เทคนิคทางชีววิทยาและการจัดกิจกรรมทางวิทยาศาสตร์

41 (Sodium phosphate dibasic, anhydrous, Na2HPO4) - โมโนเบสิกโปแทสเซียมฟอตเฟส 4.12 กรัม (Potassium phosphate monobasic, KH2PO4) โดยละลายในน้ำกลั่น 1,000 มิลลิลิตร 1.2.2 อุปกรณ์อื่นๆ ได้แก่ โกร่งบดสาร ที่วางหลอดทดลอง หลอดหยดสาร สไลด์ กระจกปิด สไลด์ สารผนึกสไลด์ และแผ่นฉลากสำหรับติดรายละเอียด 1.2.3 ตัวอย่าง ได้แก่ เลือดมนุษย์ 1.3 วิธีดำเนินการ บทปฏิบัติการนี้มีขั้นตอนต่างๆ ดังนี้ 1.3.1 การเตรียมสเปรดเดอร์ (Spreader) คัดเลือกสไลด์แผ่นใหม่จากกล่องที่มีขอบเรียบ ไม่มี รอยแตก เพื่อใช้สำหรับเกลี่ยเลือด 1.3.2 การทำความสะอาดสไลด์ล้างสไลด์และสเปรดเดอร์ด้วยน้ำยาล้างจานเข้มข้น เสร็จแล้ว ล้างน้ำประปาและน้ำกลั่นให้สะอาด จับแผ่นสไลด์ที่ขอบด้วยนิ้วมือ แล้วกำจัดไขมันที่ติดผิวหน้าสไลด์ด้วย เอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 95 เช็ดให้แห้งและวางสไลด์ในภาชนะสะอาด 1.3.3 การเตรียมตัวอย่างเลือด 1.3.3.1 ทำความสะอาดปลายนิ้วกลางด้วยเอทิลแอลกอฮล์ร้อยละ 70 แล้วปล่อยให้ แอลกอฮอล์ระเหยออกไปจนแห้งสนิท 1.3.3.2 ใช้ใบมีดสำหรับเจาะเลือด (Blood lancet) หรือเข็มฉีดยา (Syringe) เจาะ เลือดจากผิวหนังที่ตำแหน่งปลายนิ้ว 1.3.3.3 ปล่อยให้เลือดหยดแรกไหลทิ้งไป แล้วใช้หยดเลือดต่อไปหยดลงปลายด้านใด ด้านหนึ่งของแผ่นสไลด์ที่ทำความสะอาดแล้ว โดยไม่ให้ผิวหนังของปลายนิ้วสัมผัสกับสไลด์ เพราะจะทำให้มีไขมันติด มาด้วย (ภาพที่ 3.3) ภาพที่ 3.3 การเตรียมแผ่นฟิล์มเลือด ก. หยดเลือดบนสไลด์บริเวณปลายด้านหนึ่ง ข. นำแผ่นสเปรดเดอร์ (Spreader) แตะคร่อมหยดเลือด ค. เลื่อนแผ่นสเปรดเดอร์ไปทิศทางตรงข้าม 1.3.4 การเตรียมแผ่นฟิล์มเลือด 1.3.4.1 วางสไลด์แผ่นที่มีเลือดลงบนโต๊ะ หรืออาจจะถือไว้ด้วยมือโดยให้นิ้วหัวแม่มือ และนิ้วชี้จับอยู่ที่ขอบสไลด์ตรงปลายที่ไม่มีเลือด ใช้ปลายนิ้วก้อยดันใต้แผ่นสไลด์ด้านที่มีเลือดไว้(ภาพที่ 3.4 ก–ค) 1.3.4.2 ใช้สเปรดเดอร์แตะที่หยดเลือดทำมุมประมาณ 30-40 องศากับสไลด์แผ่นแรก แล้วรอให้เลือดแผ่กระจายจนเต็มด้านกว้างของสไลด์แผ่นที่สอง ก ข ค หยดเลือด

42 1.3.4.3 ไถสไลด์ไปข้างหน้าด้วยแรงสม่ำเสมอ ขั้นตอนนี้ถ้าใช้หยดเลือดขนาดพอเหมาะ ปลายของแผ่นฟิล์มเลือดจะสิ้นสุดลงประมาณปลายแผ่นสไลด์พอดี 1.3.4.4 วางพักไว้ให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง โดยไม่ต้องใช้ความร้อน แล้วจึงนำไปย้อมสี ต่อไป 1.3.5 การย้อมสีฟิล์มเลือด 1.3.5.1 วางสไลด์พาดลงบนที่ใส่หลอดทดลอง (Test tube rack) โดยให้ส่วนที่มีฟิล์ม เลือดหงายขึ้น 1.3.5.2 หยดสีไรท์ลงบนแผ่นฟิล์มเลือดจนท่วม เพื่อป้องกันการระเหยแห้งและเกิด ตะกอนขึ้น รอให้เซลล์เม็ดเลือดถูกทำให้คงสภาพด้วยเมทิลแอลกอฮอล์ที่มีอยู่ในสีไรท์ประมาณ 2 นาที (ภาพที่ 3.4 ง) 1.3.5.3 หยดสารละลายบัฟเฟอร์ (pH 6.7) ลงไปในปริมาณที่เท่ากันกับสีไรท์ แล้วใช้ ลูกยางเป่าลมเบาๆ เพื่อให้บัฟเฟอร์และสีย้อมผสมกันประมาณ 1-2 นาที หรือจนกระทั่งสังเกตเห็นฝ้าสีเขียวและ ขอบฝ้าเป็นสีแดงอ่อนลอยอยู่ที่ผิวหน้า (ภาพที่ 3.4 จ และ ฉ) 1.3.5.4 ล้างด้วยน้ำกลั่น หรือน้ำประปา โดยปล่อยให้น้ำไหลจากปลายด้านหนึ่งของ แผ่นสไลด์ไปยังปลายอีกด้านหนึ่งจนกระทั่งสีหมด ซึ่งสังเกตได้จากสีย้อมแผ่นฟิล์มที่ล้างจะจางไม่มีสีปนอยู่ หรืออาจ เห็นเป็นฟิล์มสีชมพู(ภาพที่ 3.4 ช และ ซ) 1.3.5.5 เทน้ำที่ติดอยู่ออกให้หมด ใช้กระดาษชำระเช็ดสไลด์ด้านที่ไม่มีฟิล์มเลือดให้ สะอาดในขณะที่สไลด์ยังเปียกอยู่ แล้วปล่อยสไลด์ให้แห้งในอากาศ 1.3.5.6 เมื่อแห้งสนิทดีแล้วจึงหยดสารผนึกสไลด์ลงไปบนฟิล์มเลือดหนึ่งหยดและปิด ด้วยกระจกปิดสไลด์ ดังภาพที่ 3.5 1.3.5.7 จากนั้นปล่อยสไลด์ไว้ให้แห้ง ทำความสะอาด และปิดฉลากอธิบายซึ่ง ประกอบด้วยชื่อตัวอย่าง ชื่อสารทำให้คงสภาพ ชื่อสีย้อม ชื่อผู้ทำ และวันเดือนปีที่ทำ

43 ภาพที่ 3.4 การเตรียมสไลด์ถาวรโดยวิธีการสเมียร์เลือด ก ข ค ง จ ฉ ช ซ

44 ภาพที่ 3.5 สไลด์สเมียร์เลือดที่เสร็จสมบูรณ์ ก. ฉลากอธิบายสไลด์ ข. ตำแหน่งรอยฟิล์มเลือดและการติดฉลาก อธิบาย ค. เซลล์เม็ดเลือดภายใต้กล้องจุลทรรศ์ที่กำลังขยายเลนส์ใกล้วัตถุ 40X 1.4 ผลการย้อมสีสไลด์ถาวร เมื่อตรวจสอบด้วยตาเปล่ารอยสเมียร์จะมีสีชมพู ถ้าตรวจสอบด้วย กล้องจุลทรรศน์จะเห็นเซลล์เม็ดเลือดเรียงตัวสม่ำเสมอ ไม่ซ้อนทับ เซลล์เม็ดเลือดแดงติดสีชมพู นิวเคลียสเซลล์เม็ด เลือดขาวติดสีน้ำเงิน ปนม่วง แกรนูลของนิวโทรฟิลติดสีชมพูปนม่วงแต่ของอิโอซิโนฟิลจะติดสีแดง พื้นระหว่างเซลล์ เม็ดเลือดจะต้องใสไม่มีสี และไม่มีตะกอน ดังตารางที่ 3.1 ตารางที่ 3.1 ส่วนประกอบของเลือดและลักษณะการติดสีไรท์ (Wright’s stain) เซลล์ ลักษณะการติดสี 1. เซลล์เม็ดเลือดแดง (Erythrocyte / red blood cell) ชมพูแดง 2. เซลล์เม็ดเลือดขาว (Leukocyte / white blood cell) - นิวเคลียส (Nucleus) - ไซโทพลาสซึม (Cytoplasm) ม่วงแดง–ม่วงเข้ม ลิมโฟไซต์ (Lymphocyte) โมโนไซต์ (Monocyte) นิวโทรฟิล (Neutrophil) เบโซฟิล (Basophil) - แกรนูล นิวโทรฟิล (Neutrophil) อีโอซิโนฟิล (Eosinophil) เบโซฟิล (Basophil) ฟ้าอ่อน–น้ำเงินเข้ม ฟ้าเทา ชมพูอ่อน ฟ้า ม่วงอ่อน ส้มแดง ม่วง 3. เกล็ดเลือด (Blood platelet) ชมพูแดง ที่มา: Humason. 1972: 243-251. สเมียร์เลือด เมทิลแอลกอฮอล์ สีไรท์ (Wright’s stain) นายรุ่ง จำเจริญ 8 พ.ย. 59 สไลด์ที่สำเร็จ รายละเอียด รอยสเมียร์เลือด ก ข ค 20 µm

