Biotecnologie_AppuntiMarcoClerici_Notes

◊ CLONE
È una qualunque cellula che deriva da un’altra cellula, e quindi se tutti i cloni derivano da una cellula che
presenta del DNA ricombinante avrò tanti cloni ricombinati. Usando questa tecnica si è riuscita ad ottenere
dei frammenti di DNA che corrispondono a dei geni specifici.

Gene frammento di DNA tripletta d’inizio sequenza di basi (registro)

una o più triplette di stop

Dopo aver fatto queste manipolazioni ci sono delle procedure che mi dicono se sono andate a buon fine.

◊ PROCEDURA DI INATTIVAZIONE INSERZIONALE
Inserisco cioè un pezzo di DNA estraneo nel plasmide.

Gene resistente alla Gene resistente alla
ampicillina tetracillina

Origine di replicazione

Nella figura il plasmide ingegnerizzato ha, oltre un’origine di replicazione, 2 geni i quali conferiscono ai
batteri che ricevono questo plasmide una resistenza sia all’antibiotico della tetracillina che alla ampicillina
(o penicillina).

Ci sono degli enzimi che tagliano questi geni come la penicillasi. Quest’ultima è una proteina il cui compito
è quello di tagliare il gene resistente alla penicillina. Il DNA che codifica questa proteina è sito proprio
all’interno del gene che la proteina deve tagliare.
Facendo penetrare questo plasmide all’interno di un batterio riesco a renderlo immune sia alla penicillina
che alla tetracillina, proprio grazie ala presenza sul plasmide dei due geni specifici. Riesco così a trasformare
un batterio da sensibile a resistente. Se sul gene resistente alla ampicillina /tetracillina c’è un unico sito per
un enzima di restrizione, allora si può aggiungere tale enzima, il quale riconoscendo il sito e andando a
tagliare la sequenza specifica, linearizza il plasmide. Il risultato del taglio è che la sequenza del gene per la
resistenza alla ampicillina sarà interrotta. Se al posto della sequenza che è stata tagliata inserisco un pezzo
di DNA passeggero e poi aggiungo DNA-ligasi, ottengo un plasmide ricombinato. Si è così fatta una
mutazione per inserzione. I batteri che riceveranno i plasmidi ricombinati, non saranno più immuni alla
ampicillina /tetracillina e quindi saranno sensibili a tale antibiotico proprio perché il gene è stato interrotto
dall’inserzione di un passeggero. Ciò si chiama inattivazione inserzionale.
Dopo questa procedura descritta si avranno due colonie di batteri:

- Una colonia contenente batteri che non hanno captato plasmidi e quindi saranno sensibili
alla tetracillina

- Una colonia i cui batteri hanno captato i plasmidi e quindi saranno resistenti alla
tetracillina.

I plasmidi captati potranno essere di due tipi:
- Plasmidi le cui estremità coadesive dopo il taglio si sono legate con le estremità di un
passeggero. Saranno quindi resistenti alla tetracillina ma in aggiunta contengono anche una
sequenza di DNA estraneo (plasmidi ricombinati).
- Plasmidi le cui estremità coadesive dopo il taglio si sono richiuse su se stesse. Risulteranno
quindi resistenti alla tetracillina ma al loro interno non contengono nessun frammento di
DNA estraneo, ovvero nessun passeggero.

Quindi una prima selezione mi serve per evidenziare quei batteri che non hanno captato plasmidi e che
quindi sono sensibili alla tetracillina. Una seconda selezione mi permette di dividere in due colonie i batteri
che risultano resistenti alla tetracillina. In una ci metto i plasmidi le cui estremità dopo la linearizzazione si
sono richiuse su se stesse e in un'altra i plasmidi ricombinati.

Posso utilizzare un trucco per evidenziare l’inattivazione inserzionale. Impiego stuzzicadenti sterilizzati per
prelevare i batteri dalla piastra 1 e depositarli in due piastre in parallelo in posizioni che posso facilmente
identificare. È quindi una deposizione ordinata: dopo aver toccato la piastra 1 tocco la piastra 2 e poi la 3 in
punti facilmente individuabili, poi butto via lo stuzzicadenti e ripeto la procedura. Dopo di che pongo le
piastre 2 e 3 a incubare a 37° C e osservo se cresce qualcosa.

