92 วิจารณ์ผลการทดลอง สรุปผลการทดลอง เอกสารอ้างอิง
93 งานมอบหมาย การผลิต 5% Dextrose in Normal Saline Solution วัตถุประสงค์ 1. เพื่อให้นักศึกษาได้ค้นคว้าข้อมูลในการผลิตยาไร้เชื้อปริมาตรมาก 2. เพื่อศึกษาการเตรียมยาไร้เชื้อชนิดปริมาตรมาก 3. เพื่อฝึกทักษะในการเตรียมยาไร้เชื้อโดยวิธีการทำไร้เชื้อโดยใช้ความร้อนชื้นในขั้นตอนสุดท้าย 4. เพื่อฝึกทักษะในการบรรจุ และปิดผนึกขวดบรรจุน้ำเกลือ 5. เพื่อฝึกทักษะในการใช้เครื่องมือในการผลิต และควบคุมคุณภาพของยาไร้เชื้อ บทนำ ยาฉีดปริมาตรมาก หมายถึง ผลิตภัณฑ์ที่มีตัวยาละลายอยู่ในน้ำ บรรจุในภาชนะบรรจุชนิดใช้ได้ครั้ง เดียวที่มีปริมาตร 100 มิลลิลิตรหรือมากกว่า และผ่านทำการไร้เชื้อในขั้นตอนสุดท้ายก่อนนำไปใช้ โดยมี วัตถุประสงค์ในการใช้ เช่น เพื่อเป็นแหล่งอิเล็กโทรไลต์ และ/หรือ คาร์โบไฮเดรตเมื่ออยู่ในภาวะขาดน้ำ ช็อค หรือบาดเจ็บสาหัส นอกจากนี้ยังใช้เป็นน้ำกระสายยา และเป็นแหล่งของสารอาหารทดแทนที่จำเป็นเมื่อผู้ป่วย ไม่สามารถรับประทานอาหารทางปากได้ ส่วนประกอบของตำรับมี WFI และสารสำคัญอื่น ๆ ขึ้นกับสภาวะ ของผู้ป่วยแต่ละราย ในการตั้งตำรับนั้นควรคำนึงถึง ปัจจัยทางสรีรวิทยาของผู้ป่วยในเรื่องของสมดุลของอิเล็ก โทรไลต์ในร่างกายและความเป็น isotonic เพราะหากฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำขณะที่ยังไม่ปรับให้เป็น isotonic จะทำให้เกิดความไม่สมดุลของอิเล็กโทรไลต์ เกิดการแตกหรือเหี่ยวของเม็ดเลือดแดง และเกิดการ ทำลายของเนื้อเยื่อต่าง ๆ ได้ แต่ในทางปฏิบัติแล้วสารละลาย hypertonic และ hypotonic สามารถใช้ได้ถ้า มีความจำเป็นอย่างอื่นสำคัญกว่า แต่ต้องให้ยาอย่างช้า ๆ การเติมสารอื่น ๆ ที่ใช้ในยาฉีด เช่น สารคีเลต สารบัฟเฟอร์ สารฆ่าเชื้อแบคทีเรีย และสารต้าน ออกซิเดชั่น ไม่นิยมนำมาใช้กับสารละลายยาฉีดปริมาตรมาก เนื่องจากอาจเกิดการสะสมเพราะผู้ป่วยต้องใช้ใน ปริมาณมากจนเป็นอันตรายต่อร่างกายได้ หากใช้ควรใช้ในปริมาณที่น้อยที่สุด เช่นการเติม sodium bisulfite 0.1% เพื่อเป็นสารต้านออกซิเดชั่น ในตำรับ 5% Dextrose in Lactated Ringer’s solution หรือการแทนที่ ช่องว่างเหนือสารละลายด้วยก๊าซเฉื่อย เช่น ไนโตรเจน ซึ่งสามารถช่วยลดปริมาณการใช้สารต้านออกซิเดชั่น ดังกล่าวได้ ในระหว่างการผลิตยาฉีดปริมาตรมาก การกลั้วขวดบรรจุก่อนบรรจุด้วยน้ำยาที่เตรียม สามารถลด อนุภาคแปลกปลอมที่ติดมากับขวดบรรจุได้ ในการบรรจุสารละลายปริมาตรมาก หากสารละลายปริมาตรมาก มี pH ใกล้เคียงหรือมากกว่า 7.0 ไม่ควรบรรจุในแก้ว Type II เพราะจะไปสกัดเอาความเป็นด่างของแก้ว ออกมาทำให้สารละลายมีค่าความเป็นด่างสูงขึ้น และต้องเผื่อปริมาตรในการบรรจุมากกว่าที่กำหนดไว้ใน USP เนื่องจากจะต้องใช้สารละลาย 5-15 มิลลิลิตร ในการแทนที่ภายใน intravenous set สำหรับช่องว่างเหนือ
94 สารละลายในขวดบรรจุน้ำเกลือ อาจแทนที่โดยใช้ก๊าซไนโตรเจน คาร์บอนไดออกไซด์ หรืออาจทำให้เกิด สุญญากาศบางส่วนโดยการบรรจุสารละลายขณะร้อนแล้วปิดผนึกทันที นอกจากนี้ต้องระวังเรื่องความแตกต่าง ของอุณหภูมิภายในตู้นึ่งอัดไอในขณะทำไร้เชื้อ เพราะอาจเกิดการระเบิดของขวดบรรจุ นอกจากการควบคุม คุณภาพยาฉีดปริมาตรมากในด้านความใสและการรั่วแล้ว การทดสอบสารก่อไข้นับเป็นสิ่งสำคัญที่ต้องมีการ ทดสอบ เพราะแหล่งของสารก่อไข้ที่สำคัญคือ น้ำ ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักในยาฉีดปริมาตรมาก ตำรับ Dextrose USP 5 g Normal saline q.s. to 100 ml สารเคมีที่ใช้ 1. Dextrose USP 2. Sodium chloride 3. Water for Injection ภาชนะบรรจุ ขวดบรรจุน้ำเกลือข นาด 1,000 มิลลิลิตร Type I หรือ II เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต 1. Hot plate 2. Hot air oven 3. Membrane filter pore size 0.45 µm 4. Membrane filtration set 5. Autoclave 6. Cap sealing apparatus เครื่องมือที่ใช้ในการควบคุมคุณภาพ 1. Black and white cup board 2. เครื่องตรวจสอบการรั่วของขวดน้ำเกลือ
95 การจัดเตรียมบรรจุภัณฑ์ การล้างขวดบรรจุน้ำเกลือ (infusion bottle)ขวดบรรจุน้ำเกลือมาแช่ใน 1-2 % caustic alkali หรือสารซักฟอกและน้ำยาฆ่าเชเหมาะสม 1. ล้างทั้งภายในและภายนอกขวดด้วยแปรวยน้ำประปาหรืองครั้งสุดท้ายด้วย WFI ที่ผ่านการกรอง ด้วยแผ่นกรองแบบเยื่อบางขนาดรู 0.45 µm องศาเซลเซียส นาน 45 นาที เพื่อทำไร้เชื้อ และท การล้างฝาจุกยาง (rubber closure) (รายละเอียดเหมือนในปฏิบัติการบทที่ 6) การจัดเตรียมฝาอะลูมิเนียม (รายละเอียดเหมือนในปฏิบัติการบทที่ 6) วิธีเตรียมตำรับ 1. ต้ม WFI 2. ชั่ง sodium chloride 3. ละลาย sodium chloride ใน WFI เพื่อเตรียมสารละลาย 0.9 % 4. ชั่ง dextrose 5. ละลาย dextrose ใน normal saline solution (NSS) 6. วัด pH 7. ปรับปริมาตร 8. กรองน้ำยาผ่าน membrane filter pore size 0.45 ไมครอน 9. บรรจุน้ำยาลงขวดบรรจุน้ำเกลือ 10. ปิดผนึกขวดด้วยจุกยางและ aluminium cap 11. ทำไร้เชื้อผลิตภัณฑ์ในตู้นึ่งอัดไอที่อุณหภูมิ 115 องศาเซลเซนาน 30 นาที 12. เมื่อครบเวลาแล้วจะต้องรอให้อุณหภูมิของน้ำยาในขวดเท่ากับอุณหภูมิของห้องก่อน จึงจะน หมายเหตุ ในการเตรียมสารละลาย 5% Dextrose in Normal Saline Solution ปัญหาที่พบ บ่อย คือ เมื่อนำไปทำไร้เชื้อในตู้นึ่งแล้ว จะทำให้สีของสารละลายเปลี่ยนไป เนื่องจากเกิดการ สลายตัวของ dextrose ทำให้ได้ 5-hydroxymethyl furfural ซึ่งมีสีน้ำตาล วิธีแก้ไขทำได้โดย
96 รายละเอียดในการปฏิบัติงานและเทคนิคต่าง ๆ การเตรียม 5% Dextrose in Normal Saline Solution (เตรียมกลุ่มละ 1,000 มิลลิลิตร) 1. การเตรียมสารละลาย 1.1 ต้ม WFI ประมาณ 1,600 มิลลิลิตร 1.2 เตรียม NSS 1,500 มิลลิลิตร 1.2.1 ชั่ง sodium chloride 13.5 กรัม 1.2.2 ละลาย NaCl ในน้ำต้ม 1,200 มิลลิลิตร คนให้เข้ากัน 1.2.3 ปรับปริมาตรให้ครบ 1,500 มิลลิลิตร ด้วยน้ำต้ม 1.3 เตรียม 5% Dextrose in NSS 1.3.1 ชั่ง dextrose 75 กรั 2. การกรองน้ำยาและการบรรจุ 2.1 ติดตั้งชุดกรองแบบเยื่อบางขนาดรู 0.45 µm 2.2 เติมสารละลายในตัวบรรจุ 2.3 อัดก๊าซไนโตรเจนลงถังเพื่อดันน้ำยาผ่านแผ่นกรองแบบเยื่อบางออกมา 2.4 ใช้น้ำยาที่กรองแล้วกลั้วขวดน้ำเกลือให้ทั่ว 2 ครั้ง 2.5 บรรจุน้ำยาลงขวดน้ำเกลือ ปริมาตรบรรจุประมาณ 520 มิลลิลิตร 2.6 ปิดฝาจุกยางทันที 3. การปิดผนึกขวดน้ำเกลือ 3.1 นำขวดน้ำเกลือที่ปิดด้วยจุกยางแล้วไปวางบนแท่นของเครื่องแล้วสวมทับจุกยางด้วย ฝาอะลูมิเนียม 3.2 เลื่อนขวดให้ตรงกับหัวกดของเครื่องพอดี และมีระยะห่างของหัวกดกับจุกยาง เหมาะสม ที่เครื่องจะทำงานได้ (สามารถปรับแท่นเลื่อนขึ้น-ลงได้) 3.3 เปิดเครื่องและเปิดไฟ ค่หนีบให้ฝาอะลูมิเนียมรัดติดกับคอขวดให้แน่น 3.4 ทดลองหมุนฝาขวดถ้าหมุนได้แสดงว่าปิดผนึกไม่แน่น ต้องแกะออกแล้วปิดผนึกใหม่ 4. การทำไร้เชื้อ 4.1 ผลิตภัณฑ์ไปทำไร้เชื้อในหม้อนึ่งอัดไอที่อุณหภูมิ 115 องศาเซลเซียส ความดัน 10 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว นาน 30 นาที 4.2 นำขวดบรรจุน้ำเกลือทั้งหมดมาใส่ตะกร้า และติด test tape บนขวดบรรจุน้ำเกลือที่ วางกระจายตามจุดต่างๆ ประมาณ 5 จุด 5.3 การเตรียกน้อย รอให้เย็นจึงนำผลิตภัณฑ์ออกได้ 5. การตรวจสอบผลิตภัณฑ์ ด้าน สี ความใส และการรั่วโดยใช้ค้อนยางเคาะฟังเสียง 6. การปิดฉลาก โดยเขียนฉลากให้ถูกต้องแล้วปิดข้างขวดให้เหมาะสม
