Buku Ajar Kimia Organik Analisis

1

University of Lampung

PEMISAHAN DAN
PEMURNIAN SENYAWA
ORGANIK DENGAN
METODE MODERN

BOOK CHAPTER

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
SENYAWA ORGANIK DENGAN
METODE KLASIK DAN MODERN

BOOK CHAPTER

PENULIS :
MEGA MURYANI 1817011027

MIFTA RAHMA 1657011007
MUTIARA ALFIANTI 1917011017

DOSEN PEMBIMBING
SYAIFUL BAHRI, S.Si, M.Si

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG
2021

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan karunia-Nya
sehingga Book Chapter dengan judul Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Organik
dengan Metode Klasik telah selesai. Topik book chapter Merujuk Pemisahan Dengan
Metode Klasik dan Pemurnian dengan Metode Klasik. Secara garis besar, cakupan
materinya meliputi Pemisahan dengan metode HPLC dan Pemurnian dengan metode fase
padat.
Harapan saya, dengan adanya book chapter ini, semoga dapat menambah referensi dan
wawasan tentang upaya pemisahan dan pemurnian senyawa organik dalam bidang kimia.
Saya mengetahui jika banyaknya kesalahan dan kekurangan dalam penulisan book
chapter ini, maka saya sebagai penulis meminta maaf. Semoga kedepannya dapat
diperbaiki lebih baik.

ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR...................................................................................................... ii
DAFTAR ISI ...............................................................................................................iii
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................... iv
DAFTAR TABEL............................................................................................................
CHAPTER 1. PEMURNIAN DAN PEMISAHAN SENYAWA ORGANIK DENGAN
METODE KLASIK MASERASI DAN REKRISTALISASI ........................................ 1
1. PEMBAHASAN ......................................................................................................2

1. METODE MASERASI ................................................................................2
2. METODE REKRISTALISASI.....................................................................4
CHAPTER 2. PEMURNIAN DAN PEMISAHAN SENYAWA ORGANIK DENGAN
METODE KLASIK SOXHLET DAN KROMATROGRAFI LAPIS TIPIS (KLT).. 7
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................................ 7
BAB II PEMBAHASAN ............................................................................................... ..9
1. ... Metode Soxhletasi........................................................................................... 9

A..... Sejarah Penemuan Soxhlet........................................................................9
B. Pengertian Soxhletasi ........................................................................... 10
C. Syarat Pelarut dalam Soxhletasi........................................................... 10
D. Komponen Soxhlet............................................................................... 12
E. Prinsip Kerja Soxhletasi ....................................................................... 12
F. Mekanisme Kerja Metode Soxhletasi .................................................. 14
G. Kelebihan dan Kekurangan Metode Soxhletasi ................................... 15
H. Cara Penyimpanan dan Perawatannya ................................................. 16
I. Aplikasi ................................................................................................ 16
2. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................... 17
A. Sejarah Kromatografi Lapis Tipis ........................................................ 17
B. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis ................................................... 18
C. Prinsip Kerja......................................................................................... 20
D. Fasa Diam............................................................................................. 20

ii
i

E. Fase Gerak (Eluen)............................................................................... 21
F. Aplikasi (Penotolan) Sampel................................................................ 22
G. Cara semiotomatis ................................................................................ 23
H. Cara otomatis........................................................................................ 24
I. Pengambangan (Elusi) Sampel............................................................. 24
J. Sorben Fasa Diam ................................................................................ 26
K. Deteksi Noda ........................................................................................ 27
L. Nilai Rf (Retency Factor)..................................................................... 28
M. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis ........................ 30
N. Aplikasi ................................................................................................ 31
BAB III PENUTUP........................................................................................................ 33
CHAPTER 3. PEMURNIAN DAN PEMISAHAN SENYAWA ORGANIK DENGAN
METODE MODERN........................................................................................................ 34
I. PEMBAHASAN ..................................................................................................... 35
1. Teori Pemisahan ...................................................................................................... 35
2. Metode Pemisahan................................................................................................... 37
A. HPLC..........................................................................................................................37
i. Prinsip HPLC.................................................................................................... 38
ii. Sistem Peralatan HPLC.............................................................................................38
iii. Jenis HPLC.................................................................................................................42
iv. Derivatisasi HPLC.............................................................................................44
v. Keuntungan HPLC ....................................................................................................45
vi. Perbedaan HPLC dengan Kromatrografi Lainnya.............................................45
3. Metode Pemurnian....................................................................................................46
A. Metode Fase Padat........................................................................................ 46
i. Prinsip .........................................................................................................................47
ii. Kelebihan dan Kekurangan SPE.................................................................. 47
iii. Prosedur SPE .....................................................................................................48
iv. Pengembangan Metode......................................................................................49
v. Fase SPE............................................................................................................49
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 51

iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Soxhletasi.........................................................................................................12
Gambar 2. Alat Aplikasi Sampel Secara Manual.................................................................23
Gambar 3. Pengambangan Menaik (ascending) dan pengembangan menurun (descending).......25
Gambar 4. Prosedur pengembangan dua dimensi .............................................................26
Gambar 5.Diagram Sistem Kromatografi Cair ............................................................... 39
Gambar 6. (a). Posisi saat memuat sampel (b) Posisi saat menyuntikan sampel ............. 40
Gambar 7. Diagram HPLC ............................................................................................. ..46
Gambar 8. Diagram Skematik Prosedur SPE............................................................. ..48
Gambar 9. Tabel Jenis Fase SPE .............................................................................. ..50

iv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Jenis-Jenis Fase Diam dan Tujuan Penggunaannya........................................21

v

CHAPTER 1. PEMISAHAN DAN

PEMURNIAN SENYAWA ORGANIK
DENGAN METODE KLASIK MASERASI
DAN REKRISTALISASI

1. PENDAHULUAN

Pemisahan merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan atau
memurnikan senyawa tunggal, kelompok senyawa dengan susunan yang
berkaitan dengan atau suatu zat yang terdapat dalam bahan alam, hasil proses
baik dalam skala labolatorium maupun skala industri. Pemisahan dibagi menjadi
2, yaitu :

 Pemisahan dengan proses sederhana
Pemisahan ini dengan cara tunggal, misalnya dua cairan yang tidak
bercampur diambil dengan pipet atau corong pisah, destilasi,sentrifugasi,
filtrasi dan lain-lain.

 Pemisahan dengan proses kompleks
Proses yang kompleks ini biasanya memrlukan pembentukan fase yang
kedua yaitu dengan menambah cairan, padatan, atau gas. Proses ini juga
memerlukan pengaturan dengan mekanis ataupun reaksi kimia untuk
menghasilkan pemisahan yang efektif.

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada proses pemisahan yaitu tempat senyawa
atau komponen yang akan dipisahkan (dalam keadaan tercampur atau terikat
secara kimia) ,kadar senyawa yang dipisahkan, sifat kimia dan fisika dari
senyawa yang dipisahkan, standar kemurnian yang dikehendaki, cemaran atau
campuran yang akan menjadi sumber gangguan pada proses pemisahan dan
keadaan dan harga senyawa yang akan dipisahkan.

Pemurnian adalah memisahkan campuran zaat agar mendaptkan zat-zat murni
dengan perbandingan filtrat, sentrat, dan juga dapat memisahkan antara suatu zat
dari campuran air dan campuran padat agar diperoleh suatu keadaan yang murni.
Prinsip dari pemurnian adalah berdasarkan ukuran partikel dari campuran zat cair
dengan zat padat dengan berbagai cara.

vi

2

2. PEMBAHASAN

Pemisahan dan pemurnian adalah proses pemisahan dua zat atau lebih yang
saling bercampur serta untuk mendapatkan zat murni suatu zat yang telah
tercemar atau tercampur. Campuran adalah contoh materi yang tidak murni, yaitu
bukan sebuah unsur atau sebuah senyawa. Pemisahan dan pemurnian senyawa
organik terdiri atas metode klasik dan metode modern. Berikut merupakan
metode klasik dari pemisahan dan pemurnian senyawa organik.

1. METODE MASERASI
A. Pemisahan dengan metode maserasi
Maserasi merupakan metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut diam atau
dengan adanya pengadukkan beberapa kali pada suhu ruangan. Metode ini dapat
dilakukan dengam cara merendam bahan dengan sekali-sekali dilakukan
pengadukan. Pada umumnya perendaman dilakukan selama 24 jam, kemudian
pelarut diganti dengan pelarut baru. Maserasi juga dapat dilakukan dengan
pengadukan secara sinambung (maserasi kinetik). Maserasi termasuk jenis
ekstraksi tanpa sistem pemanasan atau dikenal dengan istilah ekstraksi dingin,
jadi pada metode ini pelarut dan sampel tidak mengalami pemanasan sama sekali.
Sehingga maserasi merupakan teknik ekstraksi yang dapat digunakan untuk
senyawa yang tidak tahan panas. Namun, biasanya maserasi digunakan untuk
mengekstrak senyawa ynag tidak tahan panas (termolabil) atau senyawa yang
belum diketahui sifatnya. Karena itu membutuhkan pelarut yang banyak dan
waktu yang lama(Marjoni,2016).