Piastra 1 In tale piastra ci sono tutte le colonie
dei batteri che hanno captato i
Piastra 2 plasmidi, quindi risultano tutti
Piastra di controllo contenente resistenti alla tetracillina.
solo tetracillina. Piastra contenente tetracillina.
Unica differenza con la piastra
1 è che le colonie sono state Piastra 3
deposte in modo ordinato
Piastra contenente tetracillina
e ampicillina.

Bisognerà quindi confrontare se ci sono batteri che crescono in presenza di sola tetracillina (piastra 2) ma
non crescono con tetracillina e ampicillina. I batteri che crescono in presenza sia di tetracillina che
ampicillina sono batteri che o hanno ricevuto un plasmide che non è stato tagliato oppure che è stato
tagliato e linearizzato ma che non è stato inserzionato con alcun passeggero, ovvero le estremità si sono
ricircolarizzate su se stesse. Quelli che invece sono ricombinati ovvero quei batteri che contengono plasmidi
in cui è avvenuta l’inattivazione mediante inserzione, non potranno crescere in presenza di ampicillina
perché hanno perso il gene che li rende immuni.
Posso quindi andare ad analizzare, nella posizione corrispondente sulla piastra 2, la colonia cresciuta solo
con tetracillina e prelevarne dei campioni, poiché questi avranno al loro interno sicuramente dei plasmidi
ricombinati. A questo punto ho una collezione di plasmidi ricombinati, ciascuno con al loro interno un
frammento di DNA estraneo, ma non ho ancora ottenuto la clonazione di un gene.

Per identificare all’interno della collezione di plasmidi quello che contiene il frammento di DNA che mi
interessa (ad esempio codifica per una particolare proteina), c’è bisogno di un enzima che sia in grado di
retrotrascrivere ovvero polimerizzare una copia di DNA partendo da uno stampo di RNA. Tale enzima ci
serve poiché, servendoci di una genoteca (ovvero una collezione di frammenti di DNA già codificati)
possiamo far ingerire al nostro plasmide anziché un DNA qualunque il DNA che corrisponde al gene che
voglio clonare. Per far ciò bisogna isolare e purificare la componente di mRNA dal citoplasma di una cellula
che è specifica per la sintesi di quella proteina.
Devo quindi seguire la seguente procedura:

- Individuare le cellule in cui è presente in abbondanza l’mRNA che mi interessa.
- Attacco alla coda di poliAAA, sita all’estremità 3’ dell’mRNA, un oligonucleotide di TTTTTT. Questo

oligonucleotide si ibridizzerà facilmente con la coda di poliAAA presente nell’mRNA. Inoltre se io
attacco l’oligonucleotide di timina alla cellulosa (matrice inerte) questo mi isolerà tutti gli mRNa dai
restanti tipi di RNA. Avrò quindi un 1-3% di mRNA isolato.
- In tal modo riesco poi a selezionare l’mRNA di mio interesse.
- Su questo mRNA faccio agire l’enzima, che è una trascrittasi inversa, in modo da polimerizzare una
copia di DNA partendo da uno stampo di RNA.
In questo modo si riesce ad ottenere una collezione di DNA a doppio filamento che, attraverso la procedura
analizzata, posso inserzionare, tramite inattivazione, nei plasmidi che ho a disposizione. Riesco così ad
ottenere dei plasmidi ricombinati non più con pezzi di DNA qualunque, ma con pezzi di DNA che ho
precedentemente sintetizzato. Ottengo così una collezione di cloni.