97 สรุปผลการทดลองและถกแถลง อาจารย์ผู้รับผิดชอบจะเป็นผู้สรุปผลการทดลองและถกแถลงกับนักศึกษาในเรื่องต่างๆ ดังนี้ 1. การค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ 5% Dextrose in NSS เช่น 1.1 มีข้อบ่งใช้อย่างไร 1.2 ความคงตัวของ dextrose เป็นอย่างไร 1.3 ภาชนะบรรจุควรเป็นแก้วชนิดใด 2. สรุปเทคนิคในการเตรียมยาฉีดปริมาตรมากให้ปราศจากสารก่อไข้ และอนุภาคแปลกปลอม 3. การเกิดสีของสารละลาย และแนวทางการแก้ไข การประเมินผล 1. นักศึกษาสามารถสรุปวิธีการเตรียมยาไร้เชื้อแบบ terminally sterilized ได้ 2. นักศึกษาสามารถสรุปเทคนิคที่ใช้ในการเตรียมยาฉีดปริมาตรมากให้ปราศจากสารก่อไข้และอนุภาค แปลกปลอมได้ 3. นักศึกษาสามารถใช้เครื่องมือการผลิตและควบคุมคุณภาพยาไร้เชื้อได้อย่างถูกวิธี 4. นักศึกษาสามารถปิดผนึกขวดน้ำเกลือได้อย่างถูกวิธี 5. นักศึกษาสามารถตรวจสอบความใสและการรั่วของผลิตภัณฑ์ได้ 6. นักศึกษาสามารถแก้ไขปัญหาการเปลี่ยนสีของสารละลายได้อย่างเหมาะสม 7. นักศึกษาสามารถเขียนฉลากได้ถูกต้อง และปิดได้อย่างเหมาะสม 8. นักศึกษาสามารถค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ 5% Dextrose in NSS ได้ คำถามท้ายบท 1. เพราะเหตุใด 5 % Dextrose in Normal Saline Solution จึงเปลี่ยนสีภายหลังจากนำไปเข้าตู้นึ่งอัดไอ ที่ อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที 2. มีวิธีการป้องกันการเปลี่ยนสีของ 5 % Dextrose in NSS ได้อย่างไร และวิธีไหนเป็นวิธีที่ดีที่สุด เพราะ เหตุใด 3. ทำไมต้องกรองน้ำยาก่อนบรรจุ 4. การกลั้วขวดบรรจุน้ำเกลือก่อนบรรจุด้วยน้ำยาที่เตรียมจะสามารถลดการเกิดอนุภาคแปลกปลอมในขวด บรรจุน้ำเกลือได้หรือไม่ 5. ทำไมต้องต้มน้ำกลั่นก่อนละลายตัวยา 6. จำเป็นต้องทำไร้เชื้อจุกยางหรือไม่ 7. การทดสอบความไร้เชื้อและสารก่อไข้ในตำรับนี้ อย่างไหนสำคัญกว่ากัน เพราะเหตุใด
98 รายงานปฏิบัติการเภสัชภัณฑ์ 4 การผลิต 5% Dextrose in Normal Saline Solution โดย กลุ่มที่ ตอนที่ รายชื่อผู้ร่วมงาน ตำแหน่ง 1 2 3 4 5 6 GM PM CM W W W
99 เภสัชภัณฑ์ 4 บันทึกการผลิต ชื่อผลิตภัณฑ์: 5% Dextrose in Normal Saline Solution ปริมาณการผลิต : เลขที่ผลิต : วันผลิต : ลำดับ ชื่อส่วนประกอบ บริษัท เลขที่ จำนวนที่ต้องการ การชั่ง, ตวง ที่ ผู้ผลิต ผลิต มล. ก. มก. ผู้ชั่ง, ตวง ผู้เช็ค 1. 2. 3. Dextrose USP. Sodium chloride Water for Injection เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต และควบคุมคุณภาพ หมายเลขประจำเครื่อง 1. ตู้อบฆ่าเชื้อ 2. เครื่องกรองแบบเยื่อบาง 3. ตู้นึ่งฆ่าเชื้อ 4. เครื่องปิดฝาขวดน้ำเกลือ 5. เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง
100 วิธีการผลิต (Flow Chart)
101 บันทึกข้อมูลการควบคุมคุณภาพ ชื่อผลิตภัณฑ์ : 5% Dextrose in Normal Saline Solution เลขที่ผลิต : อันดับ ที่ การทดสอบ ค่ามาตรฐาน ผลการ ทดสอบ หมายเหตุ 1. 2. 3. 4. 5. 6. สี ความใส การรั่ว ความเป็นกรด-ด่าง สารก่อไข้ ความไร้เชื้อ
102 วิจารณ์ผลการทดลอง สรุปผลการทดลอง เอกสารอ้างอิง
103 เอกสารอ้างอิง 1. British Pharmacopoeia (BP) 1980. 2. British Pharmacopoeia (BP) 1993. 3. Facts and Comparisons, Drug Facts and Comparisons, 1997, 51st edtion, Wolters Kluwer Company, Missouri. 4. Keneth E. Avis, Herbert A. and Lieberman Leon Lachman , 1993, Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications Volume 2, 2ed edition, Revised and Expanded, Marcel Dekker, New York. 5. James E.F. Reynolds, 1996, Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 31st edition, The Pharmaceutical Press, London. 6. K.I. Duner, “The Importance of the Quality of Water in Limulus Amebocyte Lysate Tests” Technology Applications, 49(2), 119-121 (1995). 7. Leon Lachman, Herbert A. Lieberman, Joseph L. Kanig, 1986, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3rd edition, Lea & Febiger, Philadelphia. 8. Michael J. Akers, 1985, Parenteral Quality Control, Marcel Dekker, New York. 9. Microplate Automated Spectrophotometer Wellreader SK 601 Guide Book Instruction Manual, Seikayaku Corporation. 10. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1995, 19th edition, Mack Publishing, Easton Pennsylvania. 11. Salvatore Turco and Robert E. King, 1979, Sterile Dosage Forms, 2nd edition, Lea & Febiger, Philadelphia. 12. The Merck Index, 12th edition, 1996, Merck, New Jersey. 13. The Pharmaceutical Codex, 1979, 11th edition, The Pharmaceutical Press, London. 14. United State Pharmacopeia (USP) 23 and National Formulary (NF) 18, 1995.
104 ปฏิบัติการที่ 9 การผลิต Atropine Sulfate 0.5% Eye Drops ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ภญ.เพ็ญนภา เสาร์คำ วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาการเตรียมยาตาที่อยู่ในรูปแบบสารละลาย 2. เพื่อฝึกทักษะในการเตรียมยาไร้เชื้อโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อในตู้ปลอดเชื้อ 3. เพื่อฝึกทักษะในการทำไร้เชื้อโดยการกรอง 4. เพื่อฝึกทักษะในการล้าง บรรจุและปิดผนึกขวดบรรจุยาตา 5. เพื่อฝึกทักษะในการใช้เครื่องมือในการผลิตและควบคุมคุณภาพของยาตา บทนำ เภสัชตำรับของสหรัฐอเมริกา (United States Pharmacopeia; USP) ให้คำนิยามว่า ยาตาเป็นยา เตรียมไร้เชื้อที่ปราศจากอนุภาคแปลกปลอม มีการตั้งตำรับและการบรรจุในภาชนะที่เหมาะสมสำหรับการ นำเข้าไปในดวงตา รูปแบบยาตามีหลายรูปแบบ ได้แก่ สารละลาย ยาแขวนตะกอน ขี้ผึ้ง และรูปแบบยาเตรียม ที่เป็นของแข็งบางชนิด สำหรับรูปแบบสารละลายและยาแขวนตะกอนจะมีน้ำเป็นน้ำกระสายยา ส่วนรูปแบบ ขี้ผึ้งมักจะประกอบด้วยยาพื้นที่เป็นส่วนผสมของวาสลีนขาว (white petrolatum) และน้ำมันแร่ (mineral oil) รูปแบบยาตาที่นิยมใช้ ได้แก่ ยาตารูปแบบสารละลายหรือยาหยอดตาที่บรรจุในภาชนะแบบเปิดใช้หลาย ครั้ง เนื่องจากใช้สะดวกและราคาไม่สูง นอกจากนั้นยังนิยมใช้ยาตาที่บรรจุในภาชนะขึ้นรูปด้วยพอลิเอทธิลีน (polyethylene) หรือพอลิโพรพีลีน (polypropylene) เพิ่มมากขึ้น โดยสามารถบรรจุยาตาทั้งแบบที่เปิดใช้ หลายครั้งหรือเปิดใช้ในระยะเวลาที่กำหนด ยาตาที่มีอายุสั้นหลังจากการเปิดใช้ (ประมาณ 12-24 ชั่วโมง) เป็น ยาตาที่ไม่มีส่วนประกอบของสารกันเสีย (preservative) ในสูตรตำรับจึงนิยมบรรจุในภาชนะขึ้นรูปดังกล่าว ผลิตภัณฑ์ยาตาส่วนใหญ่จะผลิตภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและบรรจุลงในภาชนะบรรจุที่ผ่านการทำไร้เชื้อแล้วใน สภาวะปลอดเชื้อโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ (aseptic technique) ในการบรรจุและปิดผนึก ทั้งนี้เนื่องจากขวด บรรจุที่ทำจากพอลิเอทธิลีนความหนาแน่นต่ำ (low density polyethylene) ไม่คงตัวต่อความร้อนจากการ ทำไร้เชื้อด้วยหม้อนึ่งอัดไอ (steam sterilization)
105 ตำรับ Atropine Sulfate Ophthalmic Solution ใน USP 2021 ระบุว่า atropine sulfate ophthalmic solution เป็นสารละลายในน้ำของ atropine sulfate ที่ไร้เชื้อ ตำรับประกอบด้วยตัวยา atropine sulfate monohydrate [(C17H23NO3 )2×H2SO4×H2O] ไม่น้อยกว่าร้อยละ 93.0 และไม่มากกว่าร้อยละ 107.0 ของปริมาณที่ระบุไว้บนฉลาก ตำรับอาจประกอบด้วย สารเพิ่มคงตัวและสารต้านเชื้อจุลชีพที่เหมาะสม การเก็บรักษาต้องเก็บในภาชนะบรรจุที่ปิดสนิทและ ห้องควบคุมอุณหภูมิมีค่าความเป็นกรด-ด่างระหว่าง 3.5-6.0 ผ่านเกณ์มาตรฐานการทดสอบความปราศจาก เชื้อ (sterility test) บรรจุในภาชนะปิดสนิท (tight containers) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิห้องที่ควบคุม (controlled room temperature) นั่นคือ อุณหภูมิระหว่าง 20 ถึง 25 องศาเซลเซียส ตำรับ Atropine sulfate 0.50 g Benzalkonium chloride 0.01 g Phosphate buffer pH 5.9 q.s. 100.00 ml Phosphate buffer pH 5.9 Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4 ) anh. 0.720 g Disodium hydrogenphosphate (Na2HPO4 ) anh. 0.093 g Sodium chloride 0.520 g SWFI q.s. 100.0 ml ภาชนะบรรจุ ขวดยาหยอดตา สีชา ขนาด 10 มล. พร้อมหลอดหยดยา เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต 1. ตู้อบ (hot air oven) 2. ตู้นึ่งอัดไอ 3. แผ่นกรองเยื่อบาง ขนาดรูเปิด 0.22 µm 4. เครื่องบรรจุและเครื่องกรองยาหยอดตา (Cornwall syringe pipette) 5. ตู้ปลอดเชื้อ เครื่องมือที่ใช้ในการควบคุมคุณภาพ ตู้ตรวจดูอนุภาค (black and white cup board)
