เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ประจำปี 2563 เล่มที่ 1

396



ิ
้
การศึกษาผลของการตดเชื อโรคอื่นซ าซ้อนต่อเชื อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวของออยในสภาพไร่
Effect of mixed infections in sugarcane preinfected with white leaf disease

phytoplasma in field condition


1
ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วีรกรณ์ แสงไสย วสันต์ สิงค์ค า จีรนันท์ วนชะเอม จุฑามาศ สอนเมือง
ั
1
1
์
1
1
1
แตงไท ภิญโญ รววรรณ เชื้อกิตติศักด ภาคภูมิ ถิ่นค า และปิยะรัตน์ จังพล
1
1
ี
ิ์
1

บทคัดย่อ
่
ื้
การส ารวจเชื้อสาเหตุโรคในอ้อยในสภาพไร่เพื่อการทดสอบผลของการติดเชื้อโรคอื่นซ้ าซ้อนตอเชอ


ไฟโตพลาสมาโรคใบขาวของอ้อยมีการทาการส ารวจทั้งสิ้นจานวน 9 ครั้ง โดยเชื้อที่ส ารวจได้ทั้งหมด 4 ชนิด
เป็นเชื้อราบนใบ ซึ่งอาจไม่มีผลต่อเชื้อไฟโตพลาสมาซึ่งอยู่ในท่ออาหารของพืช การทดลองปลูกเชื้อราสาเหต ุ

โรคเส้นกลางใบแดงบนใบของต้นอ้อยที่มีเชื้อไฟโตพลาสมา แม้เชื้อสามารถเข้าทาลายเนื้อเยื่อได้ แต่ไม่มีการ
ั
ี่
ั
ี่
้
ขยายขนาด การเก็บตวอย่างอ้อยทมีลกษณะอาการทพบไดแก่ ก้านใบแดง,ใบขีดแดง,ใบแถบเหลองและ
ื
กลางใบเหลือง จากการน าแบคทีเรียที่เพาะแยกเชื้อได้ มาทดสอบจ านวน 20 ไอโซเลต พบว่าเป็นแบคทีเรีย
ี
ู
แกรมลบ จานวน 18 ไอโซเลต และแบคทเรียแกรมบวก 2 ไอโซเลต ผลการทดลองปลกเชอทสารวจได ้
ื้


ี่
จานวน 20 ชนิดในตนอ้อยทมีเชอใบขาวซ้ า 2 ครั้ง พบว่าตนอ้อยยังไม่แสดงอาการของโรคทเดนชดรุนแรง
ี่
ื้
ั

้
่
้
ี่

ุ
้
ทดสอบการปลูกเชื้อแบคทเรียสาเหตโรคอ้อย 5 ไอโซเลตโดยใชต้นอ้อยจานวน 72 ต้น พันธุ์ : TPJO4-768
ี
อายุ 2 เดือน ท าการปลูกเชื้อโดยการฉีดใสล าต้นอ้อยบันทึกผลทุก 1 สัปดาห์หลังการปลูกเชื้อเป็นระยะเวลา
่
1 เดือนจากนั้นน าการปลูกเชอซ้ าอีกสองรอบ พบว่าเชื้อทั้ง 5 isolates สามารถเพิ่มระดับความรุนแรงไดถึง
้
ื้
้
ื้
ี่
ั
ั
ู
ื้
ระดบ 2 และเริ่มแสดงอาการตงแตสปดาห์ท 1 หลงการปลกเชอ การปลกเชอในกลมตนทมีอาการใบขาว
ู
ุ่
่
ั้
ี่
ั
พบว่า isolate 4 และ 5 ซึ่งเป็นกลุ่มโคโลนีสีเหลือง มีต้นที่แสดงอาการใบขาวลดลง การปลูกเชื้อกลุ่มโคโลนี
้
สีเหลืองที่เพาะแยกได้จากใบที่มีอาการคลายใบลวก 5 ไอโซเลต ในต้นกล้าพันธุ์ขอนแก่น 3 ที่มีการติดโรคใบ
่
ขาวจานวน 60 ตน มีปริมาณเชอใบขาวก่อนปลกเชอพบปริมาณเชอตงแต <0.5- 10 copy/ul in 25 ng
ื้
ู
ั้
้

ื้
ื้
plant DNA ด้วยวิธีตัดใบ พบว่าเชื้อที่ปลูกมีการเข้าท าลายมากขึ้นในสัปดาห์ที่ 4 พบว่า isolate A และ B มี
ความรุนแรงกว่าอีก 3 isolates โดยสามารถทาลายเนื้อเยื่อใบอ้อยไดถึงระดบท 7 สวน isolate C, D และ
่
้
ี่

ั
E ทาลายไดถึงระดบ 5 ผลการตรวจเชอโรคใบขาวในตนททดสอบพบว่าในกลมควบคม มีเชออยู่ในระดบ
ุ
ุ่
้

ื้
ี่
ื้
้
ั
ั
ู
ุ่
ี
่
น้อยกว่า 10 copies/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม ท 4 สปดาห์หลงการปลก สวนกลมทดสอบทพบว่ามี
ั
ี่
ั
ี่
ี่
ุ่
้
ุ่
่
ปริมาณเชอใบขาวเพิ่มขี้น ไดแก่ กลม A, C และ E แตกลมททดสอบกับ isolate B และ D มีแนวโน้มของ
ื้
ื้
ื้
ื้
ั
ั้
ี่
่
เชอลดลงหรือคงตว ทงนี้อาจเกิดจากผลของเชอทมีตอการเพิ่มปริมาณของเชอใบขาวหรือการเกิดเชอ
ื้
ซ้ าซ้อนของทงสองเชอทาให้พืชแสดงอาการใบขาวไดมากขึ้น ผลการทดลองนี้แสดงพบว่าเชอกลมโคโลนีส ี
ั้
ุ่
้
ื้
ื้

เหลืองที่ได้จากการเพาะแยกจากใบที่มีอาการคลายใบลวกอาจมีผลต่อการลดลงของเชื้อโรคใบขาวอ้อย การ
้
ทดลองในตัวอย่างที่มีจ านวนมากขึ้นจะท าให้ได้ผลที่ชัดเจนขึ้น