◊ PROCESSO A RITROSO
Un'altra strategia di clonaggio prevede di applicare un processo a ritroso:

- Parto dalla sequenza amminoacidica della proteina di cui si vuole clonare il gene.
- La sequenza di AA è ottenuta tramite la degradazione di Edman che determina vari frammenti di

peptidi ottenuti in seguito a scissione con proteasi o con cianuro di bromogeno.
- Ottenuta la sequenza di AA, devo cercare nel codice genetico la corrispondente sequenza di

triplette nucleotidiche che posso avere. Questo perché il codice genetico è ridondante quindi ad un
AA può corrispondere più di un codone e quindi a seconda delle triplette che scelgo ho delle
sequenze finali diverse.
- Se sulla mia sequenza AA ho molte Met e Trp sarà facile identificare la sequenza genetica di mio
interesse poiché questi AA hanno un solo codone che li codifica.
- Con questo procedimento a ritroso posso identificare 8, 16 , 32 oligonucleotidi, di cui uno identifica
sicuramente un frammento di DNA che codifica per la proteina di interesse.
- Dopo aver ottenuto gli oligonucleotidi sintetici devo ripetere la procedura di inattivazione
inserzionale per ottenere dei plasmidi ricombinati contenenti dei frammenti di DNA appartenenti
alla mia genoteca.
- Dopo aver diviso i cloni ricombinati dalle restanti cellule batteriche si provvede all’amplificazione e
purificazione del DNA plasmidico ricombinante.

Dopo aver ottenuto la piastra con le colonie batteriche contenenti segmenti clonati di DNA estraneo, passo
alla setacciatura delle colonie stesse.

Nella sacchetto contenente il filtro di nitrocellulosa
aggiungo una soluzione contenente la sonda da DNA,
ottenuta marcando gli oligonucleotidi sintetici con
fosforo32 in modo da renderli radioattivi. Dopo aver
sigillato il sacchetto faccio avvenire l’ibridazione.

Soluzione contenente Traferisco la colonia su un filtro di
la sonda nitrocellulosa e inserisco il filtro in un
sacchetto trasparente per congelare i cibi.
Durante tale trasferimento, denaturo
completamente il DNA plasmidico, ovvero
separo i 2 filamenti della doppia elica.

Taglio poi un pezzo del sacchetto, butto via la soluzione sonda
contenente gli oligonucleotidi marcati con fosforo32, lavo il
filtro cosi da ripulirlo dalle sequenze di oligonucleotidi che
non si sono appaiate e così rimarranno solo quelle sequenze
di oligonucleotidi che hanno incontrato un frammento di DNA
con cui c’è complementarità secondo Watson e Crick.

Aggiungo una lastra autoradiografica al filtro che contiene il
DNA ibridizzato con la sonda. Solo pochissime colonie della
mia genoteca impressionano la lastra radiografica.

Sonda di DNA Confrontando l’autoradiografia con la piastra originaria riesco
a capire quali sono le colonie che contengono dei plasmidi
Gene di interesse che hanno al loro interno una sequenza che corrisponde alla
DNA a filamento singolo sequenza della proteina di mio interesse. Tali colonie
proveniente dai plasmidi corrispondono a quelle in cui è avvenuta l’ibridazione con la
ricombinati sonda e che quindi hanno impressionato la lastra radiografica.

Ottenuto almeno un frammento di DNA della sequenza della proteina di interesse, ripeto il processo
andando a marcare non più gli oligonucleotidi sintetici ma proprio il frammento di DNA appena ottenuto e
cercando di individuare un frammento ancora più grande della sequenza della mia proteina e cosi via..

Osservazioni:
1. Tutte questa procedura mi consente di trovare il cDNA ossia il DNA corrispondente al messaggero
che codifica la mia proteina. Tale cDNA tuttavia differisce dalla sequenza di DNA originale per la
mancanza degli introni. Ciò è dovuto al fatto che il DNA è stato copiato, mediante trascrittasi
inversa, direttamente dall’mRNA sintetico in cui sono già stati eliminati gli introni.
2. I plasmidi possono contenere al loro interno inserzioni lunghe al massimo un centinaio di coppie di
basiche è un po’ poco se si pensa a proteine lunghe 100-150 AA.

