43 เพื่อช่วยไล่ตัวอย่างให้เคลื่อนที่ได้ดีขึ้น) จากนั้นหยดบัฟเฟอร์ 3 หยด ลงไปในช่องใส่บัฟเฟอร์หมายเลข 2 จากนั้น ดึงแผ่นพลาสติกใสขึ้นลักษณะตามรูป แล้วอ่านผลภายใน 25 นาที รูปที่ 40 วิธีการตรวจและอ่านผลส าหรับตัวอย่างเลือดครบส่วน ที่มา: https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapid-test/brugiarapid-test/#support การแปลผลการทดสอบ Positive = ขึ้นแถบสีแดง 2 แถบ Negative = ขึ้นแถบสีแดง 1 แถบ อ่านผลไม่ได้ = ไม่ขึ้นแถบสีหรือแถบ C ไม่ขึ้น ให้ท าการทดสอบซ้ าอีกครั้ง
44 รูปที่ 41 วิธีแปลผลการทดสอบชุดตรวจหาเชื้อโรคเท้าช้าง ที่มา : https://reszonics.com/products/infectious-diseases-diagnosis/lateral-flow-rapidtest/brugia-rapid-test/#support การเก็บรักษาชุดตรวจ Brugia Rapid Test ชุดตรวจ Brugia Rapid Test ควรเก็บรักษาในที่แห้ง ไม่เปียกชื้น ที่อุณหภูมิ 4-30 องศาเซลเซียสและห้ามแช่แข็ง ข้อควรระวังและการควบคุมคุณภาพ 1. ควรเก็บชุดตรวจไว้ในที่แห้ง ไม่เปียกชื้น ที่อุณหภูมิ 4-30 องศาเซลเซียส 2. ตรวจสอบวันหมดอายุของชุดน้ ายาตรวจก่อนใช้งาน หากหมดอายุแล้วห้ามน ามาใช้งาน 3. ควรตรวจสอบว่าชุดน้ ายาผ่านการตรวจสอบคุณภาพมาแล้ว โดยขอดูใบรับรองผ่านการทดสอบ 4. ถ้าเก็บชุดตรวจไว้ในตู้เย็น ก่อนใช้ควรน ามาวางพักที่อุณหภูมิห้องก่อน ไม่น้อยกว่า 5 นาที 5. ตรวจสอบสภาพซองเก็บแถบชุดตรวจก่อนใช้งาน ซึ่งควรปิดสนิทไม่ช ารุดหรือฉีกขาดและไม่ควรฉีกซองแถบชุด ตรวจแล้วทิ้งไว้เป็นเวลานานๆเพราะความชื้นจะเข้าไปท าลายแอนติบอดีที่เคลือบอยู่บนแท่งชุดน้ ายา และจะไม่ สามารถน ามาใช้งานในการตรวจได้ 6. สวมถุงมือทุกครั้งก่อนท าการทดสอบ เพื่อป้องกันการปนเปื้อน 7.ชุดตรวจที่ถูกใช้ทดสอบแล้วห้ามน ากลับมาใช้ซ้ าเด็ดขาด 8.ส าหรับชุดตรวจ Brugia Rapid Test ควรตรวจสอบแผ่นพลาสติกใสที่อยู่ในแถบให้อยู่ในสภาพที่แนบสนิทกับ แถบทดสอบ ยังไม่ถูกดึงออก และหลังจากหยดสารทดสอบครบแล้วอย่าลืมดึงแผ่นพลาสติกใสออกก่อนอ่านผล ทุกครั้ง รูปตัวอย่างชุดตรวจเท้าช้างที่ใช้ในปัจจุบันในรูปแบบอื่นๆ
45 รูปที่ 42 ตัวอย่างชุดตรวจเท้าช้างอื่นๆ ที่มา: https://www.globalpointofcare.abbott/en/product-details/alere-filariasis-test-strip.html บทที่4 การตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างด้วยวิธีอื่นๆ เทคนิค Realtime PCR with High resolution melting analysis (real-time PCR-HRM) เทคนิค Realtime PCR with High resolution melting analysis (real-time PCR-HRM) เป็นเทคโนโลยี ส าหรับการวิเคราะห์ melting curve ของ PCR product ภายหลังสิ้นสุดการเพิ่มจ านวนดีเอ็นเอที่ต้องการศึกษา โดย real time PCR แล้ว ซึ่งต้องใช้HRM-dedicated software ในการตรวจวัดและการวิเคราะห์ ในขั้นตอน HRM analysis จะมีการเพิ่มอุณหภูมิจาก 50 องศาเซลเซียส ไปเรื่อยๆ จนถึง 95 องศาเซลเซียส และตรวจวัดสัญญาณสารเรืองแสงที่ถูกปล่อยออกมา เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้น DNA product จะค่อย ๆ แยกจาก DNA สายคู่ (DsDNA) เป็น DNA สายเดี่ยว (ssDNA) เมื่อ DNA สายคู่ถูกแยกออกเป็น DNA สายเดี่ยว สารฟลูออ เรสเซนซ์ (fluorescent dyes) ซึ่งแทรกตาม double stranded DNA จะหลุดออกมา ท าให้สารฟลูออเรสเซนซ์ ลดลง ระดับสัญญาณ fluorescence จึงลดลงตามอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น ผลของการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิใน ขั้นตอน Melting analysis จะแสดงอยู่ในรูปแบบของกราฟโดยแสดงความสัมพันธ์ระหว่างระดับของสัญญาณ fluorescence และอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไป
46 รูปที่ 43 แสดงปริมาณสัญญาณ fluorescence ของ DNA Melt Curve High Resolution Melting Analysis ตามปริมาณของอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไป (Mt = melting temperature) เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้นจนถึงต าแหน่งที่ DNA สายคู่ (dsDNA) จะถูกแยกเป็น DNA สายเดี่ยว (sDNA) ครึ่งหนึ่ง หรือ 50 % จะเรียกต าแหน่งอุณหภูมิดังกล่าวว่า melting temperature (Mt) ดังนั้นที่ Mt สาย DNA จะ ประกอบด้วย DNA สายคู่ 50% และ DNA สายเดี่ยว 50 % ดีเอ็นเอเป้าหมายแต่ละชนิดจะมี melting temperature เฉพาะตัว และจะแสดงเป็น peak เดียวซึ่งเรียกว่า Melting Peak ซึ่งที่ melting peak จะเห็นได้ว่า หากมีความแตกต่างของเบสใน DNA จะส่งผลต่อ melting temperature (Melting peak) เพราะปัจจัยจาก GC content ซึ่งจับกันด้วย hydrogen 3 bond, Amplicon length และ strand complementarity มีผลท าให้ melting temperature ของ DNA เป้าหมายต่างกัน โดย พยาธิฟิลาเรียแต่ละ species จะมี Melting temperature (Melting peak) ที่แตกต่างกัน ดังนั้น melting curve analysis จึงสามารถใช้ระบุ species ของดีเอ็นเอเป้าหมายที่ต้องการได้ โดยไม่ต้องใช้วิธี gel electrophoresis20 ดังตัวอย่างรูป
47 รูปที่ 44 แสดง meting peak ของ DNA เป้าหมายจากพยาธิฟิลาเรียชนิดต่างๆ เมื่อใช้primer คู่ เดียวกัน (Di=Dirofilaria immitis, Bm =Brugia malayi และ Bp = Brugia pahangi) ที่มา : Wongkamchai et al., 2013 บทที่ 5 ฟิลาเรียในยุง และการจ าแนกชนิดเชื้อ พยาธิฟิลาเรียที่พบในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มียุงเป็นพาหะน าโรคมีรายงานอยู่ 15 species จ าแนกเป็น Wuchereria 1 ชนิด , Brugia 3 ชนิด , Dirofilaria 6 ชนิด , Setaria 3 ชนิด และ Dipetalonema 2 ชนิด อีก ทั้งในธรรมชาติยังสามารถพบหนอนพยาธิฟิลาเรียในสัตว์ชนิดอื่นที่มีสายพันธุ์ต่างกัน เช่น นกบางชนิด (Aproctoides) กบ 4 สายพันธุ์ และกิ้งก่าบางชนิด เมื่อหนอนพยาธิฟิลาเรียตัวเต็มวัยให้ก าเนิดลูกพยาธิ (ไมโครฟิ ลาเรีย) ที่มีระบบอวัยวะต่าง ๆ ในร่างกายยังพัฒนาไม่เต็มที่ เช่น ระบบย่อยอาหาร ระบบขับถ่าย ระบบสืบพันธุ์
48 ท าให้ไมโครฟิลาเรียอาศัยอยู่ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือ host อื่นๆได้เพียงประมาณ 6 เดือนเท่านั้น จากนั้นก็จะ ตายไป แต่เมื่อมีแมลงบางชนิดมากินเลือดสัตว์ดังกล่าวที่มีไมโครฟิลาเรียอยู่ ไมโครฟิลาเรียก็จะสามารถอาศัยอยู่ใน ตัวแมลงตัวนั้นและวิวัฒนาการ (evolution) รูปร่างและหน้าที่ของอวัยวะต่างๆ ทีละเล็กทีละน้อยอย่างต่อเนื่อง จนสามารถอยู่ได้ในสภาวะแวดล้อมใหม่และขยายพันธุ์ต่อได้ ในกรณีของยุงช่วยเติมเต็มวงจรชีวิตหนอนพยาธิฟิลาเรียให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น โดยไมโครฟิลาเรียหรือลูกพยาธิ ของเชื้อจะเข้าสู่ยุง (intermediate host) จากการที่ยุงมากินเลือดสัตว์ที่มีไมโครฟิลเรียและเจริญเติบโต วิวัฒนาการจากไมโครฟิลาเรีย - ตัวอ่อนระยะที่ 1 (L1) - ตัวอ่อนระยะที่ 2 (L2) – และตัวอ่อนระยะที่ 3 (L3) ซึ่ง เป็นระยะติดต่อ ระบบอวัยวะต่างๆ จะพัฒนาตามล าดับ และพร้อมกลับเข้ามาอยู่ในโฮสต์จ าเพาะ (Definitive host) ที่เป็นที่อยู่อาศัยของฟิลาเรียตัวเต็มวัยและพร้อมที่จะผสมพันธุ์แบบอาศัยเพศต่อไป หนอนพยาธิฟิลาเรีย ตัว เต็มวัยสามารถมีชีวิตอยู่และกลับเข้ามาอยู่ในโฮสต์จ าเพาะ (Definitive host) ได้ประมาณ 5 - 7 ปีหรือมากกว่า นั้น รูปที่ 45 วงจรชีวิตพยาธิฟิลาเรีย Faust (1949) ได้บันทึกว่ามีความเป็นไปได้ที่มียุงถึง 73 species สามารถเป็นพาหะน าโรคนี้ ซึ่งเป็นข้อ สันนิฐานจากการตรวจพบพยาธิตัวอ่อนฟิลาเรียในยุงบริเวณป่าที่คนงานจ านวนมากเข้าไปบุกเบิก แต่ก็พบปัญหา เรื่องของการจ าแนกชนิด ในบางคราวพบตัวอ่อนพยาธิระยะที่ 1 หรือ 2 ยังไม่ใช่ระยะที่ 3 ซึ่งเป็นระยะติดต่อ จึงไม่ สามารถจ าแนกชนิดโดยใช้สันนิฐานวิทยา 1) ความยาวล าตัว จากตารางจะพบว่าความยาวเป็นหนึ่งในลักษณะที่น ามาใช้ในการจ าแนกชนิด โดย Dirofilaria มีความยาวเฉลี่ยน้อยกว่า 1,000 - 1,400 ไมโครเมตร ( L3 ของ D. immitis ที่พบใน
