คู่มือการปฏิบัติงานตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้าง และการควบคุมคุณภาพ
ข ค าน า โรคเท้าช้างเป็นโรคติดต่อที่เกิดขึ้นในประเทศเขตร้อน มียุงเป็นพาหะน าโรค ในประเทศไทยได้มีการประกาศก าจัด โรคเท้าช้างให้หมดไปตั้งแต่ปี พ.ศ. 2549 แต่ก็ยังมีรายงานอุบัติการณ์พบผู้ติดเชื้อโรคเท้าช้าง ซึ่งกองโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรคได้เล็งเห็นความส าคัญในการเฝ้าระวัง ป้องกันควบคุมโรคเท้าช้างอย่างมีประสิทธิภาพ ทั้งการตรวจวินิจฉัย การรักษา และการประเมินผลการควบคุมโรคตลอดจนการควบคุมยุงพาหะน าโรค กองโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค ได้รับความอนุเคราะห์จากคณาจารย์มหาวิทยาลัย ผู้เชี่ยวชาญโรค เท้าช้างจากหน่วยงานที่เกี่ยวข้องทั้งในและนอกกระทรวงสาธารณสุข คณะที่ปรึกษา คณะกรรมการ และคณะท างานศูนย์ อ้างอิงทางห้องปฏิบัติการโรคติดต่อน าโดยแมลง ได้รวบรวมความรู้เกี่ยวกับโรคเท้าช้าง วิธีการตรวจวินิจฉัย เทคโนโลยีใหม่ และการควบคุมคุณภาพ เพื่อเป็นแนวทางการด าเนินงานส าหรับห้องปฏิบัติการทุกแห่ง ทั้งส่วนกลาง และส่วนภูมิภาค คณะผู้จัดท าหวังเป็นอย่างยิ่งว่าหนังสือฉบับนี้จะเป็นประโยชน์แก่ผู้เกี่ยวข้องกับการตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้าง หากมี ข้อผิดพลาดประการใด ต้องขออภัยไว้ ณ ที่นี่ด้วย คณะผู้จัดท า มิถุนายน 2565
ค สารบัญ เนื้อหา หน้า บทที่ 1 ความรู้ทั่วไปเกี่ยวกับโรคเท้าช้าง 1 บทที่ 2 การตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียทางห้องปฏิบัติการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ 14 บทที่ 3 การวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิเท้าช้างด้วยชุดตรวจอย่างเร็ว 27 บทที่ 4 การตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างด้วยวิธีอื่นๆ 41 บทที่ 5 ฟิลาเรียในยุง และการจ าแนกชนิดเชื้อ 43 ภาคผนวก 51 เอกสารอ้างอิง 56
ง สารบัญรูป เนื้อหา หน้า รูปที่ 1 แสดงพื้นที่แพร่โรคและพื้นที่ไม่แพร่โรคเท้าช้างของประเทศไทย (2544) 2 รูปที่ 2 แสดงความชุกโรคเท้าช้างต่อแสนประชากร ประเทศไทย, 2535-2564 6 รูปที่ 3 แสดงวงจรชีวิตของพยาธิโรคเท้าช้าง 7 รูปที่ 4 แสดงวงจรชีวิตพยาธิโรคเท้าช้างในระบบน้ าเหลือง 8 รูปที่ 5 แสดงประเภทการปรากฏตัวของพยาธิโรคเท้าช้างในเลือดตามช่วงเวลา 9 รูปที่ 6 วิธีการเตรียมสไลด์ และเจาะเลือดปลายนิ้ว 14 รูปที่ 7 วิธีการหยดเลือดลงบนสไลด์ 15 รูปที่ 8 วิธีการเกลี่ยหยดเลือดบนสไลด์ให้ได้ขนาด 2.5 x 3 ซม. 15 รูปที่ 9 วิธีการเตรียมสียิมซ่าเข้มข้น 10 % 15 รูปที่ 10 วิธีการย้อมสียิมซ่าเข้มข้น 10 % ย้อมนาน 10 นาที 16 รูปที่ 11 วิธีการล้างฟิล์มเลือดในแนวระนาบ 16 รูปที่ 12 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวตั้ง 16 รูปที่ 13 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวนอน 17 รูปที่ 14 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวตั้งและแนวนอน 17 รูปที่ 15 ส่วนประกอบต่างๆของพยาธิไมโครฟิลาเรียเมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ 19 รูปที่ 16 ส่วนประกอบต่างๆของพยาธิไมโครฟิลาเรียเมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ 20 รูปที่ 17 เชื้อ Brugia malayi ที่ย้อมด้วยสียิมซ่า 20 รูปที่ 18 เชื้อ Wucherreria bancrofti ที่ย้อมด้วยสียิมซ่า 21
จ สารบัญรูป (ต่อ) เนื้อหา หน้า รูปที่ 19 การตรวจเลือดสดโดยใช้น้ าเกลือ 23 รูปที่ 20 การเจาะเลือดปลายนิ้วใส่หลอด Capillary 23 รูปที่ 21 การตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Knott’s technique 24 รูปที่ 22 วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้น (Membrane filtration technique) 25 รูปที่ 23 ชุดตรวจหาแอนติบอดีชนิด antifilarial IgG4 ของพยาธิฟิลาเรีย 29 รูปที่ 24 ส่วนประกอบของชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) 29 รูปที่ 25 การเก็บเลือดจากปลายนิ้ว 30 รูปที่ 26 วิธีการหยดเลือดและ หยดบัฟเฟอร์ 30 รูปที่ 27 วิธีการดึงแผ่นกระดาษออกทิ้งและหยดบัฟเฟอร์ 31 รูปที่ 28 วิธีการอ่านผลและแปลผลชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) 31 รูปที่ 29 ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง W. bancrofti 33 รูปที่ 30 วิธีเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วหรือใช้เลือดในหลอดเลือดที่เก็บเลือดจากเส้นเลือดด า 33 รูปที่ 31 วิธีหยดเลือดจ านวน 100 ไมโครลิตรจาก capillary tube 34 รูปที่ 32 วิธีดึงแถบกระดาษกาวออก และเขียนรายละเอียดผู้ป่วย 34 รูปที่ 33 วิธีอ่านผลการทดสอบ 35 รูปที่ 34 วิธีแปลผลการทดสอบ 35 รูปที่ 35 ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi 36 รูปที่ 36 ขั้นตอนการใช้ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi 37 รูปที่ 37 วิธีการเตรียมชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi 37 รูปที่ 38 วิธีการเขียนรหัส-ชื่อ ผู้ป่วย 38
ฉ สารบัญรูป (ต่อ) เนื้อหา หน้า รูปที่ 39 วิธีการตรวจและอ่านผลส าหรับตัวอย่างซีรั่ม/พลาสมา 38 รูปที่ 40 วิธีการตรวจและอ่านผลส าหรับตัวอย่างเลือดครบส่วน 39 รูปที่ 41 วิธีแปลผลการทดสอบชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง 39 รูปที่ 42 ตัวอย่างชุดตรวจเท้าช้างอื่นๆ 40 รูปที่ 43 แสดงปริมาณสัญญาณ fluorescence 41 รูปที่ 44 แสดง meting peak ของ DNA 42 รูปที่ 45 วงจรชีวิตพยาธิฟิลาเรีย 43 รูปที่ 46 เปรียบเทียบความยาวล าตัวของพยาธิตัวอ่อนฟิลาเรียระยะที่ 3 (L3) 44 รูปที่ 47 แสดงลักษณะปลายหางของ W. bancrofti 45 รูปที่ 48 แสดงลักษณะปลายหางของ B. Malayi 46 รูปที่ 49 แสดงลักษณะปลายหางของ B. Patei 47 รูปที่ 50 แสดงลักษณะปลายหางของ D. corynodes 48 รูปที่ 51 แสดงลักษณะปลายหางของ D. repense 48 รูปที่ 52 แสดงลักษณะปลายหางของ D. immitis 49 รูปที่ 53 แสดงลักษณะปลายหางของ S. equine 49 รูปที่ 54 ท าความสะอาดนิ้ว โดยใช้ส าลีชุบ 70 % alcohol 52 รูปที่ 55 วิธีเจาะเลือดปลายนิ้ว 53
ช สารบัญตาราง เนื้อหา หน้า ตารางที่ 1 การวินิจฉัยพยาธิไมโครฟิลาเรีย ที่พบในประเทศไทยโดยการย้อมสียิมซ่า 17 ตารางที่ 2 ปัญหาเกี่ยวกับฟิล์มเลือดและการแก้ไข 21 ตารางที่ 3 ตารางเปรียบเทียบวิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรีย 25 ตารางที่ 4 แสดงประสิทธิภาพของการตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างด้วยวิธีต่างๆ 28 ตารางที่ 5 การศึกษาการปรากฏตัวของพยาธิไมโครฟิลาเรียในประเทศไทย 51
1 บทที่ 1 ความรู้ทั่วไปเกี่ยวกับโรคเท้าช้าง โรคเท้าช้างเป็นโรคติดต่อที่มียุงบางชนิดเป็นพาหะ ที่เกิดจากพยาธิตัวกลมใน Superfamily Filariodidae โดยในประเทศไทยมีพยาธิที่เป็นสาเหตุอาการ 2 ชนิด ได้แก่ Wuchereria bancrofti และ Brugia malayi 1,2 ก่อให้เกิดโรคเท้าช้างในระบบน้ าเหลือง เรียกว่า Lymphatic Filariasis พยาธิตัวแก่จะอาศัยในระบบต่อมน้ าเหลือง และรบกวนระบบภูมิคุ้มกัน ตัวแก่ของพยาธิสามารถอาศัยอยู่ในร่างกายมนุษย์ได้นาน ๖-๘ ปีและสามารถผลิต พยาธิตัวอ่อน (microfilaria) เป็นล้านตัวในช่วงที่มีชีวิต3 การส ารวจโรคเท้าช้างได้มีการด าเนินการครั้งแรกในปี พ.ศ. 2492 โดยกระทรวงสาธารณสุข และพบ รายงานผู้ป่วยในพื้นที่ 6 จังหวัดของไทย ได้แก่ ในพื้นที่จังหวัด ชุมพร สุราษฎร์ธานี นครศรีธรรมราช พัทลุง ปัตตานี และนราธิวาส และองค์การอนามัยโลกได้ส ารวจโรคเท้าช้างโดยการเจาะเลือดในพื้นที่ 4 จังหวัด (สุราษฎร์ ธานี นครศรีธรรมราช พัทลุง และปัตตานี) พบว่า ในช่วงปี พ.