particulatematterandsterilitytestcolor

QUALITY CONTROL IN
STERILE PRODUCTS

กติ ตโิ ชติ วรโชตกิ ำจร

วตั ถุประสงค์

- เพ่ือทราบถงึ หลกั เกณฑ์และวธิ ีการของการควบคุม
คุณภาพผลติ ภณั ฑ์ปราศจากเชื้อโดยวธิ ี Leaker test
- เพ่ือทราบถงึ หลกั เกณฑ์และวธิ ีการของการควบคุม
คุณภาพผลติ ภณั ฑ์ปราศจากเชื้อโดยวธิ ี clarity test
และ Particulate matter test

- เพื่อทราบถงึ หลกั เกณฑ์และวธิ ีการของการควบคุม
คุณภาพผลติ ภัณฑ์ปราศจากเชื้อโดยวธิ ี sterility

test/pyrogen test/endotoxin test

การควบคุมภาพผลติ ภณั ฑป์ ราศจากเชือ้

1. Raw Materials
2. In-Process Controls
3. Finished Products

1. Raw Materials

ตอ้ งตรวจทกุ อยำ่ ง ทงั้ ตวั ยำ
สำรเคมี ภำชนะบรรจุ จกุ ฉลำก

2. In-Process Controls

o ตรวจ WFI เป็นงำนประจำ โดยเฉพำะ Pyrogen test
o ตรวจดปู รมิ ำณทผ่ี ลติ จะตอ้ งเทำ่ กบั ทฤษฏที ุกขนั้ ตอน
o ตรวจวดั คำ่ กำรนำไฟฟ้ำของน้ำระหวำ่ งกำร กลนั่ หรอื

ออสโมซสิ ยอ้ นกลบั (reverse osmosis)
o ตรวจ Sterility ในกำรผลติ
o บนั ทกึ เวลำ, อุณหภมู ใิ นกำรฆำ่ เชอ้ื ดว้ ยควำมรอ้ น
o ตรวจสอบเอกลกั ษณ์ของฉลำก
o ตรวจดปู รมิ ำตรและน้ำหนกั ของยำระหวำ่ งกำรบรรจุ

3. Finished Products

เป็นกำรตรวจตำม Specifications ทร่ี ะบุในเภสชั
ตำรบั
Leaker test
 Clarity test & Particulate matter analysis
 Sterility test
 Pyrogen test /endotoxin test
 Toxicity (Safety test)

Leaker test

◼ เป็นกำรทดสอบภำชนะบรรจุเฉพำะแอมพลู วำ่ หลอมปิดสนทิ
หรอื ไม่ เพรำะบำงทอี ำจมรี รู วั่ หรอื รอยแยกทเ่ี ลก็ มำก มอง
ดว้ ยตำเปลำ่ ไมเ่ หน็ แตเ่ ชอ้ื จลุ นิ ทรยี ส์ ำมำรถเขำ้ ไปภำยในได้
หรอื น้ำยำอำจรวั่ ซมึ ออกมำระหวำ่ งกำรเกบ็ รกั ษำ

กำรทดสอบทำไดโ้ ดยแชแ่ อมพลู ในน้ำสที เ่ี ขม้ ๆ
(เชน่ 0.5-1% Methylene blue solution)

1. ตม้
หรอื 2. เกบ็ ใน vacuum desiccator ดดู อำกำศภำยในตอู้ อก
ใหเ้ ป็นสญู ญำกำศ ทง้ิ ไวป้ ระมำณ 10 นำที ถำ้ แอมพลู ใดมรี อยรวั่ จะทำให้
ภำยในแอมพลู มคี วำมดนั เป็นลบ เมอ่ื ปล่อยใหม้ คี วำมดนั เท่ำกบั บรรยำกำศ
ภำยนอกอยำ่ งรวดเรว็ กจ็ ะดดู เอำสำรละลำยของสเี ขำ้ ไปในหลอด เมอ่ื นำแอ
มพลู ไปลำ้ ง กจ็ ะเหน็ ไดว้ ่ำหลอดใดทด่ี ดู สเี ขำ้ ไป แสดงวำ่ รวั่
หรอื 3. ยำฉดี ทต่ี อ้ งเขำ้ ทำกำรฆ่ำเชอ้ื ใน autoclave ใหใ้ สแ่ อ
มพลู ในสำรละลำยสกี ่อนนำเขำ้ autoclave(ทำพรอ้ มกบั
sterilization) เมอ่ื นำออกจำก autoclave ทง้ิ ใหเ้ ยน็ ลง แอมพลู ใด
รวั่ กจ็ ะดดู สเี ขำ้ ไป

