คู่มือปฏิบัติการชีวเคมี 62

ก

คม#ู ือปฏิบัตกิ ารชวี เคมี

นักเรียนแพทยท: หาร
และนกั ศกึ ษาแพทยท: หาร ชัน้ ปBท่ี ๒

ภาควชิ าชวี เคมี
วทิ ยาลัยแพทยศาสตร:พระมงกุฎเกลJา

พ.ศ. ๒๕๖๒

ข

คำนำ

หนังสือคูม- อื ปฏิบัติการชีวเคมีเลม- นี้ คณาจารย?ภาควิชาชีวเคมี ไดCร-วมกันปรับปรงุ และจัดทำขึ้นโดยมี
วัตถุประสงค?เพ่ือใชCสำหรับการเรียนการสอนภาคปฏิบัติของวิชาชีวเคมี ในแต-ละรายวิชาสำหรับนักเรียนแพทย?
ทหารและนกั ศึกษาแพทย?ชั้นปQที่ 2 ของวิทยาลยั แพทยศาสตร?พระมงกุฎเกลาC

คณาจารยภ: าควิชาชวี เคมี
สงิ หาคม 2562

ค

สารบัญ

รายวิชา Biochemistry & Molecular Biology (BMB) หนาC
เร่อื ง 1
2
บทนำ I. งานปฏบิ ัตชิ ีวเคมี 6
II. ระเบยี บท่วั ไป และคำแนะนำเกีย่ วกบั ปฏบิ ัติการชีวเคมี 22
30
บทที่ 1 เครอื่ งแกCวสำหรบั ปฏิบตั กิ ารชวี เคมีเบอ้ื งตนC 42
บทท่ี 2 โปรตนี 50
บทท่ี 3 Quantitative analysis 59
บทท่ี 4 เอน็ ไซม? 66
บทที่ 5 คารโ? บไฮเดรตและไขมัน
บทที่ 6 การตรวจน้ำตาลในเลือดโดยใชCเคร่อื งอตั โนมัติ หนาC
บทที่ 7 การวเิ คราะห? ดีเอ็นเอ 79
87
รายวิชา Kidney and Urinary bladder system (KUB) 100
เรอ่ื ง
หนCา
บทท่ี 8 การทดสอบหนาC ท่ีของไต 105
บทที่ 9 การวเิ คราะห?ปสm สาวะ
บทที่ 10 นวิ่ ปสm สาวะ 111
115
รายวชิ า Endocrine system
เร่อื ง

บทที่ 11 การทดสอบความทนน้ำตาลกลูโคส (GTT)

ผนวก ก นำ้ ยาและน้ำละลายต-าง ๆ
หนังสือทีใ่ ชอC า- นประกอบในการปฏิบตั กิ ารชีวเคมี

รายวิชา BMB

บทนำ

I. งานปฏบิ ัตชิ วี เคมี

การปฎบิ ตั งิ านทางชวี เคมีนอกจากจะใหคC วามรเCู รื่องวธิ กี ารและเทคนคิ ของชีวเคมีคลีนิคแลวC ยังชว- ยใหC
นกั เรียนไดฝC vกความปราณตี ความละเอยี ดถีถ่ Cวน ความมีระเบียบ และการทำงานตามลำดบั ชน้ั รวมทั้งการตัดสนิ ใจที่
ถูกตอC ง สิง่ เหลา- น้ีเปwนความจำเปwน และเปwนบนั ไดไปสค-ู วามเปนw แพทย?ที่ดี และมรี ะเบียบในการปฏิบตั งิ าน

การทำงานปฏิบัตใิ หลC ลุ -วงไปดCวยดี และโดยรวดเรว็ ตCองอาศยั สิง่ ตอ- ไปนี้
1. ความเขCาใจในการทดลองทจี่ ะทำ ทกุ คนตCองศกึ ษาโดยละเอยี ดเสยี ก-อนทจี่ ะเขาC หCองปฏบิ ัติการโดยอ-านขอC
ปฏบิ ัติมาก-อน ตอC งวางแผนงานทจี่ ะทำและคาดคะเนผลทจ่ี ะเกดิ ขึ้นไวCลว- งหนาC พยายามทำความเขาC ใจในกระบวนการ
ทเี่ กยี่ วขCอง
2. ความปราณตี และความสะอาด เปwนหัวใจของงานปฏบิ ตั ิทางเคมีอยูแ- ลวC งานปฏบิ ตั ชิ ีวเคมียง่ิ ตCองการ
มากกวา- น้นั เพราะสารบางอย-างทไ่ี ดCจากส่งิ มีชวี ติ นนั้ เสือ่ มฤทธ์ิ หรือเสียไดงC -าย (เช-น เอน็ ไซม)? ดงั นั้น การปฏิบตั ิ
จะตCองดำเนินไปอยา- งเขCมงวดตามวิธีการที่วางไวเC พ่อื จะใหCไดCผลทีถ่ กู ตอC ง
3. ถาC ผลทไี่ ดไC มต- รงตามทฤษฎี จะตอC งรายงานใหCอาจารยท? ราบทนั ทพี รCอมทงั้ แสดงหลกั ฐานดวC ย เพอ่ื จะ
ไดCรว- มกนั วจิ ารณผ? ลท่เี กดิ ข้ึนและหาขอC ผิดพลาดเพอื่ แกCไข
4. เมอื่ มีอบุ ัติเหตเุ กิดข้นึ ใหรC ายงานใหอC าจารยท? ราบทนั ที

2

II. ระเบยี บทวั่ ไป และ คำแนะนำเกี่ยวกับปฏบิ ัติการชีวเคมี

ก. การใชขC องกลาง
1. เกยี่ วกบั นำ้ ยา
1.1 นำ้ ยาที่ใชทC ดลองตCองใชCอยา- งประหยดั เสมอ การแบ-งน้ำยาของกลางไปเก็บไวใC ชเC ฉพาะตัวเปwนเร่ืองท่ี

หCามเด็ดขาด การทดลองโดยใชCของเร่ียราดสรุ ย-ุ สรุ -ายเปwนความผิดท่ีไมม- กี ารอภยั การใชนC ้ำยามากเกนิ ไปนอกจาก
จะเปwนการหมดเปลืองโดยใช-เหตุแลCว ยังอาจทำใหผC ลการทดลองผดิ หรอื สงั เกตการเปล่ยี นแปลงทเ่ี กดิ ขน้ึ ไดยC าก
ขวดนำ้ ยาทว่ี างไวCเปนw ของกลางภายหลงั ใชCแลCวตCองวางไวทC เี่ ดิม อย-าสลับจกุ กัน ทางทดี่ คี อื ใชนC ิว้ คบี จกุ ไวCขณะรนิ
นำ้ ยา การวางจุกไวบC นโต|ะอาจเกดิ การเปรอะเป}อ~ นหรอื ลมื ปด• จกุ ไดC

1.2 เมอ่ื นำ้ ยาในขวดหมด ใหนC ำขวดไปรบั นำ้ ยาใหม-จากเจาC หนCาที่ อย-าหยบิ ขวดนำ้ ยาจากโต|ะอืน่ มาใชC
1.3 อย-าใชCป•เปตw ดดู นำ้ ยาจากขวดโดยตรง (นอกจากจะมปี เ• ปwตร-วมไวCใหCใชโC ดยเฉพาะ) ควรรนิ น้ำยาแต-
พอควรลงในกระบอกตวงหรอื บีคเคอรท? ีแ่ หงC และสะอาด แลวC จงึ ดูดดCวยปเ• ปตw สว- นทเ่ี หลือเลก็ นอC ยใหเC ททงิ้ ไป
1.4 การรินน้ำยาจากขวด ตCองรินทางดCานทไี่ มไ- ดCตดิ ฉลาก
1.5 ในการเจือจางทุกอย-างที่สงั่ ใหเC จอื ดวC ยนำ้ ตCองใชนC ำ้ กลนั่ เสมอนอกจากจะมคี ำส่ังเปนw อย-างอนื่
2. เกี่ยวกบั ความรบั ผิดชอบเครื่องมอื และ อุปกรณต? -าง ๆ
2.1 เมอื่ มกี ารเสยี หายเกิดขนึ้ แกเ- ครอ่ื งมือทจี่ า- ยใหCใชCรว- มกนั ทัง้ ช้ัน ตCองรบี รายงานใหCอาจารย?ทราบ ถCา
ปรากฎว-าเครอื่ งมือเหลา- นีเ้ สยี หายโดยไมม- ผี ใCู ดรบั ว-ากระทำนกั เรียนท้ังหมดจะตอC งเฉลี่ยกนั ใชCคา- เสยี หายนัน้ ๆ
2.2 ก|อกแกส| และ ก|อกน้ำตCองป•ดใหสC นทิ เมอ่ื เลกิ ใชC ถCามีการรว่ั ใหรC ีบแจงC เจาC หนCาท่ที ราบทนั ที ขณะพกั
ใชแC กส| ช่วั คราวตอC งหร่ไี ฟใหCเหลือนอC ย หรือ ดบั เสยี เลย
2.3 อ-างน้ำมีไวสC ำหรับลาC ง และเทสง่ิ ทเี่ ปwนน้ำเทา- นั้น ส่งิ ทีเ่ ปนw ของแข็งตอC งทง้ิ ในถงั ขยะ กรดและด-างเขมC
ตอC งเจอื นำ้ ใหจC างเสยี กอ- นทีจ่ ะเทลงในอ-าง ไมCขีดไฟตอC งดับเสียกอ- นจึงทงิ้ ลงในถงั และหCามใชกC ระดาษตอ- ไฟเปนw อัน
ขาด
3. เกี่ยวกบั คำสงั่
นกั เรยี นตอC งปฏบิ ัตติ ามคำสงั่ หรือ คำแนะนำของอาจารย?โดยเครง- ครดั ผทCู ฝ่ี า• ฝน} นอกจากจะตCองรับโทษ
แลวC ยังอาจตอC งรบั ใชCคา- เสยี หายทีเ่ กดิ ข้นึ อกี ดวC ย