49 Cx. quiquafasciatus จะมีความยาวเฉลี่ยมากกว่าที่พบใน Ae. aegypti และน้ ายารักษาสภาพที่มีส่วนผสมของ Alcohol-glycerine มีผลท าตัวอ่อนพยาธิหดลงเล็กน้อย) 2) ต าแหน่งของทวารหนัก ใช้ในการหาสัดส่วนโดยใช้ระยะความกว้างของล าตัวตรงจุดรูทวารหนักหาร ด้วยความยาวของล าตัวจากจุดทวารหนักถึงปลายหาง Whaiton (1957) กล่าวว่าในกลุ่มของ Wuchererria มี ความยาวเฉลี่ยประมาณ 4 ส่วน และกลุ่มของ Dirofilaria มีความยาวเฉลี่ยประมาณ 2 ส่วน 3) ลักษณะปลายสุดของหาง ตัวอ่อนระยะที่ 3 (L3) จะมี papillae caudal อยู่บริเวณปลายหางจ านวน 1 - 3 อัน โดยส่วนมากจะมี 3 อัน อันแรกจะอยู่ตรงปลายสุดของหางและอีก 2 อัน จะอยู่บริเวณต าแหน่งด้านข้าง มักมีขนาดเล็กมาก ต้องส่องดูผ่านกล้องจุลทรรศน์ด้วยก าลังขยายสูงเพื่อพิจารณาความต่างของจ านวน ขนาด และ รูปร่างของ papillae มาใช้จ าแนกชนิดเชื้อ รูปที่ 46 เปรียบเทียบความยาวล าตัวของพยาธิตัวอ่อนฟิลาเรียระยะที่ 3 (L3) Wuchereria bancrofti พบในคน Colbold และคณะ ได้ส ารวจเก็บข้อมูล L3 ของเชื้อ W. bancrofti ที่เก็บจากยุง Cx. fatigans , An. gambiac และ An. funestus พบว่ามีความยาวล าตัวประมาณ 1,170 - 1,575 ไมโครเมตร ความกว้างของล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 18 - 32 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารถึงปลาย หางประมาณ 56 – 72 ไมโครเมตร มีปุ่มปลายหาง (Caudal papilliae) ลักษณะคล้ายฟองอากาศ 3 อัน โดยพบ
50 papillae ที่ปลายสุดของหาง 1 อัน ท าให้ปลายหางดูกลมมน อีก 2 อัน อยู่ บริเวณด้านข้างมีขนาดใกล้เคียงกัน ใน บางครั้งจึงดูเหมือนก้านดอกไม้ที่มีดอกเหมือนหลอดไฟ Iyengar, R (1905) ได้อธิบายลักษณะดังกล่าวนี้ว่าคล้าย จุกนมของวัวขนาดใหญ่ แต่บางครั้ง papillae อาจไม่ชัดเจนขึ้นอยู่กับการจัดวางล าตัวที่จะคว่ า หงาย หรือตะแคง รูปที่ 47 แสดงลักษณะปลายหางของ W. bancrofti Brugia malayi พบในคน แมว ลิง (Macaca irus และ M. rhesus) และนางอาย (Nyclicebus coucang) Brug และคณะ ได้รวบรวมข้อมูล L3 ของเชื้อ B. malayi ที่เก็บจากยุง M. uniformis และ M. longipalpis พบว่ามีล าตัวยาวประมาณ 1,280 – 1,720 ไมโครเมตร ความกว้างล าตัวตรงจุดรูทวารหนัก ประมาณ 22 – 28 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารถึงปลายหางประมาณ 42 – 64 ไมโครเมตร ซึ่งมีความยาว ใกล้เคียงกับ W. bancrofti แต่ papillae ยังพัฒนาได้ไม่ดีต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ที่มีก าลังขยาย 1,000 เท่า จึงจะ พบปุ่มบริเวณหาง 3 อัน มีลักษณะนูนเล็กน้อยของหนังก าพร้าและปุ่มนูนไม่ชัดเจน
51 รูปที่ 48 แสดงลักษณะปลายหางของ B. malayi Brugia pahungi พบในหมา แมว เสือ แมวป่า และเสือปลา Buckley and Edison ได้ส ารวจและเก็บ ข้อมูล L3 ของเชื้อ B. pahungi ที่เก็บจากยุง Ar. obturbans พบว่ามีล าตัวยาวประมาณ 1,280 - 1,720 ไมโครเมตร ความกว้างล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 17 - 24 ไมโครเมตร ความยาวของรูทวารหนักถึงปลาย หางประมาณ 42 - 63 ไมโครเมตร และมีลักษณะปลายหางไม่แตกต่างจาก B. malayi Brugia patei พบในแมวและสุนัข Buckley, Nelson & Heisoh ได้ส ารวจเก็บข้อมูล L3 ที่เก็บจากยุง An. penbaensis, M. Uniformis และ M. africanus พบว่ามีความยาวล าตัวประมาณ 1,200 – 1,800 ไมโครเมตร ความกว้างของล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 20 - 28 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารถึงปลาย หาง 44 - 68 ไมโครเมตร โดยปลายหางของ L3 นี้มีลักษณะคล้ายกับ B. malayi บริเวณล าตัวตั้งแต่ทวารหนักถึง ปลายหางจะแคบลงและกว้างขึ้นที่ส่วนปลาย โดยมีpapilliae candal 3 อัน มีลักษณะกลมนูนเด่นคล้าย ฟองอากาศบริเวณปลายสุดของหาง 1 อัน และด้านข้างเหนือขึ้นมาเล็กน้อยอีก 2 อัน มีขนาดเล็กกว่า ถ้าดูผ่าน กล้องจุลทรรศน์ของตัวพยาธิในลักษณะคว่ าท้องอยู่ด้านล่าง จะเห็นสามปุ่มบริเวณปลายหางอย่างชัดเจนคล้ายหัว สุนัข แต่ไมโครฟิลาเรียจะมีลักษณะคล้ายกับ B. malayi และ B. pahangi พบเชื้อชนิดนี้ที่เกาะปาเต้ ประเทศ เคนยา ต่อมาก็มีการพบในแมวบ้าน และทารกที่อาศัยในที่พักใกล้พุ่มไม้ริมแม่น้ าทานาบนแผ่นดินใหญ่ของประเทศ เคนยา