ศ. 2494-2495 พบว่าอัตราการตรวจและพบ microfilaria เท้าช้างเฉลี่ย ร้อยละ 21 และเป็นเชื้อชนิด Brugia malayi4 องค์การอนามัยได้เริ่มมีโครงการก าจัด โรคเท้าช้างทั่วโลกในปี 2563 โดยมีมาตรการหลัก ได้แก่ตัดการแพร่โรค (สามารถใช้มาตรการจ่ายยากลุ่มแก่ ประชากรในพื้นที่แพร่โรค ปีละครั้งไม่น้อยกว่า 5 ปี) และลดความทุกข์ทรมานของผู้ปรากฏอาการ (ใช้โปรแกรม การสอนแก่ผู้ปรากฏอาการและญาติ เพื่อให้การดูแลตนเอง และป้องกันไม่ให้เกิดความพิการในผู้ที่ยังไม่ปรากฏ อาการ)2 ประเทศไทยได้เริ่มโครงการก าจัดโรคเท้าช้างตั้งแต่ปี 2544 โดยการเตรียมการเจ้าหน้าที่ด้วยการจัดอบรม เจ้าหน้าที่ที่เกี่ยวข้อง และจัดแบ่งพื้นที่ออกเป็นพื้นที่แพร่โรคและไม่แพร่โรค และเริ่มมาตรการหลักด้วยการจ่ายยา กลุ่ม ในพื้นที่แพร่โรค 357 กลุ่มบ้าน ของ 11 จังหวัด และท าการประเมินตามแนวทางการด าเนินงานการก าจัดโรค ขององค์การอนามัยโลก ประเทศไทยได้ประกาศก าจัดโรคในปี 25602,4 โรคเท้าช้างถึงแม้จะเป็นโรคที่ประกาศก าจัดไปแล้วจากประเทศไทยแต่ยังมีพื้นที่แพร่โรคอยู่ในบางพื้นที่ ซึ่งยังมีผู้ป่วยคงทะเบียน และสภาพแวดล้อมในพื้นที่เหมาะสม รวมถึงข้อมูลการส ารวจยังมียุงพาหะในพื้นที่ ซึ่งยัง ต้องมีการเฝ้าระวัง และทบทวนความรู้เพื่อเตรียมความพร้อมในการรับมือหากเกิดเหตุโรคอุบัติซ้ า รวมถึงปัจจุบัน การเดินทางคมนาคมที่สะดวกมีการเคลื่อนย้ายประชากรสูง จึงควรมีการเฝ้าระวังการเข้ามาของประชากรจาก ประเทศที่ยังมีการแพร่โรค ดังนั้นหลังจากปี 2560 จนถึงปัจจุบัน ประเทศไทยได้มีมาตรการด าเนินการเฝ้าระวัง ติดตามโรคเท้าช้าง ในพื้นที่แพร่โรคเดิมและพื้นที่จังหวัดที่มีการลงทะเบียนของแรงงานต่างด้าวชาวเมียนมาสูง 5 ล าดับแรกในแต่ละปี โดยมีเป้าหมายของแผนงานควบคุมโรค เพื่อรักษาระดับการตัดการแพร่โรคเท้าช้าง ให้อยู่ใน เกณฑ์การก าจัดโรคตามที่ WHO ก าหนด โดยมีการติดตามเฝ้าระวังในพื้นที่แพร่โรคเดิม 11 จังหวัด เป็นระยะเวลา 10 ปี หลังประกาศก าจัดโรคเท้าช้างในประเทศไทย (2560-2569) ซึ่งมาตรการและกิจกรรมหลักที่ด าเนินการ ได้แก่
2 1. การเฝ้าระวัง: ในคน พาหะ และรังโรคในพื้นที่แพร่โรคเดิม และแรงงานต่างด้าวชาวเมียนมาที่ไม่ได้เข้า ระบบหลักประกันสุขภาพ ในพื้นที่ที่มีการลงทะเบียนของแรงงานแรงงานต่างด้าวชาวเมียนมาสูง 5 ล าดับแรก 2. ลดอัตราการพบโรคเท้าช้างในกลุ่มคนต่างด้าวที่มาจากประเทศแพร่โรค: โดยการจ่ายยากลุ่มหรือจ่าย ยาเฉพาะราย ในคนต่างด้าวที่มาจากประเทศแพร่โรค ตรวจสุขภาพหรือจ่ายยากลุ่มในระบบการตรวจประกัน สุขภาพแรงงานต่างด้าว และติดตามรักษาในผู้พบพยาธิโรคเท้าช้าง 3. ลดความทุกข์ทรมานของผู้ปรากฏอาการโรคเท้าช้าง: ติดตามอาการของผู้ป่วยเท้าช้างปรากฏอาการ เป็นระยะ ให้สุขศึกษาแก่ผู้ป่วยปรากฏอาการให้ดูแลรักษาความสะอาดอวัยวะ และกรณีผู้ป่วยมีอาการให้การรักษา แบบประคับประคองเพื่อลดความทุกข์ทรมาน รูปที่ 1 แสดงพื้นที่แพร่โรคและพื้นที่ไม่แพร่โรคเท้าช้างของประเทศไทย (2544) ปัจจุบันประเทศไทยได้รับการประกาศการก าจัดโรคเท้าช้างแล้ว หลังจากที่ได้ด าเนินงานการก าจัดมาตั้งแต่ ปีพ.ศ. 2544 ที่ได้มีการจัดแบ่งพื้นที่เป็นพื้นที่แพร่โรคและไม่แพร่โรค โดยมีพื้นที่แพร่โรค 357 กลุ่มบ้าน ใน 11
3 จังหวัด คือ เชียงใหม่ ล าพูน แม่ฮ่องสอน ตาก กาญจนบุรี ราชบุรี ระนอง สุราษฎร์ธานีนครศรีธรรมราช กระบี่ และนราธิวาส ด าเนินการจ่ายยากลุ่มด้วยยา 2 ชนิดแก่ประชากรทุกคนในพื้นที่แพร่โรค ทุกปีๆละครั้ง และให้การ ดูแลรักษาผู้ปรากฏอาการ ตามมาตรการหลักของการก าจัดโรคเท้าช้าง ประเทศไทยได้เริ่มการจ่ายยากลุ่มในปี พ.ศ. 2545-2549 และต่อเนื่องถึงปี พ.ศ. 2555 ส าหรับพื้นที่แพร่โรคจังหวัดนราธิวาส ระหว่างการด าเนินการ ก าจัดได้มีการส ารวจประเมินภาวะแพร่โรคเป็นระยะตามแนวทางการก าจัดโรคเท้าช้างขององค์การอนามัยโลก กระทั่งได้รับ การประกาศการก าจัดโรคเท้าช้างในเดือนกันยายน 25605 การด าเนินงานเฝ้าระวังโรคเท้าช้างระยะหลังประกาศการก าจัด ในปีงบประมาณ 2561-2565 จะเป็นเฝ้า ระวังโรค เพื่อคงระดับการแพร่โรคเท้าช้างให้ต่ ากว่าเกณฑ์การก าจัดโรคเท้าช้าง ที่ประกอบไปด้วยกิจกรรมหลักๆ5 ดังนี้ การด าเนินงานเฝ้าระวังโรคเท้าช้างระยะหลังประกาศการก าจัด 1. การเฝ้าระวังโรคทั้งในคน พาหะ และรังโรค 1) การเฝ้าระวังในคน - พื้นที่แพร่โรคเดิม 357 กลุ่มบ้านใน 11 จังหวัด - พื้นที่ที่มีคนต่างด้าวชาวพม่าสูง 10 จังหวัด (ปรับลดลง 5 จังหวัดตั้งแต่ปีงบ 2563 เป็นต้นไป) 2) การเฝ้าระวังในยุงพาหะ - พื้นที่แพร่โรคเดิม 357 กลุ่มบ้านใน 11 จังหวัด - พื้นที่ที่มีคนต่างด้าวชาวพม่าสูง 10 จังหวัด (ปรับลดลง 5 จังหวัดตั้งแต่ปีงบ 2563 เป็นต้นไป) 3) การเฝ้าระวังในแมว รังโรคเท้าช้างในพื้นที่การติดเชื้อพยาธิโรคเท้าช้างชนิด B. malayi - พื้นที่แพร่โรคเดิม 97 กลุ่มบ้านใน 4 จังหวัด 2. การลดอัตราการแพร่โรคเท้าช้างในกลุ่มคนต่างด้าวที่มาจากประเทศแพร่โรคเท้าช้าง - การจ่ายยากลุ่ม 3. ให้การดูแลรักษาผู้พิการจากโรคเท้าช้าง - การติดตามดูแลผู้พิการจากโรคเท้าช้าง - การประเมินสถานบริการสาธารณสุขที่ให้การดูแลผู้ปรากฏอาการโรคเท้าช้าง - การอบรมฟื้นฟูเจ้าหน้าที่ที่ให้การดูแลผู้ปรากฏอาการโรคเท้าช้าง
4 พยาธิสภาพ เกิดมาจากพยาธิตัวแก่และระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายที่มีต่อพยาธิ โดยพยาธิจะกดระบบภูมิคุ้มกันของ ร่างกาย การเคลื่อนไหวของพยาธิตัวแก่ไปตามท่อน้ าเหลือง ท าให้มีการขยายตัว โค้ง หักงอ ของท่อน้ าเหลือง ส่งผลให้น้ าเหลืองไหลไม่สะดวก ไหลช้าลง และสารที่ขับออกมาจะท าให้หลอดน้ าเหลืองเกิดการระคายเคืองน าไปสู่ การอักเสบอย่างเฉียบพลันของต่อมและทางเดินน้ าเหลืองเป็นๆหายๆ มักปรากฏอาการบวม แดง ร้อน เริ่มที่ต่อม น้ าเหลืองและลามลงไปตามท่อน้ าเหลือง และท าให้มีการติดเชื้อแบคทีเรียง่ายขึ้น เพิ่มการท าลายหลอดน้ าเหลือง เกิดการคั่งของน้ าเหลืองมากขึ้น การคั่งของน้ าเหลืองที่อวัยวะส่วนปลาย เช่น แขน ขา เป็นพยาธิสภาพส าคัญของ การติดเชื้อชนิด B. malayi ในขณะที่การคั่งของน้ าเหลืองที่อัณฑะเป็นพยาธิสภาพส าคัญของการติดเชื้อชนิด W. bancrofti การอักเสบแต่ละครั้งท าให้ผนังของท่อน้ าเหลืองหนาขึ้น ทางเดินน้ าเหลืองแคบลงเรื่อยๆ เกิดการอุดตันใน ระยะต่อมาน้ าเหลืองไหลกลับไม่สะดวก ท่อน้ าเหลืองที่อยู่ส่วนต่ ากว่าส่วนที่อุดตันจะขยายตัวขึ้น ลิ้นของท่อ น้ าเหลืองไม่สามารถปิดกั้นน้ าเหลืองได้ น้ าเหลืองจะคั่งที่ส่วนปลายมากขึ้น ระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายจะกลับสู่ภาวะปกติหลังจากที่พยาธิตัวแก่ตายลง ส่งผลให้ร่างกายมีปฏิกิริยา ต่อพยาธิ มีเซลล์มาเกาะ เกิดการอุดตันของหลอดน้ าเหลือง การคั่งของน้ าเหลืองมากขึ้นเช่นกัน การคั่งของ น้ าเหลืองดังกล่าวนั้น จะท าให้ท่อน้ าเหลืองและเนื้อเยื่อใกล้เคียงถูกท าลาย น าไปสู่การเกิดพังผืด หนาตัวของ ผิวหนังเกิดเป็นภาวะเท้าช้างในผู้ติดเชื้อชนิด W. bancrofti สามารถพบภาวะที่ปัสสาวะมีน้ าเหลืองปน ท าให้มีสี ขุ่นขาวคล้ายนม (chyluria) ได้ จากการอุดตันของต่อมน้ าเหลืองบริเวณหลังเยื่อบุช่องท้อง และยังสามารถพบ ภาวะ tropical pulmonary eosinophilia ได้จากร่างกายมีปฏิกิริยาต่อพยาธิมากในบางราย3 อาการแสดงของโรคเท้าช้าง1,3,6 อาการและอาการแสดงที่เกิดขึ้นมีความแตกต่างกัน ขึ้นกับพื้นที่ที่เกิดโรคซึ่งแบ่งได้ดังนี้ คือ 1. ไม่ปรากฏอาการ ผู้ป่วยจะไม่มีอาการปรากฏให้เห็น อาจจะพบหรือไม่พบ microfilaria ในกระแส เลือดก็ได้ การตรวจไม่พบ microfilaria เนื่องจากอยู่ในระยะ prepatent period แต่จะท าให้เกิดการท าลาย ระบบท่อน้ าเหลืองและไต ซึ่งเป็นอาการที่มองไม่เห็น 2. ปรากฏอาการ (ร้อยละ 20 – 30) ผู้ป่วยอาจจะพบหรือไม่พบ microfilaria ในเลือดก็ได้ อาการแสดง สามารถแบ่งเป็น 2 ระยะ คือ 2.1 อาการเฉียบพลัน มักเกิดร่วมกับการอักเสบเรื้อรัง ลักษณะอาการที่เกิดขึ้นอย่างทันที และ เกิดขึ้นซ้ ากันปีละหลายๆ ครั้ง โดยมีการอักเสบของผิวหนัง ต่อมน้ าเหลืองบวมโต ต่อมและทางเดินน้ าเหลือง จะ พบลักษณะแดง ร้อนเป็นแนวยาวจากต าแหน่งต่อมน้ าเหลืองลงไปตามท่อน้ าเหลือง ปวดหัว มีไข้ คลื่นไส้ในบาง ราย และความรู้สึกไม่สบายกายร่วมด้วย ช่วงเวลาแสดงอาการประมาณ 3-5 วัน และจะหายไปได้เองโดยไม่ต้อง รักษา มักเป็นซ้ าๆ หลายๆครั้ง และซ้ าที่เดิม ความถี่ของอาการอักเสบครั้งละประมาณ 5-10 วันต่อปี อาการเหล่านี้