ข. ของใชCเฉพาะแตล- ะโต|ะ
1. เครอ่ื งมอื ทจี่ า- ยใหCใชC นักเรียนทที่ ำงานดวC ยกันย-อมมีความรับผิดชอบร-วมกนั เวนC แต-มีหลกั ฐานวา- ผCูใด

ทำเสีย ผูอC นื่ จึงไมต- อC งรบั ผดิ ชอบดวC ย เม่อื มีการแตกหักหรอื หายตอC งรีบจดั การเบิกไปแทนเพอ่ื ใหมC ีจำนวนครบถCวน
อย-เู สมอ

2. การเอาใจใสร- กั ษาเครอื่ งมอื เครอื่ งใชCเปwนคะแนนส-วนหนง่ึ ในการปฏบิ ตั ิ เครอ่ื งใชทC ่ใี หปC ระจำตอC งลCางใหC
สะอาดก-อนท่ีจะเกบ็ เขCาตูC ซ่งึ ตCองจดั ใหเC ปนw ระเบียบ เมอื่ เลกิ งานแลวC ท่ที ำงานตอC งสะอาดเหมือนเดิม

3

ค. ความสะอาด
1. การรกั ษาความสะอาดเครอ่ื งแกวC
ความสะอาดเปนw ปจm จยั สำคญั ยงิ่ สำหรับความสำเรจ็ การท่ีนกั เรียนส-วนมากทำงานไม-ไดผC ลตามท่ี

คาดคะเนน้นั สาเหตทุ สี่ ำคัญทส่ี ุดคือ เครือ่ งใชสC กปรก โดยเฉพาะอยา- งยงิ่ หลอดแกCทดลอง ฉะนน้ั ของใชCทกุ ช้ินจงึ
จำเปwนตอC งทำความสะอาดอยา- งหมดจดเสมอ

- เคร่ืองแกCวทีใ่ ชเC สรจ็ แลCวควรเทของทงิ้ แลวC รีบลCางทันทีโดยใชCน้ำกับสบ-ู หรือผงซกั ฟอก พรอC มกบั ใชC
แปรงขัด ควรระวังอย-าใหCโลหะดCามแปรงขดู เคร่อื งแกCวจนเปนw รอย หรอื แตกรCาว และครงั้ สดุ ทCายจงึ ใชCน้ำกลน่ั
เล็กนอC ยลCางอกี ครง้ั หนงึ่ และลCางเฉพาะภายในเท-านนั้ หาC มใชผC Cาเชด็ ภายในเพอ่ื ใหแC หงC เพยี งแตว- างคว่ำไวCใหนC ้ำไหล
ออกไปเอง

- หลงั จากใชปC เ• ปwตดดู เลอื ด ซีรัม่ หรือ พลาสม-าแลCว ควรแช-ในน้ำแลCวลCางทนั ที ถCามีการอดุ ตนั ของเลือดใหC
แช-ใน 0.9% น้ำเกลอื แลวC ใชลC กู ยางดูดเอาน้ำเกลอื เขาC ออกจนเลอื ดทอี่ ดุ ตนั ออกไปหมด

- การลาC งปเ• ปwต ควรใชCลกู ยางดูดเอาน้ำเขCาออก อยา- ใชวC ธิ เี อาปเ• ปwตไปรองที่กอ| กนำ้ ใหCนำ้ ไหลผา- น จะไม-
สะอาดและสนิ้ เปลืองนำ้ ดCวย

- สารโปรตนี ทแี่ หงC ตดิ อย-ูมกั จะลCางออกดวC ยสารละลายดา- ง (โซเดยี มฮัยดรอกไซดเ? ขมC ขCน) ที่อนุ- ๆ (ไม-ใชC
กรดเขCมขนC ลCาง)

2. ระวังอยา- ใหสC ารเคมหี กบนโต|ะ พน้ื เครอื่ งชงั่ กลอC งจลุ ทศั น? หรอื เครอื่ งมอื อื่น ๆ หากเกดิ ข้ึนตCองรีบเช็ด
ใหสC ะอาดทันที

ง. อบุ ตั ิเหตุ และ การป…องกัน
1. การระวังไฟ
1.1 อเี ธอร? อะซีโตน แอลกอฮอล? ฯลฯ เปwนสารไวไฟ จงึ ตอC งพึงระวงั อย-าใหสC ารเหล-าน้อี ย-ใู กลเC ปลวไฟ ถาC

ตCองการระเหย ควรตงั้ ไวใC นท่ี ๆ มีลมโกรกหรอื ไมก- ต็ มC นำ้ ใหรC Cอนเสียก-อน ดบั ไฟ แลวC จึงคอ- ยเอานำ้ ยาเทลงแช-
1.2 หากเกดิ ไฟลุกขึ้น อย-าตกใจนเสียขวญั ตอC งรบี จดั การปอ… งกันมใิ หไC ฟลามไปท่อี ืน่ หากไฟลุกใน

หอC งทดลอง อย-าตกใจโยนหลอดทงิ้ จะทำใหไC ฟลามไปติดสงิ่ อน่ื ๆ เพียงแตถ- ือไวCเฉย ๆ ไมช- Cาไฟกจ็ ะดบั ถCาไฟลุกใน
ชามหรอื บีคเคอร? เอาแผน- กระดาษหรือโลหะปด• เสยี ไฟกจ็ ะดับเพราะไมม- อี ากาศ ขCอสำคัญคอื ระวงั อยา- ใหไC ฟแลบ
ติดเสอื้ ผาC ไดC

1.3 ควรสงั เกตตำแหนง- ทไี่ วCเครื่องดับเพลงิ เพ่อื จะไดCนำมาใชไC ดCทนั ที

2. สารเคมี
2.1 อยา- ใชCป•เปwตดดู กรด หรอื ด-างเขมC ขนC หรือสง่ิ ทเ่ี ปwนพษิ แรง ควรใชกC ระบอกตวงหรอื บเู ร็ตหรอื ไม-กต็ Cอง

ดูดดวC ยลูกบีบยาง
2.2 เม่ือตมC ของเหลวในหลอดทดลอง ใหCเขย-าตลอดเวลาเพ่ือกันน้ำยากระฉอกเนอ่ื งจากไดรC ับความรCอน

มากเกินไปในตำแหน-งเดียว อยา- หันหลอดเขาC ตวั หรอื หนั ไปทางผCูอื่น

4

2.3 เมื่อตอC งการดมกลิ่นแกส| ทเ่ี กดิ ขนึ้ จากน้ำยารอC นในหลอดทดลอง อย-าเอาหลอดทดลองไปรอทีจ่ มกู
โดยตรง เพราะในบางครัง้ น้ำยารCอนจัดอาจกระเดน็ เขCาตาและทำใหCตาบอดไดC ใหถC ือหลอดในระดับคางห-างจาก
หนCาพอสมควร หนั ปลายหลอดออกจากหนาC แลCวใชมC อื โบกควนั เขCาหาจมกู

3. การปฐมพยาบาล
3.1 หากกรดเขCมขCนถกู ผิวหนงั ควรลCางน้ำกอ- น แลวC ใชCสารแกCฤทธิ์กรดเพราะถCาใชCสารแกฤC ทธิ์ทนั ที

จะเกิดความรอC น เนื่องจากการ neutralize ระหว-างกรดกับสารแกCฤทธ์ิ ซงึ่ ทำใหCเปนw อันตรายตอ- ผิวหนงั ขนึ้ อีก สาร
แกฤC ทธิท์ ีใ่ ชCไดแC ก- 5% โซเดียมไบคารบ? อเนต หรอื 5% แอมโมเนยี มฮยั ดรอกไซด?

3.2 หากด-างเขCมขนC ถูกผิวหนงั ควรลาC งน้ำก-อน แลCวใชสC ารแกCฤทธิ์ดา- งคือ 5% กรดบอริค หรือ 5%
กรดอะซตี ิค

3.3 เมอ่ื ผวิ หนงั ถกู ความรอC นจัดลวก ใหทC าดวC ยกลเี ซอรอล หรอื วาสลิน
3.4 เมอ่ื กรด หรอื ด-างเขCาตา ใหCลCางตาดวC ยนำ้ มาก ๆ กอ- น แลวC ใชC 5% โซเดียมไบคาร?บอเนตลาC งตาเมอ่ื
ถกู กรด หรือใชC 5% กรดบอรคิ ลาC งตาเมอื่ ถูกดา- ง
3.5 เม่อื กรดแกเ- ขาC ปาก ใหลC CางปากดวC ยน้ำมาก ๆ และใชดC า- ง โซเดยี มฮัยดรอกไซด?ทเ่ี จอื จางมาก ๆ ลCาง
หรอื ใชC milk of magnesia
3.6 เมอื่ ดา- งแกเ- ขCาปาก ใหลC CางปากดCวยน้ำมาก ๆ และกรดออ- น เชน- 5% กรดอะซีติค

จ. การบันทึกผลการทดลอง
ใชCขCอความสนั้ ๆ เขCาใจงา- ย บันทกึ การเปล่ยี นแปลงท่มี องเห็นไดดC วC ยตาเปล-ากอ- น (เชน- การเกดิ สี ความ

ขนุ- ) แลวC จงึ แปลผลว-าสง่ิ ท่เี กดิ ขนึ้ นนั้ มคี วามหมายอยา- งไร
การบันทึกโดยแสดงเปwนตารางทำใหปC ระหยัดเวลาไดมC าก
ใหบC นั ทึกผลลงในสมุดบันทกึ ผลเลยทเี ดยี ว ไมใ- ช-จำไวC หรือ บนั ทึกในหวั ขอC ปฏบิ ัตกิ อ- นแลวC ไปลอกลงสมุด