45 เทคนิคการผนึกสไลด์ทั้งตัว การเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็ก หรือเนื้อเยื่อทั้งชิ้นเพื่อนำมาผนึกเป็นสไลด์ เรียกวิธีนี้ว่า การ ผนึกสไลด์ทั้งตัว หรือโฮลเมาท์ (Whole mount) (ธวัช ดอนสกุล. 2534: 102) วิธีนี้จะนำทุกส่วนของสิ่งมีชีวิต หรือ เนื้อเยื่อทั้งชิ้นมาผนึกเป็นสไลด์ ตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่เหมาะสมกับเทคนิคนี้ ได้แก่ เอ็มบริโอ เนื้อเยื่อต่างๆ และสิ่งมีชีวิต ขนาดเล็ก เช่น มอส ฮอร์นเวิร์ต (ศิริกานดา รัตนมณี. 2558: 1-117) ไฮดรา พารามีเซียม หนอนตัวแบน หนอนตัว กลม หนอนปล้อง หรือแมลง ฯลฯ วิธีการและขั้นตอนการปฏิบัติขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของสิ่งมีชีวิตที่ศึกษามี 2 วิธี (Weesner. 1965: 57-58) ดังนี้ 1. การผนึกสไลด์ทั้งตัวแบบชั่วคราว การผนึกสไลด์ทั้งตัวแบบชั่วคราว (Temporary whole mount) เหมาะสำหรับศึกษาโครงสร้าง บางอย่าง หรือพฤติกรรมของสิ่งมีชีวิตในระยะเวลาสั้น เช่น การศึกษาโพรโทซัวในขณะที่มีชีวิตอยู่ เพื่อศึกษาการ เคลื่อนที่ การกินอาหาร หรือการสืบพันธุ์ ฯลฯ การเตรียมสไลด์ชั่วคราวมีหลายวิธี ได้แก่ 1.1 เทคนิคการเตรียมสไลด์สด (Wet mount technique) การหยดตัวอย่างที่เป็นของเหลว หรือ ของเหลวที่สิ่งมีชีวิตนั้นอาศัยอยู่ลงบนสไลด์ให้น้อยที่สุด แล้วปิดกระปิดสไลด์ 1.2 เทคนิคการหยดแขวน (Hanging drop technique) การหยดของเหลวที่สิ่งมีชีวิตนั้นอาศัยอยู่ ลงบนกระจกปิดสไลด์ แล้วคว่ำกระจกปิดบนสไลด์หลุม เพื่อให้สิ่งมีชีวิตที่จะศึกษาแขวนลอยอยู่ภายใน 1.3 เทคนิคการใช้แผ่นเซลโลเฟน (Cellophase compressorium technique) หยดของเหลวลง บนกระจกปิดสไลด์ แล้วใช้แผ่นเซลโลเฟนปิดทับเพื่อตรึงตัวอย่าง แล้วนำไปคว่ำลงในสไลด์หลุม 1.4 เทคนิคการทำให้สลบ (Nacrotization technique) การใช้สารเคมีเพื่อลดความเร็วในการ ตอบสนองต่อสิ่งเร้าของสิ่งมีชีวิต สารที่นิยมใช้ได้แก่ เอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 10 เกลือแมกนีเซียม เมนทอล ไอของ อีเธอร์ ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ และความร้อน เป็นต้น 2. การผนึกสไลด์ทั้งตัวแบบถาวร การผนึกสไลด์ทั้งตัวแบบถาวร (Permanent whole mount) เป็นกระบวนการรักษาสภาพของ สิ่งมีชีวิตขนาดเล็กมีวิธีการคล้ายกับการทำสไลด์ถาวรทั่วไป แต่ต้องเลือกใช้สารในแต่ละขั้นตอนให้เหมาะสมกับ ตัวอย่างแบ่งได้ 2 ประเภท ดังนี้ 2.1 การเตรียมเป็นสไลด์ถาวรโดยการย้อมด้วยสี โดยทำให้ตัวอย่างเคลื่อนที่ช้าลง เพื่อป้องกันการบิด ตัว แล้วรักษาสภาพด้วยสารคงสภาพที่เหมาะสม เช่น น้ำยาคงสภาพชาวแดง (Schaudin’s fliud) น้ำยาคงสภาพ คาร์นอย (Carnoy’s fluid) น้ำยาบูแอง (Bouin’s fluid) เป็นต้น แล้วล้างสารคงสภาพส่วนเกินออกจากเซลล์ ส่วน การย้อมสีเพื่อย้อมองค์ประกอบของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ นิยมใช้สีเออร์ลิช ฮีมาทอกไซลิน (Ehrlich’s hematoxylin) เป็นสีย้อมที่ใช้เคาร์เตอร์ สเตนร่วมกับสีย้อมซาฟรานิน (Safranin) หรืออีโอชิน วาย (Eosin Y) สีคองโกเรด (Congo red) สีบอร์เรกซ์คาร์มีน (Borax carmine) ฯลฯ แล้วเข้าสู่การดึงน้ำออก (Dehydration) การทำให้ใส (Clearing) แล้วผนึกเป็นสไลด์ถาวร 2.2 การเตรียมเป็นสไลด์ถาวรโดยไม่ต้องย้อมสี เช่น การทำสไลด์สัตว์ขาข้อขนาดเล็ก หรือการเลือก บางชิ้นส่วนมาผนึกสไลด์ นิยมนำมาต้มในสารละลายกรดหรือด่างให้โครงสร้างอ่อนนุ่มก่อนแล้วผนึกเป็นสไลด์ การ ทำสไลด์ตัวอย่างสิ่งมีชีวิตให้อยู่ในสภาพเหมือนขณะมีชีวิต โดยการรักษาสภาพเซลล์ด้วยสารละลายฟอร์มาลินร้อย ละ 5 แล้วใช้กลีเซอรีนเป็นสารผนึกสไลด์ และการทำสไลด์ตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่เล็กและบอบบางโดยทำให้ตัวอย่าง เคลื่อนที่ช้าลง แล้วรักษาสภาพเซลล์ด้วยสารละลายฟอร์มาลินร้อยละ 2 และเก็บตัวอย่างในสไลด์หลุม เป็นต้น

46 การเพาะเลี้ยงตัวอย่างสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กเพื่อใช้ในห้องปฏิบัติการ ตัวอย่างที่นำมาใช้สำหรับเทคนิคการเตรียมสไลด์โดยการผนึกทั้งตัว สามารถหาได้จากแหล่งอาศัยตาม ธรรมชาติที่เหมาะสม แต่อาจทำให้เก็บตัวอย่างได้ในปริมาณน้อย ถ้าต้องการจำนวนตัวที่มากจึงจำเป็นต้องเพาะเลี้ยง ด้วยอาหารและทำในห้องปฏิบัติการ (ศุภลักษณ์ โรมรัตนพันธ์. 2545: 41-63) ดังนี้ 1. การเพาะเลี้ยงพารามีเซียมด้วยน้ำต้มฟาง เตรียมน้ำต้มฟางเทใส่ภาชนะปากกว้าง แล้วเติมน้ำจากแหล่งน้ำธรรมชาติลงไป ตั้งทิ้งไว้ในบริเวณที่มี แสงส่องถึงเป็นเวลา 1-2 สัปดาห์ หลังจากนั้นตรวจหาพารามีเซียมในน้ำต้มฟางด้วยกล้องจุลทรรศน์ทุกสัปดาห์ 2. การเพาะเลี้ยงยูกลีนา นำน้ำบ่อที่ต้มแล้วใส่ลงในขวดปากกว้างที่มีเศษฟางหรือเศษหญ้า ตั้งทิ้งไว้ในบริเวณที่มีแสงส่องถึง เป็นเวลา 1 สัปดาห์ แล้วจึงเติมยูกลีนาที่รวบรวมได้จากธรรมชาติใส่ลงไป เติมเมล็ดข้าว 2-3 เมล็ด หรือเศษฟางเพื่อ เป็นอาหาร วิธีนี้สามารถรักษาตัวอย่างได้นานหลายเดือน 3. การเพาะเลี้ยงไฮดรา รวบรวมพืชน้ำจากแหล่งน้ำธรรมชาติ เช่น คูน้ำ บ่อน้ำ หรือทะเลสาป ใส่ลงในขวดปากกว้างที่มีน้ำ เล็กน้อย เมื่อพืชน้ำเริ่มเน่า ไฮดราที่เกาะอยู่กับพืชน้ำจะลอยขึ้นมาที่ผิวน้ำ เก็บรวบรวมไฮดราที่ได้จากผิวน้ำใส่ลงใน น้ำสะอาดปราศจากคลอรีน และให้อาหารโดยใช้พวกไรแดง หรือสัตว์กลุ่มคลัสเตเชียร์ขนาดเล็ก 4. การเพาะเลี้ยงพลานาเรีย รวบรวมพลานาเรียจากพืชน้ำ ใต้ก้อนหิน ใต้ใบไม้ และวัตถุจมน้ำ หรืออาจใช้เหยื่อเช่น เนื้อสด ฯลฯ ใส่ลงในขวดปากกว้างที่มีน้ำสะอาดปราศจากคลอรีน โดยใช้ลูกน้ำ ไรแดง หรือตับสดเป็นอาหาร ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรพารามีเซียม สิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็กและเป็นเซลล์เดี่ยวไม่เหมาะที่จะนำไปเตรียมตัวอย่างโดยการผ่านวิธีที่ซับซ้อน เพราะอาจทำให้เซลล์มีความผิดปกติหรือถูกทำลายได้ดังนั้นจึงต้องเก็บตัวอย่างทั้งตัวหรือเนื้อเยื่อทั้งชิ้นมาเตรียม เป็นสไลด์โดยไม่ต้องตัดเนื้อเยื่อ เทคนิคการเตรียมสไลด์สิ่งมีชีวิตขนาดเล็กรวมทั้งบางส่วนของสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดใหญ่ วิธีนี้มีประโยชน์ต่อ การศึกษาด้านกายวิภาควิทยาของสิ่งมีชีวิต โดยนำสิ่งมีชีวิตทั้งตัวหรือส่วนของร่างกายมาผนึกในตัวกลางเรียกว่า โฮล เมาท์ (Whole mount) สารตัวกลางที่ใช้ ได้แก่ เรซินสังเคราะห์ (Synthetic resin) หรือบัลซัมกลีเซอรีน (Balsum glycerine) กลีเซอรีนเยลลี่ (Glycerine gelly) และตัวกลางชนิดอื่นที่ไม่ใช่เรซิน (Non-resinous media) ส่วน โครงสร้างที่แข็งของสิ่งมีชีวิตโดยทั่วไปแล้วมักผนึกแบบแห้ง (ธวัช ดอนสกุล. 2534: 103-106) ในบทปฏิบัติการนี้ จะกล่าวถึงการเตรียมสไลด์ถาวรทั้งตัวของพารามีเซียม เพื่อให้นักศึกษาได้ลงมือเพาะเลี้ยงพารามีเซียมใน ห้องปฏิบัติการ รวมทั้งการเตรียมเป็นสไลด์ถาวร 2.1 วัตถุประสงค์นักศึกษามีความสามารถดังนี้ 2.1.1 เพาะเลี้ยงพารามีเซียมในห้องปฏิบัติการได้ 2.1.2 เตรียมสไลด์ถาวรทั้งตัวของพารามีเซียมได้ 2.2 วัสดุ–อุปกรณ์บทปฏิบัติการนี้มีวัสดุและอุปกรณ์ดังนี้ 2.2.1 สารเคมีที่ใช้ได้แก่ 2.2.1.1 บอแรกซ์คาร์มีน (Borax carmine) ประกอบด้วย - ผงสีคาร์มีน 2 กรัม (Carmine powder, C.I. 75470) - ผงบอแรกซ์ 4 กรัม (Borax powder)