5 จะสัมพันธ์กับการติดเชื้อซ้ า (secondary infection) และจะเกิดขึ้นภายหลังจากติดเชื้อพยาธิแล้วประมาณ 3-9 เดือน อาการแสดงจะพัฒนาไปสู่ระยะเรื้อรัง ส่วนใหญ่แล้วเป็นผลมาจากการติดเชื้อแบคทีเรียที่บริเวณผิวหนังได้ ง่ายกว่าปกติ 2.2 อาการเรื้อรัง จากการอักเสบของต่อมและท่อน้ าเหลืองเป็นๆหายๆ เริ่มต้นจากเกิดการบวม ของน้ าเหลืองกดบุ๋ม แล้วต่อมาจะบวมมากขึ้นกดไม่บุ๋ม ไปสู่อวัยวะบวมหรือโต อาการเหล่านี้จะเกิดขึ้นภายหลัง จากติดเชื้อพยาธิแล้วประมาณ 5-10 ปี ผู้ป่วยที่ติดเชื้อ B. malayi มีอาการแสดงที่ส าคัญ คือขาโต โดยมีพยาธิสภาพตั้งแต่ใต้เข่าลงไป และบางครั้งก็จะพบที่แขนตั้งแต่ใต้ข้อศอกลงไป ในขณะที่ผู้ติดเชื้อ W. bancrofti จะเกิดพยาธิสภาพที่บริเวณ อวัยวะสืบพันธุ์ได้ โดยถ้าเป็นผู้หญิงอาจจะพบอาการบวมของ vulva และที่หน้าอก ส่วนในผู้ชายพบว่ามีการคั่ง ของน้ าเหลืองในอัณฑะ (hydrocele) และปัสสาวะเป็นสีขุ่นขาวเหมือนน้ านม (chyluria) แต่บางรายอาจพบการ บวมที่แขน และขาได้ แต่จะเป็นการบวมตลอดทั้งแขนหรือขา 2.3 อาการแสดงอื่นๆ ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อ W. bancrofit อาจมีภาวะไตอักเสบซึ่งแสดงออกโดย ปัสสาวะมีเม็ดเลือดปนออกมา (hematuria) นอกจากนี้อาจพบว่ามีภาวะ Tropical Pulmonary Eosinophilia (TPE) ซึ่งจะมีอาการหอบ หายใจล าบาก เจ็บหน้าอก ไอตอนกลางคืน และมี eosinophil, IgE และ IgG4 ในเลือด สูง ระบาดวิทยาโรคเท้าช้าง การส ารวจโรคเท้าช้างในประเทศไทยครั้งแรก ปีพ.ศ. 2494 โดย Dr. M.O.T Iyengar และคณะ โดยพบ ผู้ป่วยอวัยวะบวมโตเป็นจ านวนมากในจังหวัดสุราษฎร์ธานี นครศรีธรรมราช พัทลุง และปัตตานี จากการตรวจ เลือดประชากร จ านวน 4,112 คน พบว่าอัตราการตรวจพบเชื้อพยาธิโรคเท้าช้างชนิด B. Malayi เฉลี่ยร้อยละ 21 อัตราแตกต่างกันตั้งแต่ร้อยละ 2.9 - 40.8 ในแต่ละท้องที่6 สถานการณ์โรคเท้าช้างในประเทศไทยในปัจจุบัน เกิดจากการติดเชื้อพยาธิโรคเท้าช้าง 2 ชนิด คือ W. bancrofti และ B. malayi ผู้ป่วยโรคเท้าช้างในประเทศไทย มีการแบ่งเป็น 3 ประเภท คือ ผู้พบmicrofilariaหรือ แอนติเจนโรคเท้าช้าง (M) ผู้มีต่อมน้ าเหลืองอักเสบ (L) และผู้มีอวัยวะบวมโต (E) ผู้ปรากฏอาการทั้งหมดเป็นราย เก่า ที่พบในจังหวัดที่เคยเป็นแหล่งแพร่โรคเก่าและจังหวัดนราธิวาส ส่วนผู้ป่วยรายใหม่พบเฉพาะในพื้นที่จังหวัด นราธิวาสเท่านั้น5 ความชุกของผู้ป่วยโรคเท้าช้างในปี พ.ศ. 2564 เท่ากับ 0.16 ต่อแสนประชากร ส าหรับผู้พบmicrofilariaคน ไทยพบเฉพาะในจังหวัดนราธิวาส คิดเป็นอัตราความชุก 0.01 ต่อแสนประชากร และผู้ปรากฏอาการที่ยังคงมี
6 สภาวะความพิการ ต้องให้การดูแลรักษาเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดอาการแทรกซ้อน อีก 76 รายใน 7 จังหวัด คิดเป็น อัตราความชุก 0.16 ต่อแสนประชากร5 รูปที่ 2 แสดงความชุกโรคเท้าช้างต่อแสนประชากร ประเทศไทย 2535-2564 วงจรชีวิตของพยาธิโรคเท้าช้าง เมื่อยุงพาหะโรคเท้าช้างกัดและดูดเลือดคนที่มีmicrofilariaเข้าสู่ตัวยุง แล้วmicrofilariaผ่านเข้าสู่ กระเพาะยุงแล้วสลัดปลอกหุ้มล าตัวออก เคลื่อนตัวไปสู่กล้ามเนื้อบริเวณอกที่มีรูปร่างคล้ายไส้กรอก ส่วนปลายอีก ด้านหนึ่งมีหางเรียวแหลมยื่นออกมาเรียกระยะ L1 เป็นระยะตัวอ่อนระยะที่ 1 เมื่อลอกคราบจะเปลี่ยนแปลงเป็น ระยะ L2 เป็นระยะที่จะมีรูปร่างที่ยาวมากขึ้นกว่าระยะ L1 มีหางสั้น พบตุ่มยื่นออกมาบริเวณหาง 1-2 อัน และมี การเคลื่อนไหวของตัวอ่อนเล็กน้อย แล้วตัวอ่อนระยะ L2 จะลอกคราบเปลี่ยนเป็นตัวอ่อนระยะ L3 (ระยะติดต่อ) ระยะนี้จะมีรูปร่างที่ยาวขึ้นและมีการเคลื่อนไหวตลอดเวลาแล้วเคลื่อนตัวไปสู่ปากยุงมากัดคน แล้วmicrofilariaจะ เคลื่อนที่มาบริเวณแผลที่ยุงกัด ไชผ่านแผลเข้าสู่ระบบน้ าเหลืองของคน ซึ่งจะมีการเจริญเติบโตไปเป็นตัวอ่อนระยะ L4 เป็นระยะตัวเต็มวัย เมื่อพยาธิตัวแก่เพศผู้และเพศเมียผสมพันธุ์ พยาธิตัวเมียจะปล่อยmicrofilariaเข้าสู่ระบบ ไหลเวียนเลือดของคนต่อไป7 11.16 6.54 5.78 5.54 3.27 2.08 1.45 0.99 0.71 0.58 0.53 0.57 0.43 0.4 0.35 0.32 0.31 0.25 0.19 0.51 0.47 0.43 0.37 0.28 0.18 0.16 0.17 0.16 0.160.16 2535 2540 2545 2550 2555 2560 0 2 4 6 8 10 12 PR/100 000
7 รูปที่ 3 แสดงวงจรชีวิตของพยาธิโรคเท้าช้าง7
8 รูปที่ 4 แสดงวงจรชีวิตพยาธิโรคเท้าช้างในระบบน้ าเหลือง การปรากฏตัวของพยาธิโรคเท้าช้างในเลือด (periodicity)2,3 Microfilaria จะออกมาสู่เส้นเลือดส่วนปลายเป็นบางช่วงเวลาเท่านั้น และพบว่ามีความสัมพันธ์กับ ช่วงเวลาการเข้ากัดของยุง และ oxygen tension ซึ่งแบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ 1. Periodic type ปรากฏในเลือดเป็นบางเวลา มีทั้งชนิดที่พบเฉพาะกลางคืน (nocturnal periodic) หรือ พบเฉพาะกลางวัน (diurnal periodic) 2. Subperiodic type microfilaria ปรากฎตัวในกระแสเลือดตลอดเวลา แต่พบได้หนาแน่นในบาง ช่วงเวลา มีทั้งชนิดที่พบในเวลากลางคืนมากกว่ากลางวัน (nocturnal subperiodic) และพบในเวลากลางวัน มากกว่ากลางคืน (diurnal subperiodic) การปรากฏตัวของพยาธิโรคเท้าช้างในประเทศไทยปัจจุบัน 1) W. bancrofti แบบ nocturnally subperiodic type 2) B. malayi แบบ nocturnally subperiodic type และ nocturnally periodic type
9 รูปที่5 แสดงประเภทการปรากฏตัวของพยาธิโรคเท้าช้างในเลือดตามช่วงเวลา
10 วิธีการตรวจวินิจฉัย การตรวจทางห้องปฏิบัติการ การตรวจค้นหาเชื้อพยาธิmicrofilaria ในกระแสเลือดเป็นวิธีที่นิยมกันอย่างแพร่หลายในหลายประเทศ เพราะสะดวกและประหยัดค่าใช้จ่ายเหมาะต่อการปฏิบัติงานภาคสนามในระดับสถานีอนามัยที่มีเครื่องมือ วิทยาศาสตร์ เช่น กล้องจุลทรรศน์ เครื่องปั่นเม็ดเลือดเลือดแดงอัดแน่นสามารถท าการตรวจพยาธิmicrofilaria ด้วยวิธีดังนี้ 1. วิธีท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่า 2. วิธีตรวจเลือดสด (Wet film) 3. วิธีตรวจด้วย Capillary tube technique 4. วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Knott’s technique 5. วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้น (Membrane filtration technique) การรักษา Diethylcarbamazine citrate (DEC) เป็นย า รักษ าโ รคเท้ าช้ าง ( Drug of choice for Lymphatic Filariasis) ในคนมานานกว่า ปี Standard recommend dose 6 มก./กก./วัน (WHO,1992) ส าหรับเชื้อ B. malayi รับประทานยาติดต่อกัน 6 วัน เป็นผลิตภัณฑ์ในรูปแบบของ dihydrogen citrate ส าหรับรับประทาน ละลายน้ าได้ดี ดูดซึมเร็ว สามารถกระจายไปตามเนื้อเยื่อต่างๆได้ดี ยาจะออกฤทธิ์ร่วมกับ Reticuloendothetial cell มีประสิทธิภาพในการก าจัดโมโครฟิลาเรียและยาจะถูกขับออกมาทางไต แต่ประสิทธิภาพของยานี้ต่อตัวแก่ไม่ ชัดเจน การน า DEC มาใช้กับรังโรคในสัตว์เช่น หนู (jird) ต้องใช้ขนาด 300 มก./กก. ส่วนแมว 100 มก./กก. ต่าง กับในคนที่ใช้ขนาด 6 มก./กก. ก็สามารถก าจัดmicrofilariaได้ในระดับเดียวกัน เนื่องจากระบบภูมิคุ้มกันที่ต่างกัน นอกจากนี้แมวมักจะขย้อน อาเจียนยาออกมายากแก่การควบคุมปริมาณยาที่แมวได้รับและสิ่งที่ต้องระวังอย่างยิ่ง ในการก าหนดมาตรการรักษาในแมวที่เป็นสัตว์เลี้ยงแสนรักแสนหวง คือจะต้องเป็นวิธีปลอดภัยและประชาชน ยอมรับ เนื่องจากบางครั้งพยาธิตัวแก่อาจอาศัยอยู่ที่เส้นเลือด pulmonary artery และถ้ามีการใช้ยาที่มีฤทธิ์ฆ่าตัว แก่ทันทีคราวละจ านวนมาก ตัวแก่จะตายและลอยไปอุดตันในหัวใจท าให้แมวตายได้ มาตรการป้องกันและการควบคุมโรค 1.แนวทางการป้องกันควบคุมโรคเท้าช้าง 1.1 ด าเนินการรักษาผู้ป่วยรายนั้นทันที8 1.2 ถ้าพบพื้นที่แหล่งแพร่โรคใหม่โดยพบผู้ป่วยระยะแพร่เชื้อ (คนไทย) ซึ่งเป็นการติดเชื้อในพื้นที่ และในพื้นที่มีความเหมาะสมต่อการเป็นแหล่งเพาะพันธุ์ยุงพาหะให้ด าเนินการรักษากลุ่มประชาชนทั้งหมู่บ้าน เพื่อ
