คู่มือการปฏิบัติงานการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรีย

50 5.2 การเตรยมฟล์มหนาและฟล์มบาง 1. เช็ดทาํความส ทจะเตรี ฟ ์มเลือด 2. เขียนรายละเอียด เชน่อผูหัสผูันดับฟล์ม สถานทีเจาะเลือด วันเดือนปทีเก็บ เลือด ด้วยดินส ข ของสไลด์ห สติกเกอร์และจดบันทกึใน แบบลงทะเบยีนเจาะเลือดผ ชน่รว.1 ระเบยีนผ้รบการตรวจโล ัหิตหาเ อมาลาเร หันทึกขอ้มูลของแต่ละห้องปฏิบัติการ 3. ผสมเลือดทอยีูใ่นหลอด EDTA ให้เขา้กันอยา่งเบา ๆ ก ฟ ์มเลือด 4. วางสไลด์ทไดี ้เขยีนรายละเอียดแล้ว บนแบบมาตรฐานสําหรบัทาฟํ ์มเลือด ดังรูปท 1ี ร าหรบัทํา 5. ใชูดเลือด 2 ไมโครลิตร หยดบนสไลด์ในวงกลมเล็กของแบบมาตรฐาน ตําแหน่ง กึงกลางสไลด์สําหรบั ฟ ์มบาง และ 6 ไมโครลิตร (ห ช้2 ไมโครลิตร 3 ครง)ั ในวงกลมใหญ่ สําหรบั ฟ ์มหนา 6. เตร ฟ ์มบางโดยใชข้อบตัวไถสไลด์วางทาํมุม 45 องศากับด้านหน้าของหยดเลือด ดึงตัวไถ สไลด์เข้าหาหยดเลอืดให้เลอืดสัมผสัแผก่ระจายเต็มขอบของตัวไถสไลด์ผลกัตัวไถสไลด์ไปด้าน หน้า ด้วยความเรว็ส าเสมอจนสุดแผ่นสไลด์ ดังรูปท 2ี ร 7. เตร ฟล์มหนาโดยใช้มุมสไลด์ตัวไถเกลียเลือดให้อยู่ในวงกลมทีมีเส้นผ่าศูนย์กลาง 1 เซนติเมตร โดยเกลีข้าหาจุดศูนยก์ลาง ประมาณ 3 – 6 รอบ แล้วยกขึน เช็ดหยด เลือดทคี ้างทมีุมสไลด์ออกด้วยกระดาษทชชิู ดูรูปท 3ี ร า สไลด์ตัวไถ

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 51 8. ตากสไลด์ให้แห้งในแนวราบ ดังรูปท 4 เล ี่ือดทมี ี่สารกันเลือดแข็ง EDTA จะยึดติดสไลด์ได้ไม่ ดีเท่าเลือดจากปลายนิ้ ว ถ้าต้องการให้เลือดแห้งเร็ว อาจใชท้ เป่า ี่ผมปรบความร้อนต่ำ ั ๆ และ เป่าโดยให้มีระยะห่างจากฟิล์มเลือดประมาณ 30 ซม. จนแห้ง ถ้าความร้อนมากเกินไปจะทำ ให้ เลือดถูกตร ึงกับสไลด์ รูปที่ 4 : การตากสไลด์ให้วางในแนวราบ 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · เลือดทเก็บใน ี่หลอด EDTA เกิน 4 ชั่วโมง ไม่ควรน ชั่ำมาใช้เตร ียมฟิล์มหนาและบาง เน ื่ องจากสารกันเลือด แข็็งจะมีีผลต่่อรููปร่่างของเชื้้�อ · ไม่ควรใชห้ ลอดเก็บเลือดทมี ี่สารกันเลือดแข็งชนิดเฮปาร ิน · กรณีทการเจาะเลี่ือดจากหลอดเลือดดำทำนอกห้องปฏิบัติการและผู้เจาะเลือดไม่สามารถทำฟิล์มเลือด ได้้ จะต้้องส่่งเลืือดไปยัังห้้องปฏิิบััติิการทัันทีี (ไม่่ควรเกิิน 1 ชั่่วโมง) โดยไ �ม่่ต้้องแช่่เย็็นหรื ือเก็็บในตู้้เย็็น · ฟิล์มหนาควรตากให้แห้งในแนวราบห้ามวางบนพื้นที่เอียง ต้องป้องกันไม่ให้ฝุ่นละอองและแมลง มาเกาะ · ฟิล์มเลอดืหนาทเตร ียมจากเล ี่อดืทมี ี่สารกันเลอดแืข็งจะแห้งช้าการยึดเกาะสไลด์ได้น้อยกว่าเลอดืทเจาะี่ จากปลายนิ้้� ว ต้้องให้้ฟิิล์์มเลืือดแห้้งสนิิท อาจใช้้เครื่่�องเป่่าผมที่่ตั้�้�งความร้้อนไว้้เพีียงอุ่่น ๆ แต่่ถ้้าร้้อนมาก เกิินไปหรื ือเก็็บไว้้นานหลายวัันก่่อนย้้อม ก็็จะทำำ ให้้ฟิิล์์มหนาถููกตรึ ึงโดยอััตโนมััติิ (auto-fixation) เม็็ดเลืือดแดงจะไม่่แตกออกขณะย้้อม ฟิิล์์มเลืือดหนาก็็จะดำำมืืด ไม่่สามารถเห็็นเชื้้�อได้้ · ห้ามใช้ปากกาลูกลื่ นหร ือปากกาเจลเขียนสไลด์ เพราะหมึกจะถูกลบในขั้นตอนการตร ึงฟิล์มบางด้วย เอทานอลและในขั้้นตอนการ�ย้้อมสีีอาจจะทำำ ให้้หมึึกลบเลืือนได้้ · ต้องทำความสะอาดตัวไถสไลด์ด้วยน้ำสะอาด แล้วเช็ดด้วยสำลีชุบแอลกอฮอล์ 70% ทุกครง ก่อนและ ั้ หลัังใช้้ทำำ ฟิิล์์มเลืือดของแต่่ละคน 7. การควบคุมคุณภาพ · ใช้แบบมาตรฐานการทำฟิล์มเลือดมาลาเร ีย (template) เพื่อให้ตำแหน่งของฟิล์มหนาและบางอยู่ใน ตำำแหน่่งที่่�ถููกต้้อง 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM-SOP-01: การทำความสะอาดและเก็บรกษากระจกัสไลด์ · MM-SOP-05: การเขียนฉลากฟิล์มเลือดมาลาเร ีย · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ · MM-SOP-14: การจดการัขยะทเกิดจากการตรวจวินิจฉ ี่ัยโรคไข้มาลาเร ีย

52 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 9. เอกสารอ้างอิง กรมควบคุุมโรค. (2563). ชุุดภาพการจำำแนกชนิิดเชื้้�อมาลาเรี ีย. นนทบุุรี ี. (กำำลัังจััดพิิมพ์์). World Health Organization [WHO]. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2015). Quality assurance manual for malaria microscopy (version 2). Geneva: WHO Press.

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 53 การเก็บเลือดใส่กระดาษกรอง MM-SOP-07 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายขั้้�นตอนการเก็็บเลืือดใส่่กระดาษกรองสำำหรัับนำำ ไปตรวจวิ ิเคราะห์์สารพัันธุุกรรมของเชื้้�อ มาลาเรี ีย 2. หลักการและเหตุผล การตรวจหาสารพัันธุุกรรมของเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยวิธีิี polymerase chain reaction (PCR) เป็็นวิธีิที่่ ีมี�ีความ ไวสููงกว่่าการตรวจด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ โดยเฉพาะกรณีียืืนยัันชนิิดเชื้้�อ การติิดเชื้้�อผสม และเชื้้�อมีีปริ ิมาณน้้อย เลืือด บนกระดาษกรองยัังสามารถนำำมาแยกสายพัันธุ์์ของเชื้้�อในระดัับยีีน (genotyping) เพื่่�อแยกว่่าเป็็นเชื้้�อสายพัันธุ์์ที่่พ�บ ในพื้้�นที่่� (local strain) หรื ือเป็็นสายพัันธุ์์ที่่�ได้้รัับเข้้ามาใหม่่ (imported strain) และแยกระหว่่างการติิดเชื้้�อใหม่่กัับ เชื้้�อกลัับจากการดื้้�อยาที่่�ใช้รัั้กษา 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองมือ ื่ · กระดาษกรอง Whatman 3MM ทกองโรคติดต่อน ี่ำโดยแมลงเป็นผู้จดเตร ียมใ ัห้ · ไมโครปิเปตและทิปแบบใช้แล้วทงิ้ขนาด 20-200 ไมโครลิตร หร ือพาสเจอร์ปิเปต · ถุงซิปล็อคพลาสติกสีชา · สารดูดความชื้น · เลือดจากปลายนิ้ ว หร ือเลือดจากหลอดทมี ี่สารกันเลือดแข็ง EDTA · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · ปฏิบติตาม ัข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลกัสากล ประกอบด้วย สวมใส่อุปกรณ์ป้องกัน อัันตรายส่่วนบุุคคลในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้ง ไ ้�ด้้แก่่ ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย หน้้ากากอนามััย และเสื้้�อกาวน์์ 5. ว ิธการี 1. สวมถุงมือก่อนจบกระดาษกรองัทุกครง เั้ พื่อป้องกันการปนเปื้อน 2. เขียนข้อมูลของตัวอย่างทเก็บใ ี่ห้ครบถ้วนเพื่อประโยชน์ของผู้ป่วย ดังรูปท 1ี่

54 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ รูปที่ 1: กระดาษกรองสำาหรับเก็บเลือดและการเขียนฉลาก 3. กรณีที่เจาะเลือดจากปลายนิ้ ว: เช็ดเลือดหยดแรกออกด้วยสำ ลีแห้ง บีบนิ้ วเบาๆให้เลือดเป็น หยดขนาดใหญ่ แตะหยดเลือดตรงกลางวงของกระดาษกรอง การหยดเลือดต้องหยดเพียง ด้านเดียวของกระดาษกรองและกระจายตัวสม่ำ เสมอ เมอได้เล ื่ อดเต็มวงกลมแล้วจึง ืหยดเลอดื ต่อไปในวงกลมท 2 และ 3 ี่ของกระดาษกรอง เม ื่อได้เลือดเพียงพอแล้ว ให้ใชส้ ำ ลีแห้งกดปาก แผลไว้จนกว่าเลือดจะหยุดไหล 4. กรณีใช้เลือดจากหลอด EDTA ใช้ไมโครปิเปตหร ือพาสเจอร์ปิเปตดูดเลือดจากหลอด ปร ิมาตร 50 ไมโครลิตร หยดลงบนกระดาษกรอง ตรงกึ่งกลางวงกลมทกำ ี่หนด จำ นวน 3 วง ไม่ใช้ปลาย ปิเปตทิปเกลี่ยหร ือสัมผัสกระดาษกรอง รูปที่ 2 : การเก็บเลือดบนกระดาษกรองและการทำาให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง 5. ตากกระดาษกรองเก็บเลอด โดยวางไว้ในล ืกษณะัทกระดาษกรองตี่ั้งขนเึ้ พื่อป้องกันการปนเปื้อน ห้ามนำ ไปตากแดดหร ือเป่าลมร้อน ดังรูปท 2 รอจนเล ี่ือดแห้งสนิทจึงพับเก็บใส่ถุงซิปล็อคทมี ี่ สารดูดความชื้นอยู่ กำ จดอากาัศภายในถุงออกให้มากที่สุด ปิดถุงให้สนิท จากนั้นเก็บรกษาัที่ อุณหภูมิห้อง ถ้าเก็บกระดาษกรองทเลี่ือดยังไม่แห้ง ทำ ให้มีเชื้อราและไม่สามารถตรวจได้

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 55 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · ขณะรอเลือดแห้ง ระวังฝุ่น หร ือแมลงต่าง ๆ มาตอม · ห้ามเขียนข้อความใด ๆ บนวงของหยดเลือด · หมั่นตรวจสอบให้แน่ใจว่ากระดาษกรองเก็บอยู่ในสภาวะทแี่ห้งสนิท โดยดูสีของสารดูดความชื้น หากสี เปลี่่�ยนไปแสดงว่่ามีีความชื้้�นเกิิดขึ้้�น ให้้เปลี่่�ยนสารดููดความชื้้�นใหม่่ · ห้ามใช้เลือดทเก็บด้วย ี่หลอดทมี ี่สารกันเลือดแข็งชนิดเฮปาร ิน 7. การควบคุมคุณภาพ · ตรวจสอบคุณภาพของการเก็บเลือดบนกระดาษกรอง โดยตรวจสอบการเขียนฉลากถูกต้อง และตรวจ สอบหยดเลืือดบนกระดาษกรองว่่าสามารถเก็็บเลืือดได้้เต็็มวงกลมทั้ง้�สามวง และเลืือดที่่�เก็็บได้้ซึึมถึึงด้้าน หลัังของกระดาษกรอง 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM-SOP-05: การเขียนฉลากฟิล์มเลือดมาลาเร ีย · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization [WHO]. (2015). National malaria slide bank standard operating procedures. Geneva. (in preparation).

56 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจางสำำหรัับใช้ย้้อมฟิิล์์มเลืือด MM-SOP-08 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายขั้้นตอนการเต�รี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจางจากสีียิิมซ่่าเข้้มข้้น เพื่่�อใช้ย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ีย 2. หลักการและเหตุผล แนะนำำ ให้้ใช้สี้ ียิิมซ่่าเจืือจางที่่�เตรี ียมใหม่่ก่่อนย้้อมทุุกครั้ง โดย ้�ต้้องเตรี ียมจากสีียิิมซ่่าเข้้มข้้นและสารละลาย ฟอสเฟตบััฟเฟอร์์ pH 7.2 เพื่่�อให้้ได้้ฟิิล์์มเลืือดคุุณภาพดีี การย้้อมสีียิิมซ่่าอาจใช้วิ้ธีิย้ี ้อมเร็็วโดยใช้สี้ ียิิมซ่่าเจืือจาง 10% หรื ือวิธีิย้ี ้อมช้้าโดยใช้สี้ ียิิมซ่่า 3% วิธีิย้ี ้อมแบบเร็็ว ใช้้ในกรณีีที่่ต้�้องการผลเร็็ว เช่่น ในคลิินิิกผู้้ป่่วยนอกที่่�ผู้้ป่่วยนั่่�งรอผล ตรวจ หรื ือ ในกรณีีที่่�แพทย์ต้์ ้องการผลเพื่่�อการรัักษา ส่่วนวิธีิย้ี ้อมช้้าจะใช้ย้้อมสีีจำำ นวนมาก เช่่น การย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือด ในการสำำ รวจทางระบาดวิทิยาหรื ืองานวิจััิยภาคสนาม การย้้อมสีีทุุกครั้งควร้�คำำ นวณปริ ิมาณสีียิิมซ่่าเจืือจางที่่�จะใช้้ให้้ เหมาะสมเพื่่�อไม่่ให้้เหลืือทิ้้ง � 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองมือ ื่ 3.1 การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง 10% · สียิมซ่าเข้มข้นทแบ่งออกมาจาก ี่ขวดใหญ่ ใส่ขวดสีชาขนาด 25 หร ือ 50 มิลลิลิตร · สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 · หลอดทดสอบทมี ี่ขีดบอกปร ิมาตร และมีฝาปิด ขนาดความจุ 10–15 มิลลิลิตร · หลอดหยดหร ือพาสเจอร์ปิเปต (Pasteur pipette) ขนาด 1 มิลลิลิตร 3.2 การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง 3% · สียิมซ่าเข้มข้นทแบ่งออกมาจาก ี่ขวดใหญ่ ใส่ขวดสีชาขนาด 25 หร ือ 50 มิลลิลิตร · สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 · กระบอกตวงที่สะอาด ขนาดความจุ 100–500 มิลลิลิตร · หลอดหยดหร ือพาสเจอร์ปิเปต ขนาด 1 มิลลิลิตร (Pasteur pipette) · แท่งแก้วสำหรบคนั 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · ปฏิบัติตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลักสากล ประกอบด้วย สวมใส่อุปกรณ์ป้องกัน อัันตรายส่่วนบุุคคลในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้ง ไ ้�ด้้แก่่ ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย และเสื้้�อกาวน์์