47 - น้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร โดยผสมสารให้เข้ากันแล้วตั้งทิ้งไว้ โดยใช้แท่งแก้วคนทุกวัน การเตรียมสีย้อมนี้อาจทำ ได้เร็วขึ้น โดยใช้ความร้อนอุ่นสารละลายประมาณครึ่งชั่วโมงแล้วเติมเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ตั้งทิ้งไว้หลายวันโดยใช้แท่งแก้วคนทุกวัน หลังจากนั้นเก็บไว้ในภาชนะสีชาและก่อนใช้งานให้กรองด้วย กระดาษกรอง 2.2.1.2 แอซิดแอลกอฮอล์(Acid alcohol) ประกอบด้วย - กรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 2-3 หยด (Concentrated Hydrocloric acid, HCl conc.) - เอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 100 มิลลิลิตร 2.2.1.3 สารละลายไข่ขาว (Mayer’s egg albumin) ประกอบด้วย - ไข่ขาว 1 ส่วน - กลีเซอรีน 1 ส่วน - โซเดียมซาลิไซเลต ร้อยละ 1 2-3 หยด (1% Sodium salicylate) โดยใช้เฉพาะส่วนไข่ขาวรวมกับกลีเซอรีน เขย่าให้เข้ากันแล้วเติมโซเดียม ซาลิไซเลต ลงไป 2-3 หยด (โซเดียมซาลิไซเลตร้อยละ 1 เตรียมจากโซเดียมซาลิไซเลต 1 กรัม ผสมกับน้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร) กรองแล้วบรรจุขวดเก็บไว้ในตู้เย็นสามารถเก็บไว้ใช้ได้เป็นเวลานาน 2.2.1.4 น้ำยาลูกอลไอโอดีน (Lugol’s iodine solution) ประกอบด้วย - ไอโอดีน 1 กรัม (Iodine crystal) - โพแทสเซียมไอโอไดด์ 2 กรัม (Potassium iodide, KI) - เอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 95 10 มิลลิลิตร - น้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร 2.2.1.5 น้ำยาคงสภาพบูแอง (Bouin’s fluid) ประกอบด้วย - สารละลายอิ่มตัวของกรดพิคริก 75 มิลลิลิตร (กรดพิคริก 2.5 กรัม ในน้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร) - ฟอร์มาลิน 25 มิลลิลิตร - กรดอะซิติกเข้มข้น 5 มิลลิลิตร 2.2.2 อุปกรณ์อื่น ได้แก่ ใบมีดโกน ปากคีบ จานแก้ว กระจกปิดสไลด์ แผ่นสไลด์ น้ำกลั่น เข็ม เขี่ย พู่กัน สารผนึกสไลด์ และแผ่นฉลากสำหรับติดรายละเอียด 2.2.3 ตัวอย่าง ได้แก่ พารามีเซียมที่เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการ 2.3 วิธีดำเนินการ บทปฏิบัติการนี้มีขั้นตอนต่างๆ ดังนี้ 2.3.1 การเพาะเลี้ยงพารามีเซียมในห้องปฏิบัติการ พารามีเซียมที่จะนำมาใช้ในการทำสไลด์ เป็นพารามีเซียมที่ได้จากการเพาะเลี้ยงด้วยน้ำต้มฟางดังขั้นตอนต่อไปนี้ 2.3.1.1 ตัดฟางข้าวให้มีความยาวประมาณ 1 นิ้ว แล้วชั่งฟางข้าว 0.5 กรัม ต้มรวมกับ น้ำประปาหรือน้ำจากบ่อ 100 มิลลิลิตร ปล่อยทิ้งไว้ให้เดือดประมาณ 15 นาที น้ำฟางข้าวที่ได้จะมีความเข้มข้นร้อย ละ 0.5 ซึ่งเป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการเพาะเลี้ยงพารามีเซียม (ธวัส ดอนสกุล. 2534: 103-106) และ ปล่อยน้ำต้มฟางไว้ให้เย็น 2.3.1.2 ตวงน้ำต้มฟางใส่ภาชนะปากกว้างประมาณ ½ ของภาชนะพร้อมกับใส่ท่อน ฟางที่ต้มแล้ว (ภาพที่ 3.6) ตั้งทิ้งไว้ประมาณ 1 คืน หลังจากนั้นให้ตักน้ำจากบ่อ หนอง คู คลอง ที่คาดว่ามีพารามี

48 เซียมใส่ลงในน้ำต้มฟางจนค่อนภาชนะและปิดด้วยผ้าขาวบาง เสร็จแล้ววางภาชนะไว้ในห้องปฏิบัติการที่มีแสงแดด ส่องถึงประมาณ 1 สัปดาห์ 2.3.1.3 ตรวจสอบพารามีเซียมด้วยการเตรียมสไลด์สด (Wet mount) จะพบพารา มีเซียมรวมทั้งโพรโทซัวชนิดอื่นเป็นจำนวนมาก พารามีเซียมที่เจริญและขยายพันธุ์เพิ่มขึ้นมักเกาะติดกับผิวขอบ ด้านบนของบีกเกอร์ ถ้ามีจำนวนมากจะมองเห็นน้ำเป็นฝ้าสีขาว ถ้ามองดูระยะใกล้จะเห็นตัวขนาดเล็กวิ่งไปมา ภาพที่ 3.6 การเตรียมน้ำต้มฟางสำหรับเพาะเลี้ยงพารามีเซียมในห้องปฏิบัติการ 2.3.2 การเพาะเลี้ยงพารามีเซียมบริสุทธิ์ในห้องปฏิบัติการ พารามีเซียมที่นำมาเตรียมสไลด์ เป็นพารามีเซียมบริสุทธิ์ปราศจากโพรโทซัวชนิดอื่น โดยใช้หลอดแก้วปลายแหลมขนาดเล็กดูดพารามีเซียมออกมา เพียงตัวเดียวพยายามอย่าให้โพรโทซัวขนาดเล็กชนิดอื่นเจือปนด้วย โดยถ่ายพารามีเซียมลงในน้ำกลั่นหลายครั้ง เพื่อให้ปราศจากโพรโทซัวชนิดอื่น จากนั้นจึงถ่ายน้ำกลั่นที่มีพารามีเซียมใส่ในน้ำต้มฟางบริสุทธิ์ที่เตรียมไว้แล้ว จึงจะ ได้พารามีเซียมบริสุทธิ์ปราศจากโพรโทซัวชนิดอื่นไว้ใช้ทำสไลด์ต่อไป (ภาพที่ 3.7) 2.3.3 การเตรียมสไลด์ถาวรพารามีเซียมบริสุทธิ์ 2.3.3.1 ทาสไลด์ที่สะอาดปราศจากคราบไขมันด้วยสารละลายไข่ขาว โดยใช้ปลายนิ้ว ทาที่ผิวด้านบนของแผ่นสไลด์ให้เป็นฟิล์มบาง (ภาพที่ 3.8 ก และ ข) แล้วทิ้งไว้ประมาณ 20 นาที หรือนานกว่านี้ 2.3.3.2 ใช้หลอดแก้วดูดพารามีเซียมจากภาชนะที่เลี้ยง หยดลงบริเวณแผ่นฟิล์มของ สารละลายไข่ขาว 1 หยด 2.3.3.3 ใช้หลอดดูดน้ำยาคงสภาพบูแองหยดลงไปรอบหยดน้ำต้มฟางบนสไลด์ แล้ว ปล่อยให้สารทำให้คงสภาพซึมเข้าไปยังเซลล์พารามีเซียม และปล่อยให้แห้งหมาดๆ เป็นแผ่นฟิล์มนานประมาณ 10 นาที (ภาพที่ 3.8 ค) ภาพที่ 3.7 พารามีเซียมที่เลี้ยงในน้ำต้มฟางเป็นเวลา 21 วัน ก. และ ข. ภาพถ่ายใต้กล้องจุลทรรศน์กำลังขยายเลนส์ ใกล้วัตถุ 10X และ 40X ตามลำดับ 50 µm ก ข 200 µm

49 2.3.3.4 ใช้หลอดแก้วดูดน้ำยาลูกอลไอโอดีนหยดลงไปที่สารทำให้คงสภาพบนแผ่น สไลด์ (ภาพที่ 3.8 ง) แล้วเอียงสไลด์ให้น้ำยาลูกอลไหลทิ้งไป หลังจากนั้นหยดเอทิลแอลกอฮอล์ร้อยละ 70 ทิ้งไว้ ประมาณ 15 นาที เพื่อล้างน้ำยาบูแองออก หรือทิ้งไว้จนกระทั่งสีเหลืองหมดไป 2.3.3.5 ย้อมสีสไลด์ด้วยสีย้อมบอร์แรกซ์คามีนประมาณ 15-20 นาที (ภาพที่ 3.8 จ) พร้อมตรวจสอบสไลด์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ทุกๆ 2 นาที จนสังเกตเห็นนิวเคลียสย้อมติดสีเป็นสีแดงเข้ม 2.3.3.6 ล้างสีส่วนเกินด้วยเอซิดแอลกอฮอล์ประมาณ 5-10 นาที (ภาพที่ 3.8 ฉ) พร้อม ตรวจสอบสไลด์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ทุกๆ 5 นาที จนสังเกตุเห็นนิวเคลียสย้อมติดสีเป็นสีแดงเข้ม 2.3.3.7 ขจัดน้ำโดยผ่านสไลด์ลงในเอทิลแอลกอฮอล์ความเข้มข้นร้อยละ 70, 80, 95 และเอทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์ขั้นตอนละ 2 นาทีตามลำดับ 2.3.3.8 ทำให้ตัวอย่างใสและติดสีชัดเจนขึ้นโดยผ่านสไลด์ลงในไซลีนบริสุทธิ์ 2 ครั้ง ใช้ เวลาครั้งละ 2 นาที 2.3.3.9 ผนึกสไลด์ด้วยสารผนึกสไลด์ (DePeX) 1 หยด และปิดด้วยกระจกปิดสไลด์ (ภาพที่ 3.8 ช) 2.3.3.10 ผึ่งสไลด์ให้สารผนึกสไลด์แห้ง ทำความสะอาด และปิดฉลากอธิบายให้ เรียบร้อยแล้ว และส่งสไลด์ถาวรในชั่วโมงการเรียนการสอนครั้งต่อไป 2.4 ผลการย้อมสีสไลด์ถาวร นิวเคลียสของพารามีเซียมย้อมติดสีแดงเข้มหรือชมพู มองเห็นได้ชัดเจนทั้ง ไมโครนิวเคลียสและแมคโครนิวเคลียส ส่วนไซโทพลาสซึมย้อมติดสีชมพูจาง หรือค่อนข้างใส (ภาพที่3.8 ซ)

50 ภาพที่3.8 การเตรียมสไลด์ถาวรพารามีเซียมด้วยการผนึกสไลด์ทั้งตัว ก ข ค ง จ ฉ ช ซ พารามีเซียม Borax carmine นายประเสริฐ พวงศรี 8 พ.ย. 59 50 µm

51 เทคนิคการกดตัวอย่างให้แบน การกระจายตัวอย่างสิ่งมีชีวิตให้แผ่ราบบนสไลด์ด้วยการกดขยี้ (Squash) เพื่อทำให้เนื้อเยื่อที่เกาะกันอยู่ อย่างหลวมแยกออกจากกัน สามารถสังเกตเห็นส่วนของนิวเคลียสได้ชัดเจนเมื่อผ่านการย้อมด้วยสี หรือเรียกว่า เทคนิคการกดตัวอย่างให้แบน (Squash technique) โดยเนื้อเยื่อที่นิยมนำมาใช้ได้แก่ 1. เนื้อเยื่อพืช นิยมใช้กับเนื้อเยื่อที่มีลักษณะค่อนข้างอ่อนจะสามารถกดให้แบนและแพร่กระจายออกจากกันได้ง่าย เพราะวิธีนี้นิยมใช้ศึกษาและวิเคราะห์เกี่ยวกับโครโมโซมของเซลล์ที่อยู่ติดกันและแยกออกจากกันได้ดี โดยส่วนใหญ่ เป็นการศึกษาไมโทติกโครโมโซม (Mitotic chromosome) จากบริเวณเนื้อเยื่อเจริญซึ่งมีการแบ่งตัวของเซลล์ เช่น ปลายยอด ปลายราก ใบอ่อน ดอกอ่อน ฯลฯ 2. เนื้อเยื่อสัตว์ นิยมใช้กับส่วนที่เป็นของเหลว เช่น เซลล์เม็ดเลือด บางส่วนของระบบประสาท ไขกระดูก ปุ่มน้ำเหลือง (Lymph node) ฯลฯ เซลล์ในอวัยวะสร้างเซลล์สืบพันธุ์ เช่น อัณฑะแมลง ฯลฯ ปฏิบัติการเรื่อง การเตรียมสไลด์ถาวรเซลล์ประสาท เซลล์ประสาทเป็นเซลล์ขนาดใหญ่ มีใยประสาทมากมาย การศึกษารูปร่างและลักษณะของเซลล์ สามารถ ทำได้โดยนำเซลล์มากด (Squash) ให้เซลล์ประสาทและใยประสาทกระจายบนแผ่นสไลด์ให้เป็นแผ่นฟิล์มบางๆ ตัวอย่างที่ใช้ ได้แก่ ไขสันหลัง (Spinal cord) ของหมู อัณฑะของตั๊กแตน เป็นต้น ไขสันหลังเป็นส่วนหนึ่งของระบบประสาทส่วนกลางมีรูปร่างคล้ายทรงกระบอก (cylindrical shape) ทอดตัวยาวอยู่ใน spinal cord ของแนวกระดูกสันหลัง (vertebral column) โดยเป็นส่วนที่ต่อมาจากก้านสมอง ดังภาพที่ 3.9 กระดูกสันหลัง บริเวณที่ใช้ในการเตรียมสไลด์จากภาพตัดตามขวางของไขสันหลังประกอบด้วย 1. ส่วน external part คือ White matter ประกอบด้วยเส้นใยประสาทชนิด myelinated nerve fibers จำนวนมากประกอบกันเป็นทางเดินประสาททำหน้าที่นำกระแสประสาท 2. ส่วน internal part มีสีเทาคือ Gray matter ประกอบด้วยกลุ่ม cell body ของเซลล์ประสาทและ neuropil (dendrites, axons, capillaries และ glia cells ) แทรกอยู่ ภาพที่ 3.9 กระดูกสันหลัง บริเวณที่ใช้ในการเตรียมสไลด์

52 1. วัตถุประสงค์นักศึกษามีความสามารถดังนี้ 1. เตรียมสไลด์ถาวรเซลล์ประสาทในห้องปฏิบัติการได้ 2. วัสดุ–อุปกรณ์บทปฏิบัติการนี้มีวัสดุและอุปกรณ์ดังนี้ 1. ไขสันหลัง (Spinal cord) ของหมู แช่เย็น 4˚C 2. สีย้อมที่ใช้คือ 0.1 หรือ 1% methylene blue (ใช้ 0.1%) 3. วิธีดำเนินการ สามารถปฏิบัติได้ดังนี้ 1. เตรียมสไลด์ล้างสไลด์ให้สะอาด ตามวิธีการ 2. เตรียมตัวอย่าง วางไขสันหลังของหมูบน petri dish ใช้มีดผ่าตัดกรีดตัดส่วน white matter ออกให้มากที่สุด ใช้เข็มเขี่ยส่วน grey matter ประมาณหัวเข็มหมุดวางบนแผ่นสไลด์ 3. เตรียมสไลด์ตัวอย่าง โดยป้ายไขสันหลังหมูบนสไลด์ ดึงเลื่อนสไลด์ไปฝั่งตรงข้ามกันตามแนว ยาว 4. การรักษาสภาพเซลล์จุ่มสไลด์ใน staining jar ที่บรรจุแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 95% เป็น เวลา 1 นาที 5. การย้อมสีโครงสร้าง หยดสี methylene blue 2 นาที 6. การล้างสีส่วนเกิน ด้วยน้ำประปาไหลผ่าน หรือจุ่มลงในภาชนะที่บรรจุน้ำประปา จนกว่าจะ สังเกตเห็นสีน้ำเงินติดส่วนนิวเคลียสของเซลล์โดยสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แล้วจึงวางสไลด์ไว้ให้แห้งหรือหมาด 7. การผนึกเป็นสไลด์ถาวรแช่สไลด์ในแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 95% 2 นาที 1 ครั้ง แอลกอฮอล์ ความเข้มข้น 100% 2 นาที และ Xylene 2 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที 8. ผลการสังเกตบนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ไม่มีเศษขยะมาก พบการกระจายตัวของเซลล์ ไม่ ซ้อนทับกัน นิวเคลียส ติดสีน้ำเงินจางๆ และนิวคลีโอลัส ติดสีน้ำเงินเข้ม

53 ภาพที่3.10 การเตรียมสไลด์ถาวรเซลล์ประสาทจากไขสันหลัง

บทที่ 4 เทคนิคการเก็บรักษาโครงกระดูก โครงร่างแข็งหรือโครงกระดูกเป็นอวัยวะที่สำคัญที่ใช้เป็นเกณฑ์พื้นฐานสำหรับศึกษาสัตว์มีกระดูกสันหลังด้านต่างๆ โดยเฉพาะการศึกษาถึงความสัมพันธ์ของโครงสร้าง วิวัฒนาการ และอนุกรมวิธาน เช่น ลักษณะโครงสร้างของกระดูกกะโหลก ศรีษะและฟันมีความสำคัญในการจำแนกชนิดของสัตว์มีกระดูกสันหลังและอายุของสัตว์ ซึ่งเทคนิคในการเตรียมและเก็บรักษา ตัวอย่างโครงกระดูกทำได้หลายวิธีตามวัตถุประสงค์ของการใช้งาน ได้แก่ 1. เทคนิคการทำโครงกระดูกแบบแห้ง เหมาะสำหรับสัตว์ขนาดใหญ่ โดยจะต้องนำกล้ามเนื้อ ไขมัน และอวัยวะ ภายในออกให้หมด แล้วฟอกสีกระดูกให้ขาว และจึงประกอบชิ้นส่วนกระดูกต่างๆ กลับเข้าที่เดิม 2. เทคนิคการดองใส จะต้องทำให้เนื้อเยื่อลำตัวใส และย้อมสีกระดูก แล้วเก็บในกลีเซอรีน วิธีนี้เหมาะสำหรับสัตว์ ขนาดเล็กและเอ็มบริโอ เพราะเป็นวิธีที่สามารถเก็บรักษากระดูกชิ้นขนาดเล็กให้คงเชื่อต่อกับกระดูกอื่น โดยไม่มีส่วนหนึ่งหลุด หายไป หรือผิดรูปร่างไปจากธรรมชาติ ส่วนกระดูกอ่อนก็ไม่บิดงอ และยังเหมาะสำหรับการศึกษาท่อลำเลียงในพืช 3. เทคนิคการใช้รังสีเอ็กซ์ เหมาะสำหรับศึกษาตัวอย่างที่หาได้ยากและมีจำนวนจำกัด โดยการใช้รังสีฉายกระทบ ตัวอย่าง เพื่อศึกษาโครงสร้างภายในลำตัวสิ่งมีชีวิต โดยไม่ต้องทำให้ตัวอย่างเสียหายได้ เทคนิคการทำโครงกระดูกแบบแห้ง เป็นเทคนิคมาตรฐานในการจัดทำโครงกระดูกเพื่อเก็บรักษาไว้เป็นตัวอย่างตั้งแสดงในพิพิธภัณฑ์ หรือเป็นตัวอย่าง ประกอบการเรียนการสอน ประกอบด้วย 4 ขั้นตอนดังนี้ 1. การนำกล้ามเนื้อออกจากตัวอย่างซากสัตว์โดยนำตัวอย่างมาตัดผิวหนัง กล้ามเนื้อ และอวัยวะภายในออก สำหรับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม เมื่อนำผิวหนังที่บริเวณขาออกให้ระวังกระดูกชิ้นเล็ก มักจะหลุดหายได้ง่าย เช่น กระดูกที่เข้าขา หลัง (Patella) ซึ่งเป็นกระดูกที่ไม่ติดกับเอ็นหรือกระดูกอื่นๆ แล้วแยกกะโหลกศรีษะออกจากกระดูกสันหลังข้อแรก (Atlas) อย่างระมัดระวัง และใช้กรรไกรตัดเนื้อเยื่อรอบๆ foramen magnum ออก แล้วทำความสะอาดภายในกะโหลก โดยสอดเข็ม ฉีดยาเข้าทาง foramen magnum ขึ้นไปถึงสมองส่วนหน้า แล้วฉีดน้ำเข้าไปในโพรงสมอง เพื่อดันให้เนื้อสมองทะลักออกมา ช่องนี้ วิธีนี้จะไม่ได้ผลหากกะโหลกศรีษะมีรอยร้าว ให้แก้ไขโดยใช้เข็มเขี่ยเนื้อสมองออกมาแทน 2. การทำความสะอาดกระดูก เมื่อนำกล้ามเนื้อและอวัยวะภายในออกแล้ว จะพบว่ายังคงมีส่วนของกล้ามเนื้อหลง เหลืออยู่บางส่วน ให้ทำความสะอาดกระดูกด้วยหลายวิธีการดังนี้ 2.1 การใช้แมลง ปล่อยให้แมลงปีกแข็งพวก Dermestid กัดกิน โดยนำโครงกระดูกไปไว้ในภาชนะปิด มิดชิดที่มีตัวแมลง ปล่อยให้แมลงกัดกินจนเนื้อแห้งๆ ออกหมด เหมาะสำหรับสัตว์ขนาดใหญ่ 2.2 การต้ม นำซากโครงกระดูกที่นำกล้ามเนื้อ และอวัยวะภายในออกแล้ว มาต้มในน้ำเดือดของ สารละลายผสมของน้ำ 3 ส่วน และสารละลายผสมของแอมโมเนียมเข้มข้น 150 มิลลิลิตร + สบู่ 75 กรัม + โปแตสเซียมไนเต รท 12 กรัม + น้ำ 2 ลิตร จำนวน 1 ส่วน ต้มไม่เกิน 1-2 ชั่วโมง แต่จะทำให้กระดูกและข้อต่อหลุดออกจากกัน ผิวของกระดูก จะพรุนหรือปรุมาก ส่วนฟันจะหลุดจากขากรรไกร 2.3 การแช่น้ำ นำซากโครงกระดูกไปแช่ในภาชนะที่มีน้ำเย็นอุณหภูมิห้อง ตั้งทิ้งไว้ 10-20 วัน จนเน่าเปื่อย และเนื้อหลุดจากกระดูกแข็ง แล้วเทน้ำทิ้งไปและปล่อยให้แห้ง แต่วิธีนี้กระดูกจะหลุดออกจากกันโดยเฉพาะกระดูกที่มีขนาด เล็ก นอกจากนี้ยังสามารถนำไปแช่ในน้ำเย็นประมาณ 3-4 วัน โดยเปลี่ยนน้ำทุกวัน แล้วย้ายไปแช่ในสารละลาย Trisodium phosphate 0.01% ประมาณ 12- 24 ชั่วโมง สารละลายนี้จะทำให้เนื้อที่ติดกระดูกพองและหลุดได้ง่ายโดยไม่เน่าเปื่อย เมื่อนำกล้ามเนื้อและอวัยวะภายในออกหมดแล้ว ให้นำเอาไขมันออก โดยแช่ในสารละลาย CCl4 เป็นเวลา 2-3 วัน หรือมากกว่านี้ หรือใช้ผ้าชุปคลอโรฟอร์มรูดกระดูก เพื่อล้างไขมันออก 3. การทำให้กระดูกขาว ล้างกระดูกให้สะอาดด้วยผงซักฟอกกับน้ำอุ่นล้างในน้ำสะอาดและทำให้แห้ง ถ้ากระดูกยังไม่ ขาว ให้จุ่มลงในสารละลาย 5% CCl4 แล้วล้างน้ำให้สะอาดและปล่อยทิ้งไว้ให้แห้ง ส่วนในกรณีที่เป็นโครงกระดูกสดต้องแช่ นานมากกว่า 10 ชั่วโมง เพื่อให้กระดูกขาว

56 4. จัดรูปร่างโครงกระดูก จัดติดกระดูกส่วนต่างๆ ที่หลุดออกจากกัน โดยเฉพาะบริเวณข้อต่อด้วยกาวและต้องใช้ลวด ยึดกระดูกไว้ ตลอดจนจัดท่าทางให้อยู่ในลักษณะการยืน แล้วติดตั้งบนแผ่นไม้หรือวัสดุที่รองรับน้ำหนักได้แข็งแรง มีฝาครอบ ปิดมิดชิด เทคนิคการเก็บรักษาโครงกระดูกด้วยการดองใส เป็นเทคนิคที่ใช้ในการเก็บรักษาตัวอย่างสิ่งมีชีวิต เพื่อศึกษาโครงสร้างภายใน โดยการทำให้เนื้อเยื่อตัวอย่างใสด้วย การแทนที่ของเหลวภายในเนื้อเยื่อด้วยสารละลายที่มีค่าดัชนีหักเหสูง และย้อมสีส่วนที่ต้องการศึกษา โดยสามารถแสดงโครง กระดูกซึ่งเหมาะสำหรับศึกษาการเจริญของกระดูกสัตว์มีกระดูกสันหลังขนาดเล็กและตัวอ่อนระยะต่างๆ ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วย น้ำนม ตามความแตกต่างของกระดูกในตัวอย่างสัตว์ตามลำดับอายุ สีที่นิยมใช้ได้แก่ อะลิซาลีน เรด เอส (Alizarin red S) และ แอลเซียน บลู (Alcian blue) แบ่งได้เป็น 2 ประเภทดังนี้ 1. การดองใสตัวอย่างสัตว์มีกระดูกสันหลัง ในกรณีการเก็บรักษาตัวอย่างสัตว์มีกระดูกสันหลังขนาดเล็ก ที่ไม่ สามารถทำโครงกระดูกแบบสัตว์ขนาดใหญ่ โดยจะทำให้กล้ามเนื้อของสัตว์ใส พร้อมทั้งย้อมกระดูกอ่อน (Cartilage) ให้ติดสี ฟ้าของ alcian blue และกระดูกแข็ง (Bone) ติดสีสีแดงของ alizarin red S ได้แก่ตัวอ่อนหนูปลา กบ หรือโครงกระดูกตัว อ่อนสัตว์ที่อยู่ในท้องเพื่อให้เห็นความแตกต่างได้อย่างชัดเจน การดองใสสัตว์มีประโยชน์ในการศึกษาทางด้านอนุกรมวิธาน การศึกษาตัวอ่อนของสัตว์ และการศึกษาทางกาย วิภาค เช่น เปรียบเทียบชิ้นส่วนของกระดูกสัตว์แต่ละชนิด ความผิดปกติของการเจริญเติบโตของกระดูก ทราบตำแหน่งต่างๆ ของโครงกระดูกได้ใกล้เคียงความจริงมากที่สุด และสามารถแสดงให้เห็นส่วนของกระดูกที่บอบบางยากที่จะแยกออกมาได้ เช่น sclerotic ring ของลูกตา sesamoid bone และ hyoid bone เป็นต้น 2. การดองใสตัวอย่างสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง ถ้าเป็นสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังขนาดเล็กจะศึกษาอวัยวะภายใน โดย ทำให้ลำตัวใส และอวัยวะภายในมีสีน้ำตาลเข้มถึงดำ หรือศึกษาเปลือกหุ้มลำตัว ได้แก่ หนอนพยาธิ ลูกน้ำ เห็บ ไร แมลง และ แมลงใต้ดิน โดยเปลือกอ่อนติดสีฟ้าของ alcian blue และเปลือกแข็งติดสีแดงของ alizarin red S สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังมีหลายชนิด หลายขนาด และขั้นตอนการดองใสก็แตกต่างกันไปตามความเหมาะของตัวอย่าง ซึ่งต้องคำนึงถึงขนาดของตัวอย่างที่มีลำตัวไม่หนาจนเกินไป ในกรณีที่เป็นสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังขนาดเล็กจะเก็บรักษา ตัวอย่างแบบทั้งตัว (Whole mount) บนสไลด์อย่างถาวร ได้แก่ แมลงตัวเล็ก ตัวอ่อนระยะต่างๆ ของพยาธิใบไม้ตัวเต็มวัย ของหนอนพยาธิขนาดเล็ก ส่วนตัวอย่างขนาดใหญ่จะเก็บรักษาในขวดดอง แต่มีข้อเสียอยู่อย่างหนึ่งที่ต้องคอยเปลี่ยน สารละลาย เมื่อสารละลายระเหยไป เพราะจะทำให้ตัวอย่างแห้ง และเสียได้ นอกจากนี้ ยังสามารถดองใสตัวอย่างพืช เพื่อศึกษาระบบท่อลำเลียง สปอร์รูปแบบโครงสร้างของเส้นใบต่างๆ ได้แก่ ใบ ลำต้นของพืชใบเลี้ยงเดียว และใบเลี้ยงคู่

57 ปฏิบัติการเรื่อง การดองใสปลาเพื่อศึกษากระดูกและเนื้อเยื่อที่มีแคลเซียม การดองใสเป็นวิธีการเก็บรักษาตัวอย่างสัตว์มีกระดูกสันหลังอีกวิธีหนึ่ง โดยทำให้กล้ามเนื้อของสัตว์ใส พร้อมทั้งย้อม ติดสีกระดูกอ่อน (cartilage) และกระดูกแข็ง (bone) เพื่อให้เห็นความแตกต่างได้อย่างชัดเจน วิธีการดองใสเหมาะสำหรับ สัตว์มีกระดูกสันหลังขนาดเล็ก ที่ไม่สามรถทำโครงกระดูกแบบสัตว์ขนาดใหญ่ การดองใสสัตว์มีประโยชน์ในการศึกษาทางด้าน อนุกรมวิธาน การศึกษาตัวอ่อนของสัตว์ และการศึกษาทางกายวิภาค เช่น เปรียบเทียบชิ้นส่วนของกระดูกสัตว์แต่ละชนิด ความผิดปกติของการเจริญเติบโตของกระดูก ทราบตำแหน่งต่าง ๆ ของโครงกระดูกได้ใกล้เคียงความจริงมากที่สุด และ สามารถแสดงให้เห็นส่วนของกระดูกที่บอบบางยากที่จะแยกออกมาได้ เช่น sclerotic ring ของลูกตา sesamoid bone และ hyoid bone เป็นต้น วัตถุประสงค์ เพื่อใหรูจักเทคนิคการเก็บรักษาตัวอยางสัตวไมมีกระดูกสันหลังขนาดเล็กแบบการดองใสและการเตรียมตัวอย่างไดถูกตอง ส่วนประกอบและการเตรียมสารเคมี 1. Formalin 10% ประกอบด้วย - 40% formaldehyde 100 มิลลิลิตร - NaCl 9 กรัม - DW 891 มิลลิลิตร 2. Potassium hydroxide (KOH) 2% ประกอบด้วย - Potassium hydroxide 20 กรัม - น้ำกลั่น 1,000 มิลลิลิตร สัตว์ที่มีขนาดเล็กอาจใช้ KOH 1.0-0.5% 3. Hydrogen peroxide (H2O2) 3% ประกอบด้วย - Hydrogen peroxide 3 มิลลิลิตร - น้ำกลั่น 97 มิลลิลิตร 4. Alcian blue solution (Kelly and Bryden, 1983) ประกอบด้วย - alcian blue 0.001 กรัม - glacial acetic acid 20 มิลลิลิตร - 95% ethyl alcohol 80 มิลลิลิตร ต้องละลาย alcian blue ด้วยน้ำกลั่น ปริมาตร 10 มิลลิลิตรก่อน 5. Alizarin stock solution (ดัดแปลงจาก Hollister 1934) ประกอบด้วย - alizarin red S อิ่มตัว 5 มิลลิลิตร - glycerine 5 มิลลิลิตร - น้ำกลั่น 60 มิลลิลิตร เตรียมสารละลายอิ่มตัวของ alizarin red S โดยเติมผง alizarin red S ในกรดอะซิติกเข้มข้น 50% (น้ำกลั่น 2.5 มิลลิลิตร : Glacial acetic acid 2.5 มิลลิลิตร) ให้ละลายจนอิ่มตัวปริมาตร 5 มิลลิลิตร Alizarin working solution ประกอบด้วย - alizarin stock solution 10 มิลลิลิตร - 2% potassium hydroxide 1,000 มิลลิลิตร 6. Clearing solution (ดัดแปลงจาก Youngpeter, 1967) ประกอบด้วย Solution A - glycerine 30 มิลลิลิตร

58 - 2% potassium hydroxide 70 มิลลิลิตร อาจใช้อัตราส่วนตามสูตร หรือ สัดส่วน 1:3 Solution B - glycerine 50 มิลลิลิตร - 2% potassium hydroxide 50 มิลลิลิตร อาจใช้อัตราส่วนตามสูตร หรือ สัดส่วน 1:1 Solution C - glycerine 70 มิลลิลิตร - 2% potassium hydroxide 30 มิลลิลิตร อาจใช้อัตราส่วนตามสูตร หรือ สัดส่วน 3:1 การดองใสสัตว์มีกระดูกสันหลัง: ปลา วิธีดำเนินการ สัตว์มีกระดูกสันหลังที่ใช้คือ ปลา นิยมใช้กับตัวอย่างปลาที่มีขนาดเล็ก ลำตัวไม่หนาเกินไป โดยการทำให้เนื้อเยื่อ ส่วนต่างๆ ของตัวอย่างใส และย้อมสีส่วนที่ต้องการศึกษา 1. การเตรียมตัวอย่าง - เลือกตัวอย่างปลาโดยนำตัวอย่างปลาที่จะดองใส (ปลาขนาดเล็ก ลำตัวไม่ควรมีความยาวเกิน 5 ซม. ลำตัวแบน และหนาไม่เกิน 1 ซม.) มาทำการสลบด้วยการแช่ในน้ำแข็ง - นำตัวอย่างสัตว์มาขอดเกล็ดและอวัยวะภายในออก แล้วล้างตัวอย่างให้สะอาด - หลังจากนั้นนำสัตว์ใส่ลงในขวดที่มีน้ำยารักษาสภาพฟอร์มาลีนความเข้มข้น 10% หรือเอทิลแอลกอฮฮล์ 95% ทิ้ง ไว้ประมาณ 2-3 วัน หรือ 1 สัปดาห์ (ห้ามทิ้งไว้ในฟอร์มาลีนเกิน 3 เดือน เพราะเมื่อนำมาดองใส กล้ามเนื้อจะไม่ใส) 2. การล้างสารรักษาสภาพ - นำตัวอย่างสัตว์มาล้างด้วยน้ำสะอาดเป็นเวลา 4-5 ชั่วโมง หรือ 2-3 วัน เพื่อให้ไม่มีฟอร์มาลิน 3. การฟอกขาว - นำตัวอย่างมาแช่ในสารละลายผสมระหว่าง H2O2 3% และ KOH 2% ในอัตราส่วน 9:1 เป็นเวลา 1-2 วัน หรือ จนกว่าตัวอย่างจะมีสีขาวซีด โดยอาจเปลี่ยนน้ำยาใหม่หากไม่เห็นฟองอากาศรอบตัวอย่างสัตว์ - ตัวปลามีสีขาวซีด และตาดำเปลี่ยนเป็นสีชาหรือถ้าสีลำตัวและตายังเข้มอยู่ให้แช่ต่อไม่ควรเกิน 2 วัน - ตัวอย่างทั้งหมดต้องพยายามให้ทุกส่วนแช่อยู่ในสารละลายเพื่อให้เกิดปฏิกริยาอย่างมีประสิทธิภาพตลอดทั้งลำตัว ปลา ใช้ถุงใส่น้ำ กดทับตัวอย่างทั้งหมดให้แช่อยู่ในสารละลาย 4. การย้อมสีกระดูกอ่อน - นำตัวอย่างแช่ในสารละลาย alcian blue เพื่อย้อมส่วนที่เป็นกระดูกอ่อน เป็นเวลา 1-2 วัน โดยสังเกตจากบริเวณ โคนครีบและเบ้าตา จะติดสีฟ้าอย่างชัดเจน หรือ สังเกตเห็นสีน้ำเงินติดบริเวณข้อต่อ นำตัวอย่างขึ้นจากสารละลาย 5. การทำให้กล้ามเนื้อใส ***ควรเปลี่ยนน้ำยาทุกวัน*** - นำตัวอย่างมาใส่ในสารละลาย KOH 2% เป็นเวลา 1 วัน หรือจนเริ่มเห็นกระดูกสันหลังของตัวอย่าง ขั้นตอนนี้จะ กินเวลามาก ขึ้นอยู่กับขนาดของตัวอย่าง - เมื่อสังเกตเห็นสารละลายขุ่น ให้เปลี่ยน 2% KOH ใหม่ 1 วัน ให้สังเกตลำตัวปลาจะเริ่มใส มีสีเหลือง/น้ำตาลอ่อน กล้ามเนื้อและเนื้อเยื่อที่มีลักษณะอ่อนนุ่มจะถูกล้างสีออก - ให้เปลี่ยน 2% KOH ใหม่1 วัน แช่จนกระทั่งมองเห็นแนวกระดูกสันหลัง เป็นสีขาว - ให้เปลี่ยน 2% KOH ใหม่1 วัน แช่จนตัวอย่างใสขึ้นโดยเฉพาะเมื่ออยู่ในสารละลาย และมีลักษณะคล้ายวุ้น 6. การย้อมสีกระดูกแข็ง - นำตัวอย่างมาแช่ในสารละลายสีย้อมกระดูกแข็งของ Alizalin red S ซึ่งต้องใช้ Alizarin working solution 6-12 ชั่วโมง หรือ 1 วัน โดยสัตว์ที่มีขนาดใหญ่อาจต้องเปลี่ยนน้ำยาย้อมสีใหม่ ย้อมจนกระดูกติดสีแดงทั่ว

59 ภาพที่ 4.1 การดองใสสัตว์มีกระดูกสันหลัง 7. การทำให้ตัวอย่างใส - นำตัวอย่างมาแช่ในสารละลาย Glycerin + KOH 2% (สารละลาย A, B, C) ในอัตราส่วน 1:3, 1:1 และ 3:1 ตามลำดับ ขั้นตอนละ 1 วัน โดยจะต้องเคลื่อนย้ายตัวอย่างด้วยความระมัดระวัง 8. การเก็บรักษา - นำตัวอย่างมาแช่ในสารละลาย Glycerin ที่ใส่ Thymol แช่ไว้ประมาณ 1 สัปดาห์ - เก็บตัวอย่างไว้ใน Glycerin ในภาชนะที่ปิดสนิท

60 9. ผลการย้อมสีกระดูก - กระดูกอ่อนจะติดสีฟ้าของแอลเซียน บลู (Alcian blue) - กระดูกแข็งจะติดสีแดงของอะลิซาลีน เรด เอส (Alizarin red S) การดองใสสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง: กุ้ง วิธีดำเนินการ 1. นำตัวอย่างล้างด้วยน้ำให้สะอาด 2. แช่ใน FAA นาน 40 นาทีถึง 2 ชั่วโมง 3. ล้าง FAA ออกด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้งๆละ 10 นาที 4. ย้อมสีกระดูกอ่อนด้วย alcian blue solution นาน 36-48 ชั่วโมง หรือตามขนาดของตัวอย่าง โดยสังเกตเปลือกหุ้มตัวติดสีฟ้าประมาณ 7 วัน 5. เปลี่ยนมาแช่ใน 95% alcohol, 70% alcohol, 50 % alcohol, 30 % alcohol และ น้ำกลั่ นตามลำดับ ขั้นตอนละ 2 ชั่วโมง 6. เปลี่ยนมาแช่ใน trypsin solution นาน 6-72 ชั่วโมง แล้วแต่ขนาดตัวอย่าง โดยสังเกตเห็นเนื้อเยื่อใส จากบริเวณขอบด้านนอกของลำตัวเข้าด้านในของลำตัว (ลักษณะเนื้อเยื่อของลำตัวสัตว์มีสีขาวขุ่น)กะให้ เนื้อเยื่อใสประมาณครึ่งหนึ่งของลำตัว และถ้าเนื้อเยื่อใสมากเกินไปอาจจะเปื่อยในขั้นตอนต่อไป 7. เปลี่ยนมาแช่ใน 0.5% KOH ที่เติม alizarin red S ที่ละหยดจนเป็นสารละลายสีม่วงเข้มเพื่อย้อม สีกระดูกแข็ง นาน 24 ชั่วโมง หรือกระดูกแข็งติดสีแดงเข้มตามต้องการ และ 0.5% KOH ช่วยให้เนื้อเยื่อ ลำตัวใสเพิ่มขึ้นอีก 8. เปลี่ยนมาแช่ในสารละล าย 0.5% KOH: glycerol (3:1) นาน 24 ชั่วโมง เปลี่ยนมาแช่ในสารละลาย 0.5% KOH: glycerol (1:1) นาน 24 ชั่วโมง เปลี่ยนมาแช่ในสารละลาย 0.5% KOH: glycerol (1:3) นาน 24 ชั่วโมง 9. เปลี่ยนมาแช่ใน glycerol เก็บรักษาและใส thymol 2-3 เกล็ด เพื่อป้องกันเชื้อรา 10. ผลการย้อมสี เปลือกหุ้มลำตัวอ่อนติดสีฟ้า เปลือกหุ้มลำตัวแข็งติดสีแดง และเนื้อเยื่อลำตัวจะใส

61 ปฏิบัติการเรื่อง การเก็บรักษาโครงร่างแข็งด้วยการหล่อเรซินใส เรซิน (Resins) เดิมเป็นชื่อเรียกสารที่ได้จากยางเหนียวของต้นไม้สามารถละลายได้ในตัวทำละลายเกือบทุกชนิด และนำมาใช้ประโยชน์ได้มากมาย ปัจจุบันเรซินเป็นสารจากการสังเคราะห์เพื่อใช้เรียกแทนพลาสติกเหลวชนิดหนึ่ง มีลักษณะ ข้นคล้ายน้ำมันเครื่อง กลิ่นฉุน แข็งตัวด้วยความร้อนสูง เป็นวัตถุไวไฟชนิดหนึ่ง หลังเซทตัวเต็มที่มีอัตราการหดตัวที่2-8% เร ซิ่นสามารถหล่อขึ้นรูปได้มากมายหลากหลายรูปแบบ รวมทั้งการเคลือบเงา เช่น งานเคลือบกรอบรูปวิทยาศาสตร์ในขณะทำ การหล่อเรซินจะปล่อยกลิ่นสารเคมีออกมาซึ่งมีกลิ่นเหม็นฉุน ดังนั้นสถานที่ทำงานควรเป็นที่โปร่งอากาศถ่ายเทสะดวก ไม่ควร ทำงานในสถานที่ที่เป็นห้องทึบตัน และไม่มีการไหลเวียนของอากาศหรือการระบายอากาศที่ดีพอ เรซินแยกตามลักษณะเนื้อสารได้เป็น 2 แบบ คือ 1. Nonpromoted resin คือเรซิ่นชนิดที่ยังไม่ผสมสารช่วยเร่งปฏิกิริยา (Accelerator: เป็นสารโคบอล์ทที่มีสีม่วง สามารถผสมล่วงหน้าได้)ลักษณะของเนื้อเรซินจะเป็นของเหลวค้นคล้ายน้ำมัน สีใสอมเหลือง จุดเด่นคือมีอายุการเก็บ 3 เดือน (สำหรับประเทศไทยซึ่งมีอากาศร้อนชื้นควรใช้ให้หมดภายใน 1เดือน เพราะเมื่อเข้าสู่เดือนที่ 2-3 เรซิ่นจะเริ่มมีความหนดข้น ขึ้นเรื่อยๆ) และยังสามารถประยุกต์สูตรได้อีกมากมาย เพื่อให้เหมาะสมกับรูปแบบงานต่างๆ 2. Promote resin คือ เรซินชนิดที่ผสมสารช่วยเร่งปฏิกิริยามาแล้ว ลักษณะของเนื้อเรซินจะเป็นของเหลวค้นคล้าย น้ำมันเครื่อง แต่มีสีชมพูบานเย็น เมื่อนำมาใช้งานเพียงเติมสารเร่งปฏิกิริยาหรือตัวทำให้แข็ง (Hardener: ของเหลวใส อัตราส่วนในการใช้ผสม 1-2% ที่นิยมใช้คือ Methyl Ethyl Ketone) ลงไป ในเรื่องของสีเรซินนั้นบางบริษัทผู้ผลิตอาจมีการใช้ สารช่วยเร่งที่แตกต่าง ดังนั้นเรซินชนิดผสมสารช่วยเร่งบางตัวจะมีสีคล้ำ และสำหรับชนิดที่ใช้กับงานหล่อใสแล้วเรซินจะมีสีใส อมน้ำเงินอ่อน จุดเด่นคือใช้งานง่ายและคล่อง ไม่ยุ่งยาก แต่ข้อเสียคือมีอายุการเก็บสั้น อายุการเก็บไม่เกิน 2 เดือน ในการใช้ งานจริงควรใช้ให้หมดภายใน 1 เดือน ลักษณะการใช้งานของเรซินสามารถนำไปใช้งานได้มากมายหลายกลุ่มงาน ได้แก่ 1. กลุ่มงานหล่อ (casting) เช่น หล่อพระ ของชำร่วย ตุ๊กตา กระดุม แก้วเทียม ฯลฯ 2. กลุ่มงานเคลือบ (laminate) เช่น งานเคลือบกรอบรูปวิทยาศาสตร์ 3. กลุ่มงานขึ้นรูปแบบ (molding) เช่น การผลิตงานไฟเบอร์กลาส หรือ FRP (fiberglass reinforce plastic) พลาสติกเสริมแรงด้วยใยแก้ว การแข็งตัวของเรซิ่น สามารถแข็งตัวได้หลายวิธีดังนี้ 1. ใช้ catalyst หรือตัวทำให้แข็ง + ความร้อน 2. ใช้ catalyst หรือตัวทำให้แข็ง + ตัวช่วยเร่งปฏิกิริยา promote/accelerator ที่อุณหภูมิห้อง 3. ใช้วิธีอื่นๆ เช่น แสงอัลตราไวโอเลต อิเล็คตรอน แสงแดด และความร้อน โดยทั่วไปการแข็งตัวของเรซิ่นแบ่งออกเป็น 2 ช่วงคือ ช่วงที่ 1 gel time คือช่วงหลังจากเติมตัว catalyst แล้วจนเร ซิ่นจับตัวเป็นวุ้น ช่วงที่ 2 cure time คือช่วงที่เรซิ่นแข็งตัวเต็มที่และเป็นช่วงที่เรซิ่นเย็นตัวลงหลังจากที่มีความร้อนสูงในขณะ ทำปฏิกิริยา องค์ประกอบที่มีผลต่อการแข็งตัวของเรซิ่น 1. อุณหภูมิ อุณหภูมิสูงเรซิ่นแข็งตัวเร็วกว่าอุณหภูมิต่ำ 2. ปริมาณตัวเร่งฯ และ ตัวช่วยเร่งฯ ปริมาณที่มากแข็งตัวเร็วกว่าปริมาณที่น้อย 3. ความชื้นหรือน้ำ ความชื้นสูงการแข็งตัวของเรซินจะช้าลง ผิวงานขึ้นฝ้ามัว โดยปกติปริมาณน้ำที่อยู่ในเรซินจะต้อง มีค่าไม่เกิน 0.05% 4. ปริมาณออกซิเจน ออกซิเจนเป็นตัวป้องกันการแข็งตัวของเรซิน ถ้าปริมาณออกซิเจนสูง เช่นการกวนเรซินเป็น นาน การแข็งตัวของเรซิ่นจะช้าลง และออกซิเจนมีประโยชน์มากในเรื่องการยืดอายุการเก็บของเรซิ่น หากเริ่มเก็บเรซิ่นไว้นาน ขึ้น ควรสร้างออกซิเจนให้เกิดในถังหรือปีบด้วยการกลิ้งถังไปมา เพื่อให้เรซิ่นข้างในเกิดการเคลื่อนไหว จะเกิดออกซิเจน และ จะทำให้เรซินมีอายุการเก็บเพิ่มขึ้นอีกเล็กน้อย ด้วยคุณสมบัติที่ดีของเรซินในการให้เนื้อแข็ง ใส เงา มีความเบา แข็งแรงเหนียว และไม่เปราะจึงเหมาะที่จะนำมา เก็บรักษาตัวอย่างทางชีววิทยาที่ความเปราะบาง แตกหักได้ง่าย ไม่ว่าจะเป็นตัวอย่างพืชที่ทำแห้ง หรือสัตว์มีกระดูกสันหลัง