B. Prinsip kerja dari maserasi
Prinsip maserasi adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam
serbuk dalam pelarut yang sesuai selama beberapa hari pada temperature kamar
terlindung dari cahaya, pelaut akan masuk kedalam sel tanaman melewati
dididing sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan
didala sel dengan diluar sel. Larutan yang konentrasinya tinggi akan terdeak
keluar dan diganti oleh pelarut dengan konsentrasi redah (proses difusi).
Peristiwa tersebut akan berulang sampai terjadi keseimbangan antara larutan
didalam sel dan larutan diluar sel (Ansel, 1989).

C. Pelarut yang digunakan dalam metode maserasi
Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan prinsip kelarutan. Prinsip
kelarutan adalah like dissolve like, yaitu (1) pelarut polar akan melarutkan
senyawa polar, demikian juga sebaliknya pelarut nonpolar akan melarutkan
senyawa nonpolar, (2) pelarut organik akiian melarutkan senyawa organik.

3

Menurut Farmakope Indonesia, pelarut yang dapat digunakan pada maserasi
adalah air, etanol, etanol-air atau eter. Pilihan utama untuk pelarut pada maserasi
25 adalah etanol karena etanol memiliki beberapa keunggulan sebagai pelarut
diantaranya yaitu:
 Etanol bersifat lebih selektif
 Dapat menghambat pertumbuhan kapang dan kuman
 Bersifat non toksik (tidak beracun)
 Etanol bersifat netral
 Memiliki daya absorbsi yang baik
 Dapat bercampur dengan air pada berbagai perbandingan
 Panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit
 Etanol dapat melarutkan berbagai zat aktif dan meminimalisir terlarutnya
zat pengganggu seperti lemak.

D. Prosedur metode maserasi
Langkah-langkah pengerjaan maserasi adalah sebagai berikut:
 Simplisia dimasukkan ke dalam wadah yang bersifat inert dan tertutup rapat
pada suhu kamar.
 Simplisia kemudian direndam dengan pelarut yang cocok selama beberapa
hari sambil sesekali diaduk. Pelarut yang digunakan untuk maserasi data bersifat
“bisa dicampur air” seperti air itu sendiri yang disebut dengan pelarut polar dan
dapat juga digunakan pelarut yang tidak dapat bercampur dengan air seperti :
aseton, etil asetat. Pelarut yang tidak dapat bercampur dengan air ini disebut
pelarut non polar atau pelarut organik.
 Setelah proses ekstraksi selesai, pelarut dipisahkan dari sampel dengan cara
penyaringan.

Waktu maserasi pada umumnya adalah 5 hari, karena dengan waktu tersebut
telah tercapai keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel
dengan luar sel. Pengocokan yang dilakukan selama maserasi akan menjamin
keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Tanpa
adanya pengocokan akan mengakibatkan berkurangnya perpindahan bahan aktif
selama proses maserasi.

E. Kelebihan dan kekurangan ekstraksi secara maserasi
Ekstraksi secara maserasi tidak terlepas dari kelebihan dan kekurangan yang
dimiliki. Berikut ini adalah kelebihan dan kekurangan metode maserasi :
 Kelebihan dari Metode Maserasi
I. Peralatan yang digunakan sangat sederhana

iii

4

II. Teknik pengerjaan relative sederhana dan mudah dilakukan
III. Biaya operasionalnya relative rendah
IV. Dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa yang bersifat termolabil

karena maserasi dilakukan tanpa pemanasan.
V. Proses ekstraksi lebih hemat penyari.

 Kekurangan Metode Maserasi
I. Kerugian utama dari metode maserasi ini adalah memerlukan banyak

waktu.
II. Proses penyariannya tidak sempurna, karena zat aktif hanya mampu

terekstraksi sebesar 50%
III. Pelarut yang digunakan cukup banyak
IV. Kemungkinan besar ada beberapa senyawa yang hilang saat ekstraksi
V. Beberapa senyawa sulit diekstraksi pada suhu kamar
VI. Penggunaan pelarut air akan membutuhkan bahan tambahan seperti

pengawet yang diberikan pada awal ekstraksi. Penambahan pengawet
dimaksudkan untuk mencegah pertumbuhan bakteri dan kapang.

2. METODE REKRISTALISASI
A. Pemurnian dengan metode rekristalisasi
Rekristalisasi merupakan salah satu cara pemurnian zat padat dimana zat-zat
tersebut tersebut dilarutkan dalam suatu pelarut kemudian dikristalkan kembali.
Cara ini bergantung pada kelarutan zat dalam pelarut tertentu di kala suhu
diperbesar. Konsentrasi total impuriti biasanya lebih kecil dari konsentrasi zat
yang dimurnikan, bila dingin, maka konsentrasi impuriti yang rendah tetapi
dalam larutan sementara produk yang berkonsentrasi tinggi akan mengendap
(Arsyad, 2001). Rekristalisasi merupakan metode yang sangat penting untuk
pemurnian komponen larutan organik. Ada tujuh metode dalam rekristalisasi
yaitu: memilih pelarut, melarutkan zat terlarut, menghilangkan warna larutan,
memindahkan zat padat, mengkristalkan larutan, mengumpul dan mencuci kristal,
serta mengeringkan produknya (hasil) (Williamson, 1999).

B. Prinsip kerja metode rekristalisasi
Prinsip dasar proses rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang
dimurnikan dengan zat pengotornya. Pelarut yang digunakan tidak semua pelarut,
hanya pelarut yang digunakan. Syarat-syarat yang digunakan adalah pelarutnya
tidak bereaksi

iv

5

dengan zat yang dilarutkan, pelarut dapat melarutkan yang akan dilarutkan dan
tidak melarutkan zat pencemarnya. Titik didih pelarut harus lebih rendah dari
titik leleh zat yang dimurnikan agar zat tersebut tidak terurai.

C. Syarat-syarat pelarut yang baik untuk kristalisasi
Dalam proses kristalisasi diperlukan pelarut yang baik agar hasil kristal yang
didapatkan bisa berkualitas baik pula. Syarat-syarat pelarut yang baik, antara lain:

 Mempunyai titik didih relative rendah agar mudah terpisah dengan kristal
murni

 Memberikan perbedaan daya larut yang cukup besar antara zat yang
dimurnikan dengan zat pengotor.

 Tidak meninggalkan zat pengotor pada kristal
 Bersifat inert ( tidak mudah bereaksi dengan kristal)
 Mudah dipisahkan dari kristalnya
 Dapat melarutkan senyawa lain
 Mempunyai daya larut yang tinggi
 Berupa pemurni atau dengan kata lain pelarut biasanya berupa pemurni.

D. Hal yang perlu diperhatikan dalam rekristalisasi
 Pemilihan Pelarut

Pemilihan pelarut hendaknya berdasarkan kepolarannya, dimulai dari
pelarut yang polar berurut ke pelarut yang non polar atau sebaliknya, jika
cara tersebut tidak berhasil dengan baik, dapat dicoba dengan menggunakan
campuran beberapa macam pelarut.

 Pembentukan Kristal
Untuk mempercepat proses pembentukan kristal dapat dilakukan dengan
menambahkan butir kristal yang sama pada larutan lewat jenuh. hal ini
diperlukan untuk membantu pembentukan inti kristal, cara ini sering
dilakukan untuk pengkristalan senyawa anorganik. untuk senyawa organik
cara tersebut agak sulit dilakukan jarena pembentukan kristal
senyawaorganik pada umumnya sangat lambat. Cara yang paling tepat ialah
dengan mendinginkan larutan lewat jenih dengan es sambil diaduk, maka
kristal akan cepat terbentuk.

 Penyaringan

Penyaringan harus dilakukan secara cepat, sedangkan larutan dapat dalam

keadaan panas dan dingin. Jika penyaringan dilakukan dalam keadaan

panas, maka diperlukan penyaring buchner dengan pompa vakum agar

penyaringan cepat selesai. v

6

(proses ini sebenarnya ialah proses filtrasi) . Kertas saring dipilih yang
ukuran medium, jika perlu gunakan 2 buah kertas saring yang digabung
menjadi satu agar tidak bocor sewaktu divakumkan. Jika partikel pengotor
sangat kecil, dapat dilakukan sentrifugasi terlebih dahulu sebelum dilakukan
penyaringan.
 Pengeringan Kristal Dari Pelarutnya
Kristal yang stabil, dapat langsung dikeringkan menggunakan oven
pemanas, suhu oven pemanas diatur diatas titik didih pelarutnya tetapi suhu
masih dibawah titik leleh kristal. Setelah dipanaskan beberapa lama, kristal
ditempatkan di desikator, bila perlu desikator divakumkan untuk
mempercepat pengeringan. Desikator harus diisi zat pengadsorpsi yang
sesuai dengan jenis pelarut yang digunakan.

E. Rekristalisasi dengan pelarut tunggal dan multi-pelarut
 Rekristalisasi dengan pelarut tunggal

 Rekristalisasi multi-pelarut

vi

7

CHAPTER 2. PEMISAHAN DAN PEMURNIAN SENYAWA
ORGANIK DENGAN METODE KLASIK SOXHLET DAN
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

BAB I PENDAHULUAN

Metode pemisahan merupakan suatu cara yang digunakan untuk memisahkan
ataumemurnikan suatu senyawa atau skelompok senyawa yang mempunyai susunan
kimiayang berkaitan dari suatu bahan, baik dalam skala laboratorium maupun skala
industri.Metode pemisahan bertujuan untuk mendapatkan zat murni atau beberapa zat
murni dari suatu campuran, sering disebut sebagai pemurnian dan juga untuk
mengetahui keberadaansuatu zat dalam suatu sampel (analisis laboratorium).