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 57 5. วิธีีิการ 5.1 การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง 10% ใช้สำ้ ำาหรัับการย้้อมที่่มีีจำาำนวนฟิิล์์มเลืือดน้้อย และต้้องการความรวดเร็็ว โดยฟิิล์์มเลืือด 1 แผ่่นจะใช้สี้ ียิิมซ่่าเจืือจาง 3 มิิลลิิลิิตร 5.2 การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง 3% สำำาหรัับใช้ย้้อมฟิิล์์มเลืือดแบบจุ่่ม ใช้้เวลาย้้อมนาน 45 - 60 นาทีี ใช้้ในกรณีี ที่่มีีจำาำนวนฟิิล์์มเลืือดตั้้งแต่่ 20 สไลด์์ ขึ้้นไป และเป็็นฟิิล์์มเลืือดที่่ต้้องแห้้งสนิิทซึ่่งมัักจะเก็็บไว้้ ประมาณ 1 - 3 วัันก่่อนย้้อม 5.3 สููตรการคำำานวณปริ ิมาณสีียิิมซ่่าเข้้มข้้นและสารละลายฟอสเฟตบััฟเฟอร์สำ์ ำาหรัับเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง การเตรี ียมสีียิิมซ่่าเจืือจาง 10% เพื่่อใช้ย้้อมสไลด์์ (ดููในภาคผนวกตารางที่่ 1) 1. ตวงสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ทเตร ียมไว้แล้ว ปร ิมาตร 97 มิลลิลิตรด้วยกระบอก ี่ ตวง ใส่ในบีกเกอร์หร ือภาชนะผสมสี 2. ใช้ปิเปตวัดปร ิมาตรทแี่ห้งและสะอาดดูดสียิมซ่าเข้มข้นทกรองแล้วปร ิมาตร 3 มิลลิลิตร ใ ี่ส่ลง ในละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ผสมให้เข้ากันโดยคนด้วยแท่งแก้ว 3. สียิมซ่าทเจี่อจางแล้วควรย้อม ื ทันที สีทไม่ได้ใ ี่ชห้ ร ือเตร ียมไว้นานแล้วให้ทงไป ไม่นำ ิ้ มาใช้ย้อม อีก (ประสิทธิภาพของสีย้อมจะลดลง และมีตะกอนสีเพิ่ มขึน้หลังจากเจอจางแล้ว) ื ปร ิมาณสียิมซ่าเข้มข้น = 0.3 ml x จำ นวนสไลด์ทต้องการย้อม ี่ ปร ิมาณของสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ = 2.7 ml x จำ นวนสไลด์ทต้องการย้อม ี่ 1. ใชพ้าสเจอร์ปิเปต ทแี่ห้งและสะอาด หยดสียิมซ่าเข้มข้นจำ นวน 9 หยด หร ือ 0.3 มิลลิลิตร ใน หลอดทดสอบทมี ี่ขีดบอกปร ิมาตร เติมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.2 ใส่ในหลอดจนปร ิมาตรทได้เ ี่ท่ากับ 3.0 มิลลิลิตรกรณี ไม่มีสารละลายบัฟเฟอร์ pH 7.2 สามารถใช้น้ำด ื่ มบรรจุขวดทมีจำ ี่หน่ายในท้องตลาดแทนได้ 2. ปิดฝาหลอด เขย่าเบาๆ ให้สีกับบัพเฟอร์ เข้ากัน อย่าให้มีฟองอากาศ 3. สียิมซ่าเจอจางืทเตร ียมแล้วใ ี่ห้ใชทั ้นที และควรใช้ย้อมสีภายใน 15 นาที สีทไม่ได้ใ ี่ชห้ ร ือเตร ียม ไว้นานแล้วให้ทงไป ไม่นำ ิ้ มาใช้ย้อมอีก 4. ในกรณีที่มีฟิล์มเลือดหลายแผ่น สามารถคำ นวนปร ิมาตรสีย้อมให้เพียงพอกับจำ นวนสไลด์ ที่ต้องการย้อม หร ือเพิ่ มปร ิมาตรสียิมซ่าเข้มข้นและสารละลายบัฟเฟอร์ตามสัดส่วนที่ระบุใน ตารางในภาคผนวก

58 การเตรยมสียิมซา่เจอจาื ง 3% เ อใชย้อ้มสไลด์จาํนวน 20-100 สไลด์ (ดใูนภาคผนวกตาราง 2) 6. ขอ้ควรระวงัเกยวขอ้งกับขนตอนการป ัฏิบตั ิงาน · ชนะ และหลอดแก้วทใีช้ต้องแห้งและสะอาด · สียิมซาเ่จอจางืเพียงครงเัดียวแล้วใชท้งัวัน เพราะสียมิซา่ทเตีร นจากอากาศ ได้รวดเรว็ทาํ ให้คุณสมบตั ิในการย ล์มเลือดจะติดสีไม่ดีฝ สีรุงบน้ผิวของสียิมซา่จะเกาะติด ฟล์มเลือด มีผลทาํ ให้อ่ล์มเลือดได้ยาก · แบง่สียมิซา่เข้มขน้ลงในภาชนะขนาด 25-50 มิลลิลิตร ห้ามดูดสียมิซา่เข้มขน้จากขวดใหญม่าใชโ้ดยตรง เพราะจะทาํ ให้เกิดการปนเ อนกับสียิมซา่ ในขวด 7. การควบคุมคุณภาพ · ควรใชส้ ียิมซา่เข้มข้นและสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรท์ ีผ่านการควบคุมคุณภาพแล้ว ดูรายละเอียด MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพ สียิมซา่เข้าขน้และสารละลายฟอสเฟตบพัเฟอร์ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบตั ิงาน เกยวขอ้ง · MM-SOP-02: การเตร สียมิซา่เข้มข้น · MM-SOP-03A: การเตร สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 7.2 · สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 7.2 ด้วยบัฟเฟอรช์นิดเม็ด · MM-SOP-03C: การควบคุมคุณภาพของสียมิซา่เข้มขน้และสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · MM-SOP-09: การยอ้มฟ ์มเลือดมาลาเร สียมิซ่า · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจมาลาเร อมาลาเร ทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. Centers for Disease Control and Prevention. (2013). Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria parasites. Retrieved December 14, 2015, from http://www.cdc.gov/dpdx/resources/ pdf/benchAids/malaria/malaria_staining_benchaid. pdf. ของสียมิซา่เข้มขน้ = 0.03 ml x ปร สียมิซา่เจอจางืสุดทา้ยทตี ของฟอสเฟตบัฟเฟอร์= 0.97 ml x ปร สียมิซา่เจอจางืสุดทา้ยทตี สียมิซา่เจอจางืสุดทา้ยทตีขนาดของภาชนะทใีชย้อ้มสี

59 10. ภาคผนวก ตาราง 1 การผสมสียิมซา่ 10% Giemsa ย้อมนาน 10 นาทีสําหรบักรณีที ู้ป ผลตรวจ ใชย้ล์มเลือด แบบห ล์ม จาํ ท ml /cc/ มล./มิลลิลิตร บพัเฟอร์pH 7.2 ml /cc/ มล./มิลลิลิตร 1 0.3 cc (9 หยด) 2.7 cc 3 2 0.6 cc (18 หยด) 5.4 cc 6 3 1 cc 9 cc 10 4 - 5 1.5 cc 13.5 cc 15 6 2 cc 18 cc 20 7 - 8 2.5 cc 22.5 25 9 - 10 3 cc 27 30 หมายเหตุ · ml ห ห หน่วยวัทเีทา่กันคือ มิลลิลิตร ในทนี ีเขยีนไวส้ ําหรบัผู้ใชง้านทไีม่คุ้น เคยกับคําว่ามิลลิลิตร แต่จะรูจ้กั cc ตารางที 2 การย ล์มเลือดมาลาเร จุม่ด้วยสียิมซา่ 3% Giemsa นาน 30 นาที 1 - 6 1.5 48.5 50 6 - 10 3 97 100 11 - 25 7.5 242.5 250.0 26- 50 15.0 485.0 500.0 51 - 100 30.0 970.0 1,000.0 หมายเหตุ · ควรใชภ้าชนะทีมีขนาดบรรจุใหญ่กว พราะสีจะไม่ท่วมฟ มเลือดต้องเพิม ปร ของสีย อให้ท ล์มเลือด · ml ห อ cc ห หน่วยวัมาตรทีเท่ากันคือ มิลลิลิตร ในทีนีเขียนไว้สําหรบัผู้ใชง้านทีไม่ คุ้นเคยกับคําว่ามิลลิลิตร แต่จะรูจ้กั cc ml /cc/มล./มลิลลิติร จาํ ท ml /cc/ มล./มิลลิลิตร บพัเฟอร์pH 7.2 ml /cc/ มล./มิลลิลิตร ml /cc/มล./มลิลลิติร

60 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ียด้้วยสีียิิมซ่่า (Giemsa) MM-SOP-09 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิิบายขั้้นตอนการ�ย้้อมฟิิล์์มเลืือดมาลาเรี ียด้้วยสีียิิมซ่่า (Giemsa) 2. หลัักการและเหตุุผล การย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือดที่่�ถููกต้้องจำำเป็็นต่่อการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ โดยเฉพาะการ วินิิิจฉััยแยกชนิิดของเชื้้�อมาลาเรี ียได้้อย่่างถููกต้้อง สีียิิมซ่่าเป็็นสีีที่่�แนะนำำ ให้้ใช้้เพราะให้้ผลน่่าเชื่่�อถืือที่่�สุุดในการย้้อม ฟิิล์์มหนาและบาง สีียิิมซ่่าประกอบด้้วยสีีอีีโอซิิน (eosin) และสีีเมทิลีิ ีนบลูู (methylene blue หรื ือ azure) ในการ ย้้อมสีียิิมซ่่า นิิวเคลีียสของเชื้้�อมาลาเรี ียจะติิดสีีแดงของอีีโอซิิน และไซโตพลาสซึึมจะติิดสีีน้ำ ำ เงิ ินของเมทิิลีีนบลูู การย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือดที่่มี�ทั้ี งฟิิ ้�ล์์มหนาและบางบนสไลด์์แผ่่นเดีียวกััน เฉพาะส่่วนของฟิิล์์มบางจะใช้้เมทานอลเพื่่�อตรึ ึงผนััง เม็็ดเลืือดไม่่ให้้แตกขณะย้้อมสีี ส่่วนฟิิล์์มหนาเม็็ดเลืือดแดงจะแตกออก และถููกกำำจััดฮีีโมโกลบิิน (de-hemoglobin) ขณะที่่ย้�้อม สีียิิมซ่่าเจืือจาง ที่่มี�ี ค่่า pH ที่่�เหมาะสมจะทำำ ให้้ stippling ของเชื้้�อมาลาเรี ียติิดสีีชััดขึ้้�น ทำำ ให้้การวินิิิจฉััย แยกชนิิดเชื้้�อมาลาเรี ียง่่าย และชััดเจน ทำำ ให้้ได้้ผลการวินิิิจฉััยที่่�ถููกต้้อง 3. วัสดุัุ อุุปกรณ์์ และเครื่ ่�องมืือ 3.1 การย้้อมสีีแบบเร็็ว (สีียิิมซ่่าเจืือจาง 10%) · สียิมซ่าเจอจาง 10% ื · ภาชนะขนาดเล็ก หร ือบีกเกอร์ หร ือหลอดทดลอง ขนาด 15 มิลลิลิตร ทมี ี่ขีดบอกปร ิมาตร สำหรบเตร ียม ัสี ยิิมซ่่าเจืือจาง · เมทานอลบร ิสุทธ (absolute methanol) ปรา ิ์ศจากอะซิโตน (acetone free) · พาสเจอร์ปิเปตแบบพลาสติก (Pasteur pipette) ขนาด 1 หร ือ 2 มิลลิลิตร มีสเกลบอกปร ิมาตร · ขวดแก้วทมีฝาปิดมิด ี่ชิดสำหรบใ ัส่เมทานอลบร ิสุทธิ์ · ถาดหร ือทวางี่สไลด์สำหรบย้อม ั · นาฬิกาจบเวลาั · ทตากี่สไลด์ · ไดร์เป่าผม · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · น้ำกลั่นหร ือน้ำทกี่ำจดไอออน (deionized water) ัทมี pH 7.2 ี่ 3.2 การย้้อมสีีแบบช้้า (สีียิิมซ่่าเจืือจาง 3 %) · สียิมซ่าเจอจาง 3% ื · ภาชนะขนาดเล็กหร ือบีกเกอร์สำหรบใ ัส่สียิมซ่าเจอจางื · เมทานอลบร ิสุทธปรา ิ์ศจากอะซิโตน · พาสเจอร์ปิเปตแบบพลาสติกขนาด 1 หร ือ 2 มิลลิลิตร มีสเกลบอกปร ิมาตร · ขวดแก้วทมีฝาปิดมิด ี่ชิดสำหรบใ ัส่เมทานอลบร ิสุทธิ์ · ภาชนะสำหรบย้อม ัสไลด์ (Coplin jar) ชนิดแนวตั้ง · ทตากี่สไลด์ · นาฬิกาจบเวลาั · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครงเดียว ั้ทงิ้ · น้ำกลั่นหร ือน้ำทกี่ำจดไอออน (deionized water) ัทมี pH 7.2 ี่

61 4. ขอ้ควรระวงัเพืลอดภัย • เมทานอลและสียิมซ่าสามารถติดไฟและมีความเป พิษสูง เม สูดดมหร กินเขา้ไป หลีกเลีสัมผัส และการสูดดม เม ม่ได้ใชค้วรเก็บในตู้ทลี ็อคได้ • ปฏบิตั ิตามข้อกําหนดการควบคมุการแพรก่ระจายเชืหลกัสากล ประกอบด้วย สวมใส่อปุกรณป์กัน อันตรายส่วนบุคคลในการปฏิบตั ิงานทกุครงัเชน่ถุงมือ แวน่ตานิรภัย และเสืน์ 5. วธกาีร 5.1 การยอ้มแบบเร็วด้วยสียิมซา่เจอจืาง 10% สําหรบงัานปกติ 1. แบ่งสียิมซา่เข้มข้น (Giemsa stock solution) ลงในขวดขนาดเล็ก และคํา สียิมซา่ความเข้มข้น 10% ให้เพียงพอกับจาํนวนสไลด์ทีต้องการย้อม ซงกาึรย้อมฟ ือด 1 แผ่น จะใชส้ ียอ้มประมาณ 3 มิลลิลิตร เม าไปยอ้มฟ ือดทนัที 2. ฟ อืดบางด้วย absolute methanol โดยใชพ้าส หยดเมทานอลลงบนฟ บาง ห ฟ ชนะทบรรีจุเมท ทีดังรูปที1 และต้อง ระมัดระวังไม่ให้เมทานอล สัมผัสกับฟ หนา เพราะเมทานอลห หยของเมทานอลจะ ฟ ือดหนา ทาํ ให้เม็ดเลือดแดงบนฟ หนาไม่แตกขณะยอ้มสี ปราศจากอะซโิตน 3. วางฟ ทีทานอลแล้วในแนวราบรอให้แห้งสนิท ใชเ้วลาประมาณ 2 นาทีไม่ ตากฟ อดื ในแนวตัง เพราะไอระเหยของเมทานอลบนฟ ฟ หนาทอียูบ่น สไลด์เดียวกัน ดังรูปท 2 การตาก ีสไลด์หลังจุม่เมทานอล 4. วางสไลด์บนตะแกรงยอ้ม โดยให้ด้านที ฟ ือดหงายขนึเวน้ระยะไม่ให้สไลด์ติดกัน 5. เทสียมิซา่เข้มขน้ 10% ลงตรงส่วนของฟ ือดบาง ชา้ๆ จนทว่มฟ ือดทงัฟ ฟ หนา ดังรูปที3 ไม่ควรเทสีลงบนฟ หนาโดยตรงเพราะอาจทาํ ให้ฟ ือดหลุด โดย ฟ ือด 1 แผ่นจะใชส้ ีประมาณ 3 มิลลิลิตร