52 รูปที่ 49 แสดงลักษณะปลายหางของ B. patei Dirofilaria corynodes พบในลิง (Cercoptthcus aethiops และ Colobus spp.) Linstow (1899) ได้ ส ารวจและเก็บข้อมูล L3 ของเชื้อ D. corynodes ที่เก็บจากยุง An. penbaensis และ Ae. egypti พบว่ามีล าตัว ยาวประมาณ 680 - 1,000 ไมโครเมตร ความกว้างของล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 20 - 80 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารถึงปลายหาง 20 - 40 ไมโครเมตร โดยมีหางที่มีรูปร่างเหมือนซิการ์ทั่วไป คือตรงตรงทื่อ มี ส่วนตีบแคบ ช่วงระหว่างทวารหนักถึงปลายหางไม่ค่อยเด่นชัดและจุดรูทวารหนักใกล้ส่วนปลายหางมากกว่า Wuchereria มี papillae 3 ปุ่มเล็กๆ รวมกันที่ส่วนปลายมักมองเห็น papillae แค่ 2 ตุ่มเท่านั้น ท าให้หางดูทู่ Webber (1955) ได้ศึกษาพยาธิสปีชีส์นี้ในยุง Ae. egypti พบว่าความยาวมักอยู่ในช่วง 700 - 800 ไมโครเมตร ปลายหางเหมือนของ B. malayi และ Webber ยังพบว่าพยาธิในกลุ่ม Dirofilaria L3 จะพัฒนาเฉพาะในท่อ malphigian tube ของแมลงเท่านั้น ส่วน Brugia spp. และ Wuchereria spp. จะพบในกล้ามเนื้ออกได้
53 รูปที่ 50 แสดงลักษณะปลายหางของ D. corynodes Dirofilaria repense พบในสุนัข สัตว์ตระกูลแมว และสิงโต Railliet and Henry (1911) ได้ส ารวจและ เก็บข้อมูล L3 ของเชื้อ D. repense ที่เก็บจากยุง Ae. Penbaensis , Ae. Egypti , M. uniformis และ M. africanus พบว่ามีความยาวล าตัวประมาณ 640 - 1,080 ไมโครเมตร ความกว้างล าตัวตรงจุดรูทวารหนัก ประมาณ 16 - 25 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารหนักถึงปลายหางประมาณ 34 - 44 ไมโครเมตร มีลักษณะ รูปร่างคล้ายกับ D. corynodas มีpapillae 3 ปุ่ม ปุ่มบริเวณปลายหางมีขนาดเล็กมาก ส่วนอีก 2 ปุ่มอยู่เหนือ ปลายสุดเป็นปุ่มเล็กๆ หากหงายพยาธิ L3 (dorsol - ventral) จะดูราบเรียบ รูปที่ 51 แสดงลักษณะปลายหางของ D. repense Dirofilaria immitis พบในสุนัข และสุนัขป่า Leidy (1956) ได้ส ารวจและเก็บข้อมูล L3 ของเชื้อ D. immitis ที่เก็บจากยุง Ae. Penbaensis , Ae. Egypti และ Cx. fatigans พบว่ามีล าตัวยาวประมาณ
54 800 - 1,040 ไมโครเมตร ความกว้างล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 18 - 26 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวาร หนักถึงปลายหางประมาณ 26 - 40 ไมโครเมตร จากการชันสูตรศพสุนัขที่ตายตามธรรมชาติพบว่าสุนัขมักติด เชื้อฟิลาเรียหลายสายพันธุ์พร้อมกัน ในสุนัขบางตัวพบตัวแก่ของพยาธิหลายชนิด เช่น B. patei , D. immitis , D. repense และ Dipetalonema spp. ส่วน L3 ของ D. immitis ยากที่จะจ าแนกความแตกต่างกับ D. repens แต่มีจุดสังเกตคือ papillae ที่ด้านข้างทั้งสองปุ่มของ D. repense จะมีขนาดเล็กกว่าของ D. immitis และรูทวาร (anal aparture) มีเส้นบางยากแก่การสังเกต รูปที่ 52 แสดงลักษณะปลายหางของ D. immitis Setaria equina พบในม้า ลา และสุนัข Abidyaard (1989) ได้ส ารวจและเก็บข้อมูล L3 ของเชื้อ S. equina ในยุง Ae. Egypti และ An. penbaensis พบว่ามีล าตัวยาวประมาณ 1,280 - 1,720 ไมโครเมตร ความกว้างของล าตัวตรงจุดรูทวารหนักประมาณ 21 - 28 ไมโครเมตร ความยาวจากรูทวารหนักถึงปลายหาง ประมาณ 40 - 50 ไมโครเมตร โดย L3 ของเชื้อนี้มีลักษณะเด่นง่ายแก่การจ าแนก มี papillae ที่ปลายสุดของหาง ขนาดใหญ่ 1 ปุ่ม และอีก 2 ปุ่ม บริเวณด้านล่างมีลักษณะคล้ายหูขนาดเล็ก เชื้อนี้พบได้ทั่วไปในเขตปศุสัตว์นักวิจัย
55 ชาวญี่ปุ่น Inner และ shoho (1953) ได้ท า direct feeding พบว่ายุง An. Hyrcanus, Armigeres obturbans และ Ae. togoi สามารถติดเชื้อชนิดนี้ได้ รูปที่ 53 แสดงลักษณะปลายหางของ S. equine แนวทางการจ าแนกชนิดเชื้อฟิลาเรียจากตัวอ่อนระยะติดต่อในยุง มีการศึกษาเพื่อใช้สัณฐานวิทยามาใช้ในการจ าแนกชนิดฟิลาเรียจากตัวอ่อนพยาธิระยะที่ 3 ได้มาจาก การศึกษาในพื้นที่ของประเทศเคนยา ฟิจิ และมาเลเซีย โดยสรุปในส่วนที่ส าคัญของรูปร่างสัณฐานและน ามาพัฒนา เป็นแนวทางการจ าแนกชนิดเชื้อตัวฟิลาเรียจากตัวอ่อนระยะที่ 3 ในยุง 1) หางมีตุ่มนูน,............................................................................................................................................((2 หางไม่มีตุ่มนูน........................................................................................................................................)