เทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์

เอกสารประกอบการสอน รายวิชา 403016 เทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์ ผศ.ดร.ขวัญประเสริฐ พันธุ์ชัย สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏนครราชสีมา

คำนำ เอกสารประกอบการสอนรายวิชา 403016 เทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทาง วิทยาศาสตร์เล่มนี้ ผู้เขียนได้เรียบเรียงขึ้นโดยมีวัตถุประสงค์ เพื่อให้ผู้เรียนได้เพิ่มพูนความรู้ เกี่ยวกับเทคนิค ทางชีววิทยา โดยอาศัยตำรา คำบรรยาย บทความ เอกสารทางวิชาการของผู้ทรงคุณวุฒิหลายท่าน ซึ่งเนื้อหา ประกอบด้วยเทคนิคทางชีววิทยาด้านสัตว์รวมทั้งการจัดกิจกรรมวิทยาศาสตร์ผู้เรียบเรียงใคร่ ขอขอบพระคุณคณาจารย์ผู้ให้ความรู้ ผู้แต่งหนังสือ ตำรา เอกสาร และข้อมูลจากระบบสารสนเทศตามที่ได้ อ้างอิงไว้ในบรรณานุกรม ซึ่งเป็นแหล่งข้อมูลที่สำคัญที่ใช้ประกอบในการจัดทำเอกสารประกอบการสอนเล่มนี้ ตลอดจนผู้มีพระคุณทุกท่านที่ได้ให้ความช่วยเหลือในการจัดทำเอกสารประกอบการสอนเล่มนี้ เอกสารเล่มนี้จะเป็นประโยชน์แก่ผู้เรียน หากนักศึกษาได้ฝึกทบทวนความคิด วิเคราะห์ และ สังเคราะห์ให้เกิดองค์ความรู้ แล้วนำไปปฏิบัติในชั้นเรียน ดังนั้นก่อนเข้าเรียนนักศึกษาควรเตรียมตัวให้พร้อม โดยการอ่านบทปฏิบัติการ วางแผนการทดลอง และระหว่างดำเนินกิจกรรมในห้องปฏิบัติการควรใช้เวลา เรียนรู้ ทำกิจกรรมตามขั้นตอน ฝึกใช้ความคิดอย่างมีเหตุผล บันทึก และสรุปผลการศึกษาตามเวลาเวลาที่ กำหนด หากไม่เข้าใจในสิ่งใดให้ค้นคว้าหาคำตอบจากสื่อที่มีหลากหลายรูปแบบในปัจจุบัน ขวัญประเสริฐ พันธุ์ชัย

สารบัญ บทนำ บทที่ 1 การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิต บทที่ 2 เทคนิคการสตัฟฟ์สัตว์ - ปฏิบัติการเรื่อง การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงแบบแห้ง - ปฏิบัติการเรื่อง เทคนิคการสตัฟฟ์ปลา บทที่ 3 เทคนิคการเตรียมสไลด์ถาวร - ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรโดยวิธีการสเมียร์เลือด - ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรพารามีเซียม - ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรเซลล์ประสาท บทที่ 4 เทคนิคการเก็บรักษาโครงกระดูก - ปฏิบัติการเรื่อง การดองใสปลาเพื่อศึกษากระดูกและเนื้อเยื่อที่มีแคลเซียม - ปฏิบัติการเรื่อง การเก็บรักษาโครงร่างแข็งด้วยการหล่อเรซิ่นใส

หน้า -1- แนวการสอน ชื่อวิชา 403016 เทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์(Biological techniques and Scientific activities) ภาคการศึกษาที่2/2566 จำนวนหน่วยกิต 3 (1-4-4) ชื่อผู้สอน ผศ.ดร.ขวัญประเสริฐ พันธุ์ชัย และ อ.ดร.ผุสดี พรหมประสิทธิ์ สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี 1. คำอธิบายรายวิชา ทักษะการใช้วัสดุและอุปกรณ์ทางชีววิทยา ความปลอดภัยในการปฏิบัติงาน เทคนิคการเตรียมสารเคมี การรักษาอุปกรณ์ วิธี เก็บข้อมูลทางชีววิทยา เทคนิคการทำตัวอย่างทางชีววิทยา ปฏิบัติการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์ โดยจัดการห้องปฏิบัติการและ ห้องปฏิบัติการทางธรรมชาติได้อย่างเหมาะสมปลอดภัยและนำความรู้ทางชีววิทยาไปประยุกต์ใช้ในการจัดการเรียนรู้ชีววิทยา (สมรรถนะ 1.4, 4.2, 5.5) 2. จุดประสงค์รายวิชา 1. เพื่อให้มีความรู้ ความเข้าใจ เกี่ยวกับการเก็บรักษาตัวอย่างพืชและสัตว์สำหรับเตรียมสไลด์เนื้อเยื่อถาวร 2. สามารถนำความรู้ไปบูรณาการข้ามศาสตร์และประยุกต์ใช้ได้อย่างเหมาะสม 3. เพื่อให้มีทักษะในการปฏิบัติการทางชีววิทยา ได้แก่ การดอง การสต๊าฟ การใช้กล้องจุลทรรศน์เพื่อการถ่ายภาพตัวอย่าง เนื้อเยื่อพืชและสัตว์ การทำสไลด์เนื้อเยื่อถาวรพืชและสัตว์ และทักษะกระบวนการทางวิทยาศาสตร์ 4. เพื่อให้มีทักษะในการวางแผนการทำปฏิบัติการ โดยใช้กระบวนการทางวิทยาศาสตร์ 5. เพื่อให้มีจริยธรรมในการเรียน ได้แก่ ความมีวินัย ความรับผิดชอบ ตรงต่อเวลา ความมานะพยายาม ความซื่อสัตย์ 6. สามารถนำความรู้ไปจัดกิจกรรมทางชีววิทยาได้อย่างเหมาะสมปลอดภัย 3. เนื้อหารายวิชา ประกอบด้วยหัวข้อต่าง ๆ ดังต่อไปนี้ เทคนิคทางชีววิทยาด้านพืช และด้านสัตว์ 4. อุปกรณ์สื่อการสอน เอกสารประกอบการสอนวิชาเทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์สื่อการนำเสนอ PowerPoint presentation อุปกรณ์และเครื่องมือวิทยาศาสตร์และตัวอย่างสิ่งมีชีวิต 5. การวัดผลสัมฤทธิ์ในการเรียน 100 คะแนน กิจกรรม ผศ.ดร.ขวัญประเสริฐ พันธุ์ชัย อ.ดร.ผุสดี พรหมประสิทธิ์ คะแนนเก็บ (เข้าเรียน ชิ้นงาน รายงาน) คะแนนสอบ 30% สอบกลางภาค 20% 30% สอบปลายภาค 20% 6. การประเมินผลการเรียน การตัดเกรดใช้วิธีการอิงเกณฑ์ เกณฑ์ที่ใช้ในการให้ระดับคะแนนดังนี้ ช่วงคะแนน ระดับผลการเรียน ช่วงคะแนน ระดับผลการเรียน 80-100 A 60-64 C 75-79 B + 55-59 D + 70-74 B 50-54 D 65-69 C + 0-49 F 7. การให้โอกาสนอกเวลาเรียนแก่นักศึกษาเข้าพบและให้คำแนะนำด้านการเรียน นักศึกษาสามารถเข้าพบอาจารย์ที่สอนเพื่อซักถามหรือขอคำอธิบายเพิ่มเติมในเรื่องการเรียนการสอน การตรวจชิ้นงานหรืองานที่ มอบหมายได้ในวันและเวลาราชการ

หน้า -2- 8. แผนการสอน สัปดาห์ เนื้อหา ชั่วโมง กิจกรรม ผู้สอน 1 แนะนำรายวิชา - ทบทวนความรู้ทางชีววิทยา - ทักษะการใช้วัสดุและอุปกรณ์ทาง ชีววิทยาและความปลอดภัยในการ ปฏิบัติงาน 5 1. อธิบายรายละเอียดรายวิชา โดย ใช้แนวการสอน 2. บรรยาย อภิปราย ด้วยสื่อ power point 3. มอบหมายงาน ดร.ขวัญประเสริฐ พันธุ์ชัย 2-3 การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิต การคงสภาพตัวอย่างสิ่งมีชีวิต -ปฏิบัติการ การเก็บรักษาตัวอย่างแมลง -ปฏิบัติการ การสตาฟปลา ปู กุ้ง 10 1. บรรยาย อภิปราย ด้วยสื่อ power point 2. การคำนวณความเข้มข้นสาร และ การเตรียมสาร 3. การเตรียมสารต่าง ๆ และการ เตรียมตัวอย่างสัตว์ 4. ปฏิบัติการ 5. มอบหมายงาน 4-5 การเตรียมสไลด์ถาวร และการถ่ายภาพ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ -ปฏิบัติการ การเตรียมสไลด์เม็ดเลือด -ปฏิบัติการ การเตรียมสไลด์เซลล์ ประสาท -ปฏิบัติการ การเตรียมสไลด์พารามีเซียม 10 6-7 การเก็บรักษาโครงกระดูก -ปฏิบัติการ การดองใสปลา - ปฏิบัติการ การรักษาโครงร่างสัตว์ การเก็บรักษาตัวอย่างด้วยพลาสติกแข็ง -ปฏิบัติการ การทำเรซินใส 10 8 สอบกลางภาค 9 การผลิตสื่อจากวัสดุธรรมชาติ เพื่อมาใช้ในการสอนชีววิทยา 5 1. ให้นักศึกษาแบ่งกลุ่ม 4-5 คน ออกแบบและผลิตสื่อจากวัสดุ ธรรมชาติเพื่อมาใช้ในการจัดกิจกรรม ทางวิทยาศาสตร์ในสัปดาห์ที่ 15 ดร.ผุสดี พรหมประสิทธิ์ 10 การทำสไลด์กึ่งถาวรเนื้อเยื่อพืช - ปฏิบัติการ ทำสไลด์กึ่งถาวรของเนื้อเยื่อ พืช 5 1. บรรยาย อภิปราย ด้วยสื่อ power point 2. การคำนวณความเข้มข้นสาร และ การเตรียมสาร 3. การเตรียมสารต่าง ๆ และการ เตรียมตัวอย่างพืช 4. ปฏิบัติการ 11 การทำสไลด์ถาวรพืช - ปฏิบัติการ ทำสไลด์ถาวรมอส 5 12-13 การรักษาสภาพตัวอย่างพืช - ปฏิบัติการ ทำตัวอย่างแห้งพืช - ปฏิบัติการ ดองรักษาสีพืช (เขียว ม่วง ขาว ส้ม และแดง) 10 14 การพิมพ์ลายจากพืชด้วยสีธรรมชาติ - ปฏิบัติการ พิมพ์ลายจากส่วนต่าง ๆ ของพืชด้วยสีธรรมชาติ 5

หน้า -3- 15 การจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์ - การจัดห้องปฏิบัติการและ ห้องปฏิบัติการทางธรรมชาติได้อย่าง เหมาะสม 5 1. จัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์ 2. บรรยาย สาธิต ด้วยสื่อแบบต่าง ๆ 3. เทคนิคการสอนด้วยสื่อแบบต่าง ๆ 16 สอบปลายภาค 9. หนังสืออ่านประกอบการเรียน ธวัช ดอนสกุล. 2534. เอกสารคำสอน ชว 581 ไมโครเทคนิค. ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ บางเขน. พรรณิภา อริยกุลกาญจน์. 2529. เอกสารประกอบการอบรมเชิงปฏิบัติการชีววิทยา. ภาควิชาชีววิทยา มหาวิทยาลัยศิลปากร วิทยาเขตพระราชวังสนามจันทร์ นครปฐม. ยอดชาย ช่วยเงิน. 2554. คู่มือการเตรียมตัวอย่างทางวิทยาศาสตร์. พิพิธภัณฑ์ธรรมชาติวิทยา องค์การพิพิธภัณฑ์วิทยาศาสตร์ แห่งชาติ เทคโนธานี จังหวัดปทุมธานี. ศิวาพร ลงยันต์ และ ไพศาล สิทธิกรกุล. 2555. ไมโครเทคนิค. แอ๊ดวานซ์ พรินท์ติ้ง เซอร์วิส จำกัด สมุทรปราการ. ศุภลักษณ์ โรมรัตนพันธ์. 2540. แอนนิมอลไมโครเทคนิค. ภาควิชาสัตววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. ศุภลักษณ์ โรมรัตนพันธ์. 2545. เทคนิคเนื้อเยื่อสัตว์. ภาควิชาสัตววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สมพงษ์ สิทธิพรหม. 2542. การทำสไลด์ถาวรเนื้อเยื่อสัตว์โดยกรรมวิธีพาราฟิน. ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น. อำพา เหลืองภิรมย์. 2533. ปฏิบัติการวิชาไมโครเทคนิคของสัตว์. ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น. อุทัยวรรณ โกวิทวที และ สาธิต โกวิทวที. 2550. การเก็บรักษาตัวอย่างพืชและสัตว์. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพฯ.

บทนำ กฎข้อบังคับเกี่ยวกับการทำงานในห้องปฏิบัติการ นักศึกษาต้องตระหนักและลงมือปฏิบัติตามกฎข้อบังคับอย่างเคร่งครัด เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาที่จะเกิดขึ้น ทั้งต่องานที่ลงมือทำ ตนเอง รวมไปถึงนักศึกษาที่ปฏิบัติงานร่วมกัน ดังนี้ 1. อุปกรณ์ป้องกันร่างกายส่วนบุคคล การปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการที่มีสารเคมีอันตราย หรือเชื้อก่อโรค ควรมีการป้องกันความไม่ ปลอดภัยที่อาจเกิดขึ้นกับตนเองเบื้องต้นโดยใช้อุปกรณ์ ดังนี้ 1.1 เสื้อกาวน์ (Laboratory coat) เป็นเสื้อที่ผลิตมาจากเส้นใยที่ไม่ติดไฟง่าย ใช้สวมทับชุดปกติ ระหว่างปฏิบัติงาน โดยติดกระดุมเสื้อให้เรียบร้อย เพื่อป้องกันการกระเด็นเปื้อนของสารเคมี เมื่อใช้งานเสร็จควรถอด ทุกครั้งที่ออกจากห้องปฏิบัติการและซักทำความสะอาดสม่ำเสมอ 1.2 ผ้ากันเปื้อนสารเคมี (Protective coat) เป็นผ้าที่ผลิตจากหนัง หรือสารพีวีซี (PVC) ที่ทนต่อ สารเคมี ใช้สวมทับเสื้อกาวน์ เพื่อป้องกันการกระเด็นเปื้อนของสารเคมีและใส่ทำความสะอาดสารเคมีที่หกปนเปื้อน 1.3 หมวกคลุมผม (Hair cover) ใช้สำหรับคลุมศรีษะ โดยต้องรวบเส้นผมให้อยู่ในหมวกทั้งหมด เพื่อ ป้องกันการฝุ่นผงหรือเส้นผมที่หลุดร่วงไปปนเปื้อนในห้องปฏิบัติการ 1.4 ถุงมือ (Gloves) ใช้ป้องกันอันตรายหรือป้องกันความร้อนขณะหยิบจับสิ่งของ ได้แก่ ถุงมือไวนิล (Vinyl glove) ถุงมือลาเท็กซ์ (Latex glove) ฯลฯ ขณะใส่ถุงมือไม่ควรจับลูกบิดประตู โทรศัพท์ หรือปากกา และ ล้างมือก่อนถอดถุงมือทุกครั้ง 1.5 รองเท้า (Shoes) ควรเป็นรองเท้าหุ้มส้น ปกปิดนิ้วเท้ามิดชิด ผลิตจากวัสดุทนสารเคมีกัดกร่อน ทนตัวทำละลาย กันน้ำและไม่ควรใช้รองเท้าที่มีส้น หรือพื้นรองเท้าที่ลื่น 1.6 อุปกรณ์ป้องกันตา (Eye protection devices) มีหลายชนิด ได้แก่ แว่นตานิรภัย (Safety glasses) มีเลนส์ทนการกระแทก แว่นตากันไอระเหย (Goggle) มีแผ่นครอบปิดข้างเลนส์เพื่อป้องกันอันตรายต่อตา ได้มิดชิด 1.7 กระบังป้องกันใบหน้า (Face shield) เป็นวัสดุโค้งครอบใบหน้า เพื่อป้องกันอันตรายต่อดวงตา ใบหน้า และลำคอจากการกระเด็น กระแทกของวัตถุ หรือสารเคมี 2. ข้อปฏิบัติทั่วไปในการใช้ห้องปฏิบัติการ การปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการนอกจากจะมุ่งเน้นให้มีคุณภาพและเชื่อถือได้นั้น ยังต้องมีความ ปลอดภัยทั้งต่อผู้ปฏิบัติงาน บุคคลข้างเคียง รวมทั้งอาจเกิดอุบัติเหตุร้ายแรงขณะปฏิบัติงาน เช่น การระเบิด หรือเกิด เพลิงไหม้ นอกจากนี้ต้องคำนึงสิ่งแวดล้อมรอบตัว จึงจำเป็นต้องมีระเบียบปฏิบัติทั่วไป ดังนี้ 2.1 ล้างทำความสะอาดวัสดุและอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการให้สะอาดอยู่เสมอ 2.2 รักษาความสะอาด เครื่องมือ และความเป็นระเบียบในโต๊ะปฏิบัติการของตนเองจึงจะทำให้ ปฏิบัติงานได้สะดวกมากยิ่งขึ้น 2.3 มีสติรู้ตนเองและวิเคราะห์ปัญหาที่เกิดขึ้นก่อนดำเนินการในขั้นต่อไป

2 2.4 สวมเสื้อคลุมกันการปนเปื้อน (เสื้อกาวน์) ทุกครั้งขณะลงมือปฏิบัติงานในห้องห้องปฏิบัติการ เพื่อ ป้องกันสารเคมีที่เป็นอันตราย 2.5 การเตรียมสารควรใช้ภาชนะให้เหมาะสม ต้องมีฝาปิดมิดชิด และเขียนฉลากติดขวดสารเคมีทุก ชนิดเพราะเมื่อมีสารหลายขวดอาจทำให้หลงลืมได้ 2.6 ควรเตรียมสารที่มีไอระเหยเป็นพิษในตู้ดูดควัน เช่น การเตรียมกรดเข้มข้น เพราะ ไอระเหย ของกรดจะทำให้เกิดการระคายเคืองต่อผิวหนังของร่างกาย และต้องเทกรดลงในน้ำเสมอ 2.7 ไม่ควรใช้เอทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์ (Absolute ethyl alcohol) สำหรับการเตรียม แอลกอฮอล์ระดับความเข้มข้นที่ต่ำลง และต้องปิดฝาเพื่อป้องกันการระเหยของสารหรือป้องกันไม่ให้ไอน้ำจากข้าง นอกซึมเข้าไป 2.8 การชั่งน้ำหนักสาร ต้องใช้ภาชนะหรือกระดาษรองรับที่สะอาด ระวังอย่าให้สารเคมีหกเปื้อน เครื่องชั่งสาร 2.9 การตวงสารละลาย ต้องใช้อุปกรณ์ให้เหมาะสมและใช้แยกกัน เพื่อป้องกันสารเคมีปนเปื้อนกัน 2.10 ไม่ควรทิ้งเศษตัวอย่างหรือสารเคมีลงในอ่างน้ำทิ้ง เพราะนอกจากจะทำให้ท่ออุดตันแล้ว ยัง จะทำให้สารเคมีปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมได้ 2.11 สารละลายที่ใช้แล้วให้รวบรวมใส่ขวดหรือภาชนะแยกชนิดกัน และควรเป็นภาชนะที่มีฝา ปิดมิดชิด พร้อมทั้งเขียนกำกับว่า สาร..................ใช้แล้ว หรือ ทิ้งสาร.................. เช่น แอลกอฮอล์ใช้แล้ว หรือ ทิ้งสารรักษาสภาพเนื้อเยื่อ หรือ ทิ้งสีย้อม..................... 2.12 ก่อนทำให้เนื้อเยื่อคงสภาพ ต้องแน่ใจว่าได้เลือกสารคงสภาพถูกต้องแล้ว และใช้ทันทีเมื่อเตรียม สารเสร็จ 2.13 การเก็บรักษาตัวอย่างจะต้องใช้เวลาเพียงเล็กน้อยในการตัดส่วนใดส่วนหนึ่งของพืชหรือสัตว์ แล้วนำไปแช่ในสารทำให้คงสภาพทันทีเพื่อป้องกันการเสียสภาพ 2.14 ศึกษาข้อมูลการปฏิบัติงานล่วงหน้าและจัดทำตารางเวลาการปฏิบัติงาน เพื่อให้งานเสร็จตาม เวลาและป้องกันการผิดพลาด 2.15 ตรวจสอบสไลด์เนื้อเยื่อที่เตรียมเสร็จแล้วด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยตนเอง เพื่อให้เกิดความ เชี่ยวชาญและกลายเป็นผู้ปฏิบัติงานที่ดีได้ 3. ข้อปฏิบัติในการกำจัดสารปนเปื้อนทางชีววิทยาในห้องปฏิบัติการ ผู้ปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการทางชีววิทยามีความเสี่ยงต่อเชื้อจุลชีพ หรือสารเคมีอันตรายหากไม่มี ความระมัดระวังหรือการป้องกันที่ดีพอจะทำให้เชื้อจุลชีพ หรือสารเคมีมีโอกาสเข้าสู่ร่างกายได้ ทำให้เจ็บป่วยทั้งชนิด เฉียบพลันและเรื้อรัง จึงควรปฏิบัติตามข้อกำหนดเพื่อให้เกิดความปลอดภัยทั้งแก่ตนเองและผู้อื่น ดังนี้ 3.1 สารที่เป็นขยะทั่วไป เช่น เศษกระดาษ ขวดพลาสติก ให้ทิ้งลงถังขยะธรรมดา 3.2 ของมีคม เช่น เศษแก้ว เครื่องแก้วที่แตก ใบมีดโกน เศษมีด ให้ห่อด้วยกระดาษให้เรียบร้อยและ ทิ้งลงถังขยะสำหรับเศษแก้วแตก 3.3 ขยะชีวภาพ หรือขยะติดเชื้อ เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อ เลือด ปัสสาวะ ฯลฯ ต้องนึ่งฆ่าเชื้อ (Autoclave) โดยใช้อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 1 บรรยากาศ เป็นเวลา 15 นาทีแล้วจึงทิ้งลงในถังขยะ ชีวภาพ

3 3.4 หากขยะชีวภาพ หรือขยะติดเชื้อมีการหกเปื้อนโต๊ะ หรือพื้นห้องปฏิบัติการให้เช็ดทำความสะอาด ด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ แล้วกำจัดตามวิธีในข้อ 3.3 3.5 ขยะที่เป็นซากสัตว์ให้บรรจุใส่ถุงพลาสติกที่ไม่รั่วซึม มัดปากถุง ทิ้งลงถังขยะชีวภาพ หรือทิ้งในถัง ขยะชั้น 1 เท่านั้น ห้ามทิ้งไว้บริเวณห้องปฏิบัติการ ถ้าทิ้งไม่ทันเวลาที่เก็บขยะประจำวัน ให้นำไปแช่เย็นป้องกันการ เน่าก่อนที่จะทิ้งในวันถัดไป 3.6 ห้ามทิ้งภาชนะบรรจุอาหารและเศษอาหารลงในถังขยะในห้องปฏิบัติการโดยเด็ดขาด

บทที่ 1 การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิต การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิตในธรรมชาติมีวัตถุประสงค์แตกต่างกัน โดยทั่วไปจะเก็บรักษาไว้ เพื่อใช้เป็น ตัวอย่างในการเรียนการสอน (Academic) ทางชีววิทยาด้านต่างๆ ได้แก่ ด้านอนุกรมวิธาน การศึกษาลักษณะทาง สัณฐานวิทยา นิเวศวิทยา วิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิต ตลอดจนงานวิจัย (Research) และงานด้านพิพิธภัณฑ์ (Museum) เทคนิคการเก็บรักษาตัวอย่าง การเตรียมตัวอย่างสิ่งมีชีวิตเพื่อศึกษาทางชีววิทยา เมื่อสิ่งมีชีวิตตายลงเซลล์และเนื้อเยื่อจะเสียสภาพ เนื่องจากการทำงานของเอนไซม์ โดยเซลล์เกิดการย่อยสลายตัวเอง (Autolysis) หลังจากนั้นถ้าปล่อยทิ้งไว้จุลินทรีย์ จะเข้ามามีบทบาทในการทำให้เน่าเปื่อย เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาดังกล่าวจำเป็นต้องใช้เทคนิควิธีตลอดจนสารเคมีที่ เหมาะสมเพื่อป้องกันการเกิดเหตุการณ์ที่กล่าวข้างต้น วิธีการที่เกี่ยวข้องแบ่งได้ 2 วิธี คือ 1. แมโครเทคนิค (Macrotechnique) การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดใหญ่หรือเก็บรักษาตัวอย่างทั้งตัว วิธีในการเก็บรักษาไม่ยุ่งยากซับซ้อน ใน กรณีสิ่งมีชีวิตกลุ่มสัตว์จะมีการเคลื่อนที่และตอบสนองอย่างรวดเร็ว ก่อนการเก็บรักษาตัวอย่างในรูปแบบต่างๆ จำเป็นต้องปล่อยให้สิ่งมีชีวิตอยู่ในสภาวะยืดตัวตามธรรมชาติแล้วจึงทำให้หมดความรู้สึก (Narcotizing agent) หรือ ลดความไวต่อการตอบสนองต่อสิ่งเร้า โดยเติมสารที่เหมาะสมลงไปทีละน้อย จนสิ่งมีชีวิตไม่มีการตอบสนองต่อสิ่งเร้า แล้ว จากนั้นจึงทำให้ตายและรักษาสภาพเนื้อเยื่อโดยสภาพลงไปในภาชนะ โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ฟอร์มาลีนความ เข้มข้น 5-10% เป็นต้น ในส่วนตัวอย่างพืชสามารถข้ามขั้นตอนการสลบตัวอย่างไปรักษาสภาพเนื้อเยื่อได้เลย วิธีการ เก็บรักษาตัวอย่างพืชและสัตว์มีหลายวิธีได้แก่ 1.1 การเก็บดองหรือการรักษาสภาพในของเหลว (Liquid preservation) สามารถดองได้ทั้งตัวอย่างพืช และสัตว์ ควรเลือกน้ำยาดองให้เหมาะสมกับชนิดและขนาดของสิ่งมีชีวิต โดยคำนึงถึงวัตถุประสงค์ของการเก็บรักษา ตัวอย่าง น้ำยาที่ใช้ดองโดยทั่วไปได้แก่ แอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 70 ส่วนน้ำยาที่นิยมใช้ดองสัตว์ได้แก่ สารละลายนิวทรัลบัฟเฟอร์ฟอร์มาลีน (Neutral buffer formalin, NBF) น้ำยาที่นิยมใช้ดองพืชได้แก่ สารละลาย เอฟเอเอ (Formalin acid alcohol, FAA) หรือการดองแบบเก็บรักษาสีของพืชเรียกว่า การดองเขียวดองแดง (สามารถเก็บรักษาสีของพืชให้เหมือนกับธรรมชาติ เช่น สีเหลือง สีเขียว สีส้ม สีแดง สีขาว) นอกจากนี้ยังสามารถใช้ ในการดองเก็บพืชอวบน้ำ พืชน้ำ ดอกที่มีความเปราะบาง หรือตัวอย่างผลสดของพืช ในกรณีที่ต้องย้ายตัวอย่างไปดองในแอลกอฮอล์ต้องล้างฟอร์มาลินออกให้หมดโดยแช่ในน้ำไหลผ่านทิ้งไว้ 1- 2 วัน ควรเลือกภาชนะที่เหมาะสมกับขนาดตัวอย่าง ได้แก่ ตัวอย่างขนาดเล็กมาก เช่น แมลงน้ำ ไฮดรา ชิ้นส่วน ดอกไม้ เป็นต้น ให้ใส่ในขวดขนาดเล็กที่มีฝาเกลียวปิด (Vial) ตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่ขึ้น เช่น ลำต้นพืช ใบ ปลา หนู เป็นต้น ให้ใส่ในขวดรวมเป็นกลุ่มหรือเก็บแยกขวด และเขียนป้ายชื่อและข้อมูลด้วยดินสอผูกหรือใส่เข้าไปในขวดดอง และต้องตรวจสอบปริมาณของสารรักษาสภาพให้ท่วมตัวอย่างอยู่เสมอ ภาพที่ 1 แผ่นป้ายข้อมูลตัวอย่างสำหรับติดขวดตัวอย่างที่เก็บรักษาในสารคงสภาพ