11 ตัดการแพร่เชื้อพยาธิโรคเท้าช้าง ปีละ 1 ครั้ง ด้วย Diethylcarbamazine ร่วมกับ albendazole ติดต่อกัน 5 ปี และเจาะเลือดประเมินผล8 1.3 ในยุงพาหะ โดยเฉพาะแหล่งเพาะพันธุ์ของยุงร าคาญนั้น สามารถพบได้ทั่วไปในชุมชนที่มี ประชากรอาศัยหนาแน่น ตามแหล่งน้ าสกปรกในชุมชน การปรับสภาพแวดล้อมรอบบ้าน ด้วยการรักษาความ สะอาด เก็บขยะ ไม่ให้มีน้ าสกปรก แหล่งน้ าขัง ท าลายแหล่งเพาะพันธุ์ยุง จะลดจ านวนยุงลงได้รวมไปถึงการ ส่งเสริม สนับสนุนให้มีการใช้ยาทากันยุง การใช้มุ้งเพื่อป้องกันยุงกัด เพื่อลดการสัมผัสระหว่างคนและยุง และ ท าลายแหล่งเพาะพันธ์ยุงโดยวิธีการพ่นสารเคมี9 1.4 ในกรณีสัตว์รังโรค (แมว) ด าเนินการฉีดยา Ivermectin1% ปี ละ 1 ครั้ง 2. การรักษาผู้ป่วยเฉพาะราย (Selective Drug Administration: SDA)9 - ในกรณีติดเชื้อ W. bancrofti จ่ายยา DEC (Diethylcarbamazine) ครั้งเดียว 6 มก/กก. ทุก 6 เดือน จนครบ 2 ปี - ในกรณีติดเชื้อ B. malayi ให้ยา DEC 6 มก./กก. 6 วัน ทุก 6 เดือน จนครบ 2 ปี 3. การให้การดูแลผู้ปรากฏอาการ9 - ภาวะขาโต เน้นรักษาความสะอาด ดูแลไม่ให้เกิดบาดแผล/ติดเชื้อ ซ้ าซ้อน บริหารขา ผ่าตัดในกรณีที่มี ผลกระทบกับการด ารงชีวิต หรือ ขึ้นกับดุลยพินิจของแพทย์ - ภาวะอัณฑะโต รักษาด้วยการผ่าตัด 4. การเฝ้าระวังป้องกันควบคุมโรคเท้าช้างในคนต่างด้าว10 โรคเท้าช้างเป็นโรคติดต่อที่เกิดจากพยาธิตัวกลม ในประเทศไทยพบว่าชนิดที่ก่อโรคในคนมี 2 ชนิด คือ B. malayi ที่พบในภาคใต้และ W. bancrofti ที่พบในคนไทยทางภาคเหนือและภาคตะวันตกบริเวณ ชายแดนไทยพม่า และในคนพม่าที่กระจายอยู่ทั่วประเทศไทย โดยมีความแตกต่างระหว่างการแพร่เชื้อพยาธิ ชนิดนี้คือชนิดยุง พาหะ ยุงลายป่าเป็นพาหะส าหรับพยาธิชนิดนี้ในประเทศไทย ในขณะที่ยุงร าคาญเป็นยุง พาหะหลักของพยาธิชนิด นี้ในประเทศพม่า แต่มีการศึกษาหลายการศึกษาที่บ่งชี้ว่ายุงร าคาญในประเทศไทย สามารถน าโรคเท้าช้างที่พบใน คนพม่าได้ในสภาวะห้องทดลอง หลังจากรัฐบาลมีนโยบายให้คนต่างด้าวใน 3 ประเทศ คือ พม่า ลาว กัมพูชา เข้ามาท างานในประเทศ ไทย ผลการส ารวจโรคเท้าช้างในคนต่างด้าวกลุ่มนี้พบว่ามีเพียงคนต่างด้าวจากประเทศพม่าเท่านั้นที่ ตรวจพบโรค เท้าช้าง จึงได้มีการควบคุมโรคเท้าช้างในกลุ่มคนต่างด้าวชาวพม่ามาโดยตลอด ทั้งการจ่ายยากลุ่ม และเจาะเลือด ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข เรื่อง การตรวจสุขภาพและประกันสุขภาพในแรงงานต่าง ด้าว การจ่ายยากลุ่ม ในเป้าหมายที่ไม่ได้เข้าระบบประกันสุขภาพ และการเฝ้าระวังในคน ยุงพาหะในพื้นที่มีคน ต่างด้าวชาวพม่าอาศัย อยู่เป็นจ านวนมาก ในปี พ.ศ. 2545 ประเทศไทยได้เริ่มการก าจัดโรคเท้าช้าง พร้อมประเทศแพร่โรคเท้าช้างใน ภูมิภาคนี้ ซึ่งรวมถึงประเทศพม่า กัมพูชา ลาว การด าเนินมาตรการในคนต่างด้าวยังคงด าเนินควบคู่ไปกับการก าจัด
12 และ เมื่อประเทศไทยได้รับการประกาศการก าจัด เมื่อกันยายน 2560 ที่ผ่านมา ในขณะที่ประเทศพม่ายังคงไม่ สามารถตัดการแพร่โรค ต่างจากลาว และกัมพูชา จึงยังคงมีความจ าเป็นที่จะต้องด าเนินการเฝ้าระวังโรค เท้าช้าง ในกลุ่มคนต่างด้าวชาวพม่าต่อ ส่วนคนต่างด้าวจากประเทศแพร่โรคเท้าช้างในกลุ่มประชาคมเศรษฐกิจ เอเซียน เช่น อินโดนีเซีย และฟิลิปปินส์ยังคงมีจ านวนไม่มากนัก 4.1 มาตรการเฝ้าระวังโรคเท้าช้างในคนต่างด้าว 1) ตรวจและประกันสุขภาพ ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข 2) จ่ายยากลุ่มคนต่างด้าวที่ไม่ได้ตรวจและประกันสุขภาพ 3) เฝ้าระวังโรคในจังหวัดที่มีคนต่างด้าวชาวพม่าจ านวนมาก 4) การป้องกันและควบคุมยุง 5) การตรวจและประกันสุขภาพตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข เป็นไปตามประกาศ กระทรวงสาธารณสุข เรื่องการตรวจสุขภาพและประกันสุขภาพคนต่างด้าว ที่แรงงาน ต่างด้าวทุกรายในประเทศ ต้องไปรับการตรวจสุขภาพ และท าประกันสุขภาพ ซึ่งมีขั้นตอนในการตรวจ ผ่าน ระบบการจัดบริการสุขภาพ แรงงานและการจดทะเบียนแรงงานต่างด้าวแบบเบ็ดเสร็จครบวงจร (One Stop Service) ในสถานบริการ สาธารณสุข ที่กระทรวงสาธารณสุขก าหนด ที่เกี่ยวข้องกับโรคเท้าช้าง ดังนี้ 5.1 การตรวจร่างกาย ว่ามีลักษณะต้องห้ามของคนต่างด้าวซึ่งจะขอรับใบอนุญาตท างานหรือไม่ โรคเท้าช้างในระยะปรากฏอาการเป็นที่รังเกียจแก่สังคม เป็นโรคต้องห้ามมิให้ท างานในประเทศไทย ตาม กฎกระทรวงแรงงาน ในการก าหนดลักษณะต้องห้ามของคนต่างด้าวซึ่งจะขอใบอนุญาตท างาน พ.ศ. 2552 การ จ่ายยา Diethylcarbamazine citrate (DEC) และ Albendazole (ALB เป็นการจ่ายยาเพื่อ ควบคุมโรคพยาธิ ล าไส้ซึ่งส่งผลถึงโรคเท้าช้างด้วย) ซึ่งต้องด าเนินการหลังจากซักประวัติการตั้งครรภ์ หรือให้นมบุตร เนื่องจากยา DEC มีข้อห้ามในการจ่ายยาส าหรับหญิงตั้งครรภ์หรือให้นมบุตร และหลังจากการทดสอบหาสารแอมเฟตามีน เนื่องจาก DEC ก่อให้เกิดผลบวกปลอมต่อสารแอมเฟตามีนได้ เจาะเลือดหาพยาธิโรคเท้าช้าง หลังจากกินยา DEC ประมาณ 30 นาทีเพื่อกระตุ้นให้พยาธิโรคเท้าช้าง ปรากฏตัวในเวลากลางวัน จากปกติที่จะปรากฏตัวให้ตรวจ ได้ผลดีในเวลากลางคืน ใช้การตรวจด้วยการ ท าฟิล์มเลือดหนา ย้อมสียิมซ่า ตรวจหาพยาธิด้วยกล้องจุลทรรศน์ วิธี นี้แนะน าให้มีการด าเนินงานเพื่อทราบสถานการณ์โรค จากการที่ในระบบการตรวจสุขภาพได้มีการเจาะเลือดตรวจ โรคอื่นอยู่แล้ว วิธีการ กระตุ้นด้วยยาก่อนเจาะเลือด11 มิได้เป็นวิธีมาตรฐานในการตรวจหาพยาธิโรคเท้าช้าง แต่ถูก จ ากัดด้วยการ ตรวจสุขภาพนั้นด าเนินงานในเวลากลางวัน วิธีนี้สามารถตรวจหาพยาธิโรคเท้าช้างลดลงกว่าการ เจาะ เลือดในเวลากลางคืน ประมาณร้อยละ 50-70 ในการเจาะเลือดเพื่อหา microfilaria แม้ว่าการท าฟิล์มเลือด หนาจะเป็นวิธีที่ถูกก าหนดให้เป็นวิธี มาตรฐานในการตรวจหาmicrofilaria ก็ตาม แต่หน่วยงานบริการสาธารณสุข ที่ให้บริการในการตรวจ และท าประกันสุขภาพต่างด้าว สามารถเลือกใช้วิธีอื่นๆเพื่อตรวจหาเชื้อไมโครฟิลาเรียที่มี มาตรฐานเทียบเท่าได้เช่น การตรวจเลือดสด (wet film) การตรวจวิธี capillary tube technique เป็นต้น
13 5.2 ติดตามให้การรักษาให้ครบถ้วนในรายที่ตรวจพบพยาธิโรคเท้าช้าง ด้วยการจ่ายยา DEC 6 mg/kg single dose ทุก 6 เดือน ติดต่อกันอย่างน้อย 2 ปี (5 ครั้ง) โดยที่ผลการตรวจเลือดก่อนการจ่ายยา 2 ครั้ง สุดท้ายตรวจไม่พบพยาธิฯ - ข้อห้ามในการรับประทานยา DEC คือ หญิงตั้งครรภ์หรืออยู่ระหว่างให้นมบุตร (6 เดือนแรก) เด็กอายุ น้อยกว่า 6 เดือน และผู้ที่มีสุขภาพไม่แข็งแรง มีโรคประจ าตัวที่การจ่ายยาต้องอยู่ในดุลยพินิจ ของแพทย์ อาการไม่พึงประสงค์จากยา DEC เป็นอาการที่ไม่รุนแรง ส่วนใหญ่มักพบอาการมึนศีรษะ คลื่นไส้ อาเจียน ไม่ควรรับประทานยาในขณะท้องว่าง หรือควรรับประทานยาในเวลาก่อนนอน ยา DEC ที่ใช้ในการจ่ายยา กลุ่ม และรักษาในรายที่ทราบว่ามีพยาธิโรคเท้าช้างนั้น จะถูกจัดหาโดยสถาน บริการสาธารณสุขที่เข้าร่วมในการ ตรวจ และท าประกันสุขภาพแรงงานต่างด้าว ตามประกาศของ กระทรวงสาธารณสุข 5.3 จ่ายยากลุ่มคนต่างด้าวที่ไม่ได้ตรวจและท าประกันสุขภาพ ด้วยการจ่ายยา DEC alone แก่ คนต่างด้าวชาวพม่าทุกราย ในกลุ่มที่ไม่ได้รับการตรวจและประกันสุขภาพ ด้วย DEC alone ทุก 6 เดือน ตลอดเวลาที่อยู่ในประเทศไทย โดยไม่ได้จ่าย Albendazole เพื่อป้องกัน อาการไม่พึงประสงค์ของยา Albendazole จากการให้ติดต่อกัน เนื่องจากในทางปฏิบัติแล้ว ไม่สามารถ ตรวจสอบว่าได้รับไปแล้วหรือยัง ได้รับ ไปเมื่อใด ส าหรับประชากรกลุ่มเป้าหมายนี้และไม่เน้นการเจาะ เลือดหาพยาธิโรคเท้าช้าง 5.4 การเฝ้าระวังโรคเท้าช้างในจังหวัดที่มีคนต่างด้าวชาวพม่าอาศัยอยู่เป็นจ านวนมาก แม้ว่ายุง ร าคาญในประเทศไทย ยังไม่สามารถน าพยาธิโรคเท้าช้างที่พบในคนพม่า แต่มีความเสี่ยงที่จะสามารถน าได้จึงได้มี การเฝ้าระวังยุงพาหะของโรคเท้าช้างของพม่าในประเทศไทย ควบคู่ไปกับการตรวจ แอนติเจนโรคเท้าช้างในคน พม่าและคนไทยที่อาศัยอยู่ด้วยกัน ในแหล่งที่มียุงร าคาญชุกชุม เพื่อเตือน ล่วงหน้าถึงการแพร่โรคเท้าช้างจากคน ต่างด้าวชาวพม่ามาสู่คนไทย โดยใช้เป้าหมายชุมชนที่มีคนต่างด้าวชาวพม่า และคนไทย อาศัยอยู่รวมกันในแหล่ง ยุงร าคาญหนาแน่น ใน 5 จังหวัดแรกที่มีคนต่างด้าวสูง 1-2 ชุมชนต่อจังหวัด ด าเนินกิจกรรมดังนี้ - เจาะเลือดเพื่อหาโรคเท้าช้างในกลุ่มคนพม่าและคนไทย ตรวจหาแอนติเจนโรคเท้าช้างด้วยการ ใช้ชุด ทดสอบชนิดตรวจเร็ว ที่สามารถตรวจได้ในเวลากลางวัน ทราบผลภายใน 10 นาทีชุดทดสอบดังกล่าวนี้ ไม่ได้ใช้ในการตรวจสุขภาพ เนื่องจากคงมีราคาสูงอยู่เมื่อเปรียบเทียบกับการท าฟิล์มเลือดหนา - เฝ้าระวังยุงพาหะสายพันธุ์ที่ก่อโรคเท้าช้างในคนพม่า ด้วยการจับยุงและผ่าตรวจหาพยาธิโรค เท้าช้าง การ พบพยาธิโรคเท้าช้างชนิด W. bancrofti ระยะที่ 3 ในยุง จะบ่งชี้ถึงความสามารถของยุงร าคาญใน ประเทศไทยว่า มีความสามารถน าโรคเท้าช้างจากคนพม่า ในสภาพธรรมชาตินอกห้องทดลอง - ชุดทดสอบแอนติเจนโรคเท้าช้างชนิดตรวจเร็ว ที่ใช้ในการเฝ้าระวังนี้กองโรคติดต่อน าโดยแมลง จะเป็นผู้ จัดหา และสนับสนุนแก่ส านักงานป้องกันควบคุมโรค ซึ่งเป็นหน่วยงานที่ด าเนินการเฝ้าระวัง