อกี ครั้งหน่งึ วิธที ดี่ ีทสี่ ุดคอื เตรียมเขียนการทดลองหวั ขCอส้นั ๆ ไวใC นสมุดบันทกึ ลว- งหนาC และเวCนทไ่ี วสC ำหรบั บนั ทกึ
การเปล่ยี นแปลงทเ่ี กิดขึ้น

ฉ. ความสำคญั ของตวั เลข
1. ในการวัดอย-างแม-นยำ ตวั เลขท่ีไดCมาโดยการประมาณเปนw ตัวเลขท่ีมคี วามสำคัญ เชน- ในการอ-านบเู ร็ต

ที่มขี ีดแบง- 0.1 มล. เราอาจกะจำนวนระหว-างช-องไดC สมมตุ วิ -าถาC ระดบั นำ้ ยาอย-ูท่ขี ีดแบง- พอดีทเี่ ลข 0.8 นกั เรยี น
ตอC งรายงานเปนw 0.80 มล. เลข 0 หลังเลข 8 นีม้ คี วามสำคญั แตถ- าC อ-านไดCเลย 0.8 ซึ่งประมาณไดเC ปwน 0.83 มล.
ในทน่ี ีเ้ ลขทมี่ คี วามสำคญั คือเลข 3 ซึ่งเปนw การประมาณเพอื่ ใหCไดคC -าใกลเC คียงความเปwนจรงิ ทส่ี ดุ

2. การปดm ตัวเลขหลังทศนยิ มน้ันนิยมรายงานตัวเลขสำคญั ทาC ยหลังทศนยิ มใหCใกลเC คยี งกบั จำนวนเดิม เชน-
2.255 หรอื 2.264 อาจรายงานเปนw 2.26 ไดCทง้ั สองจำนวน ในกรณที เ่ี ลขทาC ยเปwน 5 เม่อื ตCองการปดm เศษใหดC ตู ัว
ที่นำหนCาเลข 5 น้ัน ถาC เปwนเลขคใู- หปC ดm เศษ 5 ท้ิงแตถ- Cาเปนw เลขคใ่ี หCปmดข้นึ เปนw จำนวนเตม็ แตถ- าC เลขทCายเกิน 5 ขึ้น
ไปก็ตCองปดm เศษใหกC บั ตวั เลขที่นำหนCาเสมอ

ยกตัวอยา- ง เช-น 36.25 เปนw 36.2 36.35 เปนw 36.4
36.26 เปwน 36.3 36.36 เปwน 36.4

5

3. การทจี่ ะรายงานเลขกหี่ ลกั หลงั ทศนิยมนั้น แลวC แต-ความเหมาะสม เช-น คา- เฉลย่ี ปกติของยูเรยี ใน
ปmสสาวะ 24 ชวั่ โมงเท-ากบั 15 ถึง 25 กรมั เม่ือคำนวณไดC 20.4343 กรัม จะรายงานเพียง 20.4 กรมั ก็ไดC ส-วน
กรดยรู ิค ค-าเฉล่ยี ปกติในเลอื ดเท-ากบั 0.0020 ถึง 0.0035 กรัม % เลขตำแหนง- ที่ 4 หลงั ทศนยิ มก็มคี วามสำคัญ
เพื่อความสะดวกในการเขียนหรอื ปอ… งกันความสบั สนเขานยิ มเปล่ยี นใหเC ปนw หนว- ยยอ- ยลงไปเปwนมลิ ลกิ รมั หรอื
ไมโครกรมั

6

บทท่ี 1

เครื่องแกวJ สำหรบั ปฏบิ ตั ิการชวี เคมีเบอ้ื งตJน

เครอื่ งมือและอุปกรณต? -างๆทใ่ี ชCอยใ-ู นหCองปฏบิ ัตกิ ารทางวทิ ยาศาตร?และทางการแพทย?มมี ากมายหลาย

ชนิด ส-วนใหญท- ี่นยิ มใชกC นั มกั ทำมาจากแกCว จงึ เรยี กช่อื เคร่ืองมอื และอปุ กรณ?เหลา- นี้วา- เครอ่ื งแกวC (Glassware)
เครอ่ื งแกCวมหี นาC ทห่ี ลกั 3 ประการคือ (1) เปนw ทสี่ ำหรับเกบ็ สาร (2) ใชวC ดั ปริมาตร และ (3) เปนw ท่ีเกิดปฏิกริ ิยาต-างๆ
เครื่องแกCวเหลา- นีท้ ำมาจากแกวC ทม่ี ีความทนทานทง้ั ต-อความรอC น แสงและการกดั กรอ- นของสารเคมตี า- งๆ จงึ เปนw

ที่นิยมใชCกนั อยา- งกวาC งขวาง ตวั อย-างเช-น เคร่ืองแกCวท่ที ำมาจากแกCวชนดิ Borosilicate และ Aluminosilicate
จะทนความรอC นสงู มาก เครื่องแกวC ที่ทำมาจากแกวC ชนดิ Low actinic จะชว- ยลดแสง จึงเหมาะสำหรบั ใสส- ารทไ่ี ว
ต-อแสงเช-น วติ ามินเอ เบตาC แคโรทนี หรอื เครอ่ื งแกวC ทท่ี ำมาจากแกCวชนดิ High silica เช-นหลอดคิวเวตทีใ่ ชกC บั

เครอ่ื ง Spectrophotometer และเทอรโ? มมเิ ตอร? ในปจm จบุ นั เครื่องพลาสติกไดCเขCามามบี ทบาทแทนเคร่ืองแกวC มาก
ข้นึ เนื่องจากมกี ารพฒั นาคณุ สมบัตขิ องพลาสติกใหทC นทานตอ- การกดั กร-อนจากกรดและดา- ง อกี ทงั้ พลาสติกยงั มี
คณุ สมบัตไิ ม-แตก และราคาถกู กว-าพลาสติกท่นี ยิ มใชC เชน- Polyethylene, Polypropylene, Teflon และ

Polyvinylchloride เปwนตนC ไมว- -าจะเปนw แกวC หรอื พลาสตกิ ชนดิ ใดก็ตาม ต-างก็มีคณุ สมบัติ และขอC จำกัดในการใชC
ที่แตกตา- งกนั ดังน้นั การศกึ ษาขCอมูลละเอียดจะชว- ยในการตัดสนิ ใจเลอื กซอื้ และเลอื กใชเC ครือ่ งแกCวไดอC ยา- ง
เหมาะสมกบั งาน และแหล-งขอC มลู ทดี่ ีทสี่ ดุ ก็คือบรษิ ทั ผผูC ลติ น่ันเอง

แมCว-าเครื่องแกCวจะมีมากมายและหลากหลาย แต-ก็มีเครื่องแกCวส-วนหนึ่งทีเ่ ปwนเครื่องมือพื้นฐานจำเปนw
สำหรับหอC งปฏิบตั ิการทั้งหลาย ไมว- -าจะเปwนหCองปฏิบตั กิ ารเคมี หCองปฏิบตั ิการชีวเคมหี รือหอC งปฏบิ ัติการเคมคี ลนิ กิ
กต็ ามโดยทัว่ ไปสามารถจดั กลม-ุ เครื่องแกวC ทีจ่ ำเปนw เหล-านีต้ ามลักษณะการใชCงานไดC 2 กลม-ุ ใหญๆ- คอื

- กล-มุ เครื่องแกCววดั ปรมิ าตร (Volumetric glassware)
- กลม-ุ เครอ่ื งแกCวใสน- ้ำยา (Non-volumetric glassware)
เคร่ืองแกวC เหลา- นแ้ี ต-ละชนดิ จะมลี ักษณะ ประโยชน? และวธิ กี ารใชCแตกตา- งกันไป ผCใู ชจC งึ ตCอง

ทำความรจCู ักกบั เครื่องแกCวเหลา- นี้กอ- นจึงจะสามารถเลอื กใชCไดเC หมาะสมกบั งานและความตCองการและสามารถ
ใชCไดอC ย-างถูกตCอง อันจะชว- ยลดความผิดพลาดทเ่ี กิดข้ึนไดC
นอกจากนีย้ ังมีเคร่ืองแกCวอ่ืนๆ และอุปกรณ?ที่ใชCร-วมที่จำเปwนตCองทำความรCูจักควบค-ูไปดCวยต-อไปน้ีเปนw

รายละเอยี ดของเครอื่ งแกวC ที่มใี ชCอยู-ทว่ั ไปในการทดลองหรือวเิ คราะห?ทางชีวเคมีเบอ้ื งตนC

กลุ-มเคร่อื งแกวC วัดปรมิ าตร (Volumetric glassware)
เปนw กลุม- เครอ่ื งแกCวที่ใชCสำหรบั วดั ปริมาตรของเหลว ทัง้ การวดั ปรมิ าตรแบบธรรมดา และการวัดปรมิ าตร

แบบทมี่ คี วามถกู ตCองแมน- ยำสงู การออกแบบการใชCงานเครอ่ื งแกวC วดั ปริมาตรนี้แบง- เปนw 2 วธิ ดี งั น้ี
1. TC (to contain) หรอื แบบทีใ่ ชรC บั เปนw เคร่อื งมือแบบที่ใชวC ดั ปรมิ าตรของเหลวทบ่ี รรจอุ ย-ู

ภายในภาชนะนั้น ๆ เมอื่ ถา- ยเทของเหลวไปสูภ- าชนะอ่นื จะไดCปรมิ าตรนCอยกว-าปริมาตรท่รี ะบุไวC
2. TD (to deliver) หรือแบบทใี่ ชสC ง- เปwนเคร่ืองมือแบบทใี่ ชวC ัดปรมิ าตรของเหลวทตี่ อC งการ