Entrambi questi due problemi si sono risolti ricorrendo all’uso dei fagi:
1. Mescolo una sospensione di batteri con una di virus e aggiungo il tutto al così detto agar molle
(sostanza gelatinosa) e poi lo rovescio in una piastra di agar duro e lo lascio solidificare.
2. Se si mantiene la piastra in un termostato, per un tempo non troppo lungo, riuscirò ad estrarla
quando ognuno degli eventi di penetrazione di un virus dentro un batterio ha dato origine ala lisi
dei batteri stessi. Questa lisi sarà stata bloccata in un punto del mio agar molle dando luogo alla
così detta placca di un fago (zona trasparente mentre quelle circostanti saranno torbide). Contando
tali placche ho il numero di virus presenti all’interno della mia piastra.
3. In seguito a numerosi studi condotti sui fagi si è capito che ci sono dei tratti del genoma virale che
hanno importanza secondaria e che possono quindi essere tagliati con l’aiuto di opportuni enzimi di
restrizione. Posso quindi sostituire queste regioni non essenziali per la sopravvivenza del fago con
pezzi di DNA estraneo e seguendo una procedura analoga a quella impiegata per i plasmidi,
ottenere dei fagi ricombinati. Il vantaggio consiste nel fatto che la porzione di DNA estraneo che
posso inserire è di gran lunga maggiore di quella che potevo inserire nei plasmidi.

FAGO RICOMBINATO: fago contenente al suo interno un pezzo di DNA estraneo ottenuto mediante
digestione di un DNA purificato dal nucleo della cellula. Non si parla più quindi di genoteche di cDNA ma di
genoteche genomiche (collezioni di frammenti di DNA derivanti dal nucleo delle cellule contenenti al loro
interno anche le sequenza introniche).
Ottengo così la clonazione di un frammento di DNA che corrisponde al gene.

AGENTI EZIOLOGICI: sono quei fattori causa di una determinata patologia e nella maggior parte dei casi
sono rappresentati da virus, batteri o funghi.
L’eziologia in medicina, è lo studio delle cause di una malattia. Le cause possono essere di natura:

- Chimica
- Fisica (radiazioni possono indurre mutazioni nella sequenza di DNA)
- Microbiologica (dovuto al fatto che viviamo in un mondo ricco di batteri e virus)
- Genetica (patrimonio genetico ricevuto dai genitori, mutazioni che si trasmettono da generazione

in generazione)
L’insieme di queste cause comporta delle conseguenze che inducono dei meccanismi patogeni.

◊ MUTAZIONI
Anemia falciforme (HbS): è provocata da una sostituzione nella catena della globina, ovvero una valina (Val
idrofobico) va a sostituire una acido glutammico (Glu idrofilico). Se la globina è difettosa l’emoglobina non
riuscirà a trasportare l’ossigeno in modo efficiente e ci sarà uno stato anemico. Nelle persone che hanno
questa mutazione quando vanno in debito di ossigeno, le molecole di globina hanno la tendenza a
raggrupparsi all’interno dei globuli rossi provocando una deformazione della membrana degli eritrociti
(aspetto a falce). Ciò causa una minor deformabilità dei globuli rossi da non permettere l’arrivo di ossigeno
nei capillari più piccoli. Vi può essere anche un’anemia puntiforme.
L’anemia può essere causata anche per delezione, infatti la globina ha più di un gene che codifica le proprie
catene α e β, quindi si possono avere diverse mutazioni.

Anemia mediterranea o Talassemia: è causata da una delezione e vi possono essere due tipologie di
talassemia. La talassemia eterozigosi dove solo uno dei due genitori presenta la delezione, il paziente ha il
50% di catene di globina sane. Questo è lo stato minore e più blando della malattia. Nella talassemia
omozigosi il paziente eredita da entrambi i genitori il gene mutato. È la forma più grave e in questo caso
manca il gene che codifica la catena β della globina.

Anemia fetale (HbF): è diversa da quella neonatale e da quella adulta (HbA). Mutazione che riguarda il
processo temporale, cioè la persistenza della HbF con il conseguente ritardo nello switch con l’HbA.