1 ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน อ าเภอเมือง จังหวัดขอนแก่น

397




ค าส าคัญ : อ้อย โรคใบขาวของอ้อย โรคอ้อย โรคใบลวก โรคเหี่ยว โรคใบจุด โรคราสนิม การติดโรคซ้ าซ้อน
ค าน า
ู

ุ
ั
ู
ผลจากการดาเนินงานของศนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ศนย์วิจยและพัฒนาการเกษตรสพรรณบุรีและ
ั
ี่
ื้
ั

สถาบันวิจยพืชไร่ โดยสารวจเชอและตรวจปริมาณเชอไฟโตพลาสมาในตวอย่างทเก็บจากแปลงดวยเทคนิค
้
ื้
้
Nested-PCR พบว่าตัวอย่างที่เก็บส ารวจในสภาพไร่หลายตัวอย่าง จะพบแถบดีเอ็นเอที่มีหลายแถบร่วมดวย
ิ
ื้
ื้
ื้
กับแถบทแสดงถึงการตดเชอไฟโตพลาสมา ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการมีเชออื่นปะปนร่วมกับเชอไฟโตพลาสมา
ี่
ด้วย และจากการตรวจอาการของต้นมักพบอาการที่เกิดจากเชื้อสาเหตุโรคอื่นด้วย เช่น โรคใบลวก โรคเหี่ยว
้
ุ
ี่
ู
ิ
ุ่
ั
โรคใบจด โรคราสนิม เป็นตนตวอย่างเหลานี้มักพบในกลมทมีการปลกในแปลงเดมเป็นเวลานาน การตรวจ
่
ยืนยันผลดวย secA gene ทมีความจาเพาะตอเชอโรคใบขาวของอ้อยแสดงให้เห็นว่าตวอย่างทตดเชออื่น
้
ี่
ั
ื้
ื้

ี่
ิ
่
ี้
ี่
ี
่
บางชนิด เชน โรคใบลวก มักตรวจไม่พบแถบดเอ็นเอทบ่งชถึงการตดเชอไฟโพลาสมาโรคใบขาวของอ้อย
ื้
ิ
หรือพบในปริมาณน้อย ในขณะที่ตัวอย่างในแปลงเดียวที่ไม่พบเชื้ออื่น สามารถตรวจพบเชื้อไฟโตพลาสมาได ้
จึงอาจมีความเป็นไปได้ที่เชื้อสาเหตุโรคอื่นบางชนิดที่ อาจมีฤทธิ์ต้านการติดเชื้อไฟโตพลาสมาได ้
จากการสารวจพบว่าตวอย่างอ้อยทตดเชอโรคใบลวก (Leaf Scald) มักตรวจไม่พบเชอไฟโต
ั
ื้
ิ
ี่
ื้

ี
พลาสมาสาเหตโรคใบขาวดวยเทคนิคพีซีอาร์ โรคใบลวกเกิดจากเชอแบคทเรีย Xanthomonas
ุ
ื้
้
ี่
albilineans เชอนี้มีการสร้างสารพิษ albicidin ททาลายระบบทอน้ าทออาหารของพืช สารพิษดงกลาวนี้
่
่
่
ั

ื้
ื้
อาจมีผลต่อการด ารงชีวิตของไฟโตพลาสมาด้วย นอกจากนี้จากการส ารวจในกลุ่มตัวอย่างที่ตรวจพบว่ามีเชอ
อื่นร่วมด้วยที่สังเกตจากผลการตรวจด้วยเทคนิคพีซีอาร์นั้น มักไม่พบเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวในปริมาณ
ู
ื้
ี่
่
ื้
ี่
ิ
ี่
ทสง แตกตางจากตนทตรวจไม่พบเชออื่น จะเห็นการตดเชอเดยวทมีปริมาณเชอไฟโตพลาสมาใบขาวมาก
ื้
ี่
้
ื้
หรือน้อยที่ชัดเจน ดังนั้นจึงอาจมีความเป็นไปได้ว่าเชอสาเหตุโรคอื่นในอ้อยบางชนิดอาจเป็นปฏิปักษ์กับเชอ
ื้
ั
ไฟโตพลาสมาโรคใบขาวของอ้อย ซึ่งอาจเป็นแนวทางในการพัฒนายาปฏิชวนะหรือสารในการก าจดเชื้อไฟ
ี
โตพลาสมาได ้
้
ี
ิ
ื้
ิ
ิ
การตดเชอซ้ าซ้อนในพืชสามารถพบไดบ่อยครั้งในธรรมชาต อาจจะเป็นการตดเชอชนิดเดยวกัน
ื้
เชน ไวรัสและไวรัส หรือ การตดเชอข้ามชนิด เชน แบคทเรียกับไวรัส ซึ่งแตละชนิดอาจจะมีปฏิกิริยาชนิด
ิ
ื้
ี
่
่
่
ส่งเสริมกัน หรือต่อต้านกันได้ จากรายงานของ Shapiro et al. (2013) พบว่า มะระป่า (Cucurbita pepo
ssp. Texana) ทตดเชอไวรัส Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) สามารถลดความรุนแรงและ
ี่
ื้
ิ
้
พัฒนาการในการแสดงอาการเหี่ยวที่เกิดจากเชอ bacterial wilt (Erwinia tracheiphila) ได้ โดยพบว่าตน
ื้
ทตดเชอไวรัส ZYMV นั้น มีการสร้าง Salicylic acid (SA) ซึ่งเป็นไฟโตฮอร์โมนทพืชสร้างขึ้นในการตอต้าน
่
ี่
ื้
ิ
ี่
ี
การเกิดเชื้อ ส่วนต้นที่ติดเชื้อแบคทีเรียโรคเหี่ยวไม่พบสารชนิดนี้ ซึ่งแสดงว่าแบคทเรียกดการท างานของพืช
่
ั
ื้
และยับยั้งการสร้างสารดงกลาว Thongwai and Kunopakarn (2007) ไดรายงานถึงการจาแนกเชอท ี่