..9( 2) มีขนาดล าตัวยาวมากกว่า 1,100ไมโครเมตร(3).......................................................................................... มีขนาดล าตัวยาวน้อยกว่า 1,100ไมโครเมตร(6)......................................................................................... 3) ปุ่ม papillae ปลายหางลักษณะกลมคล้ายฟองอากาศเห็นชัดเจนมีขนาดใกล้เคียงกัน........W. bancrofti ปุ่ม papillae ปลายหางมีรูปร่างและขนาดต่างกัน..................................................................................(4). 4) papillae ปลายสุดของหางหรือต าแหน่งบนของปลายสุดหางมีตุ่มพัฒนาจนเห็นเป็นรูปร่างชัดเจน.......(5) papillae ที่ปลายหางทั้ง อันเห็นไม่ชัดเจน 3เช่น นูนขึ้นมาจากผนังก าพร้าเล็กน้อย.................B.malayi
56 5) papillae ที่ปลายสุดด้านบนของหางใหญ่ชัดเจนดูคล้ายจมูกสุนัข papillae ด้านข้างทั้งสองเห็นไม่ชัด ตัว พยาธิผอมบาง anal ratio ประมาณ ........................................................................................4.5B.patei papillae ที่ปลายสุดอยู่กึ่งกลางกลางขนาดใหญ่ อีก อันด้านข้างแผยื่นออกมาคล้ายหู2anal ratio ประมาณ ...............................................................................................................................3.0S.equina 6) ความยาวล าตัวจากรูทวารถึงปลายมากกว่า (8)...................................................................ไมโครเมตร 50 ความยาวล าตัวจากรูทวารถึงปลายหางน้อยกว่า (7)............................................................ไมโครเมตร 50 7) ปลายหางมีpapillae ขนาดเล็ก 3 ปุ่ม...............................................................................D. corynodas ปลายหางมีpapillae 1 ปุ่ม และที่ด้านข้างอาจมี papillae ที่เล็กมากหรือไม่มีก็ได้................................... ............................................................................................................................D. immitis, D. repense ปลายหางมีpapillae 3 ปุ่มชัดเจน.............................................................................................D. arbuta 8) ความยาวล าตัวน้อยกว่า 1,ไมโครเมตรและความยาวจากรูทวาร 100หนักถึงปลายหางน้อยกว่า 50 ไมโครเมตร........................................................................................................................Foleyella spp. 9) ความยาวล าตัวอยู่ในช่วง 1,000 - 1250 ไมโครเมตรและความยาวจากรูทวารหนักถึงปลายหางมากกว่า 50 ไมโครเมตร............................................................................................................ Celeus flavescens ภาคผนวก 1. การเก็บตัวอย่างเลือดเตรียมฟิล์มจากมนุษย์ 1.1 การเจาะเลือดปลายนิ้ว 1.1.1 วัสดุอุปกรณ์ 1.1.1.1 ถุงมือ 1.1.1.2 เข็มเจาะเลือดปลายนิ้วปราศจากเชื้อ 1.1.1.3 ส าลีก้อนปราศจากเชื้อ
57 1.1.1.4 ส าลีชุบ 70 % alcohol 1.1.1.5 กระป๋องทิ้งเข็ม 1.1.1.6 แผ่นสไลด์ 1.1.1.7 ถุงขยะติดเชื้อ 1.1.2 การเลือกช่วงเวลาเพื่อเจาะเลือดผู้ป่วยควรเป็นกลางคืน เวลา 20.00 น. เป็นต้นไป หรือเวลาที่ สอดคล้องกับการปรากฏตัวของไมโครฟิลาเรียในแต่ละพื้นที่ดังตารางที่ 4 ตารางที่ 4 การศึกษาการปรากฏตัวของพยาธิไมโครฟิลาเรียในประเทศไทย กองโรคเท้าช้างได้ด าเนินการศึกษาการปรากฎตัวของพยาธิไมโครฟิลาเรียต่างๆ ในประเทศไทยในหลายพื้นที่ซึ่งพอ สรุปได้ดังนี้11 พยาธิ สถานที่ ปี/ผู้ศึกษา ช่วงเวลาที่ปรากฏตัว เวลาสูงสุด ชนิดของพยาธิ ผู้ป่วย W. bancrofti อ.แม่สะเรียง จ าหวัดแม่ฮ่องสอน 2534/ ศิริชัย และคณะ 18.00 – 24.00 น. 24.00 น. Nocturnally periodic กระเหรี่ยง อ.แม่ระมาด จ าหวัดตาก 2534/ วันพ็ญ 18.00 – 24.00 น. 20.00 น. Nocturnally subperiodic กระเหรี่ยง อ.แม่สอด จ าหวัดตาก 2538/ ธีระ ยศ และคณะ 18.00 – 24.00 น. 01.06 น. Nocturnally periodic พม่า อ.ทองผาภูมิ จ าหวัดกาญจนบุรี 2529/ ศิริชัย และคณะ 18.00 – 24.00 น. 21.00 น. Nocturnally subperiodic กระเหรี่ยง อ.สวนผึ้ง จ าหวัดราชบุรี 2537/ พิมาน และ คณะ 18.00 – 24.00 น. 23.33 น. Nocturnally periodic กระเหรี่ยง อ.เมือง จ าหวัดระนอง 2537/ ศิริชัย 24.00 -06.00 น. 02.55 น. Nocturnally periodic พม่า B. malmyi อ.ตากใบ จ าหวัดนราธิวาส 2529/ ศิริชัย และคณะ 18.00 – 24.00 น. 20.08 น. Nocturnally subperiodic ไทยมุสลิม อ.สุไหงปาดี จ าหวัดนราธิวาส 2529/ ศิริชัย และคณะ 18.00 – 24.00 น. 21.01 น. Nocturnally subperiodic ไทยพุทธ