HbF HbA
αγ αβ
γα βα

Variano anche i luoghi dove vengono sintetizzate. Il risultato è un tetramero (α γ, α γ) che funziona ma non
è ottimizzata per il funzionamento nell’età adulta in quanto il suo funzionamento è ottimale nell’età fetale
dove gli scambi gassosi avvengono tramite la placenta e non attraverso i polmoni.

Le diverse tipologie di mutazioni comportano conseguenze diverse. Queste anemie anche se comportano
un solo gene modificato possono comportare conseguenze diverse anche in relazione ai prodotti genetici
generati dai geni modificatori in gioco. Influenza molto anche lo stile di vita condotto dal paziente, il tipo di
ambiente che lo circonda e i farmaci assunti. Queste mutazioni portano a infiammazioni e proliferazioni
anomale, malattie monogeniche e multigeniche. Notevole influenza viene esercitata anche sulle cellule e
sulle loro capacità di adattarsi, di trasdurre segnali.

I cambiamenti morfologici più comuni sono:
- Atrofia: decrescita delle cellule
- Ipertrofia: incremento delle dimensioni delle cellule, si associa molto spesso all’ipertrofia. Può
dipendere sia da un maggior utilizzo delle cellule sia da un fattore ormonale.
- Mitoplasia: cambiamento dell’architettura cellulare.

◊ MORTE CELLULARE
Morte cellulare: evento non solo patologico ma può essere anche fisiologico. Un esempio può essere il
timo. Il timo è un organo immunologico che serve solo nel primo periodo di vita dopo la nascita.
Successivamente subisce un’involuzione ovvero una specie di atrofia. Ci sono dei segnali capaci di attivare
di percorsi all’interno della cellula che provocano la morte della cellula stessa.

Morte cellulare programmata va sotto il nome di APOPTOSI ed è il risultato di una catena di eventi attivati
mediante l’invio di segnali o cascate di proteasi oppure mediante taglio proteolitico o tramite l’utilizzo di
farmaci. Il risultato finale è la demolizione di struttura quali le membrane, gli acidi nucleici, le proteine, gli
organelli citoplasmatici e del nucleo della cellula. Normalmente una cellula in fase di apoptosi si
raggrinzisce ma soprattutto si formano delle vescicole che racchiudono proprio questi organelli e che perciò
vanno sotto il nome di corpi apoptotici. L’apoptosi fa quindi parte del processo di rimodellamento cellulare
che avviene all’interno dell’organismo.

Morte cellulare o NECROSI subentra a seguito di traumi o malattie. La differenza principale tra necrosi e
apoptosi è che nella necrosi avvengono dei veri e propri danni fisici alle membrane delle cellule per cui il
oro contenuto viene rovesciato all’esterno. Ciò porta a una lisi poiché tutti gli enzimi che sono
compartimentalizzati all’interno dopo la necrosi vengono liberati e quindi possono svolgere la loro azione
dannosa. Nell’apoptosi, vista la formazione dei corpi apoptotici in cui le membrane rimangono integre, non
si verifica la fuoriuscita del contenuto intracellulare. I corpi cellulari vengono poi riconosciuti dai macrofagi i
quali si attaccano alle membrane apoptotiche e le ingeriscono demolendole. La degradazione del DNA e
quindi di tutto il corredo genetico, durante la necrosi è del tutto casuale invece nell’apoptosi c’è un
meccanismo selettivo di taglio tra nucleosoma e nucleosoma. Se si sottopone ad elettroforesi su gel di
agarosio DNA che proviene da cellule apoptotiche si nota un tipico profilo a scala a pioli.

In caso di necrosi l’organismo mostra una tipica risposta infiammatoria articolata nel seguente modo:
- Chemiostasi: migrazione dei globuli bianchi verso lo stimolo. Il sensore che rileva un’anomalia invia
un segnale alle cellule dell’endotelio (cellule che ricoprono i vasi e capillari) le quali mostrando delle
molecole di adesione riescono a perturbare il flusso laminare dei leucociti e così facendo fanno
rotolare i globuli bianchi verso la periferia dei vasi. I globuli bianchi rotolano proprio perché sono
trattenuti dalle molecole di adesione esposte dalle cellule endoteliali.
- Diabetasi: dopo il rotolamento i globuli bianchi passano attraverso le cellule endoteliali riuscendo
così a raggiungere le zone sede di infiammazione.

