนชนิดสองตา ที่มีเลนส์ใกล้ตากำลังขยาย 10 เท่า มีเลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยาย 10 เท่่า 40 เท่่า และ 100 เท่่า และมีีแท่่นวางวััตถุุ · ถุงคลุมกล้องจุลทรรศน์ · กระดาษเช็ดเลนส์ · ลูกยางเป่าฝุ่น · ชุดน้ำยาทำความสะอาดกล้องจุลทรรศน์ · ผ้าเนื้อนุ่มสำหรับเช็ดกล้อง 4. ข้อ้ควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · แหล่งกำเนิดไฟฟ้าและระบบเชอมต่อไ ื่ ฟฟ้าเข้ากับกล้องจุลทรรศน์ ต้องมีความปลอดภัยต่อผู้ปฏิบัติงาน · ระวังไม่ให้กล้องจุลทรรศน์และอุปกรณ์เชอมต่อกั ื่ บไฟฟ้าถูกน้ำ · ระมัดระวังแสงสว่างทีมากเกินไป ที ่อา่จทำให้เกิดอันตรายกับดวงตา · ใช้กล้องจุลทรรศน์ให้ถูกต้องตามหลักการยศาสตร์ เพื่อป้องกันอาการปวดหลัง ปวดคอ · ห้ามใช้ xylene ทำความสะอาดส่วนต่าง ๆ ของกล้องจุลทรรศน์ เพราะจะทำให้กล้อง และเลนส์เสียหาย รวมทั้้ง xylene �ยัังเป็็นพิิษต่่อผู้้ใช้้ 5. วิ ิธีการี 5.1 การขนส่่งและการเคลื่่�อนย้้ายกล้้องจุุลทรรศน์์ · การขนส่งกล้องจุลทรรศน์ต้องบรรจุในกล่องเก็บกล้องจุลทรรศน์ โดยภายในกล่องเก็บต้องมีอุปกรณ์ ป้้องกัันการเคลื่่�อนที่่�ของกล้้อง · ถ้าไม่มีกล่องเก็บกล้องจุลทรรศน์ ให้ใช้กล่องหร ืออุปกรณ์จัดเก็บที่บร ิษัทผู้ผลิตออกแบบมาเฉพาะ สำำหรับัการเคลื่่�อนย้้าย เพื่่�อป้้องกัันไม่่ให้้กล้้องเกิิดการขยัับเคลื่่�อนที่่�ระหว่่างการขนส่่ง

ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจ นิจฉัยเชือมาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 33 • ระหวา่งการขนส ลอ้งจุลทรรศน์เค อนที สันสะเทอนมากเกินไป ควร ืจดัวางกลอ่ง เก็บกล้องอย่างดีระวังการลื�นไหลไปมาระหว่างการขนส่ง และการตกจากที�สูงป�องกันไม่ได้กล้อง ถูกน�า ความรอ้นสูง และการสัมผัสโดยตรงกับแสงแดด • ต้องถือกล้องจุลทรรศน์ด้วยสองมือเสมอ โดยมือหนึงประคองทีฐานกล้อง และอีกมือหนึงจบั ทีแขน กล้อง 5.2 สถานท างกล้องจุลทรรศน์ • วางกลอ้งจุลทรรศน์บนโต๊ะที บได้ระดับ แขง็แรง ไมส่ ันสะเทือน เนองจากการดูกลอ้งทมีกีาํ ลัง ขยายสูง การสั�นสะเทือนเพียงเล็กน้อยก็ทําให้ภาพทีห็นใต้กล้องจุลทรรศน์เคลื • วางกลอ้งจุลทรรศน์ในตําแหน่งทีผู้ใชง้านมีพนทีทํางานและวางขาไวใ้ต้โต๊ะได้เต็มทีควรใชเ้ก้าอีทีปรับ ระดับความสูงตาได้ • ไม่วางกล้องจุลทรรศน์ตรงหน้าต่างทีมีแสงสวา่งส่องเขา้มามาก ควรวางกล้องจุลทรรศน์ตรงหน้าผนัง ห้องหร น้าต่างทบึ 5.3 การตังค่ากล้องจุลทรรศน์ เมื มใช้กล้องจุลทรรศน์ ครังแรก • ตังค่ากล้องจุลทรรศน์ตามคําแนะนําในคู่มือจากผู้ผลิต เพอให้ได้การปรับตังค่าทีเหมาะสม ทังระบบ แสงและการใชง้านทัวไป 5.3.1 การตังระบบแสง ปรบัขนาดรูรบัแสง (iris aperture) ตามคําแนะนําในคู่มือจากผู้ผลิต เพื ห้ได้ ความชัดลึก (depth of field) มากที ชร้ะบบแสงโคห์เลอร์(Kohler illumination) และตังค่านี กับเลนส์ใกล้วตัถุขนาด 100 เทา่มีขันตอนดังนี 1. รูรับแสงของเลนส์รวมแสงให้เล็กที ุด 2. ลอดไฟทีฐานของกล้องจุลทรรศน์ ซงแึสงสวา่งจะส่งไปยังเลนส์รวมแสง 3. เ อนหลอดไฟขึ สงให้สวา่งทีุด 4. วางฟล์มเลือดทียอ้มสีแล้วบนแทน่วาง หยด immersion oil แล้วใชเ้ลนส์ใกล้วตัถุขนาด 100 เทา่ 5. มองผ่านเลนส์ใกล้ตา และเ อนเลนส์รวมแสงขึนลง จนเห็นขอบของรูรับแสงชดัเจน 6. ถ้าจาํสกรู เ อนเลนส์รวมแสงไปมา เพอให้วงกลมของแสงอยูต่รงกลาง 7. เ อนหลอดไฟลงแล ฟ บแสงให้กวา้งก่อนใชง้านตามปกติ 8. หมายเหตุ: การตังแสงระบบโคห์เลอรน์ ี กล้องจุลทรรศน์ทีใช้จะต้องสามารถปรับหลอดไฟ ขึนลงได้