14 บทที่ 2 การตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียทางห้องปฏิบัติการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ การตรวจค้นหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรีย ในกระแสเลือดเป็นวิธีที่นิยมกันอย่างแพร่หลายในหลายประเทศ เพราะสะดวกและประหยัดค่าใช้จ่ายเหมาะต่อการปฏิบัติงานภาคสนามในระดับสถานีอนามัยที่มีเครื่องมือ วิทยาศาสตร์ เช่น กล้องจุลทรรศน์ เครื่องปั่นเม็ดเลือดเลือดแดงอัดแน่นสามารถท าการตรวจพยาธิไมโคร ฟิลาเรียด้วยวิธีดังนี้ 1. วิธีท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่า 2. วิธีตรวจเลือดสด (Wet film) 3. วิธีตรวจด้วย Capillary tube technique 4. วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Knott’s technique 5. วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Membrane filtration technique 1. การท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่า การท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่า เป็นการตรวจค้นหาเชื้อพยาธิmicrofilaria ในกระแสเลือดเป็นวิธีที่นิยมกันอย่างแพร่หลายในหลายประเทศ เพราะสะดวกและประหยัดค่าใช้จ่ายเหมาะ
15 ต่อการปฏิบัติงานภาคสนามในระดับสถานีอนามัยที่มีเครื่องมือวิทยาศาสตร์ เช่น กล้องจุลทรรศน์ วิธีนี้เหมาะ อย่างยิ่งกับการปฏิบัติงานในพื้นที่ และเป็นวิธีมาตรฐาน (gold standard) ที่ด าเนินการอยู่ในปัจจุบัน มี ขั้นตอนการตรวจดังนี้ 1.1 เขียนรายละเอียดผู้ป่วยบริเวณริมฝ้าสไลด์ ได้แก่ ชื่อ-สกุล ผู้ป่วย หรือ code ผู้ป่วย วันที่ และเวลาเจาะ เลือด ดังรูปที่ 6 รูปที่ 6 วิธีการเตรียมสไลด์ และวิธีการเจาะเลือดปลายนิ้ว 1.2 ให้สไลด์วางอยู่ในแนวราบ หยดเลือดลงบนกระจกสไลด์ ปริมาตร 60 ลบ.มล. (ประมาณ 2-3 หยด) ดังรูป ที่ 7 รูปที่ 7 วิธีการหยดเลือดลงบนสไลด์ 1.3 ใช้มุมสไลด์อีกแผ่นเกลี่ยเลือดเป็นฟิล์มหนารูปวงรีขนาด 2.5 x 3 ซม. ดังรูปที่ 8
16 รูปที่ 8 วิธีการเกลี่ยหยดเลือดบนสไลด์ให้ได้ขนาด 2.5 x 3 ซม. 1.4 เมื่อฟิล์มเลือดแห้งสนิท ย้อมสียิมซ่า ความเข้มข้น 10 % 1.5 เตรียมสียิมซ่าเข้มข้น 10 % (ใช้สี 1 ส่วนผสมบัฟเฟอร์ pH 7.2 9 ส่วน) ดังรูปที่ 9 รูปที่ 9 วิธีการเตรียมสียิมซ่าเข้มข้น 10 % 1.6 น าฟิล์มเลือดที่แห้งแล้วมาวางบนแท่นย้อมในแนวระนาบ ย้อมฟิล์มเลือดด้วยสียิมซ่าเข้มข้น 10 % โดย หยอดสีให้ท่วมฟิล์มเลือด ย้อมนาน 10 นาที ดังรูป รูปที่ 10 รูปที่ 10 วิธีการย้อมสียิมซ่าเข้มข้น 10 % ย้อมนาน 10 นาที
17 1.7 เมื่อครบ 10 นาที ใช้น้ าสะอาด ค่อยๆ เทล้างจากบริเวณปลายสไลด์ เพื่อล้างไล่สียิมซ่าจนกระทั่งน าไล่สีไป จนหมด (จนน้ าที่ล้างใสไม่มีสียิมซ่าละลายออกมา) เพื่อป้องกันการเกิดตะกอนบนฟิล์ม แล้วผึงไว้ให้ฟิล์มแห้ง สนิท ดังรูปที่ 11 รูปที่ 11 วิธีการล้างฟิล์มเลือดในแนวระนาบ 1.8 ท าความสะอาด-ปรับแสงของกล้องจุลทรรศน์ให้อยู่ในสภาพใช้งาน 1.9 วางสไลด์ฟิล์มเลือดที่จะตรวจสอบลงบนแท่นวางสไลด์ ระวังอย่าให้สไลด์กลับด้าน 1.10 ปรับหัว Objective ก าลังขยาย 4 เท่า หรือ 10 เท่า แล้วเลื่อนฟิล์มเลือดตรวจหาพยาธิฯ โดยเริ่มจากมุม บนซ้ายสุดลงมาด้านล่าง ดังรูปที่ 12 แล้วเลื่อนฟิล์มดูดังรูปจนทั่วแผนฟิล์ม หรือจะใช้วิธีดังรูปที่ 13 และ 14 ก็ ได้ แต่จะต้องดูพยาธิให้ทั่วฟิล์มเลือด จากนั้นจึงนับจ านวนพยาธิที่มีอยู่ทั้งหมดแล้วบันทึกลงในใบรายงานผล การตรวจฟิล์มเลือด โดยพบว่าพยาธิไมโครฟิลาเรีย ที่พบในประเทศไทยโดยการย้อมสียิมซ่า จะมีลักษณะตาม ตารางที่ 1 รูปที่ 12 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวตั้ง รูปที่ 13 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวนอน
18 รูปที่ 14 วิธีการตรวจหาเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียแนวตั้งและแนวนอน ตารางที่ 1 การวินิจฉัยพยาธิไมโครฟิลาเรีย ที่พบในประเทศไทยโดยการย้อมสียิมซ่า รายละเอียด Brugia malayi Wucherreria bancrofti 1.ความยาว (Length) 177-230 ไมครอน 210-359 ไมครอน (ในผู้ป่วยกะเหรี่ยง) 210-320 ไมครอน (ในผู้ป่วยพม่า) 2.ช่องว่างตอนหัว (Cephalic space) ความยาวเป็นสองเท่าของความ กว้าง 2:1 ความยาวเท่ากับความกว้าง 1:1 3.นิวเคลียส (Nucleus) ติดสีม่วงและซ้อนทับกันไม่เป็น ระเบียบ ติดสีน้ าเงินและแยกกันอยู่อย่างมีระเบียบ 4.ลักษณะล าตัว (Figure) มักจะปิดงอและพับไปมา (Secondary kinds) จะโค้งงอมีระเบียบ (Smooth curve) 5.รูขับถ่ายของเสีย (Anal pore) โดยทั่วไปจะมองเห็นชัดเจนเป็น รอยเว้า เห็นในนิวเคลียสคอลัมน์ มองไม่ค่อยเห็น 6.หาง (Tail) มีนิวเคลียสถึงปลายหางและแยก ออกมาจากตอนปลาย 1-2 เม็ด เรียก Terminal nuclei นิวเคลียสไม่ถึงปลายหางมีช่องว่างเรียกว่า Caudal space 7.ปลอกหุ้มล าตัว (Sheath) ติดสีชมพูอมแดง (Pink or Purpish) ไม่ติดสี (Colorless) แต่บางครั้งอาจติดสี ชมพูบางๆเนื่องจาก PH ของสีย้อมเปลี่ยนไป จาก pH 7.2 หรือใช้สีมาก/ย้อมนานเกินไป ที่มา : ศิริชัย พรรณธนะ. โรคเท้าช้าง. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรคติดต่อ. โรงพิมพ์องค์การสงเคราะห์ทหาร ผ่านศึก. ม.ป.ป. หน้า 22 ส่วนประกอบต่างๆของพยาธิไมโครฟิลาเรียเมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์12
19 1.Sheath เป็นเนื้อเยื่อชนิด Hyaline ใสไม่มีสี ความยาวประมาณ 390 ไมครอน หัวท้ายปิด แต่ไมโครฟิลาเรียสามารถขยับเขยื้อนตัวไปมาได้ นอกจากนี้ยังท า หน้าที่เสมือนเปลือกไข่ การตรวจพบหรือไม่พบ Sheath เคยใช้ในการแยกข้อ แตกต่างระหว่างชนิด Periodic หรือ Subperiodic ของพยาธิ B. malayi ส่วน Sheath ของพยาธิ W. bancrofti จะย้อมไม่ติดสีแต่ของพยาธิ B. malayi ย้อม ติดสีชมพูอมม่วง (Pink หรือ Purplish) 2.Cuticle เป็นเนื้อเยื่อขวางล าตัวบางๆพบได้ตลอดล าตัวของพยาธิ 3.Cephalic space เป็นช่องว่างส่วนหัวของพยาธิ บริเวณนี้จะไม่มีนิวเคลียสอยุ่ อาจมองเห็น Stylet มีลักษณะเป็น “ขอ” ซึ่งตัวอ่อนจะใช้เป็นเครื่องช่วยท าให้หลุดออกมา จากปลอกหุ้มล าตัว (Sheath) ในพยาธิชนิด B.malayi อัตราส่วนความกว้าง: ยาว เท่ากับ 1:2 ส่วน W.bancrofti มีอัตราส่วนความกว้าง:ยาว เท่ากับ 1:1 4.Nuclear column เป็นกลุ่มนิวเคลียสเรียงตัวตั้งแต่บริเวณ Cephalic space จนถึงหางในพยาธิ ชนิด B.malayi เมื่อย้อมสียิมซ่าจะเห็นนิวเคลียสซ้อนทับกันเป็นสีน้ าเงินเข้ม ส่วน W.bancrofti นิวเคลียสจะแยกออกจากกันเป็นเม็ดเดี่ยวมองเห็นชัดเจน 5.Nerve ring เป็นส่วนของกล้ามเนื้อประสาทที่พาดขวางล าตัวซึ่งจะอยู่ห่างจากตอนหัวสุด ของพยาธิประมาณ 20% ของความยาวล าตัว เมื่อย้อมสียิมซ่าจะมองเห็นเป็น ช่องว่างสีขาวสังเกตได้ชัดเจน 6.Excretory pore เป็นรูขนาดเล็กอยู่ถัดจาก Nerve ring ลงมาเล็กน้อยประมาณ 30 % ของ ความยาวเมื่อย้อมสีจะพบว่าบริเวณนี้จะเว้าแหว่งคล้ายอักษร “v” ตะแคงอยู่ จึงเรียก V shaped มองเห็นได้ชัดเจนอาจเรียกได้อีกว่า anterior v-spot 7. Excretory cell เป็นเซลล์ขนาดใหญ่ที่มีนิวเคลียส ท าหน้าที่สร้างสรรค์เมือกแล้วปล่อยออกทาง Excretory pore (บริเวณนี้อาจเรียกรวมๆว่า Excretory vesicle) 8.Genital cells เป็นเซลล์ขนาดใหญ่มีทั้งหมด 4 เซลล์ โดย G1 จะอยู่เหนือ G2 G3 G4 ซึ่งเซลล์ 3 เซลล์หลังนี้จะอยู่ชิดกันใกล้รูขับถ่าย (anal pore) 9.Anal pore มองเห็นได้ชัดเจนในพยาธิชนิด B. malayi มีรูปร่างเว้าคล้ายอักษร “v” (Anal vesicle) เช่นกัน จึงอาจเรียกว่า posterior v-spot ต าแหน่งนี้อยู่ห่างจากส่วนหัว ของพยาธิประมาณ 80 % ของความยาวล าตัวในพยาธิชนิด W .bancrofti จะ มองเห็นต าแหน่งนี้ไม่ชัดเจน 10.Innenkorper เป็นอวัยวะภายในล าตัวเมื่อย้อมสี Azur II eosin หรือ Leishmans stain (innerboby) จะติดสีแดงเป็นแถบยาว 1/70 ส่วนความยาวล าตัวมองเห็นได้ชัดเจนใน
20 พยาธิชนิด Brugia spp. อวัยวะนี้คือท่อทางเดินอาหารเบื้องต้น (rudimentary alimentary canal) อาจเรียกว่า Innerboby ซึ่งเป็นที่รวมของเซลล์สิบพันธุ์ เบื้องต้น จ านวน 4 เซลล์ ส่วนในพยาธิ W. bancrofti จะมองเห็นบริเวณนี้ไม่ ชัดเจนและจะไม่พบในพยาธิชนิด Loa loa 11.Caudal space ช่องว่างบริเวณปลายหาง พบในพยาธิชนิด W. bancrofti มีลักษณะเรียวแหลม (tapering) ส่วน B. malayi จะพบมีนิวเคลียสที่ปลายหางแยกออกไปจากกลุ่ม 1-2 เม็ด รูปที่ 15 รูปร่างลักษณะของพยาธิไมโครฟิลาเรียเมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์
21 ที่มา : ศิริชัย พรรณธนะ. โรคเท้าช้าง. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรค. ม.ป.ป.. โรงพิมพ์ องค์การสงเคราะห์ ทหารผ่านศึก : หน้า 27.