้
สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชอสาเหตุโรคเหี่ยวในปทุมมาที่เกิดจากเชื้อ Ralstonia solanacearum
ื้
้
ื
ซึ่งสามารถคดเลอกได 5 ชนิด เป็นแบคทเรียกลม bacillus และ enterobacteria โดยมีจดประสงคในการ
ุ่
ี
ั
ุ
์
น าเชื้อผสมเหล่านี้ไปใช้ในการควบคุมโรคเหี่ยวในปทุมมา

398



ื้
วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อศึกษาผลของการติดเชื้อสาเหตุโรคอื่นต่ออุบัติการณ์การตรวจพบเชอ

ี่
ิ
่
ั
ไฟโตพลาสมาโรคใบขาวในอ้อยของตวอย่างทสารวจจากไร่เกษตรกร และผลของการตดโรคอื่นตอปริมาณ
ิ
ิ
เชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อยที่ตดเชื้อโรคใบขาวจากการปลูกเชื้อในห้องปฏบัตการ เพื่อให้ได้ข้อมูลปฏิกิริยาของ
ิ
่
ื้
ุ
่
ื้
ี่
เชอสาเหตโรคอื่นตอเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวของอ้อยทสามารถน าไปพัฒนาตอเป็นสารหรือยาในการ
ควบคุมหรือก าจัดเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวที่ได ้

วิธีด าเนินการและอุปกรณ์
์
อุปกรณ์ : อุปกรณดดจายสารละลาย เครื่องปั่นเหวี่ยง หลอดแอพเพนดอร์ฟ กระถางพลาสตก ดน
่
ู
ิ
ิ
ส าหรับเพาะกล้า เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เครื่องอ่านผลดีเอ็นเอ เครื่องตรวจปริมาณดีเอ็นเอ
วิธีการ :
แบ่งเป็น 2 ขั้นตอน ดังนี้
ขั นตอนที่ 1 ส ารวจและแยกและเพาะเชื้อสาเหตุโรคอื่นในอ้อยส าหรับการทดสอบ
สิ่งที่ใช้ในการทดลอง: ตัวอย่างอ้อยที่แสดงอาการโรคอื่น เช่น โรคใบลวก โรคเหี่ยว โรคใบจุด โร
คราสนิมจากการส ารวจจากแปลงปลูกของเกษตรกรในแหล่งปลูกต่างๆ

แบบและวิธีการทดลอง: ส ารวจและรวบรวมตัวอย่างอ้อยเป็นโรคจากไร่เกษตรกรและแปลงทดลอง
วิธีปฏิบัติการทดลอง

ี่
ุ
ั

่
สารวจและเก็บตวอย่างอ้อยทแสดงอาการโรคอื่น เชน โรคใบลวก โรคเหี่ยว โรคใบจด โรคราสนิม

ื้
ิ
ื้
่
ู
่
จากแปลงปลกของเกษตรกรในแหลงปลกตางๆ เพาะแยกเชอ และจาแนกชนิดของเชอในห้องปฏิบัตการ
ู
ื้
ี้
่
ึ
ื้
ื้
่

ตามวิธีการจาแนกเชอแตละชนิดและ เพาะเลยงเชอเพื่อการศกษาในขั้นตอไป ตรวจปริมาณเชอไฟโต
้
พลาสมาโรคใบขาวและการตดเชออื่นดวยเทคนิค Nested-PCR และ realtime PCR ตรวจยืนยันการตด
ิ
ิ
ื้
ื้
เชอโรคใบขาวและปริมาณเชอดวย SecA gene ตามวิธีการ Sakuanrungsirikul et al. (2013) บันทกผล
ึ
ื้
้
การตรวจพบเชื้อไฟโตพลาสมาร่วมกับการพบเชื้ออื่นในตัวอย่างเดียวกัน
่
ื้
ขั นตอนที่ 2 ศกษาผลของการตดโรคอื่นตอปริมาณเชอไฟโตพลาสมาดวยการปลกเชอใน
ู
ื้
้
ึ
ิ
ห้องปฏิบัติการ
้
ื
ี่
้
ี่
สิ่งที่ใช้ในการทดลอง: ตนอ้อยอายุประมาณ 2 เดอน ทไดจากการเพาะอ้อยทมีอาการยอดขาว
หรือหน่อขาวและจากล าที่ไม่มีอาการใบขาว
แบบและวิธีการทดลอง: -
วิธีปฏิบัติการทดลอง
เตรียมตวอย่างโดยน าอ้อยลาทมีอาการยอดขาว หรือหน่อขาวและลาทมาจากกอทไม่มีอาการใบ
ี่
ี่
ี่
ั


ขาว ตดข้อ ระบุตาแหน่งข้อ ระบุพันธุ์ทใช แชข้อในน้ าร้อน 52 องศาเซลเซียส 30 นาท น ามาเพาะใน
ี่

ั
่
้
ี
ื
้
้
ี้

ู
ู
ึ
กระถาง บันทก ตาแหน่งข้อทปลก ดแล รักษา และเพาะเลยงจนไดตนอายุประมาณ 2 เดอน บันทกข้อมูล
ี่
ึ
ื้
ื้
อาการใบขาว ตรวจปริมาณเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวและการตดเชออื่นดวยเทคนิค Nested-PCR และ
ิ
้
ิ
ื้
realtime PCR ตรวจยืนยันการตดเชอโรคใบขาวและปริมาณเชอดวย SecA gene ตามวิธีการ
้
ื้

399



่
ู
ื้
ื้
ุ
ู
ี่
้
Sakuanrungsirikul et al. (2013) ในตนทคดเลอกก่อนการปลกเชอ น าไปปลกเชอสาเหตโรคอื่น เชนโรค
ื
ั
ิ

ุ
ใบลวก โรคเหี่ยว โรคใบจด โรคราสนิม ในห้องปฏิบัตการตามวิธีการมาตรฐาน จานวน 50 ซ้ า/เชอ 1 ชนิด
ื้
บันทึกพัฒนาการของอาการของเชื้อชนิดต่างๆ ที่เกิดขึ้นบนใบ ตรวจปริมาณเชื้อไฟโตพลาสมา เมื่อเริ่มตรวจ
ื้
พบการแสดงอาการจากการปลกเชอตางๆ และเก็บตวอย่างเพื่อตรวจเชอเพิ่มอีกทก 14 วัน หลงการแสดง
่
ั
ุ
ั
ู
ื้
อาการ จนถึง 3 เดือนหลังการปลูกเชื้อ บันทึก วิเคราะห์ และสรุปผล
เวลาและสถานที่
เริ่มต้น : ตุลาคม 2558 สิ้นสุด กันยายน 2563
สถานที่ท าการทดลอง : ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น

