Heat Sterilization Validation

1. บทนํา ( Introduction )

ยาปราศจากเช้อื มีคุณสมบัติพิเศษหลายอยา งตา งจากยารปู แบบอื่นๆ เชน ความ ปราศจากเชอื้ ปราศจาก
ไพโรเจน ปราศจากอนุภาค แตอยางไรก็ตามจุดประสงคหลักของการผลติ ยาปราศจากเชอื้ คอื ไมมีการ
ปนเปอนของจลุ นิ ทรยี อยา งสิ้นเชิง
ปกติจะทดสอบความปราศจากเชื้อดวยการทาํ sterility test ซ่ึงเปนการสุมตวั อยางมาทดสอบเทาน้ันไม
สามารถทดสอบทกุ ภาชนะบรรจุ เน่ืองจากมีขอ จํากดั ในการทดสอบ
วัตถุประสงคก ารตรวจสอบความถกู ตองกระบวนการทําใหป ราศจากเชือ้ เพอ่ื เปนการยืนยนั วายาท่ผี ลิต
ดวยกระบวนการผลติ ทเี่ หมาะสมโดยเฉพาะวิธีการทําใหปราศจากเช้ือทถี่ กู ตองนํามาซงึ่ ยาที่ไมม คี ําวา
ไมปราศจากเช้ือ (non sterility )
หลักการที่เกย่ี วขอ งกบั การตรวจสอบความถูกตองสาํ หรบั ยาปราศจากเชือ้ คือ การสรางความปราศจาก
เชื้อเขาในผลิตภัณฑเพ่ือแสดงใหเห็นวามีความเปนไปไดสูงสุดท่ีกระบวนการทําใหปราศจากเชื้อนั้น
(sterilization method)สามารถสรางความปราศจากเชอื้ ใหกบั ทกุ หนวยของผลิตภณั ฑแ ตละครัง้ ของการ
ผลติ ( product batch ) และเพ่ือเปน การประกันและสนับสนนุ ผลของการทดสอบความปราศจากเช้อื
(sterility test )ของยาสําเรจ็ รูปอีกดวย
การตรวจสอบความถกู ตอ งของกระบวนการทําใหปราศจากเช้อื เปนกระบวนการตอ เนื่องพัฒนาเปน ข้ัน
ตอน เร่ิมตัง้ แตก ารวจิ ัยและพัฒนา การออกแบบดานวศิ วกรรม การผลิต และ การซอ มบาํ รงุ สว นการ
ทดลอง( experimental phase ) ท่ีเรียกวา การทดสอบความถูกตอ ง (Validation testing ) เปนเพยี งสวน
หนึ่งของโปรแกรมการตรวจสอบความถกู ตอ ง ( Validation Program )เทา น้นั
โปรแกรมการตรวจสอบความถกู ตอ ง จะตอ งมีองคประกอบดังนี้

• ออกแบบและสรางอุปกรณท่ีสามารถทําใหปราศจากเช้ืออยางสม่ําเสมอและเชื่อถีอไดใน
สภาวะท่ตี องการ

• ตองพสิ ูจนว าเคร่ืองมอื และอุปกรณควบคุม( critical control)ท่ีสําคญั เชน อุปกรณว ดั ความดนั
และอณุ หภมู ิ สามารถใชงานไดใ นขอบเขตของของคาควบคุม ( parameter )ในกระบวนการ

• เขาใจหลักการตายของจุลินทรยี  ( microbial death ) และความหมายของการปราศจากเช้อื ( sterile )
• เขา ใจลกั ษณะเฉพาะของวสั ดุ ( load )ท่ีจะทําใหปราศจากเชื้อดว ยกระบวนการท่ีเหมาะสม
• ตรวจสอบความถูกตอ งรอบเวลาการทาํ ใหปราศจากเชื้อ (Validate cycle )ทใ่ี ช เพ่อื พิสจู นวา

สามารถทาํ ใหป ราศจากเช้อื ไดต ามทีก่ าํ หนดไว

1

• คงสภาพการควบคมุ และตดิ ตามตรวจสอบ ( monitor ) เปนประจําในกระบวนการผลิตไวเพือ่
ใหมั่นใจวายาที่ผลิตไดมีคุณภาพปราศจากเชื้อในสภาวะท่ีไดตรวจสอบความถูกตองของ
กระบวนการทาํ ใหป ราศจากเชอ้ื

• บันทกึ เปน ลายลกั ษณอ ักษรในทกุ ข้ันตอนท่ีทาํ

2. นยิ ามศัพท ( Glossary )

Sterility หมายถงึ การไมมีจลุ ินทรียที่มีชวี ิตอยางสิ้นเชงิ

Terminal sterilization หมายถึง กระบวนการทาํ ลายจลุ นิ ทรียข องยาที่อยูในภาชนะปด

Sterilization หมายถึงกระบวนการที่ทําลายหรอื กําจัดจลุ นิ ทรยี ท่ีมีชีวิตขึน้ กบั วธิ กี ารทใ่ี ชทําให
ปราศจากเชื้อ

Bioburden หมายถึงจํานวนของจุลนิ ทรยี ที่มีชวี ติ ท่ีอยใู นวสั ดุหรือในยาเตรียมกอ นเขา กระบวนการทํา
ใหปราศจากเช้อื โดยปกติจะกําหนดเปน CFU ( colony forming unit )ตอ ปริมาตรหรอื 1หนวยบรรจุ

Pyroburden หมายถึง จํานวนไพโรเจนทอ่ี ยใู นวัสดหุ รอื ยาเตรยี มกอ นเขา กระบวนการทําใหปราศจาก
ไพโรเจน

Viable หมายถึง สามารถมีชีวติ หรอื เจริญเตบิ โตได

Non-viable หมายถงึ ไมส ามารถมชี วี ติ หรอื เจริญเตบิ โตได

Heat Shock หมายถงึ กระบวนการทใ่ี ชความรอน (80 oC - 85 oC ) คัดแยกแบคทเี รยี ที่ทนความรอน
และใชในการกระตุน ใหเ กดิ สปอร

Load หมายถึง ส่ิงของที่ใสเ ขา ไปในกระบวนการทาํ ใหป ราศจากเช้อื

2

Action Level หมายถึง คาตัวแปร หรอื เกณฑท่กี าํ หนดขน้ึ เพื่อใชในการควบคุมกระบวนการตา งๆ ซ่งึ
ถาคาทีต่ รวจวัดไดเ กินจาก action level จะตองตรวจสอบหาสาเหตแุ ละ ดําเนินการแกไ ขและปอ งกัน

Alert Level หมายถงึ คาตัวแปรหรอื เกณฑที่กาํ หนดข้นึ เพ่อื ใชใ นการควบคมุ กระบวนการตา งๆ ซง่ึ ถา
คาทีต่ รวจวดั ไดเกินจากalert level เปนการเตอื นใหร วู า กระบวนการน้นั ไดเ บ่ียงเบนจากสภาวะการ
ทํางานปกติ ควรตองตรวจสอบเอกสารหรือบันทึกท่ีเก่ยี วขอ งและแกไ ข

Worst case หมายถงึ สภาวะหรือตัวแปรท่ีอยใู นขอบเขตสูงสุดหรอื ต่ําสดุ ของสภาวะปกติ ทีอ่ าจสงผล
กระทบตอ กระบวนการผลติ หรือผลติ ภณั ฑมากทีส่ ุด และทําใหผลิตภัณฑเ สยี หายได

3. จุลชีววิทยาของกระบวนการทําใหป ราศจากเชื้อ(Microbiology of Sterilization Process)

จลุ ินทรยี มีอยูท่ัวไปในบรรยากาศสามารถเจริญเตบิ โตไดร วดเรว็ มาก บางชนิดเปน สาเหตุของ
โรคติดเชื้อชนดิ ตางๆ ในคน นอกจากน้ยี งั ทาํ ใหอาหารเนาเสยี และมีผลเสียตอวัสดตุ า งๆ ไดแ ก ผา
และหนังฟอก เปนตน ดังนัน้ เพอ่ื ปองกนั ปญ หาตางๆ ท่อี าจจะเกิดขน้ึ จงึ จําเปน ตอ งควบคุมการปน
เปอนและการเจริญของจลุ ินทรียในกระบวนการผลติ ยาปราศจากเชอื้

การทําลายจลุ นิ ทรีย สามารถทาํ ลายดวยวธิ ีทางกายภาพ เชน ความรอ น รงั สี เปน ตน หรือวธิ ี
ทางเคมี เชน น้ํายาฆาเช้อื เปนตน จุลินทรยี แ ตละชนดิ จะมคี วามทนทานตอสภาพแวดลอ มแตกตา ง
กัน

ปจจัยท่ีมีผลตอ อตั ราการถกู ทาํ ลายของจุลนิ ทรียโดยวิธที างกายภาพ หรอื วธิ ที างเคมี ไดแก
จํานวนจุลินทรีย ความเขมขนของสารตา นจลุ นิ ทรยี  ชนิดและอายขุ องจุลนิ ทรีย อุณหภมู ิ การมสี าร
อินทรีย ความเปนกรดหรือดา ง

กลไกการออกฤทธ์ยิ ับยั้งหรอื ทาํ ลายจลุ ินทรยี  ไดแก การทําใหผนังเซลลเ สียไป การเปลี่ยน
สภาพของเย่ือหมุ เซลล การเปล่ียนแปลงโมเลกลุ ของโปรตีน และกรดนิวคลอิ ิก การยบั ยงั้ การทาํ งาน
ของเอนไซม และการยับยั้งการสงั เคราะหก รดนิวคลิอกิ และโปรตนี

3

3.1 การควบคมุ จุลนิ ทรยี  ( Microbial control )