2 ตารางที่ 1 ตัวอย่างวิธีการเก็บรักษาสิ่งมีชีวิตกลุ่มสัตว์ด้วยการดอง กลุ่ม ตัวอย่าง วิธีการ / สารที่ใช้ พอริเฟอแรน ฟองน้ำ - ดองได้เลย ด้วยแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 75-95 - ห้ามดองด้วยฟอร์มาลินจะไปทำลายโครงสร้างหินปูน (Calcareous spicule) ไนดาเรียน ดอกไม้ทะเล - ใส่ตัวอย่างในภาชนะที่มีน้ำทะเลธรรมชาติเพื่อปล่อยให้สัตว์ยืดตัวเต็มที่ แล้ว เติมดีเกลือ (Epsom salt) ซึ่งเป็น Narcotizing agent ลงไปทุกๆ 20 นาที จนถึงชั่วโมงที่ 3-4 จึงทดสอบการตอบสนองด้วยการเขี่ยเบาๆ ที่ tentacle - เมื่อสัตว์ไม่ตอบสนองให้ฆ่าด้วยฟอร์มาลินหรือ Bouin’s fluid ที่ร้อน แล้ว ดองด้วย 5% Neutral buffer formalin - ปะการังนิยมเก็บเป็นตัวอย่างแห้ง ครัสเตเชียน สัตว์ขาข้อ - ดองในแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 70 จะไม่ทำให้กล้ามเนื้อบริเวณข้อ ต่อรยางค์แข็งเกินไป แต่จะทำให้สีตัวจาง - สัตว์ที่มีรยางค์ยืดยาวต้องให้ยืดตัวโดยเติมเกล็ด menthol ก่อน เอไคโนเดอร์ มาตา ดาวทะเล ดาวขนนก เม่นทะเล - ฆ่าด้วยแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 90 แล้วจึงเปลี่ยนความเข้มข้นเป็น ร้อยละ 70 - ถ้าลำตัวขนาดใหญ่หรือตัวหนาจำเป็นต้องฉีดน้ำยารักษาสภาพเข้าไปข้างในตัว คอร์ดาตา สัตว์มีกระดูก สันหลัง - สลบสัตว์ก่อนด้วยสารที่เหมาะสม เช่น อีเธอร์ จัดท่าทางของสัตว์ให้อยู่ในท่า ที่เหมาะสม แล้วเปิดช่องท้องหรือฉีดฟอร์มาลินความเข้มข้นร้อยละ 10 เข้าไป ในช่องว่างลำตัว ทำความสะอาด แล้วจึงดองในฟอร์มาลิน หลังจากนั้นเปลี่ยน สารละลายใหม่เป็นฟอร์มาลินความเข้มข้นร้อยละ 5 หรือแอลกอฮอล์ความ เข้มข้นร้อยละ 70 นอกจากนี้ยังมีเทคนิคการเก็บรักษาที่เหมือนการวิธีการดอง เรียกว่า ดองใส ซึ่งเป็นเทคนิคการเก็บรักษา ตัวอย่างสัตว์มีกระดูกสันหลังเพื่อศึกษาโครงร่างภายใน โดยทำให้เนื้อเยื่อภายในมีลักษณะโปร่งใสและทำให้โครงร่างที่ ต้องการศึกษาติดสีย้อม 1.2 การเก็บรักษาตัวอย่างแห้ง (Dry preservation) การเก็บแห้งสามารถรักษาสีของตัวอย่างได้ดีกว่าการ ดองในของเหลว ถ้าเป็นสิ่งมีชีวิตกลุ่มสัตว์สามารถเก็บรักษาตัวอย่างแห้งด้วยวิธีการสตาฟ การเก็บรักษาโครงกระดูก เป็นต้น ตัวอย่างแห้งที่ทำสำเร็จแล้วให้เก็บไว้ในกล่องหรือในตู้ที่ปิดมิดชิด และควรใส่สารกันแมลง (fumigant) ใน ภาชนะด้วย เช่น เกล็ดพาราคลอโรเบนซีน (Para-chlorobenzene) หรือ พารา-ดีซีบี (p-DCB) การบูร ลูกเหม็นหรือ เนฟทาลีน (Napthalene flake) เป็นต้น ส่วนใหญ่แล้วนิยมเก็บรักษาสิ่งมีชีวิตกลุ่มพืช ได้แก่ การเก็บตัวอย่างพืช แบบแห้ง (Herbarium) ตารางที่ 2 วิธีการเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิตด้วยการทำแห้ง กลุ่ม วิธีการ / สารที่ใช้ พืช พืชขนาดเล็ก อบแห้ง หรือตากแห้งได้เลย พืชขนาดใหญ่ อบแห้ง หรือตากแห้ง โดยวิธีการอัดแห้งด้วยแผงไม้ สัตว์ สัตว์มีกระดูกสันหลัง - ขนาดลำตัวเล็ก สามารถอบแห้งได้เลย - ถ้าลำตัวขนาดใหญ่หรือตัวหนาจำเป็นต้องฉีดน้ำยารักษาสภาพเข้าไปข้าง ในตัว แล้วจัดท่าทางก่อนนำไปทำแห้งด้วยการอบ หรือตากแห้ง (การส ตาฟ) แมลง อบแห้ง หรือตากแห้ง

3 การเก็บตัวอย่างพืชแบบแห้ง เป็นวิธีการเก็บรักษา และรวบรวมพืชไว้อย่างเป็นระเบียบในพิพิธภัณฑ์ (Museum) ในทางพฤกษศาสตร์เรียกว่า การทำเฮอร์บาเรียม (Herbarium) การเก็บและรักษาตัวอย่างพันธุ์ไม้ทำได้ 2 วิธี คือ การอัดแห้ง โดยการอัดพรรณไม้ให้แห้งด้วยแผงอัด (Presses) แล้วอบหรือผึ่งให้แห้ง แล้วนำไปติดบน กระดาษสำหรับติดตัวอย่างพันธุ์ไม้ เป็นวิธีที่นิยมกันมาก และการทำแห้งเฉพาะส่วน เป็นการเก็บตัวอย่างส่วนต่างๆ ของพืชมาอบหรือผึ่งให้แห้ง โดยไม่อัดในแผงอัดพรรณไม้ ที่นิยมทำเป็นตัวอย่างแห้งเฉพาะส่วน ได้แก่ ผลและเมล็ด แต่ถ้าเป็นผลสดอาจใช้วิธีการดองในของเหลว การเก็บตัวอย่างพืชแบบแห้งมีจุดประสงค์เพื่อ (1) นำมาวิเคราะห์หาชื่อทางวิทยาศาสตร์ (scientific name) และจำแนกตามหมวดหมู่ให้ถูกต้อง (2) เก็บไว้เป็นหลักฐานอ้างอิงในการวิเคราะห์หาชื่อพรรณไม้ครั้งต่อไป และส่งไปแลกเปลี่ยนกับสถาบันทาง พฤกษศาสตร์แหล่งอื่นๆ ทั้งใน และต่างประเทศ (3) ทราบปริมาณ ถิ่นกำเนิด และการกระจายพันธุ์ของพรรณไม้เพื่อประโยชน์ในการศึกษาด้านอื่นๆ (4) ช่วยแก้ปัญหากรณีที่ไม่สามารถหาตัวอย่างพรรณไม้จริงมาศึกษาได้เนื่องจากความจำเพาะของฤดูกาล และการเจริญเติบโตในบางท้องที่เท่านั้น นอกจากนี้ยังมีเทคนิคการเก็บรักษาตัวอย่างพืชและสัตว์ที่เปราะบางและแตกหักง่าย เรียกว่า การเก็บโดย ฝังตัวอย่างในพลาสติกใส (Plastomount หรือ Plastination) โดยจะต้องทำตัวอย่างให้แห้งก่อน 2. ไมโครเทคนิค (Microtechnique) วิธีการเก็บรักษาตัวอย่างเพื่อศึกษารายละเอียดโครงสร้างของเซลล์และเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตด้วยกล้อง จุลทรรศน์ วิธีการที่นิยมได้แก่ การเตรียมเนื้อเยื่อพืชแบบสดด้วยมือ (Free-hand section) โดยการตัดให้บางพอที่ แสงส่องผ่านจนเห็นรายละเอียดของเนื้อเยื่อ หรือใช้กระบวนการเตรียมเนื้อเยื่อโดยการคงสภาพในน้ำยารักษาสภาพ ตลอดจนการตัดด้วยเครื่องไมโครโตม วิธีการเตรียมเนื้อเยื่อมีหลายวิธีขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ในการศึกษา ตลอดจน ชนิดของเซลล์และเนื้อเยื่อ ไมโครเทคนิคสามารถแบ่งได้ 2 วิธีการดังนี้ 2.1 วิธีการเตรียมเนื้อเยื่อแบบไม่ตัดเป็นชิ้นบาง (Non-section methods) วิธีนี้เหมาะสำหรับศึกษาเซลล์ที่ มีชีวิต (Living cells) เช่น เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (Connective tissue) โพรโทซัว (Protozoa) เลือด (Blood) น้ำเหลือง (Lymph) โครโมโซมพืชและสัตว์ ฯลฯ โดยวางตัวอย่างบนสไลด์ เจือจางด้วยสารที่มีความเข้มข้นเท่ากับภายในเซลล์ จากนั้นนำไปตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แต่ก็จะทำให้สามารถสังเกตเห็นเซลล์ตัวอย่างไม่ชัดเจน วิธีการเตรียมตัวอย่างเนื้อเยื่อแบบนี้สามารถทำได้หลายวิธี (พงศ์พันธุ์ กองทอง. 2538: 17-20; Weesner. 1965: 17-23) เช่น 2.1.1 การเตรียมสไลด์แบบสด (Wet mount) เหมาะสำหรับศึกษาสิ่งมีชีวิต หรือส่วนของสิ่งมีชีวิตที่มีขนาด เล็กและปิดผนึกด้วยน้ำ (Liquid medium) เช่น โพรโทซัว สัตว์น้ำขนาดเล็ก หรือบางส่วนของพืช ฯลฯ 2.1.2 การเตรียมตัวอย่างแห้ง (Dry mount) เหมาะสำหรับศึกษาตัวอย่างที่ไม่มีชีวิต และไม่จำเป็นต้องผนึก ด้วยสาร (Air mount) เช่น ขวาก (Spicule) ฟองน้ำ เส้นขน (Hair หรือ feather) และกระดูกแข็ง (Ground bone) ฯลฯ 2.1.3 การผนึกสไลด์ทั้งตัว (Whole mount) เหมาะสำหรับศึกษาสิ่งมีชีวิต หรืออวัยวะที่มีขนาดเล็กและ แบน เช่น พารามีเซียม แมลงขนาดเล็ก ฯลฯ 2.1.4 การเกลี่ยตัวอย่าง (Smear) เหมาะสำหรับศึกษาเนื้อเยื่อที่เป็นของเหลว หรือกึ่งของเหลว ได้แก่ เลือด น้ำอสุจิ น้ำเหลือง ไขกระดูก ละอองเกสรดอกไม้ หรือเนื้อเยื่อที่มีลักษณะอ่อนนุ่ม เช่น อัณฑะ ฯลฯ 2.1.5 การกดให้แบน (Squash) เหมาะสำหรับศึกษาส่วนประกอบภายในเซลล์โดยไม่คำนึงถึงรูปร่าง ภายนอก เช่น โครโมโซม ฯลฯ 2.1.6 การแบ่งแยก (Maceration) เหมาะสำหรับศึกษาเนื้อเยื่อที่เซลล์ยึดกันอยู่อย่างแข็งแรงด้วยสารยึด ระหว่างเซลล์ (Intercellular cementing substance) เช่น ท่อลำเลียงน้ำของพืช (Xylem) และมัดกล้ามเนื้อของ สัตว์ (Muscle bundle) ฯลฯ 2.2 วิธีการเตรียมเนื้อเยื่อแบบตัดเป็นชิ้นบาง (Section methods) วิธีนี้สามารถศึกษารายละเอียด โครงสร้างของเซลล์จากเนื้อเยื่อที่ตัดเป็นชิ้นบางและย้อมสี โดยแนวในการตัดตัวอย่างที่นิยม ได้แก่ การตัดตามขวาง

4 (Transverse หรือ Cross section) สัญลักษณ์ที่ใช้คือ T.S. หรือ C.S. หรือ X.S. เป็นการตัดตั้งฉากกับแนวยาวของ ตัวอย่าง และการตัดตามยาว (Longitudinal หรือ Sagittal section) สัญลักษณ์ที่ใช้คือ L.S. หรือ S.L.S. เป็นการ ตัดในแนวตั้งฉากกับความกว้างของตัวอย่าง หรือการตัดแนวขนาน (Horizontal หรือ Frontal longitudinal section) เป็นการตัดในแนวขนานกับผิวด้านหลังของตัวอย่าง วิธีการตัดสามารถทำได้หลายแบบ ได้แก่ 2.2.1 การตัดเนื้อเยื่อด้วยมือ (Free-hand section) เหมาะกับการศึกษาเนื้อเยื่อพืชโดยใช้ตัวอย่างสด เนื่องจากผนังเซลล์มีความแข็งแรงและจับด้วยมือได้ และกระบวนการเตรียมตัวอย่างไม่ซับซ้อน 2.2.2 การใช้เครื่องไมโครโตม วิธีนี้จะต้องทำให้เนื้อเยื่อแข็งตัวโดยใช้ความเย็นหรือการฝังในพาราฟิน แล้ว ตัดเนื้อเยื่อที่ฝังในพาราฟินให้มีความหนาตามที่ต้องการในหน่วยไมโครเมตร ตัวอย่างที่นำมาตัดมักเป็นชิ้นหรือแท่ง เช่น ก้านใบ ลำต้นพืช ท่อทางเดินอาหาร ตัวอ่อนสัตว์ รังไข่ ฯลฯ ความหนาของชิ้นตัวอย่างจะบางกว่าการตัดด้วยมือ เช่น การตัดด้วยโรตารีไมโครโตม (Rotary microtome) ความหนาชิ้นตัวอย่าง 4-7 ไมโครเมตร การตัดด้วยอัลตรา ไมโครโตม (Ultramicrotome) ความหนาชิ้นตัวอย่าง 0.5-1.0 ไมโครเมตร สำหรับศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้ แสง (Compound microscope) และความหนาชิ้นตัวอย่างประมาณ 0.07 ไมโครเมตร สำหรับศึกษาด้วยกล้อง จุลทรรศน์อิเล็คตรอน (Electron microscope) และการตัดด้วยเครื่องตัดชิ้นเนื้ออุณหภูมิเยือกแข็ง (Cryostat microtome) ความหนาชิ้นตัวอย่าง 10-60 ไมโครเมตร การเก็บตัวอย่าง เพื่อเป็นประโยชน์ในการเก็บรักษาตัวอย่าง ให้ข้อมูลมีความถูกต้องและชัดเจน ต้องคำนึงถึงรายละเอียดใน การเก็บตัวอย่างดังต่อไปนี้ 1. จุดประสงค์ของการเก็บตัวอย่าง เป็นสิ่งสำคัญและมีความแตกต่างกันออกไป ซึ่งจะเป็นตัวกำหนด ขอบเขตในการวางแผนงาน และการกำหนดรูปแบบของการจัดเก็บตัวอย่าง 2. แหล่งเก็บตัวอย่าง ส่วนใหญ่จะอยู่ในธรรมชาติ เช่น ป่าไม้ แม่น้ำ ลำธาร ป่าชายเลน และทะเล เป็นต้น ผู้เก็บตัวอย่างต้องค้นคว้าข้อมูลด้านชีววิทยาและนิเวศวิทยาของสิ่งมีชีวิตที่จะไปเก็บก่อน รวมทั้งอุปกรณ์ที่จำเป็นต้อง ใช้คือ แผนที่ 3. การประสานงานกับหน่วยงานที่เกี่ยวข้อง การเก็บตัวอย่างบางพื้นที่จำเป็นต้องประสานงานกับ หน่วยงานของรัฐที่ทำงานเกี่ยวข้องกับการจัดการทรัพยากรสิ่งมีชีวิต ซึ่งจะทำหน้าที่ควบคุมดูแลสถานที่หรือออก กฎระเบียบต่างๆ เช่น กรมประมง กรมป่าไม้ ศูนย์วิจัย สถานเพาะเลี้ยง หรือสถาบันต่างๆ เป็นต้น 4. การเตรียมอุปกรณ์ในการเก็บตัวอย่าง อุปกรณ์ในการเก็บตัวอย่างโดยทั่วไป เช่น เสียม กรรไกร เทปวัด ระยะ ถุงหรือภาชนะใส่ตัวอย่าง น้ำยาหรือสารเคมี แว่นขยาย กล้องถ่ายรูป ป้ายรหัสประจำตัวอย่าง สมุดบันทึกและ ดินสอ เครื่องบอกตำแหน่ง (GPS) เป็นต้น 5. การบันทึกข้อมูล การใส่รายละเอียดทั้งหมดของตัวอย่างที่ต้องการ เช่น ชื่อสามัญ (Common name) ชื่อวิทยาศาสตร์ (Scientific name) เป็นต้น นอกจากนี้ถ้าออกเก็บตัวอย่างภาคสนามจำเป็นต้องบันทึกข้อมูลจาก แหล่งเก็บ (Field note) เป็นรายละเอียดที่เกี่ยวข้องกับตัวอย่างสามารถนำใช้เป็นประวัติของตัวอย่างและผู้เก็บ ตัวอย่าง ประกอบด้วยข้อมูลดังนี้ 5.1 วัน เดือน ปี ที่เก็บตัวอย่าง 5.2 ชื่อพื้นเมือง ชื่อที่ใช้เรียกในสถานที่เก็บตัวอย่าง 5.3 แหล่งอาศัย เช่น บนบก ในน้ำ ริมแม่น้ำ ลำธาร ฯลฯ 5.4 ลักษณะทั่วไป โดยบรรยายลักษณะภายนอกที่เด่นชัดขณะเก็บตัวอย่าง 5.5 ข้อมูลอื่นๆ ได้แก่ เลขรหัสตัวอย่าง สภาพแวดล้อม น้ำยาคงสภาพที่ใช้ ชื่อผู้เก็บตัวอย่าง ฯลฯ 6. การเก็บตัวอย่าง การเลือกเก็บตัวอย่างที่สมบูรณ์ กรณีตัวอย่างพืชต้องให้มีพร้อมทั้งดอก ใบ และผล เพราะการจำแนกชนิดของพืชต่างๆ ต้องอาศัยลักษณะของดอกเป็นสำคัญ และนอกจากนี้แล้วยังต้องอาศัยลักษณะ อื่นๆ ประกอบด้วย เช่น ใบ ผล ลำต้น เป็นต้น

5 7. การขนย้ายตัวอย่าง การขนย้ายตัวอย่างจากภาคสนามหรือแหล่งเก็บรวบรวมเป็นขั้นตอนที่สำคัญ เพราะถ้าขาดความรู้ ความระมัดระวังอาจทำให้ตัวอย่างชำรุดเสียหายจนไม่สามารถใช้งานได้ 8. การเก็บรักษาตัวอย่าง การรักษาสภาพตัวอย่างให้คงลักษณะเดิมไว้ให้มากที่สุด หรือมีสภาพเหมือน ใกล้เคียง กับสภาพในขณะที่สิ่งมีชีวิตนั้นมีชีวิตอยู่ เพื่อป้องกันการเสียหายที่เกิดขึ้นกับตัวอย่าง ดังนั้นจึงต้องใช้เทคนิค ช่วยรักษาสภาพตัวอย่าง เช่น การแช่แข็ง แช่ในน้ำยาเคมี ฯลฯ การบันทึกข้อมูลภาคสนาม รหัสตัวอย่าง ................................... รหัสภาพถ่าย .................................. ข้อมูลทั่วไป 1. สถานที่เก็บตัวอย่าง .............................................................................................................. พิกัดละติจูด ...................................................... ลองติจูด ........................................................ สภาพแวดล้อมที่พบตัวอย่าง ..................................................................................................... ปัจจัยทางกายภาพ .................................................................................................................... ................................................................................................................................................... 2. วันเดือนปี ที่เก็บตัวอย่าง ........................................................ เวลา .................................... 3. ผู้เก็บตัวอย่าง ........................................................................................................................ ข้อมูลตัวอย่าง 1. ชื่อท้องถิ่น ..................................... ชื่อทั่วไป ......................................................................... 2. ชื่อสามัญ .................................. ชื่อวิทยาศาสตร์ .................................................................. 3. อนุกรมวิธาน Phylum ............................................................................................... Class ............................................................................................... Order ............................................................................................... Family ............................................................................................... Genus ............................................................................................... Species ............................................................................................... ลักษณะสัณฐานวิทยาภายนอก 1. ขนาด กว้าง .............................................. ความยาว ............................................................ 2. น้ำหนัก .................................................... เพศ ..................................................................... 3. ลักษณะภายนอก .................................................................................................................. ................................................................................................................................................... 4. อื่นๆ ..................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................

6 การสลบตัวอย่าง การนำตัวอย่างเนื้อเยื่อสิ่งมีชีวิตไปใช้ศึกษาหรือตรวจสอบ จำเป็นต้องวางแผนการดำเนินงานให้ถูกต้องและ รอบคอบ เพื่อให้ตัวอย่างมีสภาพคงเดิม ก่อนการแยกชิ้นส่วนตัวอย่างควรทำให้ตัวอย่างสงบลงแต่ไม่ถึงตาย (Anesthetizing) ด้วยการใช้สารที่เหมาะสม แล้วจึงแยกเนื้อเยื่อที่ต้องการออกเป็นส่วนขนาดเล็กเพื่อคงสภาพใน น้ำยารักษาสภาพ ในกรณีของตัวอย่างพืชสามารถตัดเอาชิ้นส่วนหรือการขุดมาทั้งราก แล้วแช่ในสารทำให้คงสภาพที่ เหมาะสมได้ (พงศ์พันธุ์ กองทอง. 2538: 24-44) ในส่วนของเนื้อเยื่อสัตว์ให้ปฏิบัติดังนี้ 1. หลักการสลบตัวอย่างสัตว์ การสลบจะทำให้ตัวอย่างสัตว์หมดความรู้สึก ร่างกายจะหยุดกระบวนการเมแทบอลิซึม (Metabolism) ลง ทีละน้อย ซึ่งเป็นการทำให้สัตว์อยู่ในสภาพใกล้เคียงในขณะที่มีชีวิตสามารถทำได้ 2 แบบ ดังนี้ 1.1 การดมสลบสัตว์ที่มีลำตัวขนาดเล็ก ได้แก่ สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง และตัวอ่อน (Larva) ของสัตว์มี กระดูกสันหลัง นิยมใส่สารทำให้สลบลงไปในภาชนะที่เลี้ยงสัตว์ทีละน้อยจนกว่าสัตว์ไม่เคลื่อนไหว นอกจากนี้ยัง สามารถใช้วิธีการทำให้ขาดก๊าซออกซิเจน การเติมก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ หรือการแช่ในน้ำเย็นจัดสำหรับสัตว์ที่ อาศัยในน้ำ 1.2 การดมสลบสัตว์ที่มีลำตัวขนาดใหญ่พวกสัตว์มีกระดูกสันหลัง (สัตว์ที่นิยมนำมาใช้ศึกษาทางไมโคร เทคนิค เช่น หนู กระต่าย แมว สุนัข ฯลฯ เพราะหาง่าย ราคาไม่แพงมาก เมื่อเทียบสัตว์ขนาดใหญ่มาก) โดยนำ ตัวอย่างสัตว์ใส่ในภาชนะปิดที่รองพื้นด้วยสำลี หรือผ้าก๊อซที่ใส่สารสลบ เมื่อสัตว์นั้นนอนนิ่งแล้วจึงนำไปผ่าแยก ชิ้นส่วนและคงสภาพอวัยวะในสารคงสภาพ 2. สารที่นิยมใช้ในการสลบสัตว์ สารที่ใช้สำหรับทำให้สัตว์สลบมีหลายชนิด นักศึกษาควรเลือกใช้สารตามวัตถุประสงค์การใช้งาน ดังต่อไปนี้ 2.1 แมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) หรือแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เหมาะสำหรับสัตว์ที่อาศัยอยู่ทั้งในน้ำ จืดและน้ำเค็ม เช่น ดอกไม้ทะเล ปะการัง และทากเปลือย ฯลฯ 2.2 เอทิลแอลกอฮอล์ เหมาะสำหรับสัตว์ที่อาศัยอยู่ในน้ำจืดและน้ำเค็ม โดยใช้ความเข้มข้นร้อยละ 10–15 2.3 คลอรัลไฮเดรต (Choral hydrate) ใช้ได้ผลดีกับไฮดรอยด์ (Hydroid) ของสัตว์กลุ่มไนดาเรียน (Cnidarians) กลุ่มนีเมอร์ทีน (Nemerteans) และหอยบางชนิด 2.4 คลอโรฟอร์ม หรืออีเทอร์ ใช้ได้ผลดีกับสัตว์มีกระดูกสันหลัง เช่น หนู กระต่าย สุนัข ฯลฯ และสัตว์ไม่มี กระดูกสันหลัง เช่น แมลง ฯลฯ 2.5 เมนทอล เหมาะสำหรับสัตว์กลุ่มไนดาเรียน เช่น แมงกะพรุน และกลุ่มนีเมอร์ทีน เช่น พยาธิใบไม้ ฯลฯ การคงสภาพตัวอย่าง สิ่งมีชีวิตหลังการตายจะมีการเปลี่ยนแปลงเซลล์และเนื้อเยื่ออย่างรวดเร็ว ถ้าสามารถหยุดกระบวนการ ดังกล่าวได้จะส่งผลดีต่อเนื้อเยื่อที่นำมาศึกษาทางชีววิทยา ดังนั้นจึงจำเป็นต้องรักษาสภาพเนื้อเยื่อตัวอย่างให้ ใกล้เคียงกับธรรมชาติมากที่สุด โดยการใช้สารเคมีช่วยในกระบวนการดังกล่าว การทำให้คงสภาพจึงเป็นขั้นตอนที่มี ความสำคัญมากก่อนนำเนื้อเยื่อเข้าสู่กระบวนการอื่นต่อไป ดังนั้นการทำให้คงสภาพ (Fixation) เป็นการทำให้ ตัวอย่างสิ่งมีชีวิตตายลงอย่างรวดเร็ว โดยปราศจากการย่อยสลายตัวเองและการทำลายของจุลินทรีย์ รวมทั้งการทำ ให้เซลล์และสารเคมีที่อยู่ภายในเซลล์ไม่มีการเปลี่ยนแปลงไปจากเดิมด้วยสารทำให้คงสภาพ (Fixative หรือ Fixing solution) (Humason. 1972: 1-167) 1. คุณสมบัติของน้ำยาคงสภาพเนื้อเยื่อ การทำให้คงสภาพมักทำในขณะที่สัตว์ยังมีชีวิตอยู่หรือภายหลังการตายทันที โดยจุ่มหรือแช่ตัวอย่างลงใน สารทำให้คงสภาพ ถ้าเป็นตัวอย่างขนาดใหญ่ควรตัดแบ่งเนื้อเยื่อออกเป็นชิ้นขนาดเล็กพอที่จะทำให้สารคงสภาพ แทรกซึมเข้าไปถึงตรงกลางของเนื้อเยื่อได้อย่างทั่วถึงและรวดเร็ว สารคงสภาพจะทำให้ส่วนของไซโทพลาสซึมแข็งตัว ป้องกันเนื้อเยื่อไม่ให้บิดงอหรือเหี่ยวย่น นอกจากนี้ยังเป็นตัวกลางทำให้โปรตีนเชื่อมต่อกับสีส่งผลต่อการติดสีย้อมที่ดี ขึ้น