หมำยเหตุ วธิ นี ้ถี ำ้ รอยรวั่ เลก็ ประมำณ 15 ไมครอน อำจจะตรวจพบหรอื ไมพ่ บกไ็ ด้

Clarity test & Particulate matter
analysis

◼ กำรทดสอบควำมใส (clarity test)

◆ เป็นกำรตรวจอนุภำคทม่ี ขี นำด 50  หรอื มำกกว่ำ
◆ จะทำทุกภำชนะบรรจุ โดยอำจทำภำยหลงั กำรกรองก่อนบรรจแุ ละ

หลงั จำกบรรจใุ สภ่ ำชนะปิดผนกึ เสรจ็ แลว้ อกี ครงั้ หน่ึง
◆ เพ่อื ดวู ่ำยำฉดี นนั้ ปรำศจำกอนุภำคของสำรใด ๆ ทไ่ี มล่ ะลำย ทจ่ี ะไปทำ

ใหเ้ กดิ ผลทไ่ี มต่ อ้ งกำรในคนไข้ เช่น ไปอุดตนั ในระบบกำรหมนุ เวยี น
เลอื ด
◆ อนุภำคในยำฉีดส่วนใหญ่เป็นเศษแกว้ เศษพลำสตกิ เศษยำง เสน้ ใย
เซลลโู ลส ฝ่นุ ละออง ซง่ึ มขี นำดตงั้ แต่ 1 ไมครอน ถงึ 500 ไมครอน

Clarity test หรือ Visual inspection
หรอื การตรวจสอบด้วยตาเปล่า

◼ USP บ่งวำ่ ยำฉดี Solution/constituted solution ทกุ ตำรบั (รวมสำรละลำยยำ
ฉีดเขำ้ กลำ้ มและใตห้ นงั ) ตอ้ งไมม่ ี particle เมอ่ื ตรวจโดย visual inspection

วธิ ีการ

1. สอ่ งดู Particle เทยี บกบั ฉำกขำว-ดำ โดยใชไ้ ฟ 100 วตั ต์
2. สอ่ งดู Particle โดยใช้ polarized light

ข้อเสยี
▪ ควำมตงั้ ใจ, สำยตำ, สขุ ภำพ, อำรมณ์ของผตู้ รวจ
▪ ควำมแตกต่ำงระหวำ่ งแต่ละคน
▪ ตอ้ งอำศยั ควำมชำนำญมกี ำรฝึกฝน มกี ำรพกั สำยตำระหวำ่ งกำรตรวจ

Particulate matter ตำม USP24

◼ consist of mobile, randomly-sourced,
extraneous substances, other than gas bubbles,
that cannot be quantitated by chemical analysis
due to the small amount of material that it
represents and to its heterogenous composition

◼ จะหมำยถงึ อนภุ ำคท่ีมีขนำดนอ้ ยกว่ำ 50 









หลกั กำรหำ particulate matter โดย

electronic particle procedures

❑ Light-blockage principle** เช่น HIAC Particle
Counter (High Accuracy Particle Counter) ตรวจสอบ
และวดั ขนำดอนุภำค โดยใหล้ ำแสงผ่ำนหลอดทบ่ี รรจสุ ำรละลำยไป
photocell ถำ้ มอี นุภำคอยรู่ ะหว่ำงลำแสงจะทำใหบ้ ำงส่วนของลำแสง
ถกู รบกวน กำรส่งผ่ำนของแสงไป photocell จะลดลง วธิ นี ้ไี มต่ อ้ งมอี ิ
เลก็ โทรไลต์ แต่อำจมกี ำรนบั ฟองอำกำศ





Test for Particulate matter ทบ่ี ง่ ใน

USP 40

- solutions for injection i.v. (LVP, SVP)
- solution for injection i.m., subcutaneous (ยกเวน้ ยำสตั ว)์
- ยกเวน้ parenteral products for irrigation solutions,

radiopharmaceutical products
- parenteral products using final filters prior to

administration (ตอ้ งมี scientific data ยืนยนั )

Test for Particulate matter ทบ่ี ่งใน
USP 40

Method 1. Light obscuration particle count
test

1A-Large-volume injections ทงั้ หมดที่ฉลากระบวุ ่าปริมาตร
บรรจมุ ากกวา่ 100 ml (solution for parenteral infusion or
solution for injection)