3.1.1 ชนิดของการปนเปอ นจุลินทรีย (Types of contamination)
สงิ่ สําคัญในการผลิตยาปราศจากเช้อื คอื การปอ งกนั (prevention) และ การทาํ ลาย
(destruction)จุลนิ ทรยี 
การปนเปอ นจากส่งิ ทีม่ ีชีวิต ซ่ึงสวนใหญ คอื จลุ ินทรยี  (microorganism) ไดแ ก แบคทเี รีย
(bacteria) รา (fungi) ไวรสั (virus)
คนเราไมสามารถมองเห็นจลุ ินทรยี ไ ดดวยตาเปลา ตองศึกษาโดยใชก ลองจุลทรรศน แต
สามารถ มองเหน็ จลุ ินทรียจาํ นวนมากท่เี จรญิ และอยเู ปน colony ดังนน้ั ในบางคร้งั ปญหาการปนเปอ น
ของจลุ นิ ทรยใ นยา จะไมสามารถมองเห็นได การปนเปอนของจุลนิ ทรยี ในยาท่ีเปน สารละลายใส จะ
ตองมีการปนเปอ นถงึ 10 ลา นเซลลข องจลุ นิ ทรยี ต อ 1 มิลลิลิตร จึงจะเหน็ สารละลายขุน
ปจจัยท่ีสําคัญและจําเปนตอ การเจริญของจลุ นิ ทรยี  คือ ความช้ืน อาหาร และอณุ หภูมทิ เ่ี หมาะ
สม จุลินทรียบางชนดิ ตองการออกซิเจนในการเจริญโดยท่ีจุลินทรียบางชนิดไมต อ งการ อยา งไรก็ตาม
ถาขาดปจ จยั ท้ังสามดังกลาวขา งตน ก็ไมม ีผลทาํ ใหจลุ นิ ทรียตาย แตอ าจจะรอดชวี ิตอยไู ด จุลินทรยี 
หลายชนิดรอดชีวิตอยูไ ดใ นความแหง ทสี่ ะอาด หรือทเี่ ย็น
แบคทเี รีย ( bacteria ) เปนส่ิงมชี วี ิตเซลลเ ดยี ว มีรูปรางตางๆกนั คอื กลม(cocci) แทง (bacilli)
โคง (curve) แบงตามปฏกิ รยิ าการเกดิ สขี องผนงั เซลลใน Gram reaction ได 2 ประเภทไดแกG ram-
positive และGram-negative แบคทีเรียเพิ่มจาํ นวนโดยการแบง ตวั จาก 1 เปน 2 (binary fission)
คุณสมบตั ขิ องแบคทีเรยี ที่เกี่ยวขอ งกับการทาํ ใหป ราศจากเชอื้ คือการทแ่ี บคทเี รีย สามารถ
สรา ง spore ไดในสภาวะทีอ่ าหารไมเ พยี งพอและสภาวะทไ่ี มเอื้ออาํ นวยตอการเจรญิ เติบโต spore จะ
ทนตอ ความรอน sporesของแบคทีเรีย ที่ทนตอ ความรอ นสูงสุด ไดแก Bacillus และ Clostidium
โมลด (mould) เปนชนดิ หนึ่งของรา (fungi) มรี ปู รางและขนาดแตกตา งกนั ไป เช้ือราสามารถ
สราง spore ไดแต spore ของราไมทนความรอนสูงเหมอื นแบคทเี รยี
ยสี ต ( yeast )เปนชนิดหน่งึ ของรา (fungi) ถา ดภู ายใตกลองจุลทรรศนจ ะมีลักษณะเหมือน
แบคทีเรยี แตม ีขนาดใหญกวา เล็กนอ ย
ไวรสั ( virus )เปนสิง่ มชี วี ติ ที่เจริญไดภ ายในเซลลท ่ีมีชีวิตเทาน้ันโดยทวั่ ไปไวรสั ถูกทาํ ลายได
ไมยากนกั
Bacterial endotoxin เปนสาร pyrogen ท่พี บปนเปอ นมากที่สดุ ในยาปราศจากเช้อื สว นมาก
เปน toxin และโปรตนี ของแบคทเี รยี กรมั ลบ (Gram negative bacteria) เชน E.coli และ Salmonella
ถา รา งกายไดร บั toxin เหลานี้ จะทําใหเ กดิ ไข

4

Endotoxin อาจจะตรวจพบบนพื้นผวิ ของภาชนะบรรจุ ในเคร่ืองมอื และวัสดุตา งๆ ซ่ึงเคย
สัมผัสกบั สารละลายที่มี pyrogen ปนเปอ น หรอื ท้ิงไวเปยกๆ ทําใหมีจุลนิ ทรยี บ างชนิดเจรญิ ได ใน
กระบวนการทําใหปราศจากเช้อื จะไมทําลาย pyrogen ดงั นั้นจะตอ งควบคุมไมใ หม กี ารปนเปอนของจุ
ลินทรยี ท ี่สรา ง pyrogen โดยเลือกใชวัตถุดิบและน้าํ ที่ปราศจากสาร pyrogen และควบคุมกระบวนการ
ผลิตไมใ หมีการปนเปอนจุลินทรีย

นอกจากน้ียาปราศจากเชอ้ื จะตอ งไมม กี ารปนเปอ นของส่งิ ทไ่ี มม ชี วี ติ (non-living
contamination) สามารถแบง กลุมสง่ิ ท่ไี มมีชวี ติ ไดเปน 2 กลมุ คือ 1. Active contamination 2. Inert
(inactive) contamination คําวา active หมายถึงมีฤทธิ์ หรอื มคี ณุ สมบัตทิ างเคมี

3.1.2 แหลงของการปนเปอ น (Sources of contamination)
3.1.2.1 แหลงของการปนเปอนดว ยส่ิงไมม ชี ีวิต (non-living contamination)
การปนเปอนจากสารเคมี (active chemical) อาจมสี าเหตุจากฝุน ละออง ในอากาศหรอื ท่ปี ก

คลุมตามพ้ืนผวิ ของภาชนะ เครื่องมือตางๆ หรือปนเปอ นมากับสารตกคา งจากผลิตภัณฑอ ่นื ซึง่ ใช
ภาชนะหรือเคร่อื งมอื น้นั มากอ นและลา งไมสะอาดหรอื สารตกคา งจากนํ้ายาที่ใชท าํ ความสะอาด

การปนเปอนของ inert non-living contamination หรือ particulate contamination ซึง่ มแี หลง มา
จากอาคารสถานที่ เครื่องมือ วตั ถดุ ิบ หรอื วสั ดอุ ืน่ ๆ ทีอ่ าจทาํ ใหเกดิ ฝนุ ละอองในบรรยากาศได ซึ่ง
โดยปกตใิ นหอ งทใี่ ชเ ตรยี มยาปราศจากเชื้อ จะตอ งมกี ารกรองอากาศทเ่ี ขา สหู อ ง เพ่อื กรองเอาอนุภาค
ตางๆ ท่ีปนเปอ นออกไป ดังนน้ั แหลงปนเปอ นทีส่ าํ คญั โดยปกติจะมาจากคน และเสอื้ ผา ทสี่ วมใส

3.12.2 แหลงของการปนเปอ นดวยจลุ ินทรีย (Sources of micro-organisms)
แหลงของการปนเปอ นดว ยจลุ ินทรยี  ไดแ ก สิ่งแวดลอ ม นา้ํ วัตถดุ ิบ ภาชนะบรรจุ และคน
แหลงของการปนเปอ นจากคน (people as a source of contamination)
คนเปนแหลง ของการปนเปอ นของจุลินทรียท ส่ี ําคัญ โดยจะพบจุลนิ ทรยี บนผิวหนงั ผม หนวด
เครา และในทางเดินอาหาร โดยจลุ นิ ทรียเหลา นี้จะแพรก ระจายโดยการไอ จาม การพูด ตะโกน รอ ง
เพลง เปน ตน เนอ่ื งจากโดยธรรมชาติไมส ามารถกาํ จัดจุลนิ ทรยี ด งั กลาวท่มี อี ยูในคนได จงึ มคี วามจํา
เปน ตอ งมีมาตรการปองกันผลิตภณั ฑไมใ หม กี ารปนเปอนของจลุ นิ ทรยี จากคนทเ่ี กี่ยวขอ งในการผลติ
การทีเ่ ราทราบรูปรา ง Gram reaction และการเรียงตวั ของแบคทีเรยี ท่พี บในกระบวนการผลติ ชว ย
ใหรูแหลง ที่มาของการปนเปอนและการควบคมุ ปอ งกันไมใหม กี ารปนเปอนเขา ในผลติ ภณั ฑ รวมทั้งวิธี
การที่จะทาํ ใหปราศจากเช้อื ได เน่ืองจากคณุ ลกั ษณะและนิสัยความเปน อยูของแบคทีเรียตา งกนั เชน
แบคทเี รยี กรมั ลบ ( Gram negative organism ) สวนมากจะอยูในนา้ํ

5

แบคทเี รยี กรมั บวกรปู รางกลม ( Gram positive coccus ) ท่ีอยเู ปน กลมุ กอน ( cluster ) ปนเปอนจาก
คนเน่ืองจากมันชอบอยตู ามผิวหนงั

ตัวอยา งของ Gram- positive และ Gram – negative ที่อาศยั ตามแหลง ตางๆ

Organism Habitat Gram reaction
Escherichia coli Human and animal colon Gram negative
Pseudomonas aeruginosa Water Gram negative
Bacillus subtilis Soil Gram positive
Staphylococcus aureus Human skin Gram positive

3.1.3 การควบคุมการปนเปอน (Control of contamination )

3.1.3.1 การควบคุมการปนเปอ นโดยการใชห อ งสะอาด (Control of contamination - clean

rooms )
ในการผลิตยาปราศจากเชื้อ วัตถปุ ระสงคค อื การกาํ จัดจุลินทรยี ไมใ หม ปี นเปอ นในผลิตภณั ฑ

โดยการทาํ ลายจลุ ินทรยี หรือโดยการแยกจลุ ินทรียอ อกดว ยวิธีการตางๆ วิธีการทําลายจลุ ินทรียเ รียกวา
กระบวนการทําใหป ราศจากเชือ้ (sterilization)

วิธีการท่ีใชในการควบคุมไมใหม ีการปนเปอ นของจลุ นิ ทรยี ในผลิตภณั ฑ คือ การทาํ ในหอ งท่ี
สะอาด (clean room) ซึง่ จะไมก ลาวถึงมาตรฐานของ clean room ในท่ีนี้

3.1.3.2 การควบคุมการปนเปอ นท่มี าจากคน (Control of contamination - People )
จากการที่ทราบวาคนเปนแหลงสําคัญที่ทําใหเกิดการปนเปอนของจุลินทรียในกระบวนการ
ผลิต ดังนน้ั คนท่มี หี นาทใ่ี นการผลิตยาปราศจากเช้ือจะตอ งไดรบั การอบรมและปฏบิ ัติตามกฎเกณฑท่ี
ระบไุ วอ ยา งเครง ครัด
3.1.3.3 การควบคุมการปนเปอ น ดวย การทาํ ความสะอาดและการใชนํ้ายาฆา เชอื้
(Control of contamination – Cleaning and disinfection)
ปจ จัยท่ีมีผลตอการปนเปอนของจุลนิ ทรียอ กี 2 ประการ คือ การทําความสะอาด และการใช
นํา้ ยาฆา เช้ือ การทําความสะอาด เปน การลางเอาฝนุ หรอื สิ่งสกปรกท่ตี กคา งใหส ะอาด การใชนาํ้
ยาฆาเช้ือ นํา้ ยาฆา เชอื้ คือสารเคมี หรือสารผสมของสารเคมที ใ่ี ชท ําลายจลุ นิ ทรยี บ นพน้ื ผิว โดยไมม ผี ล
ทําลายสปอรของจุลินทรียบางชนดิ