7 2. ผลกระทบของการทำให้ตัวอย่างคงสภาพ เมื่อเนื้อเยื่อผ่านการทำให้คงสภาพแล้ว ยังคงต้องผ่านกระบวนการอีกหลายขั้นตอน จนกระทั่งถึงการผนึก เป็นสไลด์ถาวร ซึ่งอาจทำให้เซลล์หดตัว พองตัว บิดเบี้ยว และฉีกขาดได้ง่าย ดังนั้นสารคงสภาพต้องสามารถป้องกัน การเกิดความเสียหายเหล่านั้นได้ แต่อาจจะส่งผลกระทบบางประการ ได้แก่ เนื้อเยื่อแข็งมากขึ้น เซลล์ไม่ยืดหดตาม สภาพแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงไป การหักเหของแสงในเซลล์บางชนิดดีขึ้น ช่วยหรือยับยั้งการย้อมติดสี 3. ปัจจัยที่มีผลต่อการคงสภาพ น้ำยาคงสภาพที่ดีต้องไม่ทำลายเซลล์และเนื้อเยื่อสิ่งมีชีวิต ทำให้โพรโทพลาสซึมของเซลล์อยู่ในสภาพเป็น ของแข็งและมีความคงตัว ประสิทธิภาพในการคงสภาพของสารจึงขึ้นกับปัจจัยหลายประการดังนี้ 3.1 ความเป็นกรด-ด่างของสารละลาย การคงสภาพที่ดีนั้นสารละลายจะมีค่าความเป็นกรด-ด่างในช่วง 6-8 การรักษาสภาพของสารละลายโดยการเติมสารผ่อนความเป็นกรด-ด่างลงไป เช่น ฟอสเฟต (Phosphate) ไบ คาร์บอเนต (Bicarbonate) แคคโคไดเลต (Cacodylate) และเวอร์โรนอล (Veronal) ฯลฯ 3.2 อุณหภูมิ ช่วงอุณหภูมิที่เหมาะสมจะทำให้สารคงสภาพแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ดี เช่น การเพิ่มอุณหภูมิ สารคงสภาพฟอร์มาลินจะทำให้สารเกิดปฏิกิริยากับเนื้อเยื่อได้ดีขึ้น 3.3 ความเข้มข้นของสารคงสภาพ โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ความเข้มข้นต่ำสุดเสมอ เพื่อลดค่าใช้จ่ายในการ เตรียมสารคงสภาพ ความเข้มข้นที่สูงเกินไปอาจส่งผลเสียต่อเนื้อเยื่อ เช่น ฟอร์มาลินนิยมใช้ความเข้มข้นร้อยละ 10 และกลูตารอลดีไฮด์นิยมใช้ความเข้มข้นร้อยละ 2.5-4.0 ฯลฯ 3.4 ระยะเวลาในการแช่สาร โดยเฉพาะช่วงเวลาในการย้ายตัวอย่างจากสารคงสภาพควรปฏิบัติด้วยความ รวดเร็ว ไม่ควรปล่อยให้เนื้อเยื่อแห้ง เพราะจะส่งผลต่อออร์แกเนลล์ภายในเซลล์ นิวเคลียสหดตัวและเกิดการจับตัว ของโปรตีน 3.5 ความหนาของชิ้นตัวอย่าง ขนาดที่เหมาะสมของชิ้นตัวอย่างควรมีเส้นผ่านศูนย์กลางไม่เกิน 2 มิลลิเมตร หรือหนาไม่เกิน 3-5 มิลลิเมตร ถ้าเนื้อเยื่อนิ่มไม่สะดวกต่อการตัด ควรแช่ในน้ำยาคงสภาพนาน 10-30 นาที แล้วจึง ตัดแบ่งเป็นชิ้นเล็ก 3.6 ปริมาตรของสารคงสภาพ ต้องไม่น้อยกว่า 10-15 เท่าของปริมาตรเนื้อเยื่อ ดังนั้นต้องใช้สารคงสภาพ มากกว่าปริมาตรของเนื้อเยื่อประมาณ 30-50 เท่า ชนิดของสารคงสภาพตัวอย่าง สารเคมีที่ช่วยคงสภาพจะทำให้กระบวนการเมแทบอลิซึมในโพรโทพลาสซึมของเซลล์หยุดลงทันที และทำ ให้เกิดการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด สารทำให้คงสภาพที่นิยมใช้มีหลายชนิด ได้แก่ 1. กรดอะซิติก กรดอะซิติก (Acetic acid) เป็นสารที่นิยมใช้กันอย่างกว้างขวาง สามารถแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อได้ รวดเร็ว ทำให้โปรตีนในนิวเคลียสของเซลล์ตกตะกอน เนื้อเยื่อเปลี่ยนแปลงรูปร่างหรือขยายขนาดใหญ่ขึ้น กรด อะซิติกมักใช้ร่วมกับสารอื่นหลายชนิด แต่มีข้อเสียคือ อัตราการแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อช้าจึงส่งผลเสียต่อนิวเคลียส และมีแนวโน้มทำให้เนื้อเยื่อเหี่ยว 2. ฟอร์มาลิน หรือฟอร์มาดีไฮด์ ฟอร์มาลิน หรือฟอร์มาดีไฮด์ เป็นสารคงสภาพอีกชนิดหนึ่งที่นิยมใช้ แต่มีกลิ่นเหม็นฉุน ทำให้เกิดการ ระคายเคืองเยื่อบุต่างๆ สารนี้สามารถแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ดี ทำให้เนื้อเยื่อแข็งตัวแต่ไม่เปราะ รักษาโครงสร้าง ไซ โทพลาสซึม และนิวเคลียสของเซลล์ได้ดี ฟอร์มาลินไม่ทำให้นิวคลีโอโปรตีน (Nucleoprotein) และโปรตีนอื่นเกาะ กันเป็นก้อน นอกจากนี้ยังทำให้เนื้อเยื่อติดสีย้อมได้ดี แต่เมื่อนำฟอร์มาลินรวมกับสารอื่นจะทำให้โปรตีนในเซลล์ แยกตัว แบ่งได้ 2 ชนิด 2.1 ฟอร์มาลินความเข้มข้นร้อยละ 10 (ฟอร์มาลดีไฮด์ร้อยละ 4) ใช้เวลาการแช่ตัวอย่างประมาณ 24-48 ชั่วโมง หรือแช่ทิ้งไว้เป็นเวลานานได้ หลังจากทำให้คงสภาพแล้วควรเก็บเนื้อเยื่อไว้ในฟอร์มาลินความเข้มข้นร้อยละ 5 จนกว่าจะมีการดำเนินการในขั้นต่อไป

8 2.2 นิวทรอลบัฟเฟอร์ (Neutral Buffer Formalin solution, NBF) นิยมใช้มาก เหมาะกับการคงสภาพ เนื้อเยื่อทั่วไป ระยะเวลาการแช่ประมาณ 24 ชั่วโมง หรือนานกว่าได้ แต่จะมีเม็ดตะกอนฟอร์มาลินสีน้ำตาลตกค้างใน เนื้อเยื่อ 3. เอทิลแอลกอฮอล์ หรือเอทานอล เอทิลแอลกอฮอล์ หรือเอทานอล (Ethanol) เป็นสารที่ได้รับความนิยมอีกชนิดหนึ่ง ช่วยเก็บรักษาสาร บางอย่างที่ละลายในน้ำ เช่น ไกลโคเจน และเกลือโลหะ ฯลฯ แต่มีข้อเสียคือ ทำให้เนื้อเยื่อแข็งตัวมากเกินไปและ เซลล์เหี่ยว เอทิลแอลกอฮอล์มีความเข้มข้นสูงถึงร้อยละ 100 เรียกกันทั่วไปว่า เอทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์ แต่นิยมใช้ ร้อยละ 70-95 เพื่อทำให้เนื้อเยื่อคงสภาพ ซึ่งอาจใช้ร่วมกับกรดอะซิติกเข้มข้น (Glacial acetic acid) หรือสารอื่น เพื่อใช้เป็นสารทำให้คงสภาพ ซึ่งจะทำให้อัตราการแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อดีขึ้น สูตรที่นิยมใช้มีดังนี้ 3.1 น้ำยาคงสภาพคาร์นอย (Carnoy’s fluid) หรือสารทำให้คงสภาพคาร์นอย (Carnoy’s fixative) นิยม ใช้กับเนื้อเยื่อที่ค่อนข้างหนา สารแทรกซึมเข้าไปได้ยาก เช่น พวกนีมาโทด (Nematode) หรือพวกหนอนตัวกลม โดย ใช้เวลาแช่ประมาณ 30 นาที หรือมากกว่า 3.2 ฟอร์มาลิน–อะซิติก–แอลกอฮอล์ (Formalin–Acetic–Alcohol) นิยมเขียนแทนด้วยเอฟเอเอ (FAA) หรือเอเอฟเอ (AFA) นิยมใช้กับเนื้อเยื่อพืชโดยเตรียมในความเข้มข้นร้อยละ 70 รวมทั้งยังสามารถรักษาสภาพเนื้อเยื่อ สัตว์ได้ ส่วนผสมที่ใช้มีความแตกต่างกันขึ้นกับชนิดพืชหรือสัตว์และมีหลายสูตร ได้แก่ สูตรของลาฟโดสกี (Lavdosky) ซึ่งใช้กับเนื้อเยื่อสัตว์โดยเฉพาะเอ็มบริโอ (Embryo) ที่มีขนาดเล็ก สูตรของมอสส์มัน (Mossman) ใช้กับ เนื้อเยื่อสัตว์ที่มีขนาดค่อนข้างใหญ่ 4. กรดพิคริก หรือไตรไนโตรฟีนอล กรดพิคริก หรือไตรไนโตรฟีนอล (Trinitrophenol) สารชนิดนี้ต้องเตรียมให้อยู่ในรูปของสารละลายพิคริก อิ่มตัว (Saturated picric acid) ซึ่งละลายได้ดีกับแอลกอฮอล์ กรดพิคริกทำให้โปรตีนเกาะกันเป็นก้อน เกิดร่างแหใน นิวเคลียส และไซโทพลาสซึม ส่วนมากนิยมใช้ร่วมกับสารชนิดอื่นเป็นสารคงสภาพผสม (Mixture fixative) สูตรที่ นิยมใช้กันแพร่หลาย ได้แก่ 4.1 น้ำยาบูแอง โดยสามารถแช่เนื้อเยื่อไว้ได้ตั้งแต่ 12 ชั่วโมง ขึ้นไปจนกระทั่งถึงหลายวัน ขึ้นอยู่กับขนาด ของเนื้อเยื่อโดยเนื้อเยื่อไม่เสีย และไม่ทำให้เนื้อเยื่อนั้นแข็งมากจนเกินไป แต่ไม่เป็นผลดีต่อการติดสีย้อม 4.2 น้ำยาฮอลแลนเดอ (Hollande’s fluid) สารทำให้คงสภาพอีกชนิดหนึ่งที่ดัดแปลงจากน้ำยาบูแอง เหมาะสำหรับใช้กับโพรโทซัวในการทำสไลด์แบบสเมียร์ 4.3 น้ำยาดูบอสและบราซิล (Duboscq and Brazil’s fluid) น้ำยานี้ดัดแปลงมาจากน้ำยาบูแอง นิยมใช้ กับสัตว์กลุ่มแมลง ครัสเตเชียน (Crustacean) และนีมาโทดขนาดเล็ก ปกติใช้เวลาในการทำให้คงสภาพ 12-24 ชั่วโมง หรือขึ้นอยู่กับขนาดของตัวอย่าง 5. เมอร์คิวริกคลอไรด์ เมอร์คิวริกคลอไรด์ (Mercuric chloride) สารนี้สามารถรักษาโครงสร้างพวกแคลเซียมคาร์บอเนต (Calsium carbonate) โดยแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อได้ช้า ทำให้โปรตีนเกาะกันเป็นก้อน แต่โครงสร้างที่มีขนาดเล็ก และบอบบางอาจถูกทำลายหรือเหี่ยวย่น สารนี้สามารถใช้ได้ทั้งเป็นสารคงสภาพเพียงชนิดเดียว (Single fixative) หรือใช้ร่วมกับสารอื่น (Mixture fixative) ได้แก่ 5.1 น้ำยาคงสภาพสับลิเมต-อะซิติก (Sublimate-acetic) สารนี้ใช้กับพวกหนอนตัวแบนเพื่อเตรียมสไลด์ แบบผนึกทั้งตัว ถ้าเป็นสัตว์ทะเลให้ใช้น้ำทะเลแทนน้ำกลั่น สำหรับเนื้อเยื่อของสัตว์มีกระดูกสันหลังให้ใช้สารละลาย เกลือที่มีความเข้มข้นเท่ากับความเข้มข้นภายในเซลล์ของสัตว์ชนิดนั้นแทนน้ำกลั่น 5.2 น้ำยาคงสภาพแซงเกอร์ (Zenker’s fluid) เป็นสูตรที่นิยมใช้กับเนื้อเยื่อและเอ็มบริโอ เพื่อใช้รักษา สภาพนิวเคลียส ไซโทพลาสซึม และส่วนประกอบของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน โดยผสมรวมกับกรดอะซิติกเข้มข้นและ ระยะเวลาในการแช่ตัวอย่างประมาณ 3-24 ชั่วโมง เนื้อเยื่อที่แช่ไว้ในน้ำยาชนิดนี้ไม่ควรปล่อยทิ้งไว้นานเกินไป เพราะ จะทำให้ปรอทตกตะกอนภายในเนื้อเยื่อ

9 5.3 น้ำยาคงสภาพเฮลลี (Helly’s fluid) สารทำให้คงสภาพสูตรนี้ดัดแปลงมาจากน้ำยาสภาพแซงเกอร์ เหมาะกับเนื้อเยื่อที่จะย้อมด้วยสีย้อมแอนนิลีน (Aniline dye) โดยให้เติมฟอร์มาลินลงไปในสารละลายเข้มข้นก่อนใช้ ทุกครั้ง 5.4 น้ำยาคงสภาพไฮเดนเฮน (Heidenhain’s fluid) หรือซูซา (Susa’s fluid) เป็นสูตรที่รวมสารเมอร์คิว ริกคลอไรด์เข้ากับกรดคลอโรอะซิติก (Chloroacetic acid) ประสิทธิภาพดีเท่ากับน้ำยาคงสภาพแซงเกอร์ กรดไตร คลอโรอะซิติกเป็นกรดเข้มข้นใช้เป็นตัวทำละลายสารพวกแคลเซียม จึงมีแนวโน้มทำให้เส้นใยคลอลาเจน (Collagan fiber) ขยายขนาด 5.5 น้ำยาคงสภาพชาวแดง (Schaudin’s fliud) เป็นสูตรที่ผสมระหว่างแอลกอฮอล์กับเมอร์คิวริกคลอไรด์ นิยมใช้กับพวกโพรโทซัว แต่ไม่นิยมใช้กับเนื้อเยื่อทั่วไป 6. กรดโครมิก กรดโครมิก (Chromic acid) มีคุณสมบัติในการแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ช้า ทำให้เนื้อเยื่อเปราะและ เปลี่ยนแปลงรูปร่างไปจากเดิมพอประมาณ แต่ข้อดีคือจะทำให้ไซโทพลาซึม และนิวเคลียสของเซลล์เกาะกันเป็น ร่างแห จึงทำให้โครโมโซมคงสภาพได้ดี น้ำยาคงสภาพที่มีส่วนผสมของกรดโครมิกคือ น้ำยาคงสภาพเฟลมมิ่ง (Fleming's fluid) สูตรนี้มีส่วนผสมของออสเมียมเตตรอกไซด์ (Osmium tetroxide) และกรดอะซิติกซึ่งมี2 สูตรคือ สูตรสารละลายอ่อน (Fleming’s “week” solution) กับสูตรสารละลายเข้มข้น (Fleming’s “strong” solution) น้ำยาทั้งสองสูตรนี้มีคุณสมบัติในการแทรกซึมเข้าสู้เนื้อเยื่อได้ช้า เนื้อเยื่อที่ใช้จึงต้องมีขนาดเล็ก 7. ออสเมียมเตตรอกไซด์ ออสเมียมเตตรอกไซด์ (นิยมเรียกว่ากรดออสมิก) เป็นสารอันตรายและราคาแพงมาก จึงไม่นิยมใช้กับงาน ด้านไมโครเทคนิคพื้นฐาน สารนี้ไม่ทำให้โปรตีนเกาะกันเป็นก้อน รักษาโครงสร้างและออร์แกเนลล์ของเซลล์ได้ดี และ ทำให้โปรตีนในไซโทพลาสซึมของเซลล์กลายเป็นเนื้อเดียวกันจึงทำให้เซลล์มีสภาพใกล้เคียงกับเมื่อยังมีชีวิตอยู่มาก ด้วยเหตุนี้จึงนิยมใช้ทำให้เซลล์คงสภาพเพื่อศึกษาเซลล์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ออสเมียมเตตรอกไซด์มี คุณสมบัติในการแทรกซึมเข้าสู่เนื้อเยื่อได้ช้า วัสดุหรือเนื้อเยื่อที่ต้องการทำให้คงสภาพจึงควรมีลักษณะเป็นชิ้นหรือ เป็นท่อนขนาดเล็ก น้ำยารักษาสภาพที่เตรียมจากออสเมียมเตตรอกไซด์ ได้แก่ น้ำยาคงสภาพเฟลมมิ่งที่กล่าวไว้แล้ว ในข้อ 6 และการใช้ไอระเหยของกรดออสมิก นิยมใช้กับเนื้อเยื่อที่เป็นชิ้นบาง โพรโทซัว และสัตว์ที่มีขนาดเล็ก สารทำให้คงสภาพบางชนิดเมื่อทำให้เนื้อเยื่อคงสภาพแล้ว ต้องล้างเนื้อเยื่อด้วยน้ำเป็นเวลานานเพื่อกำจัด สารคงสภาพส่วนเกินที่ติดมากับเนื้อเยื่อ เพราะจะส่งผลต่อการย้อมติดสีในขั้นตอนการย้อมสี การคงสภาพเนื้อเยื่อพืช ก่อนที่จะนำตัวอย่างพืชมาทำให้คงสภาพจำเป็นต้องเก็บรวบรวมพืช โดยเลือกตัวอย่างที่มีโครงสร้างครบ สมบูรณ์ และได้รับความบอบช้ำน้อยที่สุด เพื่อให้มีสภาพโครงสร้างและรายละเอียดของเซลล์ใกล้เคียงกับในธรรมชาติ ถ้าไม่ทำให้คงสภาพทันทีควรเก็บรักษาตัวอย่างให้ได้รับความกระทบกระเทือน หรือเหี่ยวเฉาน้อยที่สุดในขณะขนส่ง ไปยังห้องปฏิบัติการ 1. การเก็บรวบรวมตัวอย่างพืชก่อนการทำให้คงสภาพ ความแตกต่างของโครงสร้างเนื้อเยื่อพืชมีหลายประเภท ถ้าเก็บตัวอย่างไม่ตรงกับวัตถุประสงค์ที่ตั้งไว้ อาจทำให้ เสียเวลา และสิ้นเปลืองทรัพยากร นักศึกษาควรเลือกเก็บพืชให้ถูกต้อง ด้วยวิธีที่เหมาะสม แล้วจึงแช่ในสารทำให้คง สภาพ โดยมีข้อควรปฏิบัติหลายประการดังนี้ 1.1 ราก เพื่อป้องกันไม่ให้เนื้อเยื่อชั้นคอร์เทกซ์ (Cortex) และสตีล (Stele) ถูกทำลาย ควรใช้จอบหรือ เสียมขุดขึ้นมา แล้วนำรากไปแกว่งในน้ำให้ดินหลุดออก ใช้แปรงที่อ่อนนิ่มหรือปลายพู่กันแปรงดินที่ติดอยู่ให้หลุด ออกไปให้มากที่สุด ตัดรากส่วนที่ต้องการและนำไปเก็บรักษาไว้ในตู้เย็นหรือแช่ในสารทำให้คงสภาพได้ 1.2 ลำต้น ถ้าไม่ทำให้คงสภาพทันทีสามารถเก็บรักษาให้สดได้หลายวัน โดยวางลำต้นในภาชนะที่หล่อด้วย น้ำหรือตัดลำต้นเป็นท่อนยาว ห่อด้วยกระดาษชุ่มน้ำในภาชนะปิดสนิทและเก็บไว้ในตู้เย็น

10 1.3 ใบ ใช้มีดที่มีความคมตัดก้านใบ ห้ามดึงหรือเด็ดเพราะมัดท่อลำเลียง (Vascular bundle) อาจฉีกขาด ได้ ถ้าเก็บไว้ในช่วงระยะเวลาสั้นให้วางใบไว้บนกระดาษชุ่มน้ำและเก็บไว้ในภาชนะปิดสนิท นำไปเก็บไว้ในที่เย็น จนกว่าจะทำให้คงสภาพต่อไป 1.4 ดอก ให้ตัดมาทั้งดอกหรือทั้งช่อด้วยมีดที่มีความคม เก็บรักษาเช่นเดียวกับการเก็บใบในภาชนะปิดสนิท และการเก็บส่วนผลให้ปฏิบัติด้วยวิธีเดียวกัน 1.5 ลิเวอร์เวิร์ต และมอส ให้เก็บรวบรวมมาทั้งแผ่นรวมทั้งวัตถุที่เกาะติด เก็บไว้ในภาชนะที่เปียกชื้น เพื่อ ทำให้แยกพืชแต่ละต้นที่เกาะติดอยู่ออกได้ง่ายโดยพืชไม่ถูกทำลาย 1.6 สาหร่าย ให้เก็บมาพร้อมกับน้ำที่สาหร่ายอาศัยอยู่ เก็บไว้ในสภาพที่มีอากาศเย็นเมื่อถึงห้องปฏิบัติการ จะต้องรีบทำให้คงสภาพทันที 2. การตัดแบ่งเนื้อเยื่อพืชเพื่อทำให้คงสภาพ การคงสภาพเนื้อเยื่อพืชมีลักษณะคล้ายกับเนื้อเยื่อสัตว์ คือต้องตัดแบ่งอวัยวะออกเป็นชิ้นขนาดเล็กก่อนทำ ให้คงสภาพ เพื่อให้สารคงสภาพแทรกซึมเข้าไปหยุดกิจกรรมของเซลล์และเนื้อเยื่ออย่างรวดเร็ว เพราะสารจะซึมผ่าน คิวติเคิล (Cuticle) และคอร์ก (Cork) ได้ยาก การตัดแบ่งลำต้นหรือใบที่ยังสดอยู่ทำได้โดยวางลงบนกระดาษที่ชุ่มน้ำ แล้วใช้ใบมีดที่มีความคมตัดโดยไม่ใช้แรงกดเพราะแรงกดจะทำลายเนื้อเยื่อหรือโครงสร้างส่วนที่บอบบาง เช่น เซลล์ ชั้นมีโซฟิลล์ (Mesophyll) ของใบหรือคอลเลงคิมา (Collenchyma) ของลำต้น และถ้าลำต้นมีขนาดเส้นผ่าน ศูนย์กลางตั้งแต่ 5 มิลลิเมตรขึ้นไป ควรตัดให้เป็นท่อนยาว 15 มิลลิเมตร หรือพืชที่มีอายุมากต้องตัดเนื้อเยื่อดังกล่าว ออกเป็นแว่นหนา 2-3 เซนติเมตร แล้วจึงแช่ในสารทำให้คงสภาพ ฯลฯ 3. ประเภทของการทำให้เนื้อเยื่อพืชคงสภาพ ตัวอย่างพืชที่ผ่านการคัดเลือกหรือการเก็บรวบรวมตัวอย่างแล้ว ต้องนำมาผ่านวิธีการเก็บรักษาให้ เหมาะสม เพื่อทำให้ตัวอย่างคงสภาพด้วยสารทำให้คงสภาพ และคงอยู่ในลักษณะตัวอย่างทั้งลำต้น ใบและดอก สามารถทำได้ 2 วิธี คือ 3.1 การดองหรือการรักษาสภาพในของเหลว แล้วสามารถนำเนื้อเยื่อพืชที่ผ่านการคงสภาพเพื่อเตรียม สไลด์ถาวรด้วยกระบวนการพาราฟิน โดยทำให้พาราฟินเหลวแทรกซึมเข้าไปและนำไปฝั่งตรึงไว้ในพาราฟินแข็งด้วย เทอร์เทียรีบิวทิลแอลกอฮอล์ (Tertiary butyl alcohol) แล้วจึงเข้าสู่กระบวนการตัดเนื้อเยื่อให้บาง ย้อมสี และผนึก เป็นสไลด์ถาวร หรือเก็บรักษาตัวอย่างพืชไว้ในน้ำยาดองเป็นเวลานาน 3.2 การทำแห้งด้วยวิธีการอบหรือตากแห้ง ด้วยแผงอัดพรรณไม้ แล้วเย็บตัวอย่างบนกระดาษแข็ง เหมาะ สำหรับพืชที่มีขนาดลำต้นใหญ่โต และการทำแห้งเฉพาะส่วน เช่น การเก็บผลหรือเมล็ดพืช หรือพืชที่มีขนาดเล็ก เช่น มอส ลิเวอร์เวิด การคงสภาพเนื้อเยื่อสัตว์ เมื่อสัตว์ตายจะเกิดการย่อยสลายตัวของเซลล์ (Autolysis) โดยเอนไซม์ย่อยสลายโปรตีนเป็นกรดอะมิโน และแพร่ออกนอกเซลล์ซึ่งกระบวนการนี้เรียกว่า สภาพหลังการตาย (Postmortem condition) พบรวดเร็วใน อวัยวะที่ซับซ้อน เช่น ไต สมอง ฯลฯ 1. การทำให้สัตว์มีกระดูกสันหลังคงสภาพ เมื่อตัวอย่างสัตว์ผ่านการทำให้สลบมาแล้ว ให้ผ่าลำตัวสัตว์และตัดอวัยวะที่ต้องการออกแล้วทำให้คงสภาพ อย่างรวดเร็ว โดยให้ล้างเลือดที่ติดมาด้วยน้ำเกลือ (Normal saline หรือ 0.9% NaCl) (ตารางที่ 3) แล้วแช่ตัวอย่าง ในขวดที่มีสารคงสภาพที่เหมาะสม อุปกรณ์ที่ใช้ในการเก็บตัวอย่าง ได้แก่ ขวดบรรจุน้ำยาคงสภาพ น้ำเกลือ ถาด เทียน อุปกรณ์ผ่าตัด ปากคีบ และกระดาษบอกรายละเอียด แล้วนำตัวอย่างที่แช่อยู่ในน้ำยาคงสภาพนาน 12-24 ชั่วโมง ตัดเป็นชิ้นขนาดเล็กหนาไม่เกิน 4 มิลลิเมตร ความยาวไม่เกิน 1-2 เซนติเมตร แล้วใส่ในน้ำยาคงสภาพใหม่