62 1. แบง่สียมิซา่เข้มขน้ (Giemsa stock solution) ลงในขวดขนาดเล็ก คํา สียมิซ่า ความเข้มขน้ 3% ให้เพียงพอกับจํานวนสไลด์ทตี ้องการยอ้ม โดยคํานวณจากขนาดของภาชนะ ยอ้มและคํานวณให สีมากพอทว่มสไลด์ เม าไปยอ้มฟ ือดทันที 2. ฟ ทีละสไลด์ด้วย absolute methanol โดยจุ่ม ฟ ชนะทีบรรจุ เมท ที หลีกเลียงไม่ให้ฟ หนาสัมผัสกับเมทานอล เพราะเมทานอลหร�อ ไอระเหยของเมท ฟ หนาไว้กับสไลด์อย่างรวดเรว็ทําให้เม็ดเลือดแดงบนฟ หนาไม่แตกขณะยอ้มสียมิซ่า 6. ตังเวลายอ้มสีนาน 8 - 10 นาทีควรทดสอบเวลาทเีหมาะสมทใีชย้อ้มทกุครงัทมีการเปลี ียนสี ยมิซา่เข้มข้นชุดใหม่ 7. เมอครบเวลา ให้เทบัฟเฟอร์pH 7.2 อยา่งชา้ๆ ตรงตําแหนง่ ฟ อไล่สีออก จนบัฟเฟอร์ใส ดังรูปที 4 ยกสไลด์เทบัพเฟอร์ทิง ไม่เทสีออกจากสไลด์โดยตรง เพ ของสียิมซ่าจะ เกาะติดฟ ือด มีผลต่อการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ 8. วางแผ่นฟ อดบนืทตากีสไลด์ ในแนวตังโดยให้ฟ หนาอยูด่ ้านลา่ง ระวงัอยา่ ให้ฟ หนา ถูกขูดโดยขอบของทวางีสไลด์ 9. สีที มแล้วถ้าเหลือให้เททง ดิ ังนันควรผสมสีให้พอดีกับจํานวนฟ ทตี ้องการยอ้ม 5.2 การยอ้มแบบช้าด้วยสียิมซา่เจือจาง 3% สําหรับงานวจัยหร ต้องการยอ้มสไลด์จาํนวนมาก

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 63 3. วางฟิล์มบางที่ถูกตร ึงด้วยเมทานอลแล้วในแนวราบรอให้แห้งสนิท ใช้เวลาประมาณ 2 นาที ไม่ตากฟิล์มเลือดในแนวตั้ง เพราะไอระเหยของเมทานอลบนฟิล์มบางอาจไปตร ึงฟิล์มหนา ทอยู่บน ี่สไลด์เดียวกัน 4. หันสไลด์ด้านทไม่มี ี่ฟิล์มเลือดชนกัน วางสไลด์แต่ละคู่เสียบลงตามร่องในภาชนะย้อมสี ต้องให้ แน่ใจว่าฟิล์มเลือดไม่สัมผัสกัน และให้ด้านทมีฉลากอยู่ด้านบน ด ี่ังรูปท 5 ี่ รูปที่ 5: การวางฟิล์มเลือดในภาชนะย้อมสี 5. ค่อย ๆ เทสีย้อมตรงมุมของภาชนะย้อมสี ให้ท่วมฟิล์มเลือด ไม่เทตรงฟิล์มหนาโดยตรงเพราะ อาจทำ ให้ฟิล์มหนาหลุดออก 6. ตั้งเวลาย้อมสีนาน 45-60 นาที (ควรทดสอบเวลาทเี่หมาะสมทจะใ ี่ช้ย้อมทุกครงั้ทมีการเปลี ี่ยน่ สียิมซ่าเข้มข้นชุดใหม่) 7. เมอครบเวลาย้อม ล้าง ื่ สีโดยใช้วิธีเทบัพเฟอร์อย่างช้า ๆ ตรงมุมของภาชนะย้อมสี ไม่ให้โดนแผ่น ฟิล์มโดยตรง จนล้นชะล้างสีส่วนเกินออกหมด เม ื่ อสีของบัฟเฟอร์ใสแล้ว ค่อยๆ เทบัฟเฟอร์ที่ เหลือออกจากภาชนะย้อมจนหมด 8. ย้ายฟิล์มเลือดทีละแผ่นอย่างระมัดระวัง วางแผ่นฟิล์มเลือดบนทตากี่สไลด์ในแนวตั้ง โดยให้ ฟิล์มหนาอยู่ด้านล่าง ระวังอย่าให้ฟิล์มหนาถูกขูดโดยขอบของทวางี่สไลด์ รอจนสไลด์แห้งจึง นำ มาตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ ดังรูปท 2ี่ 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · การใช้บัฟเฟอร์ล้างสไลด์: pH ของน้ำทใี่ช้ล้างสไลด์มีความสำคัญ บัฟเฟอร์ทเป็นกรดจะ ี่ทำให้ฟิล์มทย้อม ี่ มีีสีีจางลง บััฟเฟอร์ที่่ ์ �ใช้ล้้างสไลด์์จะต้้องมีี pH 7.2 เท่่ากัับบััฟเฟอร์ที่่ ์ �ใช้ผส้มสีีย้้อม · ในกรณีที่ไม่มีบัพเฟอร์ในการผสมและล้างสียิมซ่า ให้ใชน้ำด ื่ มสะอาดที่มีค่าความเป็นกรดด่างเท่ากับ บััพเฟอร์์ pH 7.2 · การดูแลเคร ืองแก้วและเคร ื่องม่ือทใี่ช้วัดปร ิมาตร: กระบอกตวง ปิเปต ภาชนะย้อมสี และบีกเกอร์ต้อง สะอาดและแห้้งก่่อนใช้ทุุ้กครั้ง ภา้�ชนะและอุุปกรณ์์ต่่าง ๆ ที่่�ใช้ย้้อมสีียิิมซ่่าควรล้้างด้้วยน้ำ ำ สะอาดทัันทีี เพื่่�อกำำจััดสีีย้้อมที่่ติ�ิดอยู่่ออกให้้ได้้มากที่่สุ�ุด แล้้วจึึงนำำ ไปแช่่ในน้ำ ำ ผสมสบู่่หรื ือผงซัักฟอกอ่่อน ๆ ก่่อนล้้าง แล้้วล้้างสบู่่หรื ือผงซัักฟอกออกให้้หมดด้้วยน้ำ ำ สะอาดก่่อนทำำ ให้้แห้้งสนิิท สบู่่หรื ือผงซัักฟอกที่่�เหลืือติิด ภาชนะแก้้วหรื ือพลาสติิกอาจทำำ ให้้ pH ของน้ำ ำ และสีีย้้อมเปลี่่�ยนแปลงได้้ ส่่งผลต่่อการย้้อมครั้ง้�ต่่อไป · ระหว่างการย้อมสียิมซ่าไม่ว่าจะเป็น 3% หร ือ 10% จะมีฝ้าสีเขียวโลหะเกิดขึนบร ิเวณ้ผิวน้ำ ต้องระวังไม่ ให้้ฝ้้าที่่�เกิิดขึ้้�นติิดฟิิล์์มเลืือดระหว่่างการล้้างสีีออกจากฟิิล์์มเลืือด เนื่่�องจากจะรบกวนการตรวจฟิิล์์มเลืือด

64 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ · เม ื่อเตร ียมฟิล์มเลือดเสร็จควรย้อมสีทันที การเก็บฟิล์มเลือดทยี่ังไม่ได้ย้อมไว้นาน 2-3 วัน ในทร้อนและ ี่ ชื้้�นจะทำำ ให้้เกิิดการตรึ ึงฟิิล์์มเลืือดโดยอััตโนมััติิ ทำำ ให้้ฟิิล์์มหนาใช้้ไม่่ได้้ 7. การควบคุมคุณภาพ · การตรวจสอบคุณภาพของฟิล์มเลือดหลังย้อมสี ตามที่ระบุใน MM-SOP-03C และตรวจสอบว่าฟิล์ม เลืือดหลัังย้้อมแล้้วต้้องไม่่มีีตะกอนสีี 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM–SOP-03C: การควบคุมคุณภาพสียิมซ่าเข้มข้นและสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ · MM–SOP-08: การเตร ียมสียิมซ่าเจอจางื สำหรบใ ัช้ย้อมฟิล์มเลือด · MM–SOP-13 : ความปลอดภัยในการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. Storey J. (2012). Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. (unpublished).

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 65 การตรวจวินิิิจฉััยเชื้อมา้�ลาเรียในฟิิ ีล์มหนาแ์ละบาง MM-SOP-10 1. วัตัถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิิบายขั้้นตอนการตรวจ�หาเชื้้อและชื้้�จำำแนกชนิิดเชื้้อมาลาเ�ชื้้รียอีย่างถููก่ต้้องด้้วยกล้อง้จุุลทรรศน์์ จากฟิิล์ม์ เลืือดที่่ย้�้อมสีียิิมซ่า ่ 2. หลักการแัละเหตุุผล การตรวจวินิิิจฉััยชนิิดเชื้้�อมาลาเรี ียและระยะที่่พ�บ รวมทั้งการตรวจ้�นัับความหนาแน่่นของเชื้้�อมีีความสำำคััญ ต่่อการรัักษาผู้้ป่่วยมาลาเรีย การีศึกษาประ ึสิทิ ธิิภาพยารัักษามาลาเรีย การสำำ ีรวจทางระบาดวิทิยา ตลอดจนการควบคุมโรคุ ดัังนั้้�น ผลการตรวจวินิิิจฉััยและการนัับจำำนวนเชื้้อ�จึงึต้้องถููกต้้อง นอกจากนี้้� เจ้า้หน้้าที่่ตรวจฟิิ�ล์์มเลืือดจะต้้องรายงาน ถ้้าหากพบว่าในฟิิ ่ล์์มเลืือดมีีเชื้้อ�อื่่�นที่่พ� บได้้ในเลืือด เช่่น พยาธิิโรคเท้า้ช้าง ้ 3. วัสดุัุอุุปกรณ์์ และเครื่�อง่มืือ · กล้องจุลทรรศน์ เลนส์ตากำลังขยาย 10 เท่า เลนส์วัตถุกำลังขยาย 10 เท่า 40 เท่า และ 100 เท่า · ฟิล์มเลือดย้อมด้วยสียิมซ่า · อิมเมอร์ชั่นออยคชัุ่ณภาพสูง · กระดาษเช็ดเลนส์ · ปากกาและดินสอ · แบบฟอร์มรายงาน รว.1: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการตรวจโล ัหิตหาเชื้อมาลาเร ีย และแบบฟอร์ม MM-01: บนัทกึ รายละเอีียดการตรวจฟิิล์์มเลืือด 4. ข้้อควรระวังเัพื่่�อความปลอดภััย · ปฏิบตั ิตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลกัสากล เมื่อทำงานในห้องปฏิบตั ิการ ด้วยการ สวมใส่่อุุปกรณ์์ป้้องกัันอัันตรายส่่วนบุุคคลในการปฏิิบััติ ิงานทุกคุรั้ง เช่้�่น ถุุงมืือ และเสื้้�อกาวน์์ 5. วิธีีิการธีี 5.1 การตรวจฟิิล์์มหนา 1. วางฟิล์มเลือดทย้อม ี่สียิมซ่าลงบนแท่นวางสไลด์ ให้ด้านทเี่ขียนฉลากอยู่ซ้ายมือ ปรบตั ำแหน่ง ของฟิล์มหนาให้ตรงกับเลนส์วัตถุกำลังขยาย 10x (10 เท่า) 2. เปิดไฟกล้องจุลทรรศน์ ปรบคัวามสว่างให้พอเหมาะ เลอน ื่ แทนวาง่สไลด์โดยปรบใัห้ฟิล์มเลอดื หนาอยู่ตรงกลางบร ิเวณทแี่สงผ่าน 3. ปรบัหาระยะคมชัดของภาพโดยการมองผ่านเลนส์ตาและเลนส์วัตถุกำลังขยาย 10x 4. เล ื่ อนเลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยาย 4x มาแทนทเลนี่ส์ 10x หยด immersion oil 1 หยด ลงบน ฟิล์มหนา ระวังไม่ให้ปลายของหลอดหยดสัมผัสฟิล์มเลือด แล้วหมุนเปลี่ยนเลนส์ใกล้วัตถุเป็น oil-immersion lens (เลนส์ 100x) ตรวจดูให้ผวิหน้าของเลนส์สัมผัสกบัหยด immersion oil 5. หมุนปุ่มปรบละเอั ียด เพื่อใหเ้หน็สวนประกอบต่าง ๆ ่ของเลอดอยื ่างชัดเจน ประเมินความเหมาะสม ของฟิล์มเลือด โดยฟิล์มหนาทดี่ีควรจะมีจำ นวนเม็ดเลือดขาว 10–20 เซลล์/วงกล้อง

66 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ข้อสังเกต: ในกรณีที่ฟิล์มเลือดมีจำ นวนเม็ดเลือดขาวน้อยกว่า 10 เซลล์/วงกล้อง ควรตรวจ มากกว่า 100 วงกล้อง เพื่อให้ใด้จำ นวนเม็ดเลอดืขาวทตรวจี่ทัง้หมดใกล้เคียงกับฟิล์มมาตรฐาน เช่น เพิ่ มเป็น 150 ถึง 200 วงกล้อง 6. ตรวจดูฟิล์มเลอดโดยปร ืบัหมุนวงกล้องและเลอน ื่ สไลด์อย่างเป็นระบบ เร ิมจากมุม่ซ้ายบนของ ภาพทเี่ห็นในกล้องจุลทรรศน์ ตามลูกศร ตรวจหาเชื้อในแต่ละวงกล้องเร ิมจาก่ขอบวงกล้องเข้า มา จากนั้นเล ื่อนไปวงกล้องถัดไปทางขวาทีละวงกล้องตามรูปท 1 ี่ รูปที่ 1 : การตรวจหาเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนา 7. ในขณะทตรวจ ี่หากภาพไม่ชัดเจน ควรปรบความคมั ชัดของภาพด้วยปุ่มปรบละเอียด เ ั พื่อให้การ ตรวจฟิล์มเลือดมีประสิทธิภาพยิง่ขึน ้ 8. ในฟิล์มหนา ต้องตรวจดูอย่างน้อย 100 วงกล้อง ก่อนท่จะรายงานีผลว่าไม่พบเชื้อมาลาเร ีย (No Malaria Parasite Seen; NMPS) หากทำ ได้ควรตรวจทัว่ทัง้ฟิล์มหนา 9. หากตรวจพบเชื้อมาลาเร ียแล้ว ต้องตรวจเพิ่ มอีกอย่างน้อย 100 วงกล้อง เพื่อยืนยันชนิดเชื้อ และให้แน่ใจว่าไม่มีการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งชนิด 10.ควรตรวจยืนยันชนิดของเชื้อด้วยฟิล์มบางทุกครง เนั้ ื่ องจากสามารถมองเห็นลักษณะของเม็ด เลือดแดงและตัวเชื้อได้ชัดเจนกว่าฟิล์มหนา 11. จำ แนกชนิดเชื้อตามคู่มือ WHO bench aids for the diagnosis of malaria 1. หลังจากตรวจหาเชื้อด้วยฟิล์มหนาแล้ว ต้องตรวจฟิล์มบางเพื่อยืนยันชนิดเชื้อและการติดเชื้อ ผสม 2. เล ื่ อนเลนส์ใกล้วัตถุกำ ลังขยาย 4x มาแทนทเลนี่ส์ 100x เลื่ อนแท่นวางสไลด์โดยปรบใ ัห้ฟิล์ม เลือดบางอยู่ตรงกลางบร ิเวณทแี่สงผ่าน 3. หยด immersion oil 1 หยด ลงบนฟิล์มบาง ระวงไม่ใ ัห้ปลายของหลอดหยดสัมผัสฟิล์มเลือด แล้วหมุนเปลี่ยนเลนส์ใกล้วัตถุเป็น 100x ปรบภาัพในวงกล้องให้ชัดโดยใช้ปุ่มปรบละเอียด ั 4. เลอน ื่ ฟิล์มบางไปบร ิเวณปลายสไลด์ บร ิเวณทเม็ดเล ี่อดแดงเร ียงต ื ัวต่อเนื่ องกันและมีการซ้อน ทับกันเพียงเล็กน้อย ดังรูปท 2ี่ 5.2 การตรวจฟิิล์์มบางเพื่่อยืืนยัันชนิิดเชื้้อและการติิดเชื้้อมากกว่่าหนึ่่งชนิิด