1B-Single dose / multiple dose small volume
injections ท่ีมีขนาดบรรจนุ ้อยกว่าหรอื เท่ากบั 100 ml (solution
for parenteral infusion or solution for injection)

Light obscuration particle count test

Test environment เครอ่ื งมือ เคร่ืองใช้ น้าที่ใช้
- เคร่ืองมือทุกชิ้นต้องสะอาด โดยแช่ใน warm nonionic

detergent solution หรอื organic solvent ล้างด้วยน้า
สะอาดแล้วจึงล้างด้วยน้าที่ผา่ นการกรองด้วยเย่ือกรองรขู นาดอย่าง
น้อย 1.2 ไมครอนหรือน้ากลนั่
- ทาใน laminar flow hood ท่ีติด ultra-HEPA
filter (High efficiency particulate air)



Light obscuration particle count test

Test environment criteria

ถา้ อนุภาคขนาดใหญ่กว่าหรือเท่ากบั 10 ไมครอน จานวนมากกว่า
25 อนุภาค/25 ml ของ combined sample (5
samples each of 5ml) จากการทา test environment
ไมเ่ หมาะสาหรบั หา particulate matter โดย light
obscuration particle count test

Light obscuration particle count test

10-unit or more pool (< 25 ml) Single units (> 25 ml)
(<10 units)

Calibration Validation

Resolution Sampling plan
Blanks
 Volume accuracy
Light Obscuration Assay

Count accuracy Training

Test 1B Test 1A

SVI (< 100ml) Limits LVI (> 100ml)

NMT 6000 /container : 10 m NMT 25 / ml : 10 m

NMT 600 /container: 25 m NMT 3 / ml : 25 m

25



2. Microscopic Particle Count Test

❑ ใช้กบั small volume และ large volume injection
❑ เป็นการนับ subvisible, essentially solid, particulate matter ใน

product ต่อหน่วยปริมาตร/ภาชนะบรรจหุ ลงั การกรองบน microporous
membrane filter
❑ ใช้กบั Product ท่ีไมส่ ามารถใช้ method 1 ได้ เช่น ผลิตภณั ฑท์ ี่ไม่ใสหรอื คอ่ นขา้ ง
หนืด เช่น emulsions, colloids, liposomal preparations หรือผลติ ภณั ฑ์
ทเ่ี กดิ ฟองเมอ่ื ทดสอบโดย method 1
❑ ไมส่ ามารถใช้กบั สารท่ีมีความหนืดมาก เช่น concentrated dextrose, starch
solution, dextrans, หรอื product ที่ประกอบด้วย amorphous,
semiliquid เน่ืองจากกรองไม่ได้ ให้เจือจางเพื่อลดความหนืดจนกรองไดแ้ ลว้ นามา
ทดสอบโดยวิธีนี้

2. Microscopic Particle Count Test

Test environment

ล้างเคร่ืองแก้วให้สะอาด เช่นเดียวกบั วิธีการของ light
obscuration โดยทาใน LAF

ต้องมอี นุภาคขนาดใหญ่กว่าหรอื เท่ากบั 10 ไมครอน
ไม่เกิน 20 อนุภาค และต้องมีอนุภาคขนาดใหญ่กว่าหรือเท่ากบั
25 ไมครอน ไม่เกิน 5 อนุภาค ต่อ 50 ml particle-free
water ใน filtration area แสดงว่า background
particle level ตา่ พอที่จะทา microscopic assay

2. Microscopic Particle Count Test

10-unit pool (< 25 ml) Single units (> 25 ml)

Calibration Validation

USP graticule Microscopic Test Amorphous P.M.?
Sampling plans
Total unit or pool
filtration Blanks
Training
Partial (statistical) counting

SVI (< 100ml) Limits LVI (> 100ml)
NMT 12 / ml : 10 m
NMT 3000 /container : 10 m NMT 2 / ml : 25 m

NMT 300 /container: 25 m









Sterility Test

◼ เป็นกำรทดสอบวำ่ ยำฉดี ทผ่ี ลติ ขน้ึ ปรำศจำกเชอ้ื จรงิ หรอื ไม่
◼ เป็นเพยี งกำรสุ่มตวั อยำ่ งมำทดสอบตำมเกณฑท์ ก่ี ำหนด
◼ ตอ้ งควบคมุ ประสทิ ธภิ ำพกำรทำงำนของเครอ่ื งมอื ทใ่ี ช้ในกำร