22 รูปที่ 16 รูปร่างลักษณะของพยาธิไมโครฟิลาเรียเมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ รูปที่ 17 เชื้อ Brugia malayi ที่ย้อมด้วยสียิมซ่า
23 ที่มา : https://www.wikidoc.org/index.php/File:Brugia_malayi.jpg รูปที่ 18 เชื้อ Wucherreria bancrofti ที่ย้อมด้วยสียิมซ่า ที่ม: https://www.researchgate.net/figure/ไมโครฟิลาเรีย-of-Wuchereria-bancrofti-with-sheath-in-theperipheral-blood-of-human-Giemsa_fig2_274893413 ข้อควรค านึงในการท าฟิล์มเลือดหนา 1. ใช้สไลด์ที่สะอาด 2. ใส่รายละเอียดบนแผ่นสไลด์ให้ครบถ้วน เช่น รายชื่อผู้ป่วย หรือ Code วัน เวลาเจาะเลือด 3. อย่าใช้กระดาษซับ ซับแผ่นสไลด์ที่ย้อมแล้ว ตารางที่ 2 ปัญหาเกี่ยวกับฟิล์มเลือดและการแก้ไข การตรวจหาเชื้อพยาธิจากการท าฟิล์มเลือดหนา หากมีข้อผิดพลาดเกิดขึ้นในบางขั้นตอน จะท าให้ผลที่ได้ คลาดเคลื่อนจากความเป็นจริง สิ่งที่ท าให้เกิดการผิดพลาดนั้นมีสาเหตุหลาย ประการ ดังนี้ รายละเอียด สาเหตุ วิธีการแก้ไข 1.ฟิล์มเลือดหลุด จากสไลด์ ฟิล์มเลือดยังแห้งไม่สนิท หรือฟิล์มเลือดหนา เกินไป - ท าความสะอาดแผ่นฟิล์มเลือดด้วย 70 % Alcohol แล้วเช็ดให้แห้ง - ใช้เลือดปริมาณ 60 ลบ. มล. - ห้ามใช้ความร้อนในการท าให้ฟิล์มเลือด แห้ง มีการใช้ลมร้อนในการท าให้ฟิล์มเลือดแห้งอย่าง รวดเร็ว มักท าให้ฟิล์มเลือดหลุดร่อน สไลด์มีคราบไขมัน
24 รายละเอียด สาเหตุ วิธีการแก้ไข 2.ฟิล์มเลือดมี ตะกอนมาก ฝุ่นละอองติดลงบนแผ่นฟิล์มขณะที่เลือดยังไม่ แห้ง ป้องกันฝุ่นละอองไม่ให้ติดลงในฟิล์มเลือด ตะกอนสี ไม่เขย่าขวดสี stock giemsa ก่อนผสม 3. ฟิล์มเลือดมีสีด า มืดจนเกินไป ปล่อยฟิล์มเลือดไว้นานวันก่อนน ามาย้อมหรือ ฟิล์มเลือดถูกความร้อนจนแห้งเกินไป และย้อม สีนานเกินไป ย้อมฟิล์มเลือดภายในเวลา 2-5 วัน หลังจากฟิล์มเลือดแห้งแล้ว ฟิล์มเลือดหนาเกินไป ใช้เลือดปริมาณ 60 ลบ. มล. เจาะเลือดปลายนิ้วขณะ alcohol ยังไม่แห้ง ท าความสะอาดนิ้วมือแล้วปล่อยให้นิ้วมือ แห้งก่อนเจาะเลือด 4. ฟิล์มเลือดมีสีน้ า เงินเข้มหรือแดง เกินไป สีที่ย้อมมีความเป็นด่าง (Alkaline) หรือกรด (Acid) มากเกินไป - ตรวจสอบ pH ของน้ า pH ของบัฟเฟอร์ - ตรวจสอบคุณภาพของสี 5. ตัวพยาธิไมโครฟิ ลาเรียและเม็ดเลือด ขาวมีสีจางเกินไป ใช้เวลาย้อมสั้นเกินไป เพิ่มเวลาย้อมสีให้เหมาะสม ประมาณ 10 นาที สียิมช่า เสื่อมคุณภาพหรือสารละลายมีความ เป็นกรดมากเกินไป - ตรวจสอบคุณภาพของสี - ตรวจสอบ pH ของบัฟเฟอร์ 6. สิ่งแปลกปลอมที่ พบเห็นในฟิล์มเลือด แผ่นสไลด์ เก่า มีรอยขีดข่วน หรือสกปรก มีเชื้อ แบคทีเรียปะปน ฝุ่น เกสรดอกไม้ น้ ากลั่น หรือ บัฟเฟอร์ที่เก็บไว้นาน ๆ จะมีเชื้อแบคทีเรีย และ เชื้อรา หรือโปรโตซัวเกิดปะปนได้ ให้ความระมัดระวังในทุกขั้นตอนในการ เตรียมย้อมฟิล์มเลือด อีกทั้งต้องค านึงถึง ความสะอาดของสไลด์และน้ ายาเป็น ส าคัญ การควบคุมคุณภาพการวิธีท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่า 1. เตรียมตัวอย่างฟิล์มเลือดที่พบเชื้อไมโครฟิลาเรียเพื่อใช้ตรวจสอบคุณภาพ 1.1 เจาะเลือดปลายนิ้วในเวลากลางคืน (20.00 น.) เป็นต้นไป หรือเวลาที่สอดคล้องกับการปรากฏตัวของ ไมโครฟิลาเรียในแต่ละพื้นที่ 1.2 เกลี่ยเป็นฟิล์มหนารูปวงรีขนาด 2.5 x 3 เซนติเมตร
25 2. เก็บสไลด์ลงในกล่องสไลด์ ติดฉลาก โดยระบุชนิดและระยะของเชื้อมาลาเรียที่พบ จ านวนสไลด์ วันที่ เตรียม และชื่อผู้เตรียมเมื่อต้องการน าสไลด์ออกมาใช้ ให้น าออกมาเฉพาะแผ่นที่ต้องการวางทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้องโดยใสในโถดูดความชื้น 3. ท าการย้อมสีฟิล์มเลือดเมื่อต้องการทดสอบ ด้วยการย้อมฟิล์มเลือดด้วยสียิมซ่า 2. การตรวจเลือดสด (Wet film) 2.1 หยดน้ าเกลือ (Normal Saline Solution 0.85 - 0.9 %) 1 หยด 2.2 หยดเลือดลงกลางกระจกสไลด์ 2.3 ผสมให้เข้ากันแล้วปิดด้วย cover slip 2.4 ตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยดูจนทั่วสไลด์ ใช้ Object 4x หรือ 10x หากพบเชื้อจะเห็นพยาธิฯ ว่ายเคลื่อนไหวไปมา รูปที่ 19 การตรวจเลือดสดโดยใช้น้ าเกลือ ที่มา : คู่มือการปฏิบัติงาน เรื่องโรคเท้าช้าง พ.ศ. 2531. กระทรวงสาธารณสุข : ชุมนุมสหกรณ์การเกษตรแห่ง ประเทศไทย จ ากัด. 2531. หน้า 16. 3. การตรวจวิธี Capillary tube technique 3.1 เจาะเลือดปลายนิ้วในเวลากลางคืน (20.00 -24.00 น.) หรือสอดคล้องกับการปรากฏตัวของเชื้อพยาธิ ไมโครฟิลาเรียในพื้นที่ 3.2 ใส่เลือดลงในหลอด Capillary ชนิดเคลือบสาร Heparin (ข้อจ ากัดไม่สามารถน าตัวอย่างเลือดใน หลอดมาท าฟิล์มเลือดหนาได้ ในกรณีที่พบเชื้อแล้วต้องการน ามาจ าแนกชนิดเชื้อ) ประมาณ 3/4 ของ หลอด หรือ 60 ลบ.มม.
26 3.3 อุดดินน้ ามันแล้วปั่นในเครื่องปั่นฮีมาโตคริต นาน 5 นาที ความเร็วตามที่เครื่องก าหนดโดยอัตโนมัติ เช่นที่ความเร็ว 11,300 รอบ/นาที เป็นต้น 3.4 น าหลอดที่ปั่นแล้ววางบนกระจกสไลด์ 3.5 ตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียตรงบริเวณ Buffy coat เป็นหลัก 3.6 ใช้ Objective 4x หรือ 10x ปรับแสงให้เหมาะสม 3.7 หากพบเชื้อพยาธิฯจะมองเห็นพยาธิตัวใสว่ายไปมาบริเวณดังกล่าว 3.8 ในรายที่ตรวจไม่พบให้เลื่อนสไลด์พร้อมหลอดเพื่อหาพยาธิฯ บริเวณเม็ดเลือดแดงใกล้ Buffy coat โดยใช้นิ้วมือกลิ้งหลอดให้ทั่ว รูปที่ 20 การเจาะเลือดปลายนิ้วใส่หลอด Capillary และวิธีการอุดดินน้ ามันที่ปลายด้านหนึ่งของหลอด Capillary ที่มา : https://www.glass-product.com/glassproducts/precision-capillary-glass-tube.html และ https://www.medicine.mcgill.ca/physio/vlab/bloodlab/hemat_n.htm 4. การตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Knott’s technique 4.1 ผสมเลือด 1 ลบ.ซม.กับน้ าเกลือ 0.89% 9 ลบ.มม. ในหลอดก้นแหลมขนาด 15 ลบ.มม. (อาจใช้ 2% ฟอร์มาลีน แทนน้ าเกลือได้) 4.2 ปั่นด้วยความเร็ว 1,500-5,000 รอบ/นาที นาน 5 นาที 4.3 เทส่วนใสทิ้ง 4.4 หยด 1% methylene blue 1 หยด เพื่อย้อมสีตะกอน 4.5 น าตะกอนมาหยดลงบนสไลด์ ปิดด้วย cover slip 4.6 ตรวจหาพยาธิฯในกล้องจุลทรรศน์โดยปรับแสงให้น้อยลง
27 รูปที่ 21 การตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้นแบบ Knott’s technique ที่มา : พาราสิตวิทยาและการวินิจฉัยโรคเท้าช้างทางห้องปฏิบัติการส าหรับหลักสูตรเจ้าหน้าที่ตรวจบ าบัดใน มาลาเรียคลินิก (จตบ.). ศิริชัย พรรณธนะ. งานชันสูตร. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรคติดต่อ. ม.ป.พ. ม.ป.ป. หน้า 19. 5. วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้น (Membrane filtration technique) วิธีนี้ต้องใช้แผ่น membrane กรองเลือด ซึ่งมีหลายยี่ห้อเช่น Nuclepore หรือ Millipore มี เส้นผ่าศูนย์กลางและจะต้องผสมสารโพลี่คาร์บอเนต membrane มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 25 มม. และมีรูพรุน ขนาด 5 ไมครอน พร้อมเครื่องกรองที่เข้าชุดกัน วิธีกรองเลือดท าได้ดังนี้ 1.1 ชุบแผ่น membrane ลงในน้ าสะอาดแล้ววางลงบนเครื่องกรองเลือด (swinex หรือ swinlok holder) โดยวางด้านมันวาวไว้ด้านบน วางปะเก็นปิดทับแล้วปิดฝาเครื่องกรอง ใช้ syringe สะอาด ขนาด 10 มล. ดูดเลือด 1 มล. ผสมน้ ากลั่น จ านวน 9 มล. ผสมเลือดให้เข้ากัน 1.2 เสียบ syringe เข้ากับเครื่องกรองแล้วฉีดเลือดผ่านลงไปช้าๆจนหมด 1.3 ฉีดน้ ากลั่นเพื่อล้างเลือดอีก 1-2 ครั้ง ครั้งละ 10 มล. 1.4 ฉีด methanol ผ่านลงไปประมาณ 4 มล. 1 ครั้ง เพื่อตรึงพยาธิ 1.5 ปิดฝาเครื่องกรองออกหยิบแผ่น membrane วางลงบนกระจกสไลด์ 1.6 ผสมสียิมซ่าความเข้มข้น 1 : 10 หยดสีลงบน membrane นาน 40-60 นาทีแล้วล้างน้ าให้สะอาด ระวังแผ่น membrane หลุดลอยน้ า 1.7 น าไปตรวจดูในกล้องจุลทรรศน์ใช้ก าลังขยาย 4x และ 100x โดยหยด immersion oil
28 รูปที่ 22 วิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรียโดยวิธีเข้มข้น (Membrane filtration technique) ที่มา : พาราสิตวิทยาและการวินิจฉัยโรคเท้าช้างทางห้องปฏิบัติการส าหรับหลักสูตรเจ้าหน้าที่ตรวจบ าบัดใน มาลาเรียคลินิก (จตบ.). ศิริชัย พรรณธนะ. งานชันสูตร. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรคติดต่อ. ม.ป.พ. ม.ป.ป. หน้า 18. ตารางที่ 3 ตารางเปรียบเทียบวิธีการตรวจหาพยาธิไมโครฟิลาเรีย วิธี ข้อดี ข้อเสีย 1. Thick blood film - แยกชนิดของพยาธิไมโครฟิลาเรียได้ - ราคาถูก - วิธีท าง่าย - ฟิล์มโลหิตเก็บไว้ได้นาน - มีความไวในการตรวจหาพยาธิฯต่ า - ใช้เวลาตรวจค่อนข้างนาน - ผู้ปฏิบัติงานต้องมีความช านาญ 2. Wet film - วิธีท าง่าย - ราคาถูก - ใช้สาธิตในชุมชนได้ดี - ไม่สามารถแยกชนิดของพยาธิฯได้ 3. Capillary Tube Technique - วิธีท าง่าย สะดวก รวดเร็วกว่า Thick blood film - ให้ความไวสูง เพราะเชื้อพยาธิฯ จะไปรวมอยู่ตรงรอยต่อ Buffy coat - ผู้ปฏิบัติงานต้องมีความช านาญ เนื่องจากบางครั้งพยาธิฯ มีน้อย และหลบเข้าไปอยู่ในบริเวณเม็ด เลือดแดง - อุปกรณ์ใช้ได้เพียงครั้งเดียว
29 วิธี ข้อดี ข้อเสีย - มองเห็นการเคลื่อนไหวได้ชัดเจน - เหมาะส าหรับการสาธิต - เหมาะส าหรับงานค้นหาผู้ป่วยใน เวลาสั้น หรือในที่ห่างไกล - เครื่องมือบางอย่างมีราคาสูง - พยาธิจะมีชีวิตอยู่ได้นานเพียง 1-3 วัน ซึ่งในวันหลังๆ จะไม่ว่องไว 4. Knott’s concentration technique - ให้ความไวสูงมาก - เหมาะสมส าหรับการตรวจสอบผู้มี เชื้อต่ าๆ หรือได้รับการรักษามาแล้ว - ใช้ประเมินผลในการรักษาได้เป็น อย่างดี - ตัวอย่างที่ตรวจพบเก็บไว้ไม่ได้นาน - ขั้นตอนยุ่งยากส าหรับเจ้าหน้าที่ สนาม - ต้องเจาะเลือดจากเส้นเลือดด า - ต้องใช้เครื่องมือราคาแพง - ใช้เวลาตรวจค่อนข้างนาน 5. Membrane filtration technique - ให้ความไวสูงมาก - ประโยชน์ เช่นเดียวกับวิธี Knott’s concentration technique - บอกชนิดของพยาธิได้ - เก็บตัวอย่างไว้ตรวจได้นาน - อุปกรณ์บางอย่างมีราคาแพงและ ใช้ได้เพียงครั้งเดียว - ใช้โลหิตปริมาณมากกว่า Thick blood film - ต้องเจาะเลือดจากเส้นเลือดด า อาจยุ่งยากส าหรับผู้ปฏิบัติ ภาคสนาม - ใช้เวลาตรวจค่อนข้างนาน ที่มา : ศิริชัย พรรณธนะ. โรคเท้าช้าง. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรคติดต่อ. โรงพิมพ์องค์การสงเคราะห์ทหาร ผ่านศึก. ม.ป.ป. หน้า 31-33.