ถา- ยเทไปสู-ภาชนะอื่น เมอื่ ถ-ายเทของเหลวหมดจะไดปC รมิ าตรเท-าที่กำหนดไวC

7

เครอ่ื งแกCววดั ปริมาตรทใ่ี ชจC ะออกแบบไวCเปนw แบบใด ผูใC ชสC ามารถดูไดจC ากเครือ่ งหมายหรอื ตัวอกั ษรทที่ าง
บริษัทผCผู ลิตทำกำกับไวC เชน- “TC” หรือ “TD”

วิธีการอ-านปรมิ าตร
ในการวัดปริมาตรของเหลวทีถ่ กู ตCอง นอกจากการเลอื กใชCเครื่องแกCวที่เหมาะสมแลCว ยังตCองรูCจกั วิธกี าร
อ-านปริมาตรอย-างถูกตCองดCวย วิธีการอ-านปริมาตรเริ่มจากการหาตำแหน-ง meniscus ของของเหลวก-อน
(meniscus คือผิวหนCาของของเหลว มีลักษณะเปwนเสCนโคCง) แลCวจึงอ-านปริมาตรตามปกติสำหรับของเหลวใส
ตำแหนง- ท่ีตอC งอา- นคือท่ีกนC ท่ีลึกที่สดุ ของเสนC โคงC ของของเหลว หากเปwนของเหลวมสี ีทบึ แสง เชน- เลือด หรือปรอท
ตCองอา- นทย่ี อดของเสCนโคงC ในขณะอ-านปริมาตร ระดับสายตาจุด meniscus และขดี บอกปรมิ าตรบนเครื่องแกCว
จะตCองอยู-ในระดับเดียวกัน ขCอควรระวังในการอ-านปริมาตร คือ ไม-ควรอ-านปริมาตรของเหลวในขณะที่มี
ฟองอากาศปะปนอยค-ู วรรอใหCฟองอากาศหมดเสียก-อน
เครอื่ งแกวC ทีใ่ ชสC ำหรบั วัดปรมิ าตรของเหลว ไดCแก-
1) กระบอกตวง (Graduated cylinders)
2) ขวดวดั ปริมาตร (Volumetric flasks)
3) ป•เปตw (Pipets)
4) บวิ เร็ต (Burets)

กระบอกตวง (Graduated cylinders)
ลักษณะ

เปนw ภาชนะทำดCวยแกวC หรอื พลาสตกิ ทรงกระบอกยาวตงั้ ขนึ้ และมฐี าน
เปนw วงกลมหรอื เปนw รูปแปดเหลี่ยม ดาC นขCางของทรงกระบอกมขี ีดบอกปรมิ าตรท่ี
แบง- เปwนขีดย-อยบอกปรมิ าตรไวCอยา- งสม่ำเสมอตลอดทง้ั แทง- กระบอกตวงเปนw
เคร่ืองมือวดั ปริมาตรทั้งแบบ TC และ TD ถCาเปwนแบบ TC ใชCวัดปริมาตร
ของเหลวทบี่ รรจุอย-ูภายในกระบอกตวง และถCาเปwนแบบ TD ใชวC ัดปรมิ าตร
ของเหลวทจี่ ะถ-ายเทไปส-ูภาชนะอน่ื กล-าวคอื เมอ่ื เตมิ ของเหลวจนเตม็ กระบอก
ตวงถงึ ขดี บอกปรมิ าตรบนสดุ แลCวเทสารละลายจากกระบอกตวงไปส-ภู าชนะอื่น
ปริมาตรของเหลวทถี่ -ายเทออกไปสามารถวดั ไดCจากกระบอกตวงแบบ TD
กระบอกตวงมหี ลายขนาดต้งั แต- 5 ถงึ 2,000 มลิ ลลิ ติ ร สามารถเลอื กขนาดของ
กระบอกตวงไดตC ามปริมาตรที่ใชC

การใชปC ระโยชน?
กระบอกตวงเปนw เคร่ืองมอื สำหรับใชCวดั ปริมาตรของเหลวแบบธรรมดาท่ไี ม-ตCองการความถกู ตCองสูง จึงไม-

เหมาะสำหรับการวิเคราะห?เชงิ ปริมาณ (quantitative analysis) สามารถวัดปรมิ าตร
และถา- ยเทของเหลว ปริมาตรเทา- ไรกไ็ ดCจนถึงปริมาตรสงู สุดที่ระบไุ วCทกี่ ระบอกตวงแต-ละอนั

8

ขCอควรระวงั
กระบอกตวงหาC มถูกความรCอน เช-นนำไปตมC หรือเผา เพราะจะแตกเมื่อถูกความรอC น เน่อื งจากทำมาจาก

แกวC หนา

ขวดวัดปริมาตร (Volumetric flasks)
ลักษณะ

เปwนขวดทรงกลม โดยเปwนกระเปาะกลมทสี่ ว- นล-างและกนC เรียบ มคี อ
ยาว มีจกุ ป•ด และที่คอขวดมขี ดี บอกปรมิ าตรทจี่ ุตามทร่ี ะบุไวC ณ อณุ หภมู ทิ ี่
กำหนด เปwนเครอ่ื งมอื วดั ปรมิ าตรแบบ TC กล-าวคอื เมอ่ื เตมิ สารละลายถงึ ขดี ที่
กำหนด จะไดปC รมิ าตรตามทรี่ ะบุไวC หากถา- ยเทสารละลายภายในไปสู-ภาชนะ
อ่นื จะไดCปริมาตรไมเ- ทา- กบั ทร่ี ะบุไวC ขวดวัดปริมาตรท่ใี ชอC ยใู- นปmจจบุ ันมหี ลาย
ขนาดตงั้ แต- 1 จนถึง 4,000 มลิ ลลิ ิตร

การใชปC ระโยชน?
ใชใC นการเตรยี มนำ้ ยาทต่ี อC งการความเขCมขนC ที่แนน- อน มคี วามถูกตCองแม-นยำสงู

มาก เชน- สารละลายมาตรฐาน หรือการเจอื จางสารละลาย
วิธกี ารใชC

1. ใส-สารทีต่ Cองการละลายหรอื เจือจางลงในขวดวัดปรมิ าตร
2. เติมน้ำหรือตัวทำละลายลงไปประมาณ 2/3 ของขวดวัดปรมิ าตร อยา- ใหCถึงขีดบอกปรมิ าตร
3. หากเปนw ของแข็งตอC งใหลC ะลายใหหC มดก-อน แลวC จึงเตมิ น้ำหรอื ตัวทำละลายจนถงึ ขดี บอก

ปริมาตร โดยเม่ือใกลCถงึ ขดี บอกปรมิ าตรใหเC ติมดCวย pasteur pipet หรือ dropper ทลี ะหยด
จนกระทั่งกนC ของจุด meniscus ของสารละลายอยใู- นระดบั พอดีกับขดี บอกปรมิ าตร ระวงั อยา- ใหมC นี ้ำ
หรอื สารละลายคCางอยู-ท่คี อขวดบริเวณเหนือขีดบอกปรมิ าตร เพราะจะทำใหCปรมิ าตรสารละลายทีไ่ ดC
ผดิ ไปจากทร่ี ะบุไวC
4. ป•ดจกุ ขวดวดั ปรมิ าตร
5. ผสมสารละลายใหเC ปwนเนอ้ื เดยี วกัน โดยควำ่ ขวดวดั ปริมาตรกลบั ไปมาหลายๆ ครง้ั พรอC มๆ
กบั เขย-า เมอื่ สารละลายเขCากันดแี ลวC จึงถา- ยเทสารละลายใสใ- นขวดอืน่ เชน- ขวดเกบ็ น้ำยา
เพอ่ื นำไปใชCต-อไป อยา- เกบ็ สารละลายไวCในขวดวัดปรมิ าตร

ขCอหCาม
1. อยา- คว่ำขวดวดั ปริมาตรจนกว-าจะเตมิ น้ำหรอื สารละลายจนถึงขีดบอกปรมิ าตรที่กำหนด
2. อยา- ตCมนำ้ ยาในขวดวัดปริมาตร
3. ไม-ควรใชขC วดวดั ปริมาตรเกบ็ สารละลาย

9

ปเ• ปwต (Pipets)
ลกั ษณะ

ป•เปwตมีลกั ษณะเปwนทอ- แกวC กลวงยาว ปลายเปด• ทัง้ สองดาC น มขี ีดบอกปริมาตร เปwนเคร่ืองมือวัดปริมาตร
ทงั้ แบบ TC และ TD ซึ่งสามารถสงั เกตไดจC ากตวั อกั ษรทก่ี ำกับไวCทสี่ ว- นปลายดาC นบนของปเ• ปwตแตล- ะอัน เรา
สามารถแบ-งปเ• ปตw ตามลักษณะการใชCงานไดเC ปนw 3 แบบดงั น้ี

- ป•เปตw แบบ TC จะบรรจุของเหลวไดตC ามปรมิ าตรทก่ี ำหนด เมือ่ จะถา- ยเทของเหลวใหCไดCตามปรมิ าตรที่
กำหนด จะตอC งดูดน้ำเขาC ไปลCางสว- นทเี่ หลอื คCางตดิ อย-ใู นป•เปตw ออกมาจงึ จะไดCปรมิ าตรครบ เชน-
micropipets

- ปเ• ปwตแบบ TD จะถา- ยเทของเหลวไดCตามปริมาตรที่กำหนดดCวยวธิ แี ตะปล*อย โดยอาศยั แรงโนมC ถว- ง
กล-าวคือเมอ่ื ของเหลวไหลออกจากป•เปwตจนเกือบหมดแลCว ตอC งแตะปลายปเ• ปตw ไวขC าC งภาชนะรองรบั ทง้ิ
ไวเC ปนw เวลา 15 วินาที เพอื่ ใหขC องเหลวทเี่ หลือคาC งอยใู- นปเ• ปwตไหลลงส-ภู าชนะรองรบั ไดหC มด เชน-
volumetric pipets