ผลติ ใหป้ รำศจำกเชอ้ื , ควบคมุ จำนวนเชอ้ื ในสถำนทท่ี ำกำรผลติ
◼ กำรทดสอบน้เี ป็นกำรทดสอบทต่ี อ้ งกำรผลทแ่ี น่นอน ตอ้ งแน่ใจวำ่

ทกุ กระบวนกำรทดสอบตอ้ งปลอดเชอ้ื 'asepsis'
◼ เพ่อื ใหไ้ ดผ้ ลกำรทดสอบทถ่ี ูกตอ้ งจรงิ ๆ ดงั นนั้ ผทู้ ำกำรทดสอบ

ตอ้ งไดร้ บั กำรฝึกมำเป็นอยำ่ งดี

Sterility Test

1. Membrane Filtration Technique
(ปกตมิ กั ใชว้ ธิ นี ้ีเป็นหลกั )

2. Direct Inoculation (Direct
transfer)

Sterility Test

Sterility (definition)
state of being free of live bacteria or

other microorganisms
Sterilization (definition)

the removal or destruction of all
microorganisms, including pathogenic and
other bacteria, vegetative forms and spores

อาหารเลยี้ งเชือ้

1. Fluid Thioglycollate Medium
(FTG)

2. Soybean-Casein Digest
Medium (SCDM)
3. Alternative Thioglycollate
Medium

1. Fluid Thioglycollate Medium

◼ เป็ น media หลักในการทดสอบ sterility test
◼ ทดสอบ bacteria ชนิด aerobe และ anaerobe
◼ ในสูตรมี Resazurin Sodium Solution
ถ้ามีสีชมพแู สดงว่ามีออกซิเจนมาก ให้ heat โดยใช้ steam จน

สีหายไป
◼ อาจใช้แทน SC media ไดโ้ ดยบ่มเพาะภายใต้ aerobic

condition ทอ่ี ุณหภมู ิ 20-25C

Incubate under aerobic/anaerobic condition

(32.5  2.5o)

2.Soybean-Casein Digest Medium

◼ เป็ น media หลักในการทดสอบ sterility test
◼ ทดสอบ aerobic bacteria และ รา

Incubate under aerobic condition
(22.5  2.5o)

3. Alternative Thioglycollate Medium
◼ เหมอื น fluid thioglycollate medium แต่ไมม่ ี agar
และ resazurin sodium solution
◼ sterilize ท่ี condition เหมอื น 1
◼ใช้สาหรบั sterility test พวก device ท่ีมี tube รู
เลก็ ๆ

Incubate under anaerobic condition

(32.5  2.5o)

หลกั กำรทดสอบ sterility test

◼ ทา positive control (growth promotion test)
◼ ทา negative control (sterility of media)
◼ ทา Method suitability test (validation test) ของ

วธิ ีทดสอบ
◼ ทดสอบ sample ตาม condition ทไี่ ด้จากการทา

validation test

positive control or growth promotion test

◼ เป็นการทดสอบ growth promotion ของ medium
◼ เพาะเลีย้ งเชื้อใน medium ท่ีต้องการทดสอบตามสภาวะที่

กาหนด (positive control)
◼ medium ที่ทดสอบใช้ได้ ถ้าเชื้อแต่ละชนิด สามารถเจริญ

ได้ภายใน 3 วนั สาหรบั เชื้อแบคทีเรยี และภายใน 5 วนั
สาหรบั เชื้อรา หลงั การบม่ เพาะเชื้อ
◼ สามารถทาไปพรอ้ มๆกบั การทดสอบ sterility of media และ
การทา sterility test
◼ หาก media ไม่ผา่ น growth promotion test หรอื sterility of
media ถอื ว่าการทดสอบ sterility test ไม่ OK

positive control or growth promotion test

⧫1. Bacillus subtilisA (ATCC No 6633)
⧫2. Candida albicansF (ATCC No 10231)
⧫3. Aspergillus nigerF(ATCC 16404)
⧫4. Clostridium sporogenesAN (ATCC 11437) หรือใช้

Bacteroides vulgatus แทน ถ้าต้องการ non-spore forming
microorganism
⧫5. Staphyloccocus aureusA (ATCC 6538) หรือ ถา้ ไมม่ ีใช้
1 แทน
6. Pseudomonas aeruginosaA (ATCC 9027) หรือใช้
Micrococcus Iuteus

Sterility Test USP40 (Positive control)

FTG SCDM

30-35 C 20-25 C

Incubate 3วนั (bacteria) 5 วนั (fungi)