Sebagian besar senyawa kimia ditemukan di alam dalam keadaan yang tidak murni.
Biasanya, suatu senyawa kimia berada dalam keadaan tercampur dengan senyawa lain.
Untuk beberapa keperluan seperti sintesis senyawa kimia yang memerlukan bahan baku
senyawa kimia dalam keadaan murni atau proses produksi suatu senyawa kimia dengan
kemurnian tinggi, proses pemisahan perlu dilakukan. Proses pemisahan sangat penting
dalam bidang teknik kimia. Suatu contoh pentingnya proses pemisahan adalah pada
proses pengolahan minyak bumi. Minyak bumi merupakan campuran berbagai
hidrokarbon. Pemanfaatan hidrokarbon- hidrokarbon penyusun minyak bumi akan lebih
berharga bila memiliki kemurnian yang tinggi. Proses pemisahan minyak bumi menjadi
komponen-komponennya akan menghasilkan produk LPG, solar, avtur, pelumas, dan
aspal.

Secara mendasar, proses pemisahan dapat diterangkan sebagai proses perpindahan massa.
Proses pemisahan sendiri dapat diklasifikasikan menjadi proses pemisahan secara
mekanis atau kimiawi. Pemilihan jenis proses pemisahan yang digunakan bergantung
pada kondisi yang dihadapi. Pemisahan secara mekanis dilakukan kapanpun
memungkinkan karena biaya operasinya lebih murah dari pemisahan secara kimiawi.
Untuk campuran yang tidak dapat dipisahkan melalui proses pemisahan mekanis
(seperti pemisahan minyak bumi), proses pemisahan kimiawi harus dilakukan.

Proses pemisahan suatu campuran dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode
pemisahan yang dipilih bergantung pada vfai se komponen penyusun campuran. Suatu
campuran dapat berupa campuran homogeni (satu fase) atau campuran heterogen (lebih

8
dari satu fase). Suatu campuran heterogen dapat mengandung dua atau lebih fase: padat-
padat, padat-cair, padat-gas, cair-cair, cair- gas, gas-gas, campuran padat-cair-gas, dan
sebagainya. Pada berbagai kasus, dua atau lebih proses pemisahan harus
dikombinasikan untuk mendapatkan hasil pemisahan yang diinginkan.

Pemisahan dan pemurnian adalah proses pemisahan dua zat atau lebih yang saling
bercampur serta untuk mendapatkan zat murni dari suatu zat yang telah tercemar
atau tercampur. Campuran adalah setia contoh materi yang tidak murni, yaitu bukan
sebuah unsur atau sebuah senyawa. Susunan suatu campuran tidak sama dengan
sebuah zat, dapat bervariasi, campuran dapat berupa homogen dan heterogen.

Pemisahan dan pemurnian campuran dilakukan berdasarkan pada zat-zat yang
tercampur tersebut. Misalnya campuran air dan pasir dipisahkan dengan
menggunakan pengendapan atau dekantasi. Campuran air dan garam dipisahkan
dengan menggunakan metode kristalisasi. Campuran air dan kapur dipisahkan
dengan menggunakan metode penyaringan atau filtrasi, dan sebagainya.

vi
i

9

BAB II PEMBAHASAN

Ekstraksi adalah pemisahan suatu zat dari campurannya dengan pembagian sebuah zat
terlarut antara dua pelarut yang tidak dapat tercampur untuk mengambil zat terlarut
tersebut dari satu pelarut ke pelarut yang lain. Ekstraksi bertujuan untuk melarutkan
senyawa-senyawa yang terdapat dalam jaringan tanaman ke dalam pelarut yang dipakai
untuk proses ekstraksi tersebut. Hal-hal yang penting diperhatikan dalam melakukan
ekstrasi yaitu pemilihan pelarut yang sesuai dengan sifat-sifat polaritas senyawa yang
ingin diekstraksi ataupun sesuai dengan sifat kepolaran kandungan kimia yang diduga
dimiliki simplisia tersebut, hal lain yang perlu diperhatikan adalah ukuran simplisia harus
diperkecil dengan cara perajangan untuk memperluas sudut kontak pelarut dan simplisia,
tapi jangan terlalu halus karna dikhawatirkan menyumbat pori-pori saringan
menyebabkan sulit dan lamanya poses ekstraksi. Pengambilan suatu senyawa organik
dari suatu bahan alam padat disebut ekstraksi. Jika senyawa organik yang terdapat
dalam bahan padat tersebut dalam jumlah kecil, maka teknik isolasi yang digunakan tidak
dapat secara maserasi, melainkan dengan teknik lain dimana pelarut yang digunakan
harus selalu dalam keadaan panas sehingga diharapkan dapat mengisolasi senyawa
organik itu lebih efesien. Isolasi semacam itu disebut soxhletasi.

1. Metode Soxhletasi

A. Sejarah Penemuan Soxhlet
Catatan William B. Jensen bahwa contoh awal extractor kontinu adalah bukti arkeologi
untuk Mesopotamia air panas ekstraktor untuk bahan organik berasal dari sekitar 3500
SM. Sebelum Soxhlet, kimiawan Perancis Anselme Payen juga memelopori dengan
ekstraksi terus menerus dalam tahun 1830- an.

Sebuah ekstraktor Soxhlet adalah bagian dari peralatan laboratorium. Ditemukan pada
tahun 1879 oleh Franz von Soxhlet. Ini awalnya dirancang untuk ekstraksi lipid dari
bahan padat. Namun, ekstraktor Soxhlet tidak terbatas pada ekstraksi lipid. Biasanya,
ekstraksi Soxhlet hanya diperlukan apabila senyawa yang diinginkan memiliki kelarutan
terbatas dalam pelarut, dan pengotor tidak larut dalam pelarut. Jika senyawa yang
diinginkan memiliki kelarutan yang signifikan dalam pelarut maka filtrasi sederhana

ix
dapat digunakan untuk memisahkan senyawa dari substansi pelarut. Biasanya bahan
padat yang mengandung beberapa senyawa yang diinginkan ditempatkan dalam sebuah

10
sarung tangan yang terbuat dari kertas filter tebal, yang dimuat ke dalam ruang utama dari
ekstraktor Soxhlet. Ekstraktor Soxhlet ditempatkan ke botol berisi ekstraksi pelarut.
Soxhlet tersebut kemudian dilengkapi dengan sebuah kondensor.

B. Pengertian Soxhletasi
Metode ekstraksi soxhletasi merupakan metode yang efektif mengekstrak minyak.
Menurut Nazarudin (1992), metode ekstraksi soxhletasi adalah sejenis ekstraksi dengan
pelarut cair organik yang dilakukan secara berulang-ulang pada suhu tertentu dengan
jumlah pelarut tertentu. Pelarut yang digunakan harus disesuaikan dengan tingkat
kepolaran ekstrak yang ingin diperoleh.

C. Syarat Pelarut dalam Soxhletasi
Syarat syarat pelarut yang digunakan dalam proses soxhletasi antara lain, sebagai berikut:
a. Pelarut yang mudah menguap Ex : heksan, eter, petroleum eter, metil klorida dan

alkohol
b. Titik didih pelarut rendah.
c. Pelarut tidak melarutkan senyawa yang diinginkan.
d. Pelarut terbaik untuk bahan yang akan diekstraksi.
e. Pelarut tersebut akan terpisah dengan cepat setelah pengocokan.
f. Sifat sesuai dengan senyawa yang akan diisolasi, polar atau nonpolar.

x

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan secara berurutan pelarut – pelarut organik
dengan kepolaran yang semakin menigkat. Dimulai dengan pelarut heksana, eter,
petroleum eter, atau kloroform untuk memisahkan senyawa – senyawa trepenoid dan
lipid – lipid, kemudian dilanjutkan dengan alkohol dan etil asetat untuk memisahkan
senyawa – senyawa yang lebih polar. Walaupun demikian, cara ini seringkali tidak.
menghasilkan pemisahan yang sempurna dari senyawa – senyawa yang diekstraksi.

Cara menghentikan soxhletasi adalah dengan menghentikan pemanasan yang sedang
berlangsung. Sebagai catatan, sampel yang digunakan dalam soxhletasi harus
dihindarkan dari sinar matahari langsung. Jika sampai terkena sinar matahari, senyawa
dalam sampel akan berfotosintesis hingga terjadi penguraian atau dekomposisi. Hal ini
akan menimbulkan senyawa baru yang disebut senyawa artefak, hingga dikatakan
sampel tidak alami lagi.

Alat soxhletasi tidak boleh lebih rendah dari pipa kapiler, karena ada kemungkinan
saluran pipa dasar akan tersumbat. Juga tidak boleh terlalu tinggi dari pipa kapiler
karena sampel tidak terendam seluruhnya. Dibanding dengan cara terdahulu (destilasi),
maka metoda soxhletasi ini lebih efisien, karena:
1. Pelarut organik dapat menarik senyawa organik dalam bahan alam secara

berulang kali.
2. Waktu yang digunakan lebih efisien.
3. Pelarut lebih sedikit dibandingkan dengan metoda maserasi atau perkolasi.