11 ตารางที่ 3 สารละลายน้ำเกลือที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการ ตัวอย่างสิ่งมีชีวิต ความเข้มข้นเกลือ (NaCl) ที่ใช้ สัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม (Mammals) สัตว์ปีก (Aves) สัตว์เลื้อยคลาน (Reptiles) สัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก (Amphibians) แมลง (Insects) สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังอื่น (Invertebrates) 0.9-0.98% 0.75% 0.8% 6.4% 0.6-0.8% 0.75% ที่มา: อำพา เหลืองภิรมย์. 2533: 2. 2. การทำให้สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังคงสภาพ สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังจะมีโครงสร้างของเนื้อเยื่อหรือเซลล์ไม่ซับซ้อน การทำให้คงสภาพในแต่ละกลุ่มจะมี วิธีการที่แตกต่างกัน ซึ่งส่วนใหญ่สามารถนำตัวอย่างมาเตรียมเป็นสไลด์แบบทั้งตัว ดังนี้ 2.1 โพรโทซัว กรณีที่มีจำนวนโพรโทซัวมากให้เติมสารทำให้คงสภาพลงในอาหารเพาะเลี้ยง แต่ถ้ามีจำนวน น้อยให้ดูดโพรโทซัวที่รวมกันอยู่บริเวณใดบริเวณหนึ่งใส่ในสารทำให้คงสภาพ นำไปเข้าเครื่องปั่นเหวี่ยงเพื่อตกตะกอน แล้วจึงเทสารทำให้คงสภาพเดิมออกและเติมสารใหม่ลงไปแทนที่และเตรียมเป็นสไลด์ถาวรได้ 2.2 ฟองน้ำ (Poriferans) เก็บขวากฟองน้ำ (Spicule) ไว้ในเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 95 เพื่อทำสไลด์ทั้งตัว ถ้าเป็นการเตรียมฟองน้ำเพื่อนำไปตัดด้วยเครื่องไมโครโตม ต้องทำให้คงสภาพด้วยน้ำยาบูแองหรือน้ำยาฮอลแลนด์ เพื่อละลายแคลเซียมคาร์บอเนตออก จากนั้นจึงนำไปทำให้คงสภาพด้วยฟอร์มาลินร้อยละ 10 ถ้าเป็นฟองน้ำที่มีขวาก เป็นสารพวกซิลิกา (Silica) ให้นำฟองน้ำแช่ลงในเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 ที่มีกรดเกลือเข้มข้น 2-3 หยด เพื่อ ละลายสารพวกซิลิกาแล้วจึงล้างด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ 2.3 ไนดาเรียน สัตว์ที่จะนำไปตัดให้บางด้วยเครื่องควรแช่ในน้ำยาบูแองแล้วตัดออกเป็นชิ้นหรือท่อน ส่วน สัตว์ที่จะนำไปทำสไลด์แบบทั้งตัวควรทำให้คงสภาพด้วยฟอร์มาลินหรือน้ำยาบูแอง เช่น ไฮดราทำให้คงสภาพใน ขณะที่หนวด (Tentacle) และลำตัวยืดยาวเต็มที่ โดยหยดน้ำยาบูแองที่ร้อนลงไปอย่างรวดเร็ว 2.4 ไบรโอซัว (Bryozoa) ทำให้สลบด้วยคลอรัลไฮเดรต หรือแมกนีเซียมคลอไรด์ จากนั้นจึงทำให้คงสภาพ ด้วยสารทำให้คงสภาพบูแองหรือฟอร์มาลินร้อยละ 10 2.5 หนอนตัวแบน (Flatworms) วิธีการคล้ายกับกลุ่มไนดาเรียน คือปล่อยให้ลำตัวยืดยาวเต็มที่แล้วหยด กรดไนตริกเพื่อทำให้คงสภาพ 2.6 นีเมอร์ทีน ทำให้สลบด้วยคลอรัลไฮเดรตก่อน จากนั้นจึงทำให้คงสภาพด้วยสารทำให้คงสภาพบูแอง 2.7 นีมาโทด (Nematodes) กลุ่มที่มีขนาดเล็กทำให้คงสภาพด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 ถ้าเป็นกลุ่ม ที่มีขนาดใหญ่ทำให้คงสภาพด้วยน้ำยาบูแองที่ร้อน จากนั้นตัดแบ่งเป็นท่อนใส่ลงในสารทำให้คงสภาพใหม่ 2.8 แอนเนลิด (Annelids) แอนเนลิดขนาดใหญ่ทำให้สลบด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ แล้วตัดออกเป็นท่อนใส่ ในสารทำให้คงสภาพบูแอง พวกแอนเนลิดขนาดเล็กทำให้คงสภาพในลักษณะที่เหยียดตรง โดยวางบนแผ่นกระจก และหยดสารทำให้คงสภาพลงไปบนสัตว์นั้นทีละหยดจนสัตว์แข็งตัว 2.9 อาร์โทรพอด (Arthropods) ถ้าเตรียมเป็นสไลด์แบบทั้งตัวต้องทำให้คงสภาพด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ถ้า จะนำไปใช้ในการตัดให้บางต้องทำให้คงสภาพด้วยสารคงสภาพบูแองที่มีอุณหภูมิประมาณ 30-40 องศาเซลเซียส เป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ เพื่อทำให้ลำตัวอ่อนนุ่ม 2.10 มอลลัสก์ (Molluscs) ทำให้สัตว์สลบด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ถ้าเป็นมอลลัสก์ที่มีขนาดเล็กทำให้คง สภาพด้วยสารคงสภาพบูแอง มอลลัสก์ที่มีขนาดใหญ่ให้ตัดแยกอวัยวะ จากนั้นจึงแช่ในน้ำยาบูแองหรือฟอร์มาลินร้อย ละ 10

12 2.11 เอคไคโนเดิร์ม (Echinoderms) ควรทำให้สลบด้วยแมกนีเซียมซัลเฟต หรือแมกนีเซียมคลอไรด์ก่อน สัตว์ที่มีขนาดใหญ่ที่จะนำไปเตรียมสไลด์เนื้อเยื่อ ต้องตัดเนื้อเยื่อเป็นท่อนและทำให้คงสภาพในน้ำยาบูแอง ถ้าจะทำ สไลด์เพื่อศึกษาแผ่นโครงร่าง (Skeletal-plate) ให้รักษาสภาพด้วยเอทิลแอลกอฮอล์

บทที่ 2 เทคนิคการสตาฟสัตว์ การรักษาสภาพตัวอย่างสัตว์เพื่อการศึกษามีหลายวิธี ทั้งการดองในของเหลว การตากแห้ง การฟอกหนัง และการสตาฟ ซึ่งการสตาฟเป็นอีกวิธีหนึ่งที่ใช้ได้ดีกับสัตว์มีกระดูกสันหลังเกือบทุกประเภท เช่น ปลา สัตว์ครึ่งบก ครึ่งน้ำ สัตว์เลื้อยคลาน สัตว์ปีก และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม สัตว์สตาฟที่มีอายุมากที่สุดในปัจจุบันคือแรด ซึ่งตั้งแสดง อยู่ที่พิพิธภัณฑ์ (Royal museum of vertebrate) ประเทศอิตาลีมีอายุประมาณ 1,600 ปี การเก็บรักษาตัวอย่างแมลง แมลงเป็นสัตว์ที่มีจำนวนมากที่สุดในโลกประมาณ 70% ของจำนวนชนิดสัตว์ทั้งหมด การเก็บและรักษา ตัวอย่างแมลง เป็นการรักษาตัวอย่างด้วยการสตาฟวิธีหนึ่ง เพียงแต่แมลงมีลำตัวขนาดเล็ก และมีโครงร่างแข็ง ภายนอก จึงไม่จำเป็นต้องนำกล้ามเนื้อหรืออวัยวะภายในออก สามารถตากแห้งหรืออบลมร้อนให้แห้งได้เลย วิธีการนี้ เป็นขั้นต้นที่จำเป็นสำหรับการจำแนกหรือการระบุชนิดของแมลง ซึ่งการรู้จักวิธีการเก็บและรักษาตัวอย่างแมลงให้ ถูกต้องยังเป็นประโยชน์สำหรับผู้ที่ต้องการเก็บรักษาตัวอย่างแมลงเพื่อความสวยงามหรือตามวัตถุประสงค์อื่น การ เก็บรักษาตัวอย่างแมลงให้อยู่ถาวร นั้นสามารถแบ่งได้เป็น 4 วิธีการ คือ 1. การเก็บแบบแห้ง การปักเข็ม 2. ติดด้วยกระดาษสามเหลี่ยม หรือชิ้นไม้ก๊อก 3. เก็บรักษาในของเหลว 4. สไลด์ถาวร แหล่งในการเก็บแมลง ชนิดและปริมาณของแมลงที่พบจะแตกต่างกันตามสภาพภูมิประเทศและภูมิอากาศ โดยทั่วไปมีโอกาสพบ แมลงในฤดูร้อนหรือต้นฤดูฝนมากกว่าฤดูอื่น โดยแต่ละช่วงเวลาจะสามารถพบแมลงกลุ่มต่างๆ ได้แตกต่างกันดังนี้ - กลุ่มผีเสื้อ วันที่ท้องฟ้าแจ่มใสช่วงเวลาเช้าตรู่หรือพลบค่ำจะพบแมลงกลุ่มผีเสื้อจำนวนมาก - กลุ่มด้วง กลุ่มตั๊กแตน กลุ่มแมลงปอ และกลุ่มผึ้ง พบในช่วงเวลากลางวัน ซึ่งแมลงจะออกหากินช่วง กลางวัน (Diurnal insect) ได้แก่ กลุ่มด้วง กลุ่มตั๊กแตน กลุ่มแมลงปอ และกลุ่มผึ้ง เป็นต้น การค้นหาแมลงในธรรมชาติจะต้องทราบแหล่งที่อยู่อาศัย แหล่งอาหาร แหล่งผสมพันธุ์ หรือทราบ พฤติกรรมของแมลง เช่น บางชนิดเป็นดำรงชีวิตเป็นตัวเบียนอาศัยอยู่กับสิ่งมีชีวิตอื่น บางชนิดหลบช่อนตามกิ่งไม้ ใบไม้ บางพวกชอบเข้าหาแสงไฟ เป็นต้น แมลงส่วนใหญ่ประมาณ 80% อาศัยอยู่บนบก และ 20% อาศัยในแหล่งน้ำ แมลงบางชนิดเฉพาะช่วงตัวเต็มวัยอาศัยอยู่บนบก ช่วงตัวอ่อนจะอาศัยในน้ำ เช่น กลุ่มแมลงปอ กลุ่มแมลงชีปะขาว เป็นต้น การเก็บแมลง แมลงมีมากมายหลายชนิดจึงจำเป็นต้องใช้เครื่องมือและอุปกรณ์ที่แตกต่างกันช่วยในการอำนวยความ สะดวกในการเก็บในธรรมชาติ ดังนี้ 1. สวิงจับแมลง (Insect net) ใช้สำหรับจับแมลงที่บินเร็ว เช่น แมลงปอ แมลงวัน ผีเสื้อ ผึ้ง เป็นต้น โดย การโฉบเอาแมลงให้เข้าไปอยู่ในถุงตาข่าย แล้วสะบัดปิดปากถุง เพื่อป้องกันแมลงบินหนีไป ผ้าทำถุงจึงควรโปร่ง บาง และเบา เพื่อโฉบตวัดได้อย่างรวดเร็ว และเพื่อให้มองเห็นตำแหน่งแมลงในถุงผ้าได้ชัดเจน ทำให้สพดวกต่อการจับ แมลงลงในภาชนะเก็บ โดยไม่ทำให้แมลงเกิดความชำรุดเสียหาย และยังช่วยหลีกเลี่ยงการถูกแมลงกัดหรือต่อย แต่ สวิงที่ใช้โฉบแมลงที่อาศัยตามพุ่มไม้ควรใช้ผ้าขาวที่หนา เพื่อให้ทนต่อการเกี่ยวกับกิ่งไม้หรือสิ่งกีดขวางอื่น

14 2. เครื่องดูดแมลง (Aspirator) ใช้สำหรับจับแมลงขนาดเล็กและแมลงที่ชอบหลบซ่อนตามซอกมุมหรือที่ มิดชิด เช่น ยุง แมลงสามง่าม มอดข้าวสาร เป็นต้น เครื่องดูดแมลงแบ่งเป็น 2 ชนิด ได้แก่ ชนิดขวด (Vial type) ซึ่งมี ขนาดใหญ่ และชนิดหลอด (Tube type) ซึ่งมีขนาดเล็กกว่า ซึ่งอาจทำจากขวดขนาดเล็กหรือหลอดแก้วหรือพลาสติก เครื่องดูดแมลงประกอบด้วยขวดหรือหลอดทรงสูงมีจุกอุดที่ปาก เจาะรูสองรูที่จุก เพื่อใช้รูหนึ่งสำหรับเสียบท่อแก้ว ขนาดเล็กและปลายท่อแก้วที่เสียบในหลอดต้องปิดด้วยผ้าขาวบาง เพื่อป้องกันไม่ให้แมลงที่ดูดเข้าไปในหลอดหลุดเข้า ไปในปาก ปลายอีกด้านของท่อแก้วต่อเข้ากับสายยางเพื่อใช้ปากดูด อีกรูหนึ่งสอดท่อแก้วสำหรับเป็นทางให้แมลงเข้า จับแมลงโดยจ่อปลายด้านสำหรับดูดแมลงเข้าไปให้ใกล้ตัวแมลงหรือบริเวณที่คาดว่าจะมีแมลง ใช้ปากดูดปลายสาย ยางแรงดูดจะทำให้แมลงหลุดเข้าไปในขวดหรือหลอดแก้ว 3. กับดักล่อแมลง (Trap) ใช้สำหรับจับแมลงที่บินหรือคลานไปมา แบ่งได้ 2 แบบ ได้แก่ กับดักแสงไฟ (Light trap) ใช้สำหรับล่อแมลงที่ชอบบินเข้าหาแสงไฟ ประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสงและ ภาชนะสำหรับเก็บแมลงที่ดักล่อได้ ความเข้มแสง สีแสงไฟ รูปแบบกับดักมีผลแตกต่างกันในการล่อแมลงต่างชนิดกัน แสงสีม่วงเป็นสีที่ใช้ได้ดีกับแมลงหลายชนิด กับดักบางชนิดมีพัดลมช่วยดูดตัวแมลงให้ตกลงสู้ภาชนะเก็บแมลง เช่น กับดักซีดีซี (CDC trap) กับดักแสงไฟหลายชนิดมีประสิทธิภาพในการจับแมลงที่ชอบแสงไฟและออกหากินในเวลา กลางคืน (Nocturnal insect) แต่จะใช้สะดวกเฉพาะในบริเวณที่มีไฟฟ้าไปถึงเท่านั้น ถ้าจำเป็นต้องใช้แบตเตอรี่เก็บ ไฟสำหรับให้พลังงานทดแทนไฟฟ้า และอาจประยุกต์ใช้ผ้าขาวขนาดตามที่ต้องการกางเป็นรูปสี่เหลี่ยมให้แมลงมาเล่น ไฟแล้วเกาะกับผ้า จะทำให้สามารถสังเกตเห็นแมลงได้ชัดเจน กับดักที่ไม่มีแสงไฟ (Bait trap) เหมาะสำหรับดักล่อแมลงกลางคืนที่ไม่ชอบเข้าหาแสงไฟ นิยมใช้กับดัก เหยื่อล่อ โดยรูปแบบของกับดักและเหยื่อที่ใช้ล่อจะต่างกันตามชนิดของแมลงที่ต้องการดักล่อ อาจใช้เมล็ดธัญพืช เนื้อสัตว์ เศษอาหาร หรือกาวเหนียวผสมกับอาหาร เป็นต้น ปัจจุบันได้มีการพัฒนานำสารล่อ (Pheromone) ซึ่งเป็น สารเคมีที่ใช้สื่อสารระหว่างแมลงในสังคมหรือชนิดเดียวกัน เช่น sex pheromone หรือ aggregating pheromone โดยหลักในการวางกับดักล่อจะวางในบริเวณที่คาดว่าจะมีแมลงเดินผ่านหรือมีแมลงมารวมกลุ่มกันหนาแน่น 4. ไม้ตีและฝ้าหรือพลาสติกรองรับ (Baiting net) ใช้สำหรับแมลงที่ชอบหลบซ่อนตัวหรือมีขนาดเล็ก หรือ มักเกาะแน่นติดกับกิ่งไม้หรือวัสดุพักอาศัย หรือพวกที่พรางตัวกลมกลืนกับสิ่งแวดล้อม โดยทั่วไปมักใช้ผ้าขาวหรือขวด พลาสติกใสรูปสี่เหลี่ยมปูลงในระดับที่ต่ำกว่าบริเวณที่ต้องการจะตีด้วยไม้ เช่น ปูใต้กิ่งไม้หรือพุ่มไม้ แล้วใช้ไม้หรือวัสดุ อื่นๆ ที่ด้ามยาวและมีความแข็งแรง ฟาดตีกิ่งไม้ที่คาดว่าจะมีแมลงที่ต้องการเกาะอาศัยอยู่ แล้วใช้มือจับมุมของผ้าทั้ง สี่ด้านหรือจับพลาสติกที่นำมารองรับ 5. ภาชนะสำหรับตัก ใช้สำหรับแมลงที่อาศัยในน้ำ ถ้าเป็นน้ำลึกไม่สามารถลงไปจับแมลงได้โดยตรง ภาชนะ ที่ใช้ตักควรมีด้ามยาวและแข็งแรง ควรหันปากภาชนะในด้านที่ทวนน้ำ เพื่อให้กระแสน้ำพัดพาแมลงเข้าสู่ภาชนะ หาก ไม่มีกระแสน้ำควรค่อยๆ กดภาชนะลงในน้ำ เพื่อให้เกิดแรงดึงดูดกระแสน้ำพร้อมตัวแมลงเข้าสู่ภาชนะ การตักจ้วง ต้องระวังไม่ให้น้ำกระเพื่อมเพราะจะทำให้แมลงหลบซ่อนตามวัสดุใต้น้ำต่างๆ ภาชนะตักต้องมีก้นลึกเพื่อให้เกิดแรง ดึงดูดน้ำเข้าไปในภาชนะและมีสีขาวเพื่อช่วยให้เห็นแมลงได้ง่ายขึ้น 6. อุปกรณ์ที่ใช้เก็บตัวอย่างแมลงในห้องปฏิบัติการ การค้นหาหรือเก็บแมลงที่มีขนาดเล็กและชอบหลบซ่อน ตัวในที่มิดชิด มักจะมีสีลำตัวใกล้เคียงกับสิ่งแวดล้อมจะเป็นเรื่องที่ยุ่งยากมาก ดังนั้นจึงควรเก็บวัสดุที่คาดว่าเป็นแหล่ง หลบซ่อนหรือที่แมลงอาศัยอยู่ เช่น ดิน ทราย เศษขยะมูลฝอย ฟาง หญ้าแห้ง ข้าวเปลือก ข้าวสาร ธัญพืช เป็นต้น มา แยกแมลงออกในห้องปฏิบัติการ โดยใช้เครื่องมือดังนี้ กรวยเบอร์ลีส (Berlese funnel) หลักการทำงานของเครื่องจะใช้ความร้อนหรือแสงจากหลอดไฟไล่แมลง แมลงจะหนีความร้อนหรือหลบแสงแทรกตัวลงตามแนวดิ่ง ซึ่งจะตกลงสู่ภาชนะรองรับที่ปลายกรวย ลักษณะทั่วไป ของเครื่องประกอบด้วยกรวยแก้วหรือกรวยโลหะที่มีขายึดหรือที่ตั้ง ส่วนปลายก้นกรวยมีตะแกรงลวดซึ่งมีความถี่ของ ตระแกรงเหมาะสมกับขนาดของแมลงที่ต้องการแยก ปลายสุดของกรวยมีภาชนะรองรับ ซึ่งอาจบรรจุสารฆ่าหรือไม่มี ก็ได้ตามวัตถุประสงค์ของงาน

15 ตะแกรงร่อนหรือเครื่องร่อน (Sieve or sifter) โดยนำวัสดุมาเขย่าร่อนบนตะแกรง ตะแกรงลวดที่ใช้อาจมี จำนวนตาของความถี่ต่างกันจามขนาดของแมลงที่ต้องการแยก หรืออาจใช้ตะแกรงที่มีจำนวนตาของความถี่ต่างกัน วางซ้อนกัน เพื่อแยกแมลงได้ครั้งละหลายขนาดก็ได้ การรักษาสภาพแมลงหรือการฆ่าแมลง เมื่อแมลงที่ได้มายังคงมีการเคลื่อนที่จำเป็นต้องหยุดกระบวนเมเทบอลิซึมของแมลง โดยการใช้สารเคมีที่ เป็นไอระเหยหรืออาจใช้กลุ่มสารที่เป็นของเหลวในการกระบวนการนี้ โดยจะต้องพิจารณาขนาด ความอ่อนนิ่มของ ลำตัว ถ้าแมลงมีขนาดใหญ่และมีโครงร่างภายนอกแข็งมักจะใช้สารไซยาไนด์ พวกที่มีลำตัวอ่อนนิ่มและขนาดเล็กนิยม ใช้สารละลายแอลกอฮอล์ สารเคมีที่ใช้จะมีความแตกต่างของความเป็นพิษ รวมไปถึงระยะเวลาที่เหมาะสมในการใช้ งาน การรักษาสภาพแมลงด้วยวิธีการต่างๆ มีดังนี้ 1. การใช้ไอระเหยของสารพิษ อุปกรณ์ที่จำเป็นต้องใช้คือ ขวดสำหรับใส่แมลงซึ่งเป็นขวดแก้วโดยทั่วไปแต่ ต้องมีปากขวดกว้าง ฝาปิดเป็นเกลียวหรือเป็นจุกไม้คอร์ก แบ่งได้เป็น 2 ประเภท คือ แบบถาวรโดยการใช้สารโซเดียม หรือโพแทสเซียมไซยาไนด์ (Sodium / Potassium cyanide) ซึ่งเป็นสารที่มีความเป็นพิษสูง (ไม่แนะนำให้ใช้) เวลา ใช้ต้องระมัดระวัง สามารถเก็บไว้ได้นานหลายเดือน และแบบชั่วคราว นิยมใช้สารเอทธิลอะซิเตต (Ethyl acetate) คาร์บอนเตตระคลอไรด์ (Carbon tetrachloride) อีเธอร์ (Ether) หรือไดเอทธิลอีเธอร์ (Diethyl ether) และ คลอโรฟอร์ม (Chloroform) ซึ่งเป็นสารระเหยเร็ว มีความเป็นพิษต่ำ แต่ระยะเวลาการใช้งานสั้นไม่เกิน 1 เดือน จึง ต้องเติมสารเป็นประจำ 2. การใช้ของเหลว แมลงที่เหมาะสำหรับการใช้ของเหลว ควรเป็นพวกที่มีลำตัวอ่อนนิ่ม เช่น ลูกน้ำยุง หนอนแมลงวัน ตัวอ่อนผีเสื้อและด้วง เป็นต้น สารที่นิยมใช้มีหลายชนิด เช่น แอลกอฮอล์ 70% และฟอร์มาลีน 10% เป็นต้น แต่การแช่ในแอลกอฮอล์จะทำให้สีตัวอย่างแมลงซีดลง การเก็บรักษาตัวอย่างแมลง ตัวอย่างที่ผ่านการรักษาสภาพตัวอย่างที่เหมาะสมแล้วจะถูกนำมาเก็บตามหลักทางวิชาการ โดยพิจารณา จากวัตถุประสงค์และการนำไปใช้งานเป็นหลักดังนี้ 1. การเก็บรักษาแบบชั่วคราว เป็นการเก็บรักษาก่อนที่จะนำตัวอย่างแมลงไปเก็บแบบถาวรต่อไป ส่วน ใหญ่เป็นการเก็บรักษาตัวอย่างในขณะที่อยู่ห่างไกลจากห้องปฏิบัติการและขาดอุปกรณ์หรือเวลาสำหรับการเก็บรักษา แบบถาวร อุปกรณ์ที่ใช้จะต้องหาง่ายและมีน้ำหนักเบา แบ่งได้ 2 แบบ คือ การเก็บรักษาแบบแห้ง เหมาะสำหรับแมลงที่มีปีกอ่อนบาง เช่น ผีเสื้อ แมลงปอ เป็นต้น โดยใช้กระดาษ โปร่งแสง บาง หรือซองแมลงที่ไม่ขาดเสียหายง่าย เช่น กระดาษแก้วชนิดเหนียว เป็นต้น โดยใช้กระดาษขนาด A4 พับเป็นรูปสามเหลี่ยม ดังภาพ การเก็บรักษาด้วยสารละลาย ควรเก็บแมลงแยกภาชนะ หรือเก็บแมลงกลุ่มที่เก็บจากสถานที่เดียวกัน แต่ ต้องระวังเรื่องความหนาแน่นเพราะจะทำให้แมลงได้รับความเสียหาย และต้องเขียนป้ายบันทึกรายละเอียด สถานที่ เวลา ชื่อผู้เก็บ ใส่ลงไปในภาชนะเสมอ

16 2. การเก็บรักษาแบบถาวร แบ่งเป็น 3 ประเภท ดังนี้ การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงให้มีสภาพคงทนถาวร สามารถเก็บได้หลายวิธี ซึ่งการเก็บแบบแห้งจะเป็นวิธีที่ นิยมที่สุด โดยการเก็บรักษาตัวอย่างแมลงแบบถาวรสามารถแบ่งได้เป็นแบบต่างๆ ได้แก่ 2.1 การปักเข็ม ใช้กับแมลงที่มีขนาดกลางถึงขนาดใหญ่ ขนาดยาวตั้งแต่ 10 มิลลิเมตร เป็นต้นไป แมลงที่จะปักเข็มต้องไม่เป็นแมลงที่มีโครงร่างแข็งหรือเปราะ และถ้าเป็นไปได้ควรทำก่อนที่ตัวอย่างจะแข็ง เพราะถ้า ทำหลังจากตัวแมลงแข็งแล้ว เมื่อสัมผัสถูกตัวอย่างจะทำให้เสียหายได้ง่ายและยากต่อการปักเข็ม การเตรียมตัวอย่างแมลง เก็บแมลงกลุ่มต่างๆ แล้วพยายามอย่าทำให้ตัวอย่างตายก่อนการปักเข็มนานเกินไป เก็บในกล่อง พลาสติก หรือขวดที่ไม่ส่งผลกระทบต่อปีกหรือขาของแมลง ถ้าตัวอย่างแมลงนั้นเก็บไว้นานจนแข็งแล้ว ต้องทำให้ อ่อนตัวเสียก่อน ซึ่งมีหลายวิธี - วิธีต้มน้ำหรือนึ่งด้วยความร้อน ถ้าเป็นแมลงปีกแข็งหรือพวกด้วง ให้นำไปแช่ในน้ำร้อน ประมาณ 2-3 นาทีหรือนึ่งด้วยไอน้ำนาน 30 นาทีขึ้นกับขนาดของแมลง - วิธีทำโหลชื้น ใช้กับตัวอย่างแมลงที่ขนาดไม่ใหญ่และปีกไม่แข็งมาก แต่ต้องระวังเพราะถ้าใส่ยาฆ่า เชื้อราไม่ทันเชื้อราจะขึ้นตัวแมลงได้ และต้องใช้เวลานานกว่าแมลงจะอ่อนตัว - นอกจากนี้อาจใช้วิธีการฉีดน้ำอุ่น เข้าไปที่บริเวณส่วนอกด้านใต้ปีก วิธีการนี้นิยมใช้กับผีเสื้อเพราะ ใช้เวลาไม่มาก และไม่ต้องกลัวว่าเชื้อราจะขึ้นเนื่องจากเราสามารถกำหนดจำนวนตัวอย่างที่จะจัดรูปร่างได้ถ้า ตัวอย่างแมลงสกปรกหรือมีคราบติด ให้ทำความสะอาดโดยใส่ในแอลกอฮอล์หรือน้ำผงซักฟอก ถ้าเป็นเกล็ดผีเสื้อ ให้ ใช้แปรงหรือพู่กันจุ่มในอีเทอร์ คลอโรฟอร์มหรืออะซีโตน แล้วปัดตามลำตัวจะทำให้คราบหลุดออกไป เข็มปักแมลง เข็มสำหรับปักแมลง จะเป็นแบบเฉพาะทำมาจากวัสดุที่สามารถกันสนิมได้ เช่น สแตนเลส ซึ่งมี หลายเบอร์ ควรเลือกใช้ให้เหมาะกับขนาดแมลงตั้งแต่เบอร์ 000 ถึงเบอร์ 7 ส่วนใหญ่นิยมใช้เข็มเบอร์ 2 และ 3 การ ปักเข็มแมลงต้องปักในแนวตั้งฉากกับตัวอย่างแมลง จากด้านหลังให้ทะลุลงไปด้านท้อง ตำแหน่งที่ปักส่วนใหญ่จะปัก เข็มให้เยื้องมาทางขวาจากเส้นกึ่งกลางปีกเล็กน้อย บริเวณอกปล้องที่ 2 แต่มีบางชนิดที่ปักแตกต่างไป เช่น พวกมวน จะปักผ่านสามเหลี่ยมที่สันหลัง (Scutellum) ส่วนตั๊กแตนจะปักเข็มผ่านบริเวณอกปล้องแรก เยื้องจากเส้นแบ่งกลาง ตัวไปทางขวาเล็กน้อย ภาพที่2.1 ตำแหน่งการปักเข็มของแมลง A. ตั๊กแตน B. แมลงวัน C. มวน D. ตั๊กแตน E. ด้วง ในการปักเข็มนั้นให้ถือแมลงโดยให้แมลงอยู่ระหว่างนิ้วหัวแม่มือและนิ้วชี้แล้วจึงทำการปักตาม ตำแหน่งที่ต้องการ แมลงที่ปักเข็มลงไปแล้วควรอยู่สูงจากปลายเข็มเท่ากัน โดยใช้แท่นจัดระดับ (Pinning block) หรือถ้าไม่มีอาจใช้การกะประมาณ ซึ่งตัวแมลงจะต้องอยู่สูงจากปลายเข็มในระดับเดียวกันโดยสูงจากพื้นประมาณ 1 นิ้ว หรือประมาณ 2/3 ของความยาวเข็ม