Sterility of media

◼ เป็นกำรทำ negative control
◼ เป็นกำร confirm sterility ของ medium
◼ วธิ กี ำร นำ medium ทจ่ี ะทดสอบ sterility test

(sterile media) ไป incubate ทอ่ี ุณหภมู ทิ จ่ี ะทำกำร
ทดสอบ ไมน่ ้อยกวำ่ 14 วนั

General procedure for Sterility Test

USP40

Number of Articles to Be Tested

◼ สำหรบั ตวั ยำทเ่ี ป็นของเหลวใหด้ ใู นตำรำงท่ี 2
◼ กำรทดสอบ sterility test ตอ้ งใช้ medium อยำ่ งน้อย 2 medium ขน้ึ

ไปต่อ 1 sample (SC , FTG)
◼ ตอ้ งระวงั ในกำรเปิด sample ทจ่ี ะทดสอบเพอ่ื ป้องกนั ไมใ่ หเ้ กดิ กำรปนเป้ือนของ

เชอ้ื บรเิ วณดำ้ นนอกของภำชนะ
◼ ผวิ ดำ้ นนอกของ ampuls และจุกขวด และ vial ตอ้ งทำควำมสะอำดกอ่ นดว้ ย

decontaminating agent ทเ่ี หมำะสมและตอ้ งเกบ็ ในทท่ี ป่ี ้องกนั กำร
recontaminate ของผวิ ดำ้ นนอก

Number of Articles to Be Tested

◼ ถำ้ vial content บรรจภุ ำยใตส้ ญู ญำกำศ ให้ sterile air โดยใช้
sterile needle ทต่ี ่อกบั membrane filter holder ทใ่ี ช้
sterilizing grade filter

◼ สำหรบั article พวก purified cotton, gauze, surgical
dressing, suture และ related pharmacopoeial articles ใหท้ ำ
กำร decontaminate ดำ้ นนอกของ package และทำกำรเปิด package
โดยวธิ ี aseptic

◼ เป็ นเกณฑส์ าหรับ sample หน่ึง container ต่อ 2 media ถา้ หน่ึง
container ใชไ้ ดแ้ ค่ 1 media จานวน sample ตอ้ งเป็ นสองเท่าของเกณฑ์

Table 2 Minimum Number of Articles to Be

Tested in Relation to the Number of Articles in the

Batch Number of Articles to be
tested
Number of Articles in the Batch

Parenteral preparations

Not more than 100 articles 10 % or 4 articles
whichever is the greater
More than 100 but not
more than 500 articles 10 articles
More than 500 articles
2 % or 20 articles,
For large volume parenterals whichever is less
2 % or 10 containers,
whichever is less

Quantity of Articles, Volume of Medium and
Incubation Conditions (Liquid Products)

◼ ปริมาณของ sample ที่ใช้ต่อ container ดรู ายละเอียดในตารางที่
1 (USP40)

◼ ปริมาตรของ medium ที่ใช้ ถา้ ไม่ไดร้ ะบใุ น monograph ให้ใช้
เกณฑด์ งั นี้ ตามเกณฑ์ของ USP40 volume of sample ต้องไม่เกนิ
10% ของ Volume media (Direct inoculation ) แต่อาจมี
การเปลี่ยนแปลงไดข้ ึน้ กบั ผลการทดสอบ method suitability

test
◼ ส่วนปริมาตร medium สาหรับวธิ ี membrane filtration สามารถ

ประยกุ ต์ปริมาตร medium ตารางท่ี 1 (USP24)
◼ อณุ หภมู ิที่ใช้สาหรบั การ incubate F. ท่ี 30-35 C., S. ที่ 20-25 C.

เป็นเวลาไม่น้อยกวา่ 14 วนั ไมว่ า่ จะใช้วิธีใดในการทดสอบ
◼ ระหวา่ ง 14 วนั ของการ incubate ถ้า sample ขุ่น พอครบ 14 วนั

ให้ sampling มา NLT 1 ml ดผู ลต่ออีก 14 วนั

Quantity of Articles, Volume of Medium and
Incubation Conditions (Liquid Products)

◼ ต้องมีการทา testing facilities ไดแ้ ก่
- clean rooms and clean zones
- isolators

◼ การ test ต้อง aseptic technique
◼ ต้องทา Negative control
◼ ต้องทา Positive control
◼ ต้องทดสอบ Bacteriostatic + Fungistatic activity ของ

ตวั อย่าง (Method suitability test) ถา้ มีกาจดั โดยใช้
neutralizing agent หรอื dilution แล้วใช้ condition ดงั กล่าว
ในการทดสอบ