Soxhletasi dihentikan apabila :
1. Pelarut yang digunakan tidak berwarnalagi.
2. Sampel yang diletakkan diatas kaca arloji tidak menimbulkan bercak lagi.
3. Hasil soxhletasi di uji dengan pelarut tidak mengalami perubahan yang spesifik.

xi

12

D. Komponen Soxhlet

Adapun komponen-komponen pada alat soxhletasi antara lain:

Gambar 1. Soxhletasi

Nama-nama instrumen dan fungsinya :
1. Kondensor : berfungsi sebagai pendingin, dan juga untuk mempercepat proses
pengembunan.
2. Timbal : berfungsi sebagai wadah untuk sampel yang ingin diambil zatnya.
3. Pipa F : berfungsi sebagai jalannya uap, bagi pelarut yang menguap dari proses
penguapan.
4. Sifon : berfungsi sebagai perhitungan siklus, bila pada sifon larutannya penuh
kemudian jatuh ke labu alas bulat maka hal ini dinamakan 1 siklus
5. Labu alas bulat : berfungsi sebagai wadah bagi sampel dan pelarutnya
6. Hot plate : berfungsi sebagai pemanas larutan

E. Prinsip Kerja Soxhletasi
Prinsip Soxhletasi adalah penyaringan yang berulang-ulang sehingga hasil yang didapat
sempurna dan pelarut yang digunakan relatif sedikit. Pelarut organik dapat menarik
senyawa organik dalam bahan alam secara berulang- ulang. Kadji, et al. (2013)
menyatakan, ekstraksi cara Soxhlet menghasilkan rendemen yang lebih besar jika
dibandingkan dengan maserasi. Hal ini disebabkan karena dengan adanya perlakuan
panas yang dapat meningkatkan kemampuan pelarut untuk mengekstraksi senyawa-
senyawa

xi
i

13

yang tidak larut didalam kondisi suhu kamar, serta terjadinya penarikan senyawa yang
lebih maksimal oleh pelarut yang selalu bersirkulasi dalam proses kontak dengan
simplisia sehingga memberikan peningkatan rendemen. Proses yang terjadi dalam
ekstraksi soxhletasi yaitu ketika pelarut dididihkan, uapnya naik melewati soxhlet menuju
ke pipa pendingin. Air dingin yang dialirkan melewati bagian luar kondensor
mengembunkan uap pelarut sehingga kembali ke fase cair, kemudian menetes ke
thimble. Pelarut melarutkan lemak dalam thimble, ekstrak minyak ini terkumpul dalam
thimble dan bila volumenya telah mencukupi, ekstrak minyak akan dialirkan lewat sifon
menuju labu alas bulat (Soekardjo, 2002). Metoda soxhletasi seakan merupakan
penggabungan antara metoda maserasi dan perkolasi. Jika pada metoda pemisahan
minyak astiri (distilasi uap), tidak dapat digunakan dengan baik karena persentase
senyawa yang akan digunakan atau yang akan diisolasi cukup kecil atau tidak
didapatkan pelarut yang diinginkan untuk maserasi ataupun perkolasi ini, maka cara
yang terbaik yang didapatkan untuk pemisahan ini adalah soxhletasi.

Metode Soxhlet termasuk jenis ekstraksi menggunakan pelarut semikontinu. Ekstraksi
dengan pelarut semikontinu memenuhi ruang ekstraksi selama 5 sampai dengan 10 menit
dan secara menyeluruh memenuhi sampel kemudian kembali ke tabung pendidihan.
Kandungan lemak diukur melalui berat yang hilang dari contoh atau berat lemak yang
dipindahkan. Metode ini menggunakan efek perendaman contoh dan tidak menyebabkan
penyaluran. Walaupun begiru, metode ini memerlukan waktu yang lebih lama daripada
metode kontinu.

Ekstraksi dengan cara soxhletasi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya
sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut konstan dengan adanya
pendingin balik. Soxhlet terdiri dari pengaduk atau granul anti-bumping, still pot (wadah
penyuling, bypass sidearm, thimble selulosa, extraction liquid, syphon arm inlet, syphon
arm outlet, expansion adapter, condenser (pendingin), cooling water in, dan cooling
waterout).

xi
ii

14

F. Mekanisme Kerja Metode Soxhletasi
Langkah-langkah dalam metode Soxhlet adalah : menimbang tabung pendidihan ;
menuangkan eter anhydrous dalam tabung pendidihan, susun tabung pendidihan, tabung
Soxhlet, dan kondensator ; ekstraksi dalam Soxhlet ; mengeringkan tabung pendidihan
yang berisi lemak yang terekstraksi pada oven 1000C selama 30 menit ; didinginkan
dalam desikator lalu ditimbang.
Sampel yang sudah dihaluskan, ditimbang 5 sampai dengan 10 gram dan kemudian
dibungkus atau ditempatkan dalam “Thimble” (selongsong tempat sampel) , di atas sampel
ditutup dengan kapas. Pelarut yang digunakan adalah petroleum spiritus dengan titik
didih 60 sampai dengan 80°C. Selanjutnya, labu kosong diisi butir batu didih. Fungsi batu
didih ialah untuk meratakan panas. Setelah dikeringkan dan didinginkan, labu diisi
dengan petroleum spiritus 60 – 80°C sebanyak 175 ml. Digunakan petroleum spiritus
karena kelarutan lemak pada pelarut organik. Thimble yang sudah terisi sampel
dimasukan ke dalam Soxhlet. Soxhlet disambungkan dengan labu dan ditempatkan pada
alat pemanas listrik serta kondensor . Alat pendingin disambungkan dengan Soxhlet. Air
untuk pendingin dijalankan dan alat ekstraksi lemak kemudian mulai dipanaskan.
Ketika pelarut dididihkan, uapnya naik melewati Soxhlet menuju ke pipa pendingin. Air
dingin yang dialirkan melewati bagian luar kondensor mengembunkan uap pelarut
sehingga kembali ke fase cair, kemudian menetes ke thimble. Pelarut melarutkan lemak
dalam thimble, larutan sari ini terkumpul dalam thimble dan bila volumenya telah
mencukupi, sari akan dialirkan lewat sifon menuju labu. Proses dari pengembunan
hingga pengaliran disebut sebagai refluks. Proses ekstraksi lemak kasar dilakukan
selama 6 jam. Setelah proses ekstraksi selesai, pelarut dan lemak dipisahkan melalui
proses penyulingan dan dikeringkan.

xi
v

15

G. Kelebihan dan Kekurangan Metode Soxhletasi
Kelebihan dari metode soxhletasi diantaranya, yaitu:
1. Sampel diekstraksi dengan sempurna karena dilakukan berulang ulang.
2. Jumlah pelarut yang digunakan sedikit.
3. Proses soxhletasi berlangsung cepat.
4. Jumlah sampel yang diperlukan sedikit.
5. Pelarut organik dapat mengambil senyawa organik berulang kali. Dibanding

dengan cara terdahulu ( destilasi ), maka metoda soxhletasi ini lebih efisien,
Karena:
1. Pelarut organik dapat menarik senyawa organik dalam bahan alam secara berulang
kali.
2. Waktu yang digunakan lebih efisien.
3. Pelarut lebih sedikit dibandingkan dengan metoda maserasi atau perkolasi.

Selain kelebihan yang diberikan, metode soxhletasi juga memiliki beberapa kekurangan,
antara lain:

1. Tidak baik dipakai untuk mengekstraksi bahan bahan tumbuhan yang mudah
rusak atau senyawa senyawa yang tidak tahan panas karena akan terjadi
penguraian.

2. Harus dilakukan identifikasi setelah penyarian, dengan menggunakan pereaksi
meyer, Na, wagner, dan reagen reagen lainnya.

3. Pelarut yang digunakan mempunyai titik didih rendah, sehingga mudah menguap.

x
v

16

H. Cara Penyimpanan dan Perawatannya
1. Cara Penyimpanan
soxhlet biasanya disimpan di laboratorium instrumen. Sebaiknya soxhlet disimpan di
meja atau tempat yang permanen untuk menghindari adanya guncangan yang dapat
merusak alat. Selain itu, soxhlet lebih baik disimpan di tempat yang tidak terlalu panas
atau tidak terlalu lembap.

2. Cara Perawatan
Perawatan soxhlet terdapat bermacam-macam. Perawatan pada pendingin yaitu air yg
digunakan air aquabides untuk mencegah kerusakan pendingin akibat terjadinya
perkaratan pada bagian dalam alat. Aquabides tersebut juga harus diganti secara berkala,
misalnya jika sering digunakan diganti setiap 2 minggu sekali. Perawatan pada alat
gelas sama seperti peralatan gelas yang lain, yaitu disimpan dalam keadaan yang bersih
dan kering disimpan di tempat yang memiliki temperatur ruangan. Penangas air dirawat
dengan cara mengganti air secara berkala, misalnya jika sering digunakan dua kali dlam
seminggu. Selain itu, ada baiknya setiap alat yang memiliki saklar tersendiri. Penangas
air untuk saklar penangas air, pendingin untuk saklar pendingin, begitu juga seterusnya.