6

3.1.3.4 การควบคมุ การปนเปอ นจากนํ้าและสารอื่นๆ(Control of contamination- water and
other materials)

ภาชนะบรรจุจะตองสะอาด สารเคมตี างๆ จะตองไมมจี ุลินทรยี และไพโรเจน (pyrogen) น้าํ
เปนสิ่งจําเปน สําหรบั การเจริญของจลุ นิ ทรียจ งึ ตองควบคมุ ไมใหมกี ารปนเปอ นของจลุ ินทรียในนา้ํ การ
ควบคุมระบบนา้ํ ดไู ดจ าก USP 24 <1231> Water for Pharmaceutical purposes / General Information

3.2 กระบวนการทําลายจลุ นิ ทรยี  (Process of microbial destruction )

การทําลายจุลินทรยี ดวยความรอนหรือสารเคมี หรอื รงั สนี ้นั เมื่อจุลนิ ทรยี ท่ีมอี ยไู ดร ับความ
รอนหรือสารเคมีหรือรังสใี นระดับท่ีเพยี งพอ จุลินทรียเหลานัน้ จะถกู ทาํ ลายหรอื ตายไป โดยมคี วาม
สัมพนั ธร ะหวางจาํ นวนจุลนิ ทรียและเวลาท่ใี ชในกระบวนการ

ปจ จยั ท่ีสําคัญของการทําใหปราศจากเชอ้ื ดว ยความรอนไดแ ก อณุ หภมู ิ เวลา จํานวนและชนดิ
ของจลุ นิ ทรยี ทีป่ นเปอนในผลิตภณั ฑแ ละกระบวนการ

การวัดประสิทธผิ ลหรือความสามารถของกระบวนการทําใหป ราศจากเชอ้ื โดยการใช คา ตางๆ
เหลาน้ปี ระกอบดวย D Value , Z Value , Lethal rate และ F0
D Value( Decimal Reduction )
หมายถึงเวลาเปนนาทีทีใ่ ชในการฆาเช้อื ชนิดใดชนิดหน่ึงเฉพาะได 90% ของประชากรของเชื้อน้นั ๆ
หรอื 1 log cycle ณ อุณหภูมิใดอุณหภูมหิ น่งึ ( รูปที่ 1 )

รปู ท่ี 1 D Value

7

D Value แปรผันตาม
• ชนิดของจลุ ินทรยี 
• การเกบ็ รักษาจุลินทรีย
• สภาวะการบงเพาะเชือ้ ( incubation condition )
• อุณหภูมิทีใ่ ชฆ า เชอื้
• ชนิดของนํา้ ยาหรือผลติ ภณั ฑ
• ระยะเวลาการเกบ็ หลังจากการฆา เชือ้
• ความอิม่ ตวั ของไอนา้ํ
• ภาชนะบรรจหุ รอื วัสดุหบี หอ

การคาํ นวณ D Value ( D Value Determination )

วธิ หี า D Value มี 2 วิธี
1. The Survival Curve Method วิธีน้ีเปน การหาคา เชิงปรมิ าณ (quantitative method ) เปน การ

ทําลายจุลินทรียบางสวนท่ีใสล งไป และนบั จาํ นวนจุลนิ ทรียทยี่ งั มีชวี ิตเหลอื อยู ( survival )
( รปู ที่ 2 ) (วิธคี ํานวณภาคผนวก1 )

รูปท่ี 2 Hypothetical Survival Curve at Constant Temperature

8

2.Fraction Negative Method มี 2 วิธี ( วธิ ที าํ ภาคผนวก 3)
• Spearman-Karber Method ใชหาคา mean time of survival
• Stumbo - Murphy Cochran Method ใชห า Most Probable Number ( MPN )
อุปกรณท่ีใชในการหา D Value
• กลองจลุ ทรรศน เพอื่ ดู Spore forming bacteria
• Biological Indicator Evaluator Resistometer ( BIER ) ( รูปท่ี 3) เปนautoclave เลก็ ๆ ชว งเวลา

ท่ีอุณหภมู ขิ ้นึ ( heat up ) และลดลง ( cool down ) ใชเวลาเปน วินาทเี ทา น้ัน เวลาและอณุ หภูมมิ ี
ความเท่ียงตรงสงู มาก ซ่งึ BIER เปนเครื่องมอื ทใี่ ชใ นการทดลองหา D Value และ Z Valueท่ีดี
ทีส่ ดุ temperature chart เปน square wave ตามรปู ที่ 4
• oil bath ที่สามารถควบคุมอณุ หภูมไิ ดเ ทีย่ งตรงและแมน ยําแทน BIER ได

รูปที่ 3 BIER VESSEL

9

รูปที่ 4 Temperature chart for BIER / steam vessel
Z Value ( Temperature Coefficient )
ไดมีการทดลองพบวาความทนทานตอ การฆา เชือ้ จะเปล่ยี นไปเม่อื มีการเปลย่ี นแปลงอุณหภูมิท่ีใชใน
การฆาเชื้อ อัตราการเปลี่ยนแปลงของการฆาเชือ้ เมอ่ื มีการเปล่ยี นแปลงอุณหภมู ิ คือคา Z Value
Z Value หมายถงึ จํานวนองศาของอุณหภมู ทิ ่ีเปลย่ี นไปแลว ทําให D value มี คาเปล่ยี น ไป 10 เทา (รูป
ท่ี 5 ) Z Value เปนคา เฉพาะของจุลินทรียช นดิ ใดชนิดหนง่ึ ในกรณีทไ่ี มม ีขอ มูลการหา Z Value โดยท่วั
ไป สําหรบั steam sterilization Z Value มีคา เทากับ 10 OC (18 OF )
สําหรับ dry heat sterilization Z Value มคี าเทา กบั 20OC

รูปท่ี 5 Z Value
DO = D value at initial temperature TO
DX = D value at the subsequent temperature TX

10

Lethal rate หรือ Instantaneous Fo
Lethal rate หมายถึงเวลาเทียบเทาของประสทิ ธิผลการฆา เชอ้ื ณ อณุ หภูมิใดอณุ หภูมหิ นงึ่ กบั อณุ หภูมิ T

Lethal Rate ( L ) มีสูตรคาํ นวณดังนี้

L = 10 ( T0 – Tb ) / Z
T0 = อุณหภมู ภิ ายในวสั ดทุ ่ใี ชในการฆา เช้ือ
Tb = อุณหภูมทิ ี่อา งอิง ( Reference temperature )
Z = Z Value ของจลุ ินทรียท ีใ่ ช

ตวั อยาง
T0 = 118 oC
Tb = 121 oC
Z = 10 oC
L = 10 ( 118 – 121) / 10
= 10( -0.3) / 10
= 0.49

หมายความวา ทกุ ๆนาทีของการฆาเชื้อที่ 118oC มปี ระสิทธิผลเทียบเทากบั การฆาเช้อื ที่ 121oC เทา กับ
0.49 นาที

F0 Value ( accumulated F0 )
F0Value เปนการวัดประสทิ ธิผลของการฆา เชื้อดวยความรอ นชืน้ หมายถงึ จาํ นวนเวลาท้งั หมดของ รอบ
การทําใหปราศจากเชื้อ( sterilization cycle ) เปนนาทีที่ มีประสทิ ธิผลเทยี บเทา การทําใหปราศจากเชอ้ื
ดวยความรอ นชนื้ ทีอ่ ุณหภมู ิ 121 OC โดยมีคา Z Value เทากับ 10 OC
เชน F0 value = 8 หมายความวา ประสทิ ธผิ ลของการฆา เชอื้ ทีอ่ ณุ หภมู หิ นึ่งอณุ หภมู ใิ ดมีประสิทธิผล
เทียบเทาการฆาเช้อื ที่ 121 OC เทากบั 8 นาที ( รวมเวลา heat up และ cool down ) โดยมี Z Value เทา กบั
10 OC

11

FH Value
FHValue เปนการวัดประสิทธผิ ลของการฆา เชอ้ื ดวยความรอ นแหง หมายถึงจาํ นวนเวลาเปน นาทขี อง
การทําใหปราศจากเชื้อดวยความรอ นแหง( Dry heat sterilization) มีประสทิ ธผิ ลเทียบเทา กบั การทาํ ให
ปราศจากเชอ้ื ดว ยความรอนแหง ทอ่ี ณุ หภมู ิ 170OC โดยมี Z Value เทากับ 20OC

4. การทาํ ใหปราศจากเช้อื ดว ยความรอนชน้ื หรือไอนา้ํ (Steam Sterilization or Moist Heat
Sterilization )

หลักการในการฆาเชือ้ ดวยไอน้ํา เปน การ ทําลายโปรตีน(denature protein ) ของเซลล ไอนํา้ มปี ระสทิ ธิ
ภาพสูงในการทําลายเช้ือทกุ ชนิด รวมท้ัง spore ท่ีมีความตานทานสงู ( high resistant spores ) ภายใน 15
นาที ท่ี 121OC ( 15 psig )

4.1 Sterilization cycle

การจะเลือกใช วิธีการทาํ ใหปราศจากเชื้อวธิ ีไหนขน้ึ กับการความคงทนตอ ความรอนของวสั ดุหรือผลติ
ภัณฑท่ีจะทําใหปราศจากเช้ือ การไมเ ส่ือมสลายของวสั ดหุ รอื ผลิตภัณฑ นั้นๆ จาํ นวนและชนดิ ของจุลิ
นทรียท ป่ี นเปอ นในผลติ ภณั ฑกอนฆา เช้ือ และทกุ วิธีทใ่ี ชจะตอ งบรรลคุ วามปราศจากเช้ือใหได Sterility
Assurance Level ไมน อยกวา 10-6
Sterilization Cycle จําแนกตามหลกั การของความรอนท่ใี ชในการฆา เชือ้ จุลนิ ทรีย ดังน้ี