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 67 รูปที่ 2: บร ิเวณที่เหมาะสมสำาหรับตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มบาง 5. เร ิมตรวจ่หาเชื้อจากด้านบนซ้ายของภาพทเี่ห็นในกล้องจุลทรรศน์ ตรงบร ิเวณทเลี่ือกในข้อ 4 โดยปรบัหมุนวงกล้องและเลื่ อนสไลด์อย่างเป็นระบบทีละวงกล้องต่อเนื่ องกันไป ตามรูปที่ 3 ตรวจดูจนสามารถยืนยันการพบเชื้อมาลาเร ียและจำ แนกชนิดได้ รูปที่ 3: การตรวจหาเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มบาง 6. จำ แนกชนิดเชื้อตามคู่มือ WHO bench aids for the diagnosis of malaria 7. บันทึกผลการตรวจในแบบรายงานผลการตรวจ เช่น แบบฟอร์ม รว 1.: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการั ตรวจโลหิตหาเชื้อมาลาเร ีย และแบบฟอร์ม MM-01: บันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด หร ือแบบฟอร์มเฉพาะของห้องปฏิบัติการแต่ละแห่ง 8. เมอใ ื่ ช้กล้องจุลทรรศน์เสร็จแล้ว จะต้องเช็ด immersion oil ออกจากเลนส์ทุกครงด้วยกระดาษ ั้ เช็ดเลนส์ การเช็ดให้ใช้วิธีเช็ดแบบปาดออก ไม่ใช้วิธถี ูเป็นวงกลมเพราะจะทำ ให้เลนส์เป็นรอย 9. สำหรบั ฟิล์มเลือดที่ตรวจวินิจฉัยแล้ว ให้วางคว่ำ ลงบนกระดาษ A4 ที่สะอาด ไม่มีตัวหนังสือ เพื่อซับ immersion oil ออกจนหมด ดังรูปท 4ี่ รูปที่ 4: การวางฟิล์มเลือดที่ตรวจว ินิจฉัยเสร็จแล้วให้คว่ำาหน้าลงบนกระดาษ A4 เพื่อซับ immersion oil

68 6. ขอ้ควรระวงัเกยวขอ้งกับขนตอนการป ัฏิบตั ิงาน · ก่อนวางสไลด์บนแทน่วางวัตถุ ตรวจสอบให้แน่ใจวา่ ฟ ์มเลือดอยูด่ ้านบน · หยด immersion oil ให้พอเหมาะไม่มากห พราะถ้าน้อยเกินไปมีผลต่อความคมชดัของ ภาพ แต่ถ้ามากเกินไปทาํ ให้immersion oil เขา้ไปสะสมภายใน oil immersion lens ทาํ ให้เลนส์เสื 7. การควบคุมคุณภาพ · ห้องปฏิบตั ิการทตีรวจวัยมาลาเร ทรรศน์ควรเขา้รว่มระบบประกันคณุภาพ โดยการส่ง ตรวจส ล์มเลือดซา (Cross-checking) กับหน่วยงานทมี ีผู้เชยีวชาญทไีด้รบัการรบรองัการประเมิน สมรรถนะจากองค์การอนามัยโลกระดับ External Competency Assessment ระดับ 1 หรอ ระดับ 2 หรอผ่านการประเมินสมรรถนะจากศูนยอ์ ้างอิงทางห้องปฏิบัติการ National Competency Assessment ระดับ A หร�อ ระดับ B (ดูรายชืด้จากหน้า website) 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบตั ิงาน เกยวขอ้ง · MM-SOP-12: การบันทกึและรายงานผัยเ อมาลาเร ทรรศน์ · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว ัยเ อมาลาเร ทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization. (1997). Bench aids for the diagnosis of filarial infection. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2009). Bench aids for malaria diagnosis. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2015). Quality assurance manual for malaria microscopy. Second edition. Geneva: WHO Press. 10. ภาคผนวก · ผังขันตอนการตรวจวัยแยกชนิดของเ อมาลาเร ฟ ์มบาง · ผังขันตอนการตรวจวัยแยกชนิดของเ อมาลาเร ฟ ์มหนา

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 69 ผังขันตอนการตรวจว ินิจฉัยแยกชนิดของเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มบาง ้

70 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพผังขันตอนการตรวจว ินิจฉัยแยกชนิดของเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนา ้

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 71 การนับจำนวนเชอมาื้ลาเร ีย MM-SOP-11 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายวิธีิีการนัับจำำนวนเชื้้�อมาลาเรี ียในฟิิล์์มเลืือดหนาและบาง 2. หลักการและเหตุผล ความหนาแน่่นของเชื้้�อมาลาเรี ียเป็็นข้้อมููลที่่�ใช้้ประเมิินความรุุนแรงของการติิดเชื้้�อและการตอบสนองต่่อการ รัักษา การนัับจำำนวนเชื้้�อมาลาเรี ียจะนัับเฉพาะระยะไม่่มีีเพศ แต่่การรายงานผลผู้้ป่่วยพบเชื้้�อ P. falciparum จะต้้อง รายงานการพบเชื้้�อระยะมีีเพศด้้วย (ถ้้าพบ) กรณีีพบการติิดเชื้้�อมากกว่่าหนึ่่�งชนิิด ต้้องรายงานชนิิดเชื้้�อที่่พ�บทุุกชนิิด แต่่การนัับความหนาแน่่นของเชื้้�อให้้นัับรวมกััน การนัับความหนาแน่่นของเชื้้�อส่่วนใหญ่่จะนัับจากฟิิล์์มหนา ยกเว้้นกรณีีไม่่มีีฟิิล์์มหนาหรื ือเกิิดความเสีียหาย จนไม่่สามารถนัับจำำนวนเชื้้�อได้้ ก็็ให้้นัับความหนาแน่่นของเชื้้�อในฟิิล์์มบางแทน นอกจากนี้้� เมื่่�อจำำนวนเชื้้�อในฟิิล์์มหนา มากกว่่า 100 ตััว/วงกล้้อง (ซึ่่�งเท่่ากัับปริ ิมาณเชื้้�อมากกว่่า 80,000 ตััวต่่อเลืือดหนึ่่�งไมโครลิิตร) ก็็ให้้นัับจำำนวนเชื้้�อใน ฟิิล์์มบางแทนเช่่นกััน 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองมือ ื่ · กล้องจุลทรรศน์ มีเลนส์ตากำลังขยาย 10x เลนส์วัตถุกำลังขยาย 10x 40x และ 100x · เคร ืองกดน่ับแยกชนิดเซลล์ (differential cell counter) 1 อัน หร ือเคร ืองกดน่ับจำนวน (key tally counters) จำำ นวน 2 อััน อัันหนึ่่�งใช้นัั้บจำำนวนเชื้้�อมาลาเรี ีย และอีีกอัันหนึ่่�งใช้นัั้บจำำนวนเม็็ดเลืือดขาว · ฟิล์มเลือดย้อมสียิมซ่า · อิมเมอร์ชั่นออย (Immersion oil) คุณภาชั่พสูง · กระดาษเช็ดเลนส์ · ปากกาและดินสอ · เคร ืองคิดเล่ข · แบบฟอร์มรายงาน รว.1: ระเบียนผู้ป่วยได้รบการตรวจโล ัหิตหาเชื้อมาลาเร ีย · แบบฟอร์ม MM-01: บันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · ปฏิบติตาม ัข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลกัสากล ประกอบด้วย สวมใส่อุปกรณ์ป้องกัน อัันตรายส่่วนบุุคคลในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้ง เช่่น ้�ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย หน้้ากากอนามััย และเสื้้�อกาวน์์ 5. ว ิธการี 5.1 การนัับและการคำำานวณความหนาแน่่นของเชื้้อในฟิิล์์มหนา 1. ก่อนเร ิมน่ับจำ นวนเชื้อ ต้องตรวจหาเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาก่อน โดยตรวจอย่างน้อย 100 วง กล้อง ทกำ ี่ลังขยายของกล้องจุลทรรศน์เท่ากับ 1,000 เท่า 2. วางแผ่นสไลด์ลงบนแท่นวางสไลด์ของกล้องจุลทรรศน์ หันสไลด์ด้านทเี่ขียนรหัสไว้ด้านซ้าย 3. การนับจำ นวนเชื้อให้นับเฉพาะเชื้อระยะไม่มีเพศ (trophozoites และ schizont) ทังการติด้ เชื้อชนิดเดียวและการติดเชื้อผสม แต่การรายงานผลเม ื่ อพบเชื้อชนิด P. falciparum ต้อง รายงานการพบเชื้อระยะมีเพศด้วย ในการติดเชื้อผสมให้นับจำ นวนเชื้อระยะไม่มีเพศของเชื้อ ทุกชนิดรวมกัน พร้อมทังรายงาน้ชนิดเชื้อที่พบทุกชนิด

72 4. มจากมุมซา้ยบนของภาพทเีห็นในกลอ้งจุลทรรศน์เลอืกวงกลอ้งทมี ีทงัเม็ดเลอืดขาวและเชอ ในวงกล้องเดียวกั ้องแรก นับจาํนวนเ อมาลาเรือดข องนับ จาํนวน ตามรูปท 1ี ร านวนเม็ดเลือดขาว 10–20 เซลล์ 5. ใช้องกดนับแยกชนิดเซลล์กําหนดตําแห ทจีะนับจาํนวนเ อ ทจีะนับจาํนวน เมด็เลอืดขาว ถ้าใช้องกดนับจาํนวนก็ใชอ้ ันหนึงสําหรบันับจาํนวนเ อ และอกีอันหนึงสําหรบั นับจาํนวนเม็ดเลือดขาว 6. หลงัจากนบัจาํนวนเ อมาลาเร อืดขาวทงัหมดในวงกลอ้งแรกแลว้เลอืนขา้มวงกลอ้ง เ อใหก้ารนบักระจายทวัฟลม์ โดยเลอืนประมาณ 3-5 วงกลอ้ง ในทศิทางตามทแีสดงในรปูที2 7. การหยุดนับจาํนวนเ อมาลาเร ห้ใชเ้กณฑ์ดังนี · เมอนับจํานวนเ อได้มากกวา่ห ทา่กับ 100 ตัวต่อ 200 เม็ดเลือดขาว สามารถหยุด นับและรายงานผลเป จาํนวนเชอืต่อเม็ดเลือดขาว 200 เซลล์ · ถ้านับเ อมาลาเรัวต่อ 200 เม็ดเลือดขาว ให้นับเ อต่อไปจนนับเม็ด เลือดขาวได้ครบ 500 เซลล์ (ดูรูปท 2 ีผังวธกีารนับเชอมืาลาเรย) 8. นับจาํนวนเ อมาลาเรือดขาวทังหมดในวงกล้องสุดท้าย แม้ว่าจะนับจาํนวนเม็ด เลือดขาวได้เกิน 200 ห ซลล์เชน่เมอนับถึงวงกล้องสุดทา้ยแล้วได้จาํนวนเม็ดเลือด ขาวรวม 210 เซลล์ก็ต้องใชเ้ลข 210 สําหรบการคั ํานวณตามสูตรด้านล่าง

73 5.2 การนับและการคํานวณความหนาแน่นของเ อในฟล์มบาง 9. บนัทึกผลการตรวจในแบบฟอรม์รว.1 ระเบยีนผ บการตรวจโล ัหิตหาเ แบบฟอรม์ MM-01: บันทกึรายละเอียดการตรวจฟ ือด 10.การคํานวณความหนาแน่นของเ อ ใชจ้าํนวนเ อทนี ับได้หารด้วยจํานวนเม็ดเลือดขาวทนี ับได้ คูณด้วยเม็ดเลือดขาวต่อเลือด 1 ไมโครลิตรของผังนี: จํานวนเ อ x จํานวนเม็ดเลือดขาว/μL จํานวนเ อต่อเลือด 1 ไมโครลิตร (μL) = จํานวนเม็ดเลือดขาวทนี ับได้ หมายเหตุ : หากไม่ทราบค่าทแีท ห้ใชค้ ่าประมาณของเม็ดเลือดขาวปกติ คือ 8,000 เซลล์/ เลือด 1 ไมโครลิตร ตัวอยา่ง: เมอนับจํานวนเม็ดเลือดขาวรวมทังหมดได้ 210 เซลล์ และนับจํานวนเ อได้ 105 ตัว แต่ไม่ทราบค่าเม็ดเลือดขาวต่อไมโครลิตรเลือด จะคํานวณความหนาแน่นของเ อได้ ดังนี 105 x 8,000 จํานวนเ อต่อเลือด 1 μL = =4,000 210 1. ถ้านับจํานวนเ ฟ หนาได้มากกวา่ 100 ตัวในแต่ละวงกล้อง ทกํ ีาลังขยายของ กล้องจุลทรรศน์ 1,000 เทา่ ให้นับจํานวนและคํานวณความหนาแน่นของเ อจากฟ 2. ใช องกดนับแยกชนิดเซลล์ กําหนดตําแห ทจะนี ับจํานวนเม็ดเลือดแดงทติดเ ีอและ ทีจะนับจํานวนวงกล้อง ถ้าใช องกดนับจํานวนก็ใช้อันหนึงสําหรบนั ับจํานวนเม็ดเลือด แดงทติดเ ี อ และอีกอันหนึงสําหรบนั ับจํานวนวงกล้อง 3. เลอนฟ สไลด์ เลืทเม็ดเล ี ื ัวส าเสมอ อาจซอ้น ทับกันได้เล็กน้อย นับจํานวนเม็ดเลือดแดงได้ประมาณ 250 เซ มนั กล้องแรก ดังรูปท 3ี านวนเม็ดเลือดแดงเหมาะสมสําหรบัการนับ 4. นับจํานวนเม็ดเลือดแดงทีมีเ พศ ถ อผสม ให้นับจํานวน เมด็เลอดแดงืทมีเีอระยะไมม่เีพศของทุกชนดิรวมกัน รายงานชนดิเ ทีบและความ หนาแน่น 5. หลังจากนับจํานวนเม็ดเลือดแดงทติดเ ีอทังหมดในวงกล้องแรกแล้ว ให้เลอนไปนับวงกล้อง ถัดไปในทศทิางตามทแีสดงในรูปท 4ี

74 6. เมอนับได้อยา่งน้อย 20 วงกลอ้ง ซงึมีเม็ดเลือดแดงรวมกันประมาณ 5,000 เซลล์ให้หยุดนับ และบนัทึกผลจาํนวนเม็ดเลือดแดงทตี ิดเ อ นําค่าทไีด้มาคํานวณจาํนวนเ อทงัหมดต่อเลือด 1 ไมโครลิตรตามสูตรต่อไปนี จาํนวนเมด็เลอืดแดงทตีดิเ อ x จาํนวนเมด็เลอืดแดงตอ่เลอืด 1 μL จาํนวนเ อต่อเลือด 1 μL = จาํนวนวงกล้อง x 250 หมายเหตุ: หากไม่ทราบค่าทแีท ห้ใชค้ ่าประมาณของเม็ดเลอืดแดงปกติคือ 5,000,000 เซลล์ /เลือด 1 ไมโครลิตร 6. ขอ้ควรระวงัเกยวขอ้งกับขนตอนการป ัฏิบตั ิงาน · ก่อนนับเ อให้ตรวจสอบคุณภาพข องนับ และปรบัตัวเลข องนับจํานวนให ทุกครง ั น่ใจว่าค่าทนี ับได้เ มต้นจาก 0 · การเลอนสไลด์ต้องระมัดระวังไม่ให้วงกล้องทับซอ้นกัน ห อนวงกล้องกลับมานัทีูกนับไป แล ป กันการนับเชืม็ดเลือดทีนับไปแล า · กรณีทมี ีจํานวนเม็ดเลือดขาวในฟ หนาน้อยกวา่ 200 เซลล์ ให้นับเ อในฟ 7. การควบคุมคุณภาพ · ห้องปฏิบตั ิการที ัทรรศนเ์ขา้รว่มระบบประกันคณุภาพ เชน่การส่งตรวจ ส ลม์เลืา (Slide cross-checking) ไปยงัหนว่ยงานทมี ีผเู้ชีชาญทีด้รบัการรบัรองการประเมิน สมรรถนะขององค์การอนามัยโลกระดับ 1 - 2 หร รบรองัการประเมินสมรรถนะจากกรมควบคมุโรค ระดับ A – B หร มินสมรรถนะโดยใชชุ้ดทดสอบมาตรฐาน (Proficiency testing) ของ กรมควบคุมโรค เชน่ห้องปฏิบตั ิการทางการแพทย์สํานักงานป กันควบคมุโรคที

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 75 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มเลือดหนาและบาง · MM-SOP-12: การบันทึกและรายงานผลการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization. (2009). Bench aids for malaria diagnosis. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2015). Quality assurance manual for malaria microscopy. Second edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva: WHO Press.