30 บทที่ 3 การวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียด้วยชุดตรวจอย่างเร็ว โรคเท้าช้าง (Lymphatic filariasis) เป็นโรคติดต่อที่เป็นปัญหาทางสาธารณสุขมีประชากรประมาณ 120 ล้านคน ใน 73 ประเทศที่ป่วยด้วยโรคเท้าช้าง ส่วนประเทศไทยมีการระบาดของเชื้อ 2 ชนิด คือ Wuchereria bancrofti และ Brugia malayi ปัจจุบันคงเหลือเพียง 5 จังหวัดเท่านั้นที่ยังเป็นแหล่งแพร่ เชื้อโรค คือ จังหวัด แม่ฮ่องสอน ตาก กาญจนบุรี สุราษฎร์ธานี และนราธิวาส จาก สถานการณ์ดังกล่าวมีความเป็นไปได้ที่ประเทศ ไทยจะก าจัดโรคเท้าช้างให้หมดไป จนไม่เป็นปัญหาทางสาธารณสุขของประเทศไทยภายในปี พ.ศ. 2550 ซึ่ง สอดคล้องกับเป้าหมายขององค์การอนามัยโลกที่ก าจัดโรคเท้าช้างให้หมดไปจากโลกภายในปี 2020 (พ.ศ. 2563)13 การตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างนั้นจ าเป็นต้องอาศัยข้อมูลหลายส่วนประกอบกันจากประวัติ การตรวจ ร่างกาย และผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการซึ่งมีอยู่หลายวิธีการวินิจฉัยที่น่าเชื่อถือของโรคเท้าช้าง คือการตรวจ พบตัวพยาธิระยะไมโครฟิลาเรียในกระแสเลือดของผู้ป่วย ซึ่งต้องอาศัยผู้เชี่ยวชาญแยกชนิดของเชื้อพยาธิในการ วินิจฉัย และยังเป็นวิธีที่มีความไวต ่ามากเนื่องจากเวลาที่ไมโครฟิลาเรียปรากฎเป็นระยะในกระแสเลือด (periodicity) แตกต่างกันไปตามชนิดและสายพันธุ์ของพยาธิ โดยทั่วไปช่วงเวลาที่มีไมโครฟิลาเรียปรากฏตัวใน กระแสเลือดมากมักเป็นเวลากลางคืนเป็นบางช่วงเวลาเท่านั้น จึงเป็นอุปสรรคที่ส าคัญของทั้งเจ้าหน้าที่และผู้ป่วย ที่มารับการตรวจวินิจฉัยด้วยวิธีเจาะเลือดเพื่อตรวจหาไมโครฟิลาเรียจึงได้มีการพัฒนาการวินิจฉัยโรคให้มีความไว และความจ าเพาะสูง และสามารถตรวจได้ง่ายและสะดวกขึ้น เช่น การตรวจหาแอนติเจน การตรวจหาแอนติบอดี การพัฒนาวิธีการตรวจหาแอนติเจนที่จ าเพาะต่อพยาธิโรคเท้าช้าง ได้มีการน า monoclonal antibody ที่จ าเพาะต่อพยาธิโรคเท้าช้างมาใช้ ปัจจุบันมีmonoclonal antibody 2 ชนิด ที่ใช้กันแพร่หลายและผลิตเป็นชุด ตรวจวินิจฉัยซึ่งที่มีความไวและความจ าเพาะต่อการวินิจฉัยผู้ป่วยโรค เท้าช้างจาก W. bancrofti สูงคือ monoclonal antibody AD12.1 และ Og4C3 ซึ่ง Og4C3 นิยมน ามาตรวจด้วยวิธี ELISA การตรวจหาแอนติเจนที่จ าเพาะของโรคเท้าช้างโดย monoclonal antibody ชนิด AD12.1 ใช้วิธีที่อาศัย หลักการ Immunochromatographic test (ICT) วิธีนี้เหมาะสมในการตรวจ ภาคสนามเพราะท าได้ง่าย สะดวก รวดเร็ว รู้ผลการตรวจได้ภายในเวลาประมาณ 15 นาที และไม่ต้องอาศัยความช านาญหรือเครื่องมือเป็นพิเศษ อีก ทั้งมีความไวและความจ าเพาะสูง ส าหรับการตรวจหาแอนติเจนของพยาธิโรคเท้าช้าง B. malayi ในปัจจุบันได้มีการพัฒนาชุดตรวจหาเชื้อ โรคเท้าช้าง B. malayi ด้วยวิธี ELISA โดยใช้ monoclonal antibody ต่อ B. malayi ชื่อ 17E10 ซึ่งให้ความไว ในการตรวจวินิจฉัยถึง 93.3 % อย่างไรก็ตาม ยังคงพบปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับพยาธิหัวใจสุนัข (Dirofilaria
31 immitis) การตรวจหาแอนติเจนที่จ าเพาะของโรคเท้าช้างท าให้การตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างสะดวกขึ้น เนื่องจาก ไม่ต้องเจาะเลือดใน ช่วงเวลากลางคืน อีกทั้งสามารถบอกภาวะการติดเชื้อในปัจจุบันและยังสามารถใช้ติดตาม ผลการรักษาได้อีกด้วย เนื่องจากระดับของแอนติเจนจะลดลงภายหลังการรักษา อย่างไรก็ตาม ปัญหาที่ส าคัญ ของการตรวจหาแอนติเจนที่จ าเพาะของโรคเท้าช้างคือราคาที่ค่อนข้างสูงส าหรับประเทศกาลังพัฒนาที่เป็นแหล่ง ชุกชุมของโรค การพัฒนาการตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างโดยการตรวจแอนติบอดีนั้นมีรายงานพบการ เกิดปฏิกิริยา ข้าม (cross reactivity) ระหว่างพยาธิโรคเท้าช้างกับพยาธิชนิดอื่น เช่น พยาธิปากขอหรือ พยาธิไส้เดือน เป็นต้น เนื่องจากกลุ่มพยาธิเหล่านี้มีโครงสร้างของแอนติเจนหลักร่วมกันอยู่ท าให้เกิดผลบวกปลอมได้ และเป็นผลท าให้ การวินิจฉัยผิดพลาด นอกจากนี้ ปัจจุบันยังพบว่ามีการศึกษาพบว่าการตรวจหา antifilarial IgG4 antibodies จะเพิ่มความจ าเพาะในการตรวจวินิจฉัยได้ และสัมพันธ์กับการติดเชื้อ ซึ่งการตรวจหา antifilarial IgG4 antibodies จะต้องใช้โปรตีนสกัดเชื้อจากพยาธิโรคเท้าช้างโดยตรง โดยจะใช้พยาธิจ านวนมากเพื่อน ามาสกัด โปรตีนเพื่อใช้ในการวินิจฉัย14,15 แม้ว่าปัจจุบันได้มีการพัฒนาการตรวจวินิจฉัยที่มีความไวสูง อย่างไรก็ตามชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง ยังคงมีราคาสูงและต้องสั่งน าเข้าจากต่างประเทศ อีกทั้งยังไม่สามารถใช้ประเมินประสิทธิภาพผลการรักษาว่าโรค ได้หายขาด ท าให้การประเมินผลการควบคุมโรคในโครงการก าจัดโรคเท้าช้างเป็นไปได้ยาก จึงจ าเป็นต้องมีการ พัฒนาวิธีการตรวจวินิจฉัยที่มีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น ซึ่งนอกจากจะสามารถวินิจฉัยโรคได้อย่างถูกต้องแม่นย า และ ความไวสูงแล้ว ยังจ าเป็นต้องสามารถติดตามและประเมินการรักษาได้ด้วย อีกทั้งยังสามารถผลิตใช้ได้เอง ภายในประเทศในราคาที่ เหมาะสม เพื่อลดการน าเข้าของผลิตภัณฑ์ราคาแพงได้14 ตารางที่ 4 แสดงประสิทธิภาพของการตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างด้วยวิธีต่างๆ16,17 Test Sensitivity Specificity Issues Materials cost Thick film (20-60 ul) 70-80 % 100 % เจาะเลือดในเวลากลางคืน ใช้แรงงานมาก ประมาณ 10-15 บาท Membrane filtration technique 95-100 % 100 % เจาะเลือดในเวลากลางคืน ใช้แรงงานมากและใช้การ เจาะจากเส้นเลือดด า ประมาณ 50-100 บาท ICT 90-98 % 99-100 % ตรวจได้ตลอดวัน เจาะ ปลายนิ้ว อ่านผลง่าย ประมาณ 50-100 บาท
32 ชุดตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) ในปี 2012 รศ.ดร.สิริจิต วงศ์ก าชัย ภาคปรสิตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาลได้ร่วมมือกับ กรม ควบคุมโรค โดยกองโรคติดต่อน าแมลง พัฒนาวิธี Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) และวิธี immunochromagraphy เพื่อใช้ตรวจหา antifilarial IgG4 วินิจฉัยการติดเชื้อโรคเท้าช้างในรูปแบบชุดตรวจ ส าเร็จรูป ซึ่งวิธีนี้สามารถใช้เลือดที่เจาะจากปลายนิ้ว (finger prick blood) และเจาะเลือดเวลาใดก็ได้ ซึ่งถือว่า เป็นนวัตกรรมระดับโลกด้านชุดตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างแบบรวดเร็ว ที่สามารถวินิจฉัยการติดเชื้อเท้าช้างได้ทั้ง 3 ชนิดได้แก่ B. malayi , B. timori และ W. bancrofti โดยอาศัยหลักการตรวจหาแอนติบอดีชนิด antifilarial IgG4 ของพยาธิฟิลาเรียที่พบในผู้ป่วยโรคเท้าช้าง18 ซึ่งชุดตรวจนี้มีความไว 97 % และความจ าเพาะสูงถึง 99.6 % ใช้งานสะดวก โดยใช้ตัวอย่างเลือดเพียง 1 หยด จากการเจาะเลือดได้ทุกช่วงเวลา สามารถรู้ผลการตรวจภายใน 15 นาที รูปที่ 23 ชุดตรวจหาแอนติบอดีชนิด antifilarial IgG4 ของพยาธิฟิลาเรีย ที่มา: https://award.nia.or.th/en/award-winner/160ชุดตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้าง การเก็บรักษาชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) 1. ชุดตรวจเก็บที่ 25-40 องศาเซลเซียส จะช่วยให้เก็บรักษาได้นาน ห้ามเก็บโดยการแช่แข็ง ไม่ควรใช้ หลังจากวันหมดอายุที่ระบุ และควรระวังไม่ให้ชุดตรวจได้รับความร้อนจัด เป็นเวลานาน 2. ควรอ่านผลในที่มีแสงสว่างเพียงพอ ในกรณีที่เกิดแถบสีจางๆ จะท าให้อ่านผลได้ยาก 3. ปริมาณตัวอย่างที่ใช้: เลือด น้ าเหลือง หรือพลาสมา 1 หยด
33 1.ชุดตรวจ Test kit บรรจุในซอง 2. ขวดน้ ายา (Assay buffer) 3. ปิเปตต์พลาสติก รูปที่ 24 ส่วนประกอบของชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) ขั้นตอนการใช้งานชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) รูปที่ 25 การเก็บเลือดจากปลายนิ้ว *รอ reference ของชุดตรวจ ELISA 1. ควรแกะชุดตรวจเมื่อจะใช้งานเท่านั้น และเขียนข้อมูลตัวอย่างลงบนแถบชุดตรวจ และเจาะเลือดจาก ปลายนิ้ว ใช้ปิเปตต์พลาสติกดูดเลือด
34 รูปที่ 26 วิธีการหยดเลือดและ หยดบัฟเฟอร์ 2. หยดตัวอย่างเลือดลงในช่องสี่เหลี่ยม จับเวลา 30 วินาที และหยดบัฟเฟอร์ลงในช่องหยดตัวอย่าง จ านวน 1 หยด รอให้ตัวอย่างเคลื่อนที่จนถึงต าแหน่ง S รูปที่ 27 วิธีการดึงแผ่นกระดาษออกทิ้งและหยดบัฟเฟอร์ 3. ดึงแผ่นกระดาษออกทิ้งและหยดบัฟเฟอร์ลงในช่องวงกลม 3 หยด ให้หยดทีละหยด โดยให้หยดแรกซึมลง ไปก่อนแล้วหยดบัฟเฟอร์หยดต่อไป จับเวลา 15 นาที แล้วอ่านผล การแปลผลการทดสอบ ผลบวก มีเส้นสีชมพูที่ปรากฏ ที่ต าแหน่ง C และ T ผลลบ มีเส้นสีชมพูปรากฏเฉพาะต าแหน่ง C