4.1.1 Overkill Sterilization

หลกั การ overkill เปน วธิ ที าํ ลาย biological indicator ท่ีทนความรอ นสูงมากและ จํานวนมาก เพือ่ แสดง
ใหเหน็ วา กระบวนการท่ใี ชสามารถทาํ ลาย bioburden ทุกชนดิ ใน load ได โดยไมต องรจู าํ นวนและการ
ทนความรอน ( heat resistance) ของ bioburden
วตั ถุประสงคข อง overkill cycle เปนการประกนั ระดบั ความปราศจากเชอ้ื ( Sterility Assurance Level
=SAL) โดยไมคํานงึ ถึง การทนความรอนและจํานวนของ bioburden ใน load ดวยการทาํ ลายจุลนิ ทรีย
ทม่ี ี D-value อยา งนอ ย 1 นาทที ่ี 121OC ไดไ มต่าํ กวา 12 -log reduction จุลินทรยี ท ่ีทนความรอนสูงมาก
เทา น้นั ท่มี ี D121 มากกวา 0.5 – 1 นาที
ตัวอยางของ Overkill cycle

• Standard cycle 121OC 15 นาที( European Pharmacopoeia )
• 12 log reduction ของจุลินทรียท ีม่ ีคา D121 1นาที

12

• Cycle ท่ที ําลายจาํ นวน 106spores Bacillus stearothermophilus

วธิ ี Overkill ไมไดก ําหนดใหหา bioburden แตก ็ควรจะควบคุม bioburden และ สภาพแวดลอม
(environment monitoring)เนื่องจาก การปนเปอ นจลุ ินทรยี  โดยเฉพาะแบคทเี รยี กรัมลบอาจทาํ ใหเ กิด
endotoxin ได และการทําใหปราศจากเชอื้ ดว ยไอนา้ํ ไมส ามารถจะกําจดั endotoxin ได

4.1.2 Bioburden / Bioindicator ( Combination ) Sterilization

หลกั การของวธิ นี เ้ี ปนการทาํ ลาย Biological indicator ที่ D Value มคี า สูงกวา bioburden ในผลิตภณั ฑ
โดยตรวจสอบความสามารถในการทําลายจลุ ินทรีย ( microbial challenge ) ของ Bioburden และ
Bioindicator รว มกัน ซึ่งหลังจากเสร็จส้นิ การทาํ ใหป ราศจากเชอ้ื แลวสามารถที่จะใหความปราศจากเชือ่
ในระดบั SAL 10-6 โดยการคาํ นวณจากbioburden ในผลิตภัณฑและ บางสว นท่ยี ังมีชวี ิต ( partial
survive ) ของ biological indicator
วิธีน้ีจะตอ งมีความรเู กีย่ วกับการทนความรอ นของ bioburden และ Biological indicator อยา งดีและการ
ควบคุมจาํ นวน bioburden เหมาะกบั ยาที่ทนความรอ นสูงปานกลาง
ตัวอยางของ Bioburden/Bioindicator Sterilization

• การทําลาย 103 ของ Biological indicator ที่มี D 121 0.3 นาที ให PNSU ( Probability of a Non
Sterile Unit ) 1 ใน 106 ของผลิตภัณฑที่ bioburden มี D 121 0.1 นาที ไมเกิน10 CFU / ภาชนะ
บรรจุ

• การทาํ ลาย 4 log ของ Biological indicator ทม่ี ี D 1210.5 นาทีให PNSU 1 ใน 106 ของผลิต
ภัณฑท่ี bioburden มี D 121 0.2 นาที ไมเกิน100 CFU / ภาชนะบรรจุ

4.1.3 Bioburden Sterilization

หลกั การของวิธี น้ี เปนวิธีทําลายแบบ worst case ของ spore ท่ีทนความรอนสูงสดุ (most heat resistant
microorganisms) ท่ีเตรียมจาก bioburden ในผลิตภัณฑ เพือ่ แสดงวากระบวนการท่ใี ชเ ชอื่ ถอื ไดใน
ความสามารถทาํ ลาย bioburden ทีม่ ีในผลติ ภัณฑน ้นั ๆ ซึ่งวิธีการนจี้ ะบรรลุผลไดจ ะตองรูจํานวนและ
การทนความรอน ของ bioburden อยางดี
ตัวอยางของ Bioburden Sterilization

• การทําลาย 106 bioburden มี D 121 0.3นาที ให PNSU 1 ใน 106 ของผลติ ภัณฑท ี่ bioburden มี
D 121 0.3 นาที ไมเ กิน1CFU / ภาชนะบรรจุ

13

การทําใหปราศจากเชอ้ื ทัง้ 3 วิธี น้ีใหค วามปราศจากเช้อื ไดในระดบั เดียวกนั ( รปู ท่ี 6 ) จะพบวา
Bioburden Sterilization ตองมขี อมูลมาก เชน จํานวน และชนดิ ของbioburden คุณลักษณะของสาร
และการควบคุมการปนเปอนจลุ ินทรยี ท ่ีเขม งวด การมขี อ มลู มากทาํ ใหม ีความเช่อื มัน่ ในการทาํ ให
ปราศจากเชอื้ ไดแ มจ ะใชความรอนนอ ยกวา แตเวลามากกวาวิธีอื่นและสงผลใหก ารคงความสภาพ
( stability )ของยาไดด ีกวา

วิธี bioburden sterilization น้ีเหมาะทีส่ ุดกบั การทาํ ใหป ราศจากเช้อื ของยาทอ่ี ยูในภาชนะบรรจุ
( terminal sterilization ) วธิ ี Overkill ใชขอมลู นอ ยกวา อาจเก็บชว งเร่มิ ตนหรอื เปน ระยะ และตองใช
ความรอ นสูงทาํ ใหเกิดการเสอ่ื มสลายของยาได สวนวธิ ี bioburden / biological indicator (BB/BI) หรอื
อาจเรยี กวธิ ี combination ก็ได อยูระหวา งกลางของอกี 2 วิธี การจะใชวธิ ีใดข้ึนอยกู ับ การคงทนตอ
ความรอนและการพิจารณาเลอื กจาก cycle development และvalidation

รปู ท่ี 6 เปรียบเทยี บวิธีการทาํ ใหปราศจากเชื้อ
Sterilization cycle ท่ีกาํ หนดตาม Pharmacopoeia ซึ่งแบงตาม USP และ BP ดังน้ี
BP 2001

• Steam sterilization of terminal sterilization the reference condition for aqueous preparations
are heating at a minimum of 121 oC for 15 minutes.

14

• FO concept โดยใชอณุ หภูมิและเวลารวมกนั ในสภาวะทที่ ําใหบ รรลผุ ล Sterility Assurance
Level (SAL )10 –6 หรอื มากกวา

USP 24
กาํ หนด sterilization cycle โดยใช Sterility Assurance Level ( SAL ) 10 –6

4.2 Sterilization Cycle Development

เปน กระบวนการหาคุณสมบัตทิ างกายภาพของ sterilization cycle ที่ใชในการทาํ ใหปราศจากเช้อื ของ
ผลิตภัณฑ สว นประกอบ และหรอื อปุ กรณ ในรปู แบบการจัดเรียงท่ีกาํ หนด โดยมี วัตถุประสงคเ พื่อ
พิสูจนวาผลิตภัณฑและหรือวัสดุ มคี ณุ สมบัติความปราศจากเชื้อ พรอ มท้งั คงสภาพการใชงานไดต าม
ปรกติในชว งการยอมรบั ของสภาวะการทําใหปราศจากเช้ือนัน้ ๆ
โดยมีเกณฑก ารยอมรับของความปราศจากเชือ้ คือ Sterility Assurance Level ( SAL ) 10-6 จะตองใหได
Probability of Non Survival Unit ( PNSU ) นอ ยกวา 1 ในลา นหนวย
วตั ถปุ ระสงคหลักของ cycle development เพือ่ หาคา ตัวแปร ท่ีเหมาะสม ( optimal sterilization
parameter )ในกระบวนการทาํ ใหป ราศจากเช้อื เชน ชว งเวลาท่ีทําใหป ราศจากเช้ือ (exposure time ), คา
F O, และอณุ หภมู ทิ ใ่ี ช เปน ตน
USP และ BP ไดก าํ หนด sterilization cycle เปน overkill สําหรับสารทีท่ นความรอ นสงู โดยไมกระทบ
ตอ ความเส่อื มสลาย ( degradation )ของสารนัน้ และสามรถรักษาความคงสภาพ ( stability )ของสารนน้ั
ไดตลอดจนถึงวนั สนิ้ อายุ สาํ หรับสารทเ่ี สือ่ มสภาพเมือ่ ถูกความความรอนสูง (Heat labile products )ใช
วธิ ี overkill ไมไ ด ตองพัฒนา sterilization cycle ที่เหมาะสมโดยพิจารณาจาก biourden โดยการทาํ ให
ปราศจากเชอ้ื น้ันจะตอ งบรรลุ Sterility Assurance Level (SAL ) ไดหรือมากกวา10-6
Sterilization cycle ท่ีดีจะตอ งให Sterility Assurance Level ท่ีเหมาะสมถูกตอ ง ขณะเดยี วกันกม็ ผี ล
กระทบตอการเสื่อมสลายของผลิตภณั ฑนอ ยท่สี ุด Cycle development จะตอ งทํา กอน ทดสอบความถกู
ตอ ง(validation testing )ซ่ีงถือเปน สวนหน่งึ ของ prevalidation program

การพจิ ารณาการทําsterilization Cycle development ขน้ึ กับ
• คุณสมบตั ิการทนตอความรอนของผลิตภัณฑ (Heat stability of the product )
• ชนิดของของภาชนะบรรจุ จกุ ยางและฝาปด (Type of primary container and closure )
• ประสิทธผิ ลของการฆา เช้ือจากการซึมผานของความรอนทีเ่ ขา ไปในผลิตภัณฑ (Heat
penetration )

15

• ชนิดของ Autoclave (Autoclave technology )
• การทนความรอนของจลุ นิ ทรยี  (Heat resistant microorganism ) จุลนิ ทรียทีม่ ี sporeเทา นั้นท่ี

ทนความรอนไดสงู ซ่งึ ตอ งหา D-Value และสามารถใชเ ปน biological indicator ได พวกทไ่ี มม ี
spore สามารถแยกออกไดด ว ยการทาํ heat shock
• จํานวนของจุลนิ ทรยี ท ่มี อี ยูในวสั ดุหรอื ผลติ ภัณฑกอ นฆา เชือ้
คาตัวแปรสําคญั ไดแก เวลา อุณหภูมิ และการทนความรอนของจุลนิ ทรยี  (resistance of microorganism)
จะตอ งศึกษาในสภาวะ worst case ซึ่งเปน หลกั การท่ใี ชก นั มากที่สดุ ในการตรวจสอบความถูกตองของ
กระบวนการ ( process validation ) เชน
กระบวนการทาํ ใหป ราศจากเชื้อท่ี sterilization cycle ปกติ 121oC 15 นาที การตรวจสอบความถกู ตอง
ในสภาวะ Worst case ที่ 120 oC 12 นาที
Cycle development จะตอ งมขี อมลู ของ bioburden เพยี งพอ และกาํ หนดจํานวนใน action level เพ่อื ใช
ในการคํานวณ หา Sterility Assurance Level (SAL )
ประโยชนข อง cycle development
• ลดตน ทนุ โดยใชพ ลงั งานทเี่ หมาะสม
• ลดตนทุนในการทาํ qualification / requalification
• ชวยลดจํานวน cycle ท่ีใชโดยปรับให เปน cycle มาตรฐาน