76 การบันทึกและรายงานผลการตรวจวนิจฉยัเชอมาืลาเรย ด้วยกลอง้จุลทรรศน ์ MM-SOP-12 1. วตัถุประสงค์ นตอนการบันทกึและการรายงานผ ล์มเลือดหาเชอมืาลาเรยด้วยกล้องจุลทรรศน์ 2. หลกกัารและเหตุผล การบันทึกและการรายงานผลการตรวจวนิจฉัยเชอมาลืาเรยด้วยกล้องจุลทรรศน์มีความสําคัญมากต่อการ รกัษาผู้ป ละใชเ้ป ข้อมูลการเฝาระวังโรค การติดตามประเมินผล และการวางแผนการดําเนินงานควบคุมโรค ไขม้าลาเรย 3. วสัดุอุปกรณ์ และเคร มือ · แบบฟอรม์รายงาน รว.1: ระเบยีนผูบัการตรวจโลหิตหาเ อมาลาเร ฟอรม์ MM-01: บนัทกึ รายละเอีล์มเลือด · ปากกาและดินสอ · · องคิดเลข สําหรบคั ํานวณความหนาแน่นของเ อ 4. ขอ้ควรระวงัเพือความปลอดภัย ไม่มี การี · เมอตรวจวัยเ อมาลาเรันทึกผลการตรวจลงในแบบบันทึกผ แบบฟอรม์รว.1: ระเบียนผู้ป ด้รบัการตรวจโลหิตหาเชอืมาลาเรย และแบบฟอรม์ MM-01: บันทึก รายละเอีล์มเลือด · ในแบบฟอรม์ ให้บันทกึรหัสผันเดืทตรวจีเ อมาลาเร ทุกชนิดทีบ ระยะทีบ และจํานวนเ อ ทนี ับได้ การรายงานควรเป รูปเดียวกัน เช่น · พบเ อมาลาเร ชนิด P. vivax ระยะ trophozoites ความหนาแน่นเ อ 35,000 ตัวต่อเลือด 1 ไมโครลิตร · พบเ อมาลาเร ชนิด P. falciparum ระยะ trophozoites ความหนาแน่นของเ อ 42,000 ตัวต่อ เลือด 1 ไมโครลิตร · พบเ อมาลาเร ชนิด P. falciparum ระยะ gametocytes · ไม่พบเ อมาลาเร ห้รายงานวา่การตรวจให้ผลลบ ห negative · เมอตรวจพบระยะ Schizonts ของ P. falciparum จะต้องรายงานด้วย เพัวบง่ชความรีุนแรง ของโรค · หลังนับจํานวนเ อมาลาเรํานวนเม็ดเลือดขาวในฟ ์มหนาแล้ว การคํานวนความหนาแน่นของเ อจะ ถูกต้องถ้าทราบความหนาแน่นของเม็ดเลือดขาวทีแท้จรงของผู้ป หากไม่ทราบค่าทีแท้จรงให้ใชค้ ่า ประมาณของเม็ดเลือดขาวปกติคือ 8,000 เซลล์/เลือด 1 ไมโครลิตร และคํานวนความหนาแน่นของเชอื มาลาเรยดังนี จาํนวนเ อระยะไม่มีเพศ x 8,000 จาํนวนเ อมาลาเรือด 1 ไมโครลิตร = จาํนวนเม็ดเลือดขาวทนี ับได้

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 77 ตัวอย่างที่ 1: พบเชื้อชนิด P. falciparum ระยะ trophozoites และ gametocyte นับจำ นวนเฉพาะระยะ trophozoites ของเชื้อ P. falciparum ได้ 155 ตัว นับจำ นวนเม็ดเลือดขาวได้ = 208 เซลล์ 155 x 8,000 ความหนาแน่นของเชื้อ= =5,962 ตัวต่อเลือด 1 ไมโครลิตร 208 ให้รายงานว่า ตรวจพบ: P. falciparum trophozoites ความหนาแน่นของเชื้อเท่ากับ 5,962 ตัว/เลือด 1 ไมโครลิตร และพบระยะ gametocyte ตัวอย่างที่ 1: พบเชื้อชนิด P. vivax ระยะ trophozoites, schizont และ gametocyte นับจำ นวนเฉพาะระยะ trophozoites และ schizont ของเชื้อ Plasmodium vivax ได้ 88 ตัว นับจำ นวนเม็ดเลือดขาวได้ = 505 เซลล์ จำ นวนเม็ดเลือดขาวทแี่ท้จร ิงของผู้ป่วย = 6,500 เซลล์/เลือด 1 ไมโครลิตร 88 x 6,500 ความหนาแน่นของเชื้อ= = 1,133 ตัวต่อเลือด 1 ไมโครลิตร 505 ให้รายงานว่า ตรวจพบ: P. vivax trophozoites ความหนาแน่นของเชื้อเท่ากับ 1,133 ตัว/เลือด 1 ไมโครลิตร ตัวอย่างที่ 1: พบเชื้อผสม ชนิด P. vivax ทุกระยะ และ P. falciparum พบเฉพาะระยะ gametocyte นับเฉพาะเชื้อ P. vivax ระยะ trophozites และระยะ schizont จำ นวน 360 ตัว และนับเม็ดเลือดขาวได้ 202 เซลล์ 360 x 8,000 ความหนาแน่นของเชื้อ= = 14,257 ตัวต่อเลือด 1 ไมโครลิตร 202 ให้รายงานว่า ตรวจพบเชื้อมาลาเร ียชนิดผสม (mixed infection) ของ P. falciparum gametocytes (ระยะมีเพศ) และ P. vivax นับจำ นวนได้ 14,257 ตัว/เลือด 1 ไมโครลิตร กรณีีที่่พ�บเชื้้�อชนิิด P. falciparum และพบเชื้้�อชนิิดอื่่�นร่่วมด้้วย (mixed infection) · P. falciparum พบระยะมีเพศและไม่มีเพศ ให้นับจำนวนเชื้อมาลาเร ียเฉพาะระยะไม่มีเพศทุกชนิด รวมกััน · P. falciparum ระยะมีเพศ ให้นับเฉพาะระยะไม่มีเพศของเชื้อมาลาเร ียชนิดอื่ น และรายงานผลดัง ตััวอย่่างที่่� 3

78 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · ในกรณีทจี่ำนวนเชื้อที่พบมากกว่า 100 ตัว ในแต่ละวงกล้องของฟิล์มหนา ให้นับความหนาแน่นของเชื้อ จากฟิิล์์มบางจะถููกต้้องมากกว่่า 7. การควบคุมคุณภาพ · ตรวจสอบความถูกของผลการตรวจ ให้ตรงกับข้อมูลผู้ป่วย 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ ยวข้อง · MM–SOP-05: การเขียนฉลากฟิล์มเลือดมาลาเร ีย · MM–SOP-10: การตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาและบาง · MM–SOP-11: การนับจำนวนเชื้อมาลาเร ีย 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization. (2010). Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide. Second edition. Geneva. Geneva: WHO Press.

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 79 ส่่วนที่่� 3 ความปลอดภััยและการจััดการของเสีียจากการตรวจวินิิิจฉััย โรคไข้้มาลาเรี ีย ส่่วนที่่� 3 ประกอบด้้วยขั้้นตอนการปฏิิ�บัติั ิงานมาตรฐานจำำนวน 2 เรื่ ่�อง ได้้แก่่ MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ MM-SOP-14: การจัดการขยะที่เกิดจากการตรวจว ินิจฉัยโรคไข้มาลาเร ีย

80 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ความปลอดภััยในการตรวจวินิิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ MM-SOP-13 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายวิิธีีปฏิิบััติิงานอย่่างปลอดภััยระหว่่างการเก็็บตััวอย่่างเลืือด การทำำ งานต่่าง ๆ เกี่่�ยวกัับเลืือด การเตรี ียมและย้้อมสีีฟิิล์์มเลืือดสำำหรัับการตรวจเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ 2. หลักการและเหตุผล ผู้้ปฏิิบััติิงานด้้านจุุลชีวีวิิทยามีีความเสี่่�ยงต่่ออัันตรายที่่�เกิิดจากการสััมผัสัเนื้้�อเยื่่�อและของเหลวจากผู้้ป่ว่ ย โดย เฉพาะเลืือด ซึ่่�งอาจมีีเชื้้�อโรคติิดต่่อหลายชนิิด เช่่น เชื้้�อไวรัสัเอชไอวี ี-1 และ เชื้้�อไวรัสัเอชไอวี ี-2 (HIV-1 และ HIV-2) ไวรัสตัับอัักเสบบีี และไวรัสตัับอัักเสบซีี (Hepatitis B และ Hepatitis C) ไวรัสที่่ ั �ทำำ ให้้เกิิดโรคไข้้เลืือดออกชนิิดต่่างๆ เช่่น ไวรัสอีั ีโบลา (Ebola) เชื้้�อโรคเหล่่านี้้�สามารถเข้้าสู่่ร่่างกายทางผิิวหนัังที่่มี�ีบาดแผล รอยถลอก หรื ือผ่่านทางเยื่่�อ เมืือก (mucous membrane) หรื ือเกิิดอุุบััติิเหตุุระหว่่างปฏิิบััติิงาน เช่่น ถููกเข็็มหรื ือวัตถุัุมีีคมที่่�ปนเปื้้�อนเชื้้�อโรคบาด เจ้้าหน้้าที่่�ห้้องปฏิิบััติิการและเจ้้าหน้้าที่่�ภาคสนามทุุกคนต้้องจััดการกัับตััวอย่่างทุุกชนิิดจากผู้้ป่่วย โดยปฏิิบััติิเสมืือน หนึ่่�งว่่าตััวอย่่างเหล่่านั้้�นมีีการปนเปื้้�อนเชื้้�อโรค และต้้องปฏิิบััติิตามข้้อกำำ หนดในแนวปฏิิบััติิเพื่่�อป้้องกัันการติิดเชื้้�อตาม หลัักสากล (universal precaution) ตลอดเวลาที่่�ปฏิิบััติิงาน 3. วัสดุและอุปกรณ์ · เสื้อกาวน์ · แว่นตานิรภัย · น้ � ำยาฆ่าเชื้อ เช่น เอทิลหร ือไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ 70% หร ือ โซเดียมไฮโปคลอไรท์ 10% · น้ � ำยาซักล้างทำความสะอาด · สารละลายไฮโปคลอไรทท์ ประกอบด้ ี่วยคลอร ีน 1 กรัมต่อลิตร สำหรับใช้งานท่วั่ว ไป · สารละลายไฮโปคลอไรทท์ ประกอบด้ ี่วยคลอร ีน 5 กรัมต่อลิตร สำหรับฆ่าเชื้ออุปกรณ์เกี่ยวกับเลือด · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครังเดีย้วทงิ้ · สบู่เหลวทมี ี่ส่วนผสมของน้ � ำยาฆ่าเชื้อโรค · ถังขยะสำหรับของมีคมมีฝาปิด · ถังขยะสำหรับขยะติดเชื้อมีฝาปิด · ถังขยะท่วั่ว ไป · ผ้าเช็ดมือ · น้ � ำสะอาด · หม้อนึ่ งความดันฆ่าเชื้อโรค 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย • เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการทุกคนควรได้รับการฝึกอบรมข้อกำ หนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตาม หลักสากล และจัดให้มีเอกสารข้อกำ หนด ฯ ไว้ในห้องปฏิบัติการ ในบร ิเวณทเข้าถ ี่ึงได้ง่าย • ปฏิบัติตามข้อกำ หนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลักสากล ประกอบด้วยการสวมใส่อุปกรณ์ ป้องกันอันตรายส่วนบุคคลในการปฏิบัติงานทุกครัง เ้ช่น ถุงมือ แว่นตานิรภัย และเสื้อกาวน์

81 การี 5.1 หอ้งปฏิบตั ิการหร น ปฏิบตั ิงาน • จดัเต นทีนทเีพียงพอต่อการปฏิบัติงานพรอ้มกัน ของเจา้หน้าที ยา่งน้อย 2 คน • แยก นทปีฏิบัต นที กปรกและ นทีะอาด • ทาํความสะอาดและฆา่เ อบน นผวิวณปฏบิตังิานดว้ยนายาฆา่เ อโซเดยีมไฮโปคลอไรท์ 10% ทันทที ีมีของหกและหลังจากการปฏิบตั ิงานแต่ละวัน • ติดฉลาก อสารเคมีและสียอ้มทุกชนิด ระบุขอ้มูลประกอบด้วย อสารเคมี วันทเีต วันที�เป�ดใช้และวนัหมดอายุ • ทาํความส องแก้วและวัสดุอน ๆ ทีนํากลับมาใชซ้าได้ เชน่ภาชนะย้อมสี ด้วยสาร ซักฟอกและล้างออกด้วย ะอาด • เก็บวัสดุอุปกรณ์ไว วณทีสิงสกปรก และแมลง เชน่ ในลินช กล่อง พรอ้มทังติดฉลาก ระบุช ภทของวสดัุ • บรรจุและขนส่งตัวอยา่งเลอดืตามขอ้กําหนดของประเท ําหนดสากล เชน่ตาม มาตรฐานขององค์การอนามัยโลก • เก็บสารเคมีอันตราย เชน่เมทานอล ไวใ้นตู้และล็อคตู้ไวเ้มอไม่ได้ใชง้าน 5.2 การป กันส่วนบุคคล • เจา้หน้าทีกุคนที ัมผัสตัวอย่างเลือดต้องได้รบัการฉีดวัคซีนตามนโยบายของประเทศ เชน่ ไวรสตั ับอักเสบบี • สวมถุงมือแบบใช้แล้วทิงทุกครัง เมอต้องปฏิบัติงานสัมผัสกับเลือด ไม่ว่าจะอยู่ในห้อง ปฏิบตั ิการหร ภาคสนาม ควรสวมไวต้ลอดเวลาที บตั ิงาน และเปลี ถุงมือใหม่เม หร ฉีกขาด • สวมเ อกาวน์เมอทาํ งานในห้องปฏิบัติการและถอดเมอออกจากห้องปฏิบัติการ • สวมแว่นตานิรภัย • ผลบนผวิหนัง เชน่บาดแผลจากของมคีม รอยถลอก แผลพพุอง และผวิหนังอักเสบ ด้วย พลาสเตอรป์ผลแบบกัน ่อนสวมถุงมือ • องสํา วใ้นห้องปฏิบัติการ และห้ามแต่งหน้า ใส่คอนแทคเลนส์ รบั ประทานอาหารและเค ด ห้องปฏิบตั ิการ • ห้ามใช้โทรศัพท์มือถือในห้องปฏิบัติการ • ถอดถุงมือเมอต้องใชค้อมพิวเต ทรศัพทใ์นห้องปฏิบัติการ • ทาํความสะอาดมืออยา่งถกูวธดี ้วยนา และนายาฆ่าเ อทใีชสํา้หรบัผิว สบูเ่หลวทีม ยาฆ่าเชืทีเร ร ล์70% ก่อนเขา้และหลังการทํางาน และก่อนออกจาก ห้องปฏิบตั ิการ • อ่านเอกสารขอ้มูลด้านความปลอดภัยของสารเคมีทุกชนิดก่อนใช้

82 5.3 ความปลอดภัยระหวา่งเก็บตัวอยา่งและจดัการกับเลือด • เขม็เจาะเลือดปลายนิว เขม็และกระบอกฉีดยา ให้ใชแ้บบใชค้รงเัดียวทงิและห้ามนํากลับมา ใช้ • แนะนําให้ใช ตอัตโนมัติในการดูดจา่ยเลือด • ถอดปลอกเข็มฉีดยาอย่างระมัดระวังเมอจะใชง้าน หลังจากใชง้าน ห้ามสวมปลอกเข็มกลับ หร ดึงเข็มออกจากกระบอกฉีดยา ให้ทงิเข็มและกระบอกฉีดยาทีช้แล้วและไม่ได้ถอดแยก ออกจากกัน ลงในภาชนะทงของิมีคมติดเชื 5.4 ล์มเลือดระหวา่งหอ้งปฏิบตั ิการ • ห่อฟ อดืด้วยกระดาษ A4 ทีะอาด ไม่มตี ัวหนังสือติดอยู่โดยตัดกระดาษให้มีขนาดพอดี สําหรบัการห่อ • จดัห่อฟ ืผ่น สําหรบักระดาษสัน และกระดาษยาว 25 - 50 แผ่น ต่อ ชุด เร ตังซอ้นกัน ห่อด้วยกระดาษทตี ัดเตร ว้ดังรูปที • ม้วนพ ฟ อดืพับหัวท นไม่ให้สไลด์หลดุควรใช แน่น ไม่แนะนําให้ใชส้ก๊อตเทปติดเพราะกระดาษทีชห้ ่อจะฉีกขาด และอาจทาํ ให้สไลด์ตก แตกได้ขณะแกะออก • นํามาห่ออีกชนัด้วยวสัดุกันกระแทกกันแตก แลว้ใส่ในกลอ่งกระดาษทมีขีนาดพอดีกับห่อ เ อ ไม่ให้เกิดการเคล วา่งการจัดส่ง • ห้ามใชก้ระดาษทชิชูห่อสไลด์ รูป 1 ว ห ล์มเลือดเ อส่งตรวจส า หร ยืนยนัผล กระดาษถ่ายเอกสาร A4 สำหรับห่อสไลด์ ฟ�ล์มเลือด จำนวน 1-25 แผ่น ตัด ตัด 1 ส่วน 2 (1/2) ของ กระดาษ ขนาด A4 ตัด 1 ส่วน 4 (1/4) ของ กระดาษ ขนาด A4 สำหรับห่อ สไลด์ฟ�ล์มเลือด จำนวน 26-50 แผ่น