106 วิธีเตรียมตำรับ เตรียมสารละลายกลุ่มละ 150 มิลลิลิตร (ให้ทำกลุ่มละ 5 ขวด แล้วส่งทั้งหมด) และมอบหมายให้กลุ่ม ใดกลุ่มหนึ่งเตรียม phosphate buffer pH 5.9 จำนวน 1,000 มิลลิลิตร) 1. คำนวณน้ำหนักสารเคมีในตำรับสำหรับการเตรียมสารละลาย 150 มิลลิลิตร (และ phosphate buffer pH 5.6 1,000 มิลลิลิตร สำหรับกลุ่มที่ได้รับมอบหมาย) 2. เตรียมตู้ปลอดเชื้อ โดยทำความสะอาดด้วยแอลกอฮอล์ 70% แล้วเปิดเครื่องทิ้งไว้นาน 15-20 นาที และตรวจสอบประสิทธิภาพของลม 3. ชั่งสารเคมีที่ต้องใช้ตามปริมาณที่คำนวณได้ แล้วนำไปทำไร้เชื้อโดยการอบด้วยก๊าซ ethylene oxide หรือการใช้รังสี แล้วนำไปไว้ในตู้ปลอดเชื้อเพื่อเตรียมในขั้นตอนต่อไป *** ตั้งแต่ขั้นตอนที่ 4 ถึง 5 ทำในตู้ปลอดเชื้อ*** 4. เตรียมตำรับ atropine sulfate 0.5% eye drop ปริมาตร 150 มิลลิลิตร 4.1. ตวงสารละลาย benzalkonium chloride 2% จำนวณ 0.75 มิลลิลิตร 4.2. เตรียมสารละลายไอโซโทนิคของ atropine sulfate ในบีกเกอร์ขนาด 500 มล. โดยละลาย atropine sulfate จำนวน 0.75 กรัม ใน SWFI ปริมาตร 10.75 มิลลิลิตร แต่ทั้งนี้มีน้ำอยู่ในสารละลาย benzalkonium chloride 2% อยู่แล้ว 0.75 มิลลิลิตร ดังนั้นจึงใช้น้ำปริมาตร 10 มิลลิลิตรในการละลาย atropine sulfate จำนวน 0.75 กรัม เพื่อให้ได้เป็นสารละลายที่มีสมบัติเป็นไอโซโทนิค 4.3. เติมสารละลาย benzalkonium chloride 2% ปริมาตร 0.75 มิลลิลิตร พร้อมคนให้เข้ากัน 4.4. ปรับปริมาตรด้วย phosphate buffer pH 5.9 ให้ครบ 150 มิลลิลิตร แล้วปิดบีกเกอร์ด้วย ฟอยล์ 5. การกรองและบรรจุน้ำยา โดยใช้ชุด Cornwall syringe pipette ที่สะอาดและแห้งด้วยเทคนิค ปลอดเชื้อ ดังมีรายละเอียดดังนี้ 5.1. ประกอบชุด Cornwall syringe pipette เข้ากับชุดกรองที่ผ่านการทำไร้เชื้อแล้ว 5.2. ตั้งปริมาตรการบรรจุที่ 10.5 มิลลิลิตร 5.3. จุ่มส่วนของท่อดูดน้ำยาลงในบีกเกอรที่บรรจุน้ำยาอยู่ (พร้อมทั้งปิดปากบีกเกอร์ด้วยฟอยล์ไว้ ขณะทำการบรรจุ) 5.4. ดูดน้ำยาโดยการกดที่ก้านลูกสูบและไล่ฟองอากาศให้ออกจากกระบอกฉีดยาให้หมด (โดยการ หันปลายด้านบรรจุขึ้นข้างบนขณะทำการไล่อากาศ) 5.5. การบรรจุให้นำขวดบรรจุยาตาวางไว้ แล้วสอดส่วนปลายสุดของชุดกรองลงบนขวดบรรจุ แล้ว จึงดันก้านของกระบอกฉีดยาช้า ๆ อย่างต่อเนื่องจนน้ำยาในกระบอกถูกฉีดออกหมด (หมายเหตุ ห้ามหยุดหรือ ปล่อยก้านกระบอกขณะที่ยังดันไม่สุด เนื่องจากจะทำให้ปริมาตรที่บรรจุไม่ครบตามจำนวน) 5.6. นำชุดหยอดยามาปิดขวดบรรจุทันที
107 6. นำผลิตภัณฑ์มาควบคุมคุณภาพ ดังนี้ 6.1.ความใส (รายละเอียดของการทดสอบแสดงในภาคผนวก) 6.2.ความไร้เชื้อ (ซึ่งจะได้ศึกษาขั้นตอนการทดสอบในปฏิบัติการที่ 10) 7. ส่งผลิตภัณฑ์ที่ผ่านการทดสอบจากข้อ 6 เพื่อใช้สำหรับทดสอบความไร้เชื้อในปฏิบัติการต่อไป 8. เขียนรายงานและวิจารณ์ผลการทดลอง ตอบคำถามท้ายบท และออกแบบฉลากและกล่องบรรจุ พร้อมทั้งส่งในรูปแบบไฟล์ pdf ก่อนเข้าปฏิบัติการครั้งต่อไป รายละเอียดและเทคนิคต่าง ๆ ที่ใช้ในการปฏิบัติงาน 1. การจัดเตรียมตู้ปลอดเชื้อ มีขั้นตอนและรายละเอียด แสดงในภาคผนวก 2. ผู้ปฏิบัติงานจะต้องสวมหมวกคลุมผม หน้ากาก (mask) และถุงมือที่เช็ดฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70% สรุปผลการทดลองและถกแถลง อาจารย์สรุปผลการทดลองและถกแถลงกับนักศึกษา ในเรื่องต่าง ๆ ดังนี้ 1. การค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Atropine Sulfate 0.5% Eye drop ในประเด็นต่อไปนี้ 1.1. วิธีการใช้ยาหยอดตาที่ถูกต้อง 1.2. ข้อบ่งใช้ของตำรับ 1.3. หน้าที่ของสารแต่ละตัวในตำรับ 1.4. วันหมดอายุภายหลังการเปิดใช้ 2. การจัดเตรียมตู้ปลอดเชื้อ รายละเอียดการจัดเตรียมตู้ปลอดเชื้อแสดงในภาคผนวก 3. การใช้ Cornwall syringe pipette รายละเอียดการใช้ Cornwall syringe pipette แสดงในภาคผนวก การประเมินผล 1. นักศึกษาสามารถสรุปวิธีเตรียมยาหยอดตาที่ทำไร้เชื้อโดยการกรองได้ 2. นักศึกษาสามารถใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการเตรียมยาหยอดตาได้อย่างถูกวิธี 3. นักศึกษาสามารถจัดเตรียมตู้ปลอดเชื้อได้ 4. นักศึกษาสามารถใช้เครื่องกรองพร้อมบรรจุแบบ Cornwall syringe pipette ได้อย่างถูกวิธี 5. นักศึกษาสามารถตรวจสอบความใสของผลิตภัณฑ์ได้ 6. นักศึกษาสามารถทำกล่องบรรจุและเขียนฉลากได้อย่างถูกต้อง 7. นักศึกษาสามารถค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop ได้
108 คำถามท้ายบท 1. ตำรับยาหยอดตาประกอบด้วยสารกลุ่มใด และทำหน้าที่อะไรในสูตรตำรับ 2. การเตรียมตำรับยาตามีกี่วิธี อะไรบ้าง 3. การปิดผนึกขวดบรรจุยาตาจะต้องมีการปิดผนึกชนิดทุติยภูมิ (secondary seal) หรือไม่ เพราะเหตุใด 4. ยาตาที่เปิดใช้แล้วสามารถใช้ได้ต่อไปนานเท่าใด 5. ข้อควรระวังในการใช้ชุดกรองพร้อมบรรจุ Cornwall syringe pipette คืออะไร 6. Phosphate buffer pH 5.9 มีผลต่อตำรับ Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop อย่างไรบ้าง 7. ตำรับ Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop ที่เตรียมในปฏิบัติการเป็นสารละลายไอโซโทนิคหรือไม่ อย่างไร 8. ตำรับ Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop ที่เตรียมในปฏิบัติการมีสารกันเสียเป็นส่วนประกอบหรือไม่ ถ้ามีคือสารใด และเหตุใดต้องมีสารกันเสียในสูตรตำรับ
109 รายงานปฏิบัติการเภสัชภัณฑ์ 4 การเตรียม Atropine Sulfate 0.5% Eye Drops ข้อความสีแดงเป็นคำชี้แจง ให้ลบออกจากรายงานก่อนส่ง โดย กลุ่มที่ ตอนที่ รายชื่อผู้ร่วมงาน ตำแหน่ง 1. 2. 3. 4. 5. 6. GM PM CM W W W
110 เทคโนโลยีเภสัชกรรม 4 บันทึกการผลิต ชื่อผลิตภัณฑ์ : Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop (ระบุชื่อการค้า เช่น Isopto® Atropine) เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : เลขทะเบียนยาตามรูปแบบที่อย.กำหนด ปริมาณการผลิต : ปริมาณที่ผลิต เช่น 100 มิลลิตร ** ไม่ใช่จำนวนผลิตภัณฑ์ที่ได้** เลขที่ผลิต : batch number หรือ lot number วันผลิต : วันที่เตรียมตำรับ ลำดับ ชื่อส่วนประกอบ บริษัท เลขที่ จำนวนที่ต้องการ การชั่ง, ตวง ที่ ผู้ผลิต ผลิต มล. ก. มก. ผู้ชั่ง, ตวง ผู้เช็ค 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต และควบคุมคุณภาพ หมายเลขประจำเครื่อง 1. 2. 3. (หากไม่ทราบบริษัทผู้ผลิต/เลขที่ผลิตหรือ เครื่องมือที่ใช้การผลิตไม่มีหมายเลขประจำเครื่องให้ใช้ N/A)
111 วิธีการผลิต (Flow Chart) ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขที่ผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต ระบุน้ำหนักของส่วนประกอบหรือค่าจริง เช่น ปริมาตรสุดท้าย 100 มิลลิตร ลงในวิธีการผลิต ผู้จัดทำ : ผู้ตรวจสอบ :
112 บันทึกข้อมูลการควบคุมคุณภาพ ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขที่ผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันควบคุมคุณภาพ : วันที่ควบคุมคุณภาพ ลำดับที่ การทดสอบ ค่ามาตรฐาน ผลการทดสอบ ผู้ทดสอบ ผู้ตรวจเช็ค หมายเหตุ 1. ความใส