17 การจัดส่วนปีก การจัดระยางค์และรูปร่างของตัวอย่างแมลงให้ดูสวยงาม และง่ายต่อการศึกษาหรือการจำแนกชนิด นั้น จะต้องทำให้ถูกต้อง และได้มาตรฐานสากล ดังนี้ - ตำแหน่งปีกของผีเสื้อกลางวัน ผีเสื้อกลางคืน และชีปะขาว ต้องให้ขอบหลังของปีกหน้ากางตรงเป็น มุมฉากกับลำตัว ขอบหน้าของปีกหลังอยู่ซ้อนด้านใต้ขอบหลังของปีกหน้าเล็กน้อย - ส่วนตำแหน่งปีกของพวกแมลงปอ ตั๊กแตน จั๊กจั่น และแมลงอื่นๆ ต้องให้ขอบหน้าของปีกหลังตั้ง ฉากกับลำตัว และส่วนขอบหลังของปีกหน้าไม่ต้องซ้อนทับกับปีกหลัง แค่เอามาชิดกันเท่านั้น - ส่วนแมลงที่ไม่จำเป็นต้องกางปีก เช่น ด้วง มวน เพลี้ย และจั๊กจั่น ให้ทำการจัดรูปร่างขาแทน โดยให้ อยู่ในลักษณะที่มองเห็นและสามารถทำการศึกษาได้ง่าย ซึ่งส่วนใหญ่จะนิยมจัดรูปร่างขาของแมลงเหล่านี้ให้อยู่ในท่า เกาะตามธรรมชาติมากกว่าท่าอื่น ภาพที่ 2.2 ตำแหน่งของการจัดวางปีกผีเสื้อและแมลงปอ A. ผีเสื้อกลางคืน B. ผีเสื้อกลางวัน C. แมลงปอ แท่นจัดรูปร่างแมลง (Spreading หรือ Pinning board) แท่นจัดรูปร่างแมลง หรือไม้สำหรับจัดท่าแมลง (Setting board) ช่วยในการจัดรูปร่างของแมลงที่มี ปีก เพื่อให้ได้รูปร่างตามที่ต้องการ โดยนำแมลงที่ปักเข็มแล้ว ปักลงในร่องของแท่นจัดรูปร่างกระทั่งปีกแนบกับผิวของ แท่นพอดีหลังจากนั้นทำการกางปีกของแมลงโดยใช้เข็มค่อยๆ เขี่ยบริเวณขอบปีกหน้า (ส่วนที่เป็นเส้นปีกที่แข็งที่สุด) จนขอบหลังตั้งฉากกับลำตัว แล้วจึงเขี่ยปีกหลังให้ขอบปีกซ้อนใต้ปีกหน้าเล็กน้อย จากนั้นใช้กระดาษลอกลาย หรือ กระดาษแก้วใสที่เตรียมไว้ วางทาบลงบนปีกหน้าและปีกหลัง ใช้เข็มหมุดตรึงบริเวณรอบๆ ปีกทุกด้าน เพื่อกันไม่ให้ ปีกหลวมหลุดออกจากท่าที่จัดไว้ทับปีกอีกข้างให้เหมือนกัน และลองตรวจสอบดูว่าได้สมมาตรกันทั้งสองข้างหรือไม่ ใช้เข็มเขี่ยหนวดให้อยู่ในตำแหน่งที่ต้องการ (ส่วนใหญ่จะให้หนวดขนานกับขอบบนของปีกหน้า) ห้ามปักเข็มลงบนปีก เพราะจะทำให้ปีกเป็นรู ไม่สวยงาม หรืออาจจัดหนวดและขาให้อยู่ในท่าเกาะตามธรรมชาติ ภาพที่ 2.3 การใช้แท่นจัดรูปร่างแมลงและตัวอย่างการจัดรูปร่างแมลง C

18 การทำให้ตัวอย่างแห้ง หลังจากจัดรูปร่างปีกและขาเสร็จแล้ว จะต้องทำให้ตัวอย่างนั้นแห้ง เพื่อจะได้คงรูปร่างตามที่จัดไว้ โดยมีวิธีการทำให้ตัวอย่างแห้งหลายวิธี เช่น - ปล่อยทิ้งไว้ให้แห้งเอง ใช้ในกรณีที่ตัวอย่างมีขนาดเล็ก - นำไปตากแดด เก็บไว้ในกล่องไม่ให้ถูกแดดโดยตรง แต่ต้องคอยระวังพวกมด หรือสัตว์เลี้ยงที่จะ สามารถสร้างความเสียหายให้กับตัวอย่างได้ - นำไปใส่ในกล่องไม้หรือภาชนะที่ปิดมิดชิด แล้วเปิดโคมไฟส่องไว้ด้านใน - ใช้ตู้อบ ซึ่งสามารถปรับอุณหภูมิได้ โดยใช้อุณหภูมิประมาณ 50-60 องศาเซลเซียส (อาจจะปรับให้ สูงหรือต่ำกว่านี้ได้ แล้วแต่ขนาดและสภาพของแมลง) ใช้เวลาประมาณ 1-2 วัน ตัวอย่างจะแห้งสนิท วิธีการตรวจสอบ ว่าแมลงแห้งหรือไม่นั้น สามารถทำได้โดยใช้เข็มแตะที่ส่วนท้องของตัวอย่างนั้นเบาๆ ถ้าท้องของตัวอย่างนั้นยังนิ่มอยู่ แสดงว่ายังไม่แห้ง ให้ทำการอบต่อไป แต่ถ้าแข็งแล้ว ให้นำตัวอย่างออกจากตู้อบทันทีแล้วนำไปในกล่องหรือตู้สำหรับ เก็บตัวอย่าง หรือนำไปศึกษาต่อไป 2.2 การติดกระดาษสามเหลี่ยมหรือแผ่นก๊อก จะใช้กับแมลงที่มีขนาดเล็กซึ่งไม่สามารถปักเข็มได้ โดยการตัดกระดาษแข็งสีขาวหรือสีอ่อนเป็นรูปสามเหลี่ยมขนาดฐานกว้างประมาณ 3-4 มิลลิเมตร ยาวประมาณ 8- 10 มิลลิเมตร ปักเข็มปักแมลงลงบนด้านฐานกระดาษสามเหลี่ยม จากนั้นใช้กาวทาที่ด้านบนของปลายสามเหลี่ยม อย่าทากาวมากจนเกินไปเพราะจะทำให้กาวติดส่วนต่างๆ มากเกินจำเป็น อาจทำให้มองไม่เห็นจุดที่ใช้ในการจำแนก ชนิดได้สำหรับกาวที่ใช้ควรเป็นชนิดที่แห้งเร็วหรืออาจใช้น้ำยาทาเล็บชนิดไม่มีสี(น้ำยาเคลือบเล็บ) แทนกาวก็ได้ หลักการติดตัวอย่างลงบนกระดาษสามเหลี่ยมนั้น โดยส่วนใหญ่จะติดให้เห็นส่วนที่จะใช้จำแนกชนิดชัดเจน ตัวอย่างเช่น - แมลงส่วนใหญ่ จะติดให้ด้านหลังอยู่ข้างบน - พวกแมลงวัน ติดโดยให้ด้านข้างซ้ายของลำตัวอยู่ด้านบน - ส่วนด้วงปีกแข็งจะติดให้ด้านหลังอยู่ข้างบนเหมือนแมลงทั่วไป แต่เวลาติดกาวด้านข้างตัวติดกับ ส่วนปลายกระดาษที่หักให้โค้งลง เพื่อให้เห็นขาทุกคู่ และสังเกตปล้องท้องได้ชัดเจน - พวกมวน ส่วนใหญ่ติดด้านข้างหรือด้านท้องกับกระดาษ เพื่อให้เห็นเส้นปีกได้ชัดเจน - ถ้าเป็นยุงต้องใช้เข็มปักแมลงขนาดเล็กแบบพิเศษ (Micro pins) เช่น เบอร์ 000 หรือ เบอร์ 00 แล้วนำไปปักลงบนชิ้นไม้ก๊อกอีกทีหนึ่ง หรืออาจใช้โฟมยางแทนไม้ก๊อกก็ได้การปักแบบนี้จะช่วยให้เห็นส่วนต่างๆ ของแมลงชัดเจนและครบถ้วน แต่ด้วยขนาดเข็มที่เล็กมา อาจทำให้หักงอได้ขณะปักจึงควรปักบนชิ้นไม้ก๊อก หรือโฟม ยาง ภาพที่ 2.4 การติดกระดาษสามเหลี่ยม A. มวน B. แมลงวัน C. ด้วง และแผ่นก๊อกของแมลงขนาดเล็ก D. ยุง - การเก็บแห้งตัวหนอน การเก็บตัวหนอนให้มีลักษณะและสีตามสภาพธรรมชาติ แต่ไม่เป็นที่นิยม เพราะ วิธีการยุ่งยากกว่าวิธีการอื่น โดยต้องฆ่าตัวหนอนในน้ำเดือดแล้วนำมาทำให้เนื้อเยื่อแห้งด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ตัดส่วน ปลายสุดของท้องออกแล้วรีดอวัยวะภายในออกให้หมด นำตัวหนอนมาเข้าเครื่องเป่าตัวหนอน ซึ่งมักจะใช้ลวดสอด

19 เข้าไปยึดตัวหนอนและช่วยรักษารูปทรงของตัวหนอนขณะเป่า เมื่อได้ขนาดตามต้องการแล้วจึงนำมายึดกับปลายไม้ที่ ยึดกับเข็มปักแมลงแล้ว 2.3 การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงในของเหลว การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงในของเหลวเป็นวิธีการที่ สามารถทำได้ง่ายและประหยัดเวลาในการทำ แมลงที่เหมาะสำหรับการใช้ของเหลว ควรเป็นพวกที่มีลำตัวอ่อนนิ่ม เช่น ตัวอย่างสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหน้าดิน ตัวอ่อนแมลงชีปะขาว แมลงปอ แมลงหางดีด และแมลงขนาดเล็กต่างๆ เป็นต้น สารที่ใช้มีหลายชนิด แต่ที่นิยมใช้ คือ แอลกอฮอล์ 70-75% แต่ต้องรักษาสภาพแมลงโดยการต้มด้วยน้ำยาเค เอเอดี (KAAD’s solution) หรือน้ำยาเอ็กซ์เอ (XA’s solution) หรือน้ำยาคาร์ล (Kahle’s solution) การแช่ใน แอลกอฮอล์จะทำให้สีตัวอย่างแมลงซีดลง และการตรวจสอบจะทำได้ยากกว่าวิธีการปักเข็มและติดกระดาษ สามเหลี่ยม ภาพที่ 2.5 ขวดดองตัวอย่างแมลงโดยใช้แอลกอฮอล์ การเตรียมสารละลายสูตรต่างๆ ดังนี้ 1. น้ำยาเคเอเอดี (KAAD’s solution) ประกอบด้วย น้ำมันก๊าด (Keroseme) 1 กรัม (หรือ 1 ส่วน) กรดน้ำส้ม (Glacial acetic acid) 2 ส่วน เอทิลแอลกอฮอล์ 95% (Ethyl alcohol) 7-10 ส่วน ไดออกเซน (Dioxane) 1 ส่วน 2. น้ำยาเอ็กซ์เอ (XA’s solution) ประกอบด้วย ไซลีน (Xylene) 1 ส่วน เอทิลแอลกอฮอล์ 95% 1 ส่วน 3. น้ำยาคาห์ล (Kahle’s solution) เอทิลแอลกอฮอล์ 95% 1 ส่วน ฟอร์มาดีไฮด์ (Formaldehyde) 6 ส่วน กรดน้ำส้ม (Glacial acetic acid) 2 ส่วน น้ำกลั่น 30 ส่วน 2.4 การเก็บในสไลด์ถาวร ใช้สำหรับเก็บรักษาตัวอย่างแมลงหรือพวกสัตว์ขาข้อที่มีขนาดเล็กและ ตัวค่อนข้างใส เช่น ยุง เหา หมัด ไรไก่ ริ้น เพลี้ยไฟ มด เป็นต้น หรือสำหรับเก็บอวัยวะบางส่วนที่ต้องการศึกษา รายละเอียด เช่น ขา หนวด ปีก ควรพยายามเอาอวัยวะภายในออกให้หมดเพื่อป้องกันไม่ให้สิ่งเหล่านี้ขัดขวางต่อการ ตรวจอวัยวะที่ต้องการศึกษาสำหรับพวกที่มีผนังตัวหนา หรือสีเข้ม ควรนำมาทำให้ใสเสียก่อนในน้ำยาแช่ใส พวก โปแตสเซียมไฮดรอกไซด์ หรือแลคโตฟีนอล

20 เมื่อแมลงใสแล้วเก็บรักษาด้วยการใช้แอลกอฮอล์เข้าแทนที่ของเหลวในตัวแมลงโดยแช่แมลงในแอลกอฮอล์ ที่มีความเข้มข้น 50, 70, 80, 85, 90, 95 และ 95 ผสมนอร์มอลบิวทิลแอลกอฮอล์ตามลำดับ จากนั้นนำไปผนึกเป็น สไลด์ในดีพีเอ็กซ์ หรือดีเพ็กซ์ (DePEX) สำหรับแมลงที่มีตัวหนาจะไม่สามารถปิดกระจกสไลด์ได้ ควรใช้สไลด์หลุมลึก ตามความหนาของแมลง แต่เนื่องจากสไลด์หลุมมีราคาแพง อาจใช้เศษแก้วหรือเศษพลาสติกหรือเทปกาวใส ความ หนาเท่าตัวแมลงหรือให้มีความหนากว่าตัวแมลงเล็กน้อย แล้วติดวัสดุดังกล่าวให้แน่นบนกระจกสไลด์รอบตัวอย่าง แมลง เพื่อช่วยพยุงไม่ให้กระจกปิดสไลด์กดทับตัวอย่างแมลง อย่าลืมว่าต้องจัดรยางค์ส่วนต่างๆ ให้ยื่นเหยียดออกจากลำตัว เรียงให้เป็นระเบียบ ลำตัวไม่พับงอ โดยใช้ เข็มเขี่ยปลายแหลมช่วยในการจัดท่าทาง การทำบันทึกประจำตัวแมลง (Insect labelling) ตัวอย่างแมลงจะมีคุณค่าทางวิทยาศาสตร์หากมีการบันทึกข้อมูลที่จำเป็นติดประจำตัวแมลงอย่างถูกต้อง โดยสามารถแบ่งวิธีบันทึกตามวิธีการเก็บรักษาแมลงดังนี้ 1. แมลงที่เก็บรักษาแบบแห้ง เช่น การปักเข็ม การติดด้วยกระดาษแข็ง นิยมใช้แผ่นป้ายสี่เหลี่ยมผืนผ้า กว้างขนาด ¼ นิ้ว ยาว ¾ นิ้ว สองแผ่น แผ่นที่ 1 บันทึกสถานที่เก็บ วันที่เก็บ และชื่อผู้เก็บ แผ่นที่ 2 บันทึกชื่อ วิทยาศาสตร์ ชื่อวงศ์ ชื่ออันดับ และชื่อผู้วิเคราะห์ ควรจัดระดับของตัวแมลง แผ่นป้ายที่ 1 และแผ่นป้ายที่ 2 ของแมลงทุกตัวให้อยู่ในระดับเดียวกันเพื่อให้ แลดูสวยงาม นิยมจัดให้ตัวแมลงอยู่ห่างจากเข็มหมุด 1.3 เซนติเมตร ตัวแมลงห่างจากป้ายอันแรก 0.6 เซนติเมตร และป้ายที่ 1 ห่างจากป้ายที่ 2 ระยะ 0.3 เซนติเมตร การจัดให้อยู่ในระดับเดียวกันด้วยแท่นจัดตัวอย่างเพื่อให้ได้ ระดับที่แน่นอน 2. แมลงที่เก็บรักษาในสไลด์ นิยมทำป้ายประจำตัวแมลงด้วยแผ่นป้ายจัตุรัสขนาดกว้าง 2.2X2.2 เซนติเมตร ปิดบนริมของสไลด์ทั้งสองข้าง โดยมีตัวอย่างแมลงอยู่ตรงกลางสไลด์ ป้ายด้านซ้ายมือ บันทึกชื่อ วิทยาศาสตร์ ชื่อวงศ์ ชื่ออันดับของแมลง และชื่อผู้วินิจฉัย ป้ายด้านขวามือบันทึกสถานที่เก็บ วันที่เก็บ ชื่อผู้เก็บ ตลอดจนแหล่งของอาหารหรือสภาพที่อยู่อาศัยของแมลงที่เก็บมา การเก็บบรรจุในภาชนะถาวร ปกตินิยมเก็บตัวอย่างแมลงทั้งชนิดที่เก็บแบบแห้งและเก็บในสไลด์ไว้ในหีบหรือกล่องถาวร เพื่อป้องกันฝุ่น ละออง หรือป้องกันการทำลายของแมลงหรือสัตว์ขนาดเล็กอื่นๆ 1. หีบหรือกล่องเก็บแมลง เป็นวัสดุที่ทำด้วยไม้หรือพลาสติกแข็งแรง มีฝาปิดมิดชิด ภายในบุด้วยแผ่นไม้ คอร์กทั้งชิ้น หรือวัสดุที่นุ่มแต่ต้องไม่เป็นขุย แล้วบุทับด้วยกระดาษ หลังจากนั้นใส่ลูกเหม็นหรือการบูรตรึงไว้ที่มุมหนึ่ง ของกล่องเพื่อป้องกันลูกเหม็นหลุดกระทบตัวอย่าง และต้องหมั่นเติมลูกเหม็นเป็นประจำ เพื่อป้องกันแมลงขนาดเล็ก เช่น มด หรือแมลงอื่นๆ เข้าไปทำลายตัวอย่างในกล่อง แล้วจัดเรียงตัวอย่างแมลงให้เป็นแถวหรือเป็นระเบียบ โดย แยกตามอันดับของแมลงที่มีวิวัฒนาการต่ำไปสูง จัดระยะห่างระหว่างแถวและระยะห่างระหว่างตัวอย่างให้เหมาะสม และสวยงาม 2. ภาชนะสำหรับเก็บสไลด์อาจเป็นหีบ กล่อง หรือตู้ที่ทำด้วยไม้ พลาสติก โลหะ หรือวัสดูอื่นที่ทนทาน ขนาดของภาชนะอาจแตกต่างกันตามวัตถุประสงค์ของการใช้งาน การวางสไลด์ลงในภาชนะอาจวางในแนวตั้งขนาน กับพื้น หรืออาจวางราบกับพื้น โดยป้องกันไม่ให้สไลด์กระทบกระแทกกับสิ่งอื่นๆ ซึ่งจะทำให้สไลด์แตกได้

21 ปฏิบัติการเรื่อง การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงแบบแห้ง แมลงในโลกของเรามีมากมายหลายชนิด และมีขั้นตอนในการเก็บและรักษาตัวอย่างแมลงหลากหลายวิธี ซึ่งโดยทั่วไปจะเริ่มต้นจากการจับแมลงมาทำให้ตายด้วยสารเคมีชนิดต่างๆ จากนั้นจัดรูปร่างและระยางค์ของแมลง ให้ อยู่ในลักษณะที่สวยงามและถูกต้องตามหลักวิชาการ และสะดวกต่อการศึกษาหรือการจำแนกชนิดของแมลงนั้น แล้ว ผ่านขบวนการต่างๆ ที่เหมาะสมเพื่อป้องกันไม่ให้ตัวอย่างเน่าเปื่อยหรือเกิดความเสียหาย หากต้องการเก็บเพื่อการ ศึกษาวิจัยหรือการศึกษาทางชีววิทยา จะต้องปิดป้ายบอกรายละเอียด วัน เวลา สถานที่เก็บแมลง ชื่อผู้เก็บ ชื่อผู้ จำแนก และชื่อวิทยาศาสตร์ของแมลงชนิดนั้นให้สมบูรณ์ วัตถุประสงค์ 1. นักศึกษาสามารถเก็บแมลงกลุ่มต่างๆ โดยใช้อุปกรณ์ที่เหมาะสมได้ 2. นักศึกษาเลือกวิธีเก็บรักษาตัวอย่างแมลงได้ถูกต้อง อุปกรณ์ 1. เข็มปักแมลง (Insect pins) 2. เข็มสำหรับจัดรูปร่างแมลง (อาจใช้เข็มหมุดแทนได้) 3. แท่นจัดรูปร่างแมลง (Spreading board) 4. กระดาษลอกลาย กระดาษแก้วหรือกระดาษว่าว (ลักษณะใสสามารถมองเห็นอีกด้านได้) 5. กระดาษสามเหลี่ยมขนาดเล็ก 6. ไม้ก๊อก หรือโฟมยาง 7. แอลกอฮอล์ความเข้มข้น 70% หรืออีเธอร์ 8. ปากคีบ (Forceps) 9. กาว หรือน้ำยาทาเล็บ 10. แท่นจัดระดับ (Pinning block) 11. อุปกรณ์เครื่องเขียน 12. สวิงตาข่าย วิธีดำเนินการ การเก็บและรักษาตัวอย่างแมลงแบ่งเป็น 6 ขั้นตอน ดังนี้ 1. การค้นหาและเก็บแมลง ต้องค้นหาจากแหล่งที่อยู่อาศัย แหล่งผสมพันธุ์ แหล่งเพาะพันธุ์ หรือแหล่งที่มีแมลงชุกชุม โดยต้องให้ตรง กับเวลาที่แมลงออกมาทำกิจกรรมดังกล่าวด้วยอุปกรณ์ที่แตกต่างกัน เช่น จับแมลงกลางวันด้วยสวิงจับแมลง แมลง กลางคืนจับด้วยการล่อไฟ หรือการใช้ไม้ยาว 2. การฆ่าแมลง 2.1 การเตรียมขวดสำหรับฆ่าแมลงมี 2 แบบ ได้แก่ ขวดฆ่าแมลงแบบถาวร ใส่ผงโปแตสเซียมหรือโซเดียมไซยาไนด์ 1 ช้อนชา ลงไปที่ก้นขวดประมาณ 1,000 กรัม เกลี่ยให้ทั่วแล้วเทปูนปาสเตอร์แห้งทับ แล้วอัดให้แน่นจนมีความหนา 1 เซนติเมตร จากนั้นใช้ปูนปาสเตอร์เปีย กราดทับให้มีความหนา 1 เซนติเมตร อีกชั้นหนึ่ง และเกลี่ยปูนปาสเตอร์ให้เรียบ และปล่อยให้แข็งตัวในตู้ดูดควันหรือ ที่มีอากาศถ่ายเทสะดวกเป็นเวลา 1-2 วัน แล้วตัดกระดาษซับให้มีขนาดและรูปร่างพอดีกับก้นขวด วางซ้อนปูปา สเตอร์ที่แข็งตัว ปิดฝาขวดให้แน่น ติดป้ายที่ข้างขวดว่า อันตราย หรือขวดรมแมลง ขวดแบบนี้สามารถเก็บไว้ใช้ได้ นานหลายเดือน ขวดฆ่าแมลงแบบชั่วคราว ราดสารที่ใช้ฆ่าแมลง 2-3 มิลลิลิตร ลงบนกระดาษซับ สำลี หรือวัสดุอื่นๆ ที่ดูด ความชื้นได้ดี เช่น แผ่นยางตัดเป็นชิ้นขนาดเล็ก แล้วตัดกระดาษซับให้มีขนาดและรูปร่างพอดีกับก้นขวด วางซ้อนปูปา

22 สเตอร์ที่แข็งตัว ปิดฝาขวดให้แน่น ติดป้ายที่ข้างขวดว่า อันตราย หรือขวดรมแมลง ขวดแบบนี้มีความเป็นพิษน้อย สามารถเตรียมได้ง่าย รวดเร็ว แต่ฤทธิ์ของสารอาจอยู่ได้ไม่นาน ต้องหมั่นเติมสารเป็นประจำ 2.2 การใส่แมลง มีข้อควรระวังในการใส่แมลงลงในขวดดังนี้ - ต้องจัดแมลงให้พร้อมที่จะใส่ลงในขวดได้ทันทีที่เปิดฝาขวด - ไม่เปิดฝาขวดทิ้งไว้นาน และหลีกเลี่ยงการสูดดมไอระเหยของสารพิษจากขวด - ไม่ควรใส่แมลงหลายตัวในขวดเดียวกัน ในเวลาเดียวกัน เพื่อป้องกันการกระทบกระแทกและชำรุด เสียหายได้ - แมลงที่มีปีกขนาดใหญ่ เช่น ผีเสื้อ แมลงปอ ควรบีบทรวงอกให้สลบก่อน หรืออาจใช้กระดาษอัดลงไปใน ขวดเพื่อจำกัดพื้นที่ในขวด ป้องกันปีกหรือเกล็ดชำรุดเสียหาย หรือใช้กระดาษสามเหลี่ยม - เฝ้าสังเกตระยะที่เหมาะสมในการฆ่าแมลง เพราะถ้านานเกินไปอาจทำให้สีลำตัวซีดลง รวมถึงรยางค์ส่วน ต่างๆ แข็งจนไม่สามารถนำมาจัดรูปร่างได้ 3. การเก็บรักษาตัวอย่างแมลงที่ตายแล้ว ให้ปักแมลงด้วยตะปูเข็มแทนเข็มปักแมลงซึ่งมีราคาสูง ด้วยตำแหน่งที่ต้องการตามชนิดของแมลง โดยถือ แมลงให้อยู่ระหว่างหัวแม่มือและนิ้วชี้ อีกมือจับเข็มปักลงบนตำแหน่ง โดยใช้เข็มปักทางด้านหลังทะลุด้านท้องของ แมลง จัดให้แมลงสูงจากพื้นประมาณ 1 เซนติเมตร หรือให้ห่างจากพื้นในตำแหน่งที่เท่ากัน แมลงที่จะปักด้วยเข็มต้อง ไม่ตายมานานเพราะตัวจะเปราะเกินไป พวกที่ปักเข็มลงกึ่งกลางของส่วนอก ได้แก่ ผีเสื้อ แมลงวัน ผึ้ง มวน แมลงปอ แมลงช้างปีกใส พวกที่มีปีกคลุมส่วนอก ควรปักเข็มเยื้องไปทางด้านขวามือของกึ่งกลางลำตัว เช่น ด้วง แมลงสาบ เพลี้ย จักจั่น 4. การจัดรูปร่างแมลง 4.1 แมลงที่มีปีก ควรใช้ไม้จัดแมลงช่วยตรึงปีกให้อยู่ในลักษณะที่ต้องการ ดังนี้ กลุ่มผีเสื้อ จัดปีกคู่แรกให้ตั้งฉากกับลำตัว ปีกคู่หลังจัดให้ซ้อนเหลื่อมใต้ปีกคู่แรกเล็กน้อย โดยใช้เข็มค่อยๆ เขี่ยปีกขึ้นไป ห้ามใช้มือจับปีกเพราะเกล็ดจะหลุด หรือปีกชำรุด แล้วใช้กระดาษทาบปีกและตรึงเฉพาะส่วนที่เป็น กระดาษกับแท่นจัดแมลงด้วยเข็มหมุด กลุ่มแมลงปอ และกลุ่มผึ้ง จัดปีกคู่หลังให้ตั้งฉากกับลำตัว และปีกคู่แรกให้อยู่เหนือปีกคู่หลัง โดยไม่เหลื่อม ซ้อนปีกคู่หลัง แล้วตรึงกับไม้จัดแมลงเช่นเดียวกับผีเสื้อ กลุ่มด้วงปีกแข็ง มวน ตั๊กแตน แมลงสาบ ไม่จำเป็นต้องกางปีก เพียงแต่จัดหนวดและขาในอยู่ในท่าเกาะ ตามธรรมชาติ แต่ถ้าต้องการกางปีกให้จัดแบบเดียวกับแมลงปอ 4.2 นำแมลงที่จัดท่าเรียบร้อยแล้วเข้าตู้อบที่อุณหภูมิ 40-50 องศาเซลเซียส ด้วงปีกแข็งและแมลงขนาด ใหญ่ เช่น ผีเสื้อ อาจต้องอบนาน 1 สัปดาห์ ตรวจสอบการแห้งโดยใช้ปลายเข็มเขี่ยส่วนท้องเบาๆ ถ้าปลายท้องไม่ยุบ ตามเข็มแล้ว สามารถนำออกจากตู้อบได้ 5. จัดทำแผ่นป้ายบันทึกประจำตัวแมลง แผ่นป้ายบันทึกประจำตัวแมลงต้องเป็นกระดาษแข็ง นิยมใช้แผ่นป้ายสี่เหลี่ยมผืนผ้าขนาดพอเหมาะบันทึก ชื่อวิทยาศาสตร์ ชื่อวงศ์ ชื่ออันดับ สถานที่เก็บ วันที่เก็บ ชื่อผู้เก็บ และชื่อผู้วิเคราะห์ติดใกล้กับตัวแมลง 6. การเก็บในภาชนะถาวร เก็บแมลงด้วยกล่องที่แข็งแรง มีฝาปิดมิดชิด โดยให้ใช้กล่องพลาสติกแข็งและใส พื้นกล่องบรรจุแผ่นโฟมที่บุ ด้วยผ้าให้เรียบร้อยและสวยงาม หลังจากนั้นใส่ลูกเหม็นหรือการบูรตรึงไว้ที่มุมหนึ่งของกล่อง แล้วจัดเรียงตัวอย่าง แมลงให้เป็นแถวหรือเป็นระเบียบ โดยแยกตามอันดับของแมลงที่มีวิวัฒนาการต่ำไปสูง จัดระยะห่างระหว่างแถวและ ระยะห่างระหว่างตัวอย่างให้เหมาะสมและสวยงาม

การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิตด้วยการสตัฟฟ์(Stuff technique) เทคนิคการสตัฟฟ์เป็นหนึ่งทางกายวิภาคศาสตร์ ที่ใช้ในการคงสภาพร่างกายสัตว์หลังจากเสียชีวิตไปแล้วให้ เก็บรักษาอยู่ได้นาน และยังคงลักษณะของสัตว์ไว้ได้เหมือนเดิมทุกประการ สัตว์ที่นิยมนำมาทำสตัฟฟ์ ได้แก่ สัตว์มี กระดูกสันหลัง ได้แก่ สัตว์น้ำ เช่น ปลา สัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ เช่น กบ เต่า สัตว์เลื้อยคลาน เช่น จระเข้ กิ้งก่า สัตว์ปีก เช่น นก และ ไก่ สัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม เช่น หนู กระรอกบิน และตัวนิ่ม สัตว์ที่ไม่มีกระดูกสันหลัง เช่น แมลง ตะขาบ กิ้งกือ แมงดา กุ้งก้ามกราม และปู หลักการที่สำคัญของการสตัฟฟ์สัตว์คือการแยกส่วนหนังออกจากร่างกายสัตว์ให้ได้ทั้งตัว แล้วใช้สารเคมีที่ ช่วยรักษาสภาพหนังสัตว์และใส่วัสดุแห้งเข้าไปแทนที่เนื้อสัตว์ เช่น ฟางข้าว ใยมะพร้าว ขี้เลื่อย สำลี ปัจจุบันนี้วิธีการ สตัฟฟ์สัตว์ได้พัฒนาขึ้นโดยการทำหุ่นจำลองของสัตว์และใส่ขดลวดแทนที่กระดูกสัตว์ ทำให้สามารถจัดรูปร่างและจัด ท่าทางสัตว์ให้คล้ายมีชีวิตจริงยิ่งขึ้น นอกจากนี้ยังมีสถานศึกษาหลายแห่งให้ความสำคัญเปิดสอนวิชาที่ว่าด้วยวิธีการ เก็บรักษาหนังสัตว์รวมทั้งขนและเกล็ด เรียกว่า Taxidermy (มาจาก taxis = preparation กับ dermis = skin) เมื่อ สตัฟฟ์สัตว์แล้วสามารถนำมาใช้เป็นตัวอย่างประกอบการเรียนการสอน จัดทำพิพิธภัณฑ์ทางธรรมชาติวิทยา ตกแต่ง สถานที่หรือเก็บซากสัตว์ที่เจ้าของรักไว้ เพราะปัจจุบันมีผู้สนใจเลี้ยงสัตว์สวยงามหรือสัตว์ที่แปลกเป็นงานอดิเรก สัตว์ เหล่านี้มักหายากและมีราคาแพง ดังนั้นเมื่อสัตว์ตายลงเจ้าของจึงต้องการเก็บซากสัตว์ไว้ในลักษณะที่คล้ายมีชีวิตจริง การสตัฟฟ์สัตว์แต่ละชนิดมีขั้นตอนการดำเนินงานที่คล้ายคลึงกัน คือเริ่มต้นจากการเตรียมสัตว์ก่อนสตัฟฟ์ การจดบันทึกและวัดขนาดสัตว์ การทำแม่พิมพ์ปูนปาสเตอร์ การผ่าตัดลอกหนัง การทำหุ่นจำลอง การใส่หุ่นจำลอง การจัดท่าและผูกป้าย การทำความสะอาดกะโหลกศรีษะ และการตกแต่ง ซึ่งบางขั้นตอนอาจไม่มีความจำเป็นต้องทำ สำหรับการสัตว์บางชนิด เช่น การสตัฟฟ์สัตว์ปีกและสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนมขนาดเล็ก ไม่จำเป็นต้องทำแม่พิมพ์ปูน พลาสเตอร์ ส่วนการทำความสะอาดกะโหลกศรีษะเป็นขั้นตอนที่ต้องทำในการสตัฟฟ์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนมทุกชนิดที่ ต้องการเก็บไว้เป็นตัวอย่างในการศึกษาอนุกรมวิธาน ข้อควรระวังในการเก็บซากสัตว์บางชนิด สัตว์ที่มีขนหรือปีก ให้นำหนังสือพิมพ์พันรอบตัวใส่ถุงพลาสติกมัดปากกันน้ำเข้ารีดลมออก แล้วนำไปแช่ แข็ง/ถังน้ำแข็ง แล้วทำการจัดเรียงขนอย่าให้ยับ หรือสวนทาง ระวังอย่าให้น้ำเข้ายกเว้นพวกสัตว์น้ำ สัตว์สะเทิ้นน้ำ สะเทิ้นบก นกที่มีกระเพาะพักแนะนำให้เอาสำลีอุดปากไว้กันอาหารไหลออกมาเปื้อนขน ปลาเกล็ด ถ้าเกล็ดหลุดเยอะจะทำยากและทำออกมาไม่สวย (ต้องทำใจ) ระยะเวลาการตายและระยะการเก็บมีผลต่อการทำค่อนข้างมาก ซากที่เพิ่งตายและแช่เย็นเพียงไม่กี่วันจะมี สภาพที่ดีทำออกมาสมบูรณ์กว่าซากที่เก็บช้าและแช่นาน และไม่ควรนำซากที่เก็บโดนความเย็นหรือโดนน้ำแข็ง โดยตรง เพราะน้ำแข็งจะกัดหนังหรือขนทำให้ขนหลุดได้ การเก็บรักษา การสตัฟฟ์สัตว์แต่ละชนิดจะใช้ระยะเวลาในการดำเนินการหลายชั่วโมงและสัตว์บางชนิดที่นำมาสตัฟฟ์เป็น สัตว์หายาก ดังนั้นสัตว์ที่ได้รับการสตัฟฟ์แล้วควรได้รับการดูแลเพื่อให้มีอายุการใช้งานคุ้มค่า และทำให้สัตว์สตัฟฟ์นั้น สามารถอยู่ได้ไปอีกหลายปี โดยปฏิบัติดังนี้ - การเก็บรักษาสัตว์สตัฟฟ์มีหลายแบบ เช่น ใส่ตู้ตู้กระจก กล่องพลาสติกหรือทำกรอบพลาสติกใสหุ้มให้ แข็งแรง เพื่อป้องกันฝุ่นและการกัดแทะจากสัตว์อื่น เช่น แมลงสาบ หนู - ถ้าเป็นพวกมด แมลง ซึ่งจะสังเกตพบว่ามีขุยสีขาวเนื่องจากมีแมลงปีกแข็งขนาดเล็กมากัดทำลาย ควรนำ สัตว์สตัฟฟ์ใส่ถุงพลาสติกแล้วใช้สำลีชุบคลอโรฟอร์มใส่ในถุง หรือใช้ยาฆ่าแมลง หรือยาฉีดยุง แล้วรัดปากถุงให้แน่น ทิ้งไว้ 1-2 วัน จะสามารถกำจัดปัญหาจากแมลงเหล่านี้ได้ - ต้องระวังเรื่องความชื้น จะทำให้เกิดพวกเชื้อราทำลายขน และหนังกับสัตว์ทุกชนิดได้ โดยต้องอบสัตว์ สตัฟฟ์ให้แห้งก่อนการเก็บ หรือถ้าเป็นห้องที่ปิดมิดชิดต้องใช้พัดลมระบายอากาศ

24 ปฏิบัติการเรื่อง การสตัฟฟ์ปลา ปลาเป็นสัตว์มีกระดูกสันหลังที่มีรูปร่างและโครงสร้างภายนอกไม่ซับซ้อนจึงง่ายต่อการสตัฟฟ์ปลาที่สตัฟฟ์ แล้วสะดวกต่อการนำมาเป็นตัวอย่างในการศึกษาเช่นศึกษาลักษณะภายนอกหรือใช้จัดแสดงวิวัฒนาการของสัตว์ แต่ ถ้าต้องการเก็บรักษาตัวอย่างไว้เพื่อการศึกษาอนุกรมวิธาน นักชีววิทยานิยมเก็บรักษาไว้ในแอลกอฮอล์มากกว่าเพราะ การวิเคราะห์ชนิด (Species) ของปลาจำเป็นต้องศึกษารายละเอียดมาก การสตัฟฟ์ปลาสามารถผ่าตัวปลาเพื่อนำ กล้ามเนื้อ กระดูกหรือก้าง รวมถึงอวัยวะภายในออกก่อนการทำขั้นตอนต่อไป โดยสามารถผ่าเปิดลำตัวปลาได้ 2 วิธีคือ การผ่าเพื่อดูรอบตัวปลา นิยมผ่าบริเวณส่วนท้องจากกึ่งกลางครีบ ท้อง (Ventral fin) ถึงช่องเปิดทวาร (Anus) รอยการผ่าจะไม่ทำให้ผิวหนังและเกล็ดข้างลำตัวถูกทำลาย และการผ่า เพื่อดูด้านเดียว โดยสามารถผ่าเปิดบริเวณใต้เส้นกลางลำตัว (Lateral line) จากส่วนหลังแผ่นปิดเหงือกถึงโคนหาง การสตัฟฟ์ในห้องปฏิบัติการนิยมนำปลาที่มีขนาดเหมาะสม (20-25 เซนติเมตร) โดยลำตัวไม่เล็กหรือใหญ่จนเกินไป เพราะถ้าใช้ปลาตัวเล็กจะต้องผ่าเปิดช่องท้องเล็กน้อยเท่านั้นและทำให้การนำกล้ามเนื้อและอวัยวะภายในออกยาก แต่เป็นปลาที่มีขนาดใหญ่เกินไปนอกจากจะเสียเวลาในการลงมือปฏิบัติงานแล้ว ยังจำเป็นต้องใช้วัสดุในการใส่แทนที่ กล้ามเนื้อและอวัยวะภายในจำนวนมาก ภาพที่ 2.6 การผ่าหนังปลา มี 2 แบบ ก. แนวการผ่าเพื่อดูรอบตัวปลา ข. แนวการผ่าเพื่อดูด้านเดียวและแสดงเพียง ด้านเดียว วิธีการสตัฟฟ์ปลามีอุปกรณ์ สารเคมี และขั้นตอนดังต่อไปนี้ การเตรียมอุปกรณ์ได้แก่ ชุดผ่าตัด (ด้ามมีด ใบมีด กรรไกร ปากคีบ) ถุงมือ หน้ากากอนามัย หลอดฉีดยา เข็มฉีดยา ถาดพาราฟิน แผ่นปูรอง (ถุงดำ) ถังพลาสติกและน้ำแข็งสำหรับสลบปลา สำลี แผ่นโฟมหนา 2 นิ้ว เข็มหมุดหัวโต เส้น ลวดเบอร์ 18 หรือ 19 ลูกตาปลอม แลกเกอร์เคลือบเงา กาวร้อน เข็มเย็บผ้า ด้ายสีขาวหรือสีดำ (ขึ้นกับหนังสัตว์) กระดาษขาวบาง (A4) และลวดเย็บกระดาษ สารเคมี ได้แก่ ฟอร์มาลีน บอแรกซ์ สารหนู สารส้มฯ (บอแรกซ์ สามารถนอมเนื้อเยื่อเพื่อช่วยย่อยสลายเนื้อเยื่อที่เอา ออกไม่หมด) ขั้นตอนการสตัฟฟ์ปลา สามารถปฏิบัติได้ดังนี้ 1. การเตรียมปลา ปลาที่นำมาสตัฟฟ์ควรเป็นปลาที่ยังมีชีวิตอยู่ เพราะสีตัวปลาจะจางลงทันทีที่ปลาตาย ดังนั้นจำเป็นต้องบันทึกสีลำตัวของปลาทันทีที่จับได้ โดยการวางบนกระดาษแล้วใช้ดินสอลากเส้นตามแนวตัวปลา บนกระดาษ แล้วลงสีด้วยสีเทียนหรือสีชนิดอื่นให้เหมือนสีของตัวปลาขณะมีชีวิตอยู่ (อาจใช้วิธีการถ่ายภาพ และใช้ ไม้บันทัดวางเพื่อเทียบขนาดให้ชัดเจน) นอกจากนี้ปลาต้องมีอวัยวะภายนอกครบสมบูรณ์แล้วจึงทำให้ปลาตาย ด้วยการแช่ในน้ำเย็นจัด (น้ำเปล่าใส่น้ำแข็ง น้ำแข็ง:น้ำเปล่า สัดส่วน 3:1) หรือการแช่ในฟอร์มาลิน 10% ถ้ายังไม่

25 พร้อมสตัฟฟ์ปลา ควรใช้ผ้าขนหนูซับน้ำให้หมาดแล้วพันรอบตัวปลา เพื่อป้องผิวหนังภายนอกแห้ง แล้วแช่ในกระติก น้ำแข็งหรือตู้เย็นเพื่อป้องกันการเน่าเปื่อย 2. การจดบันทึกและวัดขนาด ข้อมูลที่จำเป็นต้องจดบันทึกก่อนการสตัฟฟ์ได้แก่ ชื่อ น้ำหนัก เพศ ขนาด ของปลาตามมาตรฐาน สถานที่พบ สี ลักษณะพิเศษ วันเดือนปีที่เก็บตัวอย่าง ถ้าขาดข้อมูลเหล่านี้แล้วถึงแม้จะสตัฟฟ์ ปลาได้สวยงามเท่าใดก็ไม่มีคุณค่าในการศึกษา ขนาดของสัตว์นิยมวัดความยาวเป็นมิลลิเมตร และน้ำหนักชั่งให้มี หน่วยเป็นกรัม ส่วนเพศถ้าไม่สามารถสังเกตจากภายนอกได้ให้ผ่าดูเพศจากอวัยวะภายในได้ ภาพที่ 2.7 การวัดความยาวตัวอย่างปลา 3. การทำแม่พิมพ์ปูนปาสเตอร์ นำปลามาล้างทำความสะอาดโดยเฉพาะในปากและเหงือก ใช้ฟองน้ำชุบ สารส้ม (ละลายสารส้ม 1 ช้อนชาในน้ำเปล่า 1 แกลลอน) ลูบบนตัวปลาให้ทั่วเพื่อให้เมือกที่คลุมผิวหนังหลุดออกไป ใช้ถาดขนาดใหญ่กว่าตัวปลาใส่ทรายในถาดที่เตรียมไว้ให้หนาประมาณ 2-3 เซนติเมตร แล้วปูทับด้วยกระดาษ หนังสือพิมพ์ 2 ชั้น วางปลาในถาดที่เตรียมไว้โดยวางด้านที่สมบูรณ์และต้องการโชว์ไว้ด้านบน ตัดครีบอก (Pectoral fin) เฉพาะด้านบนออกและเก็บไว้ใช้ภายหลัง โดยต้องรักษาให้ครีบชื้นอยู่เสมอ แผ่ครีบที่เหลือแล้วตรึงด้วยเข็มหมุด และจัดรูปร่างปลาให้มีลักษณะตามที่ต้องการ ใช้ช้อนตักปูนปาสเตอร์ที่ผสมแล้วใส่ทับบันตัวปลาให้หนาโดยเริ่มต้น จากหัวปลา ระวังอย่าเทปูนปาสเตอร์ทับครีบ รอจนปูนปาสเตอร์แข็งตัวดีแล้วจึงดึงเข็มหมุดที่ปักไว้ออก แล้วนำปลา ออกทันทีโดยยกหางปลาเพื่อป้องกันเกล็ดงอ เก็บแม่พิมพ์ไว้ใช้ทำหุ่นตัวปลา (ขั้นตอนนี้สามารถข้ามไปได้) 4. การผ่าตัดลอกหนัง ปูกระดาษหนังสือพิมพ์หรือถุงดำบนโต๊ะ ใช้มีดที่คมกรีดหนังปลาโดยเริ่มจาก บริเวณกึ่งกลางครีบท้องไปส่วนรูทวาร แล้วใช้มีดที่ไม่คมแยกหนังปลาออกจากเนื้อปลา โดยระวังอย่าให้ครีบปลา แห้ง ขณะที่ผ่าตัดลอกหนังปลาควรใช้กระดาษชำระชุบน้ำแล้วหุ้มส่วนครีบเอาไว้ เมื่อลอกหนังปลาถึงฐานครีบต่างๆ ให้ใช้กรรไกรตัดกระดูกที่ยึดครีบ เพื่อให้กระดูกก้านครีบติดไปกับหนังด้วย ลอกหนังปลาอีกด้านด้วยวิธีการเดียวกัน และเมื่อถึงโคนหางให้ใช้กรรไกรตัดกระดูกโคนหางโดยให้กระดูกก้านครีบหางติดมากับหนังปลาด้วย ตัดลำตัวปลา ออกจากส่วนหัวให้ชิดกับกะโหลกศรีษะมากที่สุด ขูดเอาเนื้อที่ติดหนังปลาออกให้มากที่สุด แต่ระวังอย่าขูดเอาเยื่อ สีขาวหรือสีเงินที่ติดหนังปลาออก เพราะจะทำให้หนังปลาบางมากและอาจขาดเป็นรูได้ นำเนื้อที่ติดส่วนหัวปลา บริเวณต่างๆ ออกให้หมด พร้อมทั้งลูกตา และเนื้อข้างแก้มซึ่งนำออกผ่านทางเบ้าตา แต่ห้ามเอาแผงเหงือกออก หลังจากนั้นล้างหนังปลาให้สะอาดแล้วแช่ในแอลกอฮอล์เข้มข้น 70% จนอิ่มตัว ใช้แปรงทาฟอร์มาลิน 10% หรือใช้ เข็มฉีดยาฉีดเข้าไปในส่วนเหงือกและส่วนหัว และผิวด้านในหนังปลาทาด้วยผงบอแร็กซ์ 5. การขึ้นรูป เป็นการใส่วัสดุแห้งและโครงร่างแทนกระดูกแกนกลางลำตัว ตัดลวดแข็งที่มีความยาว เทียบเท่ากับกึ่งกลางส่วนหัวถึงส่วนโคนหาง แล้วใส่ปลายลวดบริเวณกึ่งกลางลำตัวจากส่วนหัวโดยแทงเข้าไปใน กะโหลกแล้วจึงเอาปลายอีกด้านใส่ที่ส่วนโคนหาง แล้วเริ่มใส่สำลีขี้เลื่อยหรือแกลบแห้งอย่างใดอย่างหนึ่งเข้าไปในตัว ปลาเพื่อทดแทนกล้ามเนื้อและอวัยวะภายในที่เอาออก โดยเริ่มจากส่วนหัวไปหาง แล้วเย็บปิดรอยเปิดด้วยเข็มและ

26 ด้ายสีเดียวกันกับหนังปลา ในขณะที่ใส่วัสดุแห้งต้องระมัดระวังไม่ให้ใส่มากหรือน้อยเกินไป และไม่ควรให้เกล็ดปลา หลุดออกมากเกินไป หากต้องการยึดปลาสตัฟฟ์ให้ตั้งตรงหลังการเย็บปิดรอยให้ใช้ลวด 2 -3 เส้น แทงเข้าไปผ่านรอย เย็บจากส่วนล่างไปหาส่วนกลางลำตัว แล้วปักบนแท่นยึดหรือแผ่นโฟมที่มีขนาดใหญ่กว่าความกว้างของลำตัว 6. การตกแต่งปลาที่สตัฟฟ์ให้มีลักษณะใกล้เคียงในธรรมชาติหรือขณะมีชีวิต แล้วจัดครีบให้คลี่ออกทั้งหมด โดยใช้กระดาษประกบทั้งสองด้านแล้วตรึงด้วยเข็มหมุดหรือเย็บด้วยลวดเย็บกระดาษ แต่ต้องระวังไม่ให้ลวดเย็บ กระดาษปักครีบ เพราะจะทำให้เกิดรูและขาดได้ บริเวณส่วนหัวใช้เข็มหมุดหรือวัสดุเปิดปากให้อ้าปากออก แผ่น กระดูกปิดเหงือก (Operculum) สามารถเปิดปิดได้ตามต้องการ ปล่อยปลาสตัฟฟ์ให้แห้งในอุณหภูมิห้องหรือใส่ใน ตู้อบลมร้อนให้แห้งสนิท แล้วจึงใส่ลูกตาปลอมที่มีสีและขนาดใกล้เคียงกับปลาในธรรมชาติเข้าไปในเบ้าตาโดยจัดให้ อยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสม นำเข้าตู้อบลมร้อนตั้งอุณภูมิไม่เกิน 50 องศาเซลเซียส อย่างน้อย 3-5 วัน เมื่อปลาสตัฟฟ์แห้งสนิทแล้ว ลอกกระดาษที่ประกบครีบต่างๆ ออก โดยใช้พู่กันชุบน้ำทารอบบริเวณครีบสักครู่ แล้วจึงลอกกระดาษออกด้วยความ ระมัดระวัง แล้วทาสีให้ตรงตามที่บันทึกไว้ตอนต้นและเคลือบเงาตัวปลา เพราะจะทำให้ตัวปลามันเงาสวยงามเหมือน ในขณะมีชีวิตในธรรมชาติ ตกแต่งระบบนิเวศโดยวางปลาสตัฟฟ์บนระบบนิเวศจำลองที่สร้างขึ้น แล้วใส่กล่องที่ปิด มิดชิดและบรรจุสารกันแมลง อย่าลืมใส่ข้อมูลที่บันทึกไว้ตอนต้นบริเวณที่สามารถสังเกตได้ชัดเจนโดยไม่บดบังความ สวยงามของระบบนิเวศที่จัดขึ้น

27 ภาพที่ 2.8 ขั้นตอนเทคนิคการสตัฟฟ์ปลานิล

28 ปฏิบัติการเรื่อง การสตัฟฟ์ปู วิธีการสตัฟฟ์ปูมีอุปกรณ์ สารเคมี และขั้นตอนดังต่อไปนี้ การเตรียมอุปกรณ์ได้แก่ ชุดผ่าตัด (ด้ามมีด ใบมีด กรรไกร ปากคีบ) ถุงมือ หน้ากากอนามัย หลอดฉีดยา เข็มฉีดยา ถาดพาราฟิน แผ่นปูรอง (ถุงดำ) สำลี แผ่นโฟมหนา 2 นิ้ว ขนาด 30X30 เซนติเมตร เข็มหมุดหัวโต เส้นลวดเบอร์ 18 หรือ 19 แลกเกอร์เคลือบเงา กาวร้อน สารเคมี ได้แก่ ฟอร์มาลีน ขั้นตอนการสตัฟฟ์ปูสามารถปฏิบัติได้ดังนี้ 1. การเตรียมปู เลือกปูสดที่อวัยวะและรยางค์ครบสมบูรณ์ ขนาดไม่เล็กจนเกินไป (ขนาดความยาวกระดอง ไม่ควรเล็กกว่า 10 เซนติเมตร) แล้วทำให้ตายโดยการแช่ในน้ำเย็นจัด (น้ำแข็ง:น้ำเปล่า สัดส่วน 3:1) ประมาณ 10-15 นาที 2. การจดบันทึกและวัดขนาด ให้ทำเช่นเดียวกับการสตัฟฟ์ปลา และล้างทำความสะอาดเศษดินทรายหรือ สัตว์ที่เกาะติดมาตามตัวออก 3. การนำส่วนเนื้อปูออก ปูกระดาษหนังสือพิมพ์หรือถุงดำบนโต๊ะ ใช้มีดที่คมกรีดรอยต่อระหว่างกระดอง และลำตัว เพื่อแยกส่วนกระดองและลำตัวออกจากกัน จากนั้นใช้กรรไกรตัดส่วนเหงือกออก ใช้ปากคีบดึงส่วนของ กล้ามเนื้อที่แทรกในลำตัวและรยางค์ส่วนต่างๆ ออกให้ได้มากที่สุด 4. ล้างทำความสะอาดเพื่อนำเศษเนื้อจากส่วนต่างๆ ออกให้เรียบร้อย แล้วซับน้ำออกให้พอหมาด แล้ว เตรียมแผ่นโฟมโดยตัดเป็นรูปสี่เหลี่ยมผืนผ้าให้มีขนาดใหญ่กว่าความกว้างของรยางค์รอบตัว เพื่อรองเป็นฐานในการ จัดท่าทาง 5. จัดท่าทางรยางค์บนแผ่นโฟม โดยให้ลักษณะท่าทางเหมือนตอนที่ปูมีชีวิตในธรรมชาติ อาจเป็นท่าทาง การเดิน การกินอาหาร หรือการต่อสู้ ใช้เข็มหมุดช่วยในการพยุงรยางค์ส่วนต่างๆ โดยห้ามปักลงไปบนตัวอย่าง โดยตรงเด็ดขาด และถ้ารยางค์ขนาดใหญ่ให้สอดลวดเข้าไปด้านในเพื่อเป็นโครงร่างให้ขยับรยางค์ไปในทิศทางที่ ต้องการได้ 6. ในส่วนก้ามหนีบ หากต้องการให้กางออกหรือยกชูขึ้น ให้ตัดแผ่นโฟมขนาดเล็กหนุนไว้ ส่วนรยางค์หนวด และตาต้องใช้เข็มหมุดยึดให้กางออก ไม่ควรพับเก็บไว้ โดยรยางค์ของลำตัวทั้งสองด้านต้องมีความสมดุลกันและเป็น ธรรมชาติ 7. จุ่มตัวอย่างลงในสารละลายผสมของฟอร์มาลิน กลีเซอร์รีน แอลกอฮอล์ และน้ำกลั่น อย่างน้อย 1 ชั่วโมง หรือใช้วิธีการฉีดสารละลายผสมเข้าไปในรยางค์ส่วนต่างๆ โดยจะต้องทำในตู้ดูดควันเท่านั้น 8. ตรวจสอบความเรียบร้อยของตัวอย่าง ทั้งจำนวนรยางค์ ท่าทาง ตำแหน่งลำตัว แล้วนำตัวอย่างเข้าตู้อบ ลมร้อน ตั้งอุณหภูมิไม่เกิน 50 องศาเซลเซียส อย่างน้อย 3-5 วัน 9. ตกแต่งความสวยงาม อาจลงสีเพื่อให้ปูมีสีสันเหมือนธรรมชาติ และเคลือบเงา ตกแต่งระบบนิเวศโดยวาง ปูสตัฟฟ์บนระบบนิเวศจำลองที่สร้างขึ้น แล้วใส่กล่องที่ปิดมิดชิดและบรรจุสารกันแมลง อย่าลืมใส่ข้อมูลที่บันทึกไว้ ตอนต้นบริเวณที่สามารถสังเกตได้ชัดเจนโดยไม่บดบังความสวยงามของระบบนิเวศที่จัดขึ้น