Lo stimolo può essere causato sia dalla presenza di un batterio che di cellule morte.

I così detti segni cardinali dell’infiammazione sono:
1. Calore: zone infiammate tipicamente sono calde perché vi è in atto una vasodilatazione dei capillari
che permette una maggior afflusso di sangue.
2. Rumor (rosso): zone più arrossate.

3. Tumor: distensione, ingrossamento. Travaso dei liquidi nelle zone colpite perché c’è un’alterata
permeabilità dei capillari.

4. Dolore: zona più sensibile e dolorosa

La differenza tra plasma e siero è dovuta alla presenza di fibrinogeno (proteina che serve per la
coagulazione del sangue).

GRANULOCITI: sono cellule che accorrono i globuli bianchi e sono in grado di rilasciare enzimi (perossidasi)
in grado di formare radicali liberi dell’ossigeno che sono capaci di distruggere qualsiasi struttura lipidica,
proteica o acido nucleico. Arrivano tramite diabetasi prima e chemiostasi dopo.

◊ PROLIFERAZIONE CELLULARE
Durante i tumori si ha una proliferazione anomale dalle cellule. Una caratteristica che si è potuta osservare
anche coltivando le cellule in vitro è che queste perdono l’inibizione da contatto. Dalle cellule coltivate in
vitro si può capire la presenza o meno di cellule tumorali:

- Se le cellule, dopo aver formato un unico strato, che ricopre l’intera superficie della piastra su cui
sono state coltivate, fermano la loro crescita allora si tratta di cellule sane.

- Se invece sono presenti delle cellule tumorali si verranno a creare delle passerelle multistrato.
Questo perché le cellule interessate hanno perso l’inibizione da contatto ovvero le molecole di
adesione (proteine transmembrana), che dovrebbero inviare dei segnali alla cellula nel caso di
contatto reciproco per far arrestare la proliferazione, perdono questa capacità.

◊ MITOSI Punto di
Fase culminante del processo proliferativo delle cellule. restrizione

Fase G0: le cellule che vanno incontro a differenziamento 6-8 h
terminale escono per sempre dal ciclo. È anche il punto di rientro.
Fase G1: vi è la sintesi di RNA e delle proteine ma non del DNA. 6-12 h 3-4 h
Fase S: sintesi del DNA cioè raddoppio le quantità di DNA nella 1h
cellula duplicando i cromosomi.
Fase G2: continua la sintesi di RNA e di proteine ma non quella del
DNA.
Fase M: mitosi ossia divisione nucleare e citochinesi (divisione
cellulare) generano due cellule figlie.
Punto di restrizione: una cellula che supera questo punto è
destinata a entrare nelle fase S

La mitosi è preceduta da tre fasi preparatorie. La più importante è la fase S. Tra mitosi e la fase S ci sono
due fasi intermedie ossia Gap1 (G1) e Gap2 (G2).

RITMO PROLIFERATIVO
Non tutte le cellule hanno lo stesso ritmo proliferativo. Per esempio le cellule cerebrali e del fegato hanno
un ritmo proliferativo lentissimo cioè proliferano solo se hanno subito delle perdite. Questa differenza nel
ritmo proliferativo si estrinseca nella fase G1. Quindi le cellule che hanno un ritmo proliferativo più veloce
hanno una fase G1 più veloce e viceversa. Le cellule cerebrali e del fegato non hanno una fase G1 bensì una
fase G0 che si potrebbe dire infinitamente lunga. La fase M è lunga più o meno uguale in tutte le cellule.

PUNTO DI RESTRIZIONE
La durata della fase G1 dipende dal punto di restrizione ossia quel momento della cellula in cui avvengono
tutte le verifiche e i controlli per permettere alla cellula stessa di completare la fase G1 e entrare nelle fase
S. Se le cellule hanno una fase G1 lunga vuol dire che prolungano il tempo di attraversamento di tale punto.
La cellula quindi prima di duplicare il DNA si assicura che tutti i processi metabolici siano a posto. Se si
devono riparare eventuali danni o correggere sequenze di DNA, lo si deve fare durante la fase G1 prima di
attraversare il punto di restrizione.