- ปเ• ปwตแบบ TD/blow out จะถา- ยเทของเหลวไดCตามปรมิ าตรทก่ี ำหนดดCวยวธิ ีแตะเปา. โดยเมื่อของ
เหลวไหลออกจากปเ• ปwตจนเกือบหมดแลวC ตอC งแตะปลายปเ• ปwตไวCขCางภาชนะรองรับนานประมาณ 15
วนิ าที เมอ่ื ครบกำหนดแลCวตอC งเป•าลมเขาC ไปไลข- องเหลวท่ีคาC งอยู-ภายในปเ• ปตw ออกมาอีกดวC ยโดยเปา• ลม
ส้นั ๆ ครั้งเดียว ปเ• ปตw แบบนจ้ี ะมแี ถบฝ…าทบึ เปwนวงซอC นกนั 2 วงตรงปลายดCานบนของป•เปตw เช-น
Ostwald-Folin pipets

การใชปC ระโยชน?
ใชวC ดั ปรมิ าตรของเหลวท่มี คี วามถกู ตอC งแมน- ยำสงู มาก

วธิ ีการใชC
ป•เปตw ทกุ ชนดิ (ยกเวนC automatic pipets) เรยี กว-าเปwน manual pipets หมายถึงกลไกการดูดและ

ถา- ยเทของเหลวเขาC ออกจากปเ• ปตw จะใชCแรงดนั จากอากาศภายนอกปเ• ปตw ดังน้ันในการใชCปเ• ปตw พวกนจี้ ะตCองใชC
ควบคู-กบั ลูกยาง (rubber bulb) ซึ่งมหี ลายแบบใหCเลือก ขนั้ ตอนการใชปC เ• ปตw มีดังน้ี

1. ลาC งปเ• ปwตดCวยของเหลวทจ่ี ะใชเC ลก็ นCอย ขน้ั น้สี ำคัญมากหากปเ• ปwตทนี่ ำมาใชCไม-แหCงสนทิ
2. บบี ลมออกจากลกู ยางคCางไวC แลCวสวมลูกยางเขCาทางปลายบนของปเ• ปตw หาC มใชCปากดดู ปเ• ปตw

เดด็ ขาด
3. จุ-มปลายป•เปตw ลงในของเหลวทตี่ อC งการดดู ขน้ึ มาโดยปเ• ปตw ตอC งตั้งตรงในแนวดิง่
4. คอ- ยๆ ผ-อนลูกยาง อากาศจะดันของเหลวเขาC ไปในปเ• ปตw ทำเชน- นี้จนกระทงั่ ของเหลวข้ึนมาสูงเหนอื

ขีดบอกปรมิ าตร
5. ปลดลูกยางออกจากปเ• ปwต พรอC มๆ กับใชนC ิ้วชปี้ ด• ท่ีปลายบนของปเ• ปwต
6. เผยอน้ิวชเ้ี ล็กนCอย เพอ่ื ปลอ- ยใหCของเหลวไหลออกจนกระทง่ั จุด meniscus ของของเหลวพอดกี บั ขดี

บอกปรมิ าตรของปเ• ปwตเมือ่ อยใ-ู นระดบั สายตา วธิ กี ารน้ีเปนw การควบคมุ การไหลของของเหลวใหลC ดลง
จนไดCปรมิ าตรท่ีตอC งการ
7. อา- นปริมาตรทีต่ Cองการ โดยตง้ั ปเ• ปwตใหCตรงในแนวด่งิ



































27

ประจุมากข้ึน อิออนของเกลอื ท่ีมากเกินไป จะไปแยง- โมเลกุลของน้ำจากโปรตีนทำใหมC นี ำ้ จับอยู-กบั โปรตีนนอC ยลง
โปรตนี จึงตกตะกอนโดยโปรตนี ทมี่ ขี นาดใหญ-จะตกลงมากอ- น เรยี กปรากฎการณ?นว้ี า- salting-out effect แต-ถCา
เอาเกลอื ทมี่ ากเกนิ ไปออกจากสารละลายจะไดCโปรตีนกลบั มาคงสภาพเดมิ แต-ถCาสารละลายเกลอื ทม่ี คี วามเขCมขนC ตำ่
( 0-0.1 M) ออิ อนของเกลอื จะไปลอC มรอบกรดอะมิโนท่ีมีประจแุ ละมโี มเลกุลของน้ำตามมาดCว ทำใหโC ปรตีนละลาย
น้ำไดCดขี ้นึ เรยี กปรากฎการณน? ้ีว-า salting-in effect
วธิ ีทำ ผสมสารละลายไข-ขาว 5 มล.กบั แอมโมเนีย ซัลเฟต อ่มิ ตวั 5 มล. โดยไม-เขย-า โกลบลู ิน(Globulin)

จะตกตะกอนลงมา ตง้ั ทิ้งไวCสักคร-ใู หCตะกอนละเอยี ดรวมตัวกันเปwนกล-ุมใหญข- ้ึน และเหน็ นำ้ ยา
เริ่มใส ใหนC ำมากรอง แลวC เตมิ ผลกึ แอมโมเนยี ม ซลั เฟต ลงในน้ำกรองทลี ะนอC ย จนไดCนำ้ ละลาย
อ่มิ ตวั ตง้ั ทง้ิ ไวC แอลบมู ิน (Albumin) จะตกตะกอน วิธนี ี้จะสามารถแยก แอลบมู นิ กบั โกลบลู นิ
ในพลาสม-าไดC

ค. การแข็งเปนw ล่ิมเพราะความรCอน โปรตนี เมื่อไดรC บั ความรCอน จะเกดิ การแข็งเปนw ล่ิม เน่อื งจาก
โครงสราC งเดิม (native form) ถูกทำลาย โดยความรCอนจะทำลายพันธะไฮโดรเจนและแรงยึดเหนยี่ วระหวา- งหม-ทู ไี่ ม-มี
ข้ัวทำใหโC ปรตนี จบั กันตกตะกอนขาว เสียสภาพอยา- งถาวร
วธิ ที ำ ใส-สารละลายไข-ขาว 2 มล.ในหลอดแกวC เตมิ กรดอะซตี คิ เจือจาง 2-3 หยด แลวC ทำใหCรอC นชาC ๆ จะ

ไดCตะกอนสขี าว ( การเติมกรดจะชว- ยใหCโปรตีนตกตะกอนไดงC -ายขนึ้ และยงั มีประโยชน?ในการ
กำจดั ผลบวกเทจ็ จากเกลือบางอย-าง เช-น ฟอสเฟต คาร?บอเนต และ ไบคารบ? อเนต ซึ่งสามารถ
ตกตะกอนไดดC CวยความรอC น แตจ- ะละลายในกรด)

ง. จุดไฟฟ…าเสมอ (Isoelectric point) "จุดไฟฟ…าเสมอ" คือ pH ของน้ำยาที่ทำใหCอนุภาคของโปรตีนมี
ประจุสุทธิ = 0 โปรตีนจะละลายไดCนCอยทีส่ ุด และพรCอมทีจ่ ะตกตะกอน เรียก pH ที่จุดนี้ว-า pI การละลายของ
โปรตีนขึ้นกับความเปwนกรดด-างของสารละลายโดยที่ pI โปรตีนจะมีแรงผลักดันกันนCอยที่สุด และมักจับกัน
ส-งเสรมิ ใหเC กิดการตกตะกอน ลักษณะทเ่ี หน็ ไดคC ือสารละลายมีความขุน- มากโดยไม-มีตะกอน ถCามกี ารเปลี่ยนแปลง
ทางกายภาพเพยี งเล็กนCอยเชน- เขย-าแรงๆ ก็จะทำใหโC ปรตนี ตกตะกอนทนั ที

วิธีทำ เตรียมหลอดแกวC 5 หลอด ใสส- ารละลาย ทมี่ ี pH 4.90, 4.70, 4.55 , 4.30 และ 4.10 หลอดละ
9 มล. แลCวเตมิ 0.5% เคซีน ใน 0.1N โซเดยี มอะซเี ตต หลอดละ 1.0 มล. รบี ผสมโดยคว่ำหลอด
คร้ังเดยี ว ตงั้ ทง้ิ ไวโC ดยไมก- ระทบกระเทือนหลอดอีก
ตรวจดูความข-นุ และตะกอนในเวลาตา- ง ๆ กัน โดยตรวจดทู ันท,ี เมือ่ ครบ 10 นาที และเม่อื ครบ

30 นาที บันทึกความขุ-นมากนCอยดCวยจำนวนเครื่องหมายบวก และปริมาณตะกอนมากนCอยดCวยจำนวน
เครอื่ งหมายคูณ ถCายงั คงใสอยใู- หใC ชเC ครอื่ งหมายลบ (+ , x , -)

28

รายงานผลการทดลองท่ี 2
เรือ่ ง โปรตีน

ชื่อ………………………………………..…………………….เลขท่ี……………วันที่.................
ชือ่ ………………………………………………………………เลขท…่ี …………
ชอ่ื ………………………………………………………………เลขท…่ี …………

จุดมง#ุ หมาย…………………………………..………………….…………………………………..……………….………………………….
…………………………………………..………………………………………………………….………………………………………………..
ผลการทดลองท่ี 2.1 การทดสอบคุณสมบัตทิ างเคมขี องโปรตีน (อธิบายผลทีเ่ กิดขน้ึ ลักษณะ สี ปรมิ าณ)

วธิ ที ดสอบ ผลการทดลอง
Ninhydrin Test

Biuret Test

Sakaguchi Test

Xanthoproteic Test

Millon Test

สรุปผลและวจิ ารณ…: ………………………………………..……………………….…………………………………….…………………
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..

