ผลของสารควบคุมการเจริญเติบโตต่อการเพาะเลี้ยงฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of fire) ในสภาพปลอดเชื้อ Effects of Plant Growth Regulators on In Vitro Culture of Philodendron sp. (Ring of fire) นางสาวจิตรกัญญา ภูสุโคตร นายบูรพา พรมพิลา สาขาวิชาวิทยาศาสตร์ทั่วไปและชีววิทยา คณะครุศาสตร์ มหาวิทยาลัยราชภัฏอุดรธานี ประจำปีการศึกษา 2565
ผลของสารควบคุมการเจริญเติบโตต่อการเพาะเลี้ยงฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of fire) ในสภาพปลอดเชื้อ Effects of Plant Growth Regulators on In Vitro Culture of Philodendron sp. (Ring of fire) นางสาวจิตรกัญญา ภูสุโคตร นายบูรพา พรมพิลา สาขาวิชาวิทยาศาสตร์ทั่วไปและชีววิทยา คณะครุศาสตร์ มหาวิทยาลัยราชภัฏอุดรธานี ประจำปีการศึกษา 2565
ก เรื่อง ผลของสารควบคุมการเจริญเติบโตต่อการเพาะเลี้ยงฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of fire) ในสภาพปลอดเชื้อ ผู้ทำวิจัย นางสาวจิตรกัญญา ภูสุโคตร นายบูรพา พรมพิลา สาขาวิชา วิทยาศาสตร์ทั่วไปและชีววิทยา ปีการศึกษา 2565 อาจารย์ที่ปรึกษา ดร.วัลยา มงคลสวัสดิ์ บทคัดย่อ การศึกษาผลของ Benzyladenine (BA) และ Thidiazuron (TDZ) ต่อการเพาะเลี้ยงต้น อ่อนของฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย โดยนำต้นอ่อนขนาด 0.5–1 เซนติเมตร เพาะเลี้ยงบนอาหาร สังเคราะห์สูตร MS ที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต BA และ TDZ ที่ระดับความเข้มข้น 0, 1.0, 2.0, 4.0 และ 8.0 มิลลิกรัมต่อลิตร เพาะเลี้ยง 12 สัปดาห์ พบว่า สูตรอาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้น 2 และ 4 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดต้นอ่อนได้มากที่สุด 24.57 และ 27.31 หน่อ/ต้น ตามลำดับ และสูตรอาหาร MS ที่ไม่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตสามารถชักนำให้เพิ่ม ความสูงของต้น จำนวนราก ความยาวรากและจำนวนใบมากที่สุด 1.44, 0.44, 0.54 และ 5.98 ตามลำดับ คำสำคัญ : ฟิโลเดนดรอน, ใบเลื่อยด่าง, ฮอร์โมน Benzyladenine (BA), ฮอร์โมน Thidiazuron (TDZ), การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
ข Title Effects of Plant Growth Regulators on In Vitro Culture of Philodendron sp. (Ring of fire) Authors Chitkanya Phusukhod. Bourapa Promphila. Program Sciences (Biology) Academic Year 2022 Adviser Wanlaya Mongkolsawat, Ph.D. ABSTRACT The effect of N 6 -benzyladenine (BA) and Thidiazuron (TDZ) on growth of Philodendron (Ring of fire), used completely randomized design (CRD) 9 treatment, 15 repetitions. Microshoots (0.5-1 cm) were cultured on MS (Murashige and Skoog, 1962) medium supplemented with various concentrations (0, 1, 2, 4 and 8 mg/l) of N 6 - BA and TDZ was studied for 12 weeks. The highest number of shoots per explant (24.57 shoots and 27.31 shoots) was observed on the MS medium supplemented with 2 and 4 mg/l BA, respectively. MS medium without PGR had the highest shoot length at 1.44 cm, highest root number at 0.44 roots per explant, highest lengths of roots at 0.54 cm. and highest leaf number at 5.98 leaf per explant. Keyword : Philodendron, Benzyladenine (BA), Thidiazuron (TDZ), Plant tissue culture
ค กิตติกรรมประกาศ โครงงานวิจัยฉบับนี้เสร็จสมบูรณ์ได้เพราะได้รับความกรุณาจากคำแนะนำและช่วยเหลือ ตลอดจนแก้ไขข้อบกพร่อง ปรับปรุงด้วยความละเอียดและเอาใจใส่อย่างดียิ่ง จาก ดร. วัลยา มงคล สวัสดิ์ และ ดร. นิภาวรรณ ลาภบุญเรือง ที่ได้สละเวลามาให้ความรู้แลอบรมสั่งสอนชี้แนะแนวทางแก่ ศิษย์ผู้วิจัยขอขอบคุณเป็นอย่างสูง ขอขอบคุณมหาวิทยาลัยราชภัฏอุดรธานี (ศูนย์สามพร้าว) คณะวิทยาศาสตร์ สาขาวิชา ชีววิทยาที่ให้ความอนุเคราะห์ยืมสถานที่ในการวิจัย ห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ SCB1 ชั้น 3 มหาวิทยาลัย ราชภัฏอุดรธานี (ศูนย์สามพร้าว) และยังให้ความอนุเคราะห์ในการยืมเครื่องมือ สารเคมีและอุปกรณ์ เครื่องแก้วที่เกี่ยวข้องในการวิจัยเพื่อให้ได้ข้อมูล ผู้วิจัยได้ตระหนักและซาบซึ้งในความกรุณาของทุกๆ ท่านเป็นอย่างยิ่ง สุดท้ายนี้ขอกราบขอบพระคุณบิดา มารดา และคุณตาคุณยาย รวมถึงญาติทุกท่านเป็น อย่างสูงที่ให้ความอนุเคราะห์สนับสนุนเป็นกำลังใจ และเป็นแรงผลักตันในการวิจัยครั้งนี้ให้สำเร็จ ลุล่วงไปได้ด้วยดี นางสาวจิตรกัญญา ภูสุโคตร นายบูรพา พรมพิลา 2565
สารบัญ หน้า บทคัดย่อภาษาไทย ก บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ข กิตติกรรมประกาศ ค สารบัญตาราง ช สารบัญภาพ ซ บทที่ 1 บทนำ 1 1.1 ที่มาและความสำคัญของปัญหา 1 1.2 วัตถุประสงค์ของงานวิจัย 2 1.3 ขอบเขตงานวิจัย 2 1.4 ประโยชน์ที่จะได้รับ 3 1.5 นิยามศัพท์เฉพาะ 3 บทที่ 2 เอกสารที่เกี่ยวข้อง 4 2.1 พฤกษศาสตร์ของพืชวงศ์ Araceae 4 2.2 พืชสกุลฟิโลเดนดรอน 4 2.3 ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ของฟิโลเดนดรอน 4 2.4 การปลูกพืชสกุลฟิโลเดนดรอน 5 2.5 การขยายพันธุ์ 5 2.6 ประวัติของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 6 2.7 อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและวิธีเตรียมอาหาร 6 2.8 เทคนิคที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 12 2.9 ชนิดอาหารที่ใช้ 15 2.10 ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช 16 2.11 หลักที่ควรคำนึงในการใช้ห้องปฏิบัติการ 18 2.12 ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื้อ 19 2.13 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 21 บทที่ 3 วิธีดำเนินการวิจัย 23 3.1 สารเคมีและสารอินทรีย์ที่ใช้ในการวิจัย 23 3.2 เครื่องมือที่ใช้ในการวิจัย 24
สารบัญ(ต่อ) 3.3 วิธีที่ใช้ในการเก็บรวบรวมข้อมูล 25 3.4 วิธีการวิเคราะห์ข้อมูล 25 บทที่ 4 ผลการวิจัย 29 4.1 ผลจากการศึกษาสารควบคุมการเจริญเติบโต 29 ที่เหมาะสมบนอาหารสังเคราะห์สูตร MS ต่อ การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย บทที่ 5 อภิปรายผลและสรุป 39 5.1 อภิปรายผลการวิจัย 39 5.2 สรุปผลการวิจัยและข้อเสนอแนะ 40 เอกสารอ้างอิง 44 ภาคผนวก 48 ประวัตินักวิจัย 63
ช สารบัญตาราง ตารางที่ หน้า 1.1 ระยะดำเนินงานวิจัย 2 2.1 ตัวอย่างปริมาณของฮอร์โมนที่ใส่ในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 14 4.1 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตร 30 อาหาร MS ที่เติม BA ที่ระดับความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ 4.2 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตร 34 อาหาร MS ที่เติม TDZ ที่ระดับความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ 4.3 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตร 38 อาหาร MS ที่เติม BA และ TDZ ที่ระดับความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์
ซ สารบัญภาพ ภาพที่ หน้า 1.1 ต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) 2 4.1 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรอาหาร 31 MS ร่วมกับ BA ทีระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ 4.2 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยบนสูตรอาหาร MS 32 ที่เติม BA ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆที่แตกต่างกันเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ 4.3 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรอาหาร 35 MS ร่วมกับ TDZ ทีระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ 4.4 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยบนสูตรอาหาร MS 36 ที่เติม TDZ ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆที่แตกต่างกันเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ 4.5 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยบนสูตรอาหาร MS 38 ที่เติม BA และ TDZ ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆที่แตกต่างกันเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์
บทที่ 1 บทนำ 1.1 ที่มาและความสำคัญของปัญหา ฟิโลเดนดรอน (Philodendron) จัดอยู่ในวงศ์ Araceae ซึ่งมีมากกว่า 500 ชนิด มีถิ่นกำเนิดอยู่ ในเขตร้อนและกึ่งร้อนของอเมริกาและหมู่เกาะอินเดียตะวันตก (Mayo et al., 1997) ลักษณะทรง ต้นและใบมีรูปร่างหลากหลายแยกตามสายพันธุ์ เช่น ฟิโลเดนดรอนก้านส้ม (P. Billietiae Croat) ก้านใบจะเป็นสีส้ม และมีใบรูปหอกขนาดใหญ่คล้ายลูกศร ฟิโลเดนดรอน ซานาดู (P. xanadu) ลำ ต้นสูงประมาณ 60-120 เซนติเมตร ใบรูปไข่ เป็นแฉกลึกเกือบถึงกลางใบคล้ายกับฟิโลเดนดรอนใบ มะละกอ (P. Selloum) แต่ขอบใบและผิวใบเรียบ เป็นมันสีเข้มเขียว หนา และเห็นเส้นใบที่ชัดเจน ฟิ โลเดนดรอน นิยมปลูกเป็นไม้ประดับ เติบโตได้ดีทั้งที่มีแดดรำไรและในร่ม สามารถนำไปใช้ในการ ประดับตกแต่งบ้าน สวน และอาคารสถานที่ ใบใช้จัดแจกันหรือช่อดอกไม้ในโอกาสต่างๆ ซึ่งไม้ ประดับชนิดนี้มีความทนทานต่อสภาพแวดล้อม คงความสวยงามเอาไว้ได้นาน แมลงไม่รบกวนมาก จึงเป็นที่นิยมทั่วไป ในปัจจุบันความต้องการไม้ตัดใบของตลาดทั้งในประเทศและนอกประเทศยังคงมี มาก ถึงแม้ว่าไม้ตัดใบจะมีความสำคัญรองจากไม้ดอกก็ตาม ในประเทศไทยมีการส่งออกไม้ประดับไป ยังประเทศญี่ปุ่น อิตาลี และเนเธอร์แลนด์ เป็นต้น ในปี 2559 มูลค่ารวม 47,488,935 บาท สำหรับฟิ โลเดนดรอน มีการส่งออกในรูปของใบไปยังประเทศญี่ปุ่น แคนาดาและอเมริกา เป็นต้น มูลค่ารวม 949,353 บาท (กรมวิชาการเกษตร, 2559) จากความต้องการใช้ฟิโลเดนดรอนในรูปแบบของไม้ กระถางและไม้ตัดใบที่เพิ่มมากขึ้น ส่งผลให้มีจำนวนน้อยลง และไม่เพียงพอต่อความต้องการของ ตลาด ปัจจุบันเรื่องของพืชพรรณต่าง ๆ กำลังมาแรงเป็นกระแสนิยม โดยเฉพาะไม้ด่างที่หลาย ๆ บ้าน เลือกปลูกเอาไว้ ซึ่งราคาจัดว่าไม่ธรรมดา ทั้งราคาสูงปานกลาจนถึงสูงมาก ทั้งนี้ บางต้นก็มีอาการ ด่างมาจากการปรับปรุงพันธุ์การกลายพันธุ์ เช่น ฟิโลเดนดรอนด่าง มอนสเตอร่าด่าง พลูด่าง ไทรด่าง ฯลฯ แต่บางต้นก็มีปัจจัยที่ทำให้เกิดความด่างตามธรรมชาติ (สำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร, 2564) ทว่าไม้แต่ละต้นเกิดด่างในธรรมชาตินั้นมีสาเหตุจากหลายปัจจัยและบางครั้งไม่ใช่การด่างแท้ ของพืชรวมถึงอัตราการด่างเองตามธรรมชาตินั้นเกิดขึ้นได้น้อยและเพิ่มจำนวนได้ช้า