ขนั้ ตอนการทํา Cycle Development

1. ตรวจสอบ bioburden ในผลติ ภัณฑ ภาชนะบรรจุ จํานวนจลุ นิ ทรยี ในสภาวะแวดลอ ม
และสาธารณปู โภค เชนระบบน้าํ ระบบอากาศ เปน ตน

2. Bioburden และจุลนิ ทรยี ท ่ีไดใ นขน้ั ตอนที่ 1 นํามาคัดแยกหาจลุ นิ ทรียที่ทนความรอ น
(screen for heat resistance ) ดว ยการทํา heat shock 80 oC – 85 oC เวลา 10 – 15 นาที

3. คํานวณ DT Valueของ สปอรจุลินทรียทีไ่ ดในข้ันตอนท่ี 3 แยกเกบ็ ขอมลู และเก็บ
สปอรน นั้ ๆไว

4. เก็บเฉพาะสปอรจ ลุ ินทรยี ท ่ที นความรอนสงู สดุ (most heat resistant microorganism )
หมายถงึ จลุ นิ ทรยี ทมี่ ี D Value สูงสุด ในข้นั ตอนที่ 3 เพอ่ื ใชเปน biological indicator(BI)

5. การยืนยันและตรวจสอบ D Value ดวยการหา Spore Log Reduction ( SLR) ที่ไดในข้ัน
ตอนท่ี 4
SLR = Log A – Log B

16

A = number of spores/unit x number of unit
B = number of survivors
6. หา lethality rate(L) ของ (DT) เทยี บกับ D121
7. คาํ นวณหาคา FO ตํ่าสดุ ท่ตี อ งใชใ นกระบวนการ ( Determination of Minimum Required
FO Value )จากคา D Value ท่ีไดขนั้ ตอนท่ี 5นํามาหา minimum FO โดยใหไ ด SAL 10-6
8. คํานวณหาเวลาของกระบวนการ ( Determination of ProcessTime )
9. ทดสอบ biological challenge ในvalidation testing โดยใช spore suspension ของ most
heat resistant microorganism ) ท่ีไดจ ากข้นั ตอนที่ 4 เปน biological indicator ( BI )
ตัวอยา ง
ในกระบวนการ cycle development ของ ยา A กําหนดให bioburden สูงสุด 100 CFU / ภาชนะบรรจุ
และ หา D valueท่ี 110 oC ( D110 ) ของจลุ นิ ทรียทีท่ นความรอนสูงสดุ จาก bioburden หรือจลุ นิ ทรียท ่ี
ปนเปอ นในกระบวนการ ได 2 นาที
คาํ นวณหา Lethal rate ( L )
L = 10( T0 – Tb )/Z
To = Temperature within the item being heated
T b = Reference temperature
Z = Z Value of the challenge organism
To = 110O C
T b = 121O C
Z = 10 O C
L = 10(110-121)/10

= 0.079
(110 O C 1นาที = 0.079 นาที ที่อณุ หภูมิ 121 O C

D121 = 2 x 0.079 = 0.158 นาที
คาํ นวณ minimum FO

FO = D 121 ( logNo – Log B )
B = maximum acceptable level for probability of survival
NO = bioburden per container

B = 1x10-6 ( 1 หนวยใน 1,000,000หนวยท่ีมี surviving spore = SAL 10-6 )

17

NO = 100 spores / ภาชนะบรรจุ
D121 = 0.158 นาที
FO = 0.158(2-(-6))
1.264 นาที
=

คํานวณเวลาของกระบวนการ ( Determination of process time ) ทําได 2วิธี

1. คํานวณจาก D110 = 2 นาที

D110 = 2 นาที ( ไดจากการทดลองหา D 110 )
จะตองใช 8D เพื่อใหไ ด SAL 10-6

Process time = 8 x 2 = 16.0 นาที

2. คาํ นวณจาก minimum F0

F0 = 1.264
D 110 = 0.079
Process time = 1.264 / 0.079 = 16 นาที

ในการปฏบิ ตั งิ านจรงิ จะตองมคี า safety factor อยา งนอย 50% หรอื ใหได 12 log reduction

4.3 Validation program of steam sterilization USP 24 ไดกาํ หนดข้ันตอนตางๆดังนี้ (หลักการ

ของ validation program นี้ใชไ ดก ับsterilization process อื่นๆดว ย )

• The installation qualification stage เปนข้ันตอนแรกของการติดตง้ั เครอ่ื งจกั รเพ่อื ตรวจสอบ
วาอุปกรณควบคุมและเครอื่ งมือไดอ อกแบบถูกตอ งตามกาํ หนดและผานการสอบเทยี บ
(calibrate ) พรอมทัง้ คณุ ภาพของระบบสาธารณปู โภค ( utility )ที่ตองการเชน ไอนาํ้ , น้ําและ
อากาศ โดยจะตองบันทกึ เปน ลายลักษณอกั ษร

• The operational qualification stage เพ่ือเปน การยืนยันวา การทํางานของ autoclave ขณะ
empty chamber มีอณุ หภมู ิ ท่ีตําแหนงตา งๆ เปน ไปตามกาํ หนดใน protocol ดวยการใชเ ครื่อง
มือวดั อุณหภูมิ ( multiple temperature sensing device ) และบนั ทึกเปน ลายลกั ษณอ ักษร ( heat

profile records ) โดยมีเกณฑการยอมรบั คือ อุณหภมู ิ ± 1.0 OCท่ีอณุ หภูมิไมต าํ่ กวา 121OC
(Acceptance range of temperature in empty chamber is when the chamber temperature is not
less than 121OC )

18

• The confirmatory stage ข้ันตอนน้ี ทําในขณะปฏบิ ัติงานจรงิ มผี ลติ ภัณฑเ รียงในรปู แบบท่ี
กําหนด โดยใช เครือ่ งมอื วดั อณุ หภมู ิ สอดเขาในตัวอยาง พรอ มกับทดสอบการทาํ ลายจุลนิ ทรีย
( microbial challenge )โดยใช Biological indicator การทดลองน้เี ปน การ หา lethality of
sterilization process โดยใชปจ จัยหลกั 2 อยา งคอื ประสิทธิผลของความรอ นทเี่ ขาไป ในผลติ
ภัณฑ ( heat penetration ) และเวลาท่ีใช

• The final stage ข้ันตอนนี้เปน การจัดทําเอกสารทีจ่ ะตอ งใชในการสนับสนุน ขอ มลู ทไ่ี ดใ นการ
ทํา validation

4.4. การทดสอบความถูกตอง (Validation testing )

4.4.1 การจดั เตรยี ม (Preparing for validation)
• จดั ทํา Validation protocol ประกอบดว ย วตั ถุประสงค ขอบเขต ผูรับผดิ ชอบ การตรวจสอบ

เกณฑก ารยอมรับ เอกสารอางอิง ผูจ ดั ทาํ ผูม ีอํานาจลงนาม
• จัดเตรียมเคร่อื งมอื วัดอุณหภมู ิทีผ่ านการสอบเทียบ(calibration ) และเครื่องบันทึกอณุ หภูมิ

เคร่ืองมอื วัดอุณหภมู ิมี 2 ชนิด
1. Cable System เปน ระบบหลาย probe เชื่อมตอกับเคร่ืองวัด เปนการอานขอ มลู และแสดง

ใหเ หน็ ณ เวลาน้ันๆ ( real time )ระบบน้ปี ระกอบดว ย
♦Probes เปน สายเช่อื มตอกับ Thermocouple การนําความรอ น ( thermal conductivity ) ของ
สายเช่ือมทําใหเ กดิ ความคลาดเคลอื่ นในการวัดอณุ หภูมิได การสอบเทยี บควรตองกําหนดชวงแคบ
♦Electronics Thermocouple สง Voltage signal ไปยงั Amplifier อุณหภมู ิอาจจะไมคงท่ีเน่ือง
จากรอยเช่อื ม ( cold junction ) ซ่ึงสามารถชดเชยไดโดยการสอบเทียบ ณ จุดใชง านและปรับกอ นการ
ทดสอบทุกคร้งั
♦ Calibration ในการใช Thermocouple จะตองทําการสอบเทียบกอนและหลงั การทดสอบ
ทุกคร้ัง
2. Wireless Loggers เปนระบบไรส ายโดยมี probe เปนอสิ ระตอกนั แตล ะ probe มกี ารเกบ็
ขอมูลในตวั มนั เอง ขอ มลู จะอานไดเมื่อเสร็จสน้ิ กระบวนการ ระบบนีป้ ระกอบดวย
♦Probes เปน Resistance Thermometer Detector ( RTD )หอหุมในหลอดเพ่ือมคี วามไวใน
การอานและคงท่ีดีทสี ดุ
♦Measuring electronics แตล ะ Logger มีตัววดั ในตัวเอง
♦High performance battery วัดอณุ หภมู ิไดสูงถึง 140 oC

19

♦Calibration ทําการสอบเทยี บเปน ระยะ และสอบเทยี บในชวงการทาํ งานจรงิ

4.4.2Heat distribution studies

• Empty Chamber Temperature Distribution
• Load Chamber Temperature Distribution
Empty Chamber Temperature Distribution
เพ่ือศึกษาความสม่าํ เสมอของอุณหภูมิใน empty chamber ของ autoclave โดยที่ ชนิด ขนาดและแบบ
ของ autoclave จะมีผลตอการกระจายอณุ หภมู แิ ตกตางกัน
ใชเคร่อื งมือวัดอณุ หภมู ิวางตาํ แหนงตางๆ ใน autoclave บน กลาง และลา ง ของดา นหนา ตรงกลาง
และ ดา นทายของ chamber และตาํ แหนง อื่นๆแลวแตช นิดของ autoclave เชน chamber drain และ
ตําแหนง water spray ( ถา มี ) และไมค วรให probe สัมผสั กับพน้ื ผิวดานในของ autoclave จํานวนของ
probe ขึ้นอยูกับขนาดของ autoclave โดยปกติใช อยา งนอ ย 10 probes ทดลองซ้าํ 3 ครั้งเพื่อแสดงความ
ม่ันคงของระบบ (stability of the system )
วิธีการ
1.เตรียมเครอ่ื งมือวัดอุณหภูมทิ ่ีผานการ สอบเทียบอยางนอย 10 ชดุ
2.วาง probesตาม ตําแหนงตา งๆ ใน autoclave ไดแก บน กลาง ลาง และ มมุ ของ chamber ตามรปู ท่ี 7
สวนตาํ แหนงอนื่ ๆแลวแต ชนดิ ของ autoclave โดยไมให probe สัมผัสกับพ้ืนผวิ ดา นในของ chamber
ดวยการใชอุปกรณ เชน เชือก หรอื กระดาษกาวชวยในการแขวนหรอื ยดื เครอ่ื งมือวัดอุณหภูมิ