35 แปลผลไม่ได้ ไม่มีเส้นสีชมพู ปรากฏที่ต าแหน่ง C รูปที่ 28 วิธีการอ่านผลและแปลผลชุดตรวจโรคเท้าช้าง (FilariaDIAGRAPID) ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง W. bancrofti ชุดตรวจที่ถูกน ามาใช้ในประเทศไทย เช่น Binax Now filariasis ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อใช้ในการตรวจหา แอนติเจนที่ขับมาจากพยาธิตัวแก่ชนิด W. bancrofti ในรูปแบบที่ง่ายต่อการปฏิบัติเพราะได้รับการพัฒนาให้ใช้ งานสะดวกยิ่งขึ้นโดย ชุดตรวจดังกล่าวมีลักษณะคล้ายสมุดเป็นกระดาษแข็งพับครึ่งได้ โดยที่ฝาด้านในด้านหนึ่งจะ มีแถบใยสังเคราะห์ (pad) มีสีชมพูขาวที่ผ่านการแช่ด้วย Polyclonal antibody ที่ถูกติดฉลากด้วยทอง (colloidal gold) ในขั้นแรกจะต้องท าการหยดเลือดจากนั้นเลือดจะซึมไปทั่วแผ่นชุดน้ ายาและถ้าในเลือดตัวอย่าง มี W. bancrofti antigen ก็จะท าปฏิกิริยากับแอนติบอดีที่ติดฉลากกับสี และเมื่อท าการปิดแผ่นพับชุดน้ ายาตรวจ ส่วนที่เป็นเม็ดเลือดยังคงอยู่ใน pad แต่ซีรั่มจะ น าพา pad ที่จับ W. bancrofti antigen สู่แผ่น membrane และ จะซึมเคลื่อนที่ ไปตาม membrane ไปถึงบริเวณแนวที่ได้ท าการตรึง Mab AD12 ไว้ สารประกอบ ระหว่าง W. bancrofti antigen กับ pad ที่ติดฉลากจะท าปฏิกิริยากับ Mab ให้ ผลบวกจะเกิดแถบสีชมพู 2 แถบ โดยถ้าปิด ฝาจะเห็นช่องเจาะสี่เหลี่ยมส าหรับอ่านผลการตรวจสอบที่สามารถมองเห็นแถบ membrane และจะพบสัญลักษณ์ “C” และ “T” ที่ด้านซ้าย โดย “C” นั้นหมายถึง Positive control เป็นตัวทดสอบว่า ชุดทดสอบยังใช้ได้โดยทุก ครั้งที่ทดสอบจะเกิดแถบสีแดงหรือชมพูที่ “C” และ “T หมายถึงผลการทดสอบ (Test) ถ้าให้ผลบวกจะเกิดแถบสี แดงชมพูที่บริเวณนี้ ในทางตรงกันข้ามถ้าให้ผลลบคือไม่มี W. bancrofti antigen จะเกิดแถบสีเฉพาะบริเวณ “C” เท่านั้น17 ตัวอย่างเลือดที่ใช้ในการตรวจ เลือดที่เจาะจากปลายนิ้วหรือการเจาะจากเส้นเลือดด าในภาชนะที่มีสารกันเลือดแข็งตัว ชนิด EDTA หรือ heparin ถ้าเก็บในที่อุณหภูมิ 4-8 องศาเซลเซียส สามารถเก็บไว้ได้ 3 วัน โดยผลการตรวจไม่แตกต่างกัน
36 การเก็บรักษาชุดตรวจ ต้องเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 2-30 องศาเซลเซียส ไม่ให้เปียกชื้นจะมีอายุการใช้งาน 1 ปี นับจากวันที่ผลิต (แต่ทางผู้ผลิตยืนยันว่าสามารถเก็บชุดตรวจที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ก็ให้ผลการตรวจไม่แตกต่างกัน) ข้อระวัง (Precautions and Warnings) 1. การที่จะให้เกิดผลลัพธ์ที่ดีจะต้องให้ฝากระดาษของชุดตรวจติดตรงตามแนวให้แน่นตามค าแนะน าการใช้ (เพิ่มรูปภาพรายละเอียดชุดตรวจ) 2. การปนเปื้อนทางสารเคมีชีวภาพจากภาชนะบรรจุหรือน้ ายาอาจน ามาสู่การให้ผลไม่ถูกต้อง พึง ระมัดระวังการปนเปื้อนระหว่างการท างาน 3. ควรตรวจสอบวันหมดอายุการใช้งาน ซึ่งจะมีการพิมพ์อยู่ที่ซองบรรจุชุดทดสอบทุกซอง ข้อจ ากัด (Limitations of Procedure) ชุดตรวจออกแบบมาใช้ตรวจหา W. bancrofti antigen ซึ่ง Ag ชนิดนี้จะไม่พบในผู้ป่วยโรคเท้าช้างที่มี สาเหตุมาจากหนอนพยาธิชนิดอื่นๆ ขั้นตอนการปฏิบัติ ชุดตรวจจะเกิดประสิทธิภาพในการตรวจวินิจฉัยสูงสุดในการตรวจวินิจฉัย ควรปฏิบัติตามขั้นตอน ดังต่อไปนี้ 1. น าชุดทดสอบออกจากซอง จากนั้นเปิดชุดทดสอบที่เป็นกระดาษแข็งพับครึ่งวางบนโต๊ะพื้นราบ รูปที่ 29 ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง W. bancrofti ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com)
37 2. เจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วหรือใช้เลือดในหลอดเลือดที่เก็บเลือดจากเส้นเลือดด าใช้ capillary tubeหรือ ดูดเลือดประมาณ 100 ไมโครลิตร ในเด็กอาจใช้วิธีการเจาะเก็บเลือดจากส้นเท้า รูปที่ 30 วิธีเจาะเก็บเลือดจากปลายนิ้วหรือใช้เลือดในหลอดเลือดที่เก็บเลือดจากเส้นเลือดด า ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com) 3. หยดเลือดจ านวน 100 ไมโครลิตรจาก capillary tube ลงในแถบใยสังเคราะห์สีขาวช้าๆให้ชุ่ม หากมี เลือดตกค้างอยู่ในหลอดอาจใช้การเคาะเบาๆลงบน pad รอจนแถบใยสังเคราะห์สีขาวเปียกชุ่ม รูปที่ 31 วิธีหยดเลือดจ านวน 100 ไมโครลิตรจาก capillary tube ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com) ข้อควรระวัง ห้ามหยดเลือดโดยตรงลงบนบริเวณแถบสีชมพู และห้ามติดฝากระดาษชุดตรวจก่อนที่ตัวอย่างจะ เคลื่อนที่กระจายไปยังส่วนบริเวณแถมสีชมพู (ซึ่งจะใช้เวลาประมาณ 30 วินาทีหลังจากหยดเลือดจนครบ)
38 4. ดึงแถบกระดาษกาวออก จะพบแถบกาวที่ฝาที่มีหมายเลข 1 ซึ่งใช้ ส าหรับยึดติดฝากระดาษชุดตรวจทั้ง 2 เข้าด้วยกัน ปิดฝาเข้าด้วยกันและเพื่อให้แน่ใจว่าปิดสนิทใช้นิ้วกดลากตามแนวที่มีกระดาษกาวที่อยู่ด้านขวาของ ช่วงที่เจาะส าหรับ อ่านผล เขียนชื่อ เพศ อายุ ที่อยู่ของผู้ที่ได้รับการตรวจทุกครั้ง รูปที่ 32 วิธีดึงแถบกระดาษกาวออก และเขียนรายละเอียดผู้ป่วย ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com) 5. อ่านผลการทดสอบ ภายใน 10 นาที หลังจากที่ปิดฝา (ไม่ควรอ่านผลเกิน 10 นาทีหลังจากที่ปิดฝา เนื่องจากอาจท าให้เกิดผลบวกปลอมได้ รูปที่ 33 วิธีอ่านผลการทดสอบ ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com)
39 การแปลผลการทดสอบ Positive = ขึ้นแถบสีแดง 2 แถบ Negative = ขึ้นแถบสีแดง 1 แถบ อ่านผลไม่ได้ = ไม่ขึ้นแถบสีหรือแถบ C ไม่ขึ้น ให้ท าการทดสอบซ้ าอีกครั้ง รูปที่ 34 วิธีแปลผลการทดสอบ ที่มา: Binax Now Filariasis Immunochromatographic Test (ICT) | PDF | Medicine | Medical Specialties (scribd.com) ข้อบ่งใช้เพิ่มเติม 1. การหยดเลือดจ านวน 100 ไมโครลิตร ควรหยดในแถบสีขาว ให้เลือดไหลขึ้นจากแถบสีขาวด้านล่างไปหา แถบสีชมพู ไม่ควรหยดเลือดบนแถบสีชมพู 2. หลังจากหยดเลือดและปิดฝาชุดตรวจเข้าหากันแล้วให้อ่านผลภายใน 15 นาที หากปรากฏแถบสียืนยัน คุณภาพในช่องอ่านผลระดับ “C” ขึ้นชัดเจนก่อนภายใน 10 นาที ให้รีบอ่านผลภายใน 10 นาที เพราะ ถ้าอ่านผลหลังจากนั้น ความถูกต้องจะลดลงมักเกิดผลบวกปลอม 3. การอ่านผลว่าเป็นผลบวกนั้น แถบสีที่ปรากฏขึ้นในระดับ “T” จะต้องชัดเจน ในกรณีที่แถบสีในช่องอ่าน ผลไม่ชัดเจนให้แปลผลทดสอบเป็นลบ
40 4. ควรเก็บรักษาชุดตรวจไว้ในที่แห้งไม่เปียกชื้น ที่อุณหภูมิ 2-3 องศาเซลเซียส (ตู้เย็นช่องแช่ธรรมดา) เพื่อ รักษาคุณสมบัติของชุดตรวจเมื่อไม่ใช้งาน ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi Brugia Rapid Test เป็นชุดตรวจในรูปแบบของแถบกระดาษทดสอบ (dipstick) ซึ่ง Rahmah Noordin และ คณะได้คิดและสังเคราะห์ B. malayi recombinant antigen BmR1 มาใช้ติดฉลากบนแผ่น dipstick เพื่อตรวจ แอนติบอดี (lgG4) ที่มีความจ าเพาะกับเชื้อชนิดโดยการทดสอบกับตัวอย่างน้ าเหลืองของที่ติดเชื้อ B. malayi รวมทั้งประเทศไทย ซึ่งให้ผลสอดคล้องกับการตรวจหาไมโครฟิลาเรียจากฟิล์มเลือด มีความไวในการตรวจร้อยละ 92-100% และความจ าเพาะร้อยละ 97-100%18,19 รูปที่ 35 ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi ที่มา : https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapidtest/brugia-rapid-test/#support ขั้นตอนการปฏิบัติ เพื่อให้เกิดประสิทธิภาพสูงสุดในการใช้ชุดตรวจ Brugia Rapid Test ควรปฏิบัติตามขั้นตอนดังต่อไปนี้
41 รูปที่ 36 ขั้นตอนการใช้ชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi ที่มา : https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapidtest/brugia-rapid-test/#support 1. น าแถบชุดตรวจออกจากซอง จากนั้นน าขวดบัฟเฟอร์มาวางที่อุณหภูมิห้อง เขย่าขวดบัฟเฟอร์ขวดขึ้นลงเบาๆ เพื่อให้ตะกอนหายไป รูปที่ 37 วิธีการเตรียมชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง B. malayi ที่มา: https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapid-test/brugiarapid-test/#support
42 2. เมื่อน าชุดตรวจออกจากซองเรียบร้อยแล้ว ให้เขียนรหัส-ชื่อ ผู้ที่ได้รับการตรวจทุกครั้ง รูปที่ 38 วิธีการเขียนรหัส-ชื่อ ผู้ป่วย ที่มา : https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapidtest/brugia-rapid-test/#support ส าหรับตัวอย่างซีรั่ม/พลาสมาให้หยดตัวอย่างจ านวน 30 µl ลงในช่องสี่เหลี่ยม (กรณีที่ซีรั่ม/พลาสมาน้อย ไม่ดูดซึมหลังจาก 2-3 นาที ให้เพิ่มบัฟเฟอร์หนึ่งหยดลงในช่องตัวอย่างหมายเลข1 (เพื่อช่วยไล่ตัวอย่างให้ เคลื่อนที่ได้ดีขึ้น) จากนั้นหยดบัฟเฟอร์ 3 หยด ลงในช่องใส่บัฟเฟอร์หมายเลข 2 แล้วดึงแผ่นพลาสติกใสขึ้น ลักษณะตามรูป แล้วอ่านผลภายใน 15 นาที รูปที่ 39 วิธีการตรวจและอ่านผลส าหรับตัวอย่างซีรั่ม/พลาสมา ที่มา: https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapid-test/brugiarapid-test/#support ส าหรับตัวอย่างเลือดครบส่วน (whole blood) ให้หยดตัวอย่างเลือดจ านวน 35 µl โดยแตะที่ปลายของ micropipette / microcapillary tube โดยให้เลือดไหลลงไปที่ช่องหมายเลข 1 แล้วหยดบัฟเฟอร์เพิ่ม 1หยด 2 1