62 และไม่มีกระดูกสันหลัง ในปฏิบัติการนี้นักศึกษาจะได้ลงมือหล่อเรซินใสเพื่อเก็บรักษาตัวอย่างแมลงที่ผ่านกระบวนการทำให้ แห้งและจัดท่าทางที่เหมาะสมมาแล้ว อุปกรณ์ 1. แม่พิมพ์แบบต่างๆ (ผิวหน้าควรเรียบจะทำให้ชิ้นงานใส) 2. ภาชนะสำหรับผสมเรซิน (แก้วพลาสติกแบบนิ่ม) 3. ไม้ผสมเรซิน (ไม้ลูกชิ้น ไม้ตะเกียบ) 4. ถุงมือ 5. ผ้าปิดจมูก 6. สีน้ำมัน 7. หลอดหยด สารเคมีที่ใช้ 1. เรซินใส (ของเหลวความเข้มข้นสูง) 2. ตัวเร่ง (สำหรับเร่งปฏิกิริยาให้เกิดการแข็งตัว) 3. โคบอล์ท (Cobalt) วิธีดำเนินการ 1. การผสมเรซิน ให้นักศึกษาผสมเรซินและตัวเร่งตามอัตราส่วนต่อไปนี้ เรซินใส (มิลลิลิตร) สารตัวเร่ง (หยด) ความเร็วการแข็งตัว 30 20 5 นาที 30 15 10 นาที 30 10 45 นาที 30 5 > 1 ชั่วโมง 2. แบ่งสัดส่วนของแม่พิมพ์ออกเป็น 3 ส่วน ดังนี้ - ส่วนที่ 1 ล่างสุด (หรือชั้นด้านหน้า) ให้มีสัดส่วน 1:5 ของปริมาตรแม่พิมพ์ - ส่วนที่ 2 กลาง (หรือชั้นใส่ตัวอย่าง) ให้มีสัดส่วน 3:5 ของปริมาตรแม่พิมพ์ - ส่วนที่ 3 บนสุด (หรือชั้นฐาน) ให้มีสัดส่วน 1:5 ของปริมาตรแม่พิมพ์ 3. แบ่งการผสมเรซินออกเป็น 3 ส่วน ดังนี้ - ส่วนที่ 1 ใช้เรซิน : ตัวเร่ง = 10 มล. : 4 หยด - ส่วนที่ 2 ใช้เรซิน : ตัวเร่ง = 50 มล. : 20 หยด - ส่วนที่ 3 ใช้เรซิน : ตัวเร่ง = 20 มล. : 12 หยด 4. การเทเรซิน 4.1 เรซินส่วนที่ 1 เมื่อผสมเรซินตามสูตร เรซิน : ตัวเร่ง = 10 มล. : 4 หยด โดยใช้ไม้คนผสมเบาๆ เพื่อไม่ให้เกิดฟองอากาศ มากเกินไป แล้วเทลงในแม่พิมพ์ที่สะอาดให้เป็นส่วนที่ 1 (ส่วนฐาน) 4.2 ตั้งทิ้งไว้โดยสังเกตุ เรซินจะเริ่มหนืดอยู่ในสภาวะเจล (Gel time) อาจใช้เวลาผ่านไป 5-10 นาที 4.3 ใส่ชิ้นตัวอย่างแมลงที่ผ่านกระบวนการเก็บรักษารูปแบบต่างๆ แล้ว โดยให้นำส่วนหลังตัวอย่างติดกับเรซินส่วนที่ 1 เพื่อใช้ เป็นกาวยึดไม่ให้ตัวอย่างลอย เมื่อเทเรซินชั้นต่อไป และวางในตำแหน่งกึ่งกลางแม่พิมพ์ ไม่เอียงหรือบิดเบี้ยวไปมา

63 4.4 เมื่อเรซินส่วนที่ 1 เริ่มแข็งตัว (Cure time) ให้เตรียมเรซินส่วนที่ 2 เมื่อผสมเรซินตามสูตร เรซิน : ตัวเร่ง = 50 มล. : 20 หยด โดยเททับชิ้นตัวอย่างแมลงที่ใส่ไปแล้วให้ท่วม หากเกิดฟองอากาศแทรกตัวในเนื้อเรซินให้ใช้ไม้จิ้มฟันเขี่ยให้ฟองหายไป ก่อนเรซินจะอยู่ในสภาวะเจล 5. ตั้งทิ้งไว้โดยสังเกตุ เรซินจะเริ่มหนืดมากขึ้นซึ่งอยู่ในสภาวะเจล อาจใช้เวลาผ่านไป 10-20 นาที(ไม่ต้องรอให้ถึง cure time เทชั้นต่อไปได้เลย เพราะเรซินจะหดตัวเล็กน้อยจะทำให้เกิดช่องว่าง และเมื่อเทชั้นที่ 3 จะเกิดการปนเปื้อนไปเคลือบชั้น 1 และ 2 ได้) 6. ให้เตรียมเรซินส่วนที่ 3 เมื่อผสมเรซินตามสูตร เรซิน : ตัวเร่ง = 20 มล. : 12 หยด และให้เติมสีน้ำมันผสมลงไป ให้ได้สี ตามที่ต้องการ (ให้สีของฐานเข้มและตัดกับสีของตัวอย่างแมลงชัดเจน) เพื่อเป็นส่วนฐานของบล็อกเรซินแมลง 7. ตั้งทิ้งไว้โดยสังเกตุ เรซินจะเริ่มหนืดมากขึ้นซึ่งอยู่ในสภาวะเจล อาจใช้เวลาผ่านไป 45 นาที ถึง 1 ชั่วโมง หรือทิ้งไว้ข้ามคืน เรซินจะแข็งตัว จึงสามารถแกะชิ้นตัวอย่างออกจากแม่พิมพ์ได้ 8. ระวังห้ามจับบริเวณหน้าบล็อกเรซิน เพราะอาจมีรอยนิ้วมีติดและบดบังตัวอย่างแมลงได้ 9. เก็บเรซินที่แข็งตัวในในภาชนะที่ปิดมิดชิดและติดชื่อแมลง ทั้งชื่อสามัญและชื่อวิทยาศาสตร์ให้เรียบร้อย