58 พยาธิ สถานที่ ปี/ผู้ศึกษา ช่วงเวลาที่ปรากฏตัว เวลาสูงสุด ชนิดของพยาธิ ผู้ป่วย อ.พระแสง จ าหวัดสุราษฎร์ ธานี 2529/ ศิริชัย และคณะ 12.00 -18.00 น. 13.03 น. Nocturnally subperiodic ไทยพุทธ 1.1.3 ขั้นตอนการตรวจ 1.1.3.1 สวมถุงมือก่อนเจาะเลือดทุกครั้ง 1.1.3.2 เลือกนิ้วนางหรือนิ้วกลางบีบใกล้ที่ปลายนิ้ว (เพราะเป็นนิ้วที่ใช้งานน้อย ผิวหนังจะบางง่าย ต่อการเจาะเลือด) ท าความสะอาดนิ้ว โดยใช้ส าลีชุบ 70 % alcohol เช็ดปลายนิ้วบริเวณที่ จะเจาะ รอจน alcohol แห้ง ดังรูปที่ 54 รูปที่54 ท าความสะอาดนิ้ว โดยใช้ส าลีชุบ 70 % alcohol 1.1.3.3 ใช้เข็มเจาะเลือดปลายนิ้วปราศจากเชื้อเจาะลึกประมาณ 1-2 มม. แล้วใช้ส าลีแห้งปราศจาก เชื้อเช็ดเลือดหยดแรกทิ้ง แล้วปล่อยให้เลือดหยดลงบนกลางแผ่นสไลด์ประมาณ 3 หยด (60 ลบ.มม.) ใช้ส าลีแห้งปราศจากเชื้อกดที่ปากแผลไว้ 1-2 นาที ดังรูปที่ 55
59 รูปที่ 55 วิธีเจาะเลือดปลายนิ้ว 1.2 การเจาะเลือดจากหลอดเลือดด า 1.2.1 วัสดุอุปกรณ์ 1.2.1.1 ถุงมือ 1.2.1.2 สายรัดแขน 1.2.1.3 หมอนรองแขน 1.2.1.4 อุปกรณ์เจาะเลือดปราศจากเชื้อ ได้แก่ เข็มเจาะเลือด กระบอกฉีดยา (Syringe) 1.2.1.5 ส าลีก้อนปราศจากเชื้อ 1.2.1.6 70 % alcohol 1.2.1.7 หลอดเก็บเลือดชนิด EDTA 1.2.1.8 Autopipette และ tip 1.2.1.9 กระป๋องทิ้งเข็ม 1.2.1.10 แผ่นสไลด์ การเจาะเลือดปลายนิ้ว 1. เลือกนิ้วที่จะเจาะ ได้แก่นิ้วกลางหรือนิ้วนาง 2. เลือกบริเวณที่เจาะปลายนิ้ว อย่าใกล้กับเล็บ 3. บีบนวดให้เลือดไหลเวียนสะดวก 4. จับสไลด์บริเวณขอบเท่านั้น 5. คว่ านิ้วลงบนแผ่นสไลด์ให้เลือดไหลลงบนสไลด์
60 1.2.2 การเลือกช่วงเวลาเพื่อเจาะเลือดผู้ป่วยควรเป็นกลางคืน เวลา 20.00 น. เป็นต้นไป หรือเวลาที่ สอดคล้องกับการปรากฏตัวของไมโครฟิลาเรียในแต่ละพื้นที่ดังตารางที่ 2 1.2.3 ขั้นตอนการตรวจ 1.2.3.1 สวมถุงมือก่อนเจาะเลือดทุกครั้ง 1.2.3.2 ประกอบเข็มเจาะเลือดและกระบอกฉีดยาให้พร้อมใช้งาน 1.2.3.3 วางแขนผู้ป่วยบนหมอนรองแขน และรัดแขนด้วยสายรัดแขน 1.2.3.4 ท าความสะอาดแขนบริเวณที่จะเจาะเลือด โดยใช้ส าลีชุบ 70 % alcohol รอจน alcohol แห้ง 1.2.3.5 ใช้เข็มเจาะเลือดเข้าเส้นเลือดด า เมื่อได้เลือดปริมาตรที่เหมาะสม ให้คลายสายรัดแขนออก 1.2.3.6 ใช้ส าลีแห้งปราศจากเชื้อซับบริเวณแผลเจาะ แล้วค่อยๆถอดเข็มออกจากแขนผู้ป่วย และใช้ ส าลีแห้งปราศจากเชื้ออีกก้อนกดที่ปากแผลไว้ 1-2 นาที 1.2.3.7 ถ่ายเลือดจากกระบอกฉีดยาใส่ลงในหลอด EDTA ผสมเลือดให้เข้ากัน 1.2.3.8 ใช้ autopipette ดูดเลือดจากหลอด EDTA 60 หยดลงบนสไลด์เพื่อท าฟิล์ม 1.2.3.9 วิธีการท าฟิล์มดังวิธีการท าฟิล์มเลือดหนา (Thick blood film) และย้อมสียิมซ่าข้างต้น 2. การเก็บตัวอย่างเลือดเตรียมฟิล์มจากสัตว์รังโรค 2.1 การเก็บสิ่งส่งตรวจประเภทเลือด การเก็บเลือดนั้นผู้ท าาการเก็บต้องเป็นผู้ที่ผ่านการฝึกอบรมและฝึกปฏิบัติจนมีความช านาญเนื่องจาก สัตว์แต่ละชนิดมีโครงสร้างทางกายวิภาคที่แตกต่างกันออกไป ดังนั้นต้องเลือกวิธีการเก็บเลือดจากต าแหน่งที่ เหมาะสมกับสัตว์ชนิดนั้นๆ โดยทั่วไปจะเจาะเก็บเลือดจากเส้นเลือดด าซึ่งวิธีการเก็บจะต้องทาให้เกิด ความเครียดและความเจ็บปวดกับสัตว์น้อยที่สุด ไม่ขัดกับหลักสวัสดิภาพสัตว์ การจับบังคับสัตว์ควรท าด้วย ความระมัดระวัง ท าการจับบังคับสัตว์อย่างถูกวิธี เหมาะสมกับสัตว์ชนิดนั้นๆ ไม่ทาให้สัตว์เครียด อาจจะ พิจารณาทาการวางยาสลบสัตว์ก่อนทาการเก็บเลือดถ้าสัตว์ตัวนั้นมีความเสี่ยงที่จะมีความเครียดมากหรือ ก่อให้เกิดอันตรายกับตัวผู้เก็บตัวอย่างหรือผู้ที่ช่วยท าการจับบังคับสัตว์ปริมาณเลือดที่เก็บต้องไม่เกินร้อยละ 10 ของปริมาณเลือดทั้งหมดในตัวสัตว์ ซึ่งสัตว์ที่โตเต็มวัยจะมีปริมาณเลือดทั้งหมดในร่างกายประมาณ 55-70 มิลลิกรัม/กิโลกรัม หากสัตว์ที่ยังไม่โตเต็มวัย สัตว์อายุมากหรือสัตว์ป่วยต้องประเมินสภาวะของสัตว์และ สถานการณ์อย่างระมัดระวัง20 2.2 อุปกรณ์ที่จ าเป็นในการเก็บเลือด