Le osservazioni sulla durata della fase G1 furono fatte dall’epidemiologo Knudson il quale sapeva che in
genetica si possono distinguere due situazioni:

- Un gene acquista o aumenta una funzione dopo aver subito una mutazione
- Un gene perda la sua funzione dopo una mutazione
Quindi ci possono essere mutazioni che accelerano il ritmo proliferativo (permettono l’acquisto di una
funzione) e mutazioni che fermano il ritmo (causano la perdita di una funzione).
I principi della genetica affermano che noi riceviamo due copie di uno stesso gene (allele materno e allele
paterno). Se uno solo dei due alleli è mutato e si hanno delle mutazioni acceleranti queste possono causare
tumori. Nel caso delle mutazioni frenanti si può avere il caso di eterozigosi, cioè soltanto uno dei due alleli è
mutato e questa situazione non provoca tumori, oppure il caso si omozigosi in cui tutti e due gli alleli sono
inattivati e causa tumori.
Knudson osservando un particolare tumore che colpisce i retinoblasti, vide che si poteva presentare in due
forme:
- Forma familiare che ha quindi una base genetica e la si ritrova di generazione in generazione.
- Forma sporadica non ereditaria molto meno frequente di quella familiare.
Sulla base di queste osservazioni Knudson enunciò la TEORIA DEI DUE COLPI:
- Primo colpo: mutazione di un allele a livello delle cellule germinali, quindi tutte le cellule avranno

un allele mutato. Ciò non è molto grave perché ne avranno un altro sano.
- Secondo colpo: alla nascita vi è un distretto, quello dell’occhio, che è meno protetto rispetto agli

altri dalle radiazioni (a livello dei retinoblasti) e ciò può causare le mutazioni anche nel secondo
allele (situazione di omozigosi). Vi è quindi la perdita totale dell’attività di un gene frenante
comportando la proliferazione incontrollata. Può succedere anche se in rari casi, che, seppur
mancando il primo colpo, una radiazione possa colpire entrambi gli alleli e quindi comportare la
perdita totale dell’attività del gene (forma sporadica).

◊ GENE RETINOBLASTOMA (Rb)
Proteina che sta alla base del retinoblastoma, controlla la trascrizione dei geni che sono coinvolti nel
passaggio del punto di restrizione. È il freno che dice alla cellula di aspettare che i meccanismi di
riparazione siano completati prima di passare alla fase S. Se Rb non riceve i giusti segnali la cellula non può
passare alla fase S.
I meccanismi di controllo della proteina Rb sono soggetti a delle cicline (proteine) che sono delle
componenti dei sistemi di modifica post-trasduzionale specifici nella fosforilazione e defosforilazione.
Quindi l’azione più importante nel controllo del ritmo proliferativo è svolta dalle kinasi cicline dipendenti
(CDK). Dalla distruzione ritmata di subunità di queste CDK, si ha il passaggio da una fase alla successiva del
ciclo. Si associano con le chinasi che sono enzimi fosforilanti.
Se Rb non è fosforilata è in grado di prelevare questo fattore di trascrizione E2F il cui scopo è quello di
trascrivere quei geni che controllano il passaggio attraverso il punto di restrizione. Questo è un esempio di
regolazione negativa. Normalmente quindi Rb interagendo con E2F frena, cioè blocca, la trascrizione di

questi geni e il processo proliferativo si ferma alla fase G1. Quando però Rb viene fosforilata da parte di
CDK l’interazione con E3F è bloccata provocando una depressione e quindi E2F può attivare la trascrizione
dei geni che servono per passare attraverso il punto di restrizione. In realtà anche il meccanismo della
chinasi è sottoposto a regolazione, infatti questa attività è normalmente bloccata da un inibitore della
chinasi (INK).

