วิจัยการเหลือรอดของ Lactobacillus sp. ในอาหารเสริมผึ้ง

วิจยั ทางวิทยาศาสตร์
การเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผง้ึ

ทเ่ี ก็บในอณุ หภมู ิปกติกบั แชเ่ ยน็

ศยามล ดวี ลิ ัย
สุมาลี นักสอน
พัชราภา เหลนเพ็ชร

วิจัยนเ้ี ป็นสว่ นหนง่ึ ของรายวชิ าวิธวี จิ ัยวิทยาศาสตร์ 1005427
สาขาวิชาวิทยาศาสตร์ คณะครุศาสตร์

มหาวทิ ยาลยั ราชภฏั บา้ นสมเดจ็ เจ้าพระยา ปกี ารศึกษา 2563

1

บทท่ี 1
บทนำ

1.1 ควำมเป็นมำและควำมสำคัญของปัญหำ

การเล้ียงผึ้งเป็นอาชีพทางเกษตรกรที่สาคัญประเทศไทยอาชีพหนึ่ง ซึ่งในประเทศไทยน้ันมีการเล้ียงผึ้งและใช้
ประโยชน์จากผ้ึงมาอย่างช้านาน อีกทั้งการเลี้ยงผ้ึงยังเป็นอาชีพหนึ่งซ่ึงนารายได้มายังเกษตรกร ในการเล้ียงผึ้งนั้นผู้เล้ียง
จะต้องทาความเข้าใจชีวิตในสังคมผึ้งและพฤติกรรมของผึ้ง เพ่ือจัดการรังผึ้งให้เป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพ ผ้ึงมีสุขภาพท่ีดี
แข็งแรง มีประชากรผึ้งงานหนาแน่นรวมท้ังมีปริมาณอาหารท่ีเหมาะสม โดยผู้เล้ียงผึ้งควรมีการตรวจฟาร์มผึ้งอย่างน้อย
สัปดาห์ละ 1 ครั้ง เพ่ือดูสภาพตา่ ง ๆ ภายในรัง (ภาณุวรรณ จนั ทวรรณกูร, 2561)

สิ่งที่สาคัญต่อการวิถีการดารงชีวิตของผึ้งคือพืชอาหาร ได้แก่น้าหวานจากดอกไม้จัดเป็นอาหารประเภท
คาร์โบไฮเดรตให้พลังงานแก่ผ้ึง และเกสรดอกไม้จัดเป็นอาหารประเภทโปรตีนช่วยให้ผึ้งเจริญเติบโต ซึ่งในช่วงเวลาท่ีไม่มี
อาหารในธรรมชาติเพียงพอต่อความต้องการ ทาให้ผ้ึงขาดเเคลนแหล่งอาหารที่สาคัญ ซ่ึงจะส่งผลทาให้ผึ้งอ่อนแอเเละมี
จานวนประชากรลดลง ผู้เล้ียงผ้ึงจึงต้องมีการทาอาหารเสริมผ้ึงมาเพื่อให้ผึ้งได้รับสารอาหารท่ีเพียงพอ โดยอาหารเสริมผ้ึง
ทว่ั ไปจะประกอบไปด้วยแปง้ ถ่วั เหลือง เกสรอบแหง้ และน้าผึ้ง

นอกจากน้ียังมีการศึกษาพบว่าโพรไบโอติก เปน็ จุลนิ ทรยี ท์ ี่ก่อใหเ้ กิดประโยชน์กับระบบทางเดนิ อาหารของผง้ึ และ
ได้คิดสูตรอาหารเสริมโปรตีนสาหรับเลี้ยงผึ้ง ประกอบด้วยเกสรกับแป้งถ่ัวเหลือง จัดเป็นแหล่งโปรตีนท่ีสาคัญสาหรับผ้ึง,
น้าตาล แหลง่ พลังงาน หรือแหล่งของคารโ์ บไฮเดรท, ผงยสี ต,์ น้า, โพรไบโอติก ( ชยั ณรงค์ สินภู่, 2555 ) ดงั นั้นคณะผ้วู ิจัยจึง
ศึกษาการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสรมิ ผึ้ง ว่าอายกุ ารเหลือรอดของ lactobacillus casei อยูใ่ นอาหาร
เสรมิ ผงึ้ เป็นระยะเวลาเท่าใด ซึง่ ทางคณะผวู้ ิจัยไดท้ าการศกึ ษาอยู่ที่ระยะเวลาประมาณ 28 วนั

คำสำคญั : การเหลือรอด, lactobacillus casei, อาหารเสริมผ้ึง

1.2 วัตถุประสงค์

1.2.1. เพือ่ ศึกษาการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสรมิ ผ้ึง
1.2.2. เพื่อเปรียบเทียบการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้ึงท่ีเก็บในอุณหภูมิปกติ
กบั แช่เย็น

2

1.3 ประโยชนท์ ี่คำดวำ่ จะได้รับ

ทราบอัตราการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้ึงทเ่ี ก็บในอุณหภูมิปกติกับแช่เย็นทา
ใหเ้ กษตรกรผ้เู ลีย้ งผ้งึ ทราบระยะทีอ่ าหารเสรมิ ผงึ้ ยงั มเี ชอ้ื lactobacillus casei อยู่

1.4 ขอบเขตของกำรวจิ ยั

การศึกษาครั้งน้ีมุ่งศึกษาเฉพาะการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้ึงที่ผสมเช้ือ
lactobacillus casei ทเ่ี กบ็ ในอุณหภูมิปกตกิ ับแช่เยน็

1.5 ตวั แปรทใี่ ช้ในงำนวิจัย

- ตวั แปรต้น อาหารเสรมิ ผึ้งที่ผสมเช้ือ lactobacillus casei ทเ่ี กบ็ ในอุณหภมู ิปกตกิ บั แช่เย็น
- ตวั แปรตำม อัตราการอยรู่ อดของเชอื้ lactobacillus casei
- ตัวแปรควบคุม ปรมิ าณอาหารเสริมผึง้ , ปรมิ าณเชอื้ lactobacillus casei เรมิ่ ตน้

1.6 นยิ ำมศพั ท์เฉพำะ

Lactobacillus casei คอื เปน็ แบคทเี รียแลคติก ตวั อยา่ งเชน่ ผลิตภณั ฑน์ มเปรย้ี ว โยเกริ ต์
อำหำรเสริมผึ้ง คือ อาหารท่ีผ้ึงบริโภคเข้าไปแล้วให้ประโยชน์ต่อสุขภาพนอกเหนือจากคุณค่าทาง
โภชนาการพ้ืนฐาน ไดแ้ ก่ น้าหวานและเกสรจากดอกไม้ เป็นต้น
กำรเหลือรอด คือ จุลนิ ทรีย์ทรี่ อดชีวติ จากปรมิ าณเช้ือเรมิ่ ตน้ ทใี่ ส่

1.7 กรอบแนวคิด

อำหำรเสริมผงึ้ ผสม กำรวัดอตั รำกำรเหลือรอด อัตรำกำรเหลือรอด
lactobacillus casei ทีเ่ กบ็ ของ lactobacillus casei ของ lactobacillus casei
ในอณุ หภูมปิ กตกิ บั แชเ่ ย็น

3

บทท่ี 2
เอกสำรและงำนวจิ ยั ที่เกย่ี วขอ้ ง

การศึกษาเร่ือง การเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผึ้ง โดยผู้วิจัยได้ทาการศึกษา
เอกสาร และงานวจิ ยั ทเ่ี กยี่ วขอ้ งเพือ่ ใชเ้ ปน็ แนวทางในการทาวจิ ยั ดงั นี้

2.1 เช้ือ lactobacillus casei
2.2 อาหารเสริมผึง้
2.3 งานวิจัยที่เก่ยี วขอ้ ง

2.1 เชื้อ lactobacillus casei

เป็นแบคทีเรียแกรมบวก (gram positive bacteria) รูปร่างเป็นท่อนเด่ียวหรือ ต่อกันเป็นสายส้ันไม่
สรา้ งสปอร์เจริญได้ทงั้ ในสภาวะที่มีออกซิเจนและไม่มีออกซเิ จน (facultative anaerobe) ไมเ่ คลือ่ นท่ีชอบเจริญ
ท่ีอุณหภมู ปิ านกลาง แตบ่ างชนดิ ชอบเจรญิ ที่อณุ หภมู ติ ่าจัดอยใู่ นกล่มุ lactic acid bacteria ทส่ี ามารถหมกั น้าตาล
กลูโคส (glucose) น้าตาลแล็กโทส (lactose) ให้เกิดกรดแล็กทิก (lactic acid fermentation) มักพบร่วมกับ
Leuconostoc.

2.1.1 บทบาทของ Lactobacillus ในอาหาร มบี ทบาทสาคญั คอื

1) เพ่ือถนอมอาหาร (food preservation) ด้วยการหมัก (fermentation) ใช้เพื่อการผลิต
อาหารหมักหลายประเภท ได้แก่

- ผลิตภัณฑอ์ าหารหมักจากนา้ นม เชน่ โยเกิร์ต (yogurt) น้านมเปรย้ี ว (fermented milk)
- ผลติ ภัณฑ์หมกั จากเนอ้ื สัตว์ เชน่ แหนม ไส้กรอกอสี าน ซาลามี (salami)
- ผลิตภัณฑห์ มักจากผักผลไม้ เช่น ผักดอง ผลไมด้ อง กิมจิ (kimchi) แตงดอง (pickle)
ซาวเคราท์ (Sauerkraut)

2) เปน็ สาเหตทุ าใหอ้ าหารเสื่อมเสีย (microbial spoilage) ของอาหารหลายชนิด เชน่ อาหารก่ึง
แห้ง การเสื่อมเสียของน้านมการเส่ือมเสียของเน้ือสัตว์ โดยทาให้เกิดรสเปรี้ยว และเกิดเมือกในน้านม
เนือ้ สตั ว์ และผลิตภัณฑ์จากเน้อื สัตว์ เช่น ไส้กรอกแฮม และเบคอน

4

2.1.2 สายพันธ์ุของ Lactobacillus ทีใ่ ชใ้ นอตุ สาหกรรมอาหาร
- Lactobacillus bulgaricus ใช้ในการหมักโยเกิร์ต เจริญได้ดีที่อุณหภูมิ 40-45 องศาเซลเซียส

ผลิตแอซีทาลดีไฮด์(acetyldehyde) ซึ่งเป็นสารให้กล่ินรสของน้านมหมัก และสร้างเอนไซม์โปรติเอส
(protease) ซึ่งจะย่อยโปรตีน(protein) ในน้านมให้ได้กรดแอมิโน (amino acid) โดยเฉพาะฮิสทิดีน
(histidine) ซึ่งเป็นกรดแอมิโนท่ีกระตุ้นการเจริญของ Streptococcus thermophilus (พิมพ์เพ็ญ พร
เฉลิมพงศ,์ ม.ป.ป)

- Lactobacillus casei ใชใ้ นการผลติ ยาคูลท์
- Lactobacillus acidophilus
- Lactobacillus plantarum
- Lactobacillus brevis

2.2 อำหำรเสริมผ้งึ

2.2.1 ความหมายของอาหารเสริมผึ้ง
อาหารเสริมผ้ึง หมายถึง อาหารที่ให้แก่ผึ้งในยามขาดแคลน ที่ไม่ใช่อาหารจากธรรมชาติของผึ้ง (น้าผ้ึง

และเกสรดอกไม้) ซึ่งไมก่ ่อใหเ้ กิดอนั ตรายต่อผู้บรโิ ภค ไดแ้ ก่ อาหารเสริมคาร์โบไฮเดรต เช่น นา้ เชือ่ ม น้าตาลทราย
และอาหารเสรมิ โปรตีน เช่น แปง้ ถ่วั เหลือง

2.2.2 วิธกี ารทาอาหารสารองไวเ้ ล้ยี งผึง้ ในฤดกู ารขาดแคลนดอกไม้
ทาได้จากการนาน้าตาลทรายมาเคี้ยวไฟอ่อนๆ เพ่ือใหน้ ้าตาลทรายละลาย หรอื จะใส่น้าเพยี งเล็กน่อย

เพอื่ ไม่ใหน้ า้ ตาลทรายไหม้ เมือ่ นา้ ตาลทรายเริม่ ละลายหมดแล้วจึงพกั ให้เยน็ กอ่ นทจี่ ะนาไปใส่ภาชนะให้ผ้ึงกิน
น้าเช่ือมที่ใช้ในการเลี้ยงผึ้งน้ัน ใช้น้าเชื่อมของน้าตาลทรายขาวจะดีกว่าน้าตาลทรายแดง ถึงแม้ว่า

น้าเช่ือมของน้าตาลทรายแดงจะมีราคาถูกกว่าน้าตาลทรายขาวมาก แต่จะบูดเสียได้ง่าย และทาให้คอมป์มีสีคล้า
ถ้าพบว่าตรงด้านบนของคอนหลอดรังผึ้งแห้งไม่มีน้าผึง้ เหลืออยู่เลยควรรบี ให้น้าเชื่อมกับผ้ึงและโดยเฉพาะคอนรมิ
สุดถ้าไม่มีน้าหวานเลย ผึ้งจะอารมณ์เสีย อย่าให้กรณีเช่นน้ีเกิดข้ึน เพราะจะทาให้ผ้ึงรังนี้อดอาหารตาย ทาให้ผึ้ง
โทรมลงอย่างรวดเร็ว ชว่ งทผ่ี ง้ึ จะขาดนา้ หวานจากดอกไมโ้ ดยธรรมชาติ จะอยู่ระหวา่ งเดอื นมิถุนายน-ตุลาคม

1) ช่วงเวลาทจี่ ะให้นา้ ตาล ถ้าผึง้ ทที่ ่านเลี้ยงอยู่มคี วามแข็งแรงเทา่ ๆ กัน หมด จะใหน้ ้าเชือ่ มเวลาไหนก็ได้
ตั้งแตเ่ ชา้ จรดเย็น ถ้าเลือกเวลาได้ควรจะเลอื กให้ตอนเยน็ ๆ จะดีทส่ี ดุ เพราะจะชว่ ยลดปัญหาการขโมยน้าผ้งึ

2) วธิ ีการให้น้าตาล
(1) การใหน้ า้ ตาลในรูปน้าตาลป่นละเอยี ด น้าตาลทรายท่ีจะให้ต้องปน่ ให้เป็นผงละเอียด เรยี กว่า

ไอซ่งิ ซูการ์ ละเอียดไมเ่ ปน็ ที่นิยมกัน หาน้าตาลชนดิ น้ียากและไมม่ ีอปุ กรณท์ ี่จะป่นนา้ ตาลจนละเอยี ดได้
(2) การใหน้ า้ ตาลทรายแกผ่ ้งึ ในรูปน้าเช่อื ม สามารถจะใหใ้ นรูปน้ีได้ สะดวกเพยี งแต่เอานา้ ตาลทราย

5

มาละลายน้าที่สะอาด หรือน้าต้ม ในอัตราส่วนต่าง ๆ ตามต้องการ โดยท่ัว ๆ ไปแล้ว อัตราปกติท่ีใช้กันได้แก่
อัตราส่วน 1 ต่อ 1 โดยใช้น้าตาลทราย 1 กิโลกรัมต่อน้า 3 ลิตร และถ้าต้องการอัตราส่วนท่ีเจือจางลง ในช่วงท่ี
อากาศร้อนและแห้งแล้ง ควรจะใช้อัตราส่วน 4 ต่อ 6 หรือ 2 ต่อ 3 คืออัตราส่วนของน้าตาลทราย 2 กิโลกรัมต่อ
น้า 3 ลิตร

3) รูปแบบของวธิ กี ารใหน้ า้ เช่ือม
(1) ให้น้าเช่ือมในกล่องไม้ภายในรังผึ้ง วิธีน้านิยมใช้กันมาก โดยทากล่องไม้อัดสี่เหลี่ยม มีบ่ายาวเท่า

ความยาวของคอน เวลาวางตามแนวคอนแลว้ การใส่น้าเชอื่ มในกล่องชนิดน้ีควรใหป้ ริมาณพอดี ๆ กับปรมิ าณผึ้งท่ี
จะใช้หมดภายใน 2-3 วัน ถา้ มากกว่านั้นนา้ เช่ือมจะบูด นอกจากนคี้ วรหาวัสดทุ ี่ลอยได้ใสล่ งไปให้ผ้งึ เกาะ

ภาพที่ 2.1 คอนบนเปน็ คอนแผ่นรังเทียม สว่ นคอนลา่ งเป็นคอนทผ่ี ง้ึ สรา้ งเปน็ หลอดรวงแล้วเรียกว่าคอมป์

ภาพท่ี 2.2 ลักษณะการจดั เรียงคอน แบบ 5 คอน กับการจัดเรียงคอนแบบ 10 คอน

(2) การให้น้าเช่ือมโดยบรรจุลงในภาชนะชนิดต่าง ๆ กระป๋องขนาด บรรจุ 1-2 ลิตร ใช้ตะปูเล็ก ๆ
เจาะรทู ่ฝี าปิด 3-4 รู เวลาคว่ากระปอ๋ งลงน้าเช่อื มจะซมึ ออกมาเปน็ หยด ๆ

(3) การให้น้าเช่ือมโดยบรรจุลงในถุงพลาสติก วิธีนี้เป็นวิธีท่ีสะดวก และประหยัดอีกวิธีหน่ึง โดยบรรจุ
นา้ เช่ือมในอตั ราสว่ นทตี่ ้องการ ลงในถงุ พลาสตกิ ทจี่ ุได้ประมาณ 3-4 ลิตร

(4) การให้น้าเช่ือมโดยวิธีราดน้าเช่ือมลงไปในหลอดรวง ถ้าเล้ียง ผ้ึงเป็นจานวนไม่มากรัง มีเวลามาก
พอ เพราะเปน็ การประหยัดไม่ต้องใชภ้ าชนะอ่ืนใด เพียงใชน้ า้ เช่ือมใสใ่ นกาน้าแล้วค่อย ๆ ยกคอนผ้งึ ขน้ึ มาเหนือรัง
วางเอียงลงเล็กน้อย ใช้น้าเช่ือมราดลงบนหวั คอนใหฉ้ ่าทั้ง 2 ด้าน ระวังอย่างไปราดน้าเชือ่ มลงในหลอดรังที่ไข่และ
ตัวหนอนอยู่

6

4) ขอ้ ควรจำในกำรให้น้ำเชอื่ มแก่ผ้ึง
(1) เลือกอตั ราสว่ นความเข้มข้นของนา้ เชื่อมให้เหมาะสมกบั ฤดูกาล
(2) ใหน้ า้ เชื่อมเฉพาะเวลาท่ผี ้ึงขาดแคลนน้าหวานจากดอกไม้เทา่ นั้น
(3) ใชน้ า้ ที่สะอาด
(4) ใหใ้ นปรมิ าณทเ่ี พยี งพอ ไม่มากไมน่ ้อยจนเกนิ ไป
(5) ให้นา้ เชอ่ื มโดยวธิ ีทีท่ ่านจะทาไดด้ ว้ ยความสะดวก รวดเร็ว และประหยดั
(6) ให้น้าเช่ือมรังที่แข็งแรงที่สุดก่อนตามลาดับลงมาหารังที่อ่อนแอเพ่ือป้องกันการร้อบบ้ิง (วิธีดีท่ีสุด

จัดการให้รงั ทกุ รังมคี วามแขง็ แกรง่ เท่ากัน)
(7) ให้นา้ เช่ือมตอนเย็น ๆ ดีกว่าตอนเชา้ ผึ้งจะไม่คอ่ ยต่ืนและไม่ค่อยเกดิ ปัญหาการร้อบบ้งิ
(8) ถ้าผ้ึงแสดงอาการต่ืนและผึ้งจากรังอ่ืน เริ่มมาก่อกวนจะขโมยน้าผึ้งให้ รีบปิดฝารัง ทาปากรัง ให้

ทางเขา้ ออกแคบ ผ้งึ รังน้ันจะไดม้ ีโอกาสป้องกันรงั ไดด้ ขี ้นึ
(9) น้าตาลทรายทใ่ี ช้ทาน้าเชอ่ื ม ต้องสะอาดปราศจากสารทจ่ี ะเป็นพิษต่อผึ้ง
(10) อย่าให้น้าเชื่อมหกรดราดข้างรัง ปากทางเข้าออกของรังหรือไหลย้อนจากในรังออกมาทางปากรัง

จะเป็นสอื่ ลอ่ นา้ ผ้ึงรังอนื่ เข้ามาขโมยเกดิ การต่อสทู้ ี่หน้าปากรังและลุกลามเขา้ ไปภายในรงั
5) กำรให้เกสรเทยี มแกผ่ ึ้ง
เกสรจากดอกไม้มีบทบาทสาคัญที่สุดในการเล้ียงผ้ึงเกสรเป็น แหล่งโปรตีนสาหรับหนอนผึ้ง และการ

เพาะเลี้ยงนางพญา เกสรท่ีได้จากธรรมชาติเป็นแหล่งที่ให้โปรตีนที่ดีท่ีสุด และวิเศษท่ีสุด ดังน้ี การใช้กับดักเกสร
ธรรมชาติได้ใช้ในระยะที่ขาดแคลนเป็นวิธีการท่ีดีท่ีสุด ถ้าหากท่านไม่มีปัจจัยดังกล่าวอยู่เลย คือไม่มีเกสรโดย
ธรรมชาติและไม่ไดด้ ักเก็บเกสรไว้ใช้ ทา่ นก็จาเป็นทจ่ี ะต้องให้เกสรเทียมในการเลยี้ งผึ้งของท่าน เพอ่ื จะทาให้สภาพ
ของผ้งึ ในรังไม่ขาดโปรตีน

วิธีสังเกตปริมาณการเก็บเกสรในรังผ้ึง ผึ้งจะเก็บเกสรไว้ในหลอดรังบริเวณใกล้ ๆ กับท่ีเก็บน้าผ้ึง จะ
สงั เกตเหน็ มีสตี ่าง ๆ ตามชนดิ ของดอกไม้ เชน่ สเี หลอื ง สีชมพู สีส้ม และบางชนดิ ก็เป็นสีมว่ ง ปริมาณเกสรทีเ่ ก็บไว้
ในหลอดรัง 1 คอน สามารถนาไปเลย้ี งตวั อ่อนในบรู๊ด 4 คอนบรู๊ด เวลายกคอนข้นึ มาตรวจดจู ะเห็นเกสรอยู่กระจัด
กระจายในหลอดรัง ซ่ึงแสดงว่ามีเกสรโดยธรรมชาติเพียงพอท่ีจะเลยี้ งผ้งึ ในรังได้ แต่ถ้าไม่มีเกสรอยู่ในหลอดรังเลย
จะตอ้ งหาเกสรเทยี มมาชดเชย สตู รเกสรเทยี มผเู้ ลยี้ งอาจเลอื กเอาสตู รใดสตู รหน่งึ เชน่

7

ตำรำงที่ 1 เกสรเทยี มสูตรที่ 1

เกสรเทยี มสตู รท่ี 1 (จากฟาร์มผ้งึ สงวน-เผ่าไทย เชยี งใหม)่

ถ่วั เขยี วทองกะเทาะเปลือก 10 กก.

น้าตาลทราย 10 กก.

หรอื น้าผงึ้ 8 กก.

บริวเวอรย์ ีสท์(Brewer yeast) 300-400 กรัม

นมผง (สกิม มลิ ด)์ 3 กก.

ไข่ตม้ สุกเอาเฉพาะไข่แดง 1 ฟอง

วธิ กี ารนาถ่วั เขียวทองท่กี ะเทาะเปลือกแลว้ มาแชน่ า้ แล้วนง่ึ ใหส้ ุกเสรจ็ แล้วก็เอามาบดและปน่ั ในเครื่อง
ปน่ั จนละเอียด ผสมนมผง บรวิ เวอรย์ สี ต์ ไข่แดงเข้าดว้ ยกัน ปน่ั ให้ละเอียด ผสมนา้ เช่ือม หรอื น้าผ้ึงจะเหลวข้น แล้ว
นาไปกรองบนผ้าขาวบาง เวลาจะนาไปใช้ก็ช้อนตักเทเป็นแนวบนหลังคอนท่ีมีตัวหนอนอยู่ประมาณ 2-3 คอน ใช้
หลงั ช้อนเกลย่ี เป็นแนวไปตามสนั คอน หลงั จากนอ้ี กี 2 วัน ก็ไปตรวจรังผงึ้ อกี ใช้ไฮฟทลู ขดู เกสรเทียมเก่าทิง้ ไป แลว้
เทชดุ ใหมล่ งไปอกี ปฏิบัติเช่นนไี้ ปเรือ่ ย ๆ จนพอเพยี ง อัตราสว่ นของถัว่ เขยี วทอง 10 กก. จะใช้เลี้ยงผึ้งได้ประมาณ
200-250 รงั การทาเกสรเทยี ม ควรจะทาครั้งหน่ึงใหพ้ อดี

ตำรำงท่ี 2 เกสรเทียมสตู รท่ี 2

สตู รเกสรเทยี มผง

บริวเวอรย์ สี ต์ 1 ส่วน

ถัว่ เหลอื งป่นละเอียด 3 สว่ น

เกสรแห้งป่น 1 ส่วน (ถ้าม)ี

ขอ้ ควรจาสาหรับเกสรเลี้ยงผึง้

(1) เกสรมีบทบาทอย่างสาคัญในการขยายตัวของผ้ึงในรัง ถ้าต้องการให้ผ้ึงแข็ง แรง สร้างบรู๊ดวางไข่ดี

ต้องไม่ให้ผ้ึงขาดเกสร

(2) เกสรจากดอกไม้โดยธรรมชาติ เป็นเกสรที่ดีท่ีสดุ และวิเศษที่สุดในการเลีย้ งผึ้ง ดังน้ัน แหล่งที่เล้ียง

ผึ้งควรจะมแี หลง่ เกสรดอกไม้อยใู่ นบริเวณนัน้

(3) เกสรเทียมเป็นเพียงส่วนประกอบทดแทนเกสรธรรมชาติ เพื่อรักษาสภาพรังให้ปกติ จะใช้เม่ือผึ้ง

ขาดเกสรจากดอกไม้ตามธรรมชาติ ในฤดูและในแหล่งท่ีมีเกสรดอกไม้ธรรมชาติอยู่มาก ควรจะทาเคร่ืองดักเกสร

เก็บ ไว้ใช้ในฤดทู ีข่ าดแคลน ในฤดูดอกไม้บาน 2 เดือน อยา่ ให้ผ้ึงขาดเกสรและนา้ หวาน เกสรในช่วง 8 สปั ดาห์กอ่ น

ดอกไม้บาน การสร้างตัวหนอนจะช้า ผ้ึงงานท่ีจะออกสนามจะมีน้อย ไม่พอที่จะไปเก็บเกี่ยวน้าหวานจากดอกไม้

ตามธรรมชาติ

8

2.3 งำนวิจยั ทีเ่ ก่ียวขอ้ ง

จุฑาทิพย์ โพธิ์อุบล นันท์นภัส ขาโต และ พริมา พิริยางกูร (2558) ได้ศึกษาการมีชีวิตอยู่รอดของ
Lactobacillus casei และ Lactobacillus acidophilus ในสมูทต้มี ะละกอพนั ธุ์แขกดาท่ีเก็บรักษาด้วยอุณหภูมิ
4 องศาเซลเซียส โดยตรวจวัดปริมาณเชื้อโพรไบโอติกแบคทีเรีย จุลินทรีย์ทั้งหมด โคลิฟอร์ม ยีสต์และราในน้า
มะละกอสมูทต้ีทุกสัปดาห์ จากการทดลองในวันเร่ิมตน้ มปี ริมาณเช้ือ Lactobacillus casei และ Lactobacillus
acidophilus เร่ิมต้นเท่ากับ 1.6x108 และ 5.3x108 CFU/mL ตามลาดับ เมื่อเก็บรักษาท่ีอุณหภูมิ 4 องศา
เซลเซียส พบว่า เชื้อ Lactobacillus casei มีปริมาณเพิ่มสูงขึ้นในช่วง 3 สัปดาห์แรก ส่วนเชื้อ Lactobacillus
acidophilus มีปริมาณลดลงตลอดการเก็บรักษา เมื่อตรวจวัดปริมาณจุลินทรีย์ทั้งหมด โคลิฟอร์ม ยีสต์และรา
พบว่ามีปริมาณเพ่ิมข้ึนเพียงเล็กน้อย จากการทดลองได้ผลสรุปว่าน้ามะละกอสมูทต้ีพันธุ์แขกดายังคงสภาพความ
เป็นผลติ ภัณฑโ์ พรไบโอตกิ ไดน้ าน 4 สปั ดาห์

ชัยณรงค์ สินภู่ (2555) ได้ศึกษาติดตามการเปลยี่ นแปลงของจุลินทรยี ์ของเกสรผึ้ง ท่ีอายุต่าง ๆ กัน และนา
ผลการศึกษามาปรับปรุงพัฒนาอาหารเสริมโปรตีนสาหรับผึ้ง โดยเทคนิค PCR-DGGE จากการศึกษา
การเปลี่ยนแปลงประชากรของจุลินทรีย์ในตัวอย่างเกสรผ้ึงที่สัปดาห์ต่างๆด้วยวิธีเพาะเลี้ยงบนอาหารเล้ียงเชื้อ
(culture dependent) และ การศึกษาแบบ metagenome (culture independent) พบยีสต์ในกลุ่ม
Zygosaccharomyces, spore-forming bacteria ในกลุ่มของ Bacillus, แบคทีเรยี ในกล่มุ ของ Lactobacillus
และเช้ือราในกลุ่ม Cladosporium, Aspergillus ซ่งึ มบี ทบาทในการเปล่ียนเกสร เปน็ bee bread และได้พัฒนา
อาหารเสริมโปรตีนสาหรับเลี้ยงผึ้ง ประกอบด้วยเกสรกับเเป้งถ่ัวเหลือง จัดเป็นแหล่งโปรตีนีท่สาคัญสาหรับผ้ึง
น้าตาลเป็นแหล่งพลังงานหรือแหล่งของคาร์โบไฮเดรท ผงยีสต์ น้า โพรไบโอติก ซึ่งเป็นจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิด
ประโยชนก์ บั ระบบทางเดินอาหารของผ้งึ

ตรี วาทกิจ บวรศักด์ิ ลีนานนท์ และสน่ัน จันทร์หอม (2560) ได้ศึกษาการเหลือรอดของแบคทีเรีย โพรไบโอติก
ในผลติ ภัณฑน์ ้าสับปะรดด้วยวิธกี ารช็อคด้วยกรดและตรงึ เซลล์เชื้อโพรไบโอตกิ ทน่ี ามาศึกษา ได้แก่ Lactococcus lactis
subsp. cremoris TISTR 1344, Lactobacillus acidophilus TISTR 1338 และเชื้อผสมอัตราสว่ น 1:1 การทดลองที่ 1
ศึกษากราฟการเติบโต พบว่า L. lactis subsp. cremoris TISTR 1344 และ L. acidophilus TISTR 1338 มีการเจรญิ
เข้าสู่ช่วงเฟสคงที่ โดยมีจานวนเซลล์ 8.5-9.0 logCFU/mL ใช้ระยะเวลาในการบ่ม 21 ชม. การทดลองที่ 2 พบว่า L.
lactis subsp. cremoris TISTR 1344 ที่ผ่านการช็อคด้วยกรด (pH 4.5) มีจานวนเหลือรอดสูงสุดเท่ากับ 5.72
logCFU/mL การทดลองท่ี 3 ศึกษาวิธีการตรึงเซลล์บนแผ่นวุ้นเซลลูโลสที่ผลิตได้จาก Acetobacter xylinum TISTR
893 โดยใช้น้าสับปะรดเป็นสับสเตรท พบว่าวุ้นท่ีมีลักษณะปั่นเป็นชิ้นเล็ก (flake) ทาให้เช้ือโพรไบโอติกมีจานวนเหลือ
รอดสูงสุดเท่ากับ 7.29 logCFU/mL ส่วนการทดลอง ท่ี 4 ศึกษาการเหลือรอดของแบคทีเรีย โพรไบโอติกรูปแบบต่างๆ
พบวา่ เซลลท์ ี่ผ่านการชอ็ คดว้ ยกรดร่วมกบั การตรงึ เซลลด์ ว้ ยเซลลูโลสมีจานวนเหลอื รอดสงู สดุ เท่ากบั 7.77 log CFU/mL

9

พิลาวัลย์ ไชยมีสุข และ บวรศักด์ิ ลีนานนท์ (ม.ป.ป.) ได้ศึกษากราฟการเจริญของเช้ือแบคทีเรีย
โปรไบโอติกต่างสายพนั ธก์ุ นั 2 ชนดิ คือ Lactobacillus acidophilus TISTR 1338 และ Lactobacillus casei
TISTR 390 ใน MRS broth โดยบ่มท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส พบว่าเช้ือจะเจริญเข้าสู่ช่วงเฟสคงท่ีในช่ัวโมงที่
24 ของการบม่ ซ่ึงเป็นช่วงทีม่ ีปริมาณของแบคทเี รยี สูงถึง 8 – 9 ล็อกโคโลนตี อ่ ลติ ร พร้อมทง้ั ศึกษาการเหลือรอด
ของเช้อื L. acidophilus TISTR 1338 และ L. casei TISTR 390 ในระหวา่ ง กระบวนการผลิตไอศกรีมข้าวกล้อง
มันปู พบว่า เชื้อแบคทีเรียโปรไบโอติกต่างชนิดกันและข้ันตอนการผลิตไอศกรีมไม่มีอิทธิพลร่วมต่อค่าเปอร์เซ็นต์
การเหลือรอด โดยสายพันธุ์ของเช้ือทั้งสองชนิดมีการเหลือรอดไม่แตกต่างกันทางสถิติ (p > 0.05) โดยที่เชื้อ
L. acidophilus TISTR 1338 และ L. casei TISTR 390 มีค่าการเหลือรอดคิดเป็นร้อยละ 96.23 ± 1.98 และ
97.01 ± 2.48 ตามลาดับ ในส่วนของขั้นตอนการผลิตท่ีแตกต่างกันคือข้ันตอนการป่ันไอศกรีม (freezing) และ
ขั้นตอนการแช่เยือกแข็ง (hardening) พบว่ามีค่าเปอร์เซ็นต์การเหลือรอดของแบคทีเรียโปรไบโอติกทั้ง 2 ชนิดไม่
แตกตา่ งกัน (p > 0.05) โดยมคี ่าการเหลอื รอดคดิ เป็นร้อยละ 97.75 ± 1.74 และรอ้ ยละ 95.49 ± 2.01 ตามลาดบั

สุคนธ์ ตันติไพบูลย์วุฒิ อัมพวัน หวานแก้ว และรุจี กรเจริญพรพงศ์ (2554) ได้ทาการศึกษาเร่ืองผลของ
อณุ หภูมใิ นการหมัก น้าตาลและน้าผง้ึ ต่อการเจริญและการอีย่รอดของเช้ือแบคทีเรยี แลคโตบาซิลลสั ในน้าลาไย ซ่งึ
วิจัยนี้ทาขึ้นเพื่อประเมินความเป็นไปได้ในการผลิตน้าลาไยหมักจากเน้ือลาไยแห้งด้วยเช้ือแบคทีเรียก รดแลคติก
Lactobacillus casei TISTR 390 และ Lactobacillus plantarum TISTR 863 ท้ังแบบธรรมชาติและแบบท่ี
เติมน้าตาลและน้าผ้ึง โดยทาการหมักน้าลาไยท่ีอุณหภูมิ 30 หรือ 37 องศา เซลเซียส (ºc) เป็นเวลา 72 ชั่วโมงทา
การวิเคราะหค์ วามเปน็ กรด-ด่าง (pH) ความเป็นกรดโดยรวม ปริมาณน้าตาลและจานวนเซลล์ท่ีไดท้ ุกๆ 24 ชั่วโมง
จนครบ 72 ช่ัวโมง และมกี ารประเมนิ การอยรู่ อดของแบคทเี รยี ท้ังสองชนิดในนา้ ลาไยหมัก เม่อื เกบ็ ทีอ่ ุณหภูมิ 7 ºc
เป็นเวลา 4 สปั ดาหจ์ ากการทดลองพบวา่ เชอ้ื ท้ังสองชนิดเจรญิ ในนา้ ลาไยธรรมชาติทีบิ ่มท่ีอณุ หภูมิ 30 ºc ไดด้ กี ว่า
ท่ีอุณหภูมิ 37 ºc อย่างมีนัยสาคัญ ทางสถิติอย่างไรก็ตาม เม่ือเก็บน้าลาไยหมักในตู้เยน็ เป็นเวลา 4 สัปดาห์ พบว่า
น้าลาไยที่หมักที่อุณหภูมิ 37 ºc มีปริมาณเชื้อเหลือรอดสูงกว่าน้าลาไยท่ีหมักที่อุณหภูมิ 30 ºc อย่างมีนัยสาคัญ
ทางสถติ ิทงั้ นอี้ าจเน่ืองจากเช้ือทงั้ สองชนิดไม่สามารถทนความเป็นกรดทสี่ ูงกว่าของน้าลาไยที่หมักที่อุณหภูมิ 30 ºc
น้าลาไย ท่ีเติมน้าตาลซูโครสและน้าผึ้ง 10% (น้าหนัก/ปริมาตร) มีปริมาณการเหลือรอดของเช้ือแบคทีเรีย หลัง
การเกบ็ ในตเู้ ย็นเปน็ เวลา 4 สัปดาห์สูงกว่าน้าลาไยธรรมชาติ

Gaggia , Baffoni, and Alberoni (1993) ได้ศึกษาพบว่า พืชเป็นอาหารสาคัญในการผลิตน้าผึ้งของผึ้ง
กลุ่มของจุลินทรีย์ในพืชประกอบด้วยแบคทีเรียหลายชนิด เช่น แบคทีเรียสกุล Lactobacillus และ
Bifidobacterium อีกท้ังยังมีการค้นพบสายพันธุ์ใหม่ของแบคทีเรียกรดแลคติก ซ่ึงคุณสมบัติโพรไบโอติกของ
แบคทีเรียเหลา่ นี้ได้รับการยอมรบั อยา่ งกว้างขวางว่ามบี ทบาทสาคญั ในลาไสจ้ ลุ นิ ทรีย์ในสตั ว์มีกระดูกสนั หลัง

10

บทท่ี 3
วธิ ีดำเนินกำรวิจยั

3.1 วัสดุ อุปกรณ์ เครอื่ งมอื สำรเคมี และอำหำรเลย้ี งเช้ือ

3.1.1 วสั ดุอุปกรณ์
1) กะละมัง
2) บีกเกอร์
3) ถงุ พลาสติก
4) ตะเกียงไฟ
5) ฟอกก้ี
6) ขวดรปู ชมพู่
7) หว่ งเขย่ี เชอ้ื
8) จานเพาะเล้ียงเช้อื
9) ปิเปตรอัตโนมตั ิ
10) ช้อนตกั สาร
11) หลอดทดลอง
12) แท่งสเปซ
13) ขวดแกว้ ดูแรน

3.1.2 เครอ่ื งมือ
1) หม้อน่งึ ความดันไอนา้ autoclave
2) เคร่ืองชงั่
3) ตปู้ ลอดเชือ้
4) ตบู้ ม่ introvater
5) เครอื่ งหมุนเหวี่ยง centrifuge
6) เครื่องเขย่าสาร Vortex Mixer
7) เครื่องดูดกลนื เเสง spactomiter

11

3.1.3 สำรเคมี
1) แอลกอฮอล์ 95%
2) แอลกอฮอล์ 75%
3) โซเดียมคลอไรต์ 0.85% (NaCl)
4) โซเดยี มคาร์บอเนต (CaCO3)

3.1.4 อำหำรผง้ึ และอำหำรเลีย้ งจุลินทรยี ์
1) เรณผู งึ้
2) แปง้ ถัว่ เหลอื ง
3) น้าผึ้ง (°Brix = 80)
4) de Man, Rogasa and Sharpe (MRS broth / agar)
5) หัวเชื้อ (inoculum) L. casei TISTR 390

3.2 วธิ กี ำรดำเนินกำร

3.2.1 กำรเตรียมจลุ ินทรยี ์ lactobacillus casei (เช้อื เร่มิ ต้น)
จุลินทรีย์ท่ีใช้ดาเนินการวิจัยเป็น L. casei TISTR 390 จากสถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และ

เทคโนโลยแี ห่งประเทศไทย
การเตรียมหัวเชื้อ (inoculum) L. casei TISTR 390 โดยการเพาะแบคทีเรียจากหลอดเชื้อแหง้

แข็งในอาหารเล้ียงเชือ้ MRS broth บ่มที่อุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ในสภาวะไร้อากาศ
ทาการถ่ายเช้ือ (subculture) อย่างน้อย 3 ครั้ง เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโต จากนั้นเล้ียงเชื้อในอาหารเล้ียงเช้ือ
MRS agar บ่มที่อุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บเชื้อเป็น stock culture นาเช้ือบรสิ ทุ ธ์ิ
จาก MRS agar เล้ียงใน MRS broth ปริมาตร 200 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48
ช่ัวโมง ในสภาวะไร้อากาศ จากนั้นนามาหมุนเหว่ียงที่ความเร็ว 6,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 10 นาที ล้างเซลล์ด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85 เปอร์เซ็นต์ 3 คร้ัง แล้วนาไปวัดค่าการดูดกลืน
แสง ปรับความขุน่ เช้ือใหไ้ ด้เท่ากับ 0.1 ซึ่งจะทาใหม้ ีปริมาณเชื้อประมาณ 1.0 x 108 CFU/มลิ ลลิ ติ ร

3.2.2 กำรเตรยี มอำหำรเสริมผ้ึงผสม lactobacillus casei (เชื้อเร่มิ ต้น)
อาหารเสริมผงึ้ เตรยี มจาก นาเรณูผ้ึง 500 กรมั ผสมกับแป้งถ่ัวเหลือง 1,250 กรัม คลุกเคล้าให้เข้า

กัน จากนั้นเติมน้าผึ้ง (°Brix = 80) 2,000 กรัม นวดให้เข้ากันจนเป็นก้อนไม่ติดมือ แบ่งใช้ 750 กรัม ค่อย ๆ เติม
หัวเช้ือ lactobacillus casei ที่เตรียมไว้ ได้แก่ L. casei ลงในอาหารเสริมผ้ึง โดยให้มีปริมาณหัวเชื้อเริ่มต้น
เทา่ กันคือ 108 CFU/กรมั

12

3.2.3 กำรเตรยี มอำหำรเลย้ี งเช้อื MRS agar
อาหารเล้ยี งเช้ือ MRS agar มวี ธิ กี ารเตรยี มดงั นี้
1. นาอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS agar ปริมาณ 67.15 กรัม ไปต้มในน้ากลั่นปริมาณ 1,000 มิลลิลิตร

ตม้ จนอาหารเลีย้ งเชอื้ MRS agar ละลาย
2. เติม 1.0 เปอร์เซน็ ต์ แคลเซียมคาร์บอเนต ลงในขวดแก้วดูแรน
3. นาอาหารเล้ียงเชื้อ MRS agar ที่ต้มจนละลายแล้ว ใส่ลงไปในขวดแก้วดูแรนที่เติม 1.0

เปอร์เซน็ ต์ แคลเซียมคาร์บอเนต ปิดฝาเกลยี วใหส้ นิทแลว้ เขยา่ ใหเ้ ข้ากัน
4. นาไปฆ่าเช้ือในหม้อน่ึงความดันไอน้า autoclave 15 ปอนด์ต่อตารางน้ิว ท่ีอุณภูมิ 121 องศา

เซลเซยี ส นาน 15 นาที
5. จากน้ันรอให้เย็นท่ีอุณหภูมิ 40-50 องศาเซลเซียส จึงนาออกจากหม้อนึ่งความดันไอน้า

autoclave แล้วเทลงจานเพาะเชอื้ ทปี่ ราศจากเช้ือ ปรมิ าณจานละ 25 มลิ ลลิ ติ ร รอให้อาหารแขง็ ตัว

3.2.4 ตรวจสอบกำรเหลอื รอดชวี ติ ของ lactobacillus casei ในอำหำรเสริมผึ้ง
ดาเนนิ การทดลอง โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (Completely Randomized Design :

CRD) โดยแบ่งเป็น 2 ชุดการทดลอง ได้แก่ อาหารเสริมผึ้งผสมเชื้อ lactobacillus casei เก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง
และ อุณหภูมิแช่แข็ง ทาการเก็บตัวอย่างอาหารเสริมผึ้งผสมเชื้อ lactobacillus casei ที่เก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง
และอุณหภูมิแช่แข็ง ปริมาณอย่างละ 1 กรัม ด้วยเทคนิคปลอดเชือ้ และทาการวิเคราะห์หาการเหลอื รอดชีวิตของ
แบคทีเรยี จากตวั อย่างเปน็ ระยะเวลา 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, และ 28 วัน นาตัวอย่างมาเจือจางแบบ serial ten-fold dilution ในสารละลาย
โซเดียมคลอไรด์ 0.85 เปอร์เซ็นต์ และใช้วิธีการตรวจนับเซลล์จุลินทรีย์แบบ viable plate count ด้วยวิธีการ
spread plate บนอาหาร MRS agar ท่ีเติม 1.0 เปอร์เซ็นต์ แคลเซียมคาร์บอเนต บ่มที่อุณหภูมิ 35-37 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 48 ช่ัวโมง ในสภาวะไร้อากาศ ทาการตรวจนับจานวนโคโลนีของแบคทีเรียท่ีมีโซนใสรอบ
โคโลนี และสุม่ ตรวจดลู กั ษณะของแบคทเี รียภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดว้ ยเทคนคิ การย้อมสีแกรม และทาการทดสอบ
catalase test พรอ้ มทงั้ บนั ทกึ ผลการทดลอง

นาการทดลองมาวิเคราะห์หาค่าความแปรปรวนของค่าเฉล่ียด้วยวิธี One Way Analysis of Variance
และเปรียบเทียบความแตกต่างค่าเฉล่ียระหว่างชุดการทดลองด้วยวิธี Duncan’s new multiple range test
(DMRT) ทร่ี ะดับความเช่ือมน่ั 95%

13

บทที่ 4
ผลกำรวิเครำะห์ข้อมูล

การศึกษาวิจัย เรื่อง การเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้ึง โดยผู้วิจัยดาเนินการ
ทดลอง โดยวางแผนการทดลองแบบสมุ่ สมบรู ณ์ (Completely Randomized Design : CRD) โดยแบ่งเป็น 2 ชดุ
การทดลอง ได้แก่ อาหารเสริมผ้ึงผสมเชื้อ lactobacillus casei เก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง และ อุณหภูมิแช่เย็น ทา
การเก็บตัวอย่างอาหารเสริมผ้ึงผสมเชื้อ lactobacillus casei ที่เก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง และอุณหภูมิแช่เย็น ซึ่ง
จลุ นิ ทรยี ์ท่ใี ชด้ าเนนิ การวจิ ยั เป็น L. casei TISTR 390 ปรมิ าณอยา่ งละ 1 กรัม ดว้ ยเทคนิคปลอดเชื้อ และทาการ
วิเคราะห์หาการเหลือรอดชีวิตของแบคทีเรียจากตัวอย่างเป็นระยะเวลา 28 วัน นาตัวอย่างมาเจือจางแบบ serial
ten-fold dilution ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85 เปอร์เซ็นต์ และใช้วิธีการตรวจนับเซลล์จุลินทรีย์แบบ
viable plate count ด้วยวิธีการ spread plate บนอาหาร MRS agar ท่ีเติม 1.0 เปอร์เซ็นต์ แคลเซียม
คาร์บอเนต บ่มที่อุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ช่ัวโมง ในสภาวะไร้อากาศ ทาการตรวจนับจานวน
โคโลนขี องแบคทีเรียทมี่ โี ซนใสรอบโคโลนี ไดผ้ ลดงั ตารางที่ 3

ตำรำงที่ 3 จานวนโคโลนีของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ที่อุณหภูมิห้องและ
อณุ หภูมิแช่เยน็ เป็นระยะเวลา 28 วนั

ระยะเวลำ จำนวนโคโลนขี องแบคทเี รียบนอำหำร MRS agar (CFU/g)
(วนั )
อำหำรเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสรมิ ผึง้ ผสมโพรไบโอตกิ ส์
0 ท่ีอุณหภมู ิห้อง ท่ีอณุ หภูมแิ ชเ่ ยน็
1
2 1.45 ± 8.32 × 108 1.38 ± 17.08 × 108
3
4 5.50 ± 6.56 × 107 2.09 ± 11.43 × 108
5
6 1.39 ± 16.80 × 107 6.37 ± 9.61 × 108
7
8 8.67 ± 33.97 × 106 9.17 ± 12.34 × 108
9
10 6.47 ± 5.50 × 106 1.25 ± 17.09 × 109

5.70 ± 12.53 × 106 2.07 ± 32.65 × 109

1.69 ± 23.45 × 106 2.34 ± 11.15 × 109

1.35 ± 38.85 × 106 2.65 ± 18.02 × 109

8.13 ± 10.78 × 105 1.73 ± 15.04 × 109

2.31 ± 9.64 × 105 1.06 ± 10.14 × 109

1.20 ± 9.53 × 105 7.13 ± 22.59 × 108

14

ระยะเวลำ จำนวนโคโลนีของแบคทีเรียบนอำหำร MRS agar (CFU/g)
(วัน)
อำหำรเสริมผ้งึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์
11 ท่ีอุณหภูมิหอ้ ง ท่อี ุณหภูมิแช่เยน็
12
13 8.50 ± 8.88 × 104 1.94 ± 3.51 × 108
14
15 4.47 ± 8.38 × 104 8.23 ± 14.64 × 107
16
17 1.51 ± 59.22 × 104 4.03 ± 7.50 × 107
18
19 4.13 ± 15.14 × 103 9.20 ± 32 × 106
20
21 2.00 ± 1.00 × 102 6.20 ± 18.24 × 106
22
23 0 2.12 ± 20.30 × 106
24
25 0 1.18 ± 15.27 × 106
26
27 0 5.63 ± 11.15 × 105
28
0 2.09 ± 12.66 × 105

0 6.67 ± 12.89 × 104

0 5.83 ± 19.50 × 104

0 2.14 ± 44.30 × 104

0 1.29 ± 23.86 × 104

0 8.10 ± 16.82 × 103

0 5.40 ± 22.27 × 103

0 1.00 ± 2.00 × 103

0 1.67 ± 1.15 × 102

00

จากตารางที่ 3 พบว่า L. casei TISTR 390 สามารถรอดชีวิตในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ท่ี
อุณหภูมิห้องได้เป็นระยะเวลา 15 วัน โดยมีปริมาณโคโลนีที่มีลักษณะโซนใสเร่ิมต้นอยู่ท่ี 1.45 ± 8.32 × 108 และ
สามารถรอดชีวิตในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ทอี่ ณุ หภูมแิ ช่เย็นไดเ้ ป็นระยะเวลา 27 วนั โดยมีปริมาณโคโลนี
ที่มีลักษณะโซนใสเริ่มต้นอยู่ที่ 1.38 ± 17.08 × 108 ซ่ึงมีอัตราการรอดชีวิตที่แตกต่างกัน จึงนาผลการตรวจนับ
จานวนโคโลนขี องแบคทีเรยี ท่ีมีโซนใสรอบโคโลนีไปคานวณค่า log CFU ต่อกรมั ดงั แสดงในตารางที่ 4

15

ตำรำงที่ 4 ค่า log CFU ต่อกรัม ของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ที่อุณหภูมิห้อง
และอุณหภมู ิแชเ่ ย็นเป็นระยะเวลา 28 วัน

ระยะเวลำ ปริมำณของแบคทเี รียทร่ี อดชวี ิต (log CFU/g)
(วัน)
อำหำรเสรมิ ผงึ้ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสรมิ ผ้งึ ผสมโพรไบโอติกส์
0
1 ทอ่ี ณุ หภูมิหอ้ ง ทอ่ี ุณหภมู แิ ช่เย็น
2
3 8.16 ± 0.02 8.14 ± 0.05
4
5 7.74 ± 0.05 8.32 ± 0.03
6
7 7.14 ± 0.05 8.80 ± 0.06
8
9 6.91 ± 0.19 8.96 ± 0.06
10
11 6.81 ± 0.04 9.09 ± 0.06
12
13 6.74 ± 0.10 9.31 ± 0.06
14
15 6.22 ± 0.06 9.37 ± 0.02
16
17 6.12 ± 0.12 9.42 ± 0.03
18
19 5.91 ± 0.06 9.24 ± 0.04
20
21 5.36 ± 0.02 9.02 ± 0.04
22
23 5.08 ± 0.03 8.84 ± 0.14

4.93 ± 0.05 8.28 ± 0.08

4.64 ± 0.09 7.91 ± 0.07

4.15 ± 0.17 7.60 ± 0.08

3.59 ± 0.18 6.94 ± 0.16

2.26 ± 0.24 6.78 ± 0.14

0 6.32 ± 0.04

0 6.07 ± 0.05

0 5.74 ± 0.08

0 5.32 ± 0.03

0 4.82 ± 0.08

0 4.75 ± 0.15

0 4.32 ± 0.09

0 4.11 ± 0.08

16

ระยะเวลำ ปริมำณของแบคทเี รยี ที่รอดชีวิต (log CFU/g)
(วนั )
อำหำรเสรมิ ผึง้ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสรมิ ผ้งึ ผสมโพรไบโอติกส์
24
25 ทีอ่ ุณหภูมิห้อง ที่อณุ หภมู แิ ช่เยน็
26
27 0 3.90 ± 0.09
28
0 3.70 ± 0.20

0 2.99 ± 0.08

0 2.16 ± 0.27

00

จากตารางที่ 4 พบว่า ค่า log CFU ต่อกรัม ของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผงึ้ ผสมโพรไบโอติกส์
ที่อุณหภูมิห้องเริ่มต้น มีค่า 8.16±0.02 จากนั้นค่อย ๆ ลดลงจนหมดไปในวันที่ 16 ส่วนค่า log CFU ต่อกรัม ของ
L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์อุณหภูมิแช่เย็นเร่ิมต้น มีค่า 8.14±0.05 จากน้ันมีค่า
เพิ่มขึ้นสูงสุดในวันท่ี 7 ก่อนจะค่อย ๆ ลดลงจนหมดไปในวันท่ี 28 ซ่ึงสามารถนาค่า log CFU ต่อกรัม ไปคานวณ
อัตราการเหลือรอด L. casei TISTR 390 ในอาหารเสรมิ ผ้ึงผสมโพรไบโอติกสท์ ่ีอุณหภูมิห้องและอุณหภมู แิ ชเ่ ย็นได้
ดังแสดงในตารางที่ 5

ตำรำงที่ 5 อัตราการรอดชีวิตของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ที่อุณหภูมิห้องและ

อณุ หภูมิแช่เย็นเป็นระยะเวลา 28 วัน

ระยะเวลำ อัตรำกำรรอดชวี ิตของ lactobacillus casei (เปอร์เซ็นต์)
(วนั )
อำหำรเสรมิ ผึ้งผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสรมิ ผ้งึ ผสมโพรไบโอติกส์

ท่ีอณุ หภมู ิห้อง ที่อณุ หภมู ิแช่เย็น

0 100 ± 0 100 ± 0
1 94.79 ± 0.65 102.21 ± 0.36
2 87.50 ± 0.63 108.12 ± 0.80
3 84.66 ± 2.39 110.07 ± 0.74
4 83.42 ± 0.46 111.71 ± 0.76
5 82.67 ± 1.21 114.41 ± 0.81
6 76.24 ± 0.76 115.11 ± 0.25
7 74.97 ± 1.49 115.76 ± 0.37

17

ระยะเวลำ ปรมิ ำณของแบคทเี รียท่รี อดชวี ิต (log CFU/g)
(วัน)
อำหำรเสรมิ ผง้ึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อำหำรเสรมิ ผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์
8
9 ท่อี ณุ หภมู ิหอ้ ง ท่อี ณุ หภมู ิแช่เย็น
10
11 72.37 ± 0.73 113.49 ± 0.46
12
13 65.70 ± 0.22 110.86 ± 0.52
14
15 62.21 ± 0.43 108.58 ± 1.71
16
17 60.36 ± 0.57 101.75 ± 1.05
18
19 56.89 ± 1.06 97.19 ± 0.94
20
21 50.91 ± 2.15 93.37 ± 0.99
22
23 44.01 ± 2.26 85.32 ± 1.95
24
25 27.68 ± 2.96 83.26 ± 1.76
26
27 0 77.70 ± 0.50
28
0 74.58 ± 0.68

0 70.58 ± 1.02

0 65.34 ± 0.33

0 59.19 ± 1.00

0 58.34 ± 1.85

0 53.12 ± 1.15

0 50.45 ± 0.96

0 47.94 ± 1.07

0 45.49 ± 2.49

0 36.78 ± 1.08

0 26.52 ± 3.38

00

จากตารางที่ 5 พบว่าอัตราการรอดชีวิตของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ที่
อุณหภูมิห้องสิ้นสุดอยู่ที่ 27.68±2.96 ในวันที่ 15 ก่อนจะหมดไปในวันที่ 16 และอัตราการรอดชีวิตของ L. casei
TISTR 390 ในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ที่อุณหภูมิแช่เย็นในช่วงแรกมีอัตราการเหลือรอดเพิ่มข้ึนโดย
เพมิ่ ขึ้นสูงสดุ ในวันที่ 7 อย่ทู ี่ 115.76±0.37 กอ่ นจะคอ่ ย ๆ ลดลงและสิ้นสดุ อยทู่ ี่ 26.52±3.38 ในวันที่ 27 กอ่ นจะ
หมดไปในวันที่ 28

18

บทที่ 5
สรุปผล อภิปรำยผล และขอ้ เสนอแนะ

จากการสรปุ ผลการวิจยั เรื่องการเหลอื รอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสรมิ ผง้ึ ท่เี ก็บในอุณหภูมิ
ปกติกบั แช่เย็นประกอบดว้ ยสาระสาคัญ ดังน้ี

1. วตั ถปุ ระสงคใ์ นการวิจัย
2. ขอบเขตการวจิ ัย
3. สรปุ ผลการวิเคราะห์ขอ้ มูล
4. อภิปรายผล
5. ขอ้ เสนอแนะ

5.1 วัตถุประสงคใ์ นกำรวจิ ยั

5.1.1 เพอ่ื ศกึ ษาการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้งึ
5.1.2 เพ่ือเปรยี บเทยี บการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสรมิ ผ้ึงทีเ่ กบ็ ในอุณหภมู ปิ กตกิ บั แชเ่ ยน็

5.2 ขอบเขตของกำรวิจยั

การศึกษาคร้ังน้ีมุ่งศึกษาเฉพาะการเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผึ้งท่ีผสมเช้ือ
lactobacillus casei ทเ่ี กบ็ ในอุณหภูมิปกตกิ ับแช่เย็น

5.4 สรุปผลกำรวเิ ครำะหข์ อ้ มูล

การศึกษาวิจัย เรื่อง การเหลือรอดของ lactobacillus casei ในอาหารเสริมผึ้ง โดยผู้วิจัยดาเนินการ
ทดลอง โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (Completely Randomized Design : CRD) โดยแบ่งเป็น 2 ชุด
การทดลอง ไดแ้ ก่ อาหารเสรมิ ผึ้งผสมเชื้อ lactobacillus casei เก็บไวใ้ นอณุ หภมู หิ ้อง และ อณุ หภมู ิแช่เยน็ ทาการ
เก็บตัวอย่างอาหารเสริมผึ้งผสมเช้ือ lactobacillus casei ที่เก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง และอุณหภูมิแช่เย็น ซึ่งจุลินทรยี ์
ท่ีใช้ดาเนินการวิจัยเป็น L. casei TISTR 390 ปริมาณอย่างละ 1 กรัม ด้วยเทคนิคปลอดเช้ือ และทาการวิเคราะห์
หาการเหลอื รอดชวี ติ ของแบคทีเรียจากตวั อย่างเป็นระยะเวลา 28 วนั สรุปผลได้ดงั นี้

5.4.1. จากการนาตัวอย่างมาเจือจางแบบ serial ten-fold dilution ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85
เปอร์เซ็นต์ และใช้วิธีการตรวจนับเซลล์จุลินทรีย์แบบ viable plate count ด้วยวิธีการ spread plate บนอาหาร
MRS agar ที่เตมิ 1.0 เปอรเ์ ซน็ ต์ แคลเซียมคารบ์ อเนต บม่ ทีอ่ ุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส เปน็ เวลา 48 ชั่วโมง ใน
สภาวะไร้อากาศ ทาการตรวจนับจานวนโคโลนีของแบคทีเรียท่ีมีโซนใสรอบโคโลนี พบว่า L. casei TISTR 390
สามารถรอดชวี ิตในอาหารเสริมผ้ึงผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอุณหภูมหิ ้องได้เป็นระยะเวลา 15 วัน โดยมีปริมาณโคโลนีที่มี

19

ลกั ษณะโซนใสเร่มิ ต้นอยู่ท่ี 1.45 ± 8.32 × 108 และสามารถรอดชีวติ ในอาหารเสรมิ ผึง้ ผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอณุ หภูมิแช่
เย็นได้เป็นระยะเวลา 27 วนั โดยมีปริมาณโคโลนีที่มลี ักษณะโซนใสเร่ิมตน้ อยู่ที่ 1.38 ± 17.08 × 108

5.4.2. จากการนาผลการตรวจนับจานวนโคโลนีของแบคทีเรียที่มีโซนใสรอบโคโลนีไปคานวณค่า log CFU
ต่อกรัม พบว่า ค่า log CFU ต่อกรัม ของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอุณหภูมิห้อง
เริ่มต้น มคี า่ 8.16±0.02 จากนั้นค่อย ๆ ลดลงจนหมดไปในวันที่ 16 สว่ นค่า log CFU ตอ่ กรัม ของ L. casei TISTR
390 ในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์อุณหภูมิแช่เย็นเริ่มต้น มีคา่ 8.14±0.05 จากน้นั มคี ่าเพิ่มขึ้นสูงสุดในวันที่ 7
ก่อนจะคอ่ ย ๆ ลดลงจนหมดไปในวันที่ 28

5.4.3 จากการนาคา่ log CFU ตอ่ กรัม ไปคานวณอัตราการเหลือรอด L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริม
ผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอุณหภูมิห้องและอุณหภูมิแช่เย็นได้ พบว่าอัตราการรอดชีวิตของ L. casei TISTR 390 ใน
อาหารเสรมิ ผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอุณหภูมหิ ้องสิ้นสุดอยู่ที่ 27.68±2.96 ในวันที่ 15 กอ่ นจะหมดไปในวันท่ี 16 และ
อัตราการรอดชีวติ ของ L. casei TISTR 390 ในอาหารเสริมผึ้งผสมโพรไบโอติกส์ท่ีอุณหภูมแิ ช่เย็นในชว่ งแรกมีอัตรา
การเหลือรอดเพ่ิมข้ึนโดยเพิ่มข้ึนสูงสุดในวันที่ 7 อยู่ท่ี 115.76±0.37 ก่อนจะค่อย ๆ ลดลงและสิ้นสุดอยู่ท่ี
26.52±3.38 ในวนั ท่ี 27 ก่อนจะหมดไปในวนั ท่ี 28

5.5 อภิปรำยผล

จากการวิจัยพบว่าการเหลือรอดของ Lactobacillus casei ในอาหารเสริมผ้ึงท่ีอุณหภูมิปกติมีปริมาณ
เพ่ิมสูงข้ึนในช่วงสัปดาห์แรกและค่อยๆลดลง ส่วนที่อุณหภูมิแช่เย็นมีปริมาณเพิ่มสูงข้ึนในช่วง 3 สัปดาห์แรกและ
คอ่ ยๆ ลดลง จงึ สรุปไดว้ า่ การเหลือรอดของ Lactobacillus casei ในอาหารเสรมิ ผึ้งที่อุณหภูมิแชเ่ ย็นเชื้อเจริญได้
ดีและมีการเหลอื รอดมากกว่าท่ีอุณหภูมิปกติ ซ่ึงอาหารเสรมิ ผงึ้ ผสม Lactobacillus casei ท่ีอุณหภูมิปกติจะเป็น
ผลิตภัณฑ์โพรไบโอติกได้ประมาณ 2 สัปดาห์ ส่วนท่ีอุณหภูมิแช่เย็นจะเป็นผลิตภัณฑ์โพรไบโอติกได้ประมาณ 4
สัปดาห์

ซึ่งจะสอดคลอ้ งกับวจิ ัยของ จฑุ าทพิ ย์ โพธิ์อบุ ล นันทน์ ภสั ขาโต และ พริมา พิรยิ างกรู ได้ศึกษาการมีชีวิต
อยู่รอดของ Lactobacillus casei และ Lactobacillus acidophilus ในสมูทต้ีมะละกอพันธ์ุแขกดาท่ีเก็บรักษา
ด้วยอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จากการทดลองพบว่า เชื้อ Lactobacillus casei มีปริมาณเพ่ิมสูงข้ึนในช่วง 3
สัปดาห์แรก และสรุปได้ว่าน้ามะละกอสมูทตี้พันธ์ุแขกดายังคงสภาพความเป็นผลิตภัณฑ์โพรไบโอติกได้นาน 4
สัปดาห์

5.6 ขอ้ เสนอแนะ

ข้อเสนอแนะในการวิจัยครั้งต่อไป สามารถนาผลงานวิจัยไปทาผลิตเป็นอาหารเสริมผ้ึงท่ีผสม
Lactobacillus casei ใช้ในการเลี้ยงและบารุงผึ้ง ซ่ึงสามารถบ่งบอกระยะเวลาท่ีเช้ือ Lactobacillus casei มี
การเหลือรอดได้ และสามารถนาไปต่อยอดศึกษาเชื้อชนิดอน่ื ท่มี ีประโยชนต์ อ่ ผง้ึ เพื่อผสมในอาหารเสรมิ ผง้ึ ได้

20

บรรณำนุกรม

กำรเกษตรทีด่ ีสำหรบั ฟำร์มผ้ึง. สืบค้นเม่อื 20 มิถุนายน 2563. เขา้ ถึงได้จาก https://www.acfs.go.th

กำรใหอ้ ำหำรแก่ผงึ้ . (ม.ป.ป.). สบื คน้ เมอ่ื 20 มิถนุ ายน 2653. เข้าถึงไดจ้ าก http://www.agriman.doae.go.th

จุฑาทพิ ย์ โพธิ์อบุ ล นันทน์ ภสั ขาโต และ พริมา พิรยิ างกรู . (2558). กำรมีชีวติ อยรู่ อดของ Lactobacillus
casei และ Lactobacillus acidophilus ในสมทู ต้ีมะละกอพันธุ์แขกดำ. สืบคน้ เม่ือ 3 ตลุ าคม 2562.
เขา้ ถึงไดจ้ าก http://www.crdc.kmutt.ac.th/Data%202015/CRDC9/data/125-128.pdf

ชัยณรงค์ สนิ ภู่. (2555). ควำมหลำกหลำยของจลุ ินทรยี ์ในเกสรผ้งึ และกำรพัฒนำอำหำรเสริมสำหรับผ้ึง.
สืบค้นเม่ือ 3 ตลุ าคม 2562. เข้าถึงได้จาก http://archive.lib.cmu.ac.th/full

ตรี วาทกจิ บวรศักด์ิ ลนี านนท์ และสนั่น จนั ทรห์ อม. (2560). กำรเหลือรอดของแบคทเี รยี โพรไบโอติกทีผ่ ่ำน
กำรชอ็ คดว้ ยกรดและตรึงเซลล์บนวุน้ ท่เี กิดจำกกำรหมกั นำ้ สับปะรด. สืบคน้ เมื่อ 3 ตุลาคม 2562.
เขา้ ถึงไดจ้ าก https://ag2.kku.ac.th/kaj/PDF

นธิ ยิ า รัตนาปนนท์ และ พมิ พ์เพ็ญ พรเฉลมิ พงศ์. (ม.ป.ป.). Lactobacillus. สบื คน้ เมือ่ 3 ตุลาคม 2562.
เข้าถึงไดจ้ าก http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/1271/lactobacillus

พชิ ัย คงพิทกั ษ์. (2541). อำหำรทดแทนเกสรสำหรบั ผงึ้ . สบื ค้นเมือ่ 20 มถิ นุ ายน 2563. เขา้ ถงึ ไดจ้ าก
http://archive.lib.cmu.ac.th/full/res/2544/tressct490476_44_full.pdf

พลิ าวลยั ์ ไชยมีสขุ และ ดร.บวรศักดิ์ ลีนานนท์. (ม.ป.ป.). กำรเหลอื รอดของเช้อื Lactobacillus
acidophilusและ Lactobacillus casei ในไอศกรมี ข้ำวกล้องมันปู. สืบคน้ เม่ือ 3 ตุลาคม 2562.
เข้าถึงได้จาก https://gsbooks.gs.kku.ac.th/58/the34th/pdf/BMP19.pdf

วรี ะวฒุ ิ พีระพันธ์.ุ (2553). สูตรอำหำรเลย้ี งผึ้งในชว่ งท่ีขำดแคลนดอกไม้. สืบคน้ เม่ือ 20 มิถนุ ายน 2563.
เขา้ ถึงไดจ้ าก https://www.rakbankerd.com/agriculture/print.php?id=285&s=tblfertilizer

สคุ นธ์ ตนั ติไพบลู ยว์ ุฒิ อัมพวนั หวานแกว้ และรจุ ี กรเจริญพรพงศ.์ (2554). ผลของอุณหภูมใิ นกำรหมัก นำ้ ตำล
และนำ้ ผง้ึ ต่อกำรเจริญและกำรอูยร่ อดของเช้ือแบคทเี รียแลคโตบำซิลลสั ในน้ำลำไย. สืบคน้ เมือ่ 3 ตุลาคม
2563. เข้าถึงไดจ้ ากhttp://www.lib.ku.ac.th/KUCONF/2555/KC4906014.pdf

21

ภำคผนวก

22

ภำคผนวก ก

(วิธีกำรดำเนนิ กำร)

23

วิธกี ำรดำเนนิ กำร

ขนั้ ท่ี 1 กำรเตรียมจุลินทรยี ์ lactobacillus casei (เช้ือเรม่ิ ต้น)

นาเชือ้ เริ่มต้นใส่ในอาหารเลยี้ ง
เชือ้ MRS broth จากนน้ั บม่
เป็นเวลา 48 ชว่ั โมง

จากนั้นนาเชอ้ื ทบ่ี ่มเสรจ็ เกบ็
เชื้อเปน็ stock culture บ่มตอ่
เป็นเวลา 48 ช่วั โมง

หลังจากบม่ เชื้อ 48 ช่ัวโมง นาเชื้อเทใส่หลอดสาหรับใสเ่ ครื่อง
หมนุ เหวย่ี ง (Centrifuge) จานวน 6 หลอด หลอดละ 52 g

24

จากนั้นนามาใสเ่ คร่อื งหมุนเหว่ยี ง หมุนเหว่ียงท่ีความเรว็ 6,000 รอบต่อนาที ทอ่ี ุณหภมู ิ 4 องศาเซลเซยี ส
เป็นเวลา 10 นาที เสรจ็ แลว้ นาเชือ้ ทไี่ ด้เทอาหารทงิ้ ลา้ งเซลล์ด้วยสารละลายโซเดยี มคลอไรด์ 0.85 เปอร์เซน็ ต์

นาเชือ้ มาล้างเซลล์ดว้ ยสารละลายโซเดียมคลอไรด์แล้วนาไปหมนุ เหวี่ยงทาซ้าท้ังหมด 3 ครั้ง
จากน้นั เทสารละลายโซเดยี มคลอไรด์ทงิ้ นาไปเขยา่ แลว้ เทเชือ้ รวมกนั

ทำกำรคำนวณก่อนนำเชื้อไปใสใ่ นอำหำรเสรมิ ผึ้ง
ทาเจอื จาง 10 เทา่ จะได้ 0.783 x 10 = 7.83
ปรับเชือ้ ให้ได้ 0.1 เพือ่ ใหเ้ ชอ้ื มีปรมิ าณเทา่ กบั 108CFU/ml
เม่อื เตรียมอาหาร 200 กรมั
จะได้ 200 x 0.1 = 2.55 ml/อาหาร200g
แบ่งได้เป็น 1.275 ml/อาหารทอี่ ุณหภมู ิปกติ 100g
และ 1.275 ml/อาหารแชเ่ ย็น 100g

นาเช้ือทไ่ี ด้ไปวดั คา่ การดูดกลืนแสง
ไดค้ า่ OD = 0.783

ขน้ั ท่ี 2 กำรเตรียมอำหำรเสรมิ ผึ้งผสม lactobacillus casei 25

เตรยี มอาหารเสริมผ้ึง โดยนาเรณูผ้งึ ,
แปง้ ถ่วั เหลอื ง คลุกเคลา้ ให้เข้ากัน
จากนั้นเติมนา้ ผ้ึงลงไปป้นั จนเปน็ กอ้ น
จากนัน้ แบง่ เป็นกอ้ นกอ้ นละ100 กรัม
จานวน 2 ก้อน

นาเชื้อเริม่ ตน้ ปริมาณ 1.275 ml ใส่ลงไปในอาหารเสรมิ ผ้งึ ท่เี ตรียมไวก้ ้อนละ 100g จานวน 2 ก้อน
ผสมให้เข้ากนั จากนัน้ นาเชื้อ 1 ก้อนเกบ็ ไวท้ ี่อณุ หภมู ิห้อง และอีก 1 ก้อนนาไปแชเ่ ย็น

ขัน้ ท่ี 3 ตรวจสอบกำรเหลอื รอดชวี ิตของ lactobacillus casei

นาอาหารเสรมิ ผึ้งทผ่ี สมเช้ือมาเจือจางแบบ serial ten-fold dilution ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85 เปอรเ์ ซ็นต์

26

จากนัน้ นาเชอื้ ท่เี จือจางมา spread plate บนอาหาร MRS agar แลว้ นาไปบ่มเป็นเวลา 48 ช่ัวโมง
ทาทดลองด้วยวิธีเดยี วกนั ท้งั หมด 28 วนั

หลังจากบม่ 48 ชวั่ โมงนามานับจานวนโคโลนี
โดยนับจานวนโคโลนีทม่ี ีเคลียรโ์ ซนเมอ่ื โคโลนีมีจานวนตั้งแต่ 30 – 300 โคโลนี
จากนน้ั นาจานวนโคโลนีตงั้ แต่วันท่ี 0 ถงึ วนั ท่ี 28 มาวเิ คราะห์หาค่าเฉลย่ี และเปรียบเทียบความแตกตา่ ง

(ทอี่ ุณหภมู ิห้อง) (ทอี่ ุณหภูมแิ ชเ่ ยน็ )

วันท่ี 0 วันที่ 1
อาหารเสริมไมผ่ สมเช้ือ lactobacillus casei อาหารเสริมผสมเชื้อ lactobacillus casei

27

ภำคผนวก ข

(ผลกำรวเิ ครำะหข์ อ้ มลู )

ตารางแสดงจานวนโคโลนี (CFU)

จานวนโคโลนี (CFU)

ระยะเวลา ระดบั ความ อาหารเสรมิ ผงึ้ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อาหารเสรมิ ผง้ึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์
(วนั ) เจอื จาง ทอี่ ณุ หภมู หิ อ้ ง ทอี่ ณุ หภมู แิ ชเ่ ย็น

1 2 3 mean SD 1 2 3 mean SD

10−1 211 240 270 240.333 29.5014 >300 >300 >300 >300 0

10−2 143 155 139 145.667 8.32666 122 136 156 138 17.088

0 10−3 0 0 0 0 0 0 4 6 3.33333 3.05505
10−4
10−5 163 175 182 173.333 9.60902 >300 >300 >300 >300 0
10−6
10−1 56 48 61 55 6.55744 223 209 195 209 11.431

10−2 0 0 0 0 0 25 22 30 25.6667 3.29983

1 10−3 125 136 158 139.667 16.8028
10−4 1 4 20 8.33333 10.2144 187 236 247 223.333 31.9427
10−5 55 62 74 63.6667 9.60902
10−6
10−1 49 96 115 86.6667 33.9755

10−2 10 0 0 3.33333 5.7735 235 278 255 256 21.5174

2 10−3 78 95 102 91.6667 12.3423
10−4
10−5 59 65 70 64.6667 5.50757
10−6
10−1 2 0 0 0.66667 1.1547 >300 >300 >300 >300 0

10−2 105 133 136 124.667 17.0978

3 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

4 10−3
10−4
10−5
10−6

10
10−1

10−2

5 10−3 >300 >300 >300 >300 0

10−4 44 58 69 57 12.53

10−5 >300 >300 >300 >300 0
10−6 187 190 245
10−1 207.333 32.6548

10−2

6 10−3 143 174 189 168.667 23.4592

10−4 20 31 29 26.6667 5.85947

10−5 >300 >300 >300 >300 0

10−6 230 226 247 234.333 11.1505

10−1

10−2

7 10−3 102 126 178 135.333 38.8501

10−4 0 2 0 0.66667 1.1547

10−5 >300 >300 >300 >300 0
10−6 280 270 245 265 18.0278
10−1

10−2 >300 >300 >300 >300 0

8 10−3 86 69 89 81.3333 10.7858
10−4

10−5 >300 >300 >300 >300 0
10−6 189 159 172
10−1 173.333 15.0444

10−2 238 220 235 231 9.64365

9 10−3 33 20 19 24 7.81025
10−4

10−5 289 255 250 264.667 21.2211

10−6 108 95 115 106 10.1489

10−1

10−2 121 110 129 120 9.53939

10 10−3 2 0 0 0.66667 1.1547
10−4

10−5 289 255 250 264.667 21.2211
10−6 50 95 69 71.3333 22.5906

10−1 >300 >300 >300 >300 0

10−2 92 88 75 85 8.88819

11 10−3
10−4

10−5 156 195 231 194 37.51
10−6 59154
10−1
259 198 288 248.333 45.9384

10−2 50 35 49 44.6667 8.3865

12 10−3 >300 >300 >300 >300 0
10−4 98 80 69
82.3333 14.6401
10−5
95 145 213 151 59.2284
10−6
10−1

10−2 0 0 4 1.33333 2.3094

13 10−3 206 178 170 184.667 18.9033
10−4

10−5 40 33 48 40.3333 7.50555
10−6 52 48 24 41.3333 15.1438
10−1

10−2 16 26 30 24 7.2111

14 10−3 60 92 124 92 32
10−4

10−5 1 1 2 1.33333 0.57735
10−6 12321
10−1

10−2 0 0 3 1 1.73205

15 10−3 >300 >300 >300 >300 0
10−4 41 71 74 62 18.2483

10−5 00000
10−6
10−1

10−2 00000

16 10−3 202 198 235 211.667 20.306
10−4 16 19 33 22.6667 9.07377

10−5
10−6

10−1 00000
00000
10−2
105 115 135 118.333 15.2753
17 10−3 10 11 16 12.3333 3.21455
10−4
10−5 00000
10−6 00000
10−1
48 52 69 56.3333 11.1505
10−2 2 9 12 7.66667 5.1316

18 10−3 00000
10−4 0 0 0 0 0 211 220 195 208.667 12.6623
10−5
10−6 1 4 6 3.66667 2.51661
10−1
00000
10−2 0 0 0 0 0 56 63 81 66.6667 12.897

19 10−3 00000
10−4
10−5 0 0 0 0 0 >300 >300 >300 >300 0
10−6 0 0 0 0 0 39 58 78 58.3333 19.5021
10−1
0 0 0 0 0 220 167 255 214 44.3058
10−2 0 0 0 0 0 23 31 50 34.6667 13.8684

20 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

21 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

22 10−3
10−4
10−5
10−6

10−1 0 0 0 0 0 110 156 122 129.333 23.8607
0 0 0 0 0 31 40 50 40.3333 9.50438
10−2
0 0 0 0 0 68 75 100 81 16.8226
23 10−3 0 0 0 0 0 2 3 8 4.33333 3.21455
10−4
10−5 0 0 0 0 0 30 58 74 54 22.2711
10−6 0 0 0 0 0 2 15 18 11.6667 8.5049
10−1
0 0 0 0 0 8 12 10 10 2
10−2 0000020111

24 10−3 0 0 0 0 0 1 1 3 1.66667 1.1547
10−4 0000000000
10−5
10−6 0000000000
10−1 0000000000

10−2

25 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

26 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

27 10−3
10−4
10−5
10−6
10−1

10−2

28 10−3
10−4
10−5
10−6

ตารางแสดงคา่ log CFU

คา่ log CFU

ระยะเวลา จานวนซา้ อาหารเสรมิ ผงึ้ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อาหารเสรมิ ผง้ึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์
(วนั ) ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ้ ง ทอ่ี ณุ หภมู แิ ชเ่ ย็น

CFU/g log mean SD CFU/g log mean SD

1 143000000 8.155 122000000 8.086

0 2 155000000 8.190 8.163 0.025 136000000 8.134 8.138 0.054

3 139000000 8.143 156000000 8.193

1 56000000 7.748 223000000 8.348

1 2 48000000 7.681 7.738 0.053 209000000 8.320 8.319 0.029

3 61000000 7.785 195000000 8.290

1 12500000 7.097 550000000 8.740

2 2 13600000 7.134 7.143 0.052 620000000 8.792 8.801 0.065

3 15800000 7.199 740000000 8.869

1 4900000 6.690 780000000 8.892

3 2 9600000 6.982 6.911 0.195 950000000 8.978 8.959 0.060

3 11500000 7.061 1020000000 9.009

1 5900000 6.771 1050000000 9.021

4 2 6500000 6.813 6.810 0.037 1330000000 9.124 9.093 0.062

3 7000000 6.845 1360000000 9.134

1 4400000 6.643 1870000000 9.272

5 2 5800000 6.763 6.749 0.099 1900000000 9.279 9.313 0.066

3 6900000 6.839 2450000000 9.389

1 1430000 6.155 2300000000 9.362

6 2 1740000 6.241 6.224 0.062 2260000000 9.354 9.370 0.020

3 1890000 6.276 2470000000 9.393

1 1020000 6.009 2800000000 9.447

7 2 1260000 6.100 6.120 0.122 2700000000 9.431 9.423 0.030

3 1780000 6.250 2450000000 9.389

1 860000 5.934 1890000000 9.276

8 2 690000 5.839 5.908 0.060 1590000000 9.201 9.238 0.038

3 890000 5.949 1720000000 9.236

1 238000 5.377 1080000000 9.033

9 2 220000 5.342 5.363 0.018 950000000 8.978 9.024 0.042

3 235000 5.371 1150000000 9.061

1 121000 5.083 500000000 8.699

10 2 110000 5.041 5.078 0.035 950000000 8.978 8.839 0.139

3 129000 5.111 690000000 8.839

1 92000 4.964 156000000 8.193

11 2 88000 4.944 4.928 0.047 195000000 8.290 8.282 0.086

3 75000 4.875 231000000 8.364

1 50000 4.699 98000000 7.991

12 2 35000 4.544 4.644 0.087 80000000 7.903 7.911 0.077

3 49000 4.690 69000000 7.839

1 9500 3.978 40000000 7.602

13 2 14500 4.161 4.156 0.175 33000000 7.519 7.601 0.081

3 21300 4.328 48000000 7.681

1 5200 3.716 6000000 6.778

14 2 4800 3.681 3.592 0.185 9200000 6.964 6.945 0.158

3 2400 3.380 12400000 7.093

1 100 2.000 4100000 6.613

15 2 200 2.301 2.259 0.241 7100000 6.851 6.778 0.143

3 300 2.477 7400000 6.869

1 2020000 6.305

16 2 1980000 6.297 6.324 0.041

3 2350000 6.371

1 1050000 6.021

17 2 1150000 6.061 6.071 0.055

3 1350000 6.130

1 480000 5.681

18 2 520000 5.716 5.745 0.083

3 690000 5.839

1 211000 5.324

19 2 220000 5.342 5.319 0.027

3 195000 5.290

1 56000 4.748

20 2 63000 4.799 4.819 0.082

3 81000 4.908

1 39000 4.591

21 2 58000 4.763 4.749 0.151

3 78000 4.892

1 22000 4.342

22 2 16700 4.223 4.324 0.093

3 25500 4.407

1 11000 4.041

23 2 15600 4.193 4.107 0.078

3 12200 4.086

1 6800 3.833

24 2 7500 3.875 3.903 0.087

3 10000 4.000

1 3000 3.477

25 2 5800 3.763 3.703 0.203

3 7400 3.869

1 800 2.903

26 2 1200 3.079 2.994 0.088

3 1000 3.000

1 100 2.000

27 2 100 2.000 2.159 0.275

3 300 2.477

1

28 2

3

ตารางแสดงอตั ราการเหลอื รอด

อตั ราการเหลอื รอด

ระยะ จานวน อาหารเสรมิ ผง้ึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์ อาหารเสรมิ ผง้ึ ผสมโพรไบโอตกิ ส์
เวลา ซา้ ทอ่ี ณุ หภมู หิ อ้ ง ทอ่ี ณุ หภมู แิ ชเ่ ย็น
(วนั )

CFU/g log % survival mean SD CFU/g log % survival mean SD

1

0 2 145666666.7 8.163 100.000 100.000 0.000 138000000 8.140 100.000 100.000 0.000

3

1 56000000 7.748 94.914 223000000 8.348 102.561

1 2 48000000 7.681 94.094 94.792 0.646 209000000 8.320 102.215 102.207 0.358

3 61000000 7.785 95.369 195000000 8.290 101.845

1 12500000 7.097 86.936 550000000 8.740 107.377

2 2 13600000 7.134 87.385 87.501 0.631 620000000 8.792 108.016 108.118 0.796

3 15800000 7.199 88.183 740000000 8.869 108.960

1 4900000 6.690 81.954 780000000 8.892 109.241

3 2 9600000 6.982 85.532 84.659 2.392 950000000 8.978 110.293 110.069 0.742

3 11500000 7.061 86.493 1020000000 9.009 110.672

1 5900000 6.771 82.942 1050000000 9.021 110.827

4 2 6500000 6.813 83.457 83.417 0.456 1330000000 9.124 112.088 111.708 0.765

3 7000000 6.845 83.851 1360000000 9.134 112.207

1 4400000 6.643 81.381 1870000000 9.272 113.906

5 2 5800000 6.763 82.851 82.669 1.207 1900000000 9.279 113.991 114.415 0.809

3 6900000 6.839 83.775 2450000000 9.389 115.348

1 1430000 6.155 75.402 2300000000 9.362 115.011

6 2 1740000 6.241 76.446 76.245 0.762 2260000000 9.354 114.917 115.106 0.251

3 1890000 6.276 76.886 2470000000 9.393 115.391

1 1020000 6.009 73.604 2800000000 9.447 116.060

7 2 1260000 6.100 74.729 74.967 1.495 2700000000 9.431 115.866 115.758 0.368

3 1780000 6.250 76.567 2450000000 9.389 115.348

1 860000 5.934 72.697 1890000000 9.276 113.963

82 690000 5.839 71.525 72.367 0.735 1590000000 9.201 113.041 113.488 0.462

3 890000 5.949 72.879 1720000000 9.236 113.460

1 238000 5.377 65.862 1080000000 9.033 110.977

92 220000 5.342 65.444 65.700 0.225 950000000 8.978 110.293 110.861 0.520

3 235000 5.371 65.795 1150000000 9.061 111.312

1 121000 5.083 62.263 500000000 8.699 106.869

10 2 110000 5.041 61.756 62.208 0.427 950000000 8.978 110.293 108.583 1.712

3 129000 5.111 62.604 690000000 8.839 108.587

1 92000 4.964 60.806 156000000 8.193 100.654

11 2 88000 4.944 60.569 60.365 0.572 195000000 8.290 101.845 101.749 1.050

3 75000 4.875 59.719 231000000 8.364 102.749

1 50000 4.699 57.562 98000000 7.991 98.174

12 2 35000 4.544 55.664 56.893 1.066 80000000 7.903 97.091 97.189 0.940

3 49000 4.690 57.454 69000000 7.839 96.302

1 9500 3.978 48.727 40000000 7.602 93.393

13 2 14500 4.161 50.976 50.908 2.149 33000000 7.519 92.366 93.375 1.000

3 21300 4.328 53.022 48000000 7.681 94.366

1 5200 3.716 45.521 44.007 2.262 6000000 6.778 83.271 85.322 1.947
14 2 4800 3.681 45.095 27.677 2.956 9200000 6.964 85.551 83.266 1.759
2400 3.380 41.407 12400000 7.093 87.144 77.696 0.500
3 100 2.000 24.500 4100000 6.613 81.239 74.580 0.679
1 200 2.301 28.187 7100000 6.851 84.169 70.583 1.017
15 2 300 2.477 30.344 7400000 6.869 84.390 65.344 0.327
3 2020000 6.305 77.462 59.198 1.006
1 1980000 6.297 77.356 58.341 1.856
16 2 2350000 6.371 78.270 53.120 1.146
3 1050000 6.021 73.971 50.455 0.957
1 1150000 6.061 74.457 47.943 1.070
17 2 1350000 6.130 75.312 45.495 2.492
3 480000 5.681 69.795 36.783 1.083
1 520000 5.716 70.222 26.524 3.384
18 2 690000 5.839 71.731
3 211000 5.324 65.410
1 220000 5.342 65.633
19 2 195000 5.290 64.989
3 4.748 58.332
1 56000 4.799 58.961
20 2 63000 4.908 60.302
3 81000 4.591 56.402
1 39000 4.763 58.520
21 2 58000 4.892 60.100
3 78000 4.342 53.348
1 22000 4.223 51.877
22 2 16700 4.407 54.135
3 25500 4.041 49.649
1 11000 4.193 51.513
23 2 15600 4.086 50.202
3 12200 3.833 47.083
1 6800 3.875 47.606
24 2 7500 4.000 49.141
3 10000 3.477 42.717
1 3000 3.763 46.234
25 2 5800 3.869 47.534
3 7400 2.903 35.665
1 3.079 37.828
26 2 800 3.000 36.856
3 1200 2.000 24.570
1 1000 2.000 24.570
27 2 100 2.477 30.432
3 100
1 300
28 2
3

CFU/g 0 day

ซา้ อณุ หภมู หิ อ้ ง อณุ หภมู แิ ชเ่ ย็น

1 143000000 122000000
2 155000000 136000000
3 139000000 156000000