ผลการทดลองท่ี 2.2 คุณสมบตั ทิ างกายภาพของโปรตนี 29

ก. การตกตะกอน (อธิบายลักษณะตะกอน สี ปรมิ าณ) 10%TCA 2% Tannic acid

Sample Sat.HgCl2 Sat.Picric acid
น้ำละลายไขข# าว

ข. การแยกออกดวJ ยเกลอื
ผลของการใชJแอมโมเนียมซัลเฟต ตกตะกอนโปรตนี ในนำ้ ละลายไขข# าว
ผลการทดลอง..………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
ค. การแขง็ เป•นลิ่มเพราะความรอJ น
ผลการทดลอง.........................……………………….…………………………………………………………………….…………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
ง. จดุ ไฟฟา‘ เสมอ (ใสเ# คร่อื งหมาย +, ++, 0)

หลอดท่ี 1 2 3 4 5
pH 4.90 4.70 4.54 4.30 4.10

ทนั ทีท่เี ติมเคซนี
ครบ 10 นาที
ครบ 30 นาที

Isoelectric point ของเคซนี อยูท# ่ี pH ……….…เพราะ…………………………………………..………………………………
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..

สรุปผลและวิจารณ:…………………………………………..…………………….………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..
…………………………………..……………………….…………………………………………………………………………………………..

30

บทที่ 3

Quantitative analysis (Spectrophotometry)

การวัดการดูดแสงโดยหลกั การของ spectrophotometry
การวดั คณุ สมบัตกิ ารดดู แสง (absorbance) ของสารในสารละลาย เปนw วธิ ที ่ใี ชCมากทางชีวเคมีมีประโยชน?

ในการศกึ ษาหาปริมาณความเขCมขCน (quantitative analysis) และคณุ ลกั ษณะ (qualitative analysis) ของสาร
(solute) ในสารละลายนัน้ โดยอาศยั หลักทางฟส• กิ ส?ของแสง คอื สารทีม่ มี วลทกุ ชนดิ สามารถดูดแสงไดใC นชว- งความ
ยาวคลืน่ แสง (wavelength) ต-าง ๆ กนั ตามคณุ ลกั ษณะจำเพาะของสารนนั้ ๆ การหาปรมิ าณสารประกอบใน
เลอื ดและปสm สาวะ เชน- หาปริมาณกลูโคสในเลือด เราอาจนำกลโู คสมาทำปฏกิ ิรยิ าใหเC กดิ สเี พ่ือวดั ความสามารถ
ในการดดู แสงของสที เ่ี กดิ ขึน้

ในทางฟ•สกิ ส? แสงแบ-งออกเปนw ช-วง ๆ ตามความยาวคล่นื ของแสง ซง่ึ มีหน-วยนาโนเมตร (nanometre,
nm) เชน- แสงในชว- งวิสิเบลิ (visible) จะมคี วามยาวคล่ืนของแสงอยใู- นช-วงตง้ั แต- 400-700nm ปกตเิ ปนw แสงสขี าว
เกดิ จากการรวมของแสง spectrum 7 สี แสงในช-วงอลั ตราC ไวโอเล็ต (ultraviolet, UV) จะมีความยาวคลนื่ ชว- ง
< 380 nm

ถาC เราทำสารอย-างหนงึ่ ใหCมสี ี เชน- โปรตนี ทำปฏิกิริยากบั นำ้ ยาอย-างหนงึ่ ไดสC ีข้นึ มา สารละลายทมี่ สี ีนจี้ ะดูด
แสงในช-วง visible ความเขCมของสบี อกถงึ ความเขมC ขCนของสารที่มอี ยูใ- นสารละลายนัน้ ไดCการหาปรมิ าณสีนี้ เรยี กวา-
“colorimetric analysis”

การทเ่ี ราเหน็ สารละลายท่มี สี นี ้ำเงิน เกิดจากการทสี่ ารน้นั ดดู สีในชว- งความยาวคลืน่ อื่น ๆ ไวนC อกจากสีนำ้
เงนิ ของตนเอง ดงั น้นั ชว- งคลนื่ ของสีน้ำเงินก็ผา- นสารละลายมาสตู- าเราไดC ปริมาณของแสงในช-วงความยาวคลนื่ ท่ถี กู
ดดู ไวCมคี วามสมั พนั ธ?โดยตรงกบั ความเขCมขนC ของสารท่ีดดู สนี น้ั สารทมี่ คี วามเขมC ขนC มากจะเกิดสเี ขมC มาก และดูดแสง
เอาไวCมาก สีของสารละลายทเ่ี กิดข้นึ แต-ละสีจะดูดแสงทีค่ วามยาวคลื่นต-างกัน เราสามารถหาปรมิ าณของสารท่ไี ม-มี
สไี ดC ถาC สารนนั้ ดดู แสงไดทC ช่ี -วง UV ซง่ึ ขึน้ อย-ูกบั คณุ ลักษณะเฉพาะของสารชนิดน้ัน ๆ

วิธกี ารวเิ คราะหห? าปรมิ าณสารทอี่ าศยั หลกั วัดการดูดแสง (absorption photometry) ของสารทค่ี วาม
ยาวคล่นื ใดความยาวคลน่ื หน่ึงของ spectrum เรยี กวา- “photometric procedures” เครือ่ งมอื ทีใ่ ชวC ดั การดดู แสง
คือ spectrophotometer เปwนเครอื่ งชนดิ ทว่ี ดั ไดCในช-วงคลืน่ แสง UV และ visible เราเรยี กว-า “UV-visible
spectrophotometer”

หลอดแกCวมาตรฐานสำหรบั ใสส- ารละลายท่ใี ชCวัดหาความเขมC ขนC นัน้ เรียกว-า cuvet ซง่ึ มี 2 ลักษณะคือ
เปwนหลอดหนCาตดั สเี่ หลยี่ มจตั ุรสั หรอื เปwนหลอดกลมคลCายหลอดทดลองธรรมดา แตท- ำดCวยแกCวทม่ี ีคุณสมบตั พิ เิ ศษ
มีขนาดเสCนผ-าศูนย?กลางตา- งกนั ซ่งึ จะเปwนระยะทางทแี่ สงจะตCองผ-านสารละลายในนน้ั เราเรียกระยะทางนวี้ -า
“ทางเดนิ ของแสง” (length of light path, l)

31

ถCาใชCแสงทีม่ คี วามเขCม Io ผ-าน cuvet ท่ใี สส- ารทดี่ ูดสี ความเขCมของแสงทีอ่ อกมาจะลดลง เปนw สัดสว- น
กับระยะทางทแ่ี สงผา- น cuvet (l) นน่ั คอื ปริมาณแสงทีถ่ ูกดดู โดยสารนนั้ จะแปรตามคา- l

กฎของ Lambert
log Io/I = kl k = ค-าคงท่ี
Io = ความเขCมของแสงกอ- นผ-าน
I = ความเขCมของแสงภายหลงั ผา- น

ถาC แสงที่ความยาวคล่ืนเดยี วกนั นี้ ผ-านสารละลายทมี่ คี วามเขCมขCน C ปรมิ าณแสงที่ถกู ดูดก็จะแปรตามความเขCมขนC
ของสารนน่ั เอง

กฎของ Beer
log Io/I = k1C k1 = คา- คงที่

log Io/I หมายถงึ absorbance ( A ) คือ การดูดแสงหรอื optical density (O.D.)
จากการรวมกฎของ Lambert & Beer ไดวC า- O.D. = KlC (K เปนw ค-าคงที่ซง่ึ ขน้ึ อย-ูกบั ชนิดของสารทด่ี ูด
แสง และ ความยาวคลื่นของแสงน้ัน กล-าวคือ ถาC เปนw สารชนิดเดยี วกนั และใหดC ูดแสงที่ความยาวคลื่นเดยี วกนั ค-า
K จะเท-ากัน)
ถาC ดใู นอีกมมุ หนง่ึ ปรมิ าณแสงทผ่ี -านออกมาจากสารละลายหลังจากทบี่ างสว- นถูกดูดไวC เราเรยี ก
“transmittance” (T)

T = I/Io
หรอื 1/T = Io/I

ดังน้นั ค-า T ปกติ < 1 เสมอ แตน- ยิ มคดิ เปนw % เรียกว-า % T
เพราะฉะนนั้ % T = I/Io x 100

ถาC เปwนน้ำกลนั่ หรอื นำ้ ยา blank (ไม-มสี ารดูดส)ี อยูใ- น cuvet เราสามารถตงั้ คา- I = Io นน่ั คือต้ังคา- ใหแC สง
ผา- นออกมาไดCหมด 100 % T เพอ่ื ความสะดวกในการวัดสารอื่นๆ

จาก log Io/I = O.D.

นน่ั คือ log 1/T = O.D.
- log T = O.D.
จาก log Io/I = O.D.

เราไดวC -า 100/% T = Io/I และ log 100/% T = log Io/I
น่ันคือ log 100/% T = O.D. หรอื log 100 - log % T = O.D.