La p53
Il tumore oltre che da radiazioni e mutazioni può essere provocato anche da virus a DNA e retrovirus
chiamati virus tumorali. Una famiglia di questi virus che può provocare anche tumori benigni ha permesso
di scoprire un altro freno cellulare ossia la p53. La p53 ha peso molecolare 53000 Da e agisce a livello della
proteina INK. All’inizio non si riusciva a capire come dei virus a DNA con un genoma estremamente piccolo
riuscissero a scatenare un tumore nelle cellule. La spiegazione è data dal fatto che il genoma di questo virus
è in grado di codificare un antigene T che non solo è in grado di complessare e inattivare la p53, ma
contemporaneamente è in grado di inattivare anche la proteina Rb. Quindi questi virus sono in grado di far
inceppare quei meccanismi regolatori che tengono frenati i meccanismi proliferativi della cellula.
La p53, oltre la funzione di freno, fa parte di un importante sistema antivirale atto al controllo della
sequenza di DNA prima che la cellula possa attraversare il punto di restrizione e passare alla fase S. La p53 è
una sorta di guardiano del genoma.
Ci sono anche dei sistemi sensoristici che hanno il compito di prendere la difficile decisione, qualora i danni
siano irreparabili, di degradare la cellula. Questo è dovuto anche al fatto che la permanenza in G1 della
cellula per i controlli di qualità non può prolungarsi oltre un ragionevole limite. In tal caso la p53 invia dei
segnali alla cellula per mandarla in apoptosi (la morte della cellula non provoca una risposta infiammatoria).
La p53 è una proteina e come tale ha un gene che la codifica. Anche questo gene può subire delle mutazioni
generando una proteina mutata. Si può avere sia il caso che solo uno degli alleli che codificano sia mutato,
ma si può avere che anche entrambi i geni siano mutati. Il risultato è che la p53 non funziona pù e quindi
mancando questo meccanismo di sorveglianza ad ogni duplicazione cellulare ci possono essere delle
mutazioni.
Il cancro quindi è una malattia genetica perché non funzionando più questi meccanismi di regolazione e
controllo, si crea il così detto accumulo catastrofico di mutazioni, cioè le cellule che si moltiplicano di
generazione in generazione non saranno più sottoposte a controlli di qualità e quindi accumuleranno delle
mutazioni.
Si è visto che certe mutazioni della p53 sono più frequenti di altre, cioè certi codoni del gene che codifica la
p53 sono più a rischio di mutazioni. Questi codoni sono colpiti da cancerogeni conosciuti quali quelli
provenienti dal fumo di sigaretta come il benzochirene. Ci sono anche altri cancerogeni che possono
provocare mutazioni della p53 quali l’Aflotossina. Deriva da aspergillo giallo che è una muffa gialla che
cresce nei paesi tropicali e contamina soprattutto i silos. L’aflatossina ha permesso di spiegare la presenza
tra i virus a DNA che causano tumori, del virus che causa l’epatite B.
L’epatite B è una malattia grave ma non tumorale che provoca continue stimolazioni infiammatoria delle
cellule del fegato. Nella popolazione del sud est asiatico c’è una percentuale maggiore di ammalati di
epatite B. Ciò si spiega con il fatto che queste popolazioni si alimentano con derrate alimentari contenute
nei silos contaminati dall’aflotossina.
Quindi nel distretto del fegato si possono verificare prima un’infiammazione dovuta alla presenza del virus
dell’epatite B e poi a causa delle derrate contaminate una mutazione di alcuni codoni del gene della p53. A
questo punto non c’è più la possibilità da parte del guardiano del genoma di controllare l’insorgere di
eventuali mutazioni nel DNA delle cellule e ciò porta all’insorgere di tumori del fegato.
Quindi per la loro funzione svolta la Rb e la p53 sono stati chiamati geni oncorepressori.

Gli oncogeni agiscono mediante il primo meccanismo visto di guadagno di funzione ossia da acceleratori.
Va di pari passo con la scoperta dei retrovirus e ha a che fare con le tecniche di ibridazione del DNA già
discusse.