ผลการทดลองและวิจารณ์
การส ารวจเชื อสาเหตุโรคอื่นในอ้อย : การส ารวจเชื้อสาเหตุโรคในอ้อยในสภาพไร่เพื่อการทดสอบ

ผลของการติดเชื้อโรคอื่นซ้ าซ้อนต่อเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวของอ้อยมีการทาการส ารวจทั้งสิ้นจานวน 9

ครั้ง ในระยะแรกช่วงเดือนตุลาคม จ านวน 3 ครั้ง เชื้อที่ส ารวจได้ทั้งหมด 4 ชนิด เป็นเชื้อราบนใบ ซึ่งอาจไม่
่

่
ื้
ู
ื้
มีผลตอเชอไฟโตพลาสมาซึ่งอยู่ในทออาหารของพืช การสารวจเชอเพิ่มอีก 3 ครั้งในชวงหลงฤดฝน เก็บ
ั
่
ตัวอย่างใบอ้อยที่สงสัยอาการของโรคพืช จากแปลงทดลองศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น, พื้นที่ปลูกอ้อยในจังหวัด
ิ
ั
้
ั้
หนองคาย, อุดรธานี, ชยภูมิ, มหาสารคาม,ร้อยเอ็ด, กาฬสนธุ์ และขอนแก่นไดทงหมด 120 ตวอย่าง โดย
ั
ี
้
ื
ลกษณะอาการทพบไดแก่ ก้านใบแดง,ใบขีดแดง,ใบแถบเหลองและกลางใบเหลอง จากการน าแบคทเรียท ี่
ื
ั
ี่
ื้

เพาะแยกเชอได มาทดสอบจานวน 20 ไอโซเลต พบว่าเป็นแบคทเรียแกรมลบ จานวน 18 ไอโซเลต เป็น

ี
้

กลม Psuedomonas จานวน 11 ไอโซเลต กลม Xanthomonas/Pantoea จานวน 7 ไอโซเลต และ
ุ่
ุ่

แบคทีเรียแกรมบวก 2 ไอโซเลต
การทดสอบการปลูกเชื อในตนอ้อยที่ตดเชื อไฟโตพลาสมา : การทดลองเพาะเชอเสนกลาง
้
ื้
้
ิ
ี่
้
ื้
ใบแดงบนใบอ้อยทของตนอ้อยทไดจากการเพาะเลยงเนื้อเยื่อ และตรวจพบว่ามีปริมาณเชอไฟโตพลาสมา
ี้
้
ี่
่
ระดับสูง เริ่มแสดงอาการส้นกลางใบแดงหลังการปลูกเชื้อประมาณ 2 สัปดาห์ แตจากสภาพอากาศร้อนและ
แลงจด ทาให้โรคไม่มีการขยายขนาดบนใบ แม้จะทาการฉีดพ่นน้ าอย่างสม่ าเสมอ การทดลองปลกเชอท ี่
ื้


ั
ู
้
้
ี่

้
้
่
ื
ื้

สารวจไดจานวน 20 ไอโซเลต ในตนอ้อยทมีเชอใบขาวในชวงระหว่างเดอน ม.ค. 2560 พบว่าตนอ้อยไม่
ื้
แสดงอาการของโรคทเด่นชดรุนแรงหลังการปลกเชอ 7 วัน (ภาพที่ 1) แตการปลูกเชอซ้ าพบว่าต้นแห้งตาย
ู
่
ี่
ื้
ั
ทั้งหมดเนื่องจากสภาพอากาศแล้ง

400



อาการบนใบ ลักษณะโคโลนี แกรม กลุ่มเชื อ อาการหลังปลูกเชื อ 7 วัน
บนอาหารเลี ยงเชื อ
ลบ กลุ่มจีนัส
Psuedomonas







ลบ กลุ่มจีนัส
Psuedomonas









ลบ กลุ่มจีนัส
Xanthomanas/
Pantoea






บวก กลุ่มจีนัส
Bacillus









ภาพที่ 1 ชนิดของเชื้อและโรคอ้อยและผลการปลูกเชื้อในต้นอ้อยที่ติดเชื้อโรคใบขาว



้
้
ื้

ี
้
ู
การทดสอบการปลกเชอแบคทเรียสาเหตุโรคอ้อย 5 ไอโซเลตโดยใชตนอ้อยจานวน 72 ตน พันธุ์
ื้
ุ
ั้
ี
ื้
์

TPJO4-768 ทาการเตรียมเซลลแขวนลอยเชอแบคทเรียทง 5 isolates โดยแยกเชอสาเหตโรคพืชจากการ
น าตัวอย่างใบอ้อยที่มีอาการเป็นโรค (ภาพที่ 2) บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient Agar (NA) บ่มนาน 48 ชั่วโมง
ที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส แล้วน าเซลล์แบคทีเรียมาเตรียมสารแขวนลอยในน้ ากลั่นฆ่าเชื้อ ที่ค่า Optical
density เทากับ 0.1 วัดทความยาวคลน 590 นาโนเมตร (OD ) มีเชอเทากับ 10 CFU/ml น าตนอ้อยท ี่
ื่
8
่
ื้
้
ี่
่
590
ทาการปลกมาแลว 2 เดอน ทาการปลกเชอโดยการฉีดใสลาตนอ้อยปริมาณตนละ 2 ml บันทกผลทก 1
้
ุ
ึ
่

ื

ู
ื้
้

ู
้
สัปดาห์หลังการปลูกเชื้อเป็นระยะเวลา 1 เดือนจากนั้นน าการปลูกเชื้อซ้ าอีกสองรอบ และตรวจเชื้อหลังจาก
ปลูกเชื้อ 1 เดือน นับจ านวนต้นที่เป็นโรค และวัดอัตราการเกิดโรคบนใบอ้อย ตามวิธี Mcmaugh (2008)

401



ไอโซเลต ลักษณะโคโลน ี ชนิดเชื อ อาการทางใบหลังปลูกเชื อ
1.UT1 เชื อแบคทีเรีย

unknown









2.UT3 เ ชื อ แ บ ค ที เ รี ย
Xanthomonas
sp./Pantoea







3.KKFC1 เชื อแบคทีเรีย
unknown











4.XAN1 เ ชื อ แ บ ค ที เ รี ย
Xanthomonas
sp./Pantoea






5.XAN2 เ ชื อ แ บ ค ที เ รี ย
Xanthomonas
sp./Pantoea








ภาพที่ 2 เชื้อแบคทีเรียสาเหตุโรคอื่นในอ้อย 5 ไอโซเลต และอาการทางใบหลังการปลูกเชื้อของต้นอ้อยทตด
ิ
ี่
โรคใบขาวที่ใช้ทดสอบ


้
โดยใชการประเมินระดับความรุนแรงของโรคด้วยตาเปล่า ดังนี้
ระดับ 0 ไม่ปรากฏอาการของโรค
ระดับ 1 ปรากฏอาการของโรค จ านวน 1-25 % ของพื้นที่ใบพืช

402



ระดับ 2 ปรากฏอาการของโรค จ านวน 26-50 % ของพื้นที่ใบพืช

ระดับ 3 ปรากฏอาการของโรค จ านวน มากกว่า 50% ของพื้นที่ใบพืช
ื้
ั้
ื้
ั
ู
ผลการประเมินระดบความรุนแรงของโรคจากการปลกเชอพบว่าเชอทง 5 isolates สามารถเพิ่ม
ั
่
ระดบความรุนแรงไดถึงระดบ 2 และเริ่มแสดงอาการตงแตสปดาห์ท 1 หลงการปลกเชอ การปลกเชอใน
ี่
ั
้
ั้
ั
ื้
ู
ู
ั
ื้
กลุ่มต้นที่มีอาการใบขาว พบว่า isolate 4 และ 5 ซึ่งเป็นแบคทีเรียในกลุ่ม Xanthomonas sp./Pantoea
ี
ื
ี่
ุ่
ี
่
sp.หรือเป็นกลมแบคทเรียทมีโคโลนีสเหลอง มีตนทแสดงอาการใบขาวลดลง สวนการทดลองในกลมที่ไม่
ี่
ุ่
้
ั
ั
ี่
้
ู
ี่
ื้
แสดงอาการใบขาว หลงการปลกเชอสปดาห์ท 7 ไม่มีตนแสดงอาการใบขาว (ตารางท 1) แสดงให้เห็นว่า
เชื้อกลุ่มนี้อาจส่งผลในทางลบต่อโรคใบขาว

ตารางที่ 1 การประเมินความรุนแรงของโรคในตนอ้อยทไดรับการปลกเชอในตนกลาอ้อยทีมีอาการใบขาว
ื้
้
้
ี่
้
้
ู
(white leaf) และต้นที่ไม่มีอาการใบขาว (Green leaf) จ านวน 6 ซ้ า และจ านวนต้นที่การแสดง
ี่
ื้

อาการใบขาวใน ดาเนินการปลกเชอครั้งท 1 เมื่อ 3 ต.ค. 2560 ตรวจตดตามการแสดงอาการ
ู
ิ
ของต้นในสัปดาห์ที่ 1 (10 ต.ค. 2560), 2 (17 ต.ค. 2560) , 3 และ 4 (24 ต.ค. 2560) ปลูกเชอ
ื้
ครั้งที่ 2 (27 พ.ย. 2560) * แสดงอาการโรคอื่นร่วมด้วย white : ต้นแสดงอาการใบขาว
isolate 1Wk1 1Wk2 1Wk3 1Wk4 2wk4 2wk5 2wk6 2wk7 Plant symptom
White leaf group At 1wk1 / 2wk7
control 0 0 0 0 0 0 0 0 6White* / 6 white
1.UT1 0 0 0 0-2 0-2 0-2 0-2 0 5 white* /6 white
2.UT3 0 1 1 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 0 white* /3 white
3.KKFC1 0 0 0 0-2 0-2 0-2 0-2 0 0 white*/4 white
4.XAN1 0-1 0-1 0-1 0-2 0-2 0-2 0-2 0-1 4 white* /2 white
5.XAN2 0 0 0 0 0 0 0 1 1 white* /0 white
Green leaf group
control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 white /0 white
1.UT1 0 0 1 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 0 white /0 white
2.UT3 0 0 0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 0 1 white*/0 white
3.KKFC1 0 0 0 0 0 0 0 0-2 0 white*/0 white
4.XAN1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 white*/0 white
5.XAN2 0-1 0-1 0-1 0-2 0-2 0-2 0-2 0-1 0 white /0 white

ี่
ื้
ื้
ื้
ู
ั
การตรวจปริมาณเชอโรคใบขาวก่อนการปลกเชอ และในสปดาห์ท 7 หลงการปลกเชอ ผลการ
ู
ั
้
ั
ื้
ื้
ู
ื้
วิเคราะห์ปริมาณเชอใบขาวในตวอย่างอ้อยก่อนการปลกเชอพบว่ามีเชอใบขาวเริ่มตนระหว่าง 0.5 –
่
ี่
ี
100.000 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม (ภาพท 3) โดยทปริมาณเชอตากว่า 1000 copy/ul ในด ี
ี่
ื้
เอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม อ้อยยังไม่แสดงอาการใบขาว

403


















ั
ภาพที่ 3 ระดบปริมาณเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อย
ประเมินด้วยวิธี nested-PCR ใช้ยีนเป้าหมาย 16S-23S ITS ใน

ุ
ใบของอ้อยก่อนทดสอบการปลูกเชื้อแบทีเรียสาเหตโรคอื่นใน
อ้อย
สีฟ้า : <0.5 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม

สีเขียว : 0.5-1 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม
สีเหลือง : 1-10 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม
สีส้ม : 10-1000 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม

สีแดง* : > 1000 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม
*แสดงอาการใบขาว

ื้
ี่
์
ิ
ื้
ั
ื้
ั

การสารวจตวอย่างเชอใบลวกจากอ้อยทตดเชอในเขตจงหวัดนครสวรรค สามารถเพาะแยกเชอ
ื
ื้
ู
ุ่
ี
้
Xanthomonas/Pantoea sp หรือกลมโคโลนีสเหลองได 5 isolates (ภาพท 4) การทดสอบปลกเชอใน
ี่
ตนอ้อยอายุ 2 เดอน จานวน 30 ตน พบว่าทกตนแสดงอาการของโรค และพบว่า isolate B และ C ให้
้
้

ุ
้
ื
ค่อนข้างผลรุนแรงกว่าอีก 3 isolates

isolate Colony form isolate Colony form
A B
ภาพที่ 4 Xanthomonas/Pantoea
C D isolates ที่ใช้ในการปลูกเชื้อในตัวอย่างอ้อย
ชุดที่ 2-2561 และต้นอ้อยอายุ 2 เดือนที่ใช้
ในการทดสอบการปลูกเชื้อ

E

404



้

การปลูกเชื้อแบคทีเรียจานวน 5 ไอโซเลตที่เพาะแยกได้ใหม่จากอ้อยที่มีอาการของโรคคลายใบลวก
ั
ี
ได้กลุ่มโคโลนีสเหลืองจ านวน 5 isolates น ามาทดสอบบนต้นอ้อยที่มีเชื้อโรคใบขาวด้วยวิธีการตดใบ ใช้ต้น
อ้อยพันธุ์ KK3 อายุ 2 เดือน จ านวน 60 ต้น (ภาพที่ 5) เก็บตัวอย่างใบไปตรวจวิเคราะห์โรคใบขาวก่อนการ
ื้
ู
ื้
ื้
่
ี
เพาะเชอ โดยวิธี PCR และปลกเชอ พบว่ามีผลการตรวจปริมาณเชอตงแต <0.5- 10 copy/ul ในดเอ็นเอ
ั้
พืช 25 นาโนกรัม (ภาคผนวก ตารางที่ 1) โดยท าการปลูกเชื้อ (inoculation) ดังนี้
ท าการปลูกเชื้อโดยการตดใบอ้อยทั้งหมด 60 ต้น โดยให้รหัส
ั
W1 – W10 : CONTROL
A1 – A10 : ปลูกเชื้อ ISOLATE A
B1 – B10 : ปลูกเชื้อ ISOLATE B

A1 – A10 : ปลูกเชื้อ ISOLATE C
A1 – A10 : ปลูกเชื้อ ISOLATE D

A1 – A10 : ปลูกเชื้อ ISOLATE E
การบันทึกผลการทดสอบทุก 1 สัปดาห์หลังการปลูกเชื้อ เป็นเวลา 2 เดือน

โดยการประเมินโรค 5 ระดับ ตามวิธีของ Andres Felipe Gutierrez Viveros

1 = ไม่ปรากฏอาการ
3 = ปรากฏอาการ 1-2 ขีดเหลือง

5 = ปรากฏอาการ 2 ขีดเหลือง

7 = ปรากฏอาการเนื้อเยื่อตาย
9 = ต้นตาย






















ั
ื
ภาพที่ 5 เชื้อแบคทเรียกลุ่มโคโลนีสเหลอง 5 ไอโซเลต ใน Nutrient Agar (NA) และต้นอ้อยตัดใบหลงการ
ี
ี
ปลูกเชื้อ

ผลการทดลองพบว่า isolate A และ B มีความรุนแรงกว่าอีก 3 isolates โดยพบว่าสามารถท าลาย
เนื้อเยื่อใบอ้อยได้ถึงระดับที่ 7 ส่วน isolate C, D และ E ท าลายได้ถึงระดับ 5 เท่านั้น เมื่อท าการตรวจสอบ

ุ่
หลังการปลูกเชื้อ 4 สัปดาห์ (ภาคผนวก ภาพที่ 1) ผลการตรวจเชอโรคใบขาวในต้นททดสอบพบว่าในกลม
ื้
ี่

405



ั
ี
ื้
ั
ี
ี
ควบคุม ไม่มีการปลูกเชอ มีเชื้อมีเชื้อเพิ่มขึ้นจากระดบสเขยวเป็นสเหลือง ส่วนใหญ่อยู่ในระดบน้อยกว่า 1-
10 copies/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม ที่ 4 สัปดาห์หลังการปลูก ส่วนในกลุ่มที่ทดสอบพบว่ามีปริมาณ
ุ่
ี
ื้
่
ี่
้
ี
เชอใบขาวเพิ่มขี้นเมื่อเทยบจากการเปลยนระดบส ไดแก่ กลม A, C และ E แตพบว่ากลมททดสอบกับ
ี่
ั
ุ่
ั
ี
ื้
ื้
isolate B และ D มีแนวโน้มของเชอลดลงหรือคงตว พิจารณาจากรหัสสปริมาณเชอ (ภาคผนวก ตารางที่
ื้
ื้
ี่
ื้
1) ซึ่งอาจเกิดจากผลของเชอทปลูกมีต่อการเพิ่มปริมาณของเชอใบขาว หรือการเกิดเชอซ้ าซ้อนของทั้งสอง
เชื้อท าให้พืชแสดงอาการใบขาวได้มากขึ้นเนื่องจากพืชอ่อนแอลง ทงนี้กลุ่มควบคุมที่ใช้เกือบทุกต้นมีปริมาณ
ั้
ี่
ั

ื้
ื้
้
เชอใบขาวตาไม่มีการเพิ่มปริมาณเชอในระยะเวลา 4 สปดาห์ การทดสอบซ้ าโดยให้มีจานวนตนทมากขึ้น
่
ี
ท าการปลูกเชื้อแบคทีเรียกลุ่มที่มีโคโลนีสเหลือง 6 ไอโซเลต ที่ได้จากการแยกเชื้อใหม่ ทดสอบบนต้นอ้อยท ี่

ื้
มีเชอโรคใบขาวซ้ า อายุ 2 เดอน จานวน 70 ตน พบว่ามี 3 ไอโซเลตมีความรุนแรงของเชออยู่ในระดบ 5
ั
ื้
้
ื
ทั้งนี้ยังไม่ได้ท าการวิเคราะห์ผลปริมาณเชื้อใบขาว (ภาพที่ 6)

ุ่
ื
ี
ื
ื้

ภาพที่ 6 ความรุนแรงของเชอกลมโคโลนีสเหลองไอโซเลท F (ซ้าย)ในการทาลายใบอ้อยอายุ 2 เดอนท ี่
ี
ทดสอบการปลกเชอด้วนวิธีตดใบ ประเมินเมื่อ 4 สปดาห์หลงการปลูกเชอ เปรียบเทยบกับกลุ่ม
ั
ื้
ั
ื้
ั
ู
ควบคุม (ขวา)

สรุปผลการทดลองและข้อเสนอแนะ :
่
่
ื้
การสารวจเชอสาเหตโรคในอ้อยในสภาพไร่พบว่าสวนใหญ่ไม่มีผลตอการเกิดโรคใบขาว แตเชอใน

่
ื้
ุ
ุ่
ุ่
ี
ี่
ี


ื
้
กลมททาให้เกิดอาการคลายใบลวก ซึ่งจากการเพาะแยกจะไดกลมแบคทเรียโคโลนีสเหลอง เมื่อทาการ
้
ทดสอบพบการเข้าทาลายใบไดเร็วและรุนแรงในบางไอโซเลท จากการทดสอบในระยะเวลา 4 สปดาห์ของ
ั
้

่
่
การเข้าทาลาย สามารถตรวจพบผลในทางลบตอการเพิ่มปริมาณเชอไฟโตพลาสมา แตทงนี้การทดสอบใน
ั้
ื้


้
ี่
ี
จ านวนต้นที่มากขึ้นจะทาให้ไดข้อมูลทชัดเจนมากขึ้น กลุ่มเชื้อแบคทเรียโคโลนีสเหลืองในการทดลองนี้ จาก
ี
ื้

ั
การตรวจดวยการวิเคราะห์ลาดบนิวคลโอไทด พบว่าเป็นกลม Pantoea sp ไม่สามารถเพาะแยกเชอ
้
ิ
ุ่
์
ุ่
Xanthomonas sp. ตองใชอาหาร selective การเพาะดวยอาหาร PDA และ NA ทาให้เชอในกลม

ื้
้
้
้
Panthoea spp. ที่เจริญเติบโตได้เร็วกว่าเกิดขึ้นแทนที่ ท าให้การทดลองไม่เป็นไปตามเป้าหมาย ที่ต้องการ
ทดสอบเชื้อ Xanthomonas แม้ได้จากใบที่แสดงอาการคล้ายใบลวก อย่างไรก็ตามในการทดลองนี้ตัวอย่าง

406



้

ู
ที่ใช้ในการปลกเชื้อมีจ านวนจากัดเนื่องจากต้องใชท่อนพันธุ์ที่มีโรคใบขาว ดังนั้นการทดสอบโดยเทคนิคการ
ื้
ั
ใช้การปลูกเชอในห้องปฏิบติการที่รวดเร็ว การใช้เทคนิค detach leaf, leaf disc รวมถึงการใชเทคนิคการ
้
เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จะท าให้ได้ผลที่แม่นย ามากยิ่งขึ้น
การน าผลงานวิจัยไปใช้ประโยชน์
่
อยู่ระหว่างการจดเตรียมข้อมูลเพื่อการเผยแพร่ ตอยอดวิธีการและผลการทดลองในโครงการปี
ั
2565-2567 ของสถาบันวิจัยพืชไร่ฯ

ค าขอบคุณ

ขอขอบคุณผู้ช่วยวิจัยที่ช่วยปฏิบัติการทดลอง ทดสอบอ้อยตามแผนงานทดลอง ขอขอบคุณคุณปิยะ

้
ั
ิ์
ิ

ื้
ุ
ุ
รัตน์ จงพล คณรวีวรรณ เชอกิตตศกด คณภาคภูมิ ถิ่นคา ทเอื้อเฟื้อตนอ้อยเพื่อการทดสอบ ขอขอบคณ
ั
ี่
ุ
ั
อ.ทักษิณา ศันสยะวิชัย ผชช.วีระพล พลรักดี ที่ให้ค าปรึกษาด้านพันธุ์ และให้ตวอย่างในการทดสอบ

เอกสารอ้างอิง
McMaugh, T. 2008. Guidelines for Plant Pest Surveillance in Asia and the Pacific. ACIAR
Monograph. No. 119 c
Sakuanrungsirikul, S., Wongwarat, T., Sankot, S., Kawabe, K., Kobori, Y. and Ando, S. 2013.
Sugarcane white leaf and sugarcane grassy shoot diseases in Thailand and their detection
methods. Proceedings of International Society Sugar Cane Technology., 28: 1-11.
Shapiro, L.R., L. Salvaudon, K. E. Mauck, H. Pulido, C.M. De Moraes, A. G. Stephenson, M. C.

Mescher. 0 1 3 . Disease interactions in a shared host plant: effects of pre-existing viral
2
infection on cucurbit plant defense responses and resistance to bacterial wilt disease.
PLoS ONE 8(10): e77393. doi:10.1371/journal.pone. 0077393

Thongwai N. and J. Kunopakarn. 2007. Growth inhibition of Ralstonia solanacearum PT1J by
antagonistic bacteria isolated from soils in the northern part of Thailand. Chiang Mai J.
Sci. 2007; 34(3) : 345-354

407



ภาคผนวก


A B























C D





















E




















ี่
ภาพที่ 1 การท าลายของเชื้อแบคทีเรียกลุ่มโคโลนีสีเหลืองทใบอ้อยในต้นที่ทดสอบการปลูกเชื้อ isolate A,
B, C, D และ E Control ใช้น้ ากลั่น

408



้
ื้
ตารางที่ 1 ปริมาณเชอโรคใบขาวตรวจดวย nested-PCR ทใช้ยีนเป้าหมาย 16S rDNA และ secA ในใบอ้อย
ี่
ก่อนและหลังการปลูกเชอแบคทีเรียกล มโคโลนีสเหลือง 5 ไอโซเลต
ี
ื้
ุ่
PCR Product ปริมาณเชื อ copy/ul in 25 ng plant ระดับความรุนแรงของ
DNA โรคที่สัปดาห์ 4**
Isolate/ต้น
isolate Nested-PCR SecA
ที่ ก่อนการปลูก หลังการปลูกเชื อ 4
700 210 275 เชื อ* สัปดาห์ 1 3 5 7 9
bp bp bp
A A1 +/- +/- <10 <0.5

A2 - +/- +/- 10 <0.5
A3 - +/- +/- >0.5 <0.5
A4 - 1+ +/- >0.5 >0.5
A5 1+ 4+ 3+ <10 10
A6 - 4+ +/- >0.5 <10
A7 - 4+ +/- >0.5 <10
A8 - 2+ +/- <10 >0.5
A9 0.5+ 4+ 1+ >0.5 10
A10 - +/- +/- >0.5 <0.5

B B1 - +/- +/- <10 <0.5
B2 - +/- 2+ >0.5 >0.5

B3 - 2+ 4+ <10 <10
B4 - 4+ 4+ 10 <10
B5 - 4+ <0.5+ >0.5 <10
B6 - 4+ <0.5+ >0.5 <10
B7 - 4+ +/- >0.5 <10
B8 - 4+ +/- >0.5 <10
B9 - 0.5+ +/- >0.5 >0.5
B10 - +/- +/- >0.5 <0.5
C C1 - +/- +/- >0.5 <0.5

C2 - 2+ 4+ 10 >0.5
C3 - +/- 2+ <10 >0.5
C4 - +/- 1+ >0.5 >0.5
C5 0.5+ 4+ 4+ >0.5 10
C6 2+ 4+ 4+ <10 100
C7 - 4+ +/- >0.5 <10
C8 - +/- +/- 10 <0.5
C9 2+ 3+ 2+ 10 100
C10 2+ 3+ 2+ <10 100

D1 - +/- 0.5+ >0.5 <0.5
D
D2 - +/- 1+ >0.5 <0.5

D3 - +/- 1+ <0.5 <0.5
D4 - 4+ 4+ >0.5 <10
D5 - +/- ? >0.5 <0.5

409



PCR Product ปริมาณเชื อ copy/ul in 25 ng plant ระดับความรุนแรงของ
DNA โรคที่สัปดาห์ 4**
Isolate/ต้น
isolate Nested-PCR SecA
ที่ ก่อนการปลูก หลังการปลูกเชื อ 4
700 210 275 เชื อ* สัปดาห์ 1 3 5 7 9
bp bp bp
D6 - 4+ <0.5+ >0.5 <10
D7 - 4+ <0.5+ >0.5 <10
D8 - 1+ <0.5+ 10 >0.5
D9 - 4+ <0.5+ >0.5 <10

D10 - 4+ +/- >0.5 <10
E E1 - 2+ 1+? 10 >0.5

E2 - +/- 0.5+ >0.5 >0.5
E3 - 2+ 4+ >0.5 >0.5
E4 - 4+ 2+ 100 <10
E5 2+ 4+ 4+ <10 100
E6 - 1+? ? <10 >0.5
E7 1+ 4+ 4+ <10 10
E8 - +/- +/- >0.5 <0.5
E9 - 4+ +/- >0.5 <10
E10 2+ 2+ 2+ >0.5 100

W1 ? 2+ 4+ 10 100?
W2 - +/- +/- >0.5 <0.5
W3 - +/- +/- >0.5 <0.5
W4 - 4+ 1+ >0.5 <10

control W5 - 4+ 2+ >0.5 <10
W6 - 3+ +/- >0.5 1
W7 - 4+ +/- >0.5 <10
W8 - 4+ +/- >0.5 <10
W9 - 4+ 0.5+ >0.5 <10
W10 - <0.5+ +/- >0.5 <0.5
positive ใบขาว ++++ + +

410



ี
การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่และวิธการตรวจเชื อโรคใบขาวด้วยเทคนิค M13-tagged
two steps- PCR ที่แม่นย าและมีความไวสูง

A new molecular marker and efficient M13-tagged two steps- PCR detection

technique for sugarcane white leaf disease


ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วีรกรณ์ แสงไสย เบญจวรรณ รัตวัต จุฑามาศ สอนเมือง
1
1
1
์
1
1
และรวีวรรณ เชื้อกิตติศักด
ิ์

รายงานความก้าวหน้า

ในงานวิจยนี้ ไดทาการพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่ สาหรับใชในการตรวจโรคใบขาวอ้อยดวย
้

้
ั
้
เทคนิค M13-tagged two-steps-PCR และเครื่องหมายโมเลกุลในการตรวจยีน Immunodominant
ั้
protein (IMP) รวมทงมีการทดลองพัฒนาเทคนิคอื่นเพิ่มเตมทง่ายและรวดเร็ว ไดแก่ Loop-Mediated
ี่
ิ
้
isothermal amplification (LAMP) และ multiplex PCR เพื่อการทดสอบเบื้องตน ในการพัฒนาวิธีการ
้

้
ตรวจเชอโรคใบขาวดวยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR ไดพัฒนาไพร์เมอร์ชนิดใหม่ในตาแหน่ง
้
ื้
16S rRNA และ 23S rRNA ของเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย ทดสอบสภาวะในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยการ
ี
ี่
ั
ปรับความเข้มข้นของไพร์เมอร์ และจ านวนรอบในการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ สามารถพัฒนาวิธีการทตรวจจบ

ู่
แถบดีเอ็นเอเป้าหมายได้ชัดเจนจานวน 2 แถบ ขนาดประมาณ 600 และ 300 คเบส ผลการเปรียบเทียบกับ
วิธี nested-PCR พบว่ามีความจาเพาะตอดเอ็นเอเป้าหมายไดมากกว่า การตรวจพิสจน์แถบดเอ็นเอทได ้
ี
ี่
่
ี
้

ู
พบว่า ตรงกับต าแหน่งของยีนเป้าหมายของเชื้อไฟโตพลาสมา การทดสอบในตัวอย่างที่ติดเชื้อหลายชนิด ยัง
พบแถบดีเอ็นเอเพิ่มขึ้น 1 ต าแหน่ง อยู่ระหว่างการวิเคราะห์และแก้ไขวิธีการ การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล
ใหม่ด้