รูปที่ 7 การวาง เคร่อื งมอื วัดอุณหภมู ิ ตามตําแหนงตางๆใน chamber

20

3.ดําเนินการทําใหปราศจากเชอ้ื ( sterilization ) ที่ 121 oC อยางนอย 30 นาที หรอื cycle ทใ่ี ชในการผลติ
ปกติ
4.หลังเสร็จสิน้ การทําใหปราศจากเช้อื ตรวจสอบผลท่ีไดใ นขอ 3 หา อุณหภมู ิสงู สดุ ตา่ํ สดุ และคา เฉลย่ี
ในแตล ะชวงเวลา
5.การแปรผลจากอุณหภมู ิทีไ่ ดในขอ 4 เทียบกับเกณฑการยอมรบั
6.ทาํ การทดลองซ้าํ อกี 2 คร้ังตามขั้นตอนท่ี 1 ถึงข้นั ตอนท่ี 5
เกณฑการยอมรับ (Acceptance criteria )

1. คาเบี่ยงเบนในแตละชว งเวลา ± 1OCจากคาเฉล่ีย
หรอื

2. USP 24 : Acceptance range in temperature in the empty chamber is when the unit is
operating at not less than 121OC

Load Chamber Temperature Distribution

เพือ่ ศึกษา ความสมํ่าเสมอของอณุ หภูมิ ที่มีผลกระทบจากรปู แบบการเรยี ง ( load pattern ) และจํานวน
ของทเ่ี ขา autoclave จะตอ งศกึ ษาความสมาํ่ เสมอของอุณหภมู ิ ในแตละ autoclave ท่ี maximum and
minimum load ของแตล ะรูปแบบการจัดเรยี งผลติ ภณั ฑ (configuration ) อยางนอย 1 คร้ัง ใช probes
อยา งนอย 10 probes วางตําแหนง ตา งๆ ( ไมไ ดส อดเขา ในผลติ ภณั ฑ )ของ chamber และทดลองขณะ
ปฎิบตั งิ านปกติ
วธิ ีการ
ใสข องที่จะ sterileในรปู แบบ ตามปกตใิ น autoclave และวาง probesตามตาํ แหนง ตางๆ ทดลองเหมือน
empty chamber

4.4.3.Heat penetration studies

เพื่อศึกษาและประกันวา ผลิตภัณฑต รงตําแหนง ท่ีไดรับความรอนนอ ยสดุ (the coolest item )ใน
load pattern ไดรับความรอ นเพียงพอท่ที าํ ใหป ราศจากเชื้อ ( sterile )และตําแหนง ทไ่ี ดรบั ความรอนสูง
สุด ( hot point )ไมทาํ ใหผ ลติ ภัณฑเส่อื มสลาย ( product degradation ) โดยปกติทดลองพรอ มกบั
microbial challenge studies โดยการทํา minimum and maximum load

minimum load size ถือเปน worst case ของการทาํ ลายจลุ ินทรยี  ( biological challenge )เน่ือง
จากวา ใชเ วลานอยในการ heat up และ cool down

21

maximum load ถือเปน worst case ของเสื่อมสลายของผลติ ภัณฑ ( product degradation )เนอ่ื ง
จากอาจไดรบั ความรอ นมากเกนิ ไป

กอ นทํา Heat penetration จะตองหาจุดที่ความรอนเขาถึงชา สุดในน้าํ ยาทบ่ี รรจใุ นภาชนะ โดย
เฉพาะ Large Volume Parenterals ( LVP ) ดวยการทาํ container mapping

Container Mapping---- Container cool point
เพื่อศึกษาหาจุดทน่ี ํ้ายาในภาชนะบรรจุไดร บั ความรอนชา สุด ( cool point ) เปน ตําแหนงทใ่ี ช
วัดอุณหภมู ิในการทํา Heat penetration
วิธีการทํา container mapping ทําได 3 วิธี
1.ใช เครือ่ งมือวัดอุณหภูมิ 3 ชุด เสียบเขาในภาชนะบรรจเุ ดียวกันตาํ แหนง บน กลาง ลา ง ตาม
รูปที่ 8 เขา sterileเพ่ือเปรียบเทียบอุณหภมู ิหาอุณหภูมติ ํา่ สดุ
2.ใชเคร่อื งมอื วดั อุณหภมู ิ 3 ชุด เสียบขาในภาชนะบรรจุ 3 ขวด ตําแหนง บน กลาง ลา ง ในแต
ละขวดเขา sterile แลวเปรียบเทียบแตล ะขวดหาอุณหภูมติ ํ่าสดุ วธิ ีนจี้ ะไดคาทแ่ี มน ยาํ นอ ยกวา
วิธที ี่ 1
3. ตําแหนงตรงกลางระหวา งระดับนา้ํ ยาและกนขวด

รูปที่ 8 Container mapping

22

4.4.4 Microbial Challenge Studies
เปนการศกึ ษาความสามารถในการทาํ ลายจุลินทรยี  ภายใตสภาวะทกี่ าํ หนดโดยใช Biological indicators
( BI ) ซึ่งเปนตัวแทนของสปอรจ ุลินทรยี ท ่ที นความรอนสงู เพ่อื ทดสอบความสามารถวา ทาํ ลายสปอรจุ
ลนิ ทรยี ไดกี่ Log ทําการทดลองพรอ มกบั Load chamber heat penetration
การศกึ ษา Microbial challenge ไมไ ดด ผู ลจากการทาํ Sterility test

Biological Indicators for Sterilization ( USP 24 <1035> )

Biological indicator มี 3 ชนิด แตละชนดิ จะตอ ง รูสายพันธของจุลินทรีย( species
microorganisms )และ จาํ นวนของจุลนิ ทรีย

ชนิดของ Biological indicators
• spores are add to a carrier ( a disk or strip of filter paper , glass, plastic, or other
materials )
• spore suspension
• self contained indicator

Biological indicator ชนดิ ตางๆ ที่ซ้ือมาใช ( commercial product )จะตองทํา performance
evaluation ในฐานะ User ‘ s Responsibility USP 24<1035> และทาํ Resistance Performance Test
( USP 24 < 55>)เพื่อตรวจสอบ D Value

Biological indicator ท่ีเตรยี มไดจ ากการ cycle development เปน non commercial product ใน
กรณนี ี้จะตองทํา performance evaluationในฐานะ Manufacturing ‘s Responsibility ( USP 24 <1035> )

Biological indicators for steam sterilization USP 25
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Bacillus coagulans
Clostidium sporogenes

23

Heat Penetration and Microbial Challenge Studies
วิธกี าร

1. กําหนดการจัดเรยี งยา ( load configuration ) ที่sterile ตามปกติ
2.ใช เคร่ืองมอื วดั อุณหภูมิ ที่ผานการ สอบเทียบ อยา งนอย 10 ชุด สอดเขาในนาํ้ ยาให probes
อยู ตําแหนง กลางระหวา งระดบั นา้ํ ยาและกน ขวดหรอื จากการทาํ container mapping
3. วางขวดยาท่ีสอด probes ตามขอ 2 ตรงตาํ แหนง load cold point ( จาก heat distribution
studies )
4.ใช Biological Indicator (BI) ตามประเภทของ sterilization cycle ใสใ นขวดนํา้ ยาหรอื
placebo กรณีทน่ี า้ํ ยา มี preservative หรือ anti – microbial agent และเก็บไว และเก็บBI ไว 1 หลอดเพอื่
เปน positive control
ขอควรระวัง การใส BI ชนิด self contained หรอื carrier ในนํ้ายา ไมควรให BI สัมผสั โดยตรง
กับภาชนะบรรจุ เนอื่ งจาก BI ไดรับความรอ นกอนน้าํ ยา
5.วางขวดท่ใี ส BI ( inoculated container ) จาก ขอ 4 ตรงตําแหนงติดกบั ขวดที่สอด probes
6.ดําเนินการ sterilization ตาม cycle ปกติท่ีใชในการผลิต
7.หลังจากเสร็จสน้ิ กระบวนการทําใหปราศจากเชอื้ นําขวดท่ีใส BI ออกมาทาํ ใหเยน็ ทันที และ
นําขวดนา้ํ ยาทอี่ ยูติดกบั ขวดใส BI เปน negative control
8. ขวดท่ีใส BI ไปเพาะเช้อื หา Spore Log Reduction ( SLR)

SLR = Log A – Log B
A = number of spore per unit x number of units
B = number of survivors
9.ตรวจสอบผลจาก บนั ทกึ เพื่อหา minimum Fo ที่ ความรอนเขา ไปในผลิตภณั ฑ
ทําการทดลองซ้ําอกี 2 ครั้ง ตามขน้ั ตอนท่ี 1 ถึงขัน้ ตอนท่ี 9

BI ตามประเภท cycle
Overkill Approach :B.stearothermophilus
Combination Approach : B. stearothermophilus , B. subtilis, C. sporogenes , B.coagulans
Bioburden Approach : Most resistant bioburden isolate (BB)

24

เกณฑการยอมรับ
Overkill Approach
Heat Penetration : Minimum Fo = 12 นาที
Microbial Challenge : BI ถกู ทําลายทง้ั หมด minimum SAL 10-6

Combination Approach
Heat Penetration : minimum F0 ไมนอยกวา ท่กี ําหนดในcycle development
Microbial Challenge : Spore Log Reduction (SLR) ทีใ่ ห minimum SAL10-6
BI อาจมีบางสวนที่มชี ีวติ เจริญเตบิ โตได
BB ถกู ทาํ ลายหมด

Bioburden Approach :
Heat Penetration : minimum F0 ไมนอยกวา ทีก่ ําหนดในcycle development
Microbial Challenge : Spore Log Reduction (SLR) ทีใ่ ห minimum SAL10-6