I. Aplikasi
Ekstraksi Soxhlet digunakan untuk mengekstrak senyawa yang kelarutannya terbatas
dalam suatu pelarut dan pengotor-prngotornya tidak larut dalam pelarut tersebut.
Sampel yang digunakan dan yang dipisahkan dengan metode ini berbentuk padatan.
Dalam percobaan ini kami menggunakan sampel kemiri. Ekstraksi soxhlet ini juga dapat
disebut dengan ekstraksi padat-cair.
Padatan yang diekstrak ditumbuk terlebih dahulu kemudian dibungkus dengan kertas
saring dan dimasukkan kedalam ekstraktor soxhlet, sedangkan pelarut organic
dimasukkan kepadal labu alas bulat kemudian seperangkat ekstraktor soxhlet dirangkai
dengan kondensor. Ekstraksi dilakukan dengan memanaskan pelarut sampai semua
analit terekstrak (kira-kira 6 x siklus). Hasil ekstraksi dipindahkan ke rotary evaporator
vacuum untuk diekstrak kembali berdasarkan titik didihnya .

x
vi

17

2. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

A. Sejarah Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi pertama kali dikenalkan oleh Michael Twest yaitu seorang botani dari
Rusia. Dia berhasil mencoba memisahkan klorofil dan pigmen- pigmen lain dalam
ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yangdiisikan ke dalam
kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut.Proses pemisahan itu diawali dengan
menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian
dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat
sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak
tumbuhan . dari pita-pita berwarna tersebut muncul istilah kromatografi, dari kata
“choram” dan “graphein”. Menurut bahasa Yunani kedua kata itu berarti “warna” dan
“menulis”.

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun
1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan
elektroforesis. Berbeda debgan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan
atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan
yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng
kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini
dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom.

x
vi
i

18

B. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa

menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.

Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit,

baik penyerap maupun cuplikannya. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah metode

kromatografi paling sederhana dan banyak digunakan. Peralatan dan bahan yang

dibutuhkan untuk melaksanakan pemisahan dan analisis sampel dengan metode KLT

cukup sederhana yaitu sebuah bejana tertutup (chamber) yang berisi pelarut dan plat

(lempeng) KLT. Pengerjaan dengan KLT pada mulanya dilakukan dengan menotolkan

sampel pada salah satu ujung fase diam (lempeng KLT) sehingga membentuk noda

(Spot). Setelah kering, lempeng dicelupkan ke dalam chamber yang telah berisi fase

gerak (pelarut tunggal ataupun campuran dua sampai empat pelarut murni) dengan posisi

noda di bawah dan sejajar di permukaan datar. Pemilihan fase diam dan fase yang tepat

memvisualisasikan campuran komponen senyawa kimia pada sampel bermigrasi sesuai

pergerakan fasa gerak melalui fasa diam dengan kecepatan yang berbeda-beda sehingga

memberikan pemisahan yang sempurna. Proses pergerakan (migrasi sampel) disebut

dengan pengembangan kromatogram (elusi). Perbedaan migrasi merupakan hasil dari

perbedaan tingkat afinitas masing-masing komponen dalam fase diam

x
vi
ii

19

dan fase gerak. Berbagai mekanisme pemisahan terlibat dalam penentuan kecepatan
migrasi. Kecepatan migrasi komponen sampel tergantung pada sifat fisika kimia dari
fase diam, fase gerak dan komponen sampel. Retensi dan selektivitas kromatografi juga
ditentukan oleh interaksi antara fase diam, fase gerak dan komponen sampel yang
berupa ikatan hidrogen, pasangan elektron donor atau pasangan elektron-akseptor, ikatan
ion- ion, ikatan ion-dipol, dan ikatan van der Waals.

Pengambilan sampel, pengawetan, dan pemurnian sampel adalah masalah umum untuk
KLT dan metode kromatografi lainnya. Sebagai contoh, pengembangan KLT biasanya
tidak sepenuhnya melarutkan kembali analit yang berada dalam lempeng kecuali
dilakukan pemurnian sebelumnya (clean up). Metode clean up paling sering dilakukan
pada ekstraksi selektif dan kromatografi kolom. Dalam beberapa kasus zat/senyawa
perlu dikonversi dahulu sebelum dianalisis dengan KLT. Hal ini dilakukan untuk
mendapatkan turunan senyawa yang lebih cocok untuk proses pemisahan, deteksi,
dan/atau kuantifikasi. KLT dapat mengatasi sampel yang terkontaminasi, seluruh
kromatogram dapat dideteksi, mempersingkat proses perlakuan sampel sehingga hemat
waktu dan biaya. Kehadiran pengotor atau partikel yang terjerap dalam sorben fase diam
tidak menjadi masalah, karena lempeng hanya digunakan sekali (habis pakai). Deteksi
senyawa menjadi mudah ketika senyawa secara alami dapat berwarna atau
berberfluoresensi atau menyerap sinar UV. Namun, perlakuan penambahan pereaksi
penampak noda dengan penyemprotan atau pencelupan terkadang diperlukan untuk
menghasilkan turunan senyawa yang berwarna atau berfluoresensi. Pada umumnya
senyawa aromatik terkonjugasi dan beberapa senyawa tak jenuh dapat menyerap sinar
UV. Senyawa-senyawa ini dapat dianalisis dengan KLT dengan fase diam yang
diimpregnasi indikator fluoresensi dan deteksi dapat dilakukan hanya dengan
pemeriksaan di bawah sinar UV 254 nm. Pada KLT, identifikasi awal suatu senyawa
didasarkan pada perbandingan nilai Rf dibandingkan Rf standar. Nilai Rf umumnya
tidak sama dari laboratorium ke laboratorium bahkan pada waktu analisis yang berbeda
dalam laboratorium yang sama, sehingga perlu dipertimbangkan penggunaan Rf relatif
yaitu nilai Rf noda senyawa dibandingan noda senyawa lain dalam lempeng yang sama.
Faktor-faktor yang menyebabkan nilai Rf bervariasi meliputi dimensi dan jenis ruang, sifat
dan ukuran lempeng, arah aliran fase gerak, volume dan komposisi fase gerak, kondisi
kesetimbangan, kelembaban, dan metode pexrisiapan sampel KLT sebelumnya.

x

20

C. Prinsip Kerja

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan
fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah
berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu :
kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada
proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi
antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.
Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir
eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan
teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini
yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.
Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar
dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa
dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini
berdasarkan prinsip “like dissolved like”.

D. Fasa Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata- rata partikel fase diam dan
semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal
efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan serbuk
selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan
partisi. Beberapa fase diam yang umum digunakan disajikan pada tabel berikut.

x
x

21

Tabel 1. Jenis-Jenis Fase Diam dan Tujuan Penggunaan

Penjerap Mekanisme Sorpsi Penggunaan
Silica Gel Adsorpsi
Asam amino,

hidrokarbon, vitamin,
alkaloid

Silica modifikasi Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa non
dengan hidrokarbon Partisi
polar
Serbuk selulosa
Asam amino,

nukleotida,
karbohidrat

Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion

logam, pewarna

makanan, alkaloid

Kieselgur Partisi Gula, asam-asam lemak
Selulosa Penukar ion Pertukaran Ion
Asam nukleat,

nukleotida, halide dan

ion-ion logam

Gel Sephadex Eksklusi Polimer, protein,
kompleks logam

E. Fase Gerak (Eluen)

Pemilihan fase gerak umumnya berdasar pada studi pustaka dan coba-coba (trial and
error). Sistem eluen yang paling sederhana yaitu campuran 2 pelarut organik karena
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi secara optimal. Cara memilih dan mengoptimasi fase gerak
dapat dilakukan dengan beberapa panduan, diantaranya:
a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknik yang sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas
fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai
Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut
non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
d. Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan

x
meningkatkan solute-solut yang bersifat basxaidan asam.

22

F. Aplikasi (Penotolan) Sampel
Volume sampel yang ditotolkan ke lempeng KLT paling sedikit 0,5 µL dengan tujuan
untuk memperoleh roprodusibilitas. Volume sampel yang ditotolkan boleh lebih besar 2-
10 µL namun harus dilakukan secara bertahap yaitu dengan cara pengerringan antar
totolan. Teknik aplikasi sampel bisa dilakukan dengan 3 cara, yaitu: a. Cara manual
Sebelum aplikasi sampel pada lempeng KLT, posisi awal penotolan diberi tanda berupa
titik dengan pensil dan akhir elusi ditandai berupa garis. Sedapat mungkin penandaan
tidak merusak sorben KLT. Alat aplikasi manual yang paling banyak digunakan adalah
pipet mikro kapiler (microcaps). Dengan cara mencelupkan pipet kapiler mikro, larutan
secara otomatis akan mengisi ruang dalam pipet mikro kapiler. Setelah terisi tempelkan
pipet pada permukaan lempeng KLT maka larutan sampel akan berpindah dari pipet
kapiler menuju sorben lempeng KLT. Penggunaan syringe lebih dipilih dibandingkan
pipet kapiler pada beberapa kondisi :

1. Bila pelarut yang digunakan memiliki berat jenis tinggi, misalnya kloroform atau
metilen klorida, sehingga cairan cenderung keluar dari pipet kapiler ketika pipet
kapiler dalam posisi vertikal. Bila pelarut yang digunakan sangat mudah menguap
(titik didih 40-60°C) misalnya nheksana, petroleum eter atau dietil eter. Gaya
kapiler tidak dapat mengisi ruang pipet kapiler secara reprodusibel.

2. Bila sampel mengandung surfaktan yang dapat mengurangi tegangan permukaan
pipet kapiler sehingga pengisian ruang dalam pipet kapiler tidak reprodusibel.

3. Bila sampel berupa cairan kental yang sulit mengalir dalam pipet kapiler.
Pengeluaran larutan dari pipet kapiler juga tidak bisa sempurna karena masih ada
larutan yang menempel pada dinding dalam pipet kapiler sehingga volume sampel
yang dikeluarkan juga tidak reprodusibel.