61 2.2.1 ส าลีแอลกอฮอล์ 2.2.2 ส าลีแห้ง 2.2.3 เข็มฉีดยาปราศจากเชื้อ ขนาดขึ้นกับต าแหน่งที่ต้องการเก็บและชนิดของสัตว์ 2.2.4 capillary (microhaematocrit) tubes ในกรณีเก็บเลือดจากสัตว์ขนาดเล็ก 2.2.5 กระบอกฉีดยา 2.2.6 บรรจุภัณฑ์เก็บเลือด เช่น หลอดเก็บเลือด 2.2.7 กล่องทิ้งของมีคม 2.3 วิธีการเก็บเลือด 2.3.1 จับบังคับสัตว์อย่างเหมาะสมกับชนิดของสัตว์ โดยไม่ขัดกับหลักสวัสดิภาพสัตว์ 2.3.2 ท าความสะอาดบริเวณที่จะท าการเก็บเลือดด้วยส าลีแอลกอฮอล์ 2.3.3 เจาะเก็บเลือดสัตว์จากเส้นเลือดด า ในต าแหน่งที่เหมาะสมส าหรับสัตว์ชนิดนั้นๆ ไม่เกินร้อยละ 10 ของปริมาณเลือดทั้งหมดในตัวสัตว์ 2.3.4 ใส่เลือดที่เจาะได้ในบรรจุภัณฑ์ที่เหมาะสมกับการตรวจตัวอย่างแต่ละประเภท 2.3.5 ห้ามเลือดด้วยส าลีแห้ง 2.3.6 ทิ้งเข็มฉีดยาลงในที่ทิ้งของมีคม และอุปกรณ์อื่นๆ แยกทิ้งเป็นขยะติดเชื้อ 2.3.7 เมื่อเก็บเลือดจากตัวสัตว์ได้แล้วควรเตรียมตัวอย่างเพื่อส่งตรวจทางห้องปฏิบัติการให้เหมาะสมกับ การตรวจโรค ซึ่งในกรณีการตรวจเชื้อพยาธิไมโครฟิลาเรียจะใช้สิ่งส่งตรวจเป็นเลือดครบส่วน (Whole blood) 2.4 เลือดครบส่วน (Whole blood) เลือดครบส่วนคือเลือดที่เก็บจากตัวสัตว์โดยตรงแล้วใส่สารป้องกันการแข็งตัวของเลือดเพื่อประโยชน์ ในการเก็บรักษาให้มีระยะเวลานานมากขึ้น ซึ่งมีประโยชน์อย่างมากในการตรวจวินิจฉัยโรคต่างๆ ที่สามารถ พบได้ในกระแสเลือดอุปกรณ์ที่ใช้ 2.4.1 หลอดเก็บเลือดที่มีสารป้องกันการแข็งตัวของเลือด (Anti-coagulant) ชนิด Heparin หรือ Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), หรือ Sodium citrate วิธีการท า 2.4.1.2 เจาะเก็บเลือดสัตว์จากหลอดเลือดด า 2.4.1.2 ใส่เลือดลงในบรรจุภัณฑ์ที่มีสารป้องกันการแข็งตัวของเลือด โดยให้มีปริมาตรและ ปริมาณสารป้องกันการแข็งตัวของเลือด เหมาะสมกับปริมาณของเลือดที่จะเก็บจากสัตว์ซึ่งมี
62 เขียนระบุไว้ข้างบรรจุภัณฑ์ 2.4.1.3 ผสมเลือดให้เข้ากับสารป้องกันการแข็งตัวของเลือดอย่างระมัดระวัง ไม่เขย่า เพื่อ ป้องกัน ไม่ให้เม็ดเลือดแดงแตก 2.4.1.4 น าไปเก็บรักษาที่อุณหภูมิที่เหมาะสมก่อนน าส่งห้องปฏิบัติการ หมายเหตุ ปริมาณเลือดที่เก็บขึ้นกับวิธีการที่ต้องการส่งตรวจ 2.4.2 ควรเก็บเลือดปริมาณอย่างน้อย 0.5 -1 มิลลิลิตร ในกรณีที่ต้องการส่งตรวจโรคที่ต้องสงสัย ด้วยวิธีทางอณูชีววิทยา โดยสามารถเก็บรักษาที่ 4 องศาเซลเซียส -20 องศาเซลเซียส หรือ – 70 องศาเซลเซียส ขึ้นอยู่กับระยะเวลาก่อนการส่งตรวจ 2.4.3 ควรเก็บเลือดปริมาณอย่างน้อย 1 มิลลิลิตรในกรณีที่ต้องการส่งตรวจโรคที่ต้องสงสัยด้วยวิธี ทางซีรั่มวิทยา โดยเก็บรักษาตัวอย่างที่ 4 องศาเซลเซียส และส่งตัวอย่างให้ห้องปฏิบัติการเร็ว ที่สุดหากไม่ได้ปั่นแยกพลาสมา20 เอกสารอ้างอิง 1. กองโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค. โรคเท้าช้าง [Internet]. กองโรคติดต่อน าโดยแมลง กรม ควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. [cited 2022 Mar 7]. Available from: https://ddc.moph.go.th/dvb/news.php?news=1133&deptcode=dvb#zikav 2. ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. การดูแลรักษาผู้ปรากฏอาการโรค เท้าช้าง. กรุงเทพมหานคร: ส านักพิมพ์อักษรกราฟฟิคแอนด์ดีไซน์; 2560. 3. กลุ่มโรคติดต่อน าโดยแมลงอื่นๆ ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค. ความรู้ทั่วไปเรื่องดรค เท้าช้าง [Internet]. ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค. 2018 [cited 2022 Mar 9]. Available from: https://ddc.moph.go.th/dvb/news.php?news=1133&deptcode=dvb#filariasis 4. Rojanapanus S, Toothong T, Boondej P, Thammapalo S, Khuanyoung N, Santabutr W, et al. How Thailand eliminated lymphatic filariasis as a public health problem. Infect Dis poverty. 2019;8(1):1–15. 5. กองโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค. รายงานประจ าปีกองโรคติดต่อน าโดยแมลง. นนทบุรี: กอง