บน scale ของ spectrophotometer จะอา- นคา- ไดCทัง้ O.D. และ % T

จากสมการ O.D. = KlC น้ี ถาC เราใชC cuvet ขนาดเดียวกนั วดั สารละลายชนิดเดยี วกนั แลCว เราจะไดCคา- l
และ K คงท่ี ดังนัน้ O.D. a C ค-าเดียว

32

scale ของ O.D. มีค-าต้ังแต- 0 ถงึ 2
scale ของ % T มคี า- ตงั้ แต- 0 ถงึ 100

จากการทเ่ี ราอา- น O.D. ของ standard solution ทรี่ Cคู วามเขCมขCนของสาร (C) แลวC เราสามารถหาความ
เขมC ขนC ของ unknown ทีเ่ ปwนสารชนิดเดียวกนั กบั standard ไดโC ดยการอา- น O.D. ของ unknown solution นั้น
และคำนวณจากสมการ

O.D.unk /O.D.std = Cunk / Cstd
C unk = O.D.unk x Cstd / O.D.std

ทง้ั น้ี standard และ unknown ตอC งเปwนสารประเภทเดียวกัน ใชC cuvet อย-างเดียวกัน ทำไปพรอC ม ๆ
กนั ดCวยวิธกี ารภายในสภาวะ (condition) เดยี วกัน และอ-านค-าจากเครอื่ งเดยี วกนั ดCวย

การคำนวณ
ในทางปฏบิ ัตเิ มือ่ เราตCองการหาความเขCมขCน (initial concentration) ของสารใดสารหนง่ึ สารนนั้ อาจจะ

ตCองผา- นกรรมวิธีหลายขนั้ ตอน เช-น การสกัด การทำปฏิกรยิ าทางเคมใี หเC กดิ สี หรอื เปลี่ยนเปนw สารอืน่ กอ- นที่จะ
นำมาวัดโดยหลกั การของ spectrophotometry ซึง่ ขั้นตอนเหลา- น้ีจะทำใหCความเขมC ขนC ของสารเปลย่ี นแปลงไป
จากเดิม ดังนั้นหลงั จากทีเ่ ราคำนวณความเขCมขCนขัน้ สุดทCาย (final concentration) ของสารนจี้ ากสมการที่
ดดั แปลงจาก Beer's law แลวC การคำนวณกลบั ไปสค-ู วามเขCมขCนเดิม (initial concentration) ของสารก-อนผ-าน
กรรมวธิ หี ลายๆ ขั้นตอนน้ีจงึ มีความสำคัญอย-างยง่ิ ในวธิ ีปริมาณวเิ คราะห?

การคำนวณสามารถแบง- ออกไดCเปนw 2 วธิ ี คอื วธิ ีบัญญัติไตรยางค? และ วิธี dilution factor

Dilution factor หมายถึง ตวั คณู ในการเจอื จาง มสี ตู รดังน้ี
dilution factor = final volume / initial volume
หรอื = initial concentration / final concentration

ตวั อย-างเชน- ถCาเรานำสารละลายทม่ี ีความเขCมขนC ของเกลอื NaCl 10 มก./มล.มา 1 มล. แลวC เติมนำ้ 9 มล.
หมายความวา- เราเจอื จางนำ้ เกลอื 10 เทา- นั่นคอื คา- dilution factor เทา- กบั 10 นัน่ เอง และเมื่อเราเจอื จางนำ้ เกลือ
10 เทา- ความเขมC ขนC ของ NaCl กจ็ ะนอC ยลง 10 เทา- ดCวย คือ มคี -าเท-ากับ 1 มก./มล. ทั้งสองวิธีนี้อาศยั หลกั การ
เดยี วกนั คอื Beer's law เพ่ือคำนวณหาความเขCมขนC สุดทาC ย (final concentration) ของสารจากสมการของ
Beer แลวC คำนวณยอC นกลับไปเปนw ความเขมC ขนC เดมิ (initial concentration) กอ- นเจอื จาง

33

ตวั อย-าง
ในการทดลองเพอ่ื หาความเขมC ขนC ของโปรตนี รวมในซรี ่ัมของผCปู ว• ยรายหน่ึง มีข้ันตอนดงั น้ี
1. นำซรี ม่ั ของผปCู ว• ย 0.2 มล. มาผสมกับ 0.9 % NaCl 10.0 มล.
2. แบง- ซรี ั่มเจอื จางแลวC น้ี 5.0 มล. ผสมกบั 0.9 % NaCl 5.0 มล. และน้ำยา biuret 10.0 มล.
3. วัด O.D.555 nm ไดC 0.34
4. นำน้ำยามาตรฐาน ท่ีมีโปรตีน 2.8 มก./มล. มา 0.5 มล. ผสมกับ 0.9 % NaCl 4.5 มล. และ
นำ้ ยา biuret 5.0 มล.
5. วัด O.D.555 nm ไดC 0.15
6. จงคำนวณหาโปรตีนรวมในซรี มั่ ผปCู •วยรายนเ้ี ปนw มก./ดล.

ข้นั ตอนในการเจอื จาง สามารถเขียนเปนw แผนผังไดC ดังนี้
Unknown
0.2 มล.ซรี ่มั + 10.0 มล.NaCl--->10.2 มล.

5.0 มล.+ 5.0 มล. NaCl + 10.0 มล. Biuret

¯

20.0 มล.(O.D.555 = 0.34)

Standard
0.5 มล. standard + 4.5 มล. NaCl + 5.0 มล. Biuret ---> 10.0 มล.
(2.8 มก./มล.) (O.D.555 = 0.15)

การคำนวณวิธบี ญั ญัติไตรยางศ?

น้ำยาโปรตีนมาตรฐานมคี วามเขมC ขCน = 2.8 มก./มล.

\0.5 มล. ท่ใี ชมC ีปรมิ าณโปรตนี = 2.8x0.5/1= 1.4 มก.

\ความเขCมขCนเมอื่ วัด O.D.555 nm (final Cstd ) = 1.4 / 10 มก./มล.
= 0.14 มก./มล.

จาก Beer’s law O.D.unk / O.D.std = C unk / Cstd
แทนคา- 0.34 X 0.14 / 0.15 = 0.317 มก./มล.

\ใน 20.0 มล. หลังทำปฎิกริ ิยา biuret มปี รมิ าณโปรตนี = 0.317 x 20

ซ่ึงมาจาก ซีรม่ั เจอื จางแลวC 5.0 มล. = 6.347 มก.

\ใน 10.2 มล. ซรี ัม่ เจอื จางแลCวมีโปรตีน = 6.347 x 10.2 / 5 = 12.947 มก.

ซง่ึ มาจาก ซรี ม่ั 0.2 มล.

\100 มล. ซีรม่ั มีโปรตนี = 100 x 12.95 / 0.2 = 6473.5 มก.

ผCูป•วยมโี ปรตนี 6473.5 / 1000 = 6.474 กรัม/ดล.ซรี ่ัม

34

การคำนวณวิธี Dilution factor
จากโจทย?ตัวอย-าง ซีรม่ั ผปCู ว• ยตอC งผ-านการเจือจาง 2 ขนั้ ตอนกอ- นวัด O.D.555 nm
0.2 มล. ---> 10.2 มล. (dilution factor = 10.2 / 0.2 = 51x)
5.0 มล. ---> 20 มล. (dilution factor = 20 / 5 = 4x)

สว- นนำ้ ยาโปรตีนมาตรฐานผ-านการเจอื จางคร้งั เดียวก-อนวดั O.D.555 nm
0.5 มล. ---> 10 มล. (dilution factor = 10 / 0.5 = 20x)

นำ้ ยาโปรตนี มาตรฐานมี initial concentration = 2.8 มก./มล.
Final concentration = 2.8 / 20 = 0.14 มก./มล.

จาก Beer’s law O.D.unk / O.D.std = Cunk / Cstd

แทนค-า \ final Cunk = 0.34 x 0.14 / 0.15 = 0.317 มก./มล.
Initial Cunk
= 0.317 x 4 x 51 = 64.735 มก./มล.
\100 มล. ซีรมั่ มีโปรตนี
= 64.735 x 100 = 6473.5 มก.

= 6.474 กรมั /ดล.ซีรมั่

การใชCเครอ่ื ง (Operating Procedure)
แบ-งออกเปwน 2 ข้ันตอน คอื

1. การเตรียมเครือ่ งก-อนใชCงาน
2. การวดั ผล
1. การเตรยี มเครอ่ื งก-อนใชงC าน
กอ- นจะใชCงานเคร่ือง ตCองตรวจสอบการปรบั มาตรฐานชุดอเิ ลคโทรนคิ (Electronic Calibration)
ซงึ่ ปกติจะปรบั เปรยี บเทียบมาแลวC จากบริษัทผูผC ลติ สามารถตรวจสอบไดCง-ายโดย
1.1 เสียบปล๊กั ของเครอื่ งเขาC กบั เบCารบั ไฟฟ…าที่มสี ายดินเรยี บรอC ย (Ground outlet)
1.2 เป•ดสวทิ ซไ? ฟ (1) ทางดCานลา- งขวามอื ของเครอ่ื งจะสงั เกตเห็นมไี ฟแสดงบนหนาC ปทm ม?