113 ฉลากผลิตภัณฑ์และกล่องบรรจุยาตา ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต
114 วิจารณ์ผลการทดลอง สรุปผลการทดลอง คำถามท้ายบท เอกสารอ้างอิง
115 การผลิต Chloramphenicol 1% Ophthalmic Ointment วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาการเตรียมยาตาที่อยู่ในรูปแบบของยาขี้ผึ้ง 2. เพื่อฝึกทักษะในการเตรียมยาไร้เชื้อ โดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อในตู้ปลอดเชื้อ 3. เพื่อฝึกทักษะในการใช้เครื่องมือในการผลิตและควบคุมคุณภาพของยาตา บทนำ ยาขี้ผึ้งป้ายตา (ophthalmic ointments) เป็นผลิตภัณฑ์ที่มีลักษณะหนืด เหมาะสำหรับยาที่ต้องการ การออกฤทธิ์นาน เพราะตัวยาจะค่อย ๆ ปลดปล่อยออกจากยาพื้นอย่างช้า ๆ ส่วนมากตัวยาสำคัญมักจะเป็น ยาปฏิชีวนะ ข้อเสียของการใช้ยารูปแบบนี้ คือ ทำให้เกิดขี้ตา เนื่องจากเศษของยาพื้นและอาจรบกวนการ มองเห็น (blur vision) เมื่อใช้จึงควรหลีกเลี่ยงการขับรถ หรือการทำงานกับเครื่องจักรอันตราย และมักใช้ป้าย ตาก่อนนอนในตอนกลางคืน ยาขี้ผึ้งป้ายตาประกอบด้วย ตัวยาสำคัญและส่วนประกอบอื่น ๆ ได้แก่ antioxidant เช่น sodium metabisulphite เพื่อช่วยป้องกันการสลายของตัวยา chelating agent เช่น disodium edetate เพื่อจับกับ ion metal ต่าง ๆ และเสริมฤทธิ์กับ antioxidant ป้องกันการสลายของตัว ยา สารกันเสีย มักนิยมใช้ 0.5% chlorobutanol และ 0.01% benzalkonium chloride และยาพื้นซึ่งเป็น องค์ประกอบสำคัญของยาขี้ผึ้งป้ายตา ยาพื้นที่นิยมใช้คือ anhydrous base เมื่อไม่มีน้ำเป็นองค์ประกอบใน ตำรับและ hydrous absorption base ที่มีanhydrous lanolin ในตำรับซึ่งมีความสามารถในการดูดน้ำได้ เล็กน้อย ไม่ใช้ยาพื้นชนิด oil in water กับยาตา เพราะสารลดแรงตึงผิวอาจก่อให้เกิดความระคายเคืองต่อเยื่อ ตาได้ นอกจากนี้ปริมาณน้ำที่ใช้ในการละลายสารช่วยในตำรับก่อนนำไปผสมกับยาพื้นจะต้องใช้ให้น้อยที่สุด เนื่องจากยาพื้นขี้ผึ้งชนิด hydrous absorption base สามารถดูดซับน้ำได้จำกัด ถ้าใช้น้ำมากเกินไปอาจเกิด การแยกชั้นกับยาพื้นได้ ตัวยาสำคัญที่ใช้ในยาขี้ผึ้งป้ายตาจะต้องอยู่ในรูป micronized powder ที่มีขนาด อนุภาคน้อยกว่า 10 ไมโครเมตร เพื่อป้องกันการระคายเคือง การทำไร้เชื้อยาตาประเภทยาขี้ผึ้งไม่สามารถใช้ วิธีทำไร้เชื้อในขั้นตอนสุดท้าย (final sterilization) ได้หากตัวยาสำคัญไม่คงตัวต่อความร้อน และเนื่องจาก ตำรับมีลักษณะเป็นขี้ผึ้งจึงไม่สามารถทำไร้เชื้อโดยการกรองได้ ดังนั้นอาจต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการเตรียม ยาขี้ผึ้งป้ายตา เริ่มตั้งแต่การทำไร้เชื้อตัวยาและยาพื้นแยกกัน แล้วนำมาผสมกันโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ (aseptic technique) ด้วย geometric dilution และ levigating technique (slab และ spatula) แล้ว บรรจุและปิดผนึก โดยทุกขั้นตอนในการผลิตนับเป็นจุดวิกฤติทั้งหมด ภาชนะที่ใช้บรรจุยาขี้ผึ้งป้ายตามักใช้ collapsible tube หรือ flexible low density polyethylene หรือหลอด laminates การเลือกใช้ต้อง คำนึงถึงความเข้ากันของตัวยากับภาชนะบรรจุ ขนาดของภาชนะบรรจุและลักษณะการใช้งาน เป็นต้น
116 ตำรับ Chloramphenicol (micronized powder) 1.00 g Benzalkonium chloride 0.01 g Disodium edetate 0.10 g Sodium metabisulphite 0.10 g Liquid paraffin 7.00 g Anh. Lanolin 5.00 g White soft paraffin q.s. 100.00 g ภาชนะบรรจุ Collapsible tube ขนาด 5 กรัม หรือ sterile disposable plastic syringe ขนาด 5 มิลลิลิตร เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต 1. Hot air oven 2. Autoclave 3. Slab and spatula 4. Stirring rod 5. Laminar air flow hood 6. Casserole 7. Hot plate การจัดเตรียมบรรจุภัณฑ์ 1. นำ collapsible tube ขนาด 5 กรัม หรือ disposable plastic syringe ขนาด 5 มิลลิลิตร บรรจุ ในภาชนะบรรจุที่เหมาะสม แล้วทำไร้เชื้อโดยการใช้ก๊าซ ethylene oxide ตามวิธีที่กำหนด 2. เก็บภาชนะบรรจุที่ทำไร้เชื้อแล้วในตู้ปลอดเชื้อจนกว่าจะใช้ วิธีเตรียมตำรับ (เตรียมกลุ่มละ 100 กรัม) 1. ล้างภาชนะและเครื่องมือที่ใช้ในการเตรียมให้สะอาด แล้วทำไร้เชื้อโดยใช้วิธีที่เหมาะสมกับเครื่องมือ แต่ละชนิด 2. ชั่ง chloramphenicol (micronized powder), benzalkonium chloride, disodium edetate, sodium metabisulphite ใส่ในภาชนะที่เหมาะสม จากนั้นนำมาทำไร้เชื้อโดยการใช้ก๊าซ ethylene oxide
117 3. ชั่ง liquid paraffin, anhydrous lanolin และ white soft paraffin ใส่ใน casserole จากนั้น นำมาทำไร้เชื้อโดยอบในตู้อบที่อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง 4. เตรียมตู้ปลอดเชื้อ โดยทำความสะอาดด้วยแอลกอฮอล์ 70% แล้วเปิดเครื่องทิ้งไว้นาน 15-20 นาที และตรวจสอบประสิทธิภาพของลม *** ตั้งแต่ขั้นตอนที่ 5-7 ทำในตู้ปลอดเชื้อ *** 5. ตวง benzalkonium chloride 2% จำนวน 0.5 มิลลิลิตร ใส่ในบีกเกอร์ขนาด 100 มิลลิลิตร ที่ สะอาดและไร้เชื้อ 6. เติม disodium edetate 0.1 กรัมและ sodium metabisulfite 0.1 กรัมลงไป อาจละลายด้วย SWFI เล็กน้อย เพื่อให้ได้สารละลายใส 7. เติมสารละลายในข้อ 6 ลงใน paraffin base ที่ไร้เชื้อใน casserole (จากข้อ 3) ผสมให้เข้ากัน โดย ใช้ stirring rod ให้ได้ ointment base 8. บดผสมตัวยา chloramphenicol 1.0 กรัมที่ไร้เชื้อกับยาพื้น (ointment base จากข้อ 7) ด้วย slab และspatula โดยใช้ geometric dilution technique (ผสมตัวยากับยาพื้น จำนวนน้อยให้เข้ากันก่อน แล้วจึงค่อย ๆ เพิ่มปริมาณยาพื้นที่เหลือลงไปผสมอย่างสม่ำเสมอจนหมด) 9. นำยาเตรียมที่ได้บรรจุใน sterile collapsible tube หรือ sterile disposable plastic syringe ขนาด 5 มิลลิลิตร แล้วทำการปิดผนึก 10. การตรวจสอบผลิตภัณฑ์ โดยตรวจสอบสีและการรั่ว 11. ส่งผลิตภัณฑ์ที่ผ่านการทดสอบจากข้อ 10 ตามช่องทางที่อาจารย์ระบุ 12. เขียนรายงานและวิจารณ์ผลการทดลอง ตอบคำถามท้ายบท และออกแบบฉลากและกล่องบรรจุ พร้อมทั้งส่งในรูปแบบไฟล์ pdf ก่อนเข้าปฏิบัติการครั้งต่อไป รายละเอียดในการปฏิบัติงานและเทคนิคต่าง ๆ 1. การจัดเตรียมตู้ปลอดเชื้อ มีขั้นตอนและรายละเอียดแสดงในภาคผนวก 2. ผู้ปฏิบัติงานจะต้องสวมหมวกคลุมผม หน้ากาก (mask) และถุงมือที่เช็ดฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70%
118 สรุปผลการทดลองและถกแถลง อาจารย์ผู้รับผิดชอบจะเป็นผู้สรุปผลการทดลองและถกแถลงกับนักศึกษาในเรื่องต่าง ๆ ดังนี้ 1. การค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Chloramphenicol 1% Ophthalmic Ointment 1.1. ใช้รักษาโรคอะไร 1.2. วิธีใช้ยา 1.3. ความคงตัวของตัวยา 1.4. การเก็บรักษา 1.5. ข้อดีของการใช้ยาขี้ผึ้งป้ายตา 2. สรุปขั้นตอนและเทคนิคการผลิตยาขี้ผึ้งป้ายตา 3. ความแตกต่างในการผลิตกับ Atropine Sulfate 0.5% Eye Drop ซึ่งใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการ ผลิตเช่นกัน 4. จุดสำคัญที่จะต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการทำงาน การประเมินผล 1. นักศึกษาสามารถสรุปวิธีเตรียมขี้ผึ้งป้ายตาโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อได้ 2. นักศึกษาสามารถจัดเตรียมเครื่องมือต่าง ๆ บรรจุภัณฑ์ และตัวยาต่าง ๆ ที่ใช้ในการเตรียมตำรับยา ขี้ผึ้งป้ายตาได้อย่างถูกต้อง 3. นักศึกษาสามารถใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการเตรียมขี้ผึ้งป้ายตาได้อย่างถูกต้อง 4. นักศึกษาสามารถทำกล่องบรรจุผลิตภัณฑ์ และเขียนฉลากปิดได้อย่างถูกต้อง 5. นักศึกษาสามารถค้นคว้าความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Chloramphenicol 1% Ophthalmic Ointment ได้ คำถามท้ายบท 1. องค์ประกอบของตำรับขี้ผึ้งป้ายตามีอะไรบ้าง 2. เทคนิคในการเตรียมขี้ผึ้งป้ายตาด้วยเทคนิคปลอดเชื้อแตกต่างจากการเตรียมยาตาประเภทสารละลาย อย่างไร 3. จากคุณสมบัติของ chloramphenicol ข้อควรระวังในการเตรียมและการเก็บรักษายาขี้ผึ้งป้ายตา คืออะไร 4. คุณสมบัติที่สำคัญของ collapsible tube ในการใช้บรรจุยาตา คืออะไร 5. Collapsible tube ที่ทำมาจากโลหะและพลาสติกแตกต่างกันอย่างไร ให้นักศึกษาเปรียบเทียบทั้งข้อ ได้เปรียบและข้อเสียเปรียบ 6. วัตถุประสงค์ของการเติม anhydrous lanolin และ liquid paraffin ในตำรับ คืออะไร 7. การใช้ยาขี้ผึ้งป้ายตามีข้อดีกว่าการใช้ยาหยอดตาอย่างไร
119 รายงานปฏิบัติการเภสัชภัณฑ์ 4 การเตรียม Chloramphenicol 1% Ophthalmic Ointment ข้อความสีแดงเป็นคำชี้แจง ให้ลบออกจากรายงานก่อนส่ง โดย กลุ่มที่ ตอนที่ รายชื่อผู้ร่วมงาน ตำแหน่ง 1 2 3 4 5 6 GM PM CM W W W
120 เภสัชภัณฑ์ 4 บันทึกการผลิต ชื่อผลิตภัณฑ์ : Chloramphenicol 1% Ophthalmic Ointment (ระบุชื่อการค้า เช่น Chloroph) เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : เลขทะเบียนยาตามรูปแบบที่อย.กำหนด ปริมาณการผลิต : ปริมาณที่ผลิต เช่น 100 มิลลิตร ** ไม่ใช่จำนวนผลิตภัณฑ์ที่ได้** เลขที่ผลิต : batch number หรือ lot number วันผลิต : วันที่เตรียมตำรับ ลำดับ ชื่อส่วนประกอบ บริษัท เลขที่ จำนวนที่ต้องการ การชั่ง, ตวง ที่ ผู้ผลิต ผลิต มล. ก. มก. ผู้ชั่ง, ตวง ผู้เช็ค 1. Chloramphenicol 2. Benzalkonium chloride 3. Disodium edetate 4. Sodium metabisulphite 5. Liquid paraffin 6. Anhydrous lanolin 7. White soft paraffin เครื่องมือที่ใช้ในการผลิต หมายเลขประจำเครื่อง 1. ตู้อบฆ่าเชื้อ 2. ตู้นึ่งอัดไอ 3. สแลปและสปาตูลา 4. แท่งแก้วคน 5. คาเซอโรล 6. ตู้ปลอดเชื้อ 7. เตาไฟฟ้า (หากไม่ทราบบริษัทผู้ผลิต/เลขที่ผลิตหรือ เครื่องมือที่ใช้การผลิตไม่มีหมายเลขประจำเครื่องให้ใช้ N/A)
121 วิธีการผลิต (Flow Chart) ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขที่ผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต ระบุน้ำหนักของส่วนประกอบหรือค่าจริง เช่น ปริมาตรสุดท้าย 100 มิลลิตร ลงในวิธีการผลิต ผู้จัดทำ : ผู้ตรวจสอบ :
122 บันทึกข้อมูลการควบคุมคุณภาพ ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขที่ผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันผลิต : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต วันควบคุมคุณภาพ : วันที่ควบคุมคุณภาพ ลำดับที่ การทดสอบ ค่ามาตรฐาน ผลการทดสอบ ผู้ทดสอบ ผู้ตรวจเช็ค หมายเหตุ 1. สี 2. การรั่ว
123 วิจารณ์ผลการทดลอง สรุปผลการทดลอง คำถามท้ายบท เอกสารอ้างอิง
124 ฉลากผลิตภัณฑ์และกล่องบรรจุยาขี้ผึ้ง ชื่อผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต เลขทะเบียนผลิตภัณฑ์ : ข้อมูลเดียวกับบันทึกการผลิต
125 ปฏิบัติการที่ 10 การทดสอบความไร้เชื้อของตำรับยาไร้เชื้อโดยวิธีกรอง รองศาสตราจารย์ ดร.ภก.ภูริวัฒน์ ลี้สวัสดิ์ วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาขั้นตอนในการทดสอบความไร้เชื้อของตำรับยาไร้เชื้อโดยวิธีกรอง 2. เพื่อฝึกทักษะการใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการทดสอบความไร้เชื้อของตำรับ 3. เพื่อฝึกทักษะและเทคนิคในการจัดเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ การเพาะและฟักจุลินทรีย์ 4. เพื่อสามารถประเมินผลการทดสอบได้ บทนำ การตรวจสอบความไร้เชื้อถือเป็นการตรวจสอบสำคัญที่ต้องกระทำในเภสัชภัณฑ์รูปแบบฉีด เนื่องจาก ผลิตภัณฑ์ยาฉีด เป็นการให้ยาผ่านทางเส้นเลือด หรือฉีดเข้าเนื้อเยื่อ หากมีเชื้อโรคก็จะก่อให้เกิดการติดเชื้อใน กระแสเลือดหรือการติดเชื้อในเนื้อเยื่อ ทำให้เกิดผลเสียต่อสุขภาพตามมาได้ โดยทั่วไปแล้วหากได้รับยาโดย การรับประทาน เชื้อจุลินทรีย์จะถูกทำลายโดยสภาวะความเป็นกรดของกระเพาะอาหารจึงส่งผลให้ เชื้อจุลินทรีย์มีโอกาสถูกดูดซึมเข้าสู่ระบบไหลเวียนเลือดได้น้อยลง แต่ผลิตภัณฑ์ยาฉีดมีการให้ยาผ่านเส้นเลือด โดยตรง การตรวจสอบความไร้เชื้อจึงเป็นการตรวจสอบที่สำคัญมาก และถูกกำหนดไว้ในเภสัชตำรับ โดยทั่วไป แล้วจะทำการสุ่มตัวอย่างเพื่อมาทดสอบความไร้เชื้อ สาเหตุที่ไม่สามารถนำเอาผลิตภัณฑ์ทั้งหมดมาทดสอบ ความไร้เชื้อได้ เนื่องจากการทดสอบความไร้เชื้อเป็นการทดสอบที่ต้องทำลายผลิตภัณฑ์ จึงจำเป็นต้องมีวิธีการ สุ่มตัวอย่างที่จะนำมาทดสอบที่เหมาะสม ดังรายละเอียดปริมาณและจำนวนตัวอย่างของยาฉีดที่ใช้ในการ เตรียมเพื่อทดสอบความไร้เชื้อในตารางที่ 11.1 และในการทดสอบความไร้เชื้อของผลิตภัณฑ์ยาฉีดต้องคำนึง อยู่เสมอว่าการทดสอบความไร้เชื้อเป็นการตรวจสอบโดยประเมินจากตัวอย่างที่สุ่มมาเป็นตัวแทนของ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมด ไม่ได้หมายความว่าผลิตภัณฑ์ทั้งหมดไร้เชื้อจริง อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดสอบความไร้เชื้อที่นิยมใช้ ได้แก่ Fluid Thioglycollate Medium (FTM) เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับแบคทีเรียชนิดที่เป็น aerobic และ anaerobic โดยอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นจะมีส่วนบนของสารละลายเป็นสีชมพูเข้ม ซึ่งไวต่อ oxygen เป็น อาหารสำหรับแบคทีเรียชนิดที่เป็น aerobic และส่วนล่างซึ่งไม่มีoxygen เป็นอาหารสำหรับแบคทีเรียชนิดที่ เป็น anaerobic Soybean-Casein Digest (SCD) หรือ Typticase Soy Broth (TSB) medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อ สำหรับเชื้อราและแบคทีเรีย ซึ่งจะมี pH สูงกว่า FTM เล็กน้อย นอกจากนี้ยังสามารถช่วยในการเจริญของ slow growing aerobic microorganism ได้ดีกว่า FTM
126 การทดสอบความไร้เชื้อทำได้ 2 วิธี คือ Direct transfer method เป็นวิธีที่มีใช้กันมานานแล้ว ทำได้โดยใส่ตัวอย่างที่ต้องการทดสอบลงใน อาหารเลี้ยงเชื้อโดยตรงด้วยเทคนิคปลอดเชื้อ สามารถใช้ได้กับผลิตภัณฑ์ต่าง ๆ เช่น ขี้ผึ้ง หรือน้ำมันที่ไม่ ละลายใน isopropyl myristate, ตัวอย่างที่ต้องการทดสอบที่เป็นของแข็ง, อุปกรณ์การให้ยาต่าง ๆ, สำลี ผ้าพันแผล, ผ้ากอซ และ disposable syringe เป็นต้น Membrane filtration method เป็นวิธีที่นิยมใช้ในการทดสอบและจัดเป็น method of choice ของการทดสอบความไร้เชื้อ วิธีนี้ตัวอย่างที่มีจุลินทรีย์ปนเปื้อนจะถูกกรองผ่าน membrane filter ที่จุลินทรีย์ ไม่สามารถกรองผ่านได้ ดังนั้นจุลินทรีย์จะถูกกักอยู่บนกระดาษกรอง แล้วจึงนำแผ่นกรองนั้นไปเพาะเลี้ยงใน อาหารเลี้ยงเชื้อต่อไป โดยมักใช้กับผลิตภัณฑ์ของเหลวที่เข้ากันได้กับน้ำกระสายยาที่เป็นน้ำ หรือของเหลวที่ เข้ากันไม่ได้กับน้ำกระสายยาที่เป็นน้ำและมีปริมาตรบรรจุน้อยกว่า 100 มิลลิลิตร รวมถึงขี้ผึ้งและน้ำมันที่ ละลายใน isopropyl myristate เป็นต้น อุปกรณ์และสารเคมี 1. หลอดทดลองขนาด 38×200 มิลลิเมตร ปริมาตรบรรจุ 100 มิลลิลิตร พร้อมสำลีปิด 8 หลอดต่อกลุ่ม 2. แผ่นกรอง (membrane filter) ที่มีรูพรุนขนาด 0.45 µm เส้นผ่าศูนย์กลาง 47 มิลลิเมตร และให้ อัตราการไหลผ่านของน้ำ 55-75 มิลลิลิตรต่อนาที ที่ความดัน 70 เซนติเมตรของปรอท 3. ชุดกรอง (filter) 4. กระบอกฉีดขนาด (syringe) 10 มิลลิลิตร 5. กรรไกร 6. คีมคีบ 7. ตะเกียงแอลกอฮอล์ 8. บีกเกอร์ขนาด 100 มิลลิลิตร 9. ตู้ปราศจากเชื้อ 10. ตู้อบเลี้ยงเชื้อ (incubator) 11. Loop ใช้ innoculate เชื้อ อาหารเลี้ยงเชื้อ 1. Fluid thioglycollate medium (FTM) 2. Soybean-casein digest medium (SCD) เชื้อที่ใช้ทดสอบ 1. Bacillus subtilis หรือ Micrococcus luteus 2. Bacteroides vulgaris หรือ Clostridium sporogens 3. Candida albicans
127 วิธีทดลอง 1. Controls in sterility test 1.1 Positive control เป็นการทดสอบอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดสอบความไร้เชื้อว่าจะสามารถ ใช้ในการเจริญเติบโตของเชื้อได้ โดย 1.1.1 Inoculate เชื้อ Bacillus subtilis ใน FTM 100 มิลลิลิตร แล้วนำไปเพาะฟักที่ 30-35 องศาเซลเซียส จะต้องมีการเจริญของเชื้อภายในเจ็ดวัน 1.1.2 Inoculate เชื้อ Candida albicans ใน SCD 100 มิลลิลิตร แล้วนำไปเพาะฟักที่ 20- 25 องศาเซลเซียส จะต้องมีการเจริญของเชื้อภายในเจ็ดวันเช่นกัน 1.2 Negative control เป็นการทดสอบอาหารเลี้ยงเชื้อว่ามีความไร้เชื้อหรือไม่ โดยนำอาหารเลี้ยง เชื้อที่จะใช้ทดสอบไปเพาะฟักโดยตรง นอกจากนี้จะทำการทดสอบเทคนิคในการทำงานตลอดจนสภาวะ แวดล้อมต่างๆ ในการทำงานว่าจะเป็นสาเหตุทำให้เกิดการปนเปื้อนของเชื้อได้หรือไม่ โดยทำเหมือนการ ทดสอบจริงทุกอย่าง แต่ไม่ต้องใส่เชื้อหรือผลิตภัณฑ์ที่จะทดสอบลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ (FTM และ SCD) แล้วนำไปเพาะฟักที่อุณหภูมิ 30-35 องศาเซลเซียส สำหรับ FTM และ 20-25 องศาเซลเซียส สำหรับ SDC จะต้องไม่มีเชื้อเจริญขึ้นภายในเจ็ดวัน 1.3 Bacteriostatic and Fungistatic Testing เป็นการทดสอบคุณสมบัติในการยับยั้งการ เจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราที่เกิดจากสารที่มีอยู่ในตำรับ วิธีทดสอบทำเหมือนการทดลองทุกอย่าง แต่เพิ่มการใส่เชื้อลงไปด้วย เชื้อที่ใช้ทดสอบใช้ชนิดเดียวกันกับการทดสอบ positive control แล้วนำ FTM และ SCD ไป เพาะฟักที่ 30-35 และ 20-25 องศาเซลเซียส ตามลำดับ จะต้องมีเชื้อเจริญขึ้นภายในเจ็ดวัน ถ้า ไม่มีการเจริญของเชื้อจะต้องมีการใช้สารทำลายฤทธิ์การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ของ antibacterial agent ที่มีใน ตำรับหรือใช้สารชะล้างอื่นที่เหมาะสม เช่น NSS ก่อนการทดสอบจริง 2. การทดสอบความไร้เชื้อโดยวิธีกรอง 2.1 เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อในหลอดขนาด 100 มิลลิลิตร ปิดจุกสำลีแล้วนึ่งฆ่าเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที 2.2 นำผลิตภัณฑ์ที่ต้องการทดสอบกรองผ่านแผ่นกรอง (membrane filter) (ขนาด 0.45 µm เส้น ผ่านศูนย์กลาง 47 มิลลิเมตร) ด้วยความดัน 70 มิลลิเมตรปรอท โดยกระบอกฉีดยา (syringe) ต่อกับชุดกรอง (filter) โดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ และทำใน laminar air flow hood 2.3 นำแผ่นกรองออกมาจากเครื่องกรอง แล้วตัดแบ่งออกเป็นสองส่วน โดยใช้กรรไกรที่ปราศจาก เชื้อ ใส่แผ่นกรองนั้นลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ FTM และ SCD อย่างละส่วนเท่ากัน แล้วนำไปเพาะฟักที่ 30-35 องศาเซลเซียส และ 20-25 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เป็นระยะเวลาไม่น้อยกว่าเจ็ดวัน
128 3. การประเมินผล โดยผลิตภัณฑ์ที่นำมาทดสอบจะถือว่าผ่านการทดสอบเมื่อ 3.1 Positive control และ Bacteriostatic and Fungistatic test มีการเจริญเติบโตของเชื้อ ภายในเจ็ดวัน 3.2 Negative control กับการทดสอบตัวอย่าง test sample ไม่มีการเจริญเติบโตของเชื้อ ภายใน เจ็ดวันโดยเปรียบเทียบกับ positive control ถ้าตัวอย่างและ negative control มีเชื้อเจริญเติบโตถือว่าไม่ ผ่านการทดสอบและจะต้องทำซ้ำใหม่ทั้งหมด แต่ถ้าตัวอย่างมีเชื้อเจริญเติบโต แต่ negative control ไม่มีเชื้อ เจริญขึ้น จะต้องทำเพิ่มอีกโดยจำนวนตัวอย่างที่จะทดสอบเพิ่มขึ้นสองเท่า แล้วทำการทดสอบเหมือนเดิมทุก ประการ เมื่อตัวอย่างทั้งหมดที่ทดสอบใหม่ไม่มีเชื้อเจริญทั้งในตัวอย่าง และ negative control จึงจะถือว่า ผ่านการทดสอบ แต่ถ้าสามารถพิสูจน์ได้ว่าการที่มีเชื้อเจริญเนื่องจากการใช้เทคนิคผิดพลาดก็ทำซ้ำใหม่ได้
129 ตารางที่ 11.1 แสดงปริมาณและจำนวนตัวอย่างของยาฉีดที่ใช้ในการเตรียมเพื่อทดสอบความไร้เชื้อ Quantities for Liquid Articles Minimum Volume of Each Medium Container content (ml) Minimum volume taken from each container for each medium Used for direct transfer of volume taken from each container (ml) Used for total volume taken from all containers for membrane filtration (ml) No. of containers per medium Less than 10 1 ml, or entire content if less than 1 ml 15 100 20 10 to less than 50 5 ml 40 100 20 50 to less than 100 10 ml 80 100 20 100 up to 500 Entire contents - 100 10 Over 500 500 ml - 100 10
130 รายละเอียดในการปฏิบัติงานและเทคนิคต่าง ๆ 1. การเตรียมตู้ปลอดเชื้อ (รายละเอียดเหมือนในปฏิบัติการที่ 6 ) 2. ผู้ที่จะเป็นผู้ปฏิบัติงานจะต้องสวมหมวกคลุมผม, mask และถุงมือที่เช็ดฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70% 3. การทดสอบความไร้เชื้อโดยวิธีกรองยา (ทุกหัวข้อทำในตู้ปลอดเชื้อ) 3.1 Positive Control วัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ทดสอบ • FTM1 หลอด • SCD 1 หลอด • เชื้อ Bacillus subtilis • เชื้อ Candida albicans • Loop • ตะเกียงแอลกอฮอล์ วิธีทดสอบ 3.1.1 เผา loop ให้ร้อนแดงด้วยตะเกียงแอลกอฮอล์ แล้วทิ้งให้เย็น 3.1.2 นำ agar slant ของเชื้อ Bacillus subtilis มาเปิดจุกสำลีออก แล้วลนปลายหลอดบน เปลวไฟของตะเกียงแอลกอฮอล์ 3.1.3 นำ loop ที่เผาและเย็นแล้วมาขูดบริเวณที่มีเชื้อเล็กน้อย พอติดปลาย loop 3.1.4 ลนปลายหลอดของเชื้ออีกครั้งแล้วปิดจุก 3.1.5 นำหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ FTM มาเปิดจุกออก แล้วลนปลายหลอดบนเปลวไฟ จากนั้น จึงนำ loop ที่มีเชื้อ Bacillus subtilis มาจุ่มลงในอาหาร แกว่ง loop เล็กน้อย แล้วดึง loop ออกไป ลน ปลายหลอดอีกครั้งแล้วปิดจุก 3.1.6 เผา loop ให้ร้อนแดงอีกครั้ง 3.1.7 ทำซ้ำวิธีการข้อ 3.1.1-3.1.6 โดยใช้เชื้อ Candida albicans และ SCD แทน 3.2 Negative Control วัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ทดสอบ • FTM 1 หลอด • SCD 1 หลอด • ตะเกียงแอลกอฮอล์ วิธีทดสอบ 3.2.1 นำหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ FTM มาเปิดจุกออก ลนปลายหลอดบนเปลวไฟ แล้วจึงปิดจุก 3.2.2 นำหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ SCD มาทำวิธีการเดียวกับ FTM
131 3.3 Bacteriostatic and Fungistatic Testing วัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ทดสอบ • บีกเกอร์ขนาด 100 มิลลิลิตร 1 ใบ • FTM 1 หลอด • SCD 1 หลอด • เชื้อ Bacillus subtilis • เชื้อ Candida albicans • Loop • ตะเกียงแอลกอฮอล์ • ชุดกรองพร้อมกระบอกฉีดขนาด 10 มิลลิลิตร ที่ไร้เชื้อ • กรรไกรไร้เชื้อ • คีมคีบไร้เชื้อ • ผลิตภัณฑ์ยาหยอดตา 2 ขวด วิธีทดสอบ 3.3.1 นำหลอด FTM มาทำตามวิธีการทดลองในช่วงแรกเหมือนกับใน positive control ทุกอย่าง (ข้อ 3.1.1-3.1.6) 3.3.2 นำหลอด SCD มาทำตามวิธีการทดลองในช่วงแรกเหมือนกับใน positive control ทุกอย่าง (ข้อ 3.1.1-3.1.6) 3.3.3 ประกอบชุดกรองเข้ากับกระบอกฉีดยาโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ 3.3.4 ถอดก้านของกระบอกฉีดยาออก เทยาหยอดตาลงไป แล้วจึงสวมก้านของกระบอกฉีดยา เข้าไปใหม่ ฉีดน้ำยาให้ไหลผ่านแผ่นกรองลงบีกเกอร์ ขนาด 100 มิลลิลิตรที่เตรียมไว้ 3.3.5 ถอดชุดกรองออก แกะเอาแผ่นกรองออกมา ตัดเป็นสองส่วนเท่า ๆ กัน โดยใช้เทคนิค ปลอดเชื้อ 3.3.6 นำหลอด FTM ที่ผ่านการใส่เชื้อในช่วงแรกมาแล้ว เปิดจุก แล้วลนปลายหลอดบนเปลว ไฟ ใส่แผ่นกรองครึ่งหนึ่งลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยให้จุ่มลงในสารละลาย จากนั้นลนปลายหลอดแล้วปิดจุก 3.3.7 นำหลอด SCD มาทำเช่นเดียวกับ FTM โดยใส่แผ่นกรองครึ่งที่เหลือลงไป
132 3.4 Test Sample วัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ทดสอบ • FTM 1 หลอด • SCD 1 หลอด • ตะเกียงแอลกอฮอล์ • ชุดกรองพร้อมกระบอกฉีดยาขนาด 10 มิลลิลิตร ที่ไร้เชื้อ • กรรไกรไร้เชื้อ • คีมคีมไร้เชื้อ • ผลิตภัณฑ์ยาหยอดตา 2 ขวด การทดสอบ 3.4.1 ประกอบชุดกรองเข้ากับกระบอกฉีดยาโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ 3.4.2 ถอดก้านของกระบอกฉีดยาออก เทยาหยอดตาลงไป แล้วจึงสวมก้านของกระบอกฉีดยา เข้าไปใหม่ ฉีดน้ำยาให้ไหลผ่านแผ่นกรองลงบีกเกอร์ ขนาด 100 มิลลิลิตรที่เตรียมไว้ 3.4.3 ถอดชุดกรองออก แกะเอาแผ่นกรองออกมา ตัดเป็นสองส่วนเท่า ๆ กัน โดยใช้เทคนิค ปลอดเชื้อ 3.4.4 นำหลอด FTM เปิดจุก แล้วลนปลายหลอดบนเปลวไฟ ใส่แผ่นกรองครึ่งหนึ่งลงใน อาหารเลี้ยงเชื้อ โดยให้จุ่มลงในสารละลาย จากนั้นลนปลายหลอดแล้วปิดจุก 3.4.5 นำหลอด SCD มาทำเช่นเดียวกับ FTM โดยใส่แผ่นกรองครึ่งที่เหลือลงไป 3.5 การประเมินผล 3.5.1 นำ FTM ทั้ง 4 หลอด ไปเพาะฟักในตู้อบที่อุณหภูมิ 30-35 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน 3.5.2 นำ SCD ทั้ง 4 หลอด ไปเพาะฟักในตู้อบที่อุณหภูมิ 20-25 เซลเซียส นาน 7 วัน 3.6 การประเมินผลการทดสอบ ภายหลังการเพาะฟักอาหารเลี้ยงเชื้อทั้ง FTM และ SCD ครบ 7 วัน แล้ว ผลิตภัณฑ์ที่นำมาทดสอบจะผ่านก็ต่อเมื่อ 3.6.1 Positive control และ bacteriostatic and fungistatic test มีการเจริญของเชื้อ 3.6.2 Negative control และ test sample ไม่มีการเจริญของเชื้อเลย ถ้า test sample และ negative control มีเชื้อเจริญเติบโตถือว่าเทคนิคไม่ดีจะต้องทำการทดสอบซ้ำใหม่ แต่ถ้า test sample มีเชื้อเจริญ แต่ negative control ไม่มีเชื้อเจริญ จะต้องทำทดสอบอีก โดยเพิ่มจำนวนตัวอย่างที่จะทดสอบ ขึ้น 2 เท่า แล้วทำการทดสอบเหมือนเดิมทุกอย่าง โดยจะต้องไม่มีเชื้อเจริญทั้งใน test sample และ negative control จึงจะถือว่าผ่านการทดสอบ
133 สรุปผลการทดลองและการถกแถลง อาจารย์ผู้รับผิดชอบ จะเป็นผู้สรุปผลการทดลองและถกแถลงกับนักศึกษา ในเรื่องต่าง ๆ ดังนี้ 1. การทดสอบความไร้เชื้อโดยวิธีกรอง 1.1 ทำไมต้องทดสอบ 1.2 ใช้ทดสอบผลิตภัณฑ์ทุกชนิดหรือไม่ 1.3 วิธีนี้ดีกว่าวิธีอื่นอย่างไร 1.4 มีข้อจำกัดในการทดสอบอย่างไรบ้าง 1.5 ลักษณะคุณสมบัติของอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ 2. สรุปขั้นตอนในการทดสอบความไร้เชื้อ 3. สรุปเทคนิคที่ใช้ในการทดสอบ 4. การประเมินผลความไร้เชื้อของผลิตภัณฑ์ที่ถูกต้อง การประเมินผล 1. นักศึกษาสามารถอธิบายขั้นตอนในการทดสอบความไร้เชื้อ โดยวิธีกรองได้ 2. นักศึกษาสามารถใช้เทคนิคปลอดเชื้อในการทดสอบความไร้เชื้อได้อย่างถูกต้อง 3. นักศึกษาสามารถประเมินผลการทดสอบความไร้เชื้อ ได้อย่างถูกต้อง 4. นักศึกษาสามารถหาความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการทดสอบความไร้เชื้อโดยวิธีกรองได้ คำถามท้ายบท 1. ตำรับยาปราศจากเชื้อทุกตำรับต้องทำการทดสอบความไร้เชื้อหรือไม่ เพราะเหตุใด 2. การทดสอบความไร้เชื้อทำได้กี่วิธี 3. ปัจจัยที่มีผลต่อการทดสอบความไร้เชื้อมีอะไรบ้าง 4 FTM เป็นอาหารเลี้ยงจุลินทรีย์ประเภทใดได้บ้าง 5 SCD เป็นอาหารเลี้ยงจุลินทรีย์ประเภทใดได้บ้าง 5. การทำ positive control มีจุดประสงค์อะไร 6. ถ้าปรากฏว่าผลของ bacteriostatic และ fungistatic test ไม่มีการเจริญของเชื้อเลยสามารถตีความได้ว่า อย่างไร และจะมีวิธีแก้ไขอย่างไร
134 รายงานปฏิบัติการเภสัชภัณฑ์ 4 การทดสอบความไร้เชื้อของตำรับยาไร้เชื้อโดยวิธีกรอง โดย กลุ่มที่ ตอนที่ รายชื่อผู้ร่วมงาน ตำแหน่ง 1 2 3 4 5 6 GM PM CM W W W
135 เภสัชภัณฑ์ 4 ตารางบันทึกข้อมูลการทดสอบความไร้เชื้อ ชื่อผลิตภัณฑ์ที่นำมาทดสอบ : Atropine sulfate 0.5% Eye Drops เลขที่ผลิต : เลขที่ทดสอบ : วันที่ทำการทดสอบ : อาหาร ผลการทดสอบภายหลังการฟัก 7 วัน เลี้ยงเชื้อ + ve Control - ve Control Bact. + Fungi. Test Test Sample FTM SCD การประเมินผล [ ] ผ่าน [ ] ไม่ผ่าน
136 วิจารณ์ผลการทดลอง สรุปผลการทดลอง เอกสารอ้างอิง
137 ปฏิบัติการที่ 11 การตรวจสอบ Bacterial Endotoxin โดยวิธี Limulus Amebocyte Lysate (LAL) แบบ Gel-Clot รองศาสตราจารย์ ดร.ภก.ภูริวัฒน์ ลี้สวัสดิ์ วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาขั้นตอนในการตรวจสอบ bacterial endotoxin โดยวิธี LAL แบบ gel-clot 2. เพื่อฝึกทักษะในการเตรียมการตรวจสอบ bacterial endotoxin โดยวิธี LAL แบบ gel-clot 3. เพื่อฝึกทักษะในการประเมินผลการตรวจสอบ bacterial endotoxin โดยวิธี LAL แบบ gel-clot บทนำ สารก่อไข้เป็นตัวชักนำให้เกิดไข้ อาจมาจากภายในและภายนอกร่างกาย ทำให้ร่างกายเกิดการหลั่งสาร กระตุ้นให้เกิดการส่งสัญญาณไปที่สมองส่วน hypothalamus ซึ่งควบคุมอุณหภูมิ ส่งผลให้อุณหภูมิร่างกาย สูงขึ้น เนื่องจากคุณสมบัติของสารก่อไข้ที่ละลายน้ำได้ดีและเกาะติดกับพื้นผิว โดยเฉพาะพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic surface) เช่น แก้ว ดังนั้น จึงต้องมีการกำจัดสารก่อไข้ โดยการกำจัดสารก่อไข้ออกจากน้ำ จะใช้วิธี การกลั่น (เป็นวิธีเก่าแก่และใช้ในการผลิตน้ำปราศจากสารก่อไข้ในปริมาณมาก) การกรองแบบ ultrafiltration (สามารถกรองอนุภาคขนาดต่ำกว่า 100 kD ได้) การทำ reverse osmosis (ใช้ในการกำจัด อนุภาคที่มีขนาดต่ำกว่า 1 นาโนเมตร) และการใช้สารดูดซับต่าง ๆ เช่น activated charcoal และ asbestos fiber เป็นต้น ส่วนการกำจัดสารก่อไข้ออกจากพื้นผิวนั้น ทำได้โดยการล้างด้วยน้ำที่ปราศจากสาร ก่อไข้ (apyrogenic water) หรือการใช้สารเคมีพวก oxidizing agent เช่น permanganate หรือ peroxide หรือใช้ความร้อนแห้งที่อุณหภูมิ 250 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ไม่นิยมใช้ความร้อนชื้นในการทำลาย สารก่อไข้เนื่องจากใช้ความดันสูงและใช้เวลานาน Limulus Amebocyte Lysate (LAL) เปนวิธีการทดสอบหาปริมาณ endotoxin เฉพาะที่เกิดจาก แบคทีเรียแกรมลบโดยใชสารสกัดจากเลือดแมงดาทะเล เรียกวา Limulus Amebocyte โดยในปี 1956 Dr. Frederic Bang พบการตายของแมงดาทะเล (horseshoe crab; Limulus polyphemus) โดยเลือดของ มันจับตัวเปนกอนแข็ง เมื่อนำไปเพาะเชื้อพบเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ เชน E. coli และ Pseudomonas sp. ตอมาจึงพบวาปฏิกิริยาของเลือดแมงดาทะเลเกิดจาก endotoxin จากแบคทีเรียแกรมลบกับ amebocyte lysate ของแมงดาทะเลจึงไดทำการสกัดสารจาก amebocyte cell นำไปเตรียมเปน reagent เรียก Limulus Amebocyte Lysate (LAL) โดย Gel-clot techniques เปนการทดสอบแบบ qualitative อาศัยหลักการ ที่วา LAL จะเกิดการแข็งตัวเมื่อมี gram negative endotoxin โดย gram negative endotoxin จะกระตุน
138 proenzyme ใน LAL ใหเปน activated enzyme เรียกวา coagulase ซึ่งจะเปลี่ยนสาร coagulogen ใน LAL ใหเปนสาร coagulin เกิดการแข็งตัวเปนเจล ซึ่งผูทดสอบตองสังเกตการเกิดเจลดวยตา LAL มีข้อดีกว่าการใช้กระต่ายทดสอบสารก่อไข้ คือเป็นการทดสอบในหลอดทดลอง (in vitro test) มี ความไว (sensitivity) มากกว่าโดย สามารถตรวจสอบ endotoxin ต่ำสุดได้ 0.01–0.14 ng/ml นอกจากนี้ ยังมีค่าใช้จ่ายถูกกว่า ใช้พื้นที่วัสดุ อุปกรณ์และบุคลากรในการทดสอบน้อยกว่า และรวดเร็วกว่าการใช้กระต่าย ในการทดสอบสารก่อไข้ ซึ่งต้องมีการนำสัตว์ทดลองมาใช้และมีปัจจัยที่มีผลในการทดสอบ เช่น ฤดูกาล วัน เวลา ความเครียด การให้อาหาร และอุณหภูมิ เป็นต้น แต่ข้อเสียของ LAL คือจะตอบสนองเฉพาะ gram negative endotoxin เท่านั้น และเพื่อให้การประเมินผลการทดสอบเป็นไปอย่างถูกต้องและมีมาตรฐาน จะต้องมีการเตรียมการในการทดสอบ ดังนี้ 1. Lysate Sensitivity Test เป็นการทดสอบเพื่อยืนยัน sensitivity ของ LAL reagent 2. Preliminary Test เป็นการทดสอบเบื้องต้น เพื่อหา dilution ของยาที่ไม่มีผลยับยั้งหรือส่งเสริม ปฏิกิริยา 3. Inhibition/Enhancement Test เป็นการทดสอบเพื่อยืนยัน dilution ของยาที่เลือกมาจาก Preliminary test ว่าไม่มีฤทธิ์ส่งเสริมหรือยับยั้งจริง 4. Routine Test เป็นการตรวจสอบปริมาณ endotoxin ในตัวอย่างว่าอยู่ในระดับที่ไม่เกิน Endotoxin Release Limit (ERL) ภายใต้สภาวะที่ทดสอบแล้วว่าไม่มี Inhibition/ Enhancement อุปกรณ์และสารเคมีที่ใช้ 1. น้ำยาที่ใช้สำหรับการตรวจสอบปริมาณ Endotoxin โดยวิธี Gel-Clot ประกอบด้วย 1.1 Pyrotell (น้ำยา LAL สำหรับวิธี Gel-Clot) Lot no……………….. 1.2 Control Standard Endotoxin (CSE) Potency ………………. EU/ml 2. น้ำกลั่นที่ปราศจากไพโรเจน (LAL Reagent Water) 3. Reaction tube ขนาด 10×75 มิลลิเมตร (sodalime glass) 4. Dilution tube ขนาด 13×100 มิลลิเมตร (borosilicate glass) 5. Rack สำหรับใส่ Test tube 6. Autopipette ขนาด 10-100 ไมโครลิตร และ 100-1000 ไมโครลิตร 7. Pipette tip ขนาด 250 และ 1000 ไมโครลิตร 8. Vortex Mixer 9. Timer 10. Aluminum foil หรือ paraffin film สำหรับปิดปาก Test tubes 11. Water bath อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 12. Hot Air Oven 13. Autoclave
139 หมายเหตุ 1. เครื่องแก้วทุกชิ้นที่ใช้จะต้องทำให้ปราศจากไพโรเจนโดยการอบใน Hot Air Oven ที่อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส นาน 4 ชั่วโมง หรือที่อุณหภูมิ 200 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง หรือที่อุณหภูมิ 250 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที 2. Pipette tip ต้องทำให้ไร้เชื้อ โดยการนึ่งใน Autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที หรือ ที่อุณหภูมิ 134 องศาเซลเซียส เป็นเวลานาน 5 นาที วิธีการทดสอบ 1. การเตรียม Control Standard Endotoxin (CSE) ความเข้มข้น 10 EU/ml จาก stock ความ เข้มข้น 1000 EU/ml 1.1 Pipette CSE ความเข้มข้น 1000 EU/ml มา 20 ไมโครลิตร ใส่ใน dilution tube 1.2 เติม LAL Reagent Water (LRW) ลงไปอีก 1,980 ไมโครลิตร 1.3 ปิดปากหลอดด้วย paraffin film 1.4 นำไปเขย่าโดยใช้เครื่อง Vortex Mixer ความถี่สูงสุด นานประมาณ 1 นาที 2. การเตรียม Negative Control (NC) 2.1 Pipette LRW มา 100 ไมโครลิตร ใส่ Reaction tube ปิดทับด้วย paraffin film 2.2 ทำซ้ำข้อ 2.1 เพื่อให้ได้ NC จำนวน 2 หลอด 3. การเตรียม Positive Control (PC) 2 3.1 Pipette CSE ความเข้มข้น 10 EU/ml จากข้อ 1 มา 500 ไมโครลิตร ใส่ใน Dilution tube 3.2 เติม LRW จำนวน 1,500. ไมโครลิตร 3.3 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 3.4 นำไปเขย่าใน Vortex Mixer นาน 1 นาที 3.5 Pipette น้ำยาจากข้อ 3.4 มา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน Dilution tube 3.6 เติม LAW จำนวน 900 ไมโครลิตร 3.7 ปิดปากหลอดด้วย paraffin film 3.8 นำไปเขย่าใน Vortex Mixer นาน 1 นาที 3.9 Pipette น้ำยาจากข้อ 3.8 มา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน Reaction tube 3.10 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 3.11 ทำซ้ำข้อ 3.9 เพื่อให้ได้ PC 2 หลอด 4. การเตรียม 5% Dextrose in NSS Dilution 1:8 4.1 Pipette LRW มา 3,500 ไมโครลิตร ใส่ใน Dilution tube 4.2 เติม 5 % Dextrose in NSS ปริมาตร 500 ไมโครลิตร 4.3 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film
140 4.4 นำไปเขย่าในเครื่อง Vortex Mixer ความถี่สูงสุด นาน 1 นาที 4.5 Pipette น้ำยาจากข้อ 4.4 มา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน Reaction tube 4.6 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 4.7 ทำซ้ำข้อ 4.4 เพื่อให้ได้ 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 จำนวน 2 หลอด 5. การเตรียม Positive Product Control (PPC) 5.1 Pipette CSE ความเข้มข้น 10 EU/ml จากข้อ 1 มา 500 ไมโครลิตร ใส่ Dilution tube 5.2 เติม 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 จากข้อ 4 ปริมาตร 1,500 ไมโครลิตร 5.3 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 5.4 นำไปเขย่าในเครื่อง Vortex Mixer นาน 1 นาที 5.5 Pipette น้ำยาจากข้อ 5.4 มา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน Dilution tube 5.6 เติม 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 จากข้อ 4 ปริมาตร 900 ไมโครลิตร 5.7 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 5.8 นำไปเขย่าในเครื่อง Vortex Mixer นาน 1 นาที 5.9 Pipette น้ำยาจากข้อ 5.8 มา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน Reaction tube 5.10ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 5.11ทำซ้ำ เพื่อให้ได้ PPC จำนวน 2 หลอด 6. การเตรียมสารละลาย LAL 6.1 เคาะหลอด vial ของ Pyrotell เบา ๆ เพื่อให้ผงของ LAL ตกลงมารวมกันที่ก้นหลอด 6.2 แกะฝาครอบอะลูมิเนียมออก แล้วค่อย ๆ เปิดฝาจุกยางออก 6.3 เติม LRW ตามปริมาตรที่ระบุที่ข้างหลอด Pyrotell 6.4 ปิดทับปากหลอดด้วย paraffin film 6.5 เขย่าหลอดเบา ๆ เพื่อให้ Lyophilized LAL ละลาย ถ้าเขย่าแรงจะทำให้เกิดฟอง 6.6 ก่อนใช้ควรเขย่าอีกครั้งเพื่อให้น้ำยามีความเป็นเนื้อเดียวกัน 7. การทำ Routine Test 7.1 การเตรียม Negative Control 7.1.1 นำ Negative Control (NC) จากข้อ 2 จำนวน 2 หลอด ซึ่งแต่ละหลอดมี LRW อยู่ 100 ไมโครลิตร 7.1.2 Pipette สารละลาย LAL จากข้อ 6 มา 100 ไมโครลิตร เติมลงในแต่ละหลอด จนครบ 2 หลอด 7.2 การเตรียม Positive Control 7.2.1 นำ Positive Control (PC) จากข้อ 3 จำนวน 2 หลอด ซึ่งแต่ละหลอดมี CSE 2 ใน LRW 100 ไมโครลิตร
141 7.2.2 Pipette สารละลาย LAL จากข้อ 6 มา 100 ไมโครลิตร เติมลงในแต่ละหลอด จนครบ 2 หลอด 7.3 การเตรียม Sample 7.3.1 นำ 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 จากข้อ 4จำนวน 2 หลอด ซึ่งแต่ละหลอดมี 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 อยู่ 100 ไมโครลิตร 7.3.2 Pipette สารละลาย LAL จากข้อ 6 มา 100 ไมโครลิตร เติมลงในแต่ละหลอด จนครบ 2 หลอด 7.4 การเตรียม Positive Product Control 7.4.1 นำ Positive Product Control จากข้อ 5 จำนวน 2 หลอด ซึ่งแต่ละหลอดมี CSE 2 ใน 5 % Dextrose in NSS Dilution 1:8 100 ไมโครลิตร 7.4.2 Pipette สารละลาย LAL จากข้อ 6 มา 100 ไมโครลิตร เติมลงในแต่ละหลอด จนครบ 2 หลอด 7.5 การ Incubate 7.5.1 นำ Reaction tube จากข้อ 7.1, 7.2, 7.3 และ 7.4 แต่ละหลอดมาเขย่าในเครื่อง Vortex Mixer นาน หลอดละ 1 นาที 7.5.2 นำหลอดทดสอบทั้ง 8 หลอดไป incubate ใน water bath ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 60 นาที โดยไม่ให้มีการกระเทือนของหลอด 7.6 การประเมินผลการทดสอบ 7.6.1 เมื่อครบเวลา 60 นาที ก็นำหลอดทดลองแต่ละหลอดมาค่อย ๆ กลับหลอด จนก้นหลอด อยู่ด้านบน ขณะเดียวกันก็สังเกตเจลที่เกิดขึ้นที่ก้นหลอดว่าแข็งตัวจับติดกับก้นหลอด (positive) หรือเหลว (negative) 7.6.2 บันทึกผลการเกิดเจลของแต่ละหลอดลงตารางที่ให้มา Replicate Positive Control (PC) Positive Product Control (PPC) Sample (SPL) Negative Control (NC) 1 2 หมายเหตุ : - ผลของหลอด NC ต้องเป็น Negative ทุกครั้ง - ส่วนผลของหลอด PPC และ PC ต้องเป็น Positive ทุกครั้ง 7.6.3 ถ้าผลการอ่าน sample ได้ผลเป็น negative แสดงว่า ตัวอย่างมี endotoxin น้อยกว่า Endotoxin Realease Limit (ERL) จึงผ่านการทดสอบ