BB ถกู ทาํ ลายหมด

4.4.5 การสมุ ตวั อยางเพอื่ ทดสอบ

การตรวจสอบความปราศจากเชือ้ (Sterility test) เก็บตัวอยางจากตําแหนงที่อุณหภมู ติ า่ํ สดุ ( load cold
point ) ท่ที ํา heat penetration
การตรวจสอบความคงสภาพ (Stability test ) และ การตรวจวเิ คราะหด า นเคมแี ละกายภาพเกบ็ ตัวอยาง
จากตาํ แหนงทอี่ ณุ หภมู ิสงู สุด ( load heat point )

4.4.6 การสรปุ ผลการตรวจสอบความถูกตอง (Summary of validation )

รวบรวมบันทกึ ทั้งหมดจากการทํา validation protocol, validation testing และ cycle development
พรอมขอ มลู สนบั สนนุ ( data sheet ) และสภาวะควบคุมตา งๆ เชนtime , temperature , Fo , bioburden
การอนุมตผิ า นหรอื ไมผา นและรบั ทราบผลจากผูเ กย่ี วขอ ง

25

4.5 การตรวจสอบติดตามอยางตอ เนอ่ื ง (Ongoing Monitoring)

สภาวะทีใ่ ชทาํ validation เชน คาอณุ หภมู ิ ความดนั เวลา F0 , bioburden ,environmental control ,load
configuration จะตองคงสภาพไวแ ละ มีการตรวจสอบและเกบ็ บนั ทึกตลอดทกุ cycle
บันทกึ จาํ นวน bioburden และจุลินทรยี ในสภาวะแวดลอม เก็บเปน ประวตั เิ พอ่ื กาํ หนด Alert level และ
Action levelและควรปรบั ปรงุ คา ที่กาํ หนดเปน ระยะหรอื ทุกป เพือ่ แสดงถึงกระบวนการท่ีไดป รับปรุงดี
ข้ึนหรือใชเทคโนโลยีใหม

4.6 การตรวจสอบความถกู ตองซ้าํ (Revalidation)

ทําการตรวจสอบซาํ้ ปละคร้ัง เพอื่ ยืนยันการทํางานทีถ่ กู ตอ งของautoclave โดยการทําPerformance
Qualification ดว ยการทดลอง heat penetration และ microbial challenge อยางนอ ย 1ครัง้
ในกรณีทีม่ ีการเปลีย่ นแปลงระบบการควบคุม กระบวนการผลิต หรอื เปล่ียนแปลงอนื่ ๆทม่ี ผี ลกระทบ
กับคุณภาพ จะตองทาํ การตรวจสอบความถกู ตอ งและไดรบั การอนมุ ัติ

4.7 การควบคุมการเปล่ียนแปลง (Change Control)

การเปล่ียนแปลงระบบของ autoclave ตองมีฝา ยวิศวกรรม ผลิต และประกนั คุณภาพรว มพิจารณาถงึ ผล
กระทบตอคณุ ภาพของกระบวนการ
การเปลย่ี นแปลงท่เี ก่ยี วของกบั autoclave chamber รูปแบบการจัดเรียงของผลิตภัณฑ ระบบ
สาธารณปู โภค และระบบควบคุมการทาํ งานของ autoclaveจะตอ งทดลองทํา temperature distribution
และ heat penetration
ควรมมี าตรฐานสําหรบั วธิ กี ารปฏบิ ตั ิ ( Standard Operating Procedure =SOP ) ของการควบคมุ การ
เปล่ียนแปลง (change control) โดยมรี ายละเอียดดังน้ี

• วัตถุประสงคข องการเปลยี่ นแปลง
• เหตผุ ลในการเปลย่ี นแปลง
• วิธีการทดสอบและ ตรวจสอบความถูกตองของกระบวนการทาํ ใหปราศจากเชอื้ หลังจากการ

เปล่ยี นแปลง
• เอกสารท่ีเกยี่ วขอ งที่มผี ลกระทบไดร บั การแกไขหลงั จากมีการเปลยี่ นแปลง
• เอกสารสนบั สนนุ การทดสอบ Equipment Qualification (EQ)

26

4.8 การบํารุงรักษา ( Preventive Maintenance =PM)

Autoclave เหมือนเคร่ืองจักรอื่นๆทส่ี ําคญั ซึง่ จําเปน ตองทาํ การบํารงุ รกั ษา เพ่ือใหสว นประกอบทสี่ าํ คัญ
เชน ประเกน็ ( gasket ) วาลว ขอตอ ทอ และหวั ฉดี ( nozzle ) อยใู นสภาพการใชงานที่ สมบรู ณ โดยมี
SOP กําหนดและระบุสว นทีต่ อ ง ทําPMใหช ดั เจนพรอ มทงั้ ความถี่ในการตรวจสอบซึ่งขนี้ กับประวัติ
การใชง าน พรอ มบันทึกสวนทที่ ํา PM และการแกไ ขปญ หา

4.9 Parametric Release

เปน การอนมุ ัตใิ หย าจําหนายได โดยไมตองทดสอบความปราศจากเชอ้ื (sterility test ) การทดสอบ
ความปราศจากเช้ือไมไ ดประกันความเชื่อมั่นความปราศจากเช้ือ ( sterile ) ของแตละรุน การผลิตของ
ผลิตภัณฑ แตอ ยูท ี่ความเชื่อถอื ของวิธีการตรวจสอบความถูกตอ ง การควบคมุ ทมี่ ปี ระสิทธภิ าพ และ
การตรวจตดิ ตาม
( monitoring ) ไมไดขน้ึ กบั การทดสอบความปราศจากเช้อื เพยี งอยา งเดยี ว

BP 2001 ไดกําหนดใหใช Parametric release แทนการทาํ sterility test ได เมื่อกาํ หนดใช parametric
release แลว การ อนุมัติ หรือ ไมอ นมุ ัติ จะเปลีย่ นสลับใช sterility test ไมไ ด
การจะใช Parametric Release จะตอ งศกึ ษาและมขี อ มูลเพียงพอทจ่ี ะสนบั สนุนดังน้ี

1.ตองควบคุมจาํ นวน bioburden และจาํ นวน spore ท้ังหมดของทุกรนุ การผลติ และจะตอ งเปรียบเทยี บ
การทนความรอ นของ spore ทพ่ี บ กับ spore ท่ี validate ในการทํา cycle development ถา spore ของ
bioburden ทนความรอนสูงกวาตอ งถอื วา ยารนุ นั้นไมปราศจากเช้อื ตองใส biological indicator ทุก
load และตอ งมขี อมูลของ biological indicator ครบถว นไดแ กช นิดของจุลนิ ทรีย แหลงทมี่ า D Value
จาํ นวน spore วันสนิ้ อายุของ spore และสภาวะการเกบ็

2.คาตวั แปร ( operation parameter ) เชนเวลา ความดันและ อุณหภมู ิ จะตองไดตามกําหนด หากคาใด
คาหนึ่งไมอยใู นเกณฑกาํ หนด จะตอ ง reject ยารุนการผลติ นั้น

3. ตองตรวจสอบความสมบรู ณของจกุ หรือฝา ( closure ) เพ่ือแสดงวา ระบบมีประสิทธิภาพกนั การปน
เปอนระหวา งผลิตหรือหลงั ผลิตตลอดจนส้นิ อายุของยา

27

5. การทําใหปราศจากเชอ้ื ดวยความรอนแหง (Dry Heat Sterilization)

วัตถุประสงคข องการใชค วามรอนแหงในการทาํ ลายเชอ้ื
• การทาํ ใหป ราศจากเชื้อ (Sterilization )
• การทําใหปราศจากเช้อื และปราศจากไพโรเจน (Sterilization and Depyrogenation)

5.1 การทําใหป ราศจากเชอ้ื (Sterilization )

จุดประสงคเพือ่ ทําลายจุลินทรีย ความรอนที่ใชสงู กวา ความรอ นช้นื และใชเวลานานกวา

5.2 การทําใหปราศจากเชอ้ื และปราศจากไพโรเจน (Sterilization and Depyrogenation )

จุดประสงคเพอ่ื ทําลายไพโรเจนหรือ endotoxins แตค วามรอ นที่ใชส ูงกวา ในการ sterilization
ดังน้ันในกระบวนการทาํ ลายไพโรเจน ก็จะบรรลวุ ตั ถุประสงคของการปราศจากเช้อื ดว ย
การทําใหปราศจากเชอ้ื ดวยความรอ นแหงและความรอ นชื้นไมไ ดเปนการทาํ ลายไพโรเจน
ปจจัยสําคญั ในการทาํ ใหปราศจากเช้ือและปราศจากไพโรเจน คือ เวลาและอณุ หภมู ิ
หลกั การในการฆาเช้อื ดวยการคํานงึ ถึงเวลาและอณุ หภมู ิ เหมือนกับการฆาเชอ้ื ดวยความรอ นช้ืน

5.3 Sterilization cycle มี 2 cycles

• Overkill approachเปน cycle ท่ีกําหนดตาม Pharmacopoeia
หลกั การใชค วามรอ นสงู ในการทําลายสปอร Bacillus subtilis var niger โดยไมไ ดค าํ นึงถึง bioburden
ใน ผลติ ภณั ฑ

• Validated SAL 10-6 cycleหลักการเหมือน steam sterilization ใช FH แทน Fo

สภาวะการทาํ ใหป ราศจากเช้อื ตามเภสัชตาํ รบั :
BP 2001

• minimum of 160 oC at least 2 hours
• SAL 10-6 or better
Remington
• 160 oC 120 to 180 minutes
• 170 oC 90 to 120 minutes

28

• 180oC 45 to 60 minutes
สภาวะการทาํ ใหปราศจากไพโรเจน:
BP 2001

• greater than 220 oC 3 log reduction in heat resistance endotoxin
Remington

• 230 oC 60 to 90 นาที
• 250 oC 30 to 60 นาที
ตูอบ ( Hot air oven )ท่ีใชสําหรับฆาเชือ้ อุปกรณ หรือภาชนะบรรจุสําหรบั การเตรียมยาปราศจากเช้อื
จะตอ งมรี ะบบกรองอากาศ อุปกรณค วบคมุ เวลาและอณุ หภมู ิ

5.4 Cycle Development

หลักการและขัน้ ตอนการทาํ เหมอื น steam sterilization
Operating parameter ตองกําหนดระหวา ง cycle development รวมทง้ั การศกึ ษา bioburden ,
pyroburden biochallenges , heat temperature setting ,cycle time ,FH value , penetration temperature
profileเพ่ือหา minimum FH ท่ีจะบรรลุ SAL 10-6