4. Bila pelarut yang digunakan sulit menguap (titik didih ≥ 100oC) misalnya air.
Pengeluaran larutan dari pipet kapiler juga tidak bisa sempurna karena masih ada
larutan yang menempel pada dinding dalam pipet kapiler sehingga volume sampel
yang dikeluarkan juga tidak reprodusibel.

x
xi
i

23

Gambar berikut merupakan alat aplikasi sampel secara manual

Gambar 2. Alat Aplikasi Sampel Secara Manual

G. Cara semiotomatis
Cara semiotomatis dapat dilakukan pada sampel dengan ditotolkan pada lapisan
permukaan lempeng tepat sesuai dengan yang diinginkan, menggunakan dosis kecil dan
tidak merusak lapisan lempeng. Sebagai contoh alat untuk aplikasi penotolan dengan
volume yang konstan pada KLT adalah Nanomat 4 dengan pemegang kapiler. Dengan alat
Nanomat, ukuran noda yang dihasilkan pada lempeng KLT adalah sama. Pada
pemegang kapiler (cappilary holder) yang berperan adalah magnet permanen. Cara
menotolkan sampel yaitu kepala aplikator ditekan, pipet akan menyentuh lapisan
lempeng pada tekanan konstan kemudian pipet dibuang (sekali pakai). Volume bisa
sampai 50-230 nl untuk KLTKT. Ketinggian ujung jarum suntik pada Nanomat
disesuaikan sedemikian rupa sehingga tidak menyentuh lempeng KLT. Untuk aplikasi
lempeng KLTKT, digunakan nano- pipet (100 atau 200 nl). Pipet ini lebih akurat,
namun, sorben rentan terhadap kerusakan. Peralatan semi/otomatis yang lain yaitu
Linomat (camag) dapat digunakan untuk menerapkan larutan sampel dalam bentuk noda
atau pita. Teknik ini direkomendasikan untuk analisis kuantitatif. Meskipun tingkat
akurasi yang mungkin dengan aplikasi manual (± 1- 2% standar deviasi relatif), noda
dan pita yang dihasilkan dari aplikasi teknik otomatis akan lebih baik dengan pemisahan
yang terukur. Alat tersebut dapat menotolkan sampel menggunakan syringe dengan
kecepatan yang konstan dan teknik spray.

x
xi
ii

24

H. Cara otomatis
Untuk sistem yang sepenuhnya otomatis, mempunyai program yang dapat menyimpan
kondisi elusi dalam komputer. Aplikasi noda dan pita dapat diprogram, dengan nomor
aplikasi dan posisi ukuran yang detail. Noda dapat diaplikasikan baik dengan teknik ini
atau dengan cara kontak langsung. Sampel disiapkan dalam vial dengan septum segel.
Menurut program pra-set, lengan mesin ATS akan bergerak dari vial larutan sampel ke
dalam syringe dan ditransfer pada lempeng KLT, kemudian kromatografi akan melakukan
pemisahan dan menghasilkan noda. Pada aplikasi larutan sampel, lengan mesin ATS
akan bergerak ke syringe dan menuju vial dan dicuci menggunakan pelarut yang sesuai.
Setelah itu syringe dibilas untuk aplikasi berikutnya. Beberapa software memungkinkan
digunakan untuk memvalidasi instrument. Volume dosis dapat divalidasi menggunakan
standard.

I. Pengambangan (Elusi) Sampel
Elusi atau pengembangan KLT dipengaruhi oleh chamber yang digunakan dan
kejenuhan dalam chamber. Metode pengembangan yang dipilih tergantung tujuan
analisis yang ingin dicapai dan ketersediaan alat di laboratorium. Terdapat beberapa
jenis metode pengembangan KLT :
a. Metode pengembangan satu dimensi
Umumnya pengembangan kromatogram yang dihasilkan dari analisis KLT
menggunakan satu dimensi yang dapat digunakan untuk tujuan kuantitatif. Beberapa
jenis metode pengembangan satu dimensi, yaitu:
1. Metode pengembangan non linier (melingkar)
Metode pengembangan melingkar hampir tidak pernah digunakan saat ini untuk analisis
KLT kecuali untuk penelitian yang menggunakan pengembangan melingkar untuk
tujuan tertentu. Pengembangan melingkar pertama kali dilakukan dalam cawan petri
yang berisi fase gerak dan sebuah sumbu ditempelkan pada lempeng KLT yang
diletakkan diatas cawan. Chamber U (Camag) adalah chamber yang digunakan untuk
pengembangan melingkar, tetapi instrumen ini tidak lagi tercantum dalam katalog
Camag. Kromatogram melingkar juga dapat dihasilkan dengan menggunakan metode
preparatif yang modern, misalnya, dengan alat OPLC (Over pressure layer
cromatography) dan micropreparative RPC (Rotation planar cromatography).

x
xi
v

25

2. Metode pengembangan linier
Dalam banyak khasus, untuk mendapatkan kromatogram KLT yang bagus dipilih metode
pengembangan linier. Metode pengembangan linier yang paling sering digunakan adalah
metode pengembangan menaik (ascending). Metode ini dilakukan dengan cara
memasukkan eluen dalam chamber, setelah chamber jenuh, ujung lempeng bagian bawah
direndam ke dalam eluen dalam chamber. Eluen bermigrasi dari bawah lempeng menuju
keatas dengan gaya kapilaritas. Sebaliknya pada pengembangan menurun (descending)
eluen bergerak dari atas menuju ke bawah.

Gambar 3. Pengambangan Menaik (ascending) dan pengembangan menurun
(descending)

3. Metode pengembangan horisontal
Kebalikan dari pengembangan linier, pada pengembangan horizontal lempeng KLT
dimasukkan ke dalam chamber terlebih dahulu. Kemudian setelah eluen dimasukkan,
strip kaca didorong sehingga menempel pada lempeng KLT sehingga eluen akan
bergerak melewati lempeng KLT. Pada chamber horizontal CAMAG dimungkinkan
pengembangan dengan dua arah yang berlawanan. Masing-masing kompartemen eluen
terisi eluen dan eluen bergerak menuju ke pusat lempeng. Ketika dua garis depan eluen
bertemu maka secara otomatis pengembangan akan berhenti.
4. Metode pengembangan kontinyu
Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara
mengalirkan fase gerak secara terus- menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah
(biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung
lapisan.
5. Pengembangan gradien Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan
komposisi fase gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan
ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak
selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikxxit ke dalam bejana dan diaduk sampai
homogen. Tujuan utama sistem ini adalah uvntuk mengubah polaritas fase gerak.

26

b. Pengembangan dua dimensi
Pengembangan dua dimensi ditujukan untuk identifikasi senyawa dalam sampel
multikomponen. Pengembangan dua dimensi disebut juga pengembangan dua arah.
Pengembangan dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi (pemisahan)
sampel ketika komponen- komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir
sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam sampel asam- asam
amino. Selain itu, adanya dua sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk
melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.
Pengembangan dua dimensi dilakukan dengan cara lempeng dielusi dengan eluen
pertama. Setelah elusi selesai lempeng dikeringkan kemudian dielusi kembali dengan
eluen kedua dengan arah migrasi eluen yang berbeda. Eluen kedua dapat berupa eluen
yang sama dengan eluen pertama atau eluen yang berbeda dengan eluen pertama.
Proses pengembangan dua dimensi ditunjukkan pada gambar berikut.

Gambar 4. Prosedur Pengembangan Dua Dimensi

J. Sorben Fasa Diam
Pemilihan fase diam pada KLT didasarkan pada sifat fisika kimia komponen sampel yang
akan dipisahkan meliputi polaritas, kelarutan, kemampuan mengion, berat molekul,
bentuk dan ukuran analit. Sifat fisika kimia tersebut berperan penting dalam menentukan
mekanisme pemisahan dalam KLT. Sorben fase diam pada KLT dapat berupa senyawa
anorganik maupun organik. Sorben anorganik misalnya alumunium oksida, silikon
oksida, magnesium karbonat, kalsium karbonat, dan lain-lain. Sedangkan sorben
organik misalnya pati dan selulosa. Partikel-partikel sorben berbentuk butiran halus
tersebut dilapiskan pada penyangga padat seperti pelat kaca, plastik atau alumunium.
Silika gel adalah sorben yang paling populer (64%), diikuti oleh selulosa (9%), dan
alumina (3%). Sejak 1973 silika gel merupxakan sorben yang paling banyak digunakan,
tetapi perubahan yang nyata telah terjadi denxgan

vi

27

munculnya sorben dengan fase kimia terikat yang telah membuka berbagai kemungkinan
baru pemisahan. Fase diam yang lebih baru tersebut cenderung digunakan untuk
mengatasi masalah pemisahan dimana resolusi komponen sampel adalah kecil atau
komponen sampel tidak dapat terpisah. Dalam penentuan pemilihan sorben dapat merujuk
pada kumpulan pustaka tentang KLT yang terdapat dalam bibiliografi (camag).

Bila prinsip pemisahan berdasarkan polaritas komponen sampel maka dalam pemilihan
sorben perlu dipertimbangkan kelarutan komponen sampel apakah hidrofilik atau
hidrofobik, apakah bahan bersifat basa, asam ataupun netral dan apakah sampel dapat
bereaksi dengan sorben atau eluen. Berdasarkan pertimbangan polaritas komponen
sampel, sorben dapat dikelompokkan sebagai berikut :
1. Sorben untuk sampel bersifat lipofilik digunakan aluminium oksida, silika,
asetylated cellulose, poliamida,
2. Sorben untuk sampel bersifat hidrofilik digunakan selulosa, selulosa penukar ion,
kieselguhr, poliamide and silika fase terbalik yang dimodifikasi.