83 5.5 การจดัการกับเลือด กกระเด็น และการจดัการเ อเกิดอุบัติเหตุําให้ต้องสัมผัสกับตัวอย่างเลือด ติดเ อ • จดัทาํขันตอนการปฏิบัต องการปฐมพยาบาลเบองต้น และจดัวางไว้ในห้องปฏิบัติการ รวมทงัต้องมีคําแนะนําทชีดัเจน เ จดัการเม มีเหตุเลือดหก/กระเด็น และอุบตั ิเหตุที ทาํ ให้ต้องสัมผัสกับตัวอยา่งเลือดติดเชื • เม ติเหตดุังต่อไปนีต้องรายงานเจา้หนา้ทคีวบคมุการติดเ อ ผจู้ดัการ ห้องปฏิบตั ิการ หัวหน้าห้องปฏิบตั ิการ หร้รับผิดชอบงานปฐมพยาบาลทันที • ตัวอยา่งเลือดติดเ ติเหตุทเีกียวขอ้งกับตัวอยา่งเลือดติดเ อ • เลือดกระเด็นเขา้ต ผิวหนังทมี ีรอยถลอก • ถูกแก้วือดแทง • มีอาการทางพยาธสภิาพต่าง ๆ ทเีกิดขนหลังจากการเกิดอุบัติเหตุ • เมอมีเลือดหกบน น ใชก้ระดาษทิชชูทับทันทีแล้วเทสารละลายโซเดียมไฮโปรคลอไรท์ 5 กรมั/ลิตร หร ล์ 70 % ตามลงไปอยา่งระมัดระวงั • เมอถูกเข็มติดเ อแท ที ิวหนัง ให้ล้างทําความสะอาดบาดแผลด้วยสบู่และนา สะอาดทันที • ถ้าเลือดกระเด็นเขา้ต ตาด้วยนาสะอาดทันท วลาอยา่งน้อย 15 นาทีปฏิบัติ ตามคําแนะนํา ธปีฏิบตั ิมาตรฐานด้านความปลอดภัยทันทีหากจาํเป ต้องไปพบแพทย์ 6. ขอ้ควรระวงัเกยวขอ้งกับขันตอนการปฏิบตั ิงาน · การห่อฟ ือด และการแกะห่อฟ ือดควรวางอยู่บนโต๊ะแห้งสะอาด ไม่มีของวางเกะกะ และอยู่ใน แนว ป ก ล์มเลือดตกแตก · การห่อฟ อืดต้องห่อให้แน่น ใชย้างรดัไมค่วรใช้เทปติดเนองจากกระดาษจะฉีกขาดขณะทแีกะออก และ ทาํ ให ล์มเลือดตกแตกได้ · ก่อนห่อฟ อืดจะต้องซบั immersion oil ออกให้หมด ให้ใชว้ธซีบัอยา่เชด็เพราะฟ อืดอาจจะหลดุ ออกขณะเชด็ immersion oil 7. การควบคุมคุณภาพ · ไม่มี 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบตั ิงาน เกยวขอ้ง · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง World Health Organization [WHO]. (1997). Guidelines for the safe transport of infectious substances and diagnostic specimens. Geneva: WHO Press. World Health Organization [WHO]. (2004). Laboratory biosafety manual. Third edition. Geneva: WHO Press

84 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ การจัดการขยะที่เกิดจากการตรวจว ินิจฉัยโรคไข้มาลาเร ีย MM-SOP-14 1. วัตถุประสงค์ เพื่่�ออธิิบายวิิธีจัี ัดการขยะที่่�เกิิดจากตรวจวิินิิจฉััยโรคไข้้มาลาเรี ียด้้วยชุุดตรวจอย่่างรวดเร็ว็ (RDT) และ/หรื ือ การตรวจหาเชื้้�อมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ รวมทั้้�งการตรวจคััดกรองภาวะพร่่องเอนไซม์์ G6PD และการตรวจ วิินิิจฉััยอื่่�นๆ ที่่�เกี่่�ยวข้้อง 2. หลักการและเหตุผล ของเสีียจากการตรวจวิินิิจฉััยเชื้้�อมาลาเรี ียจััดเป็็นขยะติิดเชื้้�อหรื ือขยะที่่มี�ผีลกระทบต่่อสิ่่� งแวดล้้อม ห้้องปฏิิบััติิ การควรมีีระบบบริ ิหารจััดการของเสีียเพื่่�อป้้องกัันการแพร่่กระจายเชื้้�อไปสู่่ผู้้ปฏิิบััติิงาน ชุุมชน และสิ่่� งแวดล้้อม เพื่่�อให้้ ระบบมีีประสิิทธิิภาพ เจ้้าหน้้าที่่�ด้้านการแพทย์์และสาธารณสุุขควรมีีความรู้้และได้้รัับการอบรมเกี่่�ยวกัับการแยกและ กำำจััดขยะทางการแพทย์ชนิ์ ิดต่่าง ๆ 3. วัสดุ อุปกรณ์ และเครองม ื่ ือ · ถังขยะทงของมีคม ิ้ · ถังทงขยะิ้ท่วั่ว ไป · ถังทงขยะิ้ติดเชื้อ · ถุงใส่ขยะ แยกสีตามประเภทขยะ · ถุงมือยางไร้แป้ง ชนิดใช้ครังเดีย้วทงิ้ · ถุงมือป้องกันของมีคมบาด · เคร ืองน่ ึ่งฆ่าเชื้อ 4. ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย · ปฏิบัติตามข้อกำหนดการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อตามหลักสากล ประกอบด้วย การสวมใส่อุปกรณ์ ป้้องกัันอัันตรายส่่วนบุุคคล เช่่น ถุุงมืือ แว่่นตานิิรภััย และเสื้้�อกาวน์์ ในการปฏิิบััติิงานทุุกครั้้ง �

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 85 5. ว ิธการี 5.1 การจัดการและกำาจัดขยะติดเชื้อ • ทงของมีคม เ ิ้ช่น เข็มฉีดยา เข็มเจาะปลายนิ้ว และเศษแก้ว ลงในถังขยะทงของมีคม ิ้ติดเชื้อ ที่่�มีีลัักษณะเป็็นถัังหนาป้้องกัันการแทงทะลุุจากของมีีคม เช่่น ภาชนะทำำ จากพลาสติิกแข็็ง ไม่่รั่่วซึึ�ม มีีการติิดฉลากและมีีฝาปิิดถััง เมื่่�อบรรจุุขยะได้้ ¾ ของถัังแล้้ว ให้้นำำ ไปทิ้้งใน �ถุุงขยะ ติิดเชื้้�อ ปิิดปากถุุง ก่่อนนำำ ไปนึ่่�งฆ่่าเชื้้�อ หรื ือส่่งบริษัิัทกำำจััดขยะติิดเชื้้�อ ห้้ามทิ้้ง�ถัังขยะทิ้้งของ� มีีคมและขยะติิดเชื้้�อในชุุมชน รวมทั้้ง�ห้้ามนำำ ไปฝัังกลบ • แยกทงขยะิ้ติดเชื้ออันตรายต่าง ๆ ยกเว้นของมีคม ออกจากขยะทไม่ ี่ติดเชื้อ โดยทงขยะิ้ติด เชื้้�อในภาชนะที่่�ทำำ จากพลาสติิกแข็็งหรื ือโลหะ มีีฝาปิิด และแยกสีีภาชนะทิ้้งขยะติิดเชื้�้�อและ ขยะไม่่ติิดเชื้้�อ • ใช้ถุงใส่ขยะติดเชื้อสีแดงทมี ี่สัญลักษณ์ Biohazard และเป็นชนิดใช้ครังเดีย้วทงิ้ • น ึ่งฆ่าเชื้อ หร ือส่งบร ิษัทกำจัดขยะติดเชื้อ ไม่นำไปฝังกลบ • เคร ืองแก้่วหร ือพลาสติกที่จะนำกลับมาใช้ใหม่ ให้นำไปล้างด้วยสารซักฟอก และน้ � ำสะอาด แล้้วตากทิ้้งไ�ว้้ให้้แห้้ง 5.2 การแยกและการกำาจัดของเสียที่เกิดจากการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ีย ชนิดของเสีย การติดฉลากสีและ สัญลักษณ์ ชนิดภาชนะ การฆ่าเชื้อ และการทิ้ ง ของมีคม เช่น เข็มเจาะปลาย นิ้ ว เข็มฉีดยา แก้วและสไลด์ แตก ปิเปตแก้ว และมีดผ่าตัด ใชส้ ีแดงสัญลักษณ์ที่ภาชนะ พร้อมเขียนระบุว่า “ที่ทงขยะิ้ มีคม” และติดสัญลักษณ์ “ชววี ัตถุอันตราย” ภาชนะทเข็มไม่ ี่ สามารถแทงทะลุได้ ทำจากพลาสติกแข็ง นงฆ่าเ ึ่ ชื้อหร ือใชส้ ารเคมี ทำลาย ตามด้วยการเผา ทำ ลาย หร ือส่งบร ิษัท กำ จัดขยะติดเชื้อ ขยะติดเชื้อ เช่น อุปกรณ์เก็บ เลือด หลอดและภาชนะใส่ เลือดทใี่ช้แล้ว ลำ ลีทใี่ช้แล้ว พลาสเตอร์ปิด แผล ถุงมือ ชุดตรวจอย่าง รวดเร็วทใี่ช้แล้ว และฟิล์ม เลือดทยังไม่ได้ย้อม ี่สี ใชส้ ีแดงสัญลักษณ์ที่ภาชนะ พร้อมเขียนระบุว่า “ที่ทงขยะิ้ ติดเชื้อ” และติดสัญลักษณ์ “ชววี ัตถุอันตราย” ถุงพลาสติกหนา แข็งแรงป้องกันการรัว่ ซึมได้เป็นอย่างดี หร ือ ภาชนะที่สามารถนง ึ่ ฆ่าเชื้อได้ นงฆ่าเ ึ่ ชื้อ ตามด้วยการ เผาทำลาย หร ือส่งบร ิษัท กำ จัดขยะติดเชื้อ ขยะสารเคมี เช่น แอลกอฮอล์ เมทานอล ไซลีน สารทเป็น ี่ตวทั ำ ละลาย โซเดียม ไฮโปคลอไรท์ ใชส้ ีเหลือง หร ือสีแดง สัญลักษณ์ที่ภาชนะ พร้อม เขียนระบุว่า “ที่ทงขยะิ้สาร เคมี” และติดสัญลักษณ์ “สารเคมี” ชนิดต่าง ๆ เช่น สารกัดกร่อน สารพิษ หร ือ สารติดไฟ เป็นต้น ภาชนะหนา แข็งแรง ป้องกันการรัวซึ่ มได้ดี และปลอดภัยต่อ การทงิ้ สารเคมีทเป็นของเหล ี่ว ไม่ควรทงลงิ้ท่อระบายน้ำ แต่ควรเก็บในภาชนะที่ ทนการรัวซึ่มและส่งไป กำ จัดทบร ิษั ี่ทรับกำ จัด ขยะสารเคมี ขยะทวั่ ไปทไม่เป็นอัน ี่ตราย เช่น กระดาษ กระดาษแข็ง พลาสติก บรรจุภัณฑ์ต่าง ๆ ไม่ต้องใชส้ ีสัญลักษณ์ที่ ภาชนะ หร ือติดสัญลักษณ์ที่ แสดงว่าเป็นชววี ัตถุอันตราย ถุงพลาสติก ทงและกำ ิ้จัด เช่นเดียว กับขยะตามบ้านเร ือน และขยะทเป็นของแข็ง ี่ ทวั่ ไป

86 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5.3 การเก็บขยะที่เป็นของมีคมและขยะติดเชื้อต่าง ๆ ก่อนนำาไปทิ้ ง • แยกขยะมีคม ขยะติดเชื้อทไม่มีคม ขยะ ี่สารเคมี และ ขยะท่วั่ว ไป ออกจากกัน • จัดพื้นที่ทิ้งขยะให้ชัดเจน โดยทำสัญลักษณ์เตือน ติดป้ายแสดงบร ิเวณที่ทิ้งของมีคม และขยะติิดเชื้้�อ เช่่น “ระวััง ขยะติิดเชื้้�อ ห้้ามเข้้าโดยไม่่ได้้รัับอนุุญาต” • ห้ามเก็บขยะมีคมและขยะติดเชื้อไว้ในห้องผู้ป่วย หร ือที่สาธารณะ 5.4 การทิ้ งของมีคมและขยะติดเชื้อ • ให้ปฏิบัติตามกฎกระทรวงสาธารณสุขว่าด้วยการกำจัดมูลฝอยติดเชื้อ พ.ศ. 2545 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · ตรวจสอบให้แน่ใจว่าขยะของเสียทงหมดได้รับการ ั้ทงอย่างถ ิู้กวธิี ไม่ควรเก็บไว้นานเกิน 48-72 ช่วั่ว โมง ทั้้ง�นี้้�ขึ้้�นอยู่่กัับสภาพอากาศ · ควรเตร ียมถังขยะในทุกพื้นทปี่ฏิบัติงาน 7. การควบคุมคุณภาพ · ให้ตรวจความถูกต้องในการจัดการขยะว่าเป็นไปตามมาตรฐาน ISO หร ือมาตรฐานทห้องป ี่ฏิบัติกำหนด ไว้้หรื ือไม่่ ซึ่่�งอาจใช้้ Check list ช่ว่ยตรวจสอบ 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ยวข้อง · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง International Organization for Standardization. (2003). ISO 15190: Medical laboratories – Requirements for safety. Retrieved March 6, 2021, from https://med.mahidol.ac.th/ patho/ sites/default/files/u2/patho/Doc_Form/ISO15190Y20030.pdf World Health Organization. (2004). Laboratory biosafety manual. Third edition. Geneva: WHO Press. World Health Organization. (2004). Safe management of wastes from health-care activities. Second edition. Geneva: WHO Press.