5.5 Depyrogenation Cycle

กําหนดจาก การทําลายไพโรเจน โดยข้ึนกบั pyroburden ไมไ ดข ึ้นกบั bioburden
Cycle development จะตองศกึ ษาendotoxin challenge ดวย Escherichia coli โดยการวางทตี่ ําแหนง
coldest point ใน load ( หลกั การเหมอื นทาํ bioindicator challenge in steam sterilization ) endotoxin
challenge ข้นึ กบั pyroburden
กรณที ่เี ปน depyrogenation cycle ไมต อ งทํา bioindicator challenge ดวย Bacillus subtilis

5.6 การทดสอบความถูกตอ ง (Validation Testing)

5.6.1 การจัดเตรยี ม (Preparing for Validation)

จดั ทาํ Validation Protocol และ สอบเทยี บอุปกรณทใี่ ชวัดอณุ หภูมิ

5.6.2 Heat distribution studies

29

Empty Chamber Heat Distribution
Load Chamber Heat Distribution
หลักการและวิธีทํา เหมือน กบั การทดสอบของ Autoclave ใช อปุ กรณว ดั อุณหภมู ิ วางตาํ แหนงตางๆ
อยา งนอ ย 10 ตําแหนง ใน hot air oven เพื่อศึกษาการกระจายความรอนไดทวั่ ถึงทกุ จดุ โดยการทดลอง
ทํา 3 ครง้ั
Acceptable range in temperature in the empty chamber is ± 15 o C when the unit is operating at not
less than 250 oC ( USP 24 )

5.6.3 Heat penetration studies

หลักการและวิธีทดสอบเหมือนกบั การทาํ ใหปราศจากเชื้อดวยความรอ นชื้น ทาํ load chamber heat
distribution .ใช อุปกรณวดั อณุ หภูมิ สอดเขาใน ผลิตภณั ฑ ที่ตําแหนง เปน cold point เพ่อื หา minimum
FH หรอื อุณหภมู ติ ํ่าสุด ท่ีซมึ ผา นเขา ไปในผลติ ภณั ฑ การทาํ heat penetration ปกตทิ ํา 3 คร้ัง

5.6.4 Microbial Challenge Studies

เพอ่ื ศึกษาประสทิ ธิผลของการทาํ ลายจุลินทรยี  โดยใชBacillus subtilis เปน Biological indicator หรือ
ใช spore of most resistant microorganism ท่ีไดจาก bioburden ในการทาํ cycle development ใสใ น
ผลิตภณั ฑ ที่ตาํ แหนง cold point ซึง่ ศกึ ษาจากการทาํ heat penetration
กรณที เี่ ปน sterilization and depyrogenation cycle ความรอ นที่ใชส ูงมากไมตองทาํ biochallenge ทาํ
เฉพาะ endotoxin reduction

Spore Log Reduction (SLR) = F170
D170

5.6.5 Endotoxin reduction

เพอื่ ศึกษาประสิทธผิ ลในการทําลาย endotoxin โดยใช Escherechia coli endotoxin 100 to 10,000 ng (
500 to 50,000 endotoxin unit ) ( รายละเอยี ดในภาคผนวก 4 )

5.6.6 การสรปุ ผลการตรวจสอบความถกู ตอ ง

สรุปรายงานการทาํ cycle development , validation testing ,data , monitoring and operating parameter

30

5.7 การตรวจสอบตดิ ตามอยางตอเน่อื ง/การตรวจสอบความถกู ตองซา้ํ /การควบคมุ การ
เปลีย่ นแปลง (Ongoing Monitoring/Revalidation / Change control)

สภาวะควบคมุ เชน clean room .bioburden ,pyroburden และ operating parameter หลังจาก validation
จะตอ ง ติดตามตรวจสอบ ตลอดทุก cycle
การตรวจสอบความถกู ตอ งซา้ํ (Revalidation) จะตองทาํ การตรวจอบความถูกตองปล ะครั้ง
กรณีท่ีมีการเปลีย่ นแปลงกระบวนการผลิต อุปกรณ หรอื software ที่มีผลกระทบตอความปลอดภัย คณุ
ภาพของผลิตภัณฑ จะตองทําการตรวจสอบความถกู ตองซ้าํ
การเปล่ยี นแปลงทม่ี ผี ลกระทบตอคุณภาพจะตองจัดทํามาตรฐานสําหรับวิธกี ารปฏิบตั ิโดยระบสุ าเหตุ
วิธีการโดยใชหลกั การเดียวกับการทาํ ใหป ราศจากเชื้อดว ยความรอนชน้ื

31

ภาคผนวก 1

Lethal Rate Table - Celsius Scale

32

ภาคผนวก 2

Resistance Performance test
USP 24

1. Total Viable Count

1. นํา Biological Indicator ที่จดั เตรียมไว จาํ นวน 3 ตัวอยาง ในแตล ะ Lot ที่

BI เตรียมไว ในรูปแบบของ Spore suspension , Spore strip หรือ Self contained นาํ
มาเตรียมในรูปของสารละลาย ใน Sterile Purified water
Biological Indicator

2. นํา suspension จาก (1) ใสล งใน water bath ที่ อุณหภูมิ 800-850C เปน เวลา 10
นาที

Water bath 3. ทําใหเ ยน็ โดยทันทีใน Ice water bath ที่ 0-40C

Ice Water bath 4. นําตัวอยางมา 1 ml. มาเตรียม Serial dilution ทเ่ี หมาะสมเพ่อื หาปรมิ าณของสปอร
1 ml. โดยใช Sterile Purified Water เปนตวั เจือจาง

5. นํา 1 ml. ในแตล ะ dilution มาเท plate ทํา 2 plate/dilution โดยใช Tryptic Soy
9 ml. Agar (20 ml./plate) และผสมใหเขากัน( For 105-107 spore/ml. Population )

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml. 1 ml. 6. Incubate ที่อุณหภมู ิ 30-350C เปน เวลา 24-48 ชัว่ โมง

7. อานผลและนบั จาํ นวนโคโลนีในแต plate โดยคูณดวย dilution factor และ
คํานวณหา จํานวนของ Spore/ml. ของ Biological Indicator เร่ิมตน และนํามา
หาคา เฉลีย่ และบันทกึ ผล

33

2. D-Value Determination

2.1 Survival Curves Method

2.1.1 ใช spore suspension ที่มีปริมาณ Biological Indicator spore อยใู นชว ง
105-107 spore/ml. โดยเตรียมใน Screw cap tube หรอื Glass ampoule

Oil bath 2.1.2 ต้ังอุณหภูมิ Oil bath ตามอณุ หภมู ิที่จะทาํ การศึกษา เลอื กเวลาท่จี ะทําการศึกษา
อยา งนอ ย 3 ชวงเวลาโดยทําซาํ้ 3 ครัง้ ในแตล ะชว งเวลา

2.1.3 นํา Screw cap tube ใสลงไปใน Oil bath ที่อุณหภมู ิคงทีต่ ามที่กาํ หนด (เวลาในการ
Oil bath Heat up ไมควรเกิน 30 วนิ าที – 1 นาที)

2.1.4 Cool down ทันที ท่ี 0-40C ใน Ice water bath

Ice Water Bath

2.1.5 นํามาหาจํานวน spore ทีเ่ หลืออยูใช Pour plate technique โดยทําเปน dilution

series
1 ml. 2.1.6 และเจือจางดวย Sterile water โดยปเ ปต suspension 1 ml. ลงใน plate และเทดว ย

Tryptic Soy Agar 20 ml./plate พรอ มผสมใหเขากัน

Undiluted 1 ml.

9 ml. 9 ml. 9 ml. 9 ml. 1 ml.
10-1 10-2 10-3 10-4
For 105-107/ml.
Population

2.1.6 Incubate ที่ 30-350C เปนเวลา 48-72 ช่ัวโมง

2.1.7 บันทึกผลนบั จาํ นวนโคโลนี ของ spore ทีเ่ กดิ ข้ึนในแตล ะชวงเวลา และคณู ดวย
dilution factor หาคา เฉล่ีย และ นาํ มา คาํ นวณหา D-Value ดังสมการ

34

D = 1/K ; K = Slope

k = slope of the survivor curve
ui = the equivalent heating time at heating medium temperature
Ni = the number of survivors
n = the number of (U, Log N) values

35

ตวั อยาง

36

2.2 Spearman – Karber Method

1. นํา Biological Indicator ในรปู ของ spore suspension หรอื ในรูปแบบอ่นื ๆ ใน
ปริมาณ 2 ml./test tube (ใชจาํ นวน 10 test tube/ 1 ชว งเวลา) โดยใชจ ํานวน spore
ที่ปริมาณ 104-107 spore/ml.

2. ต้ังอุณหภมู ใิ น Oil bath ตามเวลา และอณุ หภมู ิท่ที าํ การศกึ ษาทก่ี ําหนด โดย
ควรกาํ หนด ชวงเวลาทจี่ ะศกึ ษา อยา งนอย 6 ชว งเวลา ในแตล ะการตรวจสอบ

Oil bath

3. นํา test tube ที่มี spore suspension ใสลงใน Oil bath พรอมจบั เวลา เมื่อได
อณุ หภูมิ ตามท่กี าํ หนด (เวลาไมค วรเกิน 30 วินาที – 1 นาที ในการ Heat up
suspension ใน tube ให ถงึ อุณหภมู ทิ ี่ตงั้ ไว)

Spore suspension 4. เมื่อไดอุณหภูมิและเวลาตามทกี่ ําหนด ใหน าํ test tube มา Cool down โดยทันที
1 ml. ที่ 0-40Cใน Ice water bath

TSB 5. นํา spore suspension ท่ผี า นการทาํ Heat resistant test มาจาํ นวน 1 ml. Inoculate
30-350C ลงในTrypticase-soy broth (TSB) 9 ml. ใช 1 ml.ของ Spore suspension/ 1
หลอดของ TSB) ดวยวธิ ี Aseptic Technique โดยใช 10 หลอดของ TSB / 1 ชว ง
7 วนั เวลา

6. Incubate ที่ 30-350C เปนเวลา 7 วัน

6. บันทึกผลอา นคาความขนุ ทีเ่ กดิ ขนึ้ คดิ เปน จํานวนหลอดท่ี Negative และ Positive
ในแตล ะชว งเวลานาํ ไปคํานวณหาคา D-Value ตามสมการในภาคผนวก3

37

ภาคผนวก 3

38

Example

39

40

41

42

43

44