2 เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จึงเป็นวิธีการขยายพันธุ์วิธีหนึ่ง ที่ทำให้ได้ต้นพันธุ์จำนวนมากโดยใช้ ระยะเวลาไม่นาน จุดเด่นของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อนอกจากการขยายพันธุ์แล้วได้ต้นพันธุ์จำนวนมาก ในระยะเวลาอันรวดเร็วแล้ว ต้นพันธุ์ที่ได้ยังมีพันธุกรรมเหมือนเดิมทุกประการ ปลอดโรคและแมลง อีกด้วย หากต้องการเพิ่มปริมาณพันธุ์พืชให้เพียงพอต่อความต้องการของผู้บริโภค เทคนิคการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อถือเป็นหนึ่งทางเลือกที่สามารถแก้ไขปัญหาดังกล่าวได้ ในปัจจุบันมีรายงาน การศึกษาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของฟิโลเดนดรอนหลายชนิด เช่น การเพิ่มจำนวนยอดและชักนำให้ เกิดรากของฟิโลเดนดรอนซานาดูด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (เยาวพา จิระเกียรติกุล, 2549) ผลของ BA ร่วมกับ NAA และการฉายแสงรังสีแกมมาที่มีผลต่อฟิโลเดนดรอนเชอร์รี่เรด ในสภาพปลอดเชื้อ (สิเรียม ทองใบใหญ่, 2561) แต่ยังไม่พบว่ามีการรายงานการศึกษาในฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยด่าง Philodendron sp. (Ring of Fire) ดังนั้น ผู้วิจัยจึงสนใจที่จะศึกษาผลของ BA และ TDZ ต่อการเจริญเติบโตของฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of Fire) ในสภาพปลอดเชื้อ เพื่อเป็นการเพิ่มจำนวนและการอนุรักษ์พืชต่อไปในอนาคต 1.2 วัตถุประสงค์ของงานวิจัย เพื่อศึกษาผลของ BA และ TDZ ต่อการเจริญเติบโตของต้นอ่อนฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of Fire) ในสภาพปลอดเชื้อ 1.3 ขอบเขตงานวิจัย 1.3.1 ขอบเขตด้านพื้นที่ ห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ SCB 1304 คณะวิทยาศาสตร์ SCB1 มหาวิทยาลัยราชภัฏอุดรธานี ศูนย์สามพร้าว จังหวัดอุดรธานี 1.3.2 ขอบเขตด้านเนื้อหา ศึกษาผลของสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ,TDZ ต่อการเจริญเติบโตของฟิโลเดนดรอน ใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of Fire) ในสภาพปลอดเชื้อ 1.3.3 ขอบเขตด้านระยะเวลา ระยะเวลาในการทำวิจัยระหว่างวันที่ 11 สิงหาคม 2565 – 22 มรกราคม 2566
3 ตารางที่ 1.1 ระยะเวลาดำเดินงานวิจัย 1.4 ประโยชน์ที่จะได้รับ 1.4.1 ทราบถึงอิทธิพลของฮอร์โมน BA และ TDZ ที่เหมาะสมต่อการเจริญเติบโตของฟิโลเดน ดรอนใบเลื่อย Philodendron sp. (Ring of Fire) 1.4.2 เป็นข้อมูลพื้นฐานสำหรับการศึกษาพัฒนาพืชที่อยู่ในวงศ์เดียวกันหรือใกล้เคียงกันได้ต่อไป 1.5 นิยามศัพท์ 1.5.1 ฟิโล เป็นชื่อสั้นๆ ที่เรียกกันโดยทั่วไป ชื่อเต็มคือ ฟิโลเดนดรอน Philodendron มีชื่อมา จากภาษากรีก 2 คำคือ Phileo แปลว่า รัก และ Dendron แปลว่าต้นไม้ ซึ่งสื่อถึงลักษณะการอยู่ อาศัยที่ชอบอยู่ตามต้นไม้ใหญ่ ทั้งอิงอาศัยและเติบโตเป็นกอ แม้ว่าจะมีถิ่นกำเนิดจากจากทวีปอเมริกา ใต้แต่ก็ปรับตัวรับแสงแดดในเมืองไทยได้ และหลายชนิดก็เป็นที่คุ้นหน้าคุ้นตากันดี 1.5.2 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (Plant Tissue Culture) คือการนำเอาส่วนใดส่วนหนึ่งของพืช ไม่ว่าจะเป็นส่วนอวัยวะใดอวัยวะหนึ่ง ที่เป็นกิ่ง ตา หรือส่วนเนื้อเยื่อ มาเลี้ยงในอาหารวิทยาศาสตร์ที่ ประกอบด้วย แร่ธาตุ วิตามิน และสารควบคุมความเจริญเติบโต ภายใต้สภาพปลอดเลินทรีย์ และอยู่ ในสภาวะควบคุมน้ำตาล อุณหภูมิ แสง ความชื้น โดยส่วนของพืชที่นำมาเลี้ยงนี้จะสามาถเติบโต พัฒนาได้หลายรูปแบบ ไม่ว่าจะพัฒนาเป็นส่วนอวัยวะ เกิดเป็นกลุ่มเชลล์ที่เรียกว่า แคลลัส หรือ กิจกรรม ระยะเวลาในการดำเนินงานวิจัย ปี 2565 ก.ค ส.ค ก.ย ต.ค พ.ย ธ.ค ม.ค ก.พ มี.ค ศึกษาเอกสารและ งานวิจัย ศึกษาขั้นตอนและ แผนการดำเนินการ ดำเนินการวิจัย เก็บรวบรวมข้อมูลและ บันทึกผลการทดลอง วิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ เขียนรูปแบบรายงาน เสนอผลการดำเนินงาน
4 คัพภะ (ต้นอ่อนขนาดเล็ก) ที่เรียกว่า เอ็มบริโอ ซึ่งในที่สุดจะสามารถบังคับให้ส่วนต่าง ๆ เหล่านี้เกิด เป็นต้นใหม่ที่มีรากที่สมบูรณ์สำหรับการนำไปปลูกลงดินต่อไปได้ 1.5.3 การขยายพันธุ์พืช (Plant propagation) กระบวนการที่ทำให้เกิดการเพิ่มปริมาณต้นพืชให้ มากขึ้น โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อดำรงสายพันธุ์พืชชนิดต่าง ๆ ไว้มิให้สูญพันธุ์ เป็นการกระจายพันธุ์พืช พันธุ์ดีเพื่อเพิ่มปริมาณผลผลิต ทั้งนี้รวมถึงการผลิตต้นพันธุ์พืชพันธุ์ดีชนิดต่าง ๆ เป็นการค้าด้วย 1.5.4 ฮอร์โมนพืช (Plant hormones) สารอินทรีย์ที่พืชสร้างขึ้นเองตามธรรมชาติในบริเวณ อวัยวะหรือเนื้อเยื่อส่วนใดส่วนหนึ่งของต้นพืช ก่อนทำการเคลื่อนย้ายสารดังกล่าวไปยังเนื้อเยื่อ เป้าหมาย เพื่อส่งสัญญาณในการเริ่มกระบวนการสร้าง ทำการควบคุม หรือเปลี่ยนแปลงส่วนต่าง ๆ ของพืช ทั้งด้านการเจริญเติบโตการงอกของเมล็ดการออกดอกออกผลและการผลัดใบรวมไปถึงการ ยับยั้งการเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยาภายในต้นพืช
บทที่ 2 เอกสารที่เกี่ยวข้อง 2.1 พฤกษศาสตร์ของพืชวงศ์ Araceae Hetterscheid and Ittenbach (1996) กล่าวว่า พืชวงศ์บอน (Araceae) เป็นพืชอวบน้ำที่มี ลำต้น ใต้ดินที่หลากหลายแบบ เช่น หัวแบบเผือก เหง้า ไหล และแบบมันฝรั่ง บางชนิดมีลำต้นเหนือ ดินแบบเลื้อยพัน บางชนิดเป็นแบบตั้งตรง ในลำต้นทุกส่วนจะมีน้ำยางใส เมื่อสัมผัสถูกผิวหนังมักจะ ทำให้เกิดอาการคัน ชอบอาศัยอยู่ ในบริเวณที่ขึ้นแฉะ บางชนิดเป็นพืชน้ำ ลำต้นใต้ดินเก็บสะสมแป้ง ใบ เป็นใบเดี่ยวหรือใบประกอบ มีรูปร่างหลายแบบ ใบมีขนาดใหญ่ ก้านใบยาว เจริญจากลำต้นใต้ดิน ก้านใบ ด้านบนเป็นร่อง ด้านล่าง เป็นสันนูนใหญ่ ช่อดอกแบบช่อเชิงลดมีกาบ ดอกย่อยมีขนาดเล็ก ดอกเพศผู้อยู่ทางด้าน บนของช่อดอก ดอกเพศมียอยู่ทางด้านล่างของช่อดอก ผลเป็นแบบผลสดมีเนื้อ นุ่มและมีเมล็ดอยู่ภายใน (Department of Environment and Water Resources, 2007) ประเทศ ไทยมีการนำพืชวงศ์ Araceae มาใช้ ประโยชน์ในแง่ของ ไม้ดอกไม้ประดับ พืชอาหาร และพืช สมุนไพรหลายชนิด เช่น บอน เผือก คูน ว่าน ชันหมาก และบุกชนิดต่างๆ 2.2 พืชในสกุลฟิโลเดนดอน ไทยเกษตรศาสตร์ (2012) กล่าวไว้ว่า ฟิโลเดนดรอน (Philodendron) อยู่ในตระกูล Arum หรือวงศ์ Araceae พบขึ้นอยู่ตามธรรมชาติในหมู่เกาะอินเดียตะวันตก คำว่า Philodendron มาจาก คำว่า Phileo แปลว่า รัก ชอบ และ dendron แปลว่าต้นไม้ ซึ่งมีความหมายว่าเป็นพันธุ์ไม้ที่ชอบ ขึ้นอยู่กับต้นไม้ตามนิสัยชอบเลื้อยพันต้นไม้ใหญ่อยู่เป็นถิ่นกำเนิด Philodendron อยู่ในตระกูล Arum จึงทำให้ดอกมีรูปร่างเป็นกาบและมีปลีเหมือนพวกไม้ในตระกูล Arum ทั่ว ๆ ไป Philodendron จึงเป็นไม้ใบหรือไม้ประดับที่ดูรูปทรงของต้น และใบมากกว่าดูดอก ตามธรรมชาติ ชอบขึ้นอยู่กับต้นไม้ใหญ่มีรากอากาศงอกออกยาว ส่วนมากเป็นพันธุ์ไม้ที่ชอบเลื้อย ชอบไต่ตามสิ่งที่ อยู่ใกล้เคียง โดยใช้รากอากาศ (aerial roots) เกาะพยุงต้น ลักษณะของใบมีรูปร่างแปลก ๆ แต่ ส่วนมากมีใบเป็นรูปหัวใจ บางชนิดใบยาวรี หรือบางชนิดใบมีรูปลักษณะคล้ายลูกศร ความยาวของใบ นั้นอาจมีความยาวตั้งแต่ 3 นิ้วถึง 3 ฟุต ส่วนมากมีสีเขียวสด บางชนิดมีสีชมพู ทองแดงอยู่ใต้ใบด้วย ใบอ่อนบางชนิดมีสีชมพู หรือสีแดงอ่อนเมื่อใบแก่ก็เปลี่ยนเป็นสีเขียว หรือบางชนิดมีใบคล้ายใบลั่นทม เส้นใบสีแดง หรือชมพู พื้นใบมีสีเขียวอ่อน บางชนิดใบมีแฉกลึกเกือบถึงเส้นกลางใบ หรือบางชนิดก็ไม่ มีลำต้นขึ้นสูงจากพื้นดิน
7 2.3 ลักษณะทางพฤกษาศาสตร์ของฟิโลเดนดรอน ระบบฐานข้อมูลเกษตรดิจิตอล (2561) กล่าวถึงลักษณะทางพฤกษาศาสตร์ของฟิโลเดน ดรอน ใบเลื่อยด่างไว้ว่า ฟิโลเดนดรอน ใบเลื่อย หรือฟิโลมีถิ่นกำเนิดอยู่ในอเมริกาใต้ บราซิล ลักษณะเป็นไม้ล้มลุก มี อายุหลายปี เป็นพืชอิงอาศัยที่มีรากอากาศ ใบ เป็นใบเดี่ยว เรียงเวียน รูปใบหอกแกมรูปไข่ กว้าง ประมาณ 9.5 เซนติเมตร ยาว 25.5-29.5 เซนติเมตร ปลายเรียวแหลม โคนรูปหัวใจ ขอบหยักแบบ ขนนก หยักไม่สมมาตร ปลายหยักเว้ามนขนาดเท่า ๆ กัน ลึกเกือบถึงครึ่งหนึ่งของความกว้างใบ ใบ หนา เรียบ แผ่นใบด้านบนสีเขียว ก้านใบสีเขียวอมเหลือง ยาว 15-23 เซนติเมตร ด้านบนเป็นสัน เหลี่ยมตลอดทั้งก้านใบ ด้านใต้กลมมน โคนก้านใบเป็นร่องเล็กน้อย เส้นกลางใบด้านหลังนูน ปลอก หุ้มยอดสีเขียวอมส้ม ดอก เป็นช่อแบบช่อเชิงลดมีกาบ ภาพที่ 1.1 ต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) 2.4 การปลูกพืชสกุล Philodendron sp. ระบบฐานข้อมูลเกษตรดิจิตอล มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ (2021) กล่าวถึงการปลูกพืชสกุล Philodendron ไว้ว่าการปลูกฟิโลเดนดรอน ควรใช้ดินร่วนหรือดินที่สามารถระบายน้ำได้ดี เพื่อ ป้องกันการเน่าเสียของรากหากเกิดน้ำขัง ส่วนมากนิยมปลูกในกระถางนำไปตั้งในบริเวณที่มีแสงแดด ส่องถึงได้รำไร หรือบริเวณที่มีแสงแดดที่ไม่จัดเกินไป เช่น ริมหน้าต่าง หรือใต้ต้นไม้ขนาดใหญ่ที่มีร่ม เงา เนื่องจากฟิโลเดนดรอนเป็นพืชที่ไม่ชอบแสงแดดจัด หากได้รับแสงแดดมากเกินไปจะทำให้ต้น โทรมไม่แข็งแรง และเป็นพืชที่ต้องการน้ำในระดับปานกลาง ควรรดน้ำไม่เกินวันละ 2-3 ครั้ง อีกทั้ง เป็นพืชที่ไม่สามารถกักเก็บน้ำได้ด้วยตนเอง
8 ถ้าหากต้องการให้ลำต้นมีขนาดใหญ่มากขึ้นให้ใช้ปุ๋ยหมักหรือปุ๋ยคอก ในอัตราส่วนประมาณ 0.2-0.5 กิโลกรัมต่อต้น หรือสามารถเลือกใช้ปุ๋ยสูตร 16-16-16 อัตรา 10-20 กรัม ต่อต้น 2.5 กายขยายพันธุ์ สำนักพิมพ์บ้านสวนพอเพียง (2021) ได้กล่าวถึงวิธีการขยายพันธุ์ของพืชสกุลฟิโลเดนดรอน ไว้ว่า 2.5.1.การขยายพันธุ์ฟิโลเดนดรอนด้วยการตัดชำยอด คือ การตัดยอดของต้นของต้นฟิโลเดน ดรอนที่แก่หรือโตเต็มที่มาปักชำและจะได้ต้นใหม่ 1 ต้น วิธีการคือ เลือกต้นฟิโลเดนดรอนที่โตเต็มที่ ตัดยอดความยาวประมาณ 3-4 ข้อ ตัดยอดแล้ว ให้ทำการทาแผลด้วยปูนแดงในบริเวณที่ตัดและรอ ปูนแห้ง เมื่อปูนแห้งนำยอดไปปลูกใส่ภาชนะใหม่โดยการใช้วัสดุปลูกเป็นดินร่วน ผสมขุยมะพร้าว กาบมะพร้าวสับมากๆจะออกรากเร็วและโตเร็ว รดน้ำให้ชุ่มและใช้ถุงพลาสติกห่อและปิดให้สนิทและ ตั้งในที่มีแสงรำไร ต้นไม้จะใช้ระยะเวลาประมาณ 2 สัปดาห์ ในการงอกรากและเจริญเป็นต้นใหม่ 2.5.2.การขยายพันธุ์ฟิโลเดนดรอนด้วยการการตัดชำต้นแก่ คือ การตัดส่วนของลำต้นของต้น ฟิโลเดนดรอนที่แก่จัดหรือโตเต็มที่มาปักชำและจะได้ต้นใหม่หลายต้น วิธีการคือ ตัดส่วนของลำต้นของฟิโลเดนดรอนและจะต้องเลือกหรือตัดส่วนที่มีรากออกมาด้วย วิธีการ ให้ตัดลำต้นแก่ของฟิโลเดนดรอน โดยตัดจากลำต้นเป็นส่วน ๆ หรือนับตามข้อ ในหนึ่งส่วนนั้นให้มี ประมาณ 3 ข้อ จากนั้นนำไปปักชำในทรายหยาบหรือขี้เถ้าแกลบ ทำการรดน้ำให้ชุ่มอยู่ตลอดเวลาใช้ เวลาดูแลรักษาประมาณ 2 สัปดาห์หรือให้ตรวจสอบว่ารากแข็งแรงหรือไม่ ถ้าแข็งแรงให้ย้ายไปปลูก ต่อไปได้เลย 2.6 ประวัติของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ Gottlieb Haberlandt (1898) เป็นคนแรกที่เริ่มทำการทดลองเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ท่านได้รับ การยกย่องว่าเป็นบิดาของเทคนิคการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้ทำการทดลองโดยแยกเอาเซลล์จากใบพืชมา เลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ และตั้งสมมุติฐานว่าเซลล์พืชเพียงเชลล์เดียวที่นำมาเลี้ยงสามารถจะแบ่งตัว และเจริญเติบโตไปเป็นพืชต้นใหม่ที่สมบูรณ์ ทุกประการได้ เช่นเดียวกับพืชต้นเดิม แต่เขายังไม่ สามารถเลี้ยงเซลล์พืชให้เป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ได้ตามสมมุติฐาน เนื่องจากเซลล์ที่นำมาทำการทดลองนี้ แก่เกินไปและสูตรอาหารที่ใช้เลี้ยงยัง ไม่เหมาะสม อย่างไรก็ดีในปี 1902 เขาก็สามารถเลี้ยงเนื้อเยื่อ พืชได้สำเร็จ และมีความเชื่อมั่นว่าจะต้องมีวิธีการทำให้เซลล์ที่เลี้ยงอยู่นั้นสามารถกลับกลายเป็นพืช ทั้งต้นได้ ในระยะ30 ปีต่อมาหลังจากสมัยของ Haberlandt งานด้านการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชพัฒนาไป น้อยมาก แต่ก็มีนักวิทยาศาสตร์หลายท่านทำการศึกษาค้นคว้าเกี่ยวกับการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเทคนิค ดังกล่าวถูกพัฒนามาตลอดช่วงต้นศตวรรษที่ 19 โดยเริ่มจากการเพาะเลี้ยงบางส่วนของพืช เช่น เอมบ