ทางดาC นบนขวามอื (2) และอุน- เครื่องทงิ้ ไวCประมาณ 15-30 นาที
1.3 ใชCปุ•มหมุน (3) หมนุ เลือกความยาวคลนื่ แสงที่ 450 นาโนเมตร
1.4 หมนุ ปุ•ม (4) 100%T/ZERO A จนเข็มบนมเิ ตอร?ช้ที ี่ 100%T
1.5 ใสแ- ท-งพลาสตกิ สำหรบั ก้ันลำแสง (Occluder Block) ลงในช-องใส-หลอดวัด (5) พรCอมกบั

ป•ดฝาครอบใหสC นิท
1.6 อ-านคา- จากมเิ ตอรว? -าไดCผลอย-างไร
- หากอ-านไดC 0 %T แสดงว-าเครอ่ื งไดปC รับเปรยี บเทียบค-ามาตรฐานไวแC ลวC สามารถใชCงาน
ตอ- ไปไดCทันที
- หากอ-านคา- ไมไ- ดC 0 %T ใหใC ชCไขควงปรบั คา- 0 %T จากปม•ุ ปรบั ทางดCานหลงั ของเครือ่ ง
จนมเิ ตอรอ? -านไดC 0 %T เครื่องกส็ ามารถจะใชงC านตอ- ไปไดทC นั ที

35

2. การวัดผล
2.1 ใชปC มุ• หมนุ (3) หมนุ เลอื กความยาวคล่นื แสงท่ตี อC งการใชงC าน
2.2 เลอื กหลอดใส-สารตัวอย-างสำหรบั วดั ท่ีมีคุณสมบตั เิ หมอื นกนั (Matched Cuvet) และเหมาะสมกบั
กรรมวธิ ใี นการวเิ คราะหใ? หCใชหC ลอดใสส- ารตวั อยา- งสำหรบั วดั ชนดิ เดยี วกนั สำหรับสารละลายเปรยี บเทยี บ
(Blank), สารละลายมาตรฐาน (Standard) และสารละลายตวั อยา- ง (Sample) หลอดวดั โดยทวั่ ไปจะมี
เคร่ืองหมายในแนวตงั้ (Vertical Mark) สำหรบั การใสห- ลอดตอC งใหตC รงตำแหนง- เดยี วกนั กบั หลอดอ่นื ๆ ใน
การวัด และบางยหี่ อC จะมเี ครือ่ งหมายในแนวระดบั (Horizontal Mark) สำหรบั เปwนเคร่ืองหมายบ-งชี้ระดบั
ในการเตมิ สารละลายสำหรบั วัดใหCดCวย

ขอC สงั เกต
- ระดับสารละลายจะตCองสูงอย-างนCอย 20 มลิ ลเิ มตร สำหรบั หลอดใสส- ารมาตรฐานใชCกับ
Cuvet adapter
- ระดับสารละลายจะตCองสงู อย-างนCอย 32 มลิ ลเิ มตร สำหรบั หลอดใสส- ารท่วั ไป (Test Tube Cuvet)
ใชCกบั Universal Test Tube Holder
2.3 เปด• ฝาของชอ- งใสห- ลอดวดั (5) นำเอาแทง- พลาสติกก้นั ลำแสงออก
2.4 เติมหลอดใสส- ารสำหรบั วดั ดวC ยสารละลายเปรยี บเทยี บ (Blank) และบรรจใุ นช-องใสห- ลอดวัด ป•ดฝา
2.5 หมนุ ปุ•ม (4) 100%T/ Zero A ทางดาC นลา- งซาC ยมือของเครอ่ื ง จะอ-านผลบนมเิ ตอร?ไดเC ปนw
0.0 A (O.D.) หรือ 100%T
2.6 เป•ดฝาช-องใสห- ลอดไดC และนำเอาหลอดบรรจสุ ารละลายเปรียบเทียบออก
2.7 เตมิ หลอดใสส- ารสำหรบั วดั ดวC ยสารละลายมาตรฐาน (Standard) หรือสารละลายตัวอยา- ง
(Sample) และบรรจุในชอ- งใส-หลอดวดั ปด• ฝา
2.8 อา- นค-าเปwนค-าการดดู กลนื คลน่ื แสง (Absorbance , O.D.) หรอื ปริมาณรอC ยละท่ีแสงผา- น
(Transmittance)

36

ผังแสดงการทำงานของเคร่ือง SPECTROPHOTOMETER

SPECTROPHOTOMETER
(SPECTRONIC 21)

37

การทดลองที่ 3.1 การศกึ ษาเกย่ี วกบั เครอ่ื ง spectrophotometer
ก. ทำความรูCจกั เก่ียวกบั ส-วนตา- งๆ และทำความเขาC ใจถงึ หลกั การของเคร่ือง spectrophotometer
ข. ศึกษาวิธีใชCเคร่อื งทีถ่ กู ตCอง

การทดลองที่ 3.2 การหาความยาวคลน่ื ทเ่ี หมาะสมกบั การวดั ความเขCมขCนของสารละลาย
หลักการ สารละลาย (solution) แตล- ะประเภทจะมคี วามสามารถในการดูดกลนื แสงในแตล- ะช-วงความยาว
คลน่ื ตา- งกนั ซงึ่ ปรมิ าณแสงท่ถี กู ดูดกลนื โดยสารละลายจะเปนw สัดส-วนกับความเขมC ขCนของสารน้ัน ดังน้ันเมอ่ื จะใชC
spectrophotometer วดั ความเขCมขCนของสารละลายชนดิ หนง่ึ ควรเลือกความยาวคลน่ื ทเี่ หมาะสมตอ- การดดู กลนื
แสงของสารละลายน้นั กล-าวคอื แสงทผ่ี -านสารละลายจะถูกดูดแสงไดCดีทช่ี ว- งความยาวคล่นื หน่ึงและจะไมด- ดู แสง
เลยในความยาวคลน่ื อกี ช-วงหนง่ึ เราสามารถหาความยาวคลนื่ ทเ่ี หมาะสมนี้ไดCโดยการนำสารละลายนั้นมาอ-านคา-
O.D. หรอื %T ทค่ี วามยาวคล่นื ตา- ง ๆ กัน แลวC เขียนกราฟระหวา- งคา- O.D. หรือ %T กบั ความยาวคลืน่ ตา- ง ๆ
กราฟที่ไดCเรยี กว-า “Absorption spectrum” ของสารละลายนนั้ ความยาวคลืน่ ทเ่ี หมาะสมสำหรบั หาความเขมC ขนC

ของสารละลายหนง่ึ นน้ั เราจะใชCความยาวคลื่นตรงทีอ่ า- นค-า O.D. ไดสC ูงสุด (l max)

วธิ ีการ 1. ดูดสารละลาย oxyhemoglobin ประมาณ 4 มล.ใสใ- น cuvet
2. Cuvet อกี อนั ใส-นำ้ กลั่นเทา- ๆ กัน เพอ่ื เปนw blank ใชCสำหรบั ตงั้ 100%T หรือ 0.0 A (O.D.)
ตCองต้งั ค-า 100%T หรอื 0.0 A (O.D.) ทกุ ครงั้ ทเี่ ปล่ียนคา- ความยาวคลน่ื
3. วัดค-า O.D. และ %T ของสารละลาย oxyhemoglobin ที่ความยาวคลนื่ ต้ังแต- 500 ถงึ
600 nm โดยใหอC -านและจดค-า O.D. และ %T ทุก ๆ 10 nm **เมือ่ ไดJความยาวคลน่ื ทม่ี ี
ค#า O.D. สงู สุด ใหJวัดคา# O.D. อีกครัง้ ทคี่ วามยาวคลน่ื นนั้ ±5 nm**
4. เขยี นกราฟ absorption spectrum โดยใหCคา- ความยาวคลน่ื อยบ-ู นแกน X และ O.D. กบั %T
อยบ-ู นแกน Y

การทดลองท่ี 3.3 การเตรยี มกราฟมาตรฐาน (standard curve หรอื calibration curve)
หลักการ กราฟมาตรฐาน (Standard curve) เปนw กราฟแสดงความสมั พันธ?ระหวา- ง O.D. กบั ความเขมC ขCน
ของสาร (C) เราสามารถทำไดโC ดยนำสารละลายมาตรฐาน (standard solution) ซึง่ เราทราบปรมิ าณความเขCมขCน

มาเจือจางใหCมคี วามเขมC ขนC ตา- ง ๆ กัน แลCวนำสารละลายทค่ี วามเขมC ขCนต-าง ๆ กนั นมี้ าวัด O.D. ที่ lmax ของ
สารละลายน้ัน ค-า O.D. จะแปรตามกบั ความเขมC ขCนของสารตาม Beer's Law
หมายเหตุ 1. สารละลายมาตรฐานมกั เปwนสารละลายชนิดเดียวกบั สารละลาย unknown

2. กราฟมาตรฐานทีไ่ ดCตอC งเปนw เสCนตรงผา- นจดุ origin ซ่ึงมปี ระโยชนใ? นการหาปริมาณความเขมC
ของสารละลาย unknown

38

วิธีการ
1. ใชC standard oxyhemoglobin (HbO2) ท่ีทราบความเขมC ขนC (2.8 มก./มล.) มาเจอื จางตามตาราง

ขCางล-างนี้ และนำมาอา- นค-า O.D. ที่ l max

หลอดท่ี 12345
Dilution Blank 1 : 4 1 : 2 3 : 4 no dilution

Oxy - Hb solution (มล.) 0 1 2 3 4

น้ำกลั่น (มล.) 43210
ความเขมC ขนC

O.D.…………………….…nm

2. สราC งกราฟมาตรฐานระหวา- ง O.D. และความเขCมขนC ของสารละลายมาตรฐานลงบนกระดาษกราฟ

การแปลผล กราฟมาตรฐานทีส่ ราC งไดเC ปwนไปตาม Beer's law หรือไม- ?

การทดลองที่ 3.4 การหาความเขมC ขCนของสารละลาย unknown จากกราฟมาตรฐาน
เน่อื งจากบางครง้ั สารละลาย unknown มปี รมิ าณสารเขมC ขนC มากจนไมส- ามารถใชC กราฟมาตรฐานอ-านคา-

ความเขมC ขCนไดC ดังน้นั เรานยิ มเจือจาง unknown นี้ก-อนแลCวนำมาอ-านคา- O.D. เปรยี บเทยี บกันแตล- ะ dilution

วิธีการ 1. นำ unknown oxyhemoglobin มาเจอื จาง 1:2 และ 1:4 เทา-

2. อา- นค-า O.D. ของ unknown ทยี่ งั ไมไ- ดเC จอื จาง และทเี่ จอื จาง 1:2 และ 1:4 เทา- ที่ l max
3. หาค-าเปwน มก./มล. จากกราฟมาตรฐาน และคำนวณหาความเขมC ขนC สารเดมิ ก-อนเจอื จาง
เปwน มก./ดล. (มก. %)

การทดลองที่ 3.5 โจทย?การคำนวณเพ่ือหาความเขCมขนC ตง้ั ตCนของสาร