29 \ ภาพที่ 2.9 ขั้นตอนเทคนิคการสตัฟฟ์ปู หมายเหตุการสตัฟฟ์กุ้งให้ทำเหมือนกับการสตัฟฟ์ปู

บทที่ 3 เทคนิคการเตรียมสไลด์ถาวร การเตรียมเนื้อเยื่อเพื่อการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้กันทั่วไป จำเป็นต้องรักษาสภาพเนื้อเยื่อก่อน เพื่อป้องกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและรูปร่างของเซลล์ แล้วนำเข้าสู่กระบวนการต่างๆ เพื่อเตรียมเป็นสไลด์ถาวร ซึ่งจะสามารถเก็บรักษาตัวอย่างไว้ได้เป็นระยะเวลานาน วิธีการเตรียมสไลด์เกี่ยวข้องกับเทคนิค เครื่องมือ และ อุปกรณ์หลายชนิด ดังนั้นต้องมีความเข้าใจพื้นฐานการทำงานเพื่อสามารถเตรียมสไลด์ได้ถูกต้อง อุปกรณ์และเครื่องมือที่สำคัญ อุปกรณ์และเครื่องมือมีความจำเป็นอย่างมากในการเตรียมตัวอย่างสิ่งมีชีวิต เพื่อช่วยเตรียมตัวอย่างและ ทำให้มองเห็นสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก อุปกรณ์และเครื่องมือที่สำคัญ ได้แก่ 1. เครื่องมือ เครื่องมือที่จำเป็นสำหรับปฏิบัติงานในรายวิชาเทคนิคทางชีววิทยามีหลายชนิด ได้แก่ 1.1 กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) เป็นเครื่องมือที่ช่วยในการขยายขอบเขตประสาทสัมผัสทางตา เพื่อศึกษาตัวอย่างที่มีขนาดเล็กไม่สามารถมองเห็นด้วยตาเปล่าให้มีขนาดใหญ่ขึ้น โดยใช้หลักการหักเหของแสงผ่าน ตัวอย่าง 1.2 เครื่องอุ่นสไลด์ (Slide warmer) เป็นเครื่องมือที่ช่วยเสริมการตรึงตัวอย่างและทำให้สารผนึก สไลด์แห้งเร็วขึ้น สามารถปรับอุณหภูมิด้วยปุ่มควบคุมอุณหภูมิ (Thermostat) ให้สูงหรือต่ำได้ โดยทั่วไปนิยมปรับ อุณหภูมิที่ 45 องศาเซลเซียส 1.3 ตู้ดูดควันหรือตู้ดูดไอสารเคมี (Flume hood) เป็นเครื่องมือที่ช่วยในการดูดไอพิษหรือสารที่มี กลิ่นรุนแรง เพื่อป้องกันอันตรายต่อร่างกาย เช่น ฟอร์มาลิน ไซลีน กรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น กรดอะซิติก ฯลฯ 2. อุปกรณ์ อุปกรณ์ที่จำเป็นสำหรับปฏิบัติงานในรายวิชาเทคนิคทางชีววิทยามีหลายชนิด ได้แก่ 2.1 สไลด์ (Slide) เป็นแผ่นแก้วบาง ใช้สำหรับรองรับตัวอย่างมีความยาว 7.62 เซนติเมตร กว้าง 2.54 เซนติเมตร ผลิตจากแก้วที่มีความแข็งแรง สไลด์ที่เหมาะกับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ควรมีความหนา มาตรฐาน 0.1-1.2 มิลลิเมตร ผิวหน้าสไลด์ต้องแบนราบ สไลด์ 1 กล่องบรรจุ 50-72 แผ่น ก่อนการใช้งานต้องล้าง คราบไขมันที่ติดบนผิวหน้าสไลด์ด้วยสารทำความสะอาดก่อน สไลด์ที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการมี 3 แบบได้แก่ 2.1.1 แบบเรียบทั้งแผ่น ไม่มีรอยขัดเหมาะกับตัวอย่างทั่วไป 2.1.2 แบบเรียบด้านเดียวเรียกว่า สไลด์หลุม สำหรับศึกษาตัวอย่างที่มีชีวิตและเคลื่อนที่ได้ มี ทั้งแบบ 1, 2 และ 3 หลุม 2.1.3 สไลด์ฝ้า ด้านใดด้านหนึ่งมีรอยขัดให้จับได้สะดวก หรือสำหรับเขียนรายละเอียดของ ตัวอย่างด้วยดินสอคาร์บอน เหมาะสำหรับการจุ่มสไลด์ทั้งแผ่นที่มีตัวอย่างลงในสารเคมี 2.2 กระจกปิดสไลด์ (Cover slip หรือ Cover glass) เป็นแผ่นแก้วบางที่มีรูปแบบและความหนาที่ แตกต่างกัน 2.2.1 รูปแบบของกระจกปิด สามารถเลือกใช้ตามความเหมาะสมมีหลายแบบได้แก่ 2.1.1.1 แบบกลม ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางตั้งแต่ 6-50 มิลลิเมตร 2.1.1.2 แบบสี่เหลี่ยมจัตุรัส ขนาดกว้างXยาว เท่ากับ 16X16 หรือ 22X22 มิลลิเมตร 2.1.1.3 แบบสี่เหลี่ยมผืนผ้า ขนาดขนาดกว้างXยาว เท่ากับ 22X30 หรือ 22X40 หรือ 22X50 หรือ 22X60 มิลลิเมตร 2.2.2 ความหนาของกระจกปิด ใช้งานได้ตามความเหมาะสมตามระดับความหนาได้แก่ 2.2.2.1 เบอร์ 0 ความหนา 0.08-0.12 มิลลิเมตร เหมาะกับตัวอย่างที่ใช้เลนส์ใกล้วัตถุ 100X

31 2.2.2.2 เบอร์ 1 ความหนา 0.13-0.17 มิลลิเมตร เป็นความหนาที่นิยมใช้โดยทั่วไปใน ห้องปฏิบัติการ เนื่องจากความหนาไม่น้อยหรือมากเกินไป 2.2.2.3 เบอร์ ½ ความหนา 0.16-0.19 มิลลิเมตร 2.2.2.4 เบอร์ 2 ความหนา 0.19-0.23 มิลลิเมตร เหมาะกับการเตรียมตัวอย่างแบบโฮล เมาท์ (Whole mount) 2.2.2.5 เบอร์ 3 ความหนา 0.3-0.35 มิลลิเมตร เหมาะกับการเตรียมตัวอย่างแบบโฮล เมาท์ที่ไม่ต้องผนึกสไลด์ 2.3 ถาดตากสไลด์(Slide tray) อุปกรณ์ที่ผลิตจากโลหะสำหรับวางสไลด์ หลังการติดตัวอย่างบน แผ่นสไลด์ สามารถวางสไลด์ได้จำนวน 20 แผ่น มีขนาดกว้างXยาวXสูงเท่ากับ 18.5X28.5X0.5 เซนติเมตร 2.4 กล่องเก็บสไลด์ (Slide box) ใช้เก็บสไลด์ตัวอย่างที่เสร็จสมบูรณ์สามารถจัดเรียงสไลด์ตัวอย่าง ให้เป็นหมวดหมู่ มีฝาปิดสนิทเพื่อป้องกันความเสียหายและฝุ่นละออง สามารถเก็บสไลด์ได้ตั้งแต่ 25, 50 และ 100 แผ่น 2.5 ขวดใส่สารผนึกสไลด์พร้อมแท่งแก้ว (Balsam bottle) อุปกรณ์บรรจุสารผนึกสไลด์ประกอบด้วย ขวดแก้วใสและฝาปิด เพื่ออำนวยความสะดวกต่อการใช้งานขณะปิดผนึกสไลด์ โดยใช้แท่งแก้วป้ายสารผนึกสไลด์ หยดบนตัวอย่าง ถ้าสารปิดผนึกแห้งหรือหนืดเกินไปสามารถเติมไซลีน (Xylene) เพื่อละลายสารผนึกสไลด์ 2.6 โถแก้วย้อมสี ภาชนะแก้วสำหรับย้อมสี ก่อนใช้งานต้องจัดเรียงสไลด์ให้เป็นระเบียบก่อนจุ่มลงใน ภาชนะที่บรรจุสารละลายแบ่งได้ 2 แบบ คือ 2.6.1 ภาชนะรูปทรงสี่เหลี่ยมผืนผ้าแนวนอนเรียกว่า สเตนนิงจาร์ (Staining jar) มีหลายขนาด ทั้งแบบเป็นร่องสำหรับเรียงสไลด์ และแบบที่ผิวด้านในเรียบซึ่งใช้คู่กับตระกร้าใส่สไลด์สำหรับย้อมสี ตระกร้าย้อมสี ผลิตจากแก้ว ด้านล่างเจาะเป็นช่องและมีร่องสำหรับวางเรียงสไลด์จำนวน 10 ช่อง หรืออาจเรียงสไลด์แบบสลับฟัน ปลาได้ครั้งละ 19 แผ่น บรรจุสารละลายได้ครั้งละ 80-100 มิลลิลิตร เมื่อต้องการเปลี่ยนสารละลายใหม่ สามารถยก ชุดตระกร้าแล้วย้ายไปโถแก้วต่อไป 2.6.2 ภาชนะแก้วทรงสูงเรียกว่า คอปลินจาร์ (Coplin jar) ขนาดกว้างXยาวXสูงเท่ากับ 1X1X3 นิ้ว มีร่องสำหรับวางเรียงสไลด์จำนวน 5 ช่อง หรืออาจเรียงสไลด์แบบสลับฟันปลาได้ครั้งละ 9 แผ่น บรรจุ สารละลายได้ครั้งละ 30-40 มิลลิลิตร ขณะเปลี่ยนสไลด์ไปยังสารละลายในภาชนะใหม่ให้ใช้ปากคีบยกสไลด์จาก ภาชนะเดิม 2.7 กระบอกตวง (Cylinder) ภาชนะรูปทรงกระบอกสูง ผลิตจากแก้ว พลาสติกหรือโลหะ มีหลาย ขนาดตั้งแต่ 10-1,000 มิลลิลิตร มีขีดบอกปริมาตรแบบละเอียด ใช้ตวงหรือวัดปริมาตรสารเคมีที่อยู่ในรูปของเหลว เพื่อเตรียมสารละลายในกระบวนการต่างๆ 2.8 บีกเกอร์(Beaker) ภาชนะรูปทรงกระบอก ผลิตจากแก้ว พลาสติกหรือโลหะมีหลายขนาดตั้งแต่ 10-5,000 มิลลิลิตร มีขีดบอกปริมาตร ใช้ตวงสารได้แต่ความละเอียดน้อยกว่ากระบอกตวง เหมาะสำหรับผสมสาร หรือละลายสารด้วยความร้อน 2.9 ปิเปต (Pipette) อุปกรณ์สำหรับตวงสารปริมาณน้อยและต้องการความแม่นยำสูง มีหลายขนาด เช่น 0.1, 1, 5, 10 และ 20 มิลลิลิตร ฯลฯ รูปร่างเป็นทรงกระบอกยาวด้านในกลวงเป็นท่อ หรือมีกระเปาะตรงกลาง ส่วนปลายด้านที่สัมผัสสารจะเรียว ส่วนปลายด้านตรงข้ามตรง มีวงแถบสีบ่งบอกปริมาตรและขนาด ควรใช้ลูกยางต่อ ประกบด้านปลายตรงให้แนบสนิท แล้วบีบลูกยางไล่ลมออกก่อนนำส่วนปลายเรียวจุ่มลงในสาร แล้วปล่อยให้สาร เคลื่อนที่เข้าสู่ปิเปตช้าๆ ให้ส่วนปลายบอกระดับสารสูงกว่าปริมาตรที่ต้องการเล็กน้อย นำลูกยางออกและใช้นิ้วชี้ปิดปิ เปตด้านปลายตรง แล้วขยับนิ้วชี้เพื่อปล่อยสารให้ได้ปริมาตรตามต้องการ 2.10 ขวดใส่สารละลาย (Bottle) ภาชนะแก้วหรือพลาสติกสำหรับบรรจุสารมีฝาปิดมิดชิด อาจใสไม่ มีสีหรือมีสีชาเพื่อป้องกันแสงสำหรับสารที่อาจทำปฏิกิริยากับแสง มีหลายขนาด ได้แก่ 50, 100, 500 และ 1,000 มิลลิลิตร

32 2.11 ปากคีบ (Forcep) อุปกรณ์ที่ผลิตด้วยโลหะ ใช้หยิบจับตัวอย่างแทนมือ เพื่อป้องกันอันตราย จากสารเคมี หรือป้องกันสารคัดหลั่งจากร่างกายที่จะสัมผัสกับตัวอย่าง หรือป้องกันความร้อน ควรเลือกใช้ตามความ เหมาะสม ปากคีบมีหลายแบบ เช่น ส่วนปลายแหลม ปลายโค้ง ปลายทู่ ปลายมีเขี้ยวยื่น และปลายเรียบ ฯลฯ และมี หลายขนาด เช่น ความยาว 5, 8, 10 และ 15 นิ้ว ฯลฯ 2.12 มีดผ่าตัด (Scalpel) อุปกรณ์ที่ผลิตด้วยโลหะประกอบด้วยด้ามมีดและใบมีด ใช้สำหรับตัดชิ้น ตัวอย่างให้มีขนาดเหมาะสม ด้ามมีดและใบมีดมีหลายขนาด เช่น ด้ามมีดเบอร์ 3 ใช้งานคู่กับใบมีดเบอร์ 11 และด้าม มีดเบอร์ 4 ใช้งานคู่กับใบมีดเบอร์ 22 ฯลฯ 2.13 เข็มเขี่ย (Needle) อุปกรณ์ที่ผลิตด้วยโลหะ ใช้อำนวยความสะดวกขณะผ่าแยกอวัยวะหรือการ ผ่าตัด นอกจากนี้อาจใช้เข็มหมุด (Pin) ช่วยในการปักยึดซากสิ่งมีชีวิตแล้วตัดเฉพาะโครงสร้างส่วนที่ต้องการศึกษา 2.14 พู่กัน (Brush) อุปกรณ์ช่วยพยุงหรือขนถ่ายชิ้นส่วนตัวอย่าง ใช้แทนมือเพื่อป้องกันการทำลาย ของชิ้นตัวอย่างที่มีขนาดเล็กหรือบางมาก 2.15 กรรไกรผ่าตัด (Scissors) อุปกรณ์ที่ผลิตด้วยโลหะ สำหรับตัดตัวอย่างที่แข็ง มีหลายขนาด 2.16 กรวยกรอง (Funnel) อุปกรณ์ที่ผลิตด้วยแก้วหรือพลาสติก ใช้สำหรับลำเลียงสารลงสู่ภาชนะ มักใช้ร่วมกับกระดาษกรองเพื่อแยกสารแขวนลอย ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางที่ใช้ประมาณ 2.5-5 นิ้ว 3. ประเภทของการเตรียมสไลด์ ตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่นำมาศึกษามีทั้งอยู่ในสภาพมีชีวิตและผ่านการรักษาสภาพเพื่อทำให้เซลล์มีสภาพ เหมือนกับในธรรมชาติซึ่งแบ่งการเตรียมสไลด์ได้ 2 แบบ ได้แก่ 3.1 สไลด์กึ่งถาวร (Semi-permanent slide) สามารถเก็บรักษาตัวอย่างไว้ได้ไม่นาน และขึ้นอยู่กับ สารผนึกสไลด์ที่ใช้ ซึ่งสารผนึกสไลด์ส่วนใหญ่จะละลายได้ในน้ำ (Aqueous mountant) เมื่อน้ำระเหยไปจะคงเหลือ เพียงสารผนึกสไลด์และอาจส่งผลต่อตัวอย่างได้ 3.2 สไลด์ถาวร (Permanent slide) เป็นตัวอย่างที่ตรึงไว้ในสไลด์ที่มีความคงทนถาวร เนื้อเยื่อ ตัวอย่างจะต้องผ่านการทำให้คงสภาพ การย้อมสี และการผนึกเป็นสไลด์ถาวร สารผนึกสไลด์ส่วนใหญ่เป็นแบบเรซิน (Resinous mountant) ซึ่งละลายในตัวทำละลายน้ำมัน (Volatile oil) เมื่อตัวทำละลายระเหยสารผนึกสไลด์จะ แข็งตัวและเก็บรักษาไว้ได้นานหลายปี 4. ตัวอย่างที่นำมาใช้ในการศึกษา การศึกษาส่วนประกอบภายในเซลล์หรือออร์แกเนลล์ (Organelles) รวมทั้งการศึกษาโครงสร้าง ภายในเซลล์(Micro-structure) สามารถเตรียมตัวอย่างได้ 2 แบบ ได้แก่ 4.1 ศึกษาจากตัวอย่างสด (Living organism) ในกรณีศึกษาตัวอย่างขณะยังมีชีวิตต้องทำให้ตัวอย่าง มีชีวิตอยู่ให้นานที่สุด โดยใช้สารผนึกสไลด์ที่มีความเข้มข้นเท่ากับภายในเซลล์(Isotonic solution) ตัวอย่างส่วนใหญ่ เป็นสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว (Unicellular organism) เทคนิคที่ใช้ในการศึกษา ได้แก่ การเตรียมสไลด์แบบสด (Wet mount) เทคนิคหยดแขวน (Hanging drop technique) และการตัดเนื้อเยื่อด้วยมือ (Free-hand section) 4.2 ศึกษาจากตัวอย่างคงสภาพ (Fixed specimen) ตัวอย่างที่นำมาศึกษาต้องผ่านการรักษาสภาพ แต่อาจทำให้เกิดภาพลวงตา (Artifact) วิธีนี้สามารถเก็บรักษาตัวอย่างได้นาน หรือไม่จำเป็นต้องศึกษาสิ่งมีชีวิตนั้น ทันที ตัวอย่างเทคนิคที่ใช้ในการศึกษา ได้แก่ การเตรียมตัวอย่างแห้ง (Dry mount) การผนึกสไลด์ทั้งตัว (Whole mount) การเกลี่ยตัวอย่าง (Smear) การกดให้แบน (Squash) การแบ่งแยก (Isolation) และการตัดเนื้อเยื่อด้วย เครื่องไมโครโตม (Sectioning) 5. วิธีการเตรียมตัวอย่าง การเตรียมเนื้อเยื่อตัวอย่างสิ่งมีชีวิตเพื่อศึกษารายละเอียดของเซลล์อาจเตรียมจากเนื้อเยื่อสดได้ โดยตรง หรือเตรียมได้จากเนื้อเยื่อที่ผ่านกระบวนการทำให้เซลล์คงสภาพมาแล้ว ซึ่งวิธีการเตรียมสามารถแบ่งได้ 2 วิธี ได้แก่ 5.1 วิธีการเตรียมเนื้อเยื่อแบบไม่ตัดเป็นชิ้นบาง (Non-section methods) วิธีนี้เหมาะสำหรับศึกษา เซลล์ที่มีชีวิต (Living cells) เช่น เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (Connective tissue) โพรโทซัว (Protozoa) เลือด (Blood)

33 น้ำเหลือง (Lymp) ฯลฯ โดยวางตัวอย่างบนสไลด์ เจือจางด้วยสารที่มีความเข้มข้นเท่ากับภายในเซลล์จากนั้นนำไป ตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แต่ก็จะทำให้สามารถสังเกตเห็นเซลล์ตัวอย่างไม่ชัดเจน วิธีการเตรียม ตัวอย่างเนื้อเยื่อแบบนี้สามารถทำได้หลายวิธี เช่น 5.1.1 การเตรียมสไลด์แบบสด (Wet mount) เหมาะสำหรับศึกษาสิ่งมีชีวิต หรือส่วนของ สิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็กและปิดผนึกด้วยน้ำ (Liquid medium) เช่น โพรโทซัว สัตว์น้ำขนาดเล็ก หรือบางส่วนของพืช ฯลฯ 5.1.2 การเตรียมตัวอย่างแห้ง (Dry mount) เหมาะสำหรับศึกษาตัวอย่างที่ไม่มีชีวิต และไม่ จำเป็นต้องผนึกด้วยสาร (Air mount) เช่น ขวาก (Spicule) ฟองน้ำ เส้นขน (Hair หรือ feather) และกระดูกแข็ง (Ground bone) ฯลฯ 5.1.3 การผนึกสไลด์ทั้งตัว (Whole mount/mount part) เหมาะสำหรับศึกษาสิ่งมีชีวิต หรือ อวัยวะที่มีขนาดเล็กและแบน เช่น พารามีเซียม แมลงขนาดเล็ก ฯลฯ 5.1.4 การเกลี่ยตัวอย่าง (Smear) เหมาะสำหรับศึกษาเนื้อเยื่อที่เป็นของเหลว หรือกึ่งของเหลว ได้แก่ เลือด น้ำอสุจิ น้ำเหลือง ไขกระดูก ละอองเกสรดอกไม้ หรือเนื้อเยื่อที่มีลักษณะอ่อนนุ่ม เช่น อัณฑะ ฯลฯ 5.1.5 การกดให้แบน (Squash) เหมาะสำหรับศึกษาส่วนประกอบภายในเซลล์โดยไม่คำนึงถึง รูปร่างภายนอก เช่น โครโมโซม ฯลฯ 5.1.6 การแบ่งแยก (Maceration) เหมาะสำหรับศึกษาเนื้อเยื่อที่เซลล์ยึดกันอยู่อย่างแข็งแรง ด้วยสารยึดระหว่างเซลล์ (Intercellular cementing substance) เช่น ท่อลำเลียงน้ำของพืช (Xylem) และมัด กล้ามเนื้อของสัตว์ (Muscle bundle) ฯลฯ 5.2 วิธีการเตรียมเนื้อเยื่อแบบตัดเป็นชิ้นบาง (Section methods) วิธีนี้สามารถศึกษารายละเอียด โครงสร้างของเซลล์จากเนื้อเยื่อที่ตัดเป็นชิ้นบางและย้อมสี ซึ่งสามารถทำได้หลายแบบ ได้แก่ 5.2.1 การตัดเนื้อเยื่อด้วยมือ (Free-hand section) เหมาะกับการศึกษาเนื้อเยื่อพืชโดยใช้ ตัวอย่างสด เนื่องจากผนังเซลล์มีความแข็งแรงและจับด้วยมือได้ และกระบวนการเตรียมตัวอย่างไม่ซับซ้อน 5.2.2 การใช้เครื่องไมโครโตม วิธีนี้จะต้องทำให้เนื้อเยื่อแข็งตัวโดยใช้ความเย็นหรือการฝังใน พาราฟิน แล้วตัดเนื้อเยื่อที่ฝังในพาราฟินให้มีความหนาตามที่ต้องการในหน่วยไมโครเมตร ตัวอย่างที่นำมาตัดมักเป็น ชิ้นหรือแท่ง เช่น ก้านใบ ลำต้นพืช ท่อทางเดินอาหาร ตัวอ่อนสัตว์ รังไข่ ฯลฯ โดยแนวในการตัดตัวอย่างที่นิยม ได้แก่ 5.2.2.1 การตัดตามขวาง (Transverse หรือ Cross section) สัญลักษณ์ที่ใช้คือ T.S. หรือ C.S. หรือ X.S. เป็นการตัดตั้งฉากกับแนวยาวของตัวอย่าง 5.2.2.2 การตัดตามยาว (Longitudinal หรือ Sagittal section) สัญลักษณ์ที่ใช้คือ L.S. หรือ S.L.S. เป็นการตัดในแนวตั้งฉากกับความกว้างของตัวอย่าง หรือการตัดแนวขนาน (Horizontal หรือ Frontal longitudinal section) เป็นการตัดในแนวขนานกับผิวด้านหลังของตัวอย่าง หลักการเบื้องต้นในการเตรียมสไลด์ถาวร เซลล์และเนื้อเยื่อไม่สามารถสังเกตได้ด้วยตาเปล่า โดยเฉพาะการศึกษาออร์แกเนลล์ ภายในเซลล์ กล้อง จุลทรรศน์จึงมีบทบาทในการช่วยทำให้มองเห็นโครงสร้างภายในชัดเจนขึ้น แต่กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ มีกำลังขยายหรือขีดความสามารถจำกัด ดังนั้นวิธีการเตรียมตัวอย่างสำหรับการศึกษาจึงเป็นการเตรียมตัวอย่างแบบ สไลด์ถาวร โดยผ่านกระบวนการดังต่อไปนี้ 1. การทำให้หมดความรู้สึก การทำให้หมดความรู้สึก (Anesthetizing) ประกอบด้วย 2 ขั้นตอนคือ การฆ่าและการรักษาสภาพ เซลล์ ซึ่งเป็นการหยุดการทำงานของเอนไซม์ในเซลล์ นอกจากนี้ยังเป็นการรักษารูปร่างและองค์ประกอบภายในเซลล์ ให้ใกล้เคียงกับในธรรมชาติ สารที่นิยมใช้ได้แก่ แมกนีเซียมซัลเฟต (Magnesium sulfate) แมกนีเซียมคลอไรด์

34 (Magnesium chloride) เมนทอล (Mental) คลอโรฟอร์ม (Chloroform) อีเทอร์ (Ether) และแอลกอฮอล์ (Alcohol) ฯลฯ 2. การคงสภาพ การคงสภาพ (Fixation) เป็นการรักษาสภาพเนื้อเยื่อหรือสารในเซลล์ด้วยน้ำยาคงสภาพให้อยู่ใน สภาพใกล้เคียงกับขณะที่ยังมีชีวิตอยู่ให้มากที่สุด ถ้าเป็นสัตว์ขนาดเล็กกระบวนการฆ่าและการคงสภาพจะดำเนินไป พร้อมกัน แต่ถ้าเป็นสัตว์ขนาดใหญ่ต้องฆ่าให้สัตว์ตายก่อน แล้วตัดแบ่งอวัยวะและเนื้อเยื่อเป็นชิ้นขนาดเล็กไม่ควร หนาเกิน 1 ลูกบาศก์เซนติเมตร 2.1 วิธีการคงสภาพนิยมใช้วิธีการจุ่มหรือแช่เนื้อเยื่อลงในน้ำยาคงสภาพ โดยใช้ปริมาตรน้ำยาคง สภาพมากกว่าปริมาตรเนื้อเยื่อ 30-50 เท่า 2.2 น้ำยาคงสภาพที่ดีต้องไม่ทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ ช่วยในการติดสี ทำให้โพรโทพลาสซึม (Protoplasm) ของเซลล์อยู่ในสภาพเป็นของแข็งและมีความคงตัว น้ำยาคงสภาพมีหลายชนิดแบ่งได้ 5 กลุ่ม ดังนี้ 2.2.1 กลุ่มอัลดีไฮด์ (Aldehyde) เนื้อเยื่อที่ทำให้คงสภาพจะเกิดการเปลี่ยนแปลงกับโปรตีน โดยเกิดปฏิกิริยาของไลซีน ตัวอย่างสารในกลุ่มอัลดีไฮด์ ได้แก่ ฟอร์มาดีไฮด์ (Formadehyde) ฟอร์มาลิน (Formalin) และกลูตารอลดีไฮด์ (Glutaraldehyde) ฯลฯ 2.2.2 กลุ่มเมอร์คิวริกคลอไรด์ (Mercuric chloride) สารในกลุ่มนี้สามารถแทรกซึมเข้าสู่ เนื้อเยื่อช้าและเป็นสาเหตุให้เนื้อเยื่อแข็งกระด้าง แต่สามารถรักษาสภาพของนิวเคลียส (Nucleus) ได้ดี ตัวอย่างสาร ในกลุ่มเมอร์คิวริกคลอไรด์ ได้แก่ น้ำยาคงสภาพแซงเกอร์ (Zenker’s fluid) และน้ำยาบูแอง (Bouin’s fluid) ฯลฯ 2.2.3 กลุ่มแอลกอฮอล์ สารกลุ่มนี้มีผลทำให้โปรตีนเสียสภาพ เนื้อเยื่อเปราะและแข็งกระด้าง แต่ส่งผลดีต่อไซโทพลาสซึม (Cytoplasm) เพราะเกิดการแทรกซึมได้ดี ตัวอย่างสารในกลุ่มนี้ ได้แก่ เมทิลแอลกอฮอล์ (Methyl alcohol) และเอทิลแอลกอฮอล์ (Ethyl alcohol) 2.2.4 กลุ่มสารที่มีคุณสมบัติเป็นสารออกซิไดซ์ โดยจะทำให้เกิดการไขว้กันของโปรตีน (Crosslink protein) และเกิดการเสียสภาพของโปรตีน ตัวอย่างได้แก่ โพแทสเซียม เปอร์แมงกาเนต (Potassium permanganate) โพแทสเซียมไดโครเมต (Potassium dichromate) และออสเมียมเตตรอกไซด์ (Osmium tetroxide) ฯลฯ 2.2.5 สารกลุ่มพิคริก (Picric) ส่งผลดีต่อนิวเคลียสแต่ไม่ทำให้เนื้อเยื่อแข็งกระด้าง แต่สารกลุ่มนี้ เป็นสารอันตราย ตัวอย่างได้แก่ กรดพิคริก (Picric acid) และน้ำยาบูแอง ฯลฯ 3. การล้าง การล้าง (Washing) เป็นการล้างสารคงสภาพออกจากเนื้อเยื่อ โดยต้องพิจารณาจากสารที่เป็น ส่วนประกอบซึ่งตัวทำละลายของสารคงสภาพนั้น เช่น สารคงสภาพละลายอยู่ในเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 ต้อง ล้างด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 และถ้าคงสภาพด้วยฟอร์มาลินให้ล้างออกด้วยน้ำ ฯลฯ 4. การย้อมสี การย้อมสี (Staining) เป็นกระบวนการหลังการคงสภาพเซลล์และการล้างสารคงสภาพ ซึ่งอาจทำให้ เนื้อเยื่อโปร่งแสงเกินไป ยังไม่เหมาะสมกับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ จึงต้องย้อมด้วยสีย้อมเพื่อให้เห็นความ แตกต่างขององค์ประกอบภายใน การเลือกใช้สีขึ้นกับโครงสร้างที่ใช้ในการศึกษา และคุณสมบัติเฉพาะของสี สีย้อมที่ นิยมใช้ เช่น 4.1 สีย้อมเนื้อเยื่อสัตว์ ได้แก่ ฮีมาทอกไซลิน (Hematoxylin) อิโอซิน (Eosin) และคาร์มีน (Carmine) 4.2 สีย้อมโครโมโซม ได้แก่ อะซิโตคาร์มีน (Aceto-carmine) และอะซิโตออร์ซีน (Aceto-orecein) 4.3 สีย้อมเนื้อเยื่อพืช ได้แก่ ซาฟรานิน (Safranin) และฟาสต์กรีน (Fast green) 5. การดึงน้ำออก การดึงน้ำออก (Dehydration) กระบวนการกำจัดสารตัวทำละลายภายในเซลล์ให้เหมาะสมกับตัวทำ ละลายสีย้อม ได้แก่

35 5.1 สีย้อมละลายในน้ำ ต้องดึงน้ำออกจากเซลล์ด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้นใกล้เคียงกับน้ำ เช่น เอทิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 30 หรือ 50 ตามความเหมาะสม แต่ถ้าสิ่งมีชีวิตมีขนาดเล็กมากอาจใช้ ความเข้มข้นร้อยละ 15 โดยไม่ให้ระดับความเข้มข้นต่างกันเกินร้อยละ 20 ฯลฯ 5.2 สีย้อมละลายในเอทิลแอลกอฮอล์ ต้องดึงน้ำออกจากเซลล์ด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้น ใกล้เคียงกัน เช่น เอทิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 70 หรือ 80 ตามความเหมาะสม 6. การทำให้ใส การทำให้ใส (Clearing) กระบวนการดึงแอลกอฮอล์ออกจากเนื้อเยื่อและทำให้ตัวอย่างเนื้อเยื่อ โปร่งใสมากขึ้น สารที่นิยมใช้ได้แก่ 6.1 ไซลีน (Xylene หรือ X-free) เหมาะสำหรับเนื้อเยื่อสัตว์ 6.2 เทอร์เทียรีบิวทิลแอลกอฮอล์ หรือ บิวทิลแอลกอฮอล์ตติยภูมิ (Tertiary butyl alcohol) เหมาะ สำหรับเนื้อเยื่อพืช 7. การผนึกสไลด์ การผนึกสไลด์ (Mounting) การทำให้สไลด์ที่มีชิ้นตัวอย่างติดกับแผ่นกระจกปิดด้วยสารตัวกลางที่ เหมาะสม 7.1 วิธีการผนึกสไลด์ ควรจัดวางตัวอย่างให้อยู่กึ่งกลางสไลด์และเยื้องไปด้านขวามือ แล้ววางแผ่น กระจกปิดสไลด์ให้ทับตรงกึ่งกลางบนตำแหน่งที่มีตัวอย่าง ไม่ให้เกิดฟองอากาศขึ้นใต้แผ่นกระจก ควรใช้แผ่นกระจก ปิดขนาดเหมาะสมกับตัวอย่าง และไม่ควรให้สารผนึกสไลด์ล้นออกมาภายนอกแผ่นกระจกปิด โดยสามารถปฏิบัติ ตามขั้นตอนดังนี้ 7.1.1 หยดสารผนึกสไลด์ 1-2 หยด บนขอบด้านใดด้านหนึ่งของตัวอย่าง 7.1.2 จับแผ่นกระจกปิดวางเอียง 45-60 องศา ให้ขอบด้านล่างแตะที่สารผนึกสไลด์ 7.1.3 ใช้เข็มเขี่ยช่วยคานแผ่นสไลด์ และลดระดับองศาลงจนกระทั่งแผ่นกระจกปิดแนบกับแผ่น สไลด์ 7.2 สารผนึกสไลด์ เป็นน้ำยาทางเคมีที่ใช้ผนึกแผ่นสไลด์และกระจกปิดให้เชื่อมติดกัน อาจได้มาจาก ธรรมชาติหรือการสังเคราะห์ สารชนิดนี้มีค่าดัชนีหักเหแสงระหว่าง 1.48-1.50 ไม่มีสีหรือสีอ่อน และควรละลายใน สารทำให้ใสได้ดี สารผนึกสไลด์มีหลายชนิด ได้แก่ 7.2.1 คานาดาบัลซัม (Canada balsam) สารที่ได้จากเปลือกของพืชกลุ่มสนโบราณ มีสีเหลือง กลิ่นหอมคล้ายยางสน ราคาถูก แต่มีข้อเสียคือแห้งช้า เกิดฟองอากาศได้ง่าย และเมื่อเก็บไว้นานมักจะเปลี่ยนเป็นสี เหลือง 7.2.2 เปอร์เมาท์ (Permount) เป็นสารผนึกสไลด์สังเคราะห์ที่ไม่มีสี เมื่อเก็บไว้เป็นเวลานานจะ ไม่เปลี่ยนสี แห้งค่อนข้างช้า เกิดฟองอากาศน้อย และยังทำหน้าที่เป็นตัวช่วยให้สารในตัวอย่างใส นิยมใช้ใน ห้องปฏิบัติการ 7.2.3 ดีพีเอ็กซ์ (DePeX) สารผนึกสไลด์สังเคราะห์ที่มีคุณภาพดี ใสไม่มีสี แห้งเร็ว มีฟองอากาศ แทรกน้อย และเก็บไว้นานแล้วสารจะไม่เปลี่ยนสี แต่ราคาค่อนข้างสูง จึงนิยมใช้ในงานวิจัย การถ่ายภาพจากกล้องจุลทรรศน์ ภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์เป็นสิ่งที่สำคัญในการศึกษาตัวอย่างทางชีววิทยา การมองเห็นภาพภายใต้ กล้องจุลทรรศน์จะช่วยให้สายตามองเห็นรายละเอียดได้มากกว่าปกติและสามารถใช้เปรียบเทียบตัวอย่างได้ ในการ ทำงานวิจัยที่มีการศึกษาและทดลองนั้น ภาพถ่ายถือเป็นข้อมูลยืนยันที่น่าเชื่อถือเพราะสามารถแสดงข้อมูลเซลล์ที่ไม่ สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า

36 1. อุปกรณ์ที่สำคัญในการบันทึกภาพจากกล้องจุลทรรศน์ อุปกรณ์ที่สำคัญประกอบด้วย 2 ส่วน ดังต่อไปนี้ 1.1 กล้องจุลทรรศน์ สามารถใช้กล้องจุลทรรศน์ทุกประเภทตามวัตถุประสงค์ในการใช้งานหรือการศึกษา ตัวอย่าง การถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์ต้องใช้กล้องแบบ 3 กระบอกตา เพื่อใช้กระบอกตาที่สามเป็นแกนติดตั้ง กล้องถ่ายภาพ 1.2 กล้องถ่ายภาพ เป็นกล้องบันทึกภาพที่ใช้กันโดยทั่วไป หรือเป็นกล้องที่ผลิตมาให้ทำงานคู่กับกล้อง จุลทรรศน์แต่ละรุ่นเท่านั้น มีทั้งกล้องถ่ายภาพแบบฟิล์มและกล้องถ่ายภาพแบบดิจิตอล กล้องถ่ายภาพมีส่วนประกอบ ที่สำคัญดังนี้ 1.2.1 ตัวกล้อง (Body) เป็นกล่องทึบ แสงไม่สามารถส่องผ่านได้ เป็นโครงสร้างหลักของกล้อง ถ่ายภาพ 1.2.2 เลนส์ (Lens) เป็นเลนส์นูนใช้ในการรวมแสงที่สะท้อนจากวัตถุ แล้วส่งไปตกกระทบยัง อุปกรณ์รวมรวบข้อมูลและประมวลผลเป็นภาพ 1.2.3 ม่านปรับแสง (Iris diaphragm) อุปกรณ์ที่ใช้ปรับปริมาณแสงที่เข้าสู่ตัวกล้อง โดยอาศัย ข้อมูลที่ได้จากการตั้งค่าความเร็วของเวลาในการเปิดปิดตามต้องการ 1.2.4 ซัตเตอร์ (Shutter) ปุ่มสำหรับกดให้ม่านปรับแสงเปิด-ปิด เพื่อให้แสงเดินทางจากวัตถุ ตัวอย่างเข้าสู่ตัวกล้อง และทำให้เกิดภาพถ่ายขณะศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ หมายเหตุ กล้องถ่ายภาพในปัจจุบันเป็นเครื่องมือที่มีโปรแกรมใช้งานสำเร็จรูป สามารถตรวจสอบ สไลด์ตัวอย่างและบันทึกภาพผ่านคอมพิวเตอร์ ในห้องปฏิบัติการใช้โปรแกรมสำเร็จรูปชื่อทางการค้าคือ อิมเมจ เฟรม เวิร์ค (Image Frame work program) ดังภาพที่ 3.1 และ 3.2 ภาพที่ 3.1 โปรแกรมสำเร็จรูปอิมเมจ เฟรม เวิร์ค สำหรับถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์

37 ภาพที่ 3.2 หน้าต่างโปรแกรมสำเร็จรูปอิมเมจ เฟรม เวิร์ค 2. การถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์ด้วยชุดถ่ายภาพ 2.1 นำแผ่นสไลด์ตัวอย่างไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่กำลังขยายที่ต้องการจะถ่ายภาพ ปรับภาพให้ ชัดแล้วดึงปุ่ม BINO PHOTO ถ้าดึงแกนเหล็กออก (Photo) ภาพจะมาแสดงที่หน้าจอคอมพิวเตอร์ ถ้าดันปุ่มเหล็กเข้า หากล้อง (BINO) จะเห็นภาพเฉพาะในกล้องจุลทรรศน์ 2.2 เลือกบริเวณที่จะถ่ายภาพ แล้วกดปุ่ม Grab still image 2.3 จากนั้นกดเพิ่มสเกลที่บริเวณแถบเมนูที่เป็นภาพหัวเลนส์กำลังขยายต่างๆ ตัวเลขสเกลจะ ขึ้นมาบนรูปตามกำลังขยายที่เลือก *** เลือกสเกลให้ตรงกับกำลังขยายเลนส์ใกล้วัตถุ *** 2.4 กดแถบเมนูปุ่ม Image แล้วกดที่ Burn Scale Bar to Image เพื่อให้สเกลอยู่บนรูปภาพที่ ต้องการ 2.5 จากนั้นจะมีกล่องข้อความถามว่าต้องการให้บันทึกสเกลบนภาพ ใช่หรือไม่ ให้กด ใช่ (YES) 2.6 ทำการบันทึกภาพ โดยกดปุ่ม File แล้วไปที่ Save Image as ใน Folder ที่ตั้งไว้ที่ Desktop ของคอมพิวเตอร์ 3. การวัดขนาดของวัตถุภายใต้กล้องจุลทรรศน์โดยใช้ไมโครมิเตอร์ ไมโครมิเตอร์เป็นเครื่องมือที่ใช้วัดขนาดวัตถุที่มีขนาดเล็กมาก เช่น เซลล์พารามีเซียม เซลล์เม็ดเลือด หน่วยที่วัดเป็นไมโครเมตร

38 3.1 ไมโครมิเตอร์ประกอบด้วย 2 ส่วนคือ 3.1.1 ออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ (Ocular micrometer หรือ Eye piece micrometer) เป็นแผ่น แก้ววงกลมขนาดเล็กที่มีขีดแบ่งไว้อย่างสม่ำเสมอ ตลอดความยาวแบ่งไว้ 100 ช่อง แต่สเกลไม่มีหน่วยวัด ใส่ลงใน กระบอกเลนส์ใกล้ตาของกล้องจุลทรรศน์ 3.1.2 สเตจไมโครมิเตอร์ (Stage micrometer) ลักษณะเหมือนสไลด์ทั่วไป บริเวณกลางแผ่น สไลด์มีสเกลขนาด 1 มิลลิเมตร แบ่งเป็น 100 ช่อง แต่ละช่องมีความกว้างเท่ากับ 0.01 มิลลิเมตร 3.2 วิธีการคำนวณหาค่า 1 ช่องของออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ เพื่อคำนวณหาขนาดที่แท้จริงของวัตถุ เนื่องจากออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ไม่มีหน่วยวัดมีวิธีปฏิบัติดังนี้ 3.2.1 วางสเตจไมโครมิเตอร์บนแท่นวางวัตถุของกล้องจุลทรรศน์ โดยใช้กำลังขยายต่ำสุด และ ปรับโฟกัสให้เห็นภาพชัดเจน 3.2.2 ใส่ออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ในกระบอกเลนส์ใกล้ตาของกล้องจุลทรรศน์ 3.2.3 เริ่มเทียบมาตรฐานที่กำลังขยาย 4X โดยหมุนออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์และเลื่อนสเตจ ไมโครมิเตอร์ให้ภาพทั้งสองวางขนานกัน และให้ขีดทับซ้อนกันเล็กน้อย โดยให้ขีดแรกของทั้ง 2 อันทับกันเป็นแนว เส้นตรง 3.2.4 นับจำนวนช่องบนไมโครมิเตอร์ทั้งสอง จากแนวเส้นตรงแรกไปเรื่อยจนถึงแนวเส้นตรง เส้นที่ 2 ที่ไมโครมิเตอร์ทั้งสองทับกันเป็นแนวเส้นตรงอีกครั้ง 3.2.5 เมื่อคำนวนขนาด 1 ช่อง ออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์แล้วสามารถวัดขนาดของวัตถุจริงที่เรา มองผ่านออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ได้และเปลี่ยนกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุทุกกำลังขยายสำหรับคำนวณค่า 3.3 ตัวอย่างการคำนวณหาค่ามาตรฐานออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ กำหนดให้ที่กำลังขยายของเลนส์ใกล้ วัตถุ 10X สามารถนับช่องระหว่าง 2 เส้นตรงได้ 10 ช่องของออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์เท่ากับ 7 ช่องของสเตจ ไมโครมิเตอร์สามารถคำนวณได้ดังนี้ 1 ช่องของออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์ = 7X1 = 0.07 ช่องสเตจไมโครมิเตอร์ 100 1 ช่องของสเตจไมโครมิเตอร์ = 10 ไมโครเมตร 0.07 ช่องของสเตจไมโครมิเตอร์ = 10X0.07 1 = 0.7 ไมโครเมตร ดังนั้น 1 ช่องของออคิวลาร์ไมโครมิเตอร์มีค่าเท่ากับ 0.7 ไมโครเมตร

การเตรียมสไลด์ถาวรเนื้อเยื่อสัตว์ สิ่งมีชีวิตหรือตัวอย่างที่มีขนาดเล็กมาก อาจเป็นเซลล์เดี่ยว หรือเป็นเนื้อเยื่อที่มีความหนาของชั้นเนื้อเยื่อ น้อยไม่เหมาะที่จะนำไปเตรียมตัวอย่างด้วยการผ่านวิธีที่ซับซ้อน เพราะอาจทำให้เซลล์มีความผิดปกติหรือถูกทำลาย ได้ดังนั้นจึงต้องเก็บตัวอย่างทั้งตัวหรือเนื้อเยื่อทั้งชิ้นมาเตรียมเป็นสไลด์โดยไม่ต้องตัดเนื้อเยื่อโดยใช้เทคนิคต่างๆ ดังต่อไปนี้ เทคนิคการสเมียร์ วิธีนี้นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย โดยนำตัวอย่างกระจายลงบนแผ่นสไลด์ให้บาง เรียกว่า การสเมียร์ (Smearing) เหมาะสำหรับการเตรียมตัวอย่างที่เป็นของเหลวหรือกึ่งของเหลว (พงศ์พันธุ์ กองทอง. 2538: 17-19) ซึ่งประกอบด้วยขั้นตอนต่างๆ ดังนี้ 1. การเตรียมตัวอย่าง ตัวอย่างที่นิยมนำมาใช้ในเทคนิคนี้ ได้แก่ เลือด ของเหลวภายในช่องตัว น้ำไขสันหลัง น้ำเหลือง ปรสิตที่อยู่ในลำไส้ และอสุจิ ฯลฯ หรืออาจเป็นตัวอย่างที่อ่อนนุ่ม เช่น อัณฑะ และไขกระดูก ฯลฯ 2. การเตรียมสไลด์ วิธีการทำให้ตัวอย่างกระจาย และไม่ให้เกิดการซ้อนทับสามารถทำได้ 2 วิธี (Weesner. 1965: 52) ตามความแตกต่างของอุปกรณ์ที่ใช้ดังนี้ 2.1 วิธีใช้สไลด์ (Slide method หรือ Wedge technique) ใช้เลือดหยดลงบนแผ่นสไลด์อันที่หนึ่ง และใช้สไลด์อันที่สองวางแตะที่ขอบหยดเลือด แล้วจึงไถสไลด์ไปข้างหน้า 2.2 วิธีใช้กระจกปิดสไลด์ (Coverglass method) โดยหยดเลือดลงบนกระจกปิดสไลด์อันที่หนึ่ง และใช้กระจกปิดสไลด์อันที่สองวางทับแผ่นแรก แล้วดึงแยกออกจากกันตามแนวขนาน 3. การย้อมสี สารที่ช่วยทำให้โครงสร้างของเซลล์เกิดความแตกต่างกัน ตัวอย่างแต่ละชนิดเหมาะสมกับสีย้อมที่ แตกต่างกัน เช่น เลือดนิยมใช้สีไรท์ (Wright’s stain) สีจิมซา (Giemsa’s stain) หรือสีไรท์-จิมซา (WrightGiemsa’s stain) ฯลฯ ส่วนอสุจินิยมย้อมด้วยสีอีโอซิน (Eosin) สีนิโกรซิน (Nigrosin) และสีอะนีลีน บลู (Aniline blue) ฯลฯ การสเมียร์เลือด เทคนิคการทำให้เซลล์เม็ดเลือดกระจายอย่างสม่ำเสมอ และบางเพียงชั้นเดียว (Monolayer) บนแผ่น กระจก โดยจะต้องรักษาสภาพของเซลล์ให้เหมือนเดิมมากที่สุด เรียกว่า การสเมียร์เลือด (Blood smear) การศึกษา แผ่นฟิล์มเลือดทำให้สามารถเปรียบเทียบความแตกต่างของจำนวน ขนาด และรูปร่างของเม็ดเลือดได้ 1. การทำความสะอาดสไลด์ สไลด์ที่ใช้ต้องเรียบไม่มีรอยขีดข่วน และไม่มีคราบสกปรก หรือคราบน้ำมันที่ผิวสไลด์ การทำความ สะอาดทำได้หลายวิธี เช่น การล้างด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 95 การล้างด้วยน้ำยาล้างแก้ว (Cleaning solution) หรือล้างด้วยแอซิดแอลกอฮอล์ร้อยละ 1 (1% Acid alcohol) จากนั้นนำมาล้างน้ำ ตามด้วย เอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 95 อีกครั้ง เช็ดด้วยผ้าสะอาดปราศจากไขมันและขนผ้า แล้วนำไปเก็บในภาชนะที่แห้งและ สะอาด 2. การเจาะและเก็บเลือด ตำแหน่งการเก็บตัวอย่างเลือดที่เหมาะสม นอกจากจะไม่ทำให้ร่างกายได้รับอันตรายแล้ว ยังทำให้ได้ ปริมาณเลือดตามที่ต้องการ สามารถเก็บเลือดได้หลายแบบ ได้แก่ การเจาะจากผิวหนัง (Skin puncture) เหมาะ สำหรับการตรวจที่ต้องการเลือดในปริมาณน้อย การใช้ใบมีด หรือแลนเซต (Lancet) เจาะที่ตำแหน่งปลายนิ้ว ติ่งหู

40 หรือส้นเท้า และการเจาะจากหลอดเลือดดำ (Venue puncture) ทำให้ได้เลือดในปริมาณมาก โดยใช้เข็มเจาะที่ ตำแหน่งข้อพับของข้อศอก ข้อเท้า หรือหลังมือ เก็บในหลอดที่มีสารป้องกันการแข็งตัวของเลือด แต่ห้ามเจาะจาก หลอดเลือดแดง (Arterial puncture) เพราะอาจทำให้เกิดอันตรายได้ 3. สารป้องกันการแข็งตัวของเลือด สารป้องกันการแข็งตัวของเลือด (Anticoagulants) จะจับกับแคลเซียมในเลือดทำให้ไม่สามารถ เปลี่ยนประจุไฟฟ้าเป็นสารที่มีประจุได้ นอกจากนี้ยังทำให้คุณสมบัติของเกล็ดเลือด (Platlets) เปลี่ยนแปลงโดยไม่ สามารถเกาะติดกับพื้นผิว (Adhesive property) และการจับกลุ่ม (Agrregation property) ได้ สารป้องกันการ แข็งตัวมีหลายชนิด ได้แก่ ออกซาเลต (Oxalate) กรดเอทิลีนไดอะมีนเทตราแอซีติก (Ethylene diamine tetraacetic acid) หรืออีดีทีเอ (EDTA) สารละลายซิเทรด (Citrate solution) ฟลูออไรด์ (Fluoride) และเฮพพาริน (Heparin) ฯลฯ 4. การย้อมสีสไลด์เลือด การย้อมเซลล์เม็ดเลือดด้วยสีย้อมเพื่อศึกษารูปร่างและลักษณะ สีที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย ได้แก่ สีไรท์ (Wright’s stain) สีจิมซา (Giemsa’s stain) หรือสีไรท์-จิมซา (Wright-Giemsa’s stain) ฯลฯ ซึ่งต้องใช้ ร่วมกับสารละลายบัฟเฟอร์ เนื่องจากสีไรท์ประกอบด้วยสีประเภทกรดและด่าง ดังนั้นการติดสีจึงขึ้นกับค่าความเป็น กรด-ด่างด้วย ถ้าเป็นกรดมากจะติดสีแดงชมพูของอีโอซินมาก และถ้าเป็นเบสมากจะติดสีน้ำเงินของเมทิลีนบลูมาก สารละลายบัฟเฟอร์มีหลายชนิดเลือกใช้ได้ตามความต้องการ ได้แก่ ซอเรนเซนบัฟเฟอร์ (Sorensen’s buffer pH 6.7) และสารละลายบัฟเฟอร์ (pH 6.4 หรือ pH 6.7) ฯลฯ ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรโดยวิธีการสเมียร์เลือด เลือดเป็นเนื้อเยื่อเกี่ยวพันชนิดหนึ่งที่มีสารระหว่างเซลล์เป็นของเหลว ประกอบด้วยส่วนที่เป็นของแข็ง ได้แก่ เซลล์เม็ดเลือดแดง (Red blood cell หรือ Erythrocyte) เซลล์เม็ดเลือดขาว (White blood cell หรือ Leucocyte) และเกล็ดเลือด (Blood platelet) และส่วนที่เป็นของเหลวเรียกว่า พลาสมา (Plasma) การตรวจสอบ องค์ประกอบส่วนที่เป็นของแข็งในเลือดมีความสำคัญ เพราะรูปร่าง จำนวน และสัดส่วนของเซลล์เป็นสิ่งที่แสดงถึง การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพของร่างกายได้ ถึงแม้ว่าลักษณะบางประการสามารถสังเกตได้จากเลือดสด แต่มีอีก หลายประการที่ไม่สามารถตรวจสอบได้ จำเป็นต้องมีการรักษาสภาพ และย้อมสีเลือดจึงจะสามารถเห็นลักษณะ ดังกล่าวได้ (คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยมหิดล. 2553) ปฏิบัติการนี้นักศึกษาจะได้ฝึกการเจาะเก็บเลือด การเตรียมแผ่นฟิล์มเลือด การย้อมสี และการ ตรวจสอบเซลล์เม็ดเลือดภายใต้กล้องจุลทรรศน์ 1.1 วัตถุประสงค์ นักศึกษามีความสามารถดังนี้ 1.1.1 เตรียมสีไรท์และสารละลายบัฟเฟอร์ได้ 1.1.2 ย้อมสีแผ่นฟิล์มเลือดได้ 1.2 วัสดุ–อุปกรณ์บทปฏิบัติการนี้มีวัสดุและอุปกรณ์ดังนี้ 1.2.1 สารเคมี ได้แก่ 1.2.1.1 สีไรท์ (Wright’s stain) สามารถเตรียมได้ดังนี้ - ผงสีไรท์ (Wright’s stain powder) 0.1 กรัม - เมทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์ 60 มิลลิลิตร โดยละลายผงสีไรท์ 0.1 กรัม ด้วยโกร่งบดที่เติมเมทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์ปริมาตร 60 มิลลิลิตร แล้วเก็บในขวดสีชาที่มีฝาปิดสนิทประมาณ 1-2 เดือน ก่อนการใช้งาน 1.2.1.2 สารละลายบัฟเฟอร์ (pH 6.7) ประกอบด้วยสาร - แอนไฮดรัสไดเบสิกโซเดียมฟอสเฟต 5.13 กรัม