9 ริโอ และเนื้อเยื่อเจริญบริเวณปลายยอดและปลายราก Roger J. Gautheret การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พืชอย่างแท้จริงเกิดขึ้นสามารถเพาะต้น Sycamore บนอาหารสังเคราะห์สูตร Knop's solution แข็ง ที่เติมน้ำตาลและวุ้นที่ได้จากสาหร่าย อย่างไรก็ตามในช่วงแรกของการพัฒนากลับพบปัญหาในการทำ ให้เนื้อเยื่อพืชมีการพัฒนาเป็นยอด ราก หรือลำต้นตามต้องการ จึงเริ่มนำสารควบคุมการเจริญเติบโต พืชมาใช้โดยตอนแรกมีการใช้น้ำมะพร้าวมาผสมกับอาหารสังเคราะห์ ต่อมาจึงเริ่มปรับใช้สาร สังเคราะห์ในการชักนำให้เนื้อเยื่อพืชมีการเจริญและพัฒนาเป็นต้นอย่างสมบูรณ์ 2.7 อาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อและวิธีเตรียมอาหาร คํานูณ กาญจนภูมิ (2544) กล่าวว่า อาหารที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อมีอยู่หลายสูตร ชื่อของสูตร อาหารตั้งชื่อตามนักวิทยาศาสตร์ที่คิดค้นส่วนประกอบของอาหารสูตรนั้น ๆ ขึ้น เช่น สูตรอาหารของ White เป็น สูตรอาหารที่ White คิดขึ้นเพื่อทดลองเลี้ยงปลายรากมะเขือเทศ สูตรอาหารของ Murashige และ Skoog เป็นสูตรอาหารที่ Murashige and Skoog (1962) ได้ร่วมกันคิดขึ้นเพื่อ เลี้ยงเนื้อเยื่อของยาสูบ นอกจากนี้ยังมีสูตรอาหารของ Knudson (1946) สูตรอาหารของ Vacin and Went (1949) ซึ่งเหมาะ ในการเลี้ยงเมล็ดและเนื้อเยื่อกล้วยไม้ เป็นต้น หลักการเลือกอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่ออาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช จะประกอบด้วยธาตุ อาหารต่างๆที่พืชต้องการอย่างครบถ้วน ในปัจจุบันอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีอยู่หลายสูตร แต่ละ สูตรมีส่วนประกอบและปริมาณของสารแตกต่างกัน การจะเลือกใช้สูตรใดขึ้นอยู่กับชนิดของพืชและ จุดประสงค์ที่จะใช้ ดังนั้นในการที่จะเลือกอาหารเพื่อทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อนั้น ควรคำนึงถึงสิ่งต่าง ๆ ดังนี้ 1. ชนิดหรือสายพันธุ์ (species or cultivar) พืชต่างชนิดหรือต่างสายพันธุ์กัน ต้องการธาตุ อาหารที่ต่างกัน 2. อายุและระยะการพัฒนาของพืช (age and stage of development) แม้ว่าจะเป็นพืช ชนิดเดียวกัน แต่อายุและระยะการพัฒนาต่างกัน ก็อาจต้องการสารอาหารที่แตกต่างกัน 3. ชิ้นส่วนพืช (explant material) พืชชนิดเดียวกันหรือแม้กระทั่งต้นเดียวกัน แต่ใช้ชิ้นส่วน ของพืชจากส่วนที่ต่างกัน เช่น ถ้าใช้ส่วนยอดมาเลี้ยงก็จะใช้อาหารสูตรหนึ่ง แต่ถ้าใช้ส่วนของรากหรือ ใบก็อาจจะต้องใช้อาหารอีกสูตรหนึ่ง 4. เป้าหมายการเพาะเลี้ยง (target of culture) พืชชนิดเดียวกันและชิ้นส่วนเดียวกัน แต่ เป้าหมายของการเพาะเลี้ยงต่างกัน ก็ต้องใช้สูตรอาหารที่ต่างกันด้วย เช่น ต้องการเพาะเลี้ยงให้เกิด ยอดก็ใช้อาหารสูตรหนึ่ง แต้ถ้าหากว่าต้องการเลี้ยงให้เกิดรากก็จะต้องใช้อาหารอีกสูตรหนึ่ง เป็นต้น 5. สถานะของอาหาร (state of media) พืชขึ้นส่วนเดียวกันที่เลี้ยงในสภาพของอาหารแข็ง
10 (solid medium) และสภาพของอาหารเหลว (liquid medium) ผลที่ได้ออกมาอาจจะแตกต่างกันไป ก็ได้ 2.7.1 ประเภทของอาหาร 2.7.1.1. อาหารกึ่งแข็ง (semi-solid medium) เทคนิคที่ใช้ในยุคแรก ๆ นั้น ใช้วุ้น (agar) เพื่อปรับสารละลายอาหารให้มีสภาพเป็นของแข็งมากขึ้น โดยนึ่งใน หม้อนึ่งความดันเพื่อหลอมละลาย อาหารแล้วเทใส่ภาชนะและทิ้งให้แข็งตัวอยู่ในสภาพ อาหารกึ่งแข็ง แต่มักพบว่าคุณสมบัติต่าง ๆ ของ สารประกอบเคมีในอาหารอาจไม่ได้รับสูงสุดเท่ากับอาหารเหลว (liquid medium) กระนั้นก็ตามวุ้น ยังคงถูกนำมาใช้แต่จำเป็นต้องดัดแปลงให้เหมาะสม และต้องแน่ใจว่ามีความบริสุทธิ์จริง ๆ ในทาง ปฏิบัติแนะนำให้ล้างด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์อย่างน้อย 3 ครั้ง รายงานว่าการเจริญเติบโตของถั่ว Pea abies จะดีที่สุดในอาหารแข็งที่ใช้วุ้น Difco Purified agar ขณะที่ Difco Noble agar ซึ่งผ่านการ ฟอกใสมากกว่าจะให้ผลที่ไม่ดีเท่า และการใช้วุ้นปริมาณมากเกินไปอาจไปยับยั้งการเจริญเติบโตของ เนื้อเยื่อได้ ดังนั้น ความเข้มข้นของวุ้นที่พอเหมาะสำหรับอาหารแต่ละชนิดจะต้องมีการทดสอบ เสียก่อน อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่ใช้กันแพร่หลายและได้ผลดีเพื่อวัตถุประสงค์ส่วนใหญ่ คือ 0.8 % สารสังเคราะห์พวก gelatin และ silica gel ได้เคยมีการใช้ และในปัจจุบันมี การพัฒนา สารประกอบพวก acrylamide gels เช่นเดียวกับ starch co-polymers ก็มีการแนะนำมาใช้แทนวุ้น สารเหล่านี้มีข้อดีที่ไม่จำเป็นต้องต้มให้เดือดเพื่อช่วยให้ละลายน้ำได้ แต่ยังมีปัญหาในเรื่องการปรับค่า pH ในขณะที่สารพวกผงถ่าน (charcoal) ถูกเติมในอาหารหลายสูตร เพื่อช่วยกระตุ้นการเจริญเติบโต เนื่องจากสามารถดูดซับสารพิษพวก toxic metabolites ที่เกิดจากเนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงได้ดี 2.7.1.2 อาหารเหลว (liquid medium) อาหารเหลวเป็นที่นิยมใช้อย่างกว้างขวาง เนื่องจาก เนื้อเยื่อจะจมหรือแขวนลอยอยู่บนกระดาษกรองที่จุ่มในอาหารเหลวตลอดเวลา ในทางปฏิบัติอาจาใช้ glass wool ช่วยพยุงเนื้อเยื่อที่เลี้ยงได้เช่นกัน เช่นเดียวกับการใช้ fabric support (100 % polyester) ที่อิ่มตัวด้วยอาหารเหลว ซึ่งจะช่วยในการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐาน เกิดได้ดีขึ้นเนื้อเยื่อที่จมอยู่ในอาหารเหลวอาจถูกคนที่ความเร็ว 1 - 150 รอบต่อนาที (rpm) เพื่อช่วย ในการหายใจ นักวิทยาศาสตร์หลายท่านได้ทำการทดลองคิดค้นสูตรอาหารจนได้สูตรอาหารที่เหมาะสมกับ พืชชนิดต่าง ๆ เช่น ในการเพาะเลี้ยงกล้วยไม้ควรใช้อาหารสูตร Vacin&Went, ยาสูบ-มันฝรั่ง-มะเขือ เทศ-พิทูเนียใช้อาหารสูตร Murashige&Skoog เป็นต้น โดยมากชื่อสูตรอาหารจะใช้ชื่อตาม นักวิทยาศาสตร์ที่คิดค้นสูตรนั้นขึ้นมาองค์ประกอบของอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่ออาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง
11 เนื้อเยื่อพืช จะประกอบด้วยธาตุอาหารต่าง ๆ ที่พืชต้องการอย่างครบถ้วนจึงขอกล่าวส่วนประกอบ ของอาหาร ดังต่อไปนี้ 1. ธาตุอาหารพวกอนินทรีย์ (inorganic compound) ธาตุอาหารมีความสำคัญในการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อรองลงมาจากน้ำตาล แยกออกได้ 1.1 ธาตุอาหารที่พืชต้องการในปริมาณมาก (Macronutrient) ได้แก่ C, H, N, O, P, K, 1.2 ธาตุอาหารที่พืชต้องการในปริมาณน้อย (Micronutrient) ได้แก่ Fe, CI, Mn, Cu, S, Ca , Mg, Zn, B และ Mo 2. วิตามิน (vitamins) พืชสามารถสังเคราะห์วิตามินที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตได้ทุกชนิด แต่เซลล์พืชที่เลี้ยงในสภาพหลอดแก้วต้องการวิตามินเพิ่ม โดยเฉพาะวิตามินบี 1 เพื่อช่วยในการ พัฒนา ให้เป็นปกติ วิตามินที่ใช้ เช่น วิตามินบี 1 (thiamine 0.1 - 0.5 มก/ล.) วิตามินบี 5 (pantothenic acid 0.5 - 2.5 มก/ล.) วิตามินเอ็ม (folic acid 0.1 - 0.5 มก/ล.) วิตามินบี 2 (riboflavin 0.1 - 10.0 มก/ล.) วิตามินเอช (biotin 0.01 - 1.00 มก/ล.) และวิตามินอี (tocopherol 1 - 50 มก/ล.) ถึงอย่างวิตามินในอาหาร เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนั้น มีลักษณะที่ใช้ตามกันมากกว่าจะมีการพิสูจน์หรือทดสอบก่อนว่ามีความจำเป็น อย่างแท้จริงหรือไม่ มีเพียง thiamine-HC เท่านั้นที่ดูจะมีความจำเป็น และเป็นที่ต้องการในการ เจริญเติบโตหรือการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐาน (morphogenesis) 3. ฮอร์โมนและสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช (plant hormones and plant growth regulators) ฮอร์โมนที่สร้างขึ้นในต้นพืช (plant hormones ทำหน้าที่กระตุ้นและมีส่วนร่วม ใน กระบวนการต่าง ๆ ที่นำไปสู่การพัฒนาของต้นที่เป็นปกติการเจริญเติบโตตลอดจน การเปลี่ยนแปลง พัฒนาของเซลล์ เนื้อเยื่อ และ secondary metabolism เป็นผลมาจากฮอร์โมนเหล่านี้ทั้งสิ้น การ เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตลงในอาหารจึงอาจไม่จำเป็นเสมอไปโดยเฉพาะในการเลี้ยงแคลลัส อย่างไรก็ตามโดยปกติจะมีส่วนช่วยในการเพิ่มอัตราการเจริญเติบโตและ/หรือการกำเนิดอวัยวะ และ มีเนื้อเยื่อพืชไม่กี่ชนิดที่สร้างแคลลัสได้ในอาหารที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโตการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อพืช ออกชินและไซโทไคนินมีความสำคัญที่สุด พืชบางชนิดสร้างสารเหล่านี้อยู่แล้ว แต่ควรเพิ่ม เข้าไปในอาหารเพื่อช่วยให้การเจริญดีขึ้น บางครั้งอาจต้องใช้จิบเบอเรลลินหรือ เอทิลีน การเก็บ ฮอร์โมนพืชมักเก็บในตู้เย็นในรูปสารละลายเข้มข้น การนำฮอร์โมนพืชไปใช้อาจมีปัญหาการทำละลาย ของฮอร์โมนพืชในน้ำ การละลายออกซินควรทำในด่าง เช่น 0.1 KOH ไซโทไคนินก็เช่นเดียวกัน แต่ จิบเบอเรลลินละลายได้ได้ในแอลกอฮอล์ ออกซินและไซโทไคนินที่เตรียมเป็นสารละลายเข้มข้นควร เก็บไว้ในที่มืด หรือใส่ขวดสีชาเพราะจะเสื่อสภาพเมื่อได้รับแสง
12 3.1 ออกซิน (auxin) เช่น IAA (indole acetic acid) IBA (indole butyric acid) NAA (naphthalene acetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) ใช้ในช่วง 0.01- 10 มก/ ล. ออกซินช่วยเพิ่มขนาดของเซลล์ มักใช้ร่วมกับไซโทไคนินเพื่อช่วยใน การแบ่งเซลล์ การสร้างราก แต่การเจริญของรากจะถูกยับยั้งถ้ามีออกชินในปริมาณที่สูง 3.2 ไซโทไคนิน (cytokinin) ไซโทไคนินที่สังเคราะห์ได้ในธรรมชาติ คือ ซีอะทิน (zeatin) ใช้ ในการกระตุ้นการเจริญเติบโต ไซโทไคนินที่ใช้กันมากคือ ไคเนทิน (kinetin) 2iP (N6-isopentenyl adenine) BAP (benzyl aminopurine) มีหน้าที่ส่งเสริมการแบ่งเซลล์โดยเฉพาะถ้าใช้ร่วมกับออก ซินถ้าใช้ในความเข้มข้นสูงขึ้นจะช่วยในสร้างราก แต่ยับยั้งการเจริญของรากส่งเสริมการสร้างยอดโดย ลดผลจากการที่ตายอดข่มตาข้าง มีบทบาทในการเปลี่ยน สภาพเซลล์เป็นอวัยวะได้และชักนำให้เกิด เป็นต้น ไซโทไคนินทนความร้อนได้ดีจึงมักเติมในอาหารก่อนฆ่าเชื้อ บทบาทของออกซินและไซโทไค นินในพืชทั้งต้นและในสภาพหลอดแก้วอาจจะเหมือนกันหรือไม่เหมือนกันก็ได้ 3.3 จิบเบอเรลลิน (gibberelin) ฮอร์โมนพืชกลุ่มนี้มี 60 กว่าชนิด แต่ GA3 เป็นชนิดที่ใช้มาก ที่สุด จิบเบอเรลลินไม่ค่อยใช้กันมากนักในงานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช มีบทบาทในการชักนำให้ปล้อง ยาวขึ้นหลังจากการสร้างยอด ช่วยให้เนื้อเยื่อเจริญมีการเจริญเติบโตและช่วยในการงอกของเมล็ด ไม่ ควรฆ่าเชื้อจิบเบอเรลลินด้วยหม้อนึ่งความดัน เพราะจิบเบอเรลลิน ส่วนหนึ่งจะเสื่อมสลายไปเมื่อ ได้รับความร้อน ควรทำให้ปลอดเชื้อโดยใช้เครื่องกรองเมมเบรน นอกจากนี้จิบเบอเรลลินนั้นเคยถูก นำมาใช้ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแต่โดยทั่ว ๆ ไป มีผลปิดกั้น การเกิดอวัยวะ 3.4 แอบซาซิกแอซิค (ABA; abscisic acid) มักยับยั้งการเจริญเติบโต ในสภาพปลอดเชื้อแต่ ในบางครั้งพบว่า เอบีเอส่งเสริมการเจริญของแคลลัส และการเกิด เป็นต้นใหม่ และการเกิดเป็นต้น ใหม่ ควรทำให้สารนี้ปลอดเชื้อโดยใช้เครื่องกรองเมมเบรน เอบีเอมีบทบาทเกี่ยวกับการสังเคราะห์ไซ โทไคนินและเป็นตัวต่อต้านการทำงานของ จิบเบอเรลลิน 3.5 เอทิลีน (ethylene) อวัยวะพืช แคลลัส หรือเซลล์ในสภาพหลอดแก้วมีการผลิตเอทิลีน จึงไม่ควรปิดหลอดแก้วแน่นเกินไปเพื่อไม่ให้เกิดการสะสมของแก๊สนี้ ผลของเอทิลีนมีทั้งส่งเสริม และ ยับยั้งการเจริญเติบโต การเลี้ยงเนื้อเยื่อในที่มีแสงจะมีการสะสมเอทิลีนมากกว่าในที่มืด ถ้ามีมาก เกินไปจะทำให้เกิดการฉ่ำน้ำของพืชได้ แก๊สนี้ยังเป็นสาเหตุของการแก่ของเนื้อเยื่อพืช 4. สารที่เป็นแหล่งคาร์บอน (carbon sources) ได้แก่ สารประกอบพวกน้ำตาลต่างๆ เช่น glucose, sucrose, fructose, saccharose และ mannitol 5. สารประกอบอินทรีย์
13 5.1 สารอินทรีย์จากผักหรือผลไม้ที่สำคัญมาก เช่น น้ำมะพร้าว น้ำส้ม น้ำมะเขือเทศ น้ำแอป เปิ้ล กล้วยบด น้ำต้มมันฝรั่ง สารสกัดจากยีสต์ (yeast extract) และจากมอลท์ (malt extract) เป็น ต้น สารเหล่านี้ไม่ควรใช้ในงานวิจัย เนื่องจากไม่ทราบส่วนประกอบแน่นอน (undefined medium) ในระยะที่นำมาใช้ 5.2 สารอินทรีย์ที่มีไนโตรเจนเป็นส่วนประกอบ เช่น กรดอะมิโน (amino acids) ช่วยส่งเสริม การเจริญเติบโต และทำให้เซลล์มีการเปลี่ยนแปลงพร้อมที่จะเกิดเป็นต้นได้ เช่น แคซีนไฮโดรไลเซท (casein hydrolysate) 0.1 - 1.0 มก/ล. ทริพโทน (tryptone) 0.25 - 2.00 มก/ล. และสารสกัดจาก มอลท์ (malt extrat) 0.5 - 10 มก/ล. สารเหล่านี้ประกอบด้วยวิตามินและกรดอะมิโน ส่วนสารสกัด จากยีสต์ (yeast extract) ซึ่งมีวิตามินบีสูงมักใช้ในปริมาณ 0.25 - 2.00 มก/ล. 6. ตัวทำให้สารแข็ง เนื้อเยื่อส่วนมากจะเลี้ยงในอาหารแข็งที่มีวุ้น ซึ่งหน้าที่ช่วยพยุงเนื้อเยื่อ ให้ตั้งอยู่ได้บนอาหารในกรณีที่เลี้ยงในอาหารเหลวจะวางบนเครื่องเขย่า หรือเลี้ยงบนสะพานกระดาษ กรอง (filter paper bridge) เพื่อให้เนื้อเยื่อได้รับอากาศเพียงพอ วุ้นเป็นส่วนประกอบแพงที่สุด ใน อาหาร ผลิตจากสาหร่ายทะเลทำให้อาหารแข็งตัว วุ้นเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ (polysaccharide) มี โมเลกุลใหญ่ วุ้นที่มีคุณภาพสูง เช่น difcoitekAgar มีราคาแพงมากปราศจากสิ่งเจือปน ใน ห้องปฏิบัติการบางแห่งใช้วุ้นประกอบอาหารแทนได้ วุ้นจาก Difco Bacto มักใช้ในปริมาณ 0.6 - 1.0 % เหมาะสำหรับการเลี้ยงแคลลัสส่วนอะกาโรสเจล (agarose gel) หรือวุ้นสังเคราะห์ใช้เลี้ยงเซลล์ เดี่ยวหรือโพรโทพลาสต์ วุ้นสังเคราะห์เหล่านี้จะทำให้เกิดปัญหาการฉ่ำน้ำ (vitrification) ของเนื้อเยื่อ พืช ผลิตภัณฑ์ใหม่ของบริษัทชิกมา (Sigma) ชื่อ อะการ์เจล (Agargel ช่วยลดปัญหานี้ได้ การใช้วุ้นใน ปริมาณที่ต่ำ (0.5 %) จะทำให้อาหารไม่แข็งตัวไหลไปมาได้ โดยเฉพาะเมื่อมีPH ต่ำจึงไม่สามารถพยุง เนื้อเยื่อพืชไว้ได้ แต่ถ้าใช้วุ้นในปริมาณที่สูง (1.0 %) จะทำให้อาหารแข็งมากจนไม่สามารถให้น้ำ เพียงพอสำหรับการเจริญเติบโตของพืช และยังทำให้พืชดูดอาหารไปใช้ได้ยาก 7. ผงถ่าน (activated charcoal) มักใช้ในความเข้มข้น 0.2 - 3.0 % ในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ ผงถ่านมี ความสามารถในการดูดชับสารบางตัวออกจากอาหารได้ เนื่องจากผงถ่านมีช่องว่างที่ ละเอียดมาก มีพื้นที่ผิวในช่องว่างสูง จึงใช้ผงถ่านในการดูดชับสารพิษ เช่น สารประกอบฟีนอล (phenol) เอทิลีน ทำให้ปริมาณสารดังกล่าวในอาหารลดลง เช่น การดูดชับฮอร์โมนหรือ สารประกอบฟีนอล ซึ่งเป็นพิษกับเซลล์ นอกจากนี้อาจใช้ผงถ่านในระยะที่เกิดรากเพื่อลดแสงบริเวณ ราก และทำให้รากเจริญเติบโตได้ดี ผงถ่านจึงสำคัญต่อการสร้างเป็นต้นใหม่ สารที่มีคุณสมบัติ เหมือนกันกับผงถ่าน คือ PVP (polyviny pyrolidone) ก็สามารถดูดชับสารฟีนอลได้ หรือการเติม diethyl-dithiocarbonate (DIECA) จะช่วยป้องกันการเกิดออกชิเดชั่น
14 8. น้ำ (Water) ประมาณ 95 4 ของอาหารเป็นน้ำ ในการทำงานวิจัยควรใช้น้ำกลั่นจาก เครื่องกลั่นแก้วเครื่องกลั่นควรได้รับการทำความสะอาดอย่างสม่ำเสมอ และควรบรรจุน้ำกลั่นใน ขวด พลาสติก 9. ความเป็นกรดและด่างของอาหาร (pH of nutrient medium) pH ที่เหมาะสมของ อาหารที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอยู่ในช่วง 5.0 - 6.5 ถ้าต่ำมากไป ( <4.5 ) หรือสูงมากเกินไป ( <7.6) จะทำให้พืชหยุดการเจริญเติบโต ถ้า pH สูงกว่า 6 จะทำให้อาหารแข็งมาก ถ้า PH ต่ำกว่า 5.2 อาหารวุ้นจะอ่อนตัว ไม่เหมาะในการพยุงเนื้อเยื่อพืช นอกจากนี้จากการศึกษาพบว่าผลในการกระตุ้น การเจริญเติบโตและ การเลือกกระตุ้นของอาหารที่ใช้เลี้ยงนั้นจะขึ้นอยู่กับ pH ด้วย ที่มีค่าสูงหรือต่ำ เกินไปควรหลีกเลี่ยงเพราะจะไปชัดขวางความเป็นประโยชน์ของธาตุอาหาร ตัวอย่าง pH ที่เป็นด่าง (>7.0) หรือเป็นกรดจัด (<4.0 ทำให้กรดจิบเบอเรลลินไม่เป็นประโยชน์ได้ การเติมสารประกอบ EDTA ลงในอาหารอาจมีความสำคัญในการรักษาความเป็นประโยชน์ของธาตุเหล็กและธาตุโลหะอื่น ๆ เนื่องจาก PH จะเปลี่ยนแปลงไปตลอดเวลาขณะเพาะเลี้ยงสารเคมีที่ใช้ควรมีฉลากระบุว่าเหมาะ สำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ หรือระบุว่าเป็น analytical grade 2.7.2 การเตรียมอาหาร อาหารสูตร Murashige and Skoog (1962) ใช้กับพืชทั่วไป วิธีเตรียมอาหารที่สะดวกสบาย ง่ายที่สุดคือ การซื้ออาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแบบถุงสำเร็จรูป ซึ่งจัดจำหน่ายโดยบริษัท Sigma (3.1) วิธีนี้ใช้เวลาในการเตรียมอาหารน้อยที่สุด แต่ราคาค่อนข้าง จะแพงสำหรับในการเตรียมอาหารเพื่อ งานทดลองหรือการสอนในชั้นเรียนควรเตรียมอาหารแบบ 1 L (3.2) ในกรณีที่ต้องการเตรียมอาหาร เลี้ยงเนื้อเยื่อจำนวนมากเพื่อการทดลองหรือเพื่อการค้าควรเตรียมโดยวิธีทำ stock solution (3.3) ถึงแม้ว่าจะใช้ไม่สะดวกและเวลามากกว่าวิธี 3.1 และ 3.2 แต่มีข้อดีที่เราสามารถที่จะเพิ่มหรือลด สารเคมีได้ตามความเหมาะสม และราคาถูกกว่า 1. การเตรียมอาหารแบบถุงสำเร็จรูป 1.1 เทสารที่อยู่ในถุงลงในน้ำกลั่น 600 mL 1.2 เติม cytokinin และ/หรือ auxins ตามต้องการ (เพื่อความสะดวก ควรเตรียมเป็น stock solution) สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืชแต่ละชนิดมีคุณสมบัติแตกต่างกัน จำเป็นต้องใช้ตัวทำ ละลายและเก็บรักษาไว้ในอุณหภูมิที่เหมาะสมเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพ และวิธีเตรียม stock solution ของสารควบคุมการเจริญเติบโตแสดงไว้ใน Appendix 1.3 เติมน้ำตาล Sucrose ปกติจะใช้ 30 g/L 1.4 เติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตร 1 L
15 1.5 ปรับ pH ให้เป็น 5.6-5.8 โดยใช้ KOH หรือ HCI 1.6 เติมวุ้น (Agar) หรือ ตัวทำให้สารแข็งตัวอื่นๆ เช่น Gel rite โดยปกติจะเติมวุ้น 8-9 g/L จากนั้นก็นำไปต้มและคนจนวุ้นละลายเข้ากับอาหาร 1.7 เทใส่ลงในภาชนะที่เหมาะสม แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งความดันไอที่ 121oC นาน 15 นาที 2.8 เทคนิคที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คำนูณ กาญจนภูมิ (2544) กล่าวว่า การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะประสบผลสำเร็จตาม จุดประสงค์ได้ ต้องอาศัยเทคนิคต่าง ๆ หลายอย่าง ได้แก่ เทคนิคการเลือกชนิดของเนื้อเยื่อ เทคนิค การเลือกชนิดของ อาหาร เทคนิคการเพาะเลี้ยง เป็นด้น ในบทนี้จะกล่าวถึงเทคนิคการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อ แต่ละเทคนิคไป 1.1 เทคนิคการเลือกชนิดของเนื้อเยื่อมาเพาะเลี้ยง การเลือกชนิดของเนื้อเยื่อพืชนับว่ามีความสำคัญมาก เพราะการเพาะเลี้ยงจะประสบกับ ความสำเร็จ และได้ผลตามที่ต้องการหรือไม่นั้นขึ้นอยู่กับเทคนิคการเลือกชนิดของเนื้อเยื่อพืชเพื่อ นำมาใช้เพาะเลี้ยง เทคนิคการเลือกเนื้อเยื่อพืชมาเพาะเลี้ยงในที่นี้จะแยกตามจุดมุ่งหมายของการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ดังนี้ 1.1.1 เทคนิคการเลือกเนื้อเยื่อพืชมาเพาะเลี้ยงเพื่อการขยายพันธุ์ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเพื่อการขยายพันธุ์นั้น มีความมุ่งหมายสำคัญ คือ เพื่อให้ได้ต้นพืช ใหม่ จำนวนมากที่มีลักษณะเหมือนด้นเดิมที่นำมาเพาะเลี้ยง ซึ่งมีหลักการในการเลือกเนื้อเยื่อ ดังนี้ ก. เลือกใช้แต่เนื้อเยื่อโซมาติก (Somatic tissue) เช่น ราก ยอด ตา ใบ มาเลี้ยง ไม่ใช้เนื้อเยื่อ สืบพันธุ์(reproductive tissue) มาเพาะเลี้ยง โดยเฉพาะอย่างยิ่งละอองเรณู และไข่ เนื้อเยื่อโซมาติก ประกอบด้วยเซลล์ ซึ่งแต่ละเซลล์จะมีจำนวนโครโมโซมเป็น 2 ชุด (2n หรือ diploid number) เมื่อ นำมาเพาะเลี้ยงแล้วจะได้ด้นพืชใหม่ ที่มีจำนวนโครโมโซมในแต่ละเซลล์เท่าเดิมและเท่ากับของเซลล์ ในต้นแม่พันธุ์ แต่ถ้านำเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ เช่น ละอองเรณู ไข่ มาเพาะเลี้ยง จะได้ต้นพืชใหม่ที่มีจำนวน โครโมโซมในแต่ละเซลล์เพียงครึ่งหนึ่ง หรือ เป็นชุดเดียว (n หรือ haploid number) ซึ่งอาจมีผลทำ ให้ ลักษณะของพืชด้นใหม่ผิดไปจากด้นแม่พันธุ์ ข. เลือกใช้บริเวณที่มีเซลล์ของพืชที่มีการแบ่งเซลล์อยู่ตลอดเวลา ซึ่งเรียกว่า เป็นเนื้อเยื่อเจริญ (meristematic tissue) บริเวณดังกล่าว ได้แก่ บริเวณปลายยอด ปลายราก ต้นอ่อน หรือ ถ้า
16 จำเป็นต้องใช้บริเวณของพืชที่มีอายุมากก็เลือกเอาเนื้อเยื่อตรงบริเวณที่มีเยื่อเจริญหรือแคมเบียมมา เลี้ยง เนื่องจากบริเวณเหล่านั้นจะประกอบด้วยเซลล์ ซึ่งแบ่งเซลล์อยู่เสมอ จะทำให้เนื้อเยื่อที่นำมา เลี้ยงมีการแบ่งเซลล์และเจริญต่อไปได้อย่างรวดเร็ว ในทางตรงกันข้ามถ้าใช้เนื้อเยื่อของพืชจาก บริเวณที่แก่ตัวแล้ว หรือเซลล์เปลี่ยนไปเป็นเนื้อเยื่อถาวรที่ทำหน้าที่เฉพาะอย่างแล้ว เซลล์ของเนื้อเยื่อ เหล่านั้นหยุดการแบ่งเซลล์แล้ว เมื่อนำเพาะเลี้ยงบนอาหารจะต้องใช้เวลามาก ที่จะทำให้เซลล์เปลี่ยน กลับมาเป็นเซลล์เยื่อเจริญที่สามารถแบ่งเซลล์ได้ใหม่ ซึ่งบางครั้งอาจไม่ประสบความสำเร็จก็ได้ ค. เลือกเนื้อเยื่อที่ปกติตรงตามพันธุ์ ไม่เลือกเนื้อเยื่อที่มีลักษณะแปรผันไปจากลักษณะเดิม เช่น ไม่เลือกใช้ตาที่ผ่าเหล่าไป เพื่อป้องกันไม่ให้ด้นพืชที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมี ลักษณะแปร ผันไปจากด้นแม่พันธุ์ 1.1.2 เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเพื่อการปรับปรุงพันธุ์ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเพื่อการปรับปรุงพันธุนั้น มีความมุ่งหมายที่จะให้ได้พันธุ์ใหม่หรือได้ พันธุ์เดิมที่มีลักษณะแปรผันไป เช่น มีขนาดของผลใหญ่ขึ้น ดอกใหญ่ ผลไม่มีเมล็ด ก. การเลือกเนื้อเยื่อพืชเพื่อนำมาเพาะเลี้ยงให้ได้พืชด้นใหม่เป็นพันธุ์แท้ โดยผลิตพืชที่ แต่ละ เซลล์มีโครโมโซมเพียงชุดเดียว (n) หรือพืชแฮพลอยด์ (haploid plant) แล้วจึงใช้สารเคมีคอลชิซิน (colchicine) ชักนำให้เป็นด้นที่แต่ละเซลล์มีโครโมโซม 2 ชุด (2n) ซึ่งเป็นด้นพืชปกติและเป็นพันธุ์แท้ การเลือกต้องเลือกเนื้อเยื่อพืชที่แต่ละเซลล์มีโครโมโซมเพียงชุดเดียว (n) อยู่แล้วมาเพาะเลี้ยง ส่วนที่ นิยมนำมาเพาะเลี้ยง ได้แก่ อับเรณู และ ละอองเรณูที่อยู่ระหว่างการแบ่งเซลล์ไมโอซิสครั้งแรก (first meiotic division) นอกจากนี้ยังเพาะเลี้ยงจากไข่ที่ยังไม่ได้รับการผสมเกสร ข. การเลือกเนื้อเยื่อเพื่อนำมาเพาะเลี้ยงให้ได้ต้นพืชที่มีลักษณะแปรผันไป เพื่อการ คัดเลือก พันธุ์เนื้อเยื่อที่จะนำมาเพาะเลี้ยงจะต้องเป็นเนื้อเยื่อที่มีความแตกต่างกัน เพื่อจะได้ต้นใหม่ หลาย ๆ ลักษณะ ซึ่งเหมาะที่จะใช้คัดพันธ์ต่อไป เช่น การเลือกเนื้อเยื่อของใบพืชที่ด่างสีแดงมาเลี้ยง เนื้อเยื่อ บริเวณดังกล่าวประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่เป็นสีเขียว และ สีแดงอยู่ใกล้ชิดกัน ต้นใหม่ที่เกิดจากการ เพาะเลี้ยงอาจมีทั้งต้นที่ด่างเหมือนต้นเดิม หรือด่างผิดไปจากเดิม หรือมีสีเขียวล้วน หรือ สีแดงล้วนก็ ได้ แล้วแต่ว่าต้นใหม่เจริญจากเนื้อเยื่อส่วนใด ถ้าเจริญจากเนื้อเยื่อต่างของต้นเดิมก็จะได้ต้นใหม่ เหมือนต้นเดิมถ้าเจริญจากเนื้อเยื่อสีเขียวต้นใหม่ก็จะมีสีเขียวล้วน ถ้าเจริญจากเนื้อเยื่อสีแดงจะได้ต้น ใหม่ที่มีสีแดง เป็นต้น เมื่อได้ต้นใหม่ที่มีลักษณะต่าง ๆ กันแล้ว จึงคัดเลือกพันธุ์โดยเลือกเอาเฉพาะต้น ที่มีลักษณะตามที่ด้องการ
17 ค. การเลือกเนื้อเยื่อพืชเพื่อสร้างพืชพันธุ์ใหม่ขึ้นจากการผสมของเซลล์โซมาติก (Somatic cell) ของพืชต่างชนิดกัน การเลือกเนื้อเยื่อของพืชต่างชนิดกันที่จะนำมาผสมกันนิยมเลือก เนื้อเยื่อที่ ต่างกันสังเกตได้ง่ายเช่น เลือกเอาเนื้อเยื่อที่ใบของพืชชนิดหนึ่งมาผสมกับเนื้อเยื่อจากกลีบดอก ของ พืชอีกชนิดหนึ่ง เนื่องจากมีสีต่างกัน จะสังเกตเห็นได้ชัดเมื่อผสมกัน การทำให้เซลล์ของพืชต่างชนิด กันผสมกัน จะต้องนำเซลล์มาสลายเอาผนังเซลล์ออกเสียก่อน โดยใช้เอนไซม์เซลลูเลส ทำให้ได้โปรโต พลาสต์ซึ่งเป็นเซลล์ที่ไม่มีผนังเซลล์แล้วจึงนำโปรโตพลาสต์ของพืชที่ต่างกันมาเลี้ยงด้วยกันแล้วกระตุ้น ให้โปรโตพลาสต์เข้ารวมกัน ง. การเพาะเลี้ยงต้นอ่อนที่เกิดจากการผสมข้ามพันธุ์โดยการนำเมล็ดหรือด้นอ่อนในเมล็ดมา เพาะเลี้ยง ซึ่งวิธีการนี้ทำกันมากในกล้วยไม้ทำให้ได้กล้วยไม้พันธุ์ใหม่ ๆ มากมาย ซึ่งเกิดจากนักเลี้ยง กล้วยไม้ได้ผสมพันธุกล้วยไม้ต่างชนิดกัน แล้วนำเอาเมล็ดที่ได้ไปเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ทั้งนี้ เนื่องจาก เมล็ดกล้วยไม้ไม่สามารถงอกได้ตามธรรมชาติ เพราะเมล็ดกล้วยไม้เล็กมาก และไม่มีอาหารสะสมหรือ เอนโดสเปิร์มอยู่เลย 1.1.3 เทคนิคการเลือกอาหารสำหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ปัญหาอย่างหนึ่งที่พบก็คือ อาหาร เราจะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชชนิด ต่าง ๆ ด้วยอาหารสูตรใดจึงจะได้ผลดี การเลือกสูตรอาหารสำหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีวิธีการเลือก ดังนี้ ก. เลือกสูตรอาหารจากเอกสารงานวิจัย ล้ามีผู้เคยทำการทดลองมาแล้วอาจเป็นพืช ชนิด เดียวกัน หรือชนิดใกล้เคียงกัน และมีจุดประสงค์ในการเพาะเลี้ยงเหมือนกัน เช่น มีจุดประสงค์เพื่อ การขยายพันธุ์ก็ใช้สูตรอาหารเดียวกันได้เลย ข. ทดลองเพาะเลี้ยงในสูตรอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงพืชหลายชนิดได้ผลดีมาแล้ว เช่น สูตร MS สูตร B5 สูตร White วิธีนี้จะใช้เมื่อได้ตรวจเอกสารงานวิจัยแล้ว พบว่าพืชชนิดนั้น ๆ ยังไม่มีผู้ใดเคย ทำการเพาะเลี้ยงมาก่อน ค. เมื่อทดลองเพาะเลี้ยงในอาหารสูตรใดสูตรหนึ่งไม่ได้ผลดี อาจทดลองใช้ธาตุอาหารของแต่ ละสูตรอาหารมาสลับกัน เช่น ใช้ธาตุอาหารหลักของสูตร MS ใช้ธาตุอาหารรองของสูตร B5 และใช้ วิตามินของสูตร White ตามวิธี broad spectrum experiment ง. สร้างสูตรอาหารขึ้นใหม่โดยวิเคราะห์ว่าพืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยงมีส่วนประกอบของ ธาตุ ชนิดใดบ้างแต่ละธาตุมีปริมาณมากน้อยเพียงใด แล้วนำผลการวิเคราะห์มาสร้างสูตรอาหารขึ้นตาม
18 ปริมาณของธาตุที่พบเป็นส่วนประกอบอยู่ในพืช จ. อาจเลือกใช้สูตรอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชหลายชนิดได้ เช่น สูตร MS หรือ สูตร B5 โดยนำมาเดิมฮอร์โมนพืช (plant regulator) ในปริมาณต่าง ๆ กัน พบว่าพืชบางชนิดถึงแม้จะ เพาะเลี้ยงในอาหารสูตรเดียวกัน แต่ล้าไม่ได้เดิมฮอร์โมนพืชในปริมาณที่เหมาะสมก็ไม่สามารถเจริญ พัฒนาได้ ฮอร์โมนพืชที่ใช้เดิมลงในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ ฮอร์โมนกลุ่มออกชิน และ ไซโตไคนิน การเตรียมอาหารที่ใส่ฮอร์โมนดังกล่าวนิยมเตรียมให้มีความเข้มข้นของฮอร์โมนออกชิน และไซโตไค นินประมาณ 5 ระดับความเข้มข้น เช่น 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2 มิลลิกรัมต่อลิตร ในการเตรียมอาหาร อาจจะใส่ฮอร์โมน 2 ชนิด ที่มีระดับความเข้มข้นของฮอร์โมน 2 ชนิดแตกต่างกัน ดังตารางที่ 4 จะได้ อาหาร 25 ชนิดแล้วนำไปทดลองเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เพื่อดูว่าความเข้มข้นของฮอร์โมนระดับใดที่พืช ชนิดนั้น สามารถเจริญพัฒนาได้ดีที่สุด ตารางที่ 2.1 ตัวอย่างปริมาณของฮอร์โมนที่ใส่ในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (a, b, c ... หมายถึงอาหารที่ ปริมาณฮอร์โมนแตกต่างกัน) (คำนูณ กาญจนภูมิ, 2544) NAA (มิลลิกรัมต่อลิตร) BAP (มิลลิกรัมต่อลิตร) 0 1 2 3 4 0 a f k p u 0.5 b g L q V 1 c h m r w 1.5 d i n s X 2 e j o t y 2.9 ชนิดของอาหารที่ใช้ อาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแต่ละ สูตรแบ่งออกเป็น 2 ชนิดตามสถานะคือ 1.1 อาหารกึ่งแข็งหรืออาหารวุ้น (solid medium) เป็นอาหารที่เติมวุ้นลงในสารละลายของ อาหารตาม สูตร ชิ้นส่วนของพืชที่เพาะเลี้ยงในอาหารวุ้นนี้ส่วนหนึ่งจะสัมผัสกับอากาศ อีกส่วนหนึ่งจะ จมอยู่ใต้ อาหารเนื้อเยื่อที่จมอยู่ใต้อาหารจะขาดออกซิเจน จึงไม่ควรให้เนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนของพืชจมลง ไปใน อาหารเกิน 1 ใน 2 ของชิ้นส่วนของพืช ส่วนมากเวลาปักชิ้นส่วนของพืชลงในอาหารวุ้น มักจะปัก ลง ไปในอาหารประมาณ 1 ใน 3 ของชิ้นส่วนนั้น
19 1.2 อาหารเหลว เป็นอาหารที่ไม่เดิมวุ้นลงในสารละลายของอาหารอาหารเหลว มีข้อดีกว่า อาหารวุ้น หลายประการคือ 1.1.1 การเพาะเลี้ยงในอาหารวุ้น เมื่อเพาะเลี้ยงไประยะหนึ่งแล้วพืชจะเจริญได้ไม่ เต็มที่ เนื่องจากสารอาหารบริเวณที่พืชอยู่จะถูกดูดไปใช้จนเหลือไม่เพียงพอกับความต้องการของพืช 1.1.2 ในวุ้นที่เดิมลงไปในอาหารอาจจะมีสารพิษปนอยู่ แม้ว่าจะผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ โรค แล้วก็ไม่สามารถทำลายสารพิษที่ปนเปื้อนอยู่ได้ 1.1.3 การเพาะเลี้ยงในอาหารวุ้น เนื้อเยื่อของพืชจะปล่อยของเสียออกมาสะสมอยู่ใน อาหารบริเวณโดยรอบของเนื้อเยื่อ ของเสียเหล่านี้จะยับยั้งการเจริญเติบโตของพืช 1.1.4 การเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว ชิ้นส่วนของพืชจะจมอยู่ในอาหาร ทำให้ได้รับ อาหารมากเท่ากันตลอดเวลา นอกจากนี้สารพิษที่เนื้อเยื่อที่ปล่อยออกมาในอาหารก็จะกระจายไปใน อาหารเท่า ๆ กัน เนื่องจากขวดอาหารเหลวจะต้องวางไว้บนเครื่องเขย่าด้วยความเร็ว 100-120 รอบ ต่อนาที ทำให้สารพิษไม่เข้มข้นมากจนยับยั้งการเจริญของพืช ทำให้พืชเจริญได้รวดเร็วกว่าการเลี้ยงใน อาหารวุ้น อย่างไรก็ตามการเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวก็มีข้อเสียอยู่บ้าง คือ ก. ต้องเขย่าภาชนะที่เพาะเลี้ยงตลอดเวลา ทำให้สิ้นเปลืองค่าไฟฟ้า ข. ต้องเปลี่ยนอาหารบ่อย ทำให้สิ้นเปลืองแรงงาน จึงไม่เหมาะในการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อเพื่อเก็บรักษาพันธุกรรม และ ยังมีโอกาสติดเชื้อได้ง่ายจากการย้ายเปลี่ยนอาหาร ภาชนะที่ใช้ ใส่อาหารเหลวที่เหมาะสำหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ ขวดรูปชมพู่ (flask) ปริมาตรของ อาหารเหลวที่ บรรจุใส่ลงในขวดรูปชมพู่จะต้องไม่มากเกินไปหรือน้อยเกินไป เพราะถ้าปริมาตรของ อาหารมาก เกินไป จะทำให้อาหารเคลื่อนไหวช้าไป อาจทำให้ชิ้นส่วนของพืชขาดออกซิเจน แต่ถ้าใส่ปริมาตรของ อาหารน้อยเกินไป จะทำให้อาหารเคลื่อนไหวเร็วและแรงมาก อาจทำให้ชิ้นส่วนของพืชกระแทกกับ ข้างขวดเกิดการเสียหาย เนื่องจากชิ้นส่วนของพืชอาจจะแตกหักหรือตายได้ ปริมาตรของอาหารที่ พอเหมาะคือประมาณ 20% ของปริมาตรของขวดรูปชมพู่ 2.10 ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ธัญญา ทะพิงค์แก (2554) กล่าวว่า ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเป็นพื้นที่ที่ประกอบด้วย การทำงานทุดขั้นตอน ตั้งแต่การเตรียมชิ้นส่วนพืช การเตรียมอาหาร การย้ายเนื้อเยื่อ การเพาะเลี้ยง จึงต้องมีห้องปฏิบัติการที่จัดสรรไว้อย่างเหมาะสม
20 ปิยะดา ต้นตสวัสด์ (2551) กล่าวว่า ห้องปฏิบัติการสำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช มี ส่วนประกอบ 3 ส่วนคือ ห้องเตรียมอาหาร ห้องปลอดเชื้อ และห้องเพาะเลี้ยง ห้องนึ่งอาหารเป็นส่วน หนึ่งที่อาจจะแยกออกต่างหากจากห้องเตรียมอาหาร ดังนั้น ห้องแล็บจึงควรมีการออกแบบให้ เหมาะสมสำหรับการปฏิบัติงานให้มีความเชื่อมโยงกัน เพื่อให้การทำงานความสะดวกปลอดภัยและมี ประสิทธิภาพ แต่ละแลบจึงออกแบบให้เหมาะสมสำหรับงานของตนเองโดยทั่วไปแล้วแลบ ต่าง ๆ จะ มีหลักการกว้าง ๆ คล้ายคลึงกัน ซึ่งผู้รับผิดชอบจะให้คำแนะนำก่อนใช้ห้องแลบครั้งแรกเสมอ ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีขนาดใหญ่หรือเล็กไม่ใช่จุดสำคัญ ทั้งนี้ชื้นอยู่กับปริมาณงานที่ทำ หรือเงินทุนที่มีอยู่หรือหามาได้ ที่สำคัญคือ บริเวณที,ทำงานต้องสะอาด ไม่มีฝุ่นละอองและ เชื้อจุลินทรีย์ เนื่องจากจุลินทรีย์มีอัตราการเจริญเติบโตรวดเร็วกว่าชื้นเนื้อเยื่อหลายเท่า เพื่อ ประโยชน์สำหรับผู้ที่ต้องการจัดตั้งห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ในบทนี้จะกล่าวถึงสภาพของ ห้องปฏิบัติการตลอดจนรายละเอียดเครื่องมืออุปกรณ์ และสารเคมีที่ควรจะใช้ในการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อ ห้องปฏิบัติการอย่างน้อยควรจะมีสามส่วน ได้แก่ บริเวณเตรียมอาหาร บริเวณถ่ายเนื้อเยื่อ และห้องเพาะเลี้ยง 2.10.1 ห้องเตรียมอาหาร ห้องเตรียมอาหารต้องมีเนื้อที่กว้างขวางพอที่จะปฏิบัติการได้อย่างสะดวก มีโต๊ะ สำหรับ ปฏิบัติการ ตู้เย็นสำหรับเก็บสารละลายเข้มข้น หม้อนึ่งความดันสำหรับฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรดด่าง เตาหลอมอาหาร อ่างน้ำ ตู้เก็บสารเคมีและอุปกรณ์ และควรจะเป็นห้อง เดียวที่เป็นห้องเดียวที่เป็นทางติดต่อกันภายนอก หมายความว่าการจะเข้าสู่ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อควรจะมีประตูทางเข้าสู่ห้องเตรียมอาหารเพียงทางเดียว ส่วนห้องถ่ายเนื้อเยื่อและห้อง เพาะเลี้ยงไม่ควรจะมีประตูติดต่อกันภายนอกโดยตรง 2.10.2 ห้องถ่ายเนื้อเยื่อ ห้องย้ายเนื้อเยื่อต้องสะอาดและปลอดเชื้อ ควรเป็นห้องที่สร้างอย่างมิดชิด และให้ผู้คนเข้า ออกน้อยที่สุดเท่าที่จำเป็น เครื่องมือสำคัญที่มีในห้องนี้ คือ ตู้สำหรับถ่ายเนื้อเยื่อหรือย้ายเนื้อเยื่อซึ่ง เป็นตู้ที่มีอากาศถ่ายเทผ่านแผ่นกรองที่สามารถกรองเชื้อจุลินทรีย์ไว้ได้ตลอดเวลา ทำให้อากาศภายใน บริเวณตู้เป็นอากาศบริสุทธิ์ลดภาวะเสี่ยงต่อการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ในอากาศลง 2.10.3 ห้องเพาะเลี้ยง มีชั้นติดไฟให้สว่าง ประมาณ 3000 ลักซ์ เป็นห้องที่สะอาดและควรจะควบคุมอุณหภูมิได้
21 ไม่ให้ร้อนมากเกินไป ส่วนใหญ่นิยมตั้งอุณหภูมิประมาณ 25-27 องศาเซลเซียส และควรจะติดตั้ง เครื่องควบคุมไฟให้เปิดวันละประมาณ 16 ชั่วโมงเพื่อจะได้ประหยัดพลังงานและยืดอายุในการใช้งาน ของหลอดไฟ ถ้ามีการเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวจะต้องมีเครื่องเขย่าตั้งอยู่ในห้องนี้ด้วยเช่นกัน ไฟที่ใช้ ควรจะเป็นไฟหลอดฟลูออเรสเซนต์จะได้ไม่ร้อนมาก ห้องปฏิบัติการธรรมดา สำหรับคนทำงาน 1 หรือ 2 คน สำหรับงานเริ่มต้นซึ่งยังไม่มากนัก สามารถจัดอยู่ในห้องเดียวกันได้ ส่วนห้องจะมีขนาดใหญ่ขึ้น ห้องเตรียมอาหาร (Media preparation room) มีขนาด 4 เมตร X 3 เมตร ห้องถ่ายเนื้อเยือ (Transfer room) มีขนาด 3 เมตร X 1.5 เมตร และห้องเพาะเลี้ยง (Culture growing room) มีขนาด 2.5 เมตร X 3 เมตร ตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ ควรจะมี ขนาดใหญ่พอที่จะทำงานพร้อมกันได้ 2 คน ทางเข้าทั้งสองทางอาจจะปรับปรุงเป็นห้องเก็บของด้วย หรืออาจจะทำเป็นสำนักงานและวางหม้อนึ่งความดัน เครื่องกรองน้ำ หรือห้องพักก็ได้ การวางแผนควรจะคำนึงถึงสภาพแวดล้อมที่สะอาด เพราะเป็นสิ่งที่สำคัญที่สุดใน ความสำเร็จของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ สภาพอากาศรอบ ๆ ก็ควรจะบริสุทธิ์ ไม่มีฝุ่นละอองหรือมลพิษ อื่น ๆ ห้องและส่วนประกอบต่าง ๆ ควรจะปูด้วยวัสดุที่ทำความสะอาดง่าย ผิวเรียบ ฝุ่นและสารเคมี ไม่ จับ สะดวกในการทำความสะอาด 2.11 หลักที่ควรคำนึงถึงในใช้ห้องปฏิบัติการ ความสะอาดเป็นสิ่งที่ควรคำนึงถึงมากที่สุด การทำงานโดยภาพรวมและความสะดวกในการ ทำงานให้ต่อเนื่องในแต่ละขั้นตอน ก็เป็นสิ่งที่ควรจะนํามาคํานึงในการในการจัดวางตำแหน่งของห้อง ต่าง ๆ ตลอดจนตำแหน่งของทางเดิน ตู้ โต๊ะทำงาน ประตู และหน้าต่างด้วย ห้องเตรียมอาหารเปรียบ เหมือนห้องครัว ควรจะมีอ่างสำหรับล้างอุปกรณ์ มีตู้เย็นสำหรับเก็บสารบางอย่าง เช่น ฮอร์โมน มี อุปกรณ์ในการล้างเครื่องแก้ว มีที่วางเครื่องแก้ว หลังจากล้างเสร็จแล้วผึ่งให้แห้งก่อนที่จะนําเข้าไป เก็บเข้าตู้ มีชั้นหรือตู้สำหรับเก็บสารต้นตอ วุ้นและน้ำาตาล ซึ่ง ใช้ในการเตรียมอาหาร นอกจากนี้ควร จะมีโต๊ะขนาดใหญ่เพื่อสะดวกในการเตรียมอาหารมีโต๊ะที่มั่นคงแข็งแรงในการวางเตาสำหรับต้ม อาหาร เครื่องวัด pH เครื่องชั่ง และมีบริเวณสำหรับหม้อนึ่งความดัน (Autoclave) เพื่อนึ่งฆ่าเชื้อใน อาหารด้วย 1.1 ระเบียบปฏิบัติทั่วไป การใช้ห้องปฏิบัติการจะต้องยึดหลักปฏิบัติการเดียวกันเพื่อความ เป็นระเบียบ ปลอดภัยและให้เกิดผลตามวัตถุประสงค์ ห้องปฏิบัติการแต่ละแห่งอาจตั้งระเบียบไว้ให้ ทุกคนปฏิบัติเพื่อประโยชน์ ของส่วนรวมและของผู้ปฏิบัติเอง ทุกคนต้องนึกถึงความปลอดภัยที่จะเกิด
22 จากการทำงานใน ห้องปฏิบัติการซึ่งอาจเกิดจากไฟ สารเคมี เครื่องแก้ว สารกัมมันตรังสีและอื่น ๆ ทุก คนต้องช่วยกันรักษา ความสะอาด ต้องเช็ดทำความสะอาดทุกครั้งหลังจากที่ทำงานเสร็จสิ้นในแต่ละ วัน อย่าทิ้งภาระที่ตนเองทำไว้ให้คนอื่น ต้องช่วยกันประหยัด ใช้วัสดุหรือพลังงานด้วยความประหยัด เช่น สารเคมี น้ำ ไฟฟ้า ฯลฯ เก็บและล้างภาชนะทุกชิ้นที่ตนเองใช้ในแต่ละวันและวางไว้ในที่อัน เหมาะสม น้ำที่ใช้ล้างภาชนะ เครื่องแก้ว ครั้งสุดท้ายความเป็นน้ำกลั่นเพื่อป้องกันการเกิดคราบไม่ สะอาด 1.1.1 หลังล้างเสร็จแล้วให้วาคว่ำภาชนะทุกชิ้นให้แห้งก่อนเก็บเข้าที่ในตู้เก็บที่มิดชิด และควร วางคว่ำเพื่อป้องกันฝุ่นละอองตกเข้าไปภายใน 1.1.2 ก่อนใช้อุปกรณ์ทุกชนิดจะต้องเข้าใจและรู้วิธีใช้จากผู้รู้ก่อน การใช้ผิดวิธีจะทำให้เกิดผล เสียกับอุปกรณ์นั้น ๆ ได้ เช่น เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรดต่าง ฯลฯ 1.1.3 ตามปกติสารเคมีจะถูกจัดวางไว้ตามลำดับอักษรเพื่อความสะดวกในการค้น ดังนั้น หลังใช้แล้วควรเก็บเข้าที่เติมทันที 12.1.4 การชั่งสารเคมี ควรตักใส่ภาชนะหรือกระดาษไข ห้ามวางสารเคมีบนแท่นชั่ง โดยตรง ให้ตักสารเคมีทีละน้อยจนครบตามต้องการ 1.1.5 ไม่ควรตักสารด้วยซ้อนอันเดียวกัน เพื่อป้องกันการปนเปื้อน 1.1.6 วัสดุอุปกรณ์ทุกชนิดเป็นสมบัติของห้องปฏิบัติการ ไม่สมควรที่ใครจะหยิบฉวยเอา ออกไปจากห้องโดยพลการ 11.2 ข้อปฏิบัติในการใช้ตู้ปลอดเชื้อ 11.2.1 ก่อนที่จะใช้งานให้เปิดไฟ UV (Ultraviolet) ทิ้งไว้อย่างน้อย 30 นาทีพร้อมเปิดพัด ลม (Blower) เป่า ไม่ควรเปิด UV ทิ้งไว้นานเกินไปเพราะว่าจะทำให้เกิดโอโซน ซึ่งเป็นอันตราย และ ยังไวไฟด้วย 11.2.2 หลังจากปิด UV ให้มีแอลกอฮอล์ (แอลกอฮอล์หมายถึง Ethyl alcohol) 70% ให้ทั่ว ภายในตู้ เพราะ UV ไม่สามารถฆ่าเชื้อได้หมด 11.2.3 ควรฉีดพ่นแอลกอฮอล์กับอุปกรณ์ทุกชิ้นก่อนนําเข้าตู้ปลอดเชื้อ หลังจากใช้ เสร็จแล้ว ควรเช็ดพื้นตู้ให้สะอาด 11.2.4 ไม่ควรทิ้งอะไรไว้ในตู้นอกจากอุปกรณ์ที่ใช้ประจำ เช่น ปากคีบ มีดผ่าตัด ฯลฯ เพราะจะกีด ขวางการปฏิบัติงานของผู้อื่นที่จะใช้ที่หลัง
23 11.2.5 ไม่ควรแช่อุปกรณ์ เช่น ปากคีบ มีดผ่าตัด ทิ้งไว้ในแอลกอฮอล์นาน เพราะอาจเกิดการ กัดกร่อนกับโลหะได้ 11.2.6 ตรวจสอบความเรียบร้อยภายในตู้ก่อนจากไป เช่น ปิดไฟ ปิดพัดลม ปิดประตูตู้ (ถ้า มี) ปิดแก๊ส (กรณีใช้เตาแก๊ส) และถอดปลั๊กอุปกรณ์ทุกชนิดเพื่อประหยัดพลังงาน 11.2.7 ควรสังเกตแรงพัดลมของตู้ปลอดเชื้อเป็นครั้งคราว เพราะอาจเกิดการอุดตัน ของไส้ กรองจากฝุ่นละออง เพื่อเจ้าหน้าที่จะได้ให้บริการหรือเปลี่ยนไส้กรองใหม่ 11.2.8 วัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ประจำตู้ควรอยู่กับตู้ เช่น ตะเกียง ปากคีบ มีด และกระบอกฉีด แอลกอฮอล์ 2.12 ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โชคชัย วนภู (2544) ได้กล่าวถึงการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชไว้ว่า ในปัจจุบันนั้นการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อมีบทบาทอย่างมาทั้งในด้านเกษตรกรรม อุตสาหกรรม และด้านการแพทย์ 12.1. การขยายพันธุ์พืชปริมาณมากในระยะเวลาสั้น เป็นการนำชิ้นส่วนของพืชใด มาเลี้ยงใน อาหารสังเคราะห์ในสภาพปลอดเชื้อเพื่อเพิ่มปริมาณ เช่น การขยายพันธุ์กล้วยไม้ ไม้ดอกไม้ประดับ รวมถึงพืชผักบางชนิด ซึ่งปัจจุบันสามารถใช้เพื่อผลิตพืชในเชิงการค้าอย่างกว้างขวาง 12.2. การผลิตพืชที่ปราสจากเชื้อโรค การผลิตพืชโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเชื่อจะให้ดันพืชที่ป ราสจากเชื้อโรคโดยเฉพาะอย่างยิ่งจากเชื้อราและแบคที่เรียเพราะหากมีเชื้อเหล่านี้แล้วจะแสดงอาการ ปนเปื้อนในอาหารที่ใช้เลี้ยงทันที เนื่องจากแบคทีเรียและเชื้อราเจริญได้อย่างรวดเร็วในอาหาที่ใช้เยง ทำให้สามารถขจัดทิ้งได้ ส่วนไวรัส จะทำการนำชิ้นส่วนพืชที่เป็นเนื้อเยื่อเจริญ (meristem) เพาะเลี้ยง ในอาหารเพื่อผลิตท่อนพันธุ์พืชที่ปราศจากการปนเปื้อนของเชื้อโรคซึ่งไวรัสจะแพร่กระจายไปยัง เนื้อเยื่อส่วนต่าง ๆ โดยทางระบบท่อน้ำท่ออาหาร แต่การใช้ meristem ซึ่งยังไม่มีท่อน้ำท่ออาหารจะ ปลอดจากไวรัส เช่นในส่วนของเนื้อเยื่อเจริญส่วนปลายยอด (apical meristem) และเนื้อเยื่อ ส่วนคัพภะ(embryonic tissue) ที่อยู่ในเมล็ด 12.3. การปรับปรุงพันธุ์ ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สามารถคัดเลือกสายพันธุ์ที่ทนทาน (olerant plants) หรือสายพันธุ์ที่ต้านทาน (resistant plants) ได้จากการจัดการเงื่อนไขของอาหาร และสภาวะแวดล้อมของการเลี้ยง หรือชักนำการกลายพันธุ์ (induced mutation) โคยใช้รังสี หรือ สารเคมี เช่น การคัดเลือกสายพันธุ์พืชทนเค็มจากการเลี้ยงเซลล์หรือเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสม ของเกลือ การคัดเลือกสายพันธุ์ทนดินเปรี้ยวจากการเลี้ยงในอาหารที่มีสภาพกรด การคัดเลือกสาย พันธุ์ทนร้อน โคยเลี้ยงในสภาพที่มีอุณหภูมิสูง นอกจากนี้ จากความก้าวหน้าของเทคโนโลยีการตัดต่อ
24 ดีเอนเอ (DNA recombination) และการถ่ายยืน (gene transformation) ขังเปิด โอกาสในการ สร้างสายพันธุ์ใหม่ (transgenic plants) ที่ต้องการในพืชแต่ละชนิด 12.4 การผลิตยาและสารเคมีบางชนิด พืชบางชนิดให้สารที่มีคุณสมบัติเป็นยา หรือสารเคมีที่ มีประโยชน์ทางค้านอุตสาหกรรมในบางกรณี เนื้อเยื่อที่นำมาสกัดสารดังกล่าวมีปริมาณน้อยมาก จึง ต้องใช้วิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อเพิ่มจำนวน และชักนำให้มีการสังเคราะห์สารที่ต้องการในปริมาณ มากขึ้น 12.5 การศึกษาทางชีวเคมี สรีรวิทยา และพันธุศาสตร์ พืชที่เลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ สามารถติดตามการพัฒนาและการเปลี่ยนแปลงในด้านเหล่านี้ได้ง่าย ชัดเจน และถูกต้องแม่นยำ ทั้งใน ระดับเซลล์ เนื้อเชื่ออวัยวะ และพืชทั้งต้น เช่น การศึกษาการตอบสนองของเซลล์หรือเนื้อเยื่อพืชต่อ สารเคมีป้องกันกำจัดโรคและแมลงศัตรูพืช สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช เป็นต้น เนื่องจากการ ควบคุมตัวแปรต่างๆ ทำได้ดีกว่าในสภาพการปลูกปกติ 12.6 การเก็บรักษาพันธุ์พืช เป็นกระบวนการหนึ่งที่ใช้สำหรับเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรมใน ระยะยาว โดยการเก็บเนื้อแช่เย็นจัดในไนโตรเจนเหลว เพื่อหยุดยั้งกระบวนการทางชีวเคมีของเซลล์ เมื่อต้องการปลูกหรือเพิ่มปริมาณ ก็นำมาเลี้ยงในอาหารสูตรปกติของพืชนั้นๆ 12.7 เพื่อการผลิตที่พืชพันธุ์ที่ต้านทาน (resistant plant) เราสามารถที่ชักนําให้เกิดความ ต้านทานขึ้นในต้นพืช โดยการเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีเงื่อนไขต่าง ๆ เช่น การสร้างพันธุ์ต้านทานต่อ สารพิษของโรคต้านทานต่อแมลง ต้านทานต่อยากําจัดวัชพืช 12.8 เพื่อการผลิตที่พืชพันธุ์ที่ทนทาน (tolerant plant) ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เรา สามารถที่จะคัดสายพันธุ์ทนทานได้จากการจัดเงื่อนไขของอาหาร และสภาพแวดล้อม เช่น คัดเลือก สายพันธุ์พืชทนเค็มจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสมของเกลือ การคัดสายพันธุ์ทนต่อ ดินเปรี้ยวจากการเลี้ยงในอาหารที่มีสภาพเป็นกรด การคัดสายพันธุ์ที่ทนร้อนโดยการเพาะเลี้ยงใน สภาพที่มี อุณหภูมิสูง เป็นต้น 12.9 เพื่อการผลิตยาหรือสารเคมีจากพืช เป็นที่ทราบกันดีแล้วว่า พืชบางชนิดสามารถให้สาร ที่มีคุณสมบัติทางยา หรือมีประโยชน์ทางด้านอุตสาหกรรม แต่ในบางครั้งปริมาณเนื้อสารที่ต้องการมี อยู่ ในปริมาณน้อยมาก จะต้องใช้ชิ้นส่วนพืชจำนวนมากนํามาสกัดแยก การเพาะเลี้ยงเซลล์หรือ เนื้อเยื่อของ พืชเหล่านั้น ในสภาพแวดล้อมและอาหารที่เหมาะสมก็อาจชักนําให้เกิดการสังเคราะห์ สารที่เราต้องการ ได้มากขึ้น 12.10 เพื่อการศึกษาทางชีวเคมี และสรีรวิทยาของพืช ต้นพืชที่เลี้ยงในหลอดทดลองเรา สามารถที่จะติดตามการพัฒนา และเปลี่ยนแปลงได้ง่าย และอย่างใกล้ชิด เช่น การศึกษาการ
25 ตอบสนอง ของเนื้อเยื่อพืชต่อยาฆ่าแมลง ยาปราบศัตรูพืช หรือต่อสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช และการ ควบคุมตัวแปรต่าง ๆ ในหลอดทดลองกระทำได้ง่ายกว่าในแปลงทดลอง 12.11 การแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชกับต่างประเทศ (international transfer) การแลกเปลี่ยน พันธุ์ พืชในสภาพที่อยู่ในขวด สะดวกกว่าการใช้เมล็ด หรือส่วนอื่น ๆ ของพืช เพราะพืชในขวดสะอาด ปราศจาศเชื้อจุลินทรีย์ 2.13 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง เปรมฤดี ดายศ และคณะ (2563) ได้ทำการทดลองเกี่ยวกับการชักนำการเกิดแคลลัสในข้าว พันธุ์สังห์หยด ทำการชักนำการเกิดยอดทำโดยนำเมล็ดข้าวพันธุ์สังข์หยดพัทลุงที่ปลอดเชื้อวางเลี้ยง บนอาหารสูตร MS ที่ไม่เติมและเติม TDZ ความเข้มข้น 1, 2 และ 3 มก./ล. วางแผนการ ทดลองแบบ สุ่มสมบูรณ์จำนวน 10 ซ้ำ หลังเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 4 สัปดาห์พบว่าTDZ ทุกความเข้มข้น สามารถชัก นำให้เกิดยอดได้โดยไม่ผ่านการเกิดแคลลัส จำนวนยอดที่ได้มีปริมาณเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นของ TDZ ที่เพิ่มขึ้น โดยที่ระดับความเข้มข้น 3 มก./ล. ชักนำให้เกิดยอดได้จำนวนมากที่สุด (7.00 ยอด/ เมล็ด) Skoog (1962) (MS) ที่เติม BA เข้มข้น 0, 1, 2, 3,4 และ 5 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0 และ 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 8 สัปดาห์ พบว่าอาหารสูตร MS ที่เติม BA เข้มข้น 1มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้ชิ้นส่วนใบอ่อน มีการเจริญเป็นแคลลัสได้ดีที่สุดร้อยละ 50 และพบว่ามีการสร้างยอดจากแคลลัสร่วมด้วย จากนั้นทำ การย้ายแคลลัส และยอดมาเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์สูตร MS ที่เติม BA เข้มข้น 0, 1, 2, 3, 4 และ 5 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0 และ 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร เพื่อการเพิ่มปริมาณต้น อ่อนบอนสีเป็นเวลา 8 สัปดาห์ พบว่า แคลลัสสามารถเจริญเป็นต้นใหม่ได้ดีที่สุด ร้อยละ 50 เมื่อ เพาะเลี้ยงบนอาหารที่เติม BA เข้มข้น 3 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร และจากการย้ายต้นอ่อนนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรต่าง ๆ พบว่า อาหารทุกสูตรสามารถเพิ่ม ปริมาณต้นอ่อนบอนสีได้ โดยพบว่าอาหารสูตร MS ที่เติม BA เข้มข้น 2 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชัก นำให้เกิดยอดใหม่สูงสุดเท่ากับ 4 ยอด และพบว่าต้นอ่อนที่ย้ายเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่เติม BA เข้มข้น 4 มิลลิกรัมต่อลิตรร่วมกับ NAA เข้มข้น 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร มีความสูงมากที่สุด เท่ากับ 5.3 ชม. จากนั้นย้ายต้นอ่อนบอนสีที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 6 สัปดาห์ ออกย้ายปลูกในสภาพธรรมชาติ ด้วย การปลูกในดินเหนียวตากแดดจนแห้งแล้วทุบผสมกับเศษหญ้าแห้ง และขี้เถ้าแกลบ ในอัตราส่วน 2 : 1 : 1 เป็นเวลา 5 เดือนพบว่าบอนสีมีอัตราการรอดชีวิตร้อยละ 90
26 นูรูลฮูดา มะดีเย๊าะ และคณะ (2560) ผลของไซโตไคนินและความเข้มข้นต่อการเกิดยอดและ จำนวนยอดของบอนสี Caladium bicolor Vent. ในสภาพปลอดเชื้อ โดยนำส่วนต่าง ๆ ของบอนสี ได้แก่ ปลายยอด ส่วนใบที่มีก้านใบ ส่วนใบที่ไม่มีก้านใบ และส่วนก้านใบ เลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งสูตร Murashige and Skoog (Ms) ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตในกลุ่มไซโตไคนิน ได้แก่ BAความ เข้มข้น 3 mg/! น้ำผตาลซูโครส 3 เปอร์เซ็นต์ และผงวุ้น 1.1 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 8 สัปดาห์พบว่า ส่วนบอนสีที่มีความสามารถในการเกิดยอดใหม่ได้ดีที่สุดคือ ส่วนปลายยอด โดยมีเปอร์เซ็นต์การเกิด ยอดรวมสูงสุด 85 เปอร์เซ็นต์ จำนวนยอดรวมเฉลี่ยสูงสุด 22.85 ยอดต่อหนึ่งชิ้นส่วนพืชส่วนระดับ ความเข้มข้นของ BA ที่เหมาะสมต่อการเกิดยอดใหม่ของบอนสีนั้น โดยการนำส่วนยอดเลี้ยงบน อาหารสังเคราะห์สูตร MS เติม BA ที่มี 4 ระดับความเข้มข้น (0 1 3 และ 5 mg/L) เป็นเวลา 8 สัปดาห์ พบว่าBA ระดับความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อลิตร ไม่เฉพาะที่จะสามารถชักนำให้มีเปอร์เซ็นต์ การเกิดยอดใหม่สูงสุดแล้ว 100 เปอร์เซ็นต์ แต่ยังทำให้เกิดจำนวนยอดสูงสุดรวมเฉลี่ย 18.08 ยอดต่อ ชิ้นส่วนพืชอีกด้วย ภพเก้า พุทธรักษ์ (2555) ได้ทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใบอ่อนกุหลาบหิน บอนสี และคว่ำตาย หงายเป็นที่เพาะเลี้ยงบนสูตร อาหาร MS ดัดแปลง เป็นเวลา 6 สัปดาห์ พบว่าชิ้นส่วนใบอ่อนกุหลาบ หินที่เพาะเลี้ยงบนสูตรอาหาร MS ตัดแปลง ที่เติม TDZ เข้มข้น 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชัก นำให้เกิดการสร้างยอดเฉลี่ยมากที่สุด 241 ยอดต่อชิ้นพืช เริ่มต้น และการเพาะเลี้ยงใบอ่อนบอนสีบนสูตร อาหาร MS ดัดแปลง ที่เติม BA เข้มข้น 0.5 มิลลิกรัม ต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดยอดเฉลี่ยมากที่สุด 12 ยอด ต่อชิ้นพืชเริ่มต้น ส่วนการเพาะเลี้ยงใบอ่อนคว่ำตายหงาย เป็นบนสูตรอาหาร MS ดัดแปลงที่เติม BA เข้มข้น 3.0 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA เข้มข้น 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดยอด เฉลี่ยมากที่สุด 243 ยอดต่อชิ้นพืชเริ่มต้น การชักนำให้เกิดราก จากยอดใหม่ของกุหลาบหิน พบว่า ยอดอ่อนของกุหลาบหินที่เพาะเลี้ยงบนสูตรอาหาร MS ดัดแปลง ที่ เติม NAA ความเข้มข้น 0.1 และ 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดจำนวนรากเฉลี่ยมากที่สุด 7 รากต่อยอดเริ่มต้น และพืชต้น ใหม่ที่มีขนาดความสูงประมาณ 2-2.5 เซนติเมตร ของบอนสี กุหลาบหิน และคว่ำตายหงายเป็น ที่ได้ จากการทดลอง สามารถย้ายออกปลูก และเจริญเติบโตได้ดีในสภาพแวดล้อม ปกติ โดยมีอัตราการ รอดชีวิต 80 เปอร์เซ็นต์
บทที่ 3 วิธีดำเนินการวิจัย 3.1 สารเคมีและสารอินทรีย์ที่ใช้ในการวิจัย สารเคมีในการเตรียมสูตรอาหารสังเคราะห์ MS (1962) ได้แก่ 2.1 Stock solution (MS A) คือ 2.1.1 แมกนีเซียมซัลเฟลต (Magnesium sulfate; MgSO4 .7H2O) 2.1.2 โปแตสเขียมไนเตรท (Potassium Nitrate; KNO3 ) 2.1.3 แคลเซียมคลอไรท์ (Calcium chloride; CaCl2 .2H2O) 2.1.4 แอมโมเนียมไนเตรท (Ammonium Nitrate; NH4NO3 ) 2.1.5 โปตัสเขียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (Potassium Dihydrogen phosphate;KH2PO4 ) 2.2 Stock solution (MS B) คือ 2.2.1 โคบอลต์ (II) คลอไรด์ (Cobalt chloride; CoCl2 .6H2O) 2.2.2 คอปเปอร์ซัลเฟต (Copper sulfate; CuSO4 .5H2O) 2.2.3 โซเดียมโมลิบเดต (Sodium Molybdate; NaMoO4 .2H2O) 2.2.4 โพแทสเซียมไอโอไดด์ (Potassium iodide; KI) 2.2.5 กรดบอริค (Boric Acid; H3BO4 ) 2.2.6 ขิงค์ซัลเฟต (Zinc Sulfate Heptahydrate; ZnSO4 .7H2O) 2.2.7 แมงกานีสซัลเฟต (Manganese Sulfate; MnSO4 .4H2O) 2.3 Stock solution (MS c) คือ 2.3.1 โซเดียมเอทิลีนไออามีนอะซีเตรท (Na2EDTA) 2.3.2 เฟอรัสซัลเฟต (Ferrous sulfate heptahydrate; FeSO4 .7H2O) 2.4 Stock solution (MS D) คือ 2.4.1 ไทอะมีน (Thiamine) 2.4.2 กรดนิโคตินิก (Nicotinic acid)
27 2.4.3 ไกลซีน (Glycine) 2.4.4 ไพริดอกซีน (Pyridoxine) 2.5 Stock solution (MS E) คือ 2.5.1 มายโยอินโนซิตอล (Myo-inositol) 2.6 สารเคมีสำหรับทำความสะอาดและฆ่าเชื้อ 2.6.1 เอทิลแอลกอฮอล์เข้มข้น 70% (70% Alcohol) 2.6.2 เอทิลแอลกอฮอล์เข้มข้น 95% (95% Alcohol) 2.6.3 นำกลัน (Distilled water) 2.7 สารควบคุมการเจริญเติบโต 2.7.1 ฮอร์โมน BA (6-Benzylaminopurine) 2.7.2 ฮอร์โมน Kinetin (Kinetin) 2.8 สารเคมีที่ใช้ปรับ ความเป็นกรดเป็นด่าง (pH) 2.8.1 Hydrochloric acid (HCl) 1.0 N 2.8.2 Potassium hydroxide (KOH) 1.0 N 2.9 สารอินทรีย์อื่น ๆ 2.9.1 นํ้าตาลทราย (Sugar) 2.9.2 วุ้น (Agar) 3.2 เครื่องมือที่ใช้ในการวิจัย 1.1 ขวดอาหาร (Bottle) 1.2 หลอดหยด (Dropper) 1.3 ช้อนตักสาร (Spatula) 1.4 บีกเกอร์ (Beaker) 1.5 แท่งแก้ว (Stirring rod) 1.6 เครื่องชั่ง ( Balance ) 1.7 เครื่องวัดค่าความเป็นกรด-เบส (pH Meter) 1.8 บีกเกอร์แสตนเลส (Stainless beaker) 1.9 ทัพพี (Ladle)
28 1.10 ตะเกียงแอลกอฮอล์ (Burner) 1.11 ช้อนตักสาร (Spatula) 1.12 บีกเกอร์ (Beaker) 1.13 กระบอกตวง (Cylinder) 1.14 ปากคีบ (Forceps) 1.15 ตะแกรงวางหลอดทดลอง (Test tube rack) 1.16 มีดผ่าตัด (Scalpel) 1.17 จานแก้ว (Petri dish) 1.18 กระดาษฟอยล์ (Aluminum foil) 1.19 ตู้ปลอดเชื้อ (Laminar flow) 1.20 หม้อนึ่งความดันไอ (Autoclave) 1.21 หม้อด้ามอลูมิเนียม (Aluminum handle pot) 1.22 เตาแก๊ส (Gas stove) 1.23 ปืนจุดเตาแก๊ส (Gas Lighter) 1.24 ฟิล์มยืดห่ออาหาร (Wrap) 3.3 วิธีการที่ใช้ในการเก็บรวบรวมข้อมูล 3.1 ศึกษาสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมบนอาหารสังเคราะห์สูตร MS ต่อการ เจริญเติบโตของด้นอ่อนฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย 3.1.1 การศึกษาอิทธิพลของ BA ต่อการเจริญเติบโตของด้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยด่าง นำต้นอ่อนฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยขนาดความสูงประมาณ 1-1.5 ซม. ย้ายเลี้ยงบนสูตร อาหาร สังเคราะห์ MS ที่เติม BAP ที่ระดับความเข้มข้น 1, 2, 4 และ 8 มก./ล. เดิมน้ำตาล 30 ก./ล. ผงวุ้น 8 ก./ล.pH 5.7-5.8 ทำการเพาะเลี้ยงในห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ควบคุมอุณหภูมิ 25-27 องศา เซลเซียส ให้แสง 16 ชั่วโมงต่อวัน ที่ความเข้มแสง 3,000 ลักซ์ เป็นเวลา 12 สัปดาห์ 3.1.2 การศึกษาอิทธิพลของ TDZ ต่อการเจริญเติบโตของด้นด้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยด่าง นำต้นต้นอ่อนฟิโลเดนดรอนใบเลื่อยขนาดความสูงประมาณ 1-1.5 ซม. ย้ายเลี้ยงบนสูตร อาหาร สังเคราะห์ MS ที่เดิม TDZ ที่ระดับความเข้มข้น 1, 2, 4 และ 8 มก./ล. เดิมน้ำตาล 30 ก./ล.
29 ผงวุ้น 8 ก./ล. และpH 5.7-5.8 ทำการเพาะเลี้ยงในห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ควบคุมอุณหภูมิ 25-27 องศา เซลเซียส ให้แสง 16 ชั่วโมงต่อวัน ที่ความเข้มแสง 3,000 ลักซ์ เป็นเวลา 12 สัปดาห์ 3.4 วิธีการวิเคราะห์ข้อมูล เมื่อครบเวลา 12 สัปดาห์ ทำการเก็บผลการทดลอง โดยการนับจำนวนต้นที่เพิ่มขึ้น ความสูง ของต้น จำนวนราก ความยาวราก และจำนวนใบ จากนั้น นำข้อมูลมาทำการวิเคราะห์ผลการทดลอง โดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูป SPSS เพื่อหาค่าเฉลี่ย (Mean) ค่า คลาดเคลื่อนมาตรฐาน (Standard Error) และทดสอบความแตกต่างระหว่างค่าเฉลี่ยด้วยวิธี Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT หรือ DUNCAN)
บทที่ 4 ผลการวิจัย 4.1 ผลจากการศึกษาสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมบนอาหารสังเคราะห์สูตร MS ต่อ การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) 4.1.1 อิทธิพลของ BA ต่อการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) ต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) ขนาด 1-1.5 เซนติเมตร เพาะเลี้ยงในอาหาร สูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่เติม BA ความเข้มข้น 0, 1, 2, 4, และ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นเวลา 12 สัปดาห์ พบว่าต้นที่เพาะเลี้ยงบนอาหารที่เติม BA ความเข้มข้น 0, 1, 2, 4, และ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เพิ่มจำนวนหน่อใหม่เฉลี่ย 15.69, 18.91, 24.57, 27.31 และ 21.67 หน่อต่อต้น ความสูงต้นเฉลี่ย 1.44, 1.22, 1.36, 1.09 และ 1.06 เซนติเมตร จำนวนรากเฉลี่ย 0.44, 0.16, 0.20, 0.37 และ 0.14 รากต่อต้น ความยาวรากเฉลี่ย 0.54, 0.24, 0.10, 0.12 และ 0.45 เซนติเมตร และ จำนวนใบเฉลี่ย 5.98, 5.03, 5.88, 5.30 และ 4.70 ใบต่อต้นตามลำดับ จากการทดลองพบว่าสูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่เติม BA ความเข้มข้น 4 มิลลิกรัม ต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดจำนวนหน่อใหม่เฉลี่ยสูงสุด 27.31 เซนติเมตร สูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่ไม่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโต และการที่เติม BA 2 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เพิ่มความ สูงต้นเฉลี่ยสูงที่สุด 1.44 และ 1.34 เซนติเมตร ตามลำดับ สูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่ไม่เติมสาร ควบคุมการเจริญเติบโต สามารถเพิ่มจำนวนราก ความยาวรากและจำนวนใบเฉลี่ยมากที่สุด คือ 0.44, 0.54 และ 5.98 ตามลำดับ มีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95%
ตาราง 4.1 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรหมายเหตุ อักษรที่แตกต่างกันทางแนวตั้งมีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับควNS หมายถึง ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95* หมายถึง แตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95% ค่าตัวเลขในตาราง หมายถึง ค่าเฉลี่ย (mean) " ± " ค่าคลาดเคลื่อนสูตรอาหาร MS ที่เติมสาร ควบคุมการเจริญเติบโต จำนวนหน่อใหม่ เฉลี่ยต่อต้น ความสูงต้นเฉลี่ย (ซม./ต้น) จำMS+BA 0 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 1 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 2 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 4 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 8 มิลลิกรัมต่อลิตร 15.69±2.03c 18.91±1.60bc 24.57±2.99ab 27.31±2.80a 21.67±0.71abc 1.44±0.07a 1.22±0.51b 1.36±0.32a 1.09±0.44bc 1.06±0.37c F-test * *
31 รอาหาร MS ที่เติม BA ที่ระดับความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ วามเชื่อมั่น 95% จากการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบ DMRT 5% นมาตรฐาน (Standard Error) จำนวนรากเฉลี่ย (ราก/ต้น) ความยาวรากเฉลี่ย (ซม./ต้น) จำนวนใบเฉลี่ย (ใบ/ต้น) 0.44±0.12a 0.16±0.05b 0.20±0.05b 0.37±0.01b 0.14±0.04b 0.54±0.17a 0.24±0.13b 0.10±0.51b 0.12±0.01b 0.45±0.02b 5.98±0.41a 5.03±0.27c 5.88±0.17ab 5.30±0.12bc 4.70±0.11c * * *
32 ภาพที่ 4.1 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรอาหาร MS ร่วมกับ BA ทีระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ (ก) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ความเข้มข้น 0 มก./ล. หรือ ควบคุม(control) (ข) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ความเข้มข้น 1 มก./ล. (ค) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ความเข้มข้น 2 มก./ล. (ง) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ความเข้มข้น 4 มก./ล. (จ) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ความเข้มข้น 8 มก./ล. ก ข ค ง จ 1 cm. 1 cm. 1 cm. 1 cm. 1 cm.
33 (ก) ค่าเฉลี่ยจำนวนหน่อใหม่เมื่อเพาะเลี้ยงบน อาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้นต่างๆ หลังจาก เพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ (ค) ค่าเฉลี่ยความสูงเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้นต่างๆ หลังจากเพาะเลี้ยง นาน 12 สัปดาห์ (ข) ค่าเฉลี่ยความยาวรากเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้นต่างๆ หลังจาก เพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ (ง) ค่าเฉลี่ยจำนวนใบเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้นต่างๆ หลังจากเพาะเลี้ยง นาน 12 สัปดาห์ (จ) ค่าเฉลี่ยจำนวนรากเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม BA ความเข้มข้นต่างๆหลังจากเพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ ภาพที่ 4.2 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) บนสูตรอาหาร MS ที่เติม BA ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆที่แตกต่างกันเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ 15.69 18.9 24.57 27.31 21.66 0 20 40 จ ำนวนหน่อใหม่ control BA1 BA2 BA4 BA8 (หน่อ/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนหน่อใหม่เฉลี่ย 1.43 1.22 1.36 1.08 1.05 0 1 2 control BA1 BA2 BA4 BA8 ควำมสูงต้น (ซม.) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) ความสูงต้นเฉลี่ย 0.44 0.15 0.11 0.02 0.08 0 0.2 0.4 0.6 control BA1 BA2 BA4 BA8 จ ำนวนรำก (รำก/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนรากเฉลี่ย 0.54 0.24 0.1 0.01 0.04 0 0.2 0.4 0.6 control BA1 BA2 BA4 BA8 ควำมยำวรำก (ซม.) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) ความยาวรากเฉลี่ย 5.98 5.03 5.88 5.25 4.7 0 5 10 control BA1 BA2 BA4 BA8 จ ำนวนใบ (ใบ/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนใบเฉลี่ย
34 4.1.2 อิทธิพลของ TDZ ต่อการเจริญเติบโตของต้นต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) ต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) ขนาด 1-1.5 เซนติเมตร เพาะเลี้ยงในอาหารสูตรอาหาร สังเคราะห์ MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้น 0, 1, 2, 4, และ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นเวลา 12 สัปดาห์ พบว่าต้นที่ เพาะเลี้ยงบนสูตรสังเคราะห์MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้น 0, 1, 2, 4, และ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำ ให้เพิ่มจำนวนหน่อใหม่เฉลี่ย 15.69, 5.66, 3.42, 3.12 และ 5.77 หน่อต่อต้น ตามลำดับ ความสูงเฉลี่ย 1.44, 1.14, 1.10, 0.83 และ 0.86 เซนติเมตร จำนวนรากเฉลี่ย 0.44, 0.02, 0.01, 0.00 และ 0.06 รากต่อต้น ความ ยาวรากเฉลี่ย 0.54, 0.01, 0.01, 0.00 และ 0.01 เซนติเมตร และจำนวนใบเฉลี่ย 5.98, 2.96, 3.10, 2.54 และ 2.32 ใบต่อต้น ตามลำดับ จากการทดลองพบว่าสูตรอาหารสังเคราะห์ที่ไม่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโต สามารถชักนำให้เพิ่ม จำนวนหน่อใหม่ ความสูงต้น จำนวนราก ความยาวราก และจำนวนใบเฉลี่ยสูงสุด 15.69, 1.44, 0.44, 0.54 และ 5.98 เซนติเมตร ตามลำดับ มีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95%
ตาราง 4.2 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรหมายเหตุ อักษรที่แตกต่างกันทางแนวตั้งมีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับควNS หมายถึง ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95* หมายถึง แตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95% ค่าตัวเลขในตาราง หมายถึง ค่าเฉลี่ย (mean) " ± " ค่าคลาดเคลื่อนสูตรอาหาร MS ที่เติมสาร ควบคุมการเจริญเติบโต จำนวนหน่อใหม่ เฉลี่ยต่อต้น ความสูงต้นเฉลี่ย (ซม./ต้น) จำMS+TDZ 0 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 1 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 2 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 4 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร 15.69±2.03a 5.66±0.66b 3.42±0.38b 3.12±0.47b 5.77±0.49b 1.44±0.07a 1.14±0.03b 1.10±0.08b 0.83±0.10c 0.86±0.03c F-test * *
35 รอาหาร MS ที่เติม TDZ ที่ระดับความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ วามเชื่อมั่น 95% จากการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบ DMRT 5% นมาตรฐาน (Standard Error) จำนวนรากเฉลี่ย (ราก/ต้น) ความยาวรากเฉลี่ย (ซม./ต้น) จำนวนใบเฉลี่ย (ใบ/ต้น) 0.44±0.12a 0.02±0.01b 0.01±0.01b 0.00±0.00b 0.06±0.01b 0.54±0.17a 0.01±0.01b 0.01±0.01b 0.00±0.00b 0.01±0.01b 5.98±0.41a 2.96±0.13bc 3.10±0.28b 2.54±0.24bc 2.32±0.12c * * *
36 ภาพที่ 4.3 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูตรอาหาร MS ร่วมกับ TDZ ที ระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันเป็นเวลา 12 สัปดาห์ (ก) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต TDZ ความเข้มข้น 0 มก./ล. หรือ ควบคุม(control) (ข) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต TDZ ความเข้มข้น 1 มก./ล. (ค) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต TDZ ความเข้มข้น 2 มก./ล. (ง) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต TDZ ความเข้มข้น 4 มก./ล. (จ) ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโต TDZ ความเข้มข้น 8 มก./ล. ก ข ค ง จ 1 cm. 1 cm. 1 cm. 1 cm. 1 cm.
37 (ก) ค่าเฉลี่ยจำนวนหน่อใหม่เมื่อเพาะเลี้ยงบน อาหาร MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้นต่างๆ หลังจากเพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ (ค) ค่าเฉลี่ยความสูงเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้นต่างๆ หลังจากเพาะเลี้ยง นาน 12 สัปดาห์ (ข) ค่าเฉลี่ยจำนวนรากเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้นต่างๆ หลังจาก เพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ (ง) ค่าเฉลี่ยความยาวรากเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้นต่างๆ หลังจาก เพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ (จ) ค่าเฉลี่ยจำนวนใบค่าเฉลี่ยจำนวนรากเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม TDZ ความเข้มข้นต่างๆ หลังจากเพาะเลี้ยงนาน 12 สัปดาห์ ภาพที่ 4.4 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of fire) บนสูตรอาหาร MS ที่เติม TDZ ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆที่แตกต่างกันเป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ 15.69 5.66 3.42 3.12 5.76 0 10 20 control TDZ1 TDZ2 TDZ4 TDZ8 จ ำนวนหน่อใหม่ (หน่อ/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนหน่อใหม่ 1.43 1.14 1.1 0.83 0.86 0 1 2 control TDZ1 TDZ2 TDZ4 TDZ8 ควำมสูงต้น (ซม.) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) ความสูงต้นเฉลี่ย 0.44 0.02 0.01 0 0.02 0 0.2 0.4 0.6 control TDZ1 TDZ2 TDZ4 TDZ8 จ ำนวนรำก (รำก/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนรากเฉลี่ย 0.54 0.009 0.008 0 0.006 0 0.2 0.4 0.6 control TDZ1 TDZ2 TDZ4 TDZ8 ควำมยำวยำก (ซม.) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) ความยาวรากเฉลี่ย 5.98 2.96 3.29 2.54 2.31 0 5 10 control TDZ1 TDZ2 TDZ4 TDZ8 จ ำนวนใบ (ใบ/ต้น) สูตรอาหาร MS (มก./ล.) จ านวนใบเฉลี่ย
38 4.13. เปรียบเทียบอิทธิพลของ BA และ TDZ ต่อการเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) จากการศึกษาสูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโต BA และ TDZ ที่ระดับ ความเข้มข้นแตกต่างกัน พบว่าสูตรอาหารสังเคราะห์ MS ที่เติม BA ความเข้มข้น 4 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถ ชักนำให้เพิ่มจำนวนหน่อใหม่เฉลี่ยสูงสุด 27.31 หน่อต่อต้น และสูตรอาหารสังเคราะห์ที่ไม่เติมสารควบคุมการ เจริญเติบโต สามารถชักนำให้เพิ่มความสูงต้น จำนวนราก ความยาวราก และจำนวนใบเฉลี่ยสูงสุด 1.44, 0.44, 0.54 และ 5.98 เซนติเมตร ตามลำดับ มีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95%
ตาราง 4.3 การเจริญเติบโตของต้นฟิโลเดนดรอนใบเลื่อย (Ring of Fire) บนสูสัปดาห์ สูตรอาหาร MS ที่เติมสาร ควบคุมการเจริญเติบโต จำนวนหน่อใหม่ เฉลี่ยต่อต้น ความสูงต้นเฉลี่ย (ซม./ต้น) MS MS+BA 1 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 2 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 4 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+BA 8 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 1 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 2 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 4 มิลลิกรัมต่อลิตร MS+TDZ 8 มิลลิกรัมต่อลิตร 15.69±2.03c 18.91±1.60bc 24.57±2.99ab 27.31±2.80a 21.67±0.71 ab 5.66±0.66d 3.42±0.38d 3.12±0.47d 5.77±0.49d 1.44±0.07a 1.22±0.51bc 1.36±0.32ab 1.09±0.44c 1.06±0.37c 1.14±0.03c 1.10±0.08c 0.83±0.10d 0.86±0.03d F-test * * หมายเหตุ อักษรที่แตกต่างกันทางแนวตั้งมีความแตกต่างกันทางสถิติที่ระดับควNS หมายถึง ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95* หมายถึง แตกต่างกันทางสถิติ ที่ระดับความเชื่อมั่น 95% ค่าตัวเลขในตาราง หมายถึง ค่าเฉลี่ย (mean) " ± " ค่าคลาดเคลื่อน