63 โรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค; 2564. 6. เกษแก้ว มีเพียร. ความรู้เบื้องต้นโรคเท้าช้าง (การอบรมหลักสูตรเจ้าหน้าที่ตรวจบ าบัดในมาลาเรียคลีนิค (จตบ.) รุ่นที่ 12) [Internet]. สระบุรี: ศูนย์อบรมโรคติดต่อน าโดยแมลง พระพุทธบาท จังหวัดสระบุรี; 2548. Available from: http://elib.ddc.moph.go.th/pdf/LymphaticFilariasis/LymphaticFilariasis.pdf 7. กองโรคเท้าช้าง กรมควบคุมโรคติดต่อ กระทรวงสาธารณสุข. โรคเท้าช้าง. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์องค์การ สงเคราะห์ทหารผ่านศึก; 2538. 8. ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. คู่มือในการด าเนินงานป้องกันควบคุม โรคเท้าช้าง. 1st ed. กรุงเทพมหานคร: โรงพิมพ์ชุมนุมสหกรณ์การเกษตรแห่งประเทศไทย; 2549. 9. ธนพร ตู้ทอง. การด าเนินงานเฝ้าระวังป้องกันควบคุมโรคเท้าช้าง [Internet]. 2561 [cited 2565 Mar 7]. Available from: https://ddc.moph.go.th/dvb/news.php?news=1133&deptcode=dvbs 10. กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. แนวทางคัดกรองโรคในแรงงานต่างด้าวในศูนย์บริการเบ็ดเสร็จ. กรุงเทพมหานคร; 2562. 11. Bancroftian filariasis: long-term effect of the DEC provocative day test on microfilaraemia. Simonsen PE, Meyrowitach DW, Makunde WH. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1997 MayJun;91(3):290-3. 12. ศิริชัย พรรณธนะ. โรคเท้าช้าง. กองโรคเท้าช้าง. กรมควบคุมโรคติดต่อ. โรงพิมพ์องค์การสงเคราะห์ทหาร ผ่านศึก. ม.ป.ป. หน้า 24-26. 13. ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. คู่มือการตรวจวินิจฉัยโรคติดต่อน าโดย แมลงโดยใช้ชุดน้ ายาตรวจอย่างรวดเร็ว.นนทบุรี .2550 หน้า 28-33 14. วิวรพรรณ สรรประเสริฐและคณะ. การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยโรคเท้าช้างด้วยวิธีนาโนเทคโนโลยี [Internet]. หน่วยปฏิบัติการวิจัยโรคเท้าช้าง คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.2557. Available from:http:// file:///C:/Users/User/Downloads/Fulltext%231_379286. หน้า 14-15 15. สุรางค์ ไตรธีระประภาพ. บทความฟื้นฟูวิชาการก้าวทันโรคเท้าช้างอันตรายที่จะกลับมา [Internet]. ภาควิชาปรสิตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.1997. Available from : http:// http://clmjournal.org/_fileupload/journal/308-4-6 16. ศิริชัย พรรณธนะ. โรคเท้าช้าง. กองโรคเท้าช้าง กรมควบคุมโรคติดต่อ. โรงพิมพ์องค์การสงเคราะห์ทหาร ผ่านศึก. ม.ป.ป.2538.
64 17. ธีระยศ กอบอาษา.งานชันสูตรโรคเท้าช้าง.ส านักโรคติดต่อน าโดยแมลง กรมควบคุมโรค กระทรวง สาธารณสุข.2546.นนทบุรี.หน้า 30-54 18. สิริจิต วงศ์ก าชัยและคณะ. การพัฒนาชุดตรวจส าเร็จรูป (แบบELISAและแบบรวดเร็ว) เพื่อตรวจหา antifilarial IgG4 ที่จ าเพาะต่อพยาธิเท้าช้างโดยใช้ ecombinant antigen[Internet]. 2555. Available from : https://kb.hsri.or.th/dspace/handle/11228/4961?locale-attribute=th 19. N Rahmah et al. Specificity and sensitivity of a rapid dipstick test (Brugia Rapid) in the detection of Brugia malayi infection. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. (2001) 95,601-604 20. Wongkamchai S, Monkong N, Mahannol P, Taweethavonsawat P, Loymak S, Foongladda S. Rapid detection and identification of Brugia malayi, B. pahangi, and Dirofilaria immitis by high-resolution melting assay. Vector Borne Zoonotic Dis. 2013 Jan;13(1):31-6. doi: 10.1089/vbz.2012.0971. 21. คู่มือการเก็บและส่งสิ่งส่งตรวจจากสัตว์ เพื่อการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการศูนย์เฝ้าระวังและติดตาม โรคติดต่อจากสัตว์ป่า สัตว์ต่างถิ่น และสัตว์อพยพ คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล.มกราคม 2561. หน้า 9-10.