87 ระบบรายงานและการประกันคุณภาพด้านการตรวจวนิจฉยัมาลาเร ด้วยขันตอนการปฏบิตั ิงานมาตรฐานจาํนวน 3 เร ด้แก่ MM-SOP-16: การตรวจสอบ MM-SOP-17: การทดสอบความชาํ MM-SOP-15: ระบบรายงานด้านการตรวจว�นิจฉัยมาลาเร�ยด้วยกล้องจุลทรรศน์

88 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ ระบบรายงานด้้านการตรวจวินิิิจฉััยมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ MM-SOP-15 1. วััตถุุประสงค์์ เพื่่�ออธิิบายวิิธีีการบัันทึึกข้้อมููลในรายงานต่่าง ๆ ที่่�เกี่่�ยวข้้องกัับการตรวจวิินิิจฉััยมาลาเรี ียด้้วยกล้้องจุุลทรรศน์์ การควบคุุมคุุณภาพ และการติิดตามเฝ้้าระวัังประสิิทธิิภาพยารัักษามาลาเรี ีย 2. หลัักการและเหตุุผล ข้้อมููลการตรวจวิินิิจฉััยมาลาเรี ียมีีความสำำคััญ นอกจากผลการตรวจที่่ถูู�กต้้องจะช่ว่ ยให้้ผู้้ป่ว่ ยได้้รัับการรัักษา ที่่ถูู�กต้้องรวดเร็ว็สามารถป้้องกัันการเสีียชีีวิิตของผู้้ป่ว่ยแล้้ว ยัังมีีข้้อมููลอื่่�น ๆ ที่่สำ�ำคััญและจำำเป็็นต้้องได้้รัับการบัันทึึก อย่่างถููกต้้อง เช่่น ผลการติิดตามประสิิทธิิภาพของยาที่่�ใช้รั้ักษาสามารถใช้้เพื่่�อการเฝ้้าระวัังเชื้้�อมาลาเรี ียดื้้�อยา ผลการ ประเมิินสมรรถนะการตรวจวิินิิจฉััยในระบบการควบคุุมคุุณภาพมีีประโยชน์์ต่่อการประกัันคุุณภาพผลการตรวจวิินิิจฉััย และใช้้เพื่่�อการพััฒนาสมรรถนะของผู้้ตรวจ ข้้อมููลเหล่่านี้้�มีีประโยชน์์ต่่อประสิิทธิิภาพการดำำเนิินงานโครงการกำำจััดโรค ไข้้มาลาเรี ียของประเทศไทย 3. วัสดุัุ อุุปกรณ์์ และเครื่ ่�องมืือ · ปากกาแดงและปากกาน้ � ำเงินสำหรับการบันทึกข้อมูล · แบบฟอร์ม รว. 1 ระเบียนผู้ป่วยได้รับการตรวจโลหิตหาเชื้อมาลาเร ีย · แบบฟอร์ม MM-01: บันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด · แบบฟอร์ม MM-02: บันทึกรายละเอียดการตรวจสอบฟิล์มเลือด · แบบฟอร์ม iDES-01: แบบบันทึกการติดตามผลการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย · แบบฟอร์ม iDES-02: ใบนำส่งตัวอย่างการติดตามการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย 4. ข้้อควรระวัังเพื่่�อความปลอดภััย · ไม่มี

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 89 5. วิธีีบัิ ันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์มรายงานผลการตรวจวินิิิจฉััยมาลาเรี ีย 5.1 การบัันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์ม รว.1: ระเบีียนผู้้ป่่วยได้้รัับการตรวจโลหิิตหาเชื้้อมาลาเรี ีย รายงาน รว.1 ออกแบบให้ใช้สำ หรับการค้นหาผู้ป่วยมาลาเร ียทุกลักษณะงาน ทุกพื้นท และี่ทุกประเภทของผู้ป่วย เลือกโดยใส่เคร ืองหมาย ( ่ ) ลงในช่อง ที่ต้องการ เหนือตาราง ได้แก่ • PCD ให้ระบุสถานทรับี่ตรวจบำบัด เช่น MC, นคม. และระบุสถานที่ตั้งของ PCD นั้น ๆ ใส่่ชื่่�อของกลุ่่มบ้้าน หมู่่ที่่� ตำำบล อำำเภอ และจัังหวััด • สำหรับ ACD ให้ระบุลักษณะการเจาะเลือด ได้แก่ SCD, CIS, MMC, FSMC, MBS หรื ือลัักษณะอื่่�น ๆ (ระบุุ) ให้้ระบุุสถานที่่�ปฏิิบััติิงานโดยใส่่ชื่่�อของกลุ่่มบ้้าน หมู่่ที่่� ตำำบล อำำเภอ และจัังหวััด • ชื่อผู้ปฏิบัติงาน ให้ใส่ชื่อ นามสกุล ผู้ทำการเจาะเลือด ถ้ามีผู้ปฏิบัติงานหลายคน ให้ใส่ชื่อ หััวหน้้าและคณะ • ระยะพื้นทมี 4 ประเ ี่ภท คือ A1, A2, B1, B2 เลือกระยะพื้นทของกลุ่มบ้าน ี่ทปี่ฏิบัติงาน ตาม ทะเบีียนท้้องที่่�ปฏิิบััติิงานประจำปีำ ี (POA) • ประเภทผู้ป่วยแบ่งตามสัญชาติและถิ่ นทอยีู่่ • คนไทย หมายถึง ผู้ทมีบั ี่ตรประชาชนคนไทย • ต่างชาติ 1 หมายถึง ผู้ทไม่ได้มี ี่สัญชาติไทย และอาศัยอยู่ในประเทศไทย มากกว่า 6 เดืือน • ต่างชาติ 2 หมายถึง ผู้ทไม่ได้มี ี่สัญชาติไทย และอาศัยอยู่ในประเทศไทย น้อยกว่า 6 เดืือน • ประเภทผู้ป่วยแบ่งตามประวัติการป่วย • ผู้ป่วยรายใหม่ หมายถึง ผู้ทไม่เคย ี่ตรวจพบเชื้อมาก่อน หร ือผู้ทมีประ ี่วัติตรวจพบ เชื้้�อเกิินระยะ 3 เดืือนไปแล้้ว หรื ือรัักษาหายขาดแล้้ว • ผู้ป่วยรายเก่า หมายถึง ผู้ป่วยในระยะติดตามผลการรักษา หร ือในระยะ 3 เดือน หลัังตรวจพบเชื้้�อ ในตารางแบบฟอร์มรายงาน • ช่องท 1ี่ วันเดือนปีทเจาะเลี่ือด • ช่องท 2ี่ ชื่อ นามสกุล ของผู้ทได้รับการ ี่ตรวจ • ช่องท 3-9 ี่รายละเอียดทงหมดเกี ั้ ่ยวกับทอยีู่่ของผู้ได้รับการเจาะเลือด • ช่องท 10ี่อายุเป็นปี • ช่องท 11 ี่เพศชายให้ลง ช. เพศหญิงให้ลง ญ. • ช่องท 12 ี่อุณหภูมิร่างกาย วัดโดยใช้ปรอทวัดไข้ เป็นองศาเซลเซียส (ถ้าวัดทาง รัักแร้้ ต้้องบวก 0.5 องศาเซลเซีียส

90 • ชอ่งท 13ีอาชพทีเีสียงต่อการติดเ อในระยะ 1 เดื ือด ส่วนสาเหตุที ตามที ้ปวยแจ้ง • ชอ่งท 14ี อันดับฟ ือดให้ตรงกับทเีขยีนบนสไลด์ • ชอ่งท 15-20 ีเลือก ( ) ผลการตรวจเลือด ว พบเ พบเชืชนิดใด (Pf, Pv, Pm, mix, fg) • ชอ่งท 21-27 จ ี ํานวนเม็ดยาทจีา่ยรกัษา ดังนี o ชอ่งท 21 ี A = ยาอาร์ติซูเนต o ชอ่งท 22 ี M = ยาเมโฟลคว o ชอ่งที23 C = ยาคลอโรคว o ชอ่งท 24-25 Pri ี = ยาไพรมาคว o ชอ่งท 26 FD-ACT ี= ยาอนุพันธอ์ารต์ ิมิซนิ ินผสมในเม็ดเดียวกันกับยา อนๆ เชน่ยาไดไฮโดรอารต์ ิมิซนิ ิน-ไปเปอรร์าคว ต้น o ชอ่งท 27 ีช่องทีเว้นว่างไว้ใส่ยาอนทีจ่ายให้ผู วย (ระบุชนิดยา) เช่น พาราเซตามอล • ชอ่งท 28 จ ี ํานวนมุ้ง LLIN ทแจกให้คน ีต่างชาติ 2 ทีที • ชอ่งท 29 ีผลการนบัเ อระยะโทรโฟซอยต์/ 200 เมด็เลอดขาืว โดยกรณีทีงกลอ้งสุดทา้ย นับเม็ดเลือดขาวได้เกิน 200 ตัว ให้ใช้เม็ดเลือดขาวทังหมดทีนับได้ เช่น นับเชื�อได้ 250 ตัว จากเม็ดเลือดขาว 203 ตัว ให้เขยีนเป • ชอ่งที 30 ถ้ามีความจํา ต้องส่งต่อผู วย ให้ระบุเหตุผลที ่งต่อ เชน่หญิงตังครรภ์ เด็กอายุตากว่า 1 ป ร ้ปวยทีมีอาการรุนแรง และให้ระบุถึงสถานทีทีส่งต่อ เช่น ช พยาบาล • รายงานนีให้ห่อรวมกับสไลด์ที ือด ส่งไปตรวจทห้องป ีฏิบัติการ • ใต้ตาราง ให้ผู้รบั ฟ ือดลงวันที ีรบัและลง อกํากับ เมอผู้ตรวจฟ ือดได้ตรวจ เร รอ้ยแล้ว ให้ลงวันทีตรวจและลงช กํากับไวด้ ้วย • รายงานนีใช ฏิบัติงานของทางราชการ จะต้องเก็บรกัษาไว้ให้ดี สามารถใช้เป ลักฐานสําคัญในการตรวจสอบการปฏิบตั ิงานของมาลาเร ลินิก • กรุณาเขยีนด้วยตัวบรรจง

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 91 5.2 การบัันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์ม MM-01: บัันทึึกรายละเอีียดการตรวจฟิิล์์มเลืือด แบบฟอร์ม MM-01: บันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด เป็นแบบฟอร์มทบันี่ทึก ผลการตรวจว ินิจฉัยมาลาเร ียในสถานบร ิการสาธารณสุข เช่น ใช้ในมาลาเร ียคลินิก หร ือใน โรงพยาบาล ประกอบด้วย 3 ส่วน ได้แก่ ส่วนที่ 1 ข้อมูลทั่วไป เป็นส่วนที่อยู่ด้านบนของตาราง ประกอบด้วย ข้อมูลสถานที่ตรวจ ประจำ งวด การตรวจทงี่วดการตรวจแบ่งเป็น 3 งวดต่อเดือน คือ งวดท 1 ระห ี่ว่างวันท 1 -10 ง ี่วดท 2 ี่ ระหว่างวันท 11 - 20 และง ี่วดท 3 ระห ี่ว่างวันท 21 ถ ี่ึง 30 ส่วนที่ 2 รายละเอียดการเตร ียมฟิล์มเลือด (ในตาราง) ช่องท 1 ี่วันทเี่ตร ียมฟิล์มเลือด ต้องเป็นวันเดียวกับทเจาะเลี่ือด ช่องท 2 รหั ี่สฟิล์ม หร ือ lab number ที่สามารถเชื่อมโยงถงข้อม ึลู ผู้ป่วยในรายงานอนๆ เ ื่ ช่น รว. 1 ส่วนที่ 3 รายละเอียดผลการตรวจฟิล์มเลือด ช่องท 3 ี่วันที่ตรวจ อาจเป็นวันเดียวกับทเี่ตร ียมฟิล์มเลือดในกรณีที่ต้องการทราบผลทันที แต่ มีหลายกรณีที่ตรวจคนละวันกับที่เตร ียมฟิล์ม เช่น ในการค้นหาผู้ป่วยเชิงรุกในพื้นที่ เสี่ยง หร ือในกลุ่มแรงงานต่างชาติ ซึ่งจำ นวนฟิล์มเลือดมาก ไม่สามารถตรวจให้เสร็จ ภายใน 1 วัน ช่องท 4 ี่ผลการตรวจ กรณีตรวจไม่พบเชื้อ ให้ลงผลเป็น “NMPS” หร ือ “ไม่พบเชื้อ” กรณีพบเชื้อ ให้ระบุชนิดเชื้อที่พบ รายละเอียดตาม MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียใน ฟิล์มหนาและบาง ช่องที่ 5, 6 และ 7 การลงผลการนับจำ นวนเชื้อในกรณีที่ตรวจพบเชื้อ รายละเอียดตาม MM-SOP-11: การนับจำ นวนเชื้อมาลาเร ีย ช่องท 8 ี่ ชื่อผู้ตรวจฟิล์มเลือด เขียนตัวบรรจง ไม่ใช้ลายเซ็น ช่องท 9 หมายเห ี่ตุ ใชส้ ำ หรับบันทึกค่าจำ นวนเม็ดเลือดขาว หร ือเม็ดเลือดแดงทนับได้ กรณี ี่ที่ ต้องใช้เพื่อการคำ นวณความหนาแน่นเชื้อ

92 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 5.3 การบัันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์ม MM-02: บัันทึึกรายละเอีียดการตรวจสอบฟิิล์์มเลืือด MM-02 บันทึกรายละเอียดการตรวจสอบฟิล์มเลอด ื เป็นแบบฟอร์มใชส้ ำ หรับบันทึก ผลการตรวจสอบฟิล์มเลือด โดยผู้บันทึกข้อมูลประกอบด้วยเจ้าหน้าท 2 คน ค ี่ือ 1) ผู้ทำ หน้าที่ ตรวจสอบเป็นผู้ลงผลการตรวจสอบ 2) ผู้ทำ หน้าที่ลงผลการตรวจเดิมต้องไม่ใชผู่ ้ที่ทำ หน้าที่ ตรวจสอบฟิล์ม และลงหลังจากผู้ทำ หน้าที่ตรวจสอบ ได้บันทึกผลการตรวจสอบแล้ว เน ื่ องจาก ในระบบการตรวจสอบ ผูท้ ำ หน้าที่ตรวจสอบต้องไม่ทราบผลการตรวจที่ส่งมาจากห้องปฏิบัติการ เคร ือข่ายก่อนดำ เนินการตรวจฟิล์มเลอด ข้อม ื ลในแบบบันูทึกการตรวจสอบฟิล์มประกอบด้วย ส่วนที่ 1 ข้อมูลทั่วไป ประกอบด้วย งวดที่วันท เดี่ือน ปีที่ทำการตรวจสอบฟิล์มเลือด และสถานที่ตรวจ ส่วนที่ 2 ข้อมูลรายละเอียดของฟิล์มเลือดที่สามารถตรวจสอบผลย้อนกลับได้ ช่องท 1 ี่วันที่ตรวจสอบ ช่องท 2 อันดับ ี่ฟิล์มเดิม ซึ่งเป็นอันดับฟิล์มทจะี่ตรงกับอันดับฟิล์มใน MM-01 ช่องท 3 อันดับ ี่ฟิล์มใหม่ที่ผู้ตรวจสอบฟิล์มเลอดื ซ้ำเป็นผู้กำ หนดขนเ ึ้ พื่อใช้ในการตรวจสอบซ้ำ ช่องท 4 และ 5 ี่ผลการตรวจเดิมทห้องป ี่ฏิบัติการเคร ือข่ายส่งมาให้ ประกอบด้วยผลบวกหร ือลบ ชนิดเชื้อ และความหนาแน่นของเชื้อ ซึ่งการลงผลนี้ต้องลงภายหลังจากผูต้รวจสอบซ้ำ ได้ลงผลตรวจสอบสอบซ้ำแล้ว และผูท้ลงี่ผลการตรวจเดิมต้องไม่ใชผู่ท้ ี่ทำ หน้าที่ตรวจ สอบฟิล์มเลือดซ้ำ ส่วนที่ 3 ข้อมูลผลการตรวจสอบฟิล์มเลือด ช่องท 6 คุณ ี่ภาพของฟิล์มเลอด หมายถืงการเึตร ียมฟิล์มเลอด การย้อม ืสีฟิล์มเลอดได้มา ืตรฐาน หร ือไม่ รวมถึงการบันทึกกรณีสไลด์ฟิล์มเลือดแตกหร ือชำ รุดจนไม่สามารถตรวจได้ ช่องท 7 ี่ผลการตรวจสอบฟิล์มเลือดซ้ำ ดูรายละเอียดวธิีการลงผลการตรวจใน MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาและบาง ช่องท 8 ี่ผลการนับเชื้อ รายงานเป็นค่าความหนาแน่นของเชื้อ ดูรายละเอียดวธิีการคำ นวณ ความหนาแน่นของเชื้อทนับได้ใน MM-SOP-11: การนับจำ ี่นวนเชื้อมาลาเร ีย ส่วนที่ 4 การรายงานกรณีพบผลการตรวจไม่สอดคล้องกัน ส่วนนี้จะใช้เฉพาะกรณีที่ผลการตรวจไม่สอดคล้อง เมื่ อพบความไม่สอดคล้องกันของ ผลการตรวจของห้องปฏิบัติการเคร ือข่ายกับเจ้าหน้าที่ตรวจสอบซ้ำในแต่ละระดับ จะต้องมีการ ตรวจยืนยันผลการตรวจโดยเจ้าหน้าที่ที่ผ่านการประเมิน ECAMM level 1 หร ือ 2 อีก 1-2 คน และใชผ้ลการตรวจที่สอดคล้องกันของผู้ตรวจสอบ 2 ใน 3 เป็นเกณฑ์การตัดสินขั้นสุดท้าย ช่องท 9 ี่ ผลตรวจยนยัน ืทเป็นข้อ ี่สรุปของห้องปฏิบัติการ ดูรายละเอียดวธิีการตรวจยนยันใน ื MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาและบาง ช่องท 10 ี่ ผลการนับเชื้อที่เป็นข้อสรุปสุดท้ายของผู้ตรวจสอบ 2 ใน 3 ดูรายละเอียดวธิีการ รายงานผลความหนาแน่นของเชื้อใน MM-SOP-11: การนับจำ นวนเชื้อมาลาเร ีย ช่องท 11 ี่ลงชื่อผู้ตรวจยืนยันกรณีผลไม่สอดคล้องกัน ช่องท 12 ี่วันที่ตรวจยืนยันผล

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 93 ส่วนที่ 5 ผลการตรวจยืนยันด้วยว ิธี Polymerase chain reaction (PCR) การตรวจยืนยันด้วยวธิี Polymerase Chain Reaction (PCR) ให้ดำ เนินการตรวจ ในกรณีที่สงสัยว่าพบเชื้อมาลาเร ียชนิด P. knowlesi หร ือกรณีผลการตรวจสอบซ้ำไม่สอดคล้อง กับผลการตรวจเดิม และหน่วยงานที่ส่งตรวจสอบซ้ำขอให้ตรวจยืนยันด้วยวธิี PCR ช่องท 13 ี่ วันที่ตรวจด้วยวธิี PCR ช่องท 14 ี่ ผลการตรวจด้วยวธิี PCR ให้ระบุผลการตรวจพบหร ือไม่เชื้อ และชนิดเชื้อกรณีที่ตรวจ พบเชื้อ ช่องท 15 ี่ ชื่อผู้ตรวจ (ตัวบรรจง) ช่องท 16 ี่หมายเหตุ ในกรณีทหน่ ี่วยงานที่ทำการตรวจสอบซ้ำ ไม่ได้ทำการตรวจด้วยวธิี PCR ได้เองให้ลงชื่อห้องปฏิบัติการทเป็น ี่ผู้ตรวจด้วยวธิี PCR 5.4 การบัันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์ม iDES-01: บัันทึึกการติิดตามผลการรัักษาผู้้ป่่วยมาลาเรี ีย คำ แนะนำ การลงรายงาน แบบติดตามผลการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย มีดังนี้ สถานที่ตรวจรักษา 1. ใชส้ ำ หรับผู้ป่วยมาลาเร ียทุกราย 2. สถานที่ตรวจรักษา ลงชื่อและทอยีู่่สถานทให้การ ี่ตรวจรักษา ข้อมูลผู้ป่วย 1. ชื่อ-นามสกุลผู้ป่วย ลงชื่อและนามสกุลของผู้ป่วย 2. อายุ ลงอายุของผู้ป่วย เป็นปี 3. เพศ เลือกทำ เคร ืองหมาย ่ ลงหน้าช่อง ชาย หร ือหญิง 4. น้ำหนัก ลงน้ำหนักของผู้ป่วย เป็นกิโลกรัม 5. ทอยีู่่ปัจจุบัน ลงเลขท หมีู่่ ตำ บล อำ เภอ และจังหวัดทอยีู่่ของผู้ป่วย กรณีผู้ป่วยต่างชาติ ให้ใชท้อยีู่่ของนายจ้าง รหสั ผู้ป่วย 1. ลงรหัส นคม./วันทกินยา ี่วันแรก/อันดับผู้ป่วย ผลการตรวจ 1. ชนิดเชื้อที่ตรวจพบ เลือกทำ เคร ืองหมาย ่ ลงหน้าช่องชนิดเชื้อที่ตรวจพบ 2. ผลการตรวจ G6PD เลือกทำ เคร ืองหมาย ่ ลงหน้าช่องผลการตรวจ ยารักษา 1. ชนิดยาทจ่าย เล ี่ือกทำ เคร ืองหมาย ่ ลงหน้าช่องยาทจ่ายและลงจำ ี่นวนเม็ดยา ทจ่าย ี่ทงหมดั้

94 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ วันที่นัด 1. วันนัด/เดือน/ปี ลงวันท เดี่ือน และปี พ.ศ. ที่ติดตามผลการรักษาตามกำ หนดนัด วันที่ผู้ป่วยมา ลงวันท เดี่ือน และปี พ.ศ. ที่ติดตามผลการรักษาผู้ป่วยจร ิง 2. อุณหภูมิ เป็นองศาเซลเซียส วัดอุณหภูมิร่างกายของผู้ป่วยทางปาก หากวัดทาง รักแร้ ให้บวกเพิ่ ม 0.5 องศาเซลเซียส 3. จำ นวนเชื้อระยะไม่มีเพศ/เม็ดเลือดขาว สำ หรับสถานตรวจบำ บัดที่ตรวจด้วย กล้องจุลทรรศน์ ลงตัวเลขจำ นวนเชื้อระยะไม่มีเพศ กรณีวงกล้องสุดท้ายนับจำ นวน เม็ดเลือดขาวเกิน 200 ตัว ให้ใช้จำ นวนเม็ดเลือดขาวทั้งหมดที่นับได้ เช่น นับเชื้อระยะไม่มีเพศได้ 250 ตัวจากเม็ดเลือดขาว 203 เซลล์ ให้ลง 250/203 ถ้าไม่พบ ให้ลง 0 4. อาการข้างเคียงที่พบ ลงเคร ืองหมาย ่ ในช่องอาการข้างเคียง 5. ชื่อผู้รับผิดชอบ ลงชื่อ-นามสกุล เจ้าหน้าที่ผู้รับผิดชอบ 6. กรุณาเขียนตัวบรรจง ให้ชัดเจน ดำาเนินการ 1. แนะนำ การกินยา ลงเคร ืองหมาย ่ ในช่องทดำ ี่เนินการ 2. อาเจียนภายใน 30 นาทีลงเคร ืองหมาย ่ ในช่องใช่ หร ือไม่ใช่ 3. ทฟำ ิล์มเลือด 2 แผ่น ลงเคร ืองหมาย ่ ในช่องวันทดำ ี่เนินการ 4. เก็บเลือดบนกระดาษกรอง ลงเคร ืองหมาย ่ ในช่องวันทดำ ี่เนินการ 5.5 การบัันทึึกข้้อมููลในแบบฟอร์์ม iDES-02: ใบนำำาส่่งตััวอย่่างการติิดตามการรัักษาผู้้ป่่วยมาลาเรี ีย แบบฟอร์ม iDES-02: ใบนำส่งตัวอย่างการติดตามการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ตัวอย่างที่ส่งตรวจสามารถเชื่อมโยงผลการตรวจระหว่างวันแรกที่พบเชื้อ และวันที่ติดตามผลการรักษาได้ ทำ ให้สามารถแปลผลประสิทธภิาพการรักษาได้อย่างถูกต้อง ตัวอย่างส่งตรวจประกอบด้วย ฟิล์มเลือด 1 แผ่น กระดาษกรองเก็บเลือด 3 จุด 1 แผ่น ทลงี่ ข้อมูลหน้าซองกระดาษกรองให้ครบถ้วน ดูรายละเอียดใน MM-SOP-07: การเก็บเลือดใส่ กระดาษกรอง การติดตามผู้ป่วยมาลาเร ียต้องติดตาม 4 ครัง ้สำ หรับเชื้อมาลาเร ียชนิดฟัลซิปารัม จะติดตามวันท 3 7 28 และ 42 ี่วัน และสำ หรับเชื้อมาลาเร ียชนิดไวแวกซ์ ติดตาม วันท 14 ี่ 28 60 และ 90 วัน ข้อมูลที่ต้องบันทึกประกอบด้วย ส่วนที่ 1 ข้อมูลทั่วไป ข้อมูลทวั่ ไป หน่วยงานที่ส่ง ชื่อผู้ส่ง และเบอร์โทรติดต่อ เพื่อให้สามารถติดต่อกลับได้ ในกรณีมีข้อสงสัย ส่วนที่ 2 ข้อมูลการตรวจพบเชื้อครังแรก้ ข้อมูลการตรวจพบเชื้อครังแรก และข้อมู้ลผู้ป่วยที่ชว่ ยในการเชื่อมโยงกับวันที่ติดตาม ได้ แบ่งออกเป็น ช่องท 1 ี่ อันดับท หมายถี่ึงอันดับของตัวอย่างที่ส่งเพื่อให้รูว้่ามีกี่ตัวอย่าง ช่องท 2ี่ รหัสผู้ป่วย ใช้รหัสเดียวกับรหัสใน แบบฟอร์ม MM-01: แบบบันทึกรายละเอียดการ ตรวจฟิล์มเลือด MM-01

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 95 ช่องท 3ี่ ชื่อ-นามสกุล ผู้ป่วย เพื่อชว่ ยในการตรวจสอบเม ื่อมีตัวอย่างติดตามวันอื่ นที่ส่ง มาภายหลัง ดังนั้นควรเขียนให้ชัดเจน ตัวสะกดจะต้องถูกต้องตรงกันในผู้ป่วย รายเดียวกัน ช่องท 4ี่ เลขบัตรประจำตัวประชาชน หร ือบัตรอ ื่ น ๆ ที่สามารถระบุตัวบุคลได้ และต้องลง ทุกครัง้ที่ส่งตัวอย่าง ช่องท 5ี่ สถานบร ิการที่ตรวจพบเชื้อครังแรก (Day 0) ประกอบด้้วยชื่อสถานที่ตรวจ อำ เภอ และจังหวัด ช่องท 6ี่ วันแรกที่พบเชื้อ ให้ ลงวันท เดี่ือน และปี ที่พบเชื้อวันแรก ช่องท 7ี่ ผลการตรวจวันแรกที่พบเชื้อ ให้ระบุชนิดเชื้อ ส่วนที่ 3 ผลการตรวจคัดกรองภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD สถานบร ิการตรวจว ินิจฉัยมาลาเร ียบางทำการตรวจภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD ได้ หากมีการตรวจภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD ให้กรอกข้อมูลผลการตรวจดังนี้ ช่องท 8: ี่ ผลการตรวจภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD ด้วยวธิฟีลูออเรสเซนต์ (Fluorescence Spot Test, FST) ให้ลงผลเป็น “ปกติ” หร ือ “พร่อง” ดูรายละเอียดในค่มูือ ปฏิบัติงานการตรวจคัดกรองภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD และการควบคุมคุณภาพ ช่องท 9-11: ี่ ผลการตรวจภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD ด้วยวธิี Biosensor ช่องที่ 9 ใส่ค่า G6PD ที่ตรวจได้ ช่องที่ 10 ใส่ค่าฮีโมโกลบิน (Hb) และช่องที่ 11 การแปลผล การตรวจ ให้ลงผลเป็น “ปกติ” หร ือ “พร่อง” ดู ดูรายละเอียดในค่มูือปฏิบัติงาน การตรวจคัดกรองภาวะพร่องเอนไซม์ G6PD และการควบคุมคุณภาพ ส่วนท 4 ี่ข้อมูลของตัวอย่างที่ติดตามการรักษา ช่องท 12: ี่การติดตามครัง้ที่ ระบุเป็นวันที่ติดตาม (Day) เช่น Day 3 หร ือ Day 7 หร ือ Day 14 ช่องท 13: ี่ วันที่เก็บตัวอย่าง ซึ่งอาจจะตรงหร ือไม่ตรงกับวันในตารางติดตามก็ได้ ให้ลง วันท เดี่ือน ปี ช่องท 14: ี่ ผลการตรวจฟิล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ ณ วันทเก็บ ี่ตัวอย่างส่งตรวจ ช่องท 15: ี่จำ นวนเชื้อ และจำ นวนเม็ดเลือดขาวทนับได้ ี่ ช่องท 16: ี่ความหนาแน่นของเชื้อทคำ ี่นวณได้ ส่วนที่ 5 ตัวอย่างส่ ิงส่งตรวจ ให้ทำ เคร ืองหมาย (/) หร ือ ระบุ่ว่า “มี” “ไม่มี” ในช่องทกำ ี่ หนด ได้แก่ ฟิล์มเลอด 1 แ ืผ่นที่ เป็นแบบหนาและบางบนสไลด์แผ่นเดียวกัน กระดาษกรองเก็บเลอด 3 จุด 1 แ ืผ่น แบบติดตาม การรักษา (จะส่งเมื่ อครบการติดตาม หร ือสิ้ นสุดการติดตาม) ซองยากำ กับการกินยาสำ หรับ ผู้ป่วยไวแวกซ์ให้ส่งวันท 14 เ ี่ พื่อตรวจสอบว่าผู้ป่วยกินยาครบถ้วนหร ือไม่ หมายเหตุ: แบบฟอร์มนี้จัดทำ เป็นเล่มทมี ี่สำ เนาในตัวเอง เพื่อสะดวกในการจัดส่ง สามารถขอ ได้ท กองโรค ี่ติดต่อนำ โดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข โทร 02 590 3128-9

96 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 6. ข้อควรระวังที่เก ี่ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงาน · อ่านคำแนะนำการลงรายงานให้ละเอียด · ไม่ใชน้้ � ำยาลบคำผิดเมื่อเขียนผิด หร ือต้องการแก้ไข ให้ใช้ปากกาขีดฆ่าแล้วเขียนใหม่ · เขียนชื่อผู้ป่วยให้ชัดเจนอ่านง่าย และระมัดระวังเร ือง่ตัวสะกดให้ถูกต้อง 7. การควบคุมคุณภาพ · ตรวจสอบความครบถ้วนถูกต้อง และทำสำเนาเก็บไว้เพื่อเป็นหลักฐาน 8. เอกสารมาตรฐานการปฏิบัติงานที่เก ี่ยวข้อง · MM-SOP-07: การเก็บเลือดใส่กระดาษกรอง · MM-SOP-10: การตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียในฟิล์มหนาและบาง · MM-SOP-11: การนับจำนวนเชื้อมาลาเร ีย · MM-SOP-13: ความปลอดภัยในการตรวจว ินิจฉัยมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ 9. เอกสารอ้างอิง · กองโรคติดต่อนำโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข แนวทางการปฏิบัติงานกำจัดโรคไข้ มาลาเรี ียสำำหรัับบุุคลากรทางการแพทย์์ พ.ศ. 2562 หน้้า 23 - 36 · กองโรคติดต่อนำโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข แนวทางเวชปฏิบัติในการรักษาผู้ป่วย โรคไข้้มาลาเรี ียประเทศไทย พ.ศ. 2562 หน้้า 33 - 39 10. ภาคผนวก · แบบฟอร์ม รว. 1: ระเบียนผู้ป่วยได้รับการตรวจโลหิตหาเชื้อมาลาเร ีย · MM - 01: แบบบันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด (Detailed Record of Blood Film Examination) · MM - 02: แบบบันทึกรายละเอียดการตรวจสอบฟิล์มเลือดและตรวจสอบซ้ำ � (Detailed Record of Blood Film Checking and Rechecking) · iDES - 01: แบบติดตามผลการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย · iDES - 02: ใบนำส่งตัวอย่างการติดตามการรักษาผู้ป่วยมาลาเร ีย

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 97แบบฟอร์ม รว. 1 ระเบียนผู้ป่วยได้รับการตรวจโลหิตหาเชื้อมาลาเร ีย 93แบบฟอร์มรว. 1 ระเบียนผู้ป่วยได้รับการตรวจโลหิตหาเชื้อมาลาเร ีย

98 คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ วันทเี่ตร ียม ฟิล์มเลือด 1 รหัสฟิล์ม/ Lab number 2 วันที่ ตรวจ 3 ผลการ ตรวจ 4 จำ นวน เชื้อที่ นับได้ 5 จำ นวน WBC หร ือ จำ นวน RBC ทนับี่ 6 ความหนาแน่น ของเชื้อ (P/µl) 7 ผู้ตรวจ 8 หมายเหตุ 9 แบบฟอร์์ม MM-01: บัันทึึกรายละเอีียดการตรวจฟิล์ิ ์มเลืือด MM01 แบบบันทึกรายละเอียดการตรวจฟิล์มเลือด (Detailed Record of Blood Film Examination) สถานที่ตรวจ สคร./ ศตม/ นคม./ รพ. ........................................................................................ ประจำ งวดวันท ……..…………...……. เดี่ือน ………………..………… พ.ศ. ………...…..

คู่มือปฏิบัติงานการตรวจว ินิจฉัยเชื้อมาลาเร ียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการควบคุมคุณภาพ 99 แบบฟอร์ม MM-02: บันทึกรายละเอียดการตรวจสอบฟิล์มเลือด แบบบันทึกรายละเอียดการตรวจสอบฟลมเลือด และตรวจสอบซํ้า (Detailed Record of Blood Film Checking and Rechecking) ประจํางวดที่...............................วันที่.................เดือน.................................พ.ศ. ............................ หนวยงานตรวจสอบ........................ MM02 วันที่ ตรวจสอบอันดับ ฟลมเดิมอันดับ ฟลมใหมผลการ ตรวจความ หนาแนนเชื้อ (Parasite/ul) ผลการตรวจเดิมผลการ ตรวจคุณภาพ ฟลมความ หนาแนนเชื้อ (Parasite/ul)ผลการตรวจซํ้าวันที่ผลตรวจ ยืนยันผลตรวจ ยืนยันความ หนาแนน เชื้อ ผลการตรวจไมสอดคลองวันที่ ตรวจ PCRผลตรวจ ดวย PCRชื่อหอง ปฏิบัติการ PCR ผลตรวจดวย PCRหมายเหตุ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16