34 ค่มือปฏิบั ูติงานการตรวจ นิจฉัยเชือมาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5.3.2 การปรบภั าพให้เหมาะสมสําหรบั การใชง้านในการตรวจวนิจฉัยโรคในห้องปฏิบัติการ ในการใชง้านสําหรบัการตรวจวนิจฉัยเช ลาเร นันจะต้องปรบภัาพทีห็นในกลอ้งจุลทรรศน์ให้พอดี กับสายตาของผู้ทีทาํหน้าทีวนิจฉัย เนื จากพบว่าบางคนจะมีสายตาของตาทังสองข้างไม่เท่ากัน รวมทังมี สายตาเอียง ทาํ ให้การปฏิบัติงานติดต่อกันนานๆ ไม่สามารถทาํ ได้ โดยมีขอ้แนะนําตามขันตอนการใชง้านดังนี 1. ปรับระยะภาพทีเห็นผ่านกล้องจุล บภาพหยาบ แล บภาพ ละเอียดตามขันตอน 2. ปรับระยะห่างของเลนส์ตา โดยเ อน interpupillary distance ปรับระยะห่างระหวา่งเลนส์ ตาสองข้าง ให้ภาพที�เกิดขึ�นภาพใต้กล้องจุลทรรศน์ ที�ปรากฎเป�น 2 วงที�ซ้อนเหลื�อมกัน รวมเป�นภาพวงเดียว ภาพเป�นวงเดียวกันแล้วให้ปรับระนาบของภาพทังสองตา โดย � ซงพึบวา่ ในแต่ละคนจะมรีะยะห่างของตาทงัสองขา้งแตกต่างกนัเมอเห็น 2.1 ในกรณีทีกล้องจุลทรรศน์ปรับระยะเลนส์ตาได้ขา้งเดียว (หมุนเลนส์ตา ขึนลงได้ขา้งเดียว) • เลนส์ตาหมุนได้ และปรับ บภาพละเอียดโดยดูผ่านเลนส์ตาขา้งที ปรับไม่ได้ จนภาพทีเห็นชดัเจน • เมอภาพชดัเจนแล ละใชต้าอีกขา้งดูภาพปรับ eyepiece diopter หมุน เลนส์ตาขึนลงจนภาพทีเห็นชดัเจ บภาพ • ปรับระยะห่างระหวา่งเลนส์ตาอีกครัง 2.2 ในกรณีทีกล้องจุลทรรศน์สามารถปรับระยะเลนส์ตาได้ทังสองขา้ง (หมุนเลนส์ตา ขึน-ลง ได้ทังสองขา้ง) • ให้ตังระยะของภาพจากตาทังสองขา้งให้ชดัแล ง และปรับ ปรับภาพละเอียดโดยดูผ่านเลนส์ตาขา้งเดียว จนภาพทีเห็นชดัเจน • เมอภาพชดัแล้วให้สลับ ละใชต้าอีกขา้งดูภาพปรับ eyepiece diopter หมุน เลนส์ตาขึนลงจนภาพทีเห็นชดัเจนมากที บภาพ ยกเว้นไม่ สามารถปรับภาพให้ชดัเจนได้ ให้ปรับ บภาพละเอียดให้ภาพชดัเจน • ให้สลบั ง ปรับ eyepiece diopter อีกขา้ง โดยหมนุเลนส์ตาขึนลงจนภาพ ทีเห็นชดัเจนมากที ุด • ปรับระยะห่างระหวา่งเลนส์ตาอีกครังให้พอดีระยะห่างของตา

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 35 5.4 การใชง้านกล้องจุลทรรศน์ 1. ทาํความคุ้นเคยกับส่วนประกอบต่าง ๆ และหน้าทของกีล้องจุลทรรศน์ดังรูปที1 เพอให้ใชง้าน ได้อยา่งมีประสิทธภิาพ 2. ตรวจด ไฟอยใู่นตําแหนง่ทหีรไฟไวต้าสุสว ซไ์ฟ และปรบัความสวา่งให้เหมาะกับ อนป บความสวา่งทฐานกีล้อง 3. ปรบัให้เลนส์ทกี ําลังขยายตุดอยูใ่นตําแหน่งตรงกับแทน่วางวตัถุ ทใชีง้าน 4. วางวัตถุในทีนีคือตัวอย่างสไลด์ฟล์มเลือด ทีต้องการตรวจบนแท่นวาง ใช้ส ลิป (specimen holder) ยดึจบสั ไลด์ 5. เ อนสไลด์ให้ตําแหน่งทตี ้องการดูอยูต่รงกลางบ แสงผ่าน 6. มดูตัวอยา่งตังแต่เลนส์วตัถุทกี ําลังขยาย 10 เทา่ ปรบภัาพให้ชดัแล้วปรบัเ อนขึนไปทกี ําลัง ขยายสูงขึน 40 เทา่และ 100 เทา่ตามลาํดับ 7. การใชก้ล้องทกุครงควรเรัมทกี ําลังขยายของเลนส์วตัถุทตีุดเสมอ 8. หรไฟตรง sliding control lever ไปทระดี ับตุดก ส ซ์ไฟ และดึงปลักไฟออกตาม ลาํดับ 9. เ อนแทน่วางวตัถุ (stage) ลงตุด 10. หมุนเลนส์ใกล้วัตถุกําลังขยายตาสุดซงึจะสันทีสุดให้อยู่ในตําแหน่งตาสุดตรงกับแท่นวางวัตถุ ให้อยูต่รงกับลาํกล้อง และเ อนลาํกล้องลงตุด 11. นําสไลด์ออกจากแทน่วางวตัถุ 12. ใชก้ระดาษเชด็เลนส์เชด็เลนส์ตาก่อน จากนันจงึเชด็เลนส์ทมี ีกําลังขยายตุด จนถึงเลนส์ทมี ี กําลังขยายสูงสุด ตามลาํดับ สียหายทอาีจเกิดกับเลนส์ใกล้วตัถุ 40x • ใชก้ระดาษเชด็เลนส์เชด็ immersion oil ออกทนัทเีมือสัมผัสกับเลนส์ 40x เนืองจาก เลนส์ 40x อยู่ใกล้กับเลนส์ 100x แล ลนส์ทีมีขนาดยาว จงึมีโอกาสสัมผัสกับ immersion oil ได้เลนส์40x ไม่มีระบบ าให้เกิดการสะสมอยูใ่นเลนส์และ มีฝุ�นจับการแก้ไขต้องทาํ โดยบ ษัทผู้ผลิตเทา่นัน สียหายทอาีจเกิดกับเลนส์ใกล้วตัถุ 100x • เ อนแทน่วางตัวอยา่งลงให้ตุดก่อนนําสไลด์ออก • หลังจากใชง้านกล้องจุลทรรศน์เสรจ็แล้ว ให้เชด็ immersion oil ทเีลนส์ออกทนัทีด้วย กระดาษเชด็เลนส์ถ้าไม่ได้เชด็ออกทนัทีoil จะสะสมและจบัตัวแขง็มีผลต่อประสิทธภิาพ ของระบบแสงของเลนส์ • เมือไม่ได้ใชง้านกล้องจุลทรรศน์แล้ลนส์ใกล้วัตถุกําลังขยาย 100 เท่า โดยการหมุนเลนส์ใกล้วตัถุกําลังขยายตุดมาไวท้ตี ําแหน่งใชง้าน

36 ค่มู ือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ รููปที่� 1: ่ส่่วนประกอบของกล้้องจุุลทรรศน์์

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 37 5.5 การบํารงุรกัษาประจาํวนั 1. ตรวจสอบความผิดปกติของกล้องจุลทรรศน์และบนัทกึความผิดปกติในสมุดบนัทกึการบาํรุง รกัษากล้องจุลทรรศน์ประจาํวนั 2. ทาํความสะอาดส่วนต่าง ๆ ของกล้องจุลทรรศน์ด้วยผ้าสะอาด 3. ทาํความสะอาดเลนส์ใกล้วตัถุหลังการใชง้านแต่ละวนั 4. เชด็ immersion oil ออกจากกล้องให้หมดด้วยกระดาษเชด็เลนส์เทา่นัน หร ลกอฮอล์ 70% 5. ทําความสะอาดเลนส์ด้วยกระดาษเชด็เลนส์เท่านัน ห้ามทําความสะอาดด้วยแอลกอฮอล์ กระดาษชาํ ระอเนกประสงค์ทวไป ัสําลี หรือ ซงึจะทาํ ให้เกิดรอยบนเลนส์ได้ 6. ห ส่เลนส์ทงไว ิ ้ให้หาฝ ันฝ อง 7. ป จา่ยไฟกลอง้เมอหยุดใชง้าน และถอดปลกัสายไฟทกุครงัเพอป ฟกระชาก คลุมกล้องด้วยผ้าคลุมกล้องเพันฝนเมอไม่ใชง้าน 5.6 การเก็บรกัษา · เมอ ื� ไมใ่ชง้าน ใหเ้กบ็รกัษากลอ้งจลุทรรศนใ์นที�แหง้เพอ ื� ป�องกนัการเจร�ญของเชื�อราบนผวิเลนส์ และปร�ซมึเชน่เกบ็ ในตเู้กบ็กลอ้งที�มกีารควบคมุอณุหภมูแิละความชื�น อาจเกบ็เลนสแ์ละ prism heads ไวใ้นกลอ่งผนกึแนน่ ไมใ่หอ้ากาศเขา้และใสส่ารกันชื�นไวภ้ายในกลอ่ง (ตอ้งเป�นสารกนชื�น ั ที�ไม่ใส่ cobalt chloride) 5.7 การซอ่มกล้อง · ผู้ใชก้ล้องสามารถเปลียนหลอดไฟทแตกหรีลียนฟ ส์ได้โดยให้ปฏิบัติตามคําแนะนําในคู่มือ จากบร�ษทัผผู้ลติการซอ่มแซมส่วนอืน ๆ ต้องดําเนินการโดยผู้เชยีวชาญเทา่นัน · ไม่ควรสลับเลนส์หร อมต่อระบบระหวา่งกล้องจุลทรรศน์ · การบาํรงุรกัษาทเีกียวกับระบบแสง เชน่การเปลยีนเลนส์การบาํรงุรกัษาแทน่วางวตัถตุ้องทาํ โดย ชา่งผชู้ํานาญงาน · บันทกึการซอ่มบาํรุงทงหมดัลงในแบบบนัทกึการบาํรุงรกัษากล้องจุลทรรศน์ประจาํวนั 6. ขอ้ควรระวักีขอ้งกับขนตัอนการปฏิบตั ิงาน · วางกล้องลงอยา่งระมัดระวงับนโต๊ะทแีขง็แรง แห้ง สะอาด พนเร บไม่เอียง · ก่อนทีะเสียบปลัก หร ลักออก ต้องตรวจสอบวา่ส ซ์ไฟ ันไฟกระชากทําให้ หลอดไฟใต้ฐานกล้องชาํรุด ·ดําเนินการ การซ่อมแซมสิ� งผิดปกติที�เกิดขึ�นกับกล้องจุลทรรศน์ ควรใช้ผู้ชํานาญงานเฉพาะที�มีทักษะในการ · การถอดเลนส์ตาออกจากกล้องทเกี ็บรกัษาไว้มีโอกาสทําให้ฝ อราเขา้ไปในส่วนของชุดเลนส์ ทอียูภ่ายในกล้องได้ 7. การควบคุมคุณภาพ · ระหว่างการนิเทศงานตามปกติผู้นิเทศงานจะต้องตรวจสอบการติดตังและการบํารุงรกัษา กล้องจุลทรรศน์และทะเบยีนการบาํรุงรกัษากล้องจุลทรรศน์ · ห้องปฏิบัติการต้องจดั ให้มีแบบบนัทกึการบาํรุงรกัษากล้องจุลทรรศน์

38 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจ นิจฉัยเชอมืาลา้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏบิตั ิกีขอ้ง · MM-SOP-10: การตรวจ จฉัยเชอมาล ล้องจุลทรรศน์ · MM-SOP-11: การนับจํานวนเชอมาล 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization [WHO]. (2011). Universal access to malaria diagnostic testing. An operational manual. Geneva: WHO Press.

ค่มู ือปฏิบัติงานการตรวจว ินิ จฉัยเชือม้ าลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 39 แบบบัันทึึกการบำำรุุงรัักษากล้้องจุุลทรรศน์์ หมายเลขกล้้องจุุลทรรศน์์ ................................................................... วัันที่่�ใช้้ครั้้งแ�รก........................................................................................... ชนิิดกล้้องจุุลทรรศน์์ .................................................................... Serial number…………………………..........…..…………………….. บริ ิษััทผู้้ผลิิต ..................................................... ทำำเครื่่องหมาย � ในแต่่ละหัวัข้้อที่่ตรว�จสอบ เมื่่อคร�บเดืือน ให้เ้ก็็บบัันทึกึนี้้ในแ �ฟ้มเ้ก็็บรวบรวม การบำ�รุงรักษาประจำ�วัน วันที่ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 ตรวจสอบระบบแสงและการมอง เห็น (optics) ทังหมด ้ ตรวจสอบการทำ�งานของปุ่มปรับ ภาพหยาบและละเอียด ทำ�ความสะอาดภายนอกของ กล้องจุลทรรศน์ทุกส่วนประกอบ ทำ�ความสะอาดโดยรอบบร ิเวณที่ ตงกล ั้ ้องจุลทรรศน์ ทำ�ความสะอาดเลนส์ (ทุกกำ�ลังขยาย) เปลี่ยนหลอดไฟ (เฉพาะเมื่อหลอดเสีย) ใช้ผ้าคลุมกล้องหลังใช้งานเสร็จ ความเห็็นเพิ่่มเ�ติิมของผู้้ใช้้กล้้อง ................................................................................................................................................................................................................. ความเห็็นของผู้้ตรวจสอบ............................................................................................................................................................................................................................. ลงชื่่อ ........................................................... � ผู้้ใช้ก้ล้อง้ ลงชื่่อ ........................................................... �ผู้้ตรวจสอบ วัันที่่............................................................... � วัันที่่.............................................................. �

40 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ส่่วนที่่� 2 การเจาะเลืือด เตรี ียมฟิิล์์มเลืือด ย้้อมสีีอ่่านผล และรายงานผลการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย ส่่วนที่่� 2 ประกอบด้้วยขั้นตอนการปฏิิ ้�บัติั ิงานตามมาตรฐานจำำนวน 9 เรื่ ่�อง ได้้แก่่ MM-SOP-05: การเขียนฉลากฟิล์มเลือดมาลาเร ีย MM-SOP-06A: การเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วและการเตร ียมฟิล์มหนาและบาง MM-SOP-06B: การเจาะเลือดจากเส้นเลือดดำาและการเตร ียมฟิล์มหนาและบางจากเลือดในหลอดที่มี สารกันเลือดแข็ง MM-SOP-07: การเก็บเลือดใส่กระดาษกรอง MM-SOP-08: การเตร ียมสียิมซ่าเจือจางสำาหรับใช้ย้อมฟิล์มเลือด MM-SOP-09: การย้อมฟิล์มเลือดมาลาเร ียด้วยสียิมซ่า MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาและบาง MM-SOP-11: การนับจำานวนเชื้อมาลาเร ีย MM-SOP-12: การบันทึกและรายงานผลการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์

41 การเขียนฉล ลม ์ เลอืดมาลาเร MM-SOP-05 1. วตัถุประสงค์ นตอนการเข ล์มเลือดมาลาเร 2. หลกัการและเหตุผล การเข ล์มเลือดอย่างถูกต้องมีความสําคัญ ทําให้สามารถทวนสอบกลับไปยังข้อมูลของผู้ป ว่า ตัวอยา่งและข้อมูลทีบันทกึถกูต้องตรงกัน การไม่เข ลม์เลือด หร ขยีนไมถ่กูต้องอาจมีผลต่อการวนิจฉัยโรค ผิดพลาด แม้เตร ล์มเลือดเพ ล์มเดียวก็ต้องเขยีนฉลาก การเข ล์มเลือดยังมีส่วนชว่ยในการควบคุม คุณภาพด้วยวธกีารตรวจส ล์มเลื า (slide cross checking) จากห้องปฏิบตั ิการต่าง ๆ ทีส่งไปยังศูนยอ์ ้างอิง ทางห้องปฏิบตั ิการโรคติดต่อนําโดยแมลง 3. วัสดุและอุปกรณ์ • ดินสอเขยีนสไลด์ห ขยีนสไลด์ชนิดหมึกติดถาวร • กระจกสไลด์คุณภาพดี ขนาดประมาณ 25x75 มิลลิเมตร ข ข ทปลายด้าน ีหนึงเ อใช้เขยีน หร สไลด์ใสธรรมดา สไลด์ต้องสะอาดปราศจากไขมันหร ขีด • สติกเกอร์ขนาดประมาณ 16x21 มิลลิเมตร สําหรบติดกระจก ัสไลด์แบบธรรมดาที อใช้เขยีนฉลาก ล์มเลือด • แบบฟอรม์การลงทะเบยีนผ ของหนว่ยงาน เชน่รว.1: ระเบยีนผ บการตรวจโล ัหิตหาเ 4. ขอ้ควรระวงัเพือความปลอดภัย • ปฏิบัติตามขอ้กําหนดการควบคุมการแพรก่ระจายเ อตามหลักสากลเมอทาํ งานในห้องปฏิบัติการ โดย การ สวมใสันอันตรายส่วนบุคคลในการปฏิบัติงานทกุครง เัชน่ถุงมือ และเ อกาวน์ การี 1. บันทึกข้อมูลผู้ป ทะเบยีนเจาะเลือดผู้ป บยีนผู้ป ด้รับการตรวจ โลหิตหาเชื ร 2. หยิบสไลด์ที สะอาด มาเขียนฉลาก โดยใชด้ ินสอหร ขียนสไลด์แบบทีม่ได้ เขยีนทีด้านร ฝ หร สติกเกอร์โดยระบุรหัสประจาตั ํวผปู้อันดั ลม์ วันทีก็บตัวอยา่ง เลือด และรหัสห้องปฏิบตั ิการ/คลินิก/สถานทีก็บตัวอยา่งเลือด ตัวอยา่งเชน่ผู้ป ในวันที ของห้องปฏิบัติการ กกก ตัวอย่างการเข ล์มเลือดใน รูปที 3. นําสไลด์ไปใช้เก็บเลือดจากผู้ป ซึ ป บุคคลที กับแบบลงทะเบียนและฉลากทีขียน ล์มเลือด

42 6. ขอ้ควรระวงัเกยวขอ้งกับขันตอนการปฏิบตั ิงาน · ก่อนเจาะเลอืดผ ห้เขยีนฉลากให้ครบถ้วน ระหวา่งการเขยีนฉลาก ระวงัอยา่ ให้มอืห องเขยีนสัมผสั กับกระจกสไลด์บร ทีา ล์มเลือด · ห้ามใชป้ากกาลูกลนห ขียนฉลาก เพราะหมึกจะลบเลือนระห ฟ ทานอล และระหวา่งการยอ้มสี 7. การควบคุมคุณภาพ · ตรวจสอบความถูกต้องตรงกันของขอ้มูลบนฉลากฟ ับขอ้มูลผ ทะเบยีน เชน่รว.1 · ตรวจสอบสไลด์ทเีขยีนฉลากแล้วต้องไม่มีคราบมันและรอยนิวมือบนกระจกสไลด์ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบตั ิงาน เกยวขอ้ง · MM-SOP-01: การทาํความสะอาดและเก็บรกษากระจกัสไลด์ · MM-SOP-13: ความปลอดภั ัยเ ทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press.

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 43 การเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วและการเตร ียมฟลิ ์มหนาและบาง MM-SOP-06A 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายขั้้นตอนการเจาะเ�ลืือดจากปลายนิ้้� วและการเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบาง สำำหรัับการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อ มาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ 2. หลักการและเหตุผล วิธีิีมาตรฐานของการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียคืือการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อจากฟิิล์์มเลืือดด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ ฟิิล์์มเลืือดที่่ดี�ีที่่สุ� ุดในการตรวจหาเชื้้�อควรเตรี ียมจากเลืือดที่่�เจาะจากหลอดเลืือดฝอยที่่�ปลายนิ้้� ว ฟิิล์์มเลืือดที่่มี�ีคุุณภาพ จะทำำ ให้้การตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียถููกต้้อง 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองมือ ื่ · กระจกสไลด์คุณภาพดี ขนาดประมาณ 25x75 มิลลิเมตร ขอบเร ียบ มีขอบฝ้าทปลายด้าน ี่หนึ่งเพื่อใช้เขียน หรื ือกระจกสไลด์์ใสธรรมดา สไลด์์ต้้องสะอาดปราศจากไขมัันหรื ือรอยขีีด · เอทิลแอลกอฮอล์ 70% หร ือ alcohol swabs · เข็มเจาะเลือดจากปลายนิ้ ว ปราศจากเชื้อ ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · สำลีแห้ง ปราศจากเชื้อ · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · ภาชนะสำหรบัทงิ้ขยะติดเชื้อมีคม · ภาชนะทงิ้ขยะติดเชื้อทั่วไป ทั่ · ถาดสำหรบตากัสไลด์ · กล่องเก็บสไลด์ มีฝาปิดป้องกันฝุ่นและแมลงวัน · แบบฟอร์มการลงทะเบียนรบัผู้ป่วย เช่น รว.1: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการตรวจโล ัหิตหาเชื้อมาลาเร ีย แบบบัันทึึกข้้อมููลของแต่่ละห้้องปฏิิบััติิการ · ดินสอเขียนสไลด์หร ือปากกาเขียนสไลด์ชนิดหมึกติดถาวร · ตัวไถสไลด์ (spreader) · สติกเกอร์ขนาดประมาณ 16x21 มิลลิเมตร สำหรบติดกระจก ัสไลด์แบบธรรมดาทไม่มีฝ้า ี่ · แบบมาตรฐานสำหรบั ทำฟิล์มเลือดมาลาเร ีย (template) 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · สวมถุงมือก่อนเจาะเลือดและระหว่างทำฟิล์มเลือดเพื่อป้องกันตัวเอง และเพื่อไม่ให้มีคราบมันติดบน สไลด์์ ซึ่่�งมีีผลต่่อการทำำ ฟิิล์์มเลืือด และถอดถุุงมืือทิ้้� งก่่อนออกจากห้้องปฏิิบััติิการหรื ือระหว่่างการ จดบัันทึึก · เข็มเจาะปลายนิ้ วต้องใช้ครงเดียว ั้ทิ้ ง เม ื่อใช้แล้วต้องไม่สวมปลอกเข็มกลับคืน เพราะอาจทำให้เข็ม บาดมืือ · ระวังอย่าสัมผัสเลือดโดยตรงทั้งทั้ทเปียก ี่หร ือแห้งแล้วก็ตาม · เม ื่อมีบาดแผลหร ือรอยถลอกบนมือหร ือแขน ให้ปิดแผลด้วยพลาสเตอร์ชนิดกันน้ำ · ระวังอุบัติเหตุจากการถูกเข็มหร ือของมีคมทมีการปนเปื ี่ ้อนเลือด · ล้างมือด้วยสบู่ทุกครงั้ทันทหีลังจากปฏิบัติงาน · หากเลอดกระเด็น ืถูกผิวหนัง เช็ดออกทันทีด้วยสำลีชุบแอลกอฮอล์ แล้วล้างบร ิเวณที่สัมผัสเลอดด้วย ืสบู่ และน้ำ ำทัันทีี

44 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ · ของมีคม เช่น เข็มเจาะเลือดและเศษแก้วแตกต้องทิ้ งในถังขยะสำหรบัทิ้ งของมีคม ฆ่าเชื้อ แล้วส่ง บริษััทกำ ิ ำจััดขยะติิดเชื้้�อ ขยะติิดเชื้้�อไม่่มีีคม ให้้ทิ้้� งในถุุงขยะติิดเชื้้�อ แล้้วนำำ ไปเผา หรื ือส่่งบริษััทกำ ิ ำจััด ขยะติิดเชื้้�อ · เจาะเลือดในบร ิเวณทมีแี่สงสว่างเพียงพอ 5. ว ิธการี 5.1 การเจาะเลือดจากปลายนิ้ว 1. ก่อนเจาะเลอดืผู้ป่วย จะต้องเตร ียมอุปกรณ์ให้พร้อม ประกอบด้วย เข็มเจาะปลายนิว ้สำ ลีแห้ง แอลกอฮอล์ 70% สไลด์ และตัวไถสไลด์ เขียนรายละเอียด เช่น ชื่อผู้ป่วย/รหัสผู้ป่วย/อันดับ ฟิล์ม สถานทเจาะเลี่อด วืนเดั ือนปีทเก็บเล ี่อด ด้วยดิน ืสอลงบร ิเวณขอบฝ้าของสไลด์ หร ือด้วย ปากกาลงบนสติกเกอร์ และจดบันทึกข้อมูลผู้ป่วยในแบบลงทะเบียนเจาะเลือดผู้ป่วย เช่น รว.1: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการตรวจโล ัหิตหาเชื้อมาลาเร ีย หร ือ แบบบันทึกข้อมูลของแต่ละ ห้องปฏิบัติการ 2. สวมใส่อุปกรณ์ป้องกัน เช่น ถุงมือ เสื้อกาวน์ 3. ควรเลือกเจาะเลือดทนิ ี่ ้ วนางหร ือนิ้ วกลาง ห้ามเจาะนิ้ วหัวแม่มือทังเด็กและ้ผู้ใหญ่ กรณีเด็ก ทารกให้เจาะนิ้ วหัวแม่เท้าแทน ไม่ควรเจาะส้นเท้าเด็ก 4. จบมั ือผู้ป่วยหงายขึ้น นวดปลายนิ้ วเพื่อให้เลือดไหลเวียน ทำความสะอาดนิ้ วด้วยสำ ลีชุบ แอลกอฮอล์ 70% เพื่อกำ จดัสิ่ งสกปรกและไขมันบนนิ้ ว 5. เม ื่อแอลกอฮอล์แห้ง ใช้เข็มใหม่ปราศจากเชื้อเจาะที่บร ิเวณด้านข้างของนิ้ วให้ห่างจากฐาน เล็บ และเจาะในแนวตั้งอย่างรวดเร็ว ดังรูปท 1ี่ รูปที่ 1 : การเจาะเลือดบร ิเวณปลายนิ้วมือ

45 6. บบีเบา ๆ ให้เลือดออก เชด็เลือดหยดแรกทงิด้วยสําลีแห้งสะอาด และให้แน่ใจวา่ ไม่มีสําลี ติดอยู่ทปลาย ีนิว 7. บีบปลายนิวให้เลือดออก ใชน้ ิวจัขอบสไลด์นํามาแตะบนหยดเลือด อย่าให้สไลด์ สัมผัสถ ผล โดยแตะหยดเลือดขนาดเล็ก 1 หยด ลงตรงกลางแผ่นสไลด์เ อ นําไปทาฟํ 8. บบี ปลายนิวให้เลอืดออกอกีแตะหยดเลอืดอกี 2-3 หยด ห่างจากเลอืดทีาํ ฟ 1 เซนติเมตร สําหรบันําไปทาฟํหนา ดังรูปท 2ี 9. ใชส้ ําลีสะอาดและแห้งเชด็เลือดทปลาย ีนิวออก แล้วใชส้ ําลีแห ผิวทีูกเจาะเลือด เ อให้เลือดหยุดเรว็ขนึ 10.นําเลือดไปทาฟํ ือดหนาและบางทนัที 1. วางสไลด์บน นราบสีอ่อนทีะอาด เพราะจะทาํ ให้มองเห็นฟ ือดได้ชดเจนั 2. ฟ ช้ตัวไถสไลด์ทีแห้งและสะอาดแตะลงบนสไลด์หน้าหยดเลือดแล้ว ค่อย ๆ ถอยหลังตัวไถให้มาชนกับหยดเลอดืรอให้เลอดืแผ่กระจายเต็มขอบตัวไถ เอียงตัวไถ สไลด์ทาํมมุ 30-45 องศา ดันตัวไถสไลด์ไปขา้งหนา้ตามความยาวของแผ่นสไลด์ด้วยความเรว็ ส าเสมอ เลือดก็จะกระจายติดกับสไลด์ ดังรูปท 3ี สไลด์ตัวไถ

46 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 3. การเตร ียมฟิล์มหนา ใช้มุมของตัวไถลากหยดเลอด 3 ืหยด ให้วนเลอดเป็นวงกลมประมาณ ื 3 - 6 รอบ ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 1 เซนติเมตร โดยวนจากด้านนอกเข้าหาจุดศูนย์กลาง ฟิล์ม ดังรูปท 4ี่ รูปที่ 4 : การสเมียร์ฟิล์มหนา 4. ตากฟิล์มเลอดใ ืห้แห้งโดยสไลด์ยงคงอยู่ในแนวราบ ด ั ังรูปท 5 ี่ถ้าต้องการให้แห้งเร็ว ใช้ไดร์ เป่าผมทอุณี่หภูมิต่ำ ๆ เป่าห่างจากสไลด์ 30 เซนติเมตร จนฟิล์มเลือดแห้ง ถ้าเป่าใกล้เกิน ไปหร ือใช้ความร้อนมากเกินไปจะทำ ให้เลือดถูกตร ึงบนฟิล์มเลือดจากความร้อน รูปที่ 5 : การตากสไลด์ในแนวราบ 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · ฟิล์มหนาควรตากให้แห้งในแนวราบ ห้ามวางบนพื้นทเอียง และต้องป้องก ี่ันไม่ให้ฝุ่นละอองและแมลงมา เกาะกิิน · ฟิล์มหนาอาจถูกตร ึงโดยอัตโนมัติ (auto-fixation) ได้ ถ้าโดนความร้อน ดังนั้นจึงควรย้อมทันที ไม่ควร เก็็บไว้้นานโดยไม่่ได้้ย้้อม · การทำให้ฟิล์มหนาแห้ง อาจใช้เคร ืองเป่า่ผมแต่ อย่าให้ร้อนเกินไปเพราะจะทำให้ผนังเม็ดเลือดแดงถูก ตรึ ึง (auto-fixation) เมื่่�อนำำมาย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือดจะดำำมืืด · ห้ามใช้ปากกาลูกลื่ นหร ือปากกาเจลเขียนสไลด์ เพราะในขั้นตอนการย้อมสีอาจจะทำให้หมึกลบเลือนได้ · ต้องทำความสะอาดตัวไถสไลด์ด้วยน้ำสะอาด แล้วเช็ดสำลีชุบแอลกอฮอล์ 70% ทุกครง ก่อนและ ั้หลังใช้ ทำำ ฟิิล์์มเลืือดของแต่่ละคน 7. การควบคุมคุณภาพ · ให้ใช้แบบมาตรฐานการทำฟิล์มเลือดมาลาเร ีย (template) เพื่อให้ตำแหน่งของฟิล์มหนาและบางอยู่ใน ตำำแหน่่งที่่�ถููกต้้อง

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 47 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM-SOP-01: การทำความสะอาดและการเก็บรกษากระจกัสไลด์ · MM-SOP-05: การเขียนฉลากฟิล์มเลือดมาลาเร ีย · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ · MM-SOP-14: การจดการัขยะทเกิดจากการตรวจวินิจฉ ี่ัยโรคไข้มาลาเร ีย 9. เอกสารอ้างอิง กรมควบคุุมโรค. (2563). ชุุดภาพการจำำแนกชนิิดเชื้้�อมาลาเรี ีย. นนทบุุรี ี. (กำำลัังจััดพิิมพ์์). World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2015). Quality assurance manual for malaria microscopy. Second edition. Geneva: WHO Press.

48 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การเจาะเลืือดจากเส้้นเลืือดดำำและการเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบาง จากเลืือดในหลอดที่่�มีีสารกัันเลืือดแข็็ง MM-SOP-06B 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายขั้้นตอนการเจาะเ�ก็็บเลืือดจากเส้้นเลืือดดำำ และการเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบางจากเลืือดในหลอด ที่่มี�ีสารกัันเลืือดแข็็ง 2. หลักการและเหตุผล สถานพยาบาลบางแห่่งเก็็บตััวอย่่างเลืือดผู้้ป่่วยโดยเจาะจากเส้้นเลืือดดำำ เพื่่�อใช้้ตรวจวิ ิเคราะห์์ทางห้้องปฏิิบััติิ การหลายอย่่าง ที่่�อาจรวมถึึงการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ การเจาะจากเส้้นเลืือดดำำ จะได้้ปริ ิมาณ เลืือดมากกว่่าการเจาะจากปลายนิ้้� ว ตััวอย่่างเลืือดจะถููกเก็็บในหลอดที่่�มีีสารกัันเลืือดแข็็ง เอทีีลีีน ไดเอมีีน เตตระ อะซิติิ ิก แอซิิด (Ethylene diamine tetra acetic acid; EDTA) ซึ่่�งสามารถนำำมาเตรี ียมฟิิล์์มหนาและบาง สำำหรัับการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ีย 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองมือ ื่ · กระจกสไลด์คุณภาพดี ขนาดประมาณ 25x75 มิลลิเมตร ขอบเร ียบ มีขอบฝ้าทปลายด้าน ี่หนึ่งเพื่อใช้เขียน หรื ือกระจกสไลด์์ใสธรรมดา สไลด์์ต้้องสะอาดปราศจากไขมัันหรื ือรอยขีีด · กระบอกฉีดยาพร้อมเข็มเบอร์ 21 หร ือ 23 ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · หลอดเก็บตัวอย่างเลือดทเคลี่ือบสารกันเลือดแข็งชนิด อีดีทีเอ (EDTA) ขนาดบรรจุ 3-5 มิลลิลิตร · เอทิลแอลกอฮอล์ 70% หร ือ alcohol swabs · สำลีแห้ง ปราศจากเชื้อ · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · สายรดแัขนสำหรบเจาะเลั ือด (tourniquet) · ภาชนะสำหรบัทงิ้ขยะติดเชื้อมีคม · ภาชนะทงิ้ขยะติดเชื้อทั่วไป ทั่ · ไมโครปิเปต (Micropipette) · ไมโครปิเปตทิป (Micropipette tip) · ถาดสำหรบตากัสไลด์ · กล่องเก็บสไลด์ มีฝาปิดป้องกันฝุ่นและแมลงวัน · แบบฟอร์มการบันทึกข้อมูล เช่น รว.1: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการตรวจโล ัหิตหาเชื้อมาลาเร ีย หร ือ แบบบันทึก ข้้อมููลของแต่่ละห้้องปฏิิบััติิการ · ดินสอเขียนสไลด์หร ือปากกาเขียนสไลด์ชนิดหมึกติดถาวร · สไลด์สำหรบไ ัถ (spreader) · สติกเกอร์ขนาดประมาณ 16x21 มิลลิเมตร สำหรบติดกระจก ัสไลด์แบบธรรมดาทไม่มีฝ้า ี่ · แบบมาตรฐานสำหรบั ทำฟิล์มเลือดมาลาเร ีย (template) 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · สวมถุงมือก่อนเจาะเลอดและระืหว่างทำฟิล์มเลอด เื พื่อป้องกันตัวเอง และเพื่อไม่ให้มีคราบมันติดบนสไลด์ ที่่�อาจมีีผลต่่อการทำำ ฟิิล์์มเลืือด และถอดถุุงมืือทิ้้ง�ก่่อนออกจากห้้องปฏิิบััติิการ หรื ือระหว่่างการจดบัันทึึก · ใช้กระบอกฉีดยาและเข็มอันใหม่เสมอ ไม่สวมปลอกเข็มกลับคืน เพราะอาจทำให้เข็มบาดมือ

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 49 · ระวังไม่ให้เลือดทั้งทั้ทเปียก ี่หร ือแห้ง ถูกมือหร ือแขน · เม ื่ อมีบาดแผลหร ือรอยถลอกบนมือหร ือแขน ให้ปิดพลาสเตอร์ปิดแผลชนิดกันน้ำ · ระวังอุบัติเหตุจากการถูกเข็มหร ือของมีคมทมี่ีการปนเปื้อนเลือดบาด · ล้างมือด้วยสบู่ทุกครงั้หลังจากปฏิบัติงาน · หากเลือดกระเด็นถูกผิวหนัง เชดออก็ ทันทีด้วยสำลีชุบแอลกอฮอล์ แล้วล้างบร ิเวณที่สัมผัสเลือดด้วยสบู่ และน้ำ ำ ทัันทััทีี · ของมีคม เชน เ่ข็มเจาะเลือดและเศษแก้วแตกต้องทงใน ิ้ถังขยะสำหรบัทงิ้ของมีคม แล้วนำ ไปเผา นึ่งฆ่าเชื้อ หรือืส่่งบริษััทกำิษััทกำำจััดจััขยะติิดเชื้้อ �ขยะติิดเชื้้อไ �ม่่มีีคม ให้้ทิ้้งใน ทิ้้�ถัังขยะหรือืถุุงขยะติิดเชื้้อ แ�ล้้วนำำ ไปเผาหรือืส่่ง บริษััทกำิษััทกำำจััดจััขยะติิดเชื้้อ� · เจาะเลือดในบร ิเวณทมี่ีแสงสว่างเพียงพอ 5. วิธีีิการธีี 5.1 การเจาะเก็็บเลืือดจากเส้้นเลืือดดำำา 1. เขียนรายละเอียดชื่อผู้ป่วย วันเดือนปีทเกี่็บเลือด ที่หลอด EDTA และแผ่นสไลด์ 2. ใชส้ายรดแัขนผู้ป่วย โดยรดเัหนือข้อพับแขนจนกระทังเ่ห็นเส้นเลือด บอกให้ผู้ป่วยกำมือ เพื่อ ให้เห็นหร ือคลำ เจอเส้นเลือดชัดขึน้ 3. ใช้นิ้ วชคลี้ทำแี่ขนของผู้ป่วยเพื่อเลือกเส้นเลือดทมี่ีขนาดใหญ่และเคลื่ อนทนี่้อยที่สุด 4. ใชส้ ำ ลีชุบแอลกอฮอล์ 70% หมาดๆ เช็ดบร ิเวณตำ แหน่งทจะเจาะเลี่ือด และห้ามสัมผัสบร ิเวณ นั้นอีก 5. ปล่อยให้บร ิเวณที่เชดด้วยแอลกอฮอล์แ ็ห้งเอง ใชเวลาประมาณ 30 วินา ้ทีเพื่อให้แน่ใจว่า ตัวอย่างเลือดทเกี่ ็บมาจะไม่มีแอลกอฮอล์ปนเปื้อน 6. แทงเข็มเจาะเลือดปราศจากเชื้อที่สวมติดกับหลอดฉีดยาหร ือหลอดสุญญากาศเข้าไปใน เส้นเลือดดำ วางเข็มในแนวเดียวกับเส้นเลือดดำ ดูดเลือดอย่างช้า ๆ ให้ได้ปร ิมาตรตามทระบีุ่ สำหรบัหลอดเก็บเลือดทมี่ีสารกันเลือดแข็งแต่ละขนาด a. ข้อสังเกต: สารกันเลือดแข็งอาจมีผลต่อการที่เลือดจะยึดติดกับสไลด์และต่อการย้อมสี ยิมซา โดยเฉ ่พาะเมื่อสัดส่วนของเลอดกื ับสารกันเลอดแืข็งไม่เหมาะสม ดังนั้นปร ิมาณเลอดื ทจะใ ี่ส่ในหลอดจะต้องเป็นไปตามทระบี่ ุในหลอด EDTA แต่ละขนาด 7. เม ื่อได้ปร ิมาตรเลือดเพียงพอ ปลดสายรดแัขน ให้ผู้ป่วยคลายมือ ดึงเข็มออกและนำสำ ลีแห้ง วางกดทรอยเี่ข็มเจาะ ให้ผู้ป่วยกดสำ ลีแห้ง 3-5 นาที หร ือจนกว่าเลือดจะหยุดไหล 8. ใส่เลอดใน ืหลอด EDTA และผสมให้เข้ากัน โดยการพลิกกลบัหลอดไปมาเบา ๆ 6 ครง ั้ห้ามเขย่า หลอด