K. Deteksi Noda

Deteksi lempeng KLT dapat dilakukan secara langsung maupun dengan instrumen.

Untuk noda yang berwarna deteksi noda dapat dilakukan dengan visualisasi langsung pada

lempeng KLT dengan menggunakan cahaya matahari, atau dapat dibantu dengan

menggunakan lampu UV yang memberikan pencahayaan pada panjang gelombang

tertentu. Untuk noda yang tidak berwarna beberapa jenis visualisasi dari zona

kromatografi diperlukan untuk mengdeteksi noda hasil kromatografi. Sebagian besar

senyawa akan menyerap sinar UV atau sinar tampak atau fluoresensi tetapi beberapa

senyawa membutuhkan visualisasi yang sesuai untuk mengamati noda hasil

kromatografi. Visualisasi dapat dilakukan dengan cara penyemprotan atau pencelupan

ke dalam pereaksi penampak noda. Karena sorben yang digunakan pada lempeng KLT

umumnya bersifat inert maka reaksi kimia dapat dilakukan di atas lempeng tanpa

terpengaruh lapisan sorben. Berbagai macam pereaksi kimia telah digunakan untuk

mendeteksi zona kromatografi dengan penampakan hasil yang baik. Beberapa pereaksi

yang disebut sebagai pereaksi universal digunakan untuk memvisualisasikan berbagai

senyawa yang berbeda struktur molekulnya. Termasuk dalam kelompok pereaksi ini

adalah pelarut asam dan uap amonia, fluorescein, diklorofluoresein, dan yodium.

Adapun beberapa pereaksi dapat digunaxkan dalam teknik destruktif (destructive

techniques). x
vi

i

28

Teknik ini menyebabkan kerusakan pada senyawa yang akan meninggalkan noda yang
tampak pada lapisan kromatografi. Sebaliknya ada teknik non destruktif (nondestructive
tekniques) yang memungkinkan deteksi senyawa dalam zona kromatografi tanpa
merubah sorben lempeng atau zona kimianya. Termasuk dalam teknik non destruktif
adalah sinar tampak dan UV, dan kadang-kadang dengan penggunaan yodium atau
amonia uap. Dua pereaksi terakhir dalam banyak kasus “reaksi” dimasukkan dalam
reaksi reversibel. Pereaksi lainnya yang merupakan kelompok gugus spesifik dan dapat
digunakan untuk mendeteksi gugus senyawa, seperti alkohol, aldehid, keton, ester, atau
asam. Pereaksi ini disebut kelompok pereaksi gugus spesifik.

L. Nilai Rf (Retency Factor)
Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :

= ℎ ℎ

ℎ ℎ

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik
yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8. Harga-
harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga
standar. Senyawa standart biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan
senyawa yang dipisahkan pada kromatogram.
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis
yang juga mempengaruhi harga Rf yaitu :
 Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
 Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge¬ringkan
molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan
penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun
menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang
dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap
dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

x
x
vi
ii

29

 Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi
lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka
perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
 Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
 Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan,
karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga
digunakan).
 Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-
noda dengan kemungkinan terben¬tuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya,
hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
 Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk
mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh
penguapan atau perubahan-perubahan fase.
 Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih pen¬ting dalam kromatografi
kertas, hingga perlu mengusahakan at¬mosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.
Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan
pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang
berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi- tepi dan keadaan ini
harus dicegah.

x
xi
x

30

M. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut:
 Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

 Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun

(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
 Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan

metode kertas tidak bisa
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan

ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
 Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

 Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)

 Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).
 Preparasi sample yang mudah

 Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak

mungkin

 Kebutuhan ruangan minimum Analisis KLT banyak digunakan karena : Waktu yang
diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

 Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang
konstituen utama dalam sampel

 Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel
 Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis

kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

x
x
x

31

Adapun kekurangan KLT yaitu:

 Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.

 Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
 Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

N. Aplikasi
Kromatografi Lapis Tipis dapat diaplikasikan dibeberapa bidang, diantaranya yaitu:
a. Bidang Pangan
Pada penelitian analisis kualitatif pewarna rhodamin B dalam sampel saus tomat.
Sampel dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis. Zat warna dari sampel saus
tomat ditarik kedalam benang wol bebas lemak dalam suasana asam sampai benang wol
tersebut terwarnai oleh pewarna saus tomat. Setelah benang wol terwarnai oleh pewarna
saus tomat, pewarna tersebut dilepaskan ke dalam larutan basa. Larutan basa tersebut
selanjutnya akan digunakan sebagai cuplikan sampel pada analisis Kromatografi Lapis
Tipis. Noda totolan sampel dibandingkan dengan noda totolan baku standar rhodamin B
yang telah dieluasi bersama-sama dan dilihat di bawah lampu UV pada λ 366 dan λ 254
nm, apabila terdapat zat pewarna rhodamin B dalam sampel maka noda pada lempeng
KLT akan berflouresensi di lampu UV pada λ 366 nm dan tidak berflorousensi dilampu
UV pada λ 254 nm, pada penelitian ini noda totolan sampel pada lempeng KLT tidak
menunjukan flouresensi di lampu UV pada λ 366 nm, sehingga dapat disimpulan bahwa
pada sampel saus tomat ini tidak terkandung zat pewarna rhodamin B.

b. Bidang farmasi
Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat
diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan
obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan
mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek
terapi yang dikehendaki.

x
x
xi

32

Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet
maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa
dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam H2SO4 yang kemudian akan
berinteraksi dengan komponen- komponen sampel baik secara kimia maupun
berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.

Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan
perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai
maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai
fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan
harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.
Analisis dengan KLT juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang
kelompok kandungan kimianya telah diketahui.
Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :
1. Alkaloid
2. Antraglikosida
3. Arbutin
4. Glikosida Jantung
5. Zat pahit
6. Flavonoid
7. Saponin
8. Minyak atsiri
9. Kumarin dan asam fenol karboksilat
10. Valepotriat

x
x
xi
i

33

BAB III PENUTUP

KESIMPULAN

metode ekstraksi soxhletasi adalah sejenis ekstraksi dengan pelarut cair organik yang
dilakukan secara berulang-ulang pada suhu tertentu dengan jumlah pelarut tertentu.
Pelarut yang digunakan harus disesuaikan dengan tingkat kepolaran ekstrak yang ingin
diperoleh. Prinsip Soxhletasi adalah penyaringan yang berulang- ulang sehingga hasil
yang didapat sempurna dan pelarut yang digunakan relatif sedikit. Pelarut organik dapat
menarik senyawa organik dalam bahan alam secara berulang-ulang.

Syarat syarat pelarut yang digunakan dalam proses soxhletasi antara lain, sebagai
berikut:
a. Pelarut yang mudah menguap Ex : heksan, eter, petroleum eter, metil klorida dan

alkohol
b. Titik didih pelarut rendah.
c. Pelarut tidak melarutkan senyawa yang diinginkan.
d. Pelarut terbaik untuk bahan yang akan diekstraksi.
e. Pelarut tersebut akan terpisah dengan cepat setelah pengocokan.
f. Sifat sesuai dengan senyawa yang akan diisolasi, polar atau nonpolar.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.
Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik
penyerap maupun cuplikannya. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah metode
kromatografi paling sederhana dan banyak digunakan. Peralatan dan bahan yang
dibutuhkan untuk melaksanakan pemisahan dan analisis sampel dengan metode KLT
cukup sederhana yaitu sebuah bejana tertutup (chamber) yang berisi pelarut dan plat
(lempeng) KLT.

x
x
xi
ii

34

CHAPTER 3. PEMURNIAN DAN
PEMISAHAN SENYAWA ORGANIK
DENGAN METODE MODERN

I. PENDAHULUAN

Senyawa organik sering dijumpai dalam keadaan tidak murni atau dalam keadaan
campuran. Hal ini sering kali terjadi pada pengerjaan isolasi suatu senyawa organik.
Pemurnian banyak dilakukan dengan berbagai cara tergantung sifat senyawa yang akan
dimurnikan. Pemisahan dan pemurnian merupakan suatu cara yang dilakukan untuk
memisahkan atau memurnikan suatu senyawa atau sekelompok senyawa yang
mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan, baik dalam skala
laboratorium maupun skala industri. Pada prinsipnya, pemisahan dilakukan untuk
memisahkan dua zat atau lebih yang saling bercampur. Sedangkan pemurnian dilakukan
untuk mendapatkan zat murni dari suatu zat yang telah tercemar oleh zat lain.
Pemisahan adalah suatu metode yang digunakan untuk memisahkan dan atau
memurnikan senyawa tunggal, kelompok senyawa dengan susunan yang berkaitan atau
suatu zat yang terdapat dalam bahan alam, hasil proses reaksi baik dalam skala
laboratorium maupun skala industri. Jenis-jenis pemurnian tersebut antara lain ekstraksi
yang dilanjutkan dengan isolasi dan akhirnya akan dimurnikan dengan cara kristalisasi
atau kromatografi lapis tipis serta preparatif. Teknik - teknik lain untuk pemurnian dapat
dilakukan dengan beberapa cara lain destilasi dan sublimasi.
Berdasarkan prosesnya, pemisahan terbagi menjadi 2 yaitu :

a. Pemisahan dengan proses sederhana
Pemisahan ini hanya dengan cara tunggal, misalnya dua cairan yang tidak bercampur
diambil dengan pipet atau corong pisah, destilasi, sentrifugasi, filtrasi, dll.

b. Pemisahan dengan proses kompleks
Proses yang kompleks ini biasanya memerlukan pembentukan fase yang kedua yaitu
dengan menambah cairan, padatan atau gas. Proses ini juga memerlukan pengaturan
dengan proses mekanis ataupun rekasi kimia untuk menghasilkan pemisahan yang efektif.
Pemurnian adalah memisahkan campuran zaat agar mendaptkan zat-zat murni dengan
perbandingan filtrat, sentrat, dan juga dapat memisahkan antara suatu zat dari campuran
air dan campuran padat agar diperoleh suatu keadaan yang murni. Prinsip dari pemurnian
adalah berdasarkan ukuran partikel dari campuran zat cair dengan zat padat dengan
berbagai cara.

35

II. PEMBAHASAN

Pemurnian adalah pemisahan fisik bahan kimia yang diinginkan dari bahan asing
atau pencemar. Hasil murni dari proses pemurnian yang berhasil disebut isolate.
Pemurnian banyak dilakukan dengan berbagai cara tergantung sifat senyawa yang akan
dimurnikan.
Pemisahan adalah suatu metode yang digunakan untuk memisahkan dan atau
memurnikan senyawa tunggal, kelompok senyawa dengan susunan yang berkaitan atau
suatu zat yang terdapat dalam bahan alam, hasil proses reaksi baik dalam skala
laboratorium maupun skala industri. Jenis-jenis pemurnian tersebut antara lain ekstraksi
yang dilanjutkan dengan isolasi dan akhirnya akan dimurnikan dengan cara kristalisasi
atau kromatografi lapis tipis serta preparatif. Teknik - teknik lain untuk pemurnian dapat
dilakukan dengan beberapa cara lain destilasi dan sublimasi. Prosedur pemisahan dapat
dilakukan untuk keperluan isolasi, pemurnian, identifikasi, dan penentuan kuantitatif
komponen yang ditentukan dalam suatu sampel.
Contoh beberapa masalah pemisahan diantaranya, yaitu pemisahan asam-asam amino
atau protein, penguapan air laut untuk mendapatkan garam (NaCl), pemisahan isotop-
isotop logam, pemurnian suatu logam dari bahan tambang, isolasi parfum dari bunga-
bungaan, isolasi zat warna dari tanaman, dan isolasi minyak dari tumbuh-tumbuhan.

1. Teori Pemisahan

Jika suatu metode mempunyai selektifitas yang tinggi terhadap analit maka kinerja dari
analisis menjadi sederhana, tetapi sebaliknya bila terdapat zat pengganggu maka
selektivitas dari metode akan sulit untuk dicapai. Bila tidak ada zat pengganggu,
hubungan antara sinyal sampel (Ssamp) dan konsentrasi (CA) adalah:
Ssamp = kA. CA ...................................................................................................................................... 1)

Di mana kA adalah sensitivitas. Sedangkan bila ada zat pengganggu persamaan 1)
menjadi:
Ssamp = kACA + kiCi ................................................................................................................ 2)

Di mana ki dan Ci adalah sensitivitas dan konsentrasi zat pengganggu. Jadi dengan adanya
zat pengganggu selektivitas metode ditentukan oleh perbedaan relatif sensitivitas analit

36

dan zat pengganggu. Sekalipun metode lebih selektif terhadap zat pengganggu, Ssamp
bisa digunakan untuk menentukan konsentrasi analit jika sumbangan zat pengganggu
terhadap Ssamp signifikan. Koefisien selektivitas KA,I merupakan ciri dari selektivitas
metode.
KA, I = 1 ...................................................................................................... 3)

2

Bila k1 pada persamaan 3) disubstitusikan ke persamaan 2), maka setelah disederhanakan
menjadi
Ssamp = kA [CA + KA,I Ci ] ................................................................................ 4)

Oleh karena itu, zat pengganggu tidak akan menjadi masalah sepanjang konsentrasi
produk dan koefisien selektivitas secara signifikan lebih kecil dari konsentrasi analit.
KA,I Ci << CA ...............................................................................................................................................................................5)
Bila zat pengganggu tidak dapat diabaikan maka akurasi analisis harus dimulai dengan
pemisahan analit dan zat pengganggu.
Tujuan akhir dari analisis pemisahan adalah mengeluarkan salah satu analit atau
pengganggu dari matriks sampel. Efisiensi pemisahan dipengaruhi oleh gangguan untuk
mendapatkan semua analit, dan gangguan untuk menghilangkan semua pengganggu.
Bila recovery (perolehan kembali) analit diberi notasi RA, adalah:

RA = ..................................................................................................... 6)

( )

Di mana CA adalah konsentrasi analit hasil setelah pemisahan dan (CA)o konsentrasi analit
awal. Nilai recovery 1 berarti tidak ada analit yang hilang pada waktu pemisahan.
Recovery pengganggu Ri adalah:
Ri = ...................................................................................................... 7)

( )

Di mana Ci adalah konsentrasi pengganggu setelah pemisahan dan (Ci)o adalah
konsentrasi pengganggu awal. Keefektifan pemisahan disebut dengan faktor pemisahan
(Si,a) adalah perubahan perbandingan pengganggu dan analit yang disebabkan pemisahan.
Si,a = / ............................................................................................ 8)

(Ci)o / (CA)o

Dalam pemisahan yang sempurna nilai RA = 1, Ri = 0 dan Si,A = 0, Pada umumnya faktor
pemisahan kira-kira 10-7 untuk analisis kuantitatif analit runutan dalam adanya makro
pengganggu dan 10-3 untuk analit dan pengganggu yang sebanding. Recovery dan faktor

37

pemisahan merupakan cara yang digunakan untuk mengevaluasi keefektifan pemisahan.
Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam proses pemisahan :

1. Tempat senyawa atau komponen yang akan dipisahkan, dalam keadaan tercampur
atau terikat secara kimia.

2. Kadar senyawa yang dipisahkan
3. Sifat-sifat fisika dan kimia dari senyawa yang dipisahkan
4. Standar kemurnian yang dikehendaki
5. Cemaran atau campuran yang akan menjadi sumbergangguan pada proses

pemisahan
6. Keadaan dan harga senyawa yang akan dipisahkan

Pemisahan dan pemurnian senyawa organic terbagi atas metode klasik dan metode
modern. Berikut merupakan metode modern dari pemisahan dan pemurnian :

2. MetodePemisahan

A. HPLC
HPLC adalah alat laboratorium yang bekerja dengan metode fisikokimia, didasarkan pada
teknik kromatografi dimana fase geraknya berupa cairan dan fase diamnya bisa berupa
memiliki bentuk padat atau cair. Dalam proses memahami alat HPLC (High Pressure
Liquid Chromatography), anda sebagai pembaca perlu memahami hal-hal lainnya yang
memang berhubungan secara langsung dengan alat ini, seperti :

a). Fase gerak dan fase diam
b). Polar dan non polar
c). Fase normal dan terbalik, dan lainnya.

HPLC adalah sebuah alat laboratorium spesifik (specific laboratory equipment) yang
penggunaanya membutuhkan keahlian khusus, penggunaan alat ini dipastikan selalu
menggunakan sample cair. HPLC merupakan alat laboratorium yang bisa dikonfigurasi
sesuai dengan kebutuhan, karena terdiri dari module-module yang berbeda. Aplikasi
penggunaan HPLC akan mengacu kepada fase normal dan fase terbalik. Pada fase normal
yang menjadi fase diamnya adalah polar dan fase geraknya adalah non polar. Sedangkan
pada fase terbalik, fase diamnya adalah non polar dan fase geraknya adalah polar.
GC memiliki hubungan yang dekat dengan HPLC. Salah satu keuntungan menggunakan

38

HPLC dibandingkan dengan GC ialah lebih stabil untuk menganalisis sample yang tidak
mudah menguap (unvolatille).

i. Prinsip HPLC
Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi yaitu untuk mengukur sampel. Dalam
kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat sampel
bergerak melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa oleh fase
gerak (dapat berupa zat cair ataugas).
Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat dengan fase diam akan
bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang
lemah. Pada kromatografi kertas, sampel yang diteteskan di bagian ujung kertas
kromatografi (fase diam) akan lambat laun bergerak dan terpecah komponennya seiring
dengan pergerakan cairan pada dasar kertas (fase gerak). HPLC pun demikian, sampel
yang diinjeksikan bergerak melalui fase diam dalam kolom karena terbawa oleh fase
gerak.

ii. Sistem Peralatan HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

39

Gambar 5. Diagram Sistem Kromatografi Cair

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya
terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan
dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase
gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog
dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-
pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan
fase terbalik.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.

40

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

Gambar 6. (a). Posisi saat memuat sampel (b) Posisi saat menyuntikan sampel
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses

41

pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding
dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 μl/menit).

 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.

 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam
pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silica yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti
silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu
retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektok HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

42

1) Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2) Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.

3) Stabil dalam pengopersiannya.
4) Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita.
5) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier).
6) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

iii. Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase
diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi Fase Terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau

43

dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah faseterbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan

larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi
karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-
alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi
puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik
dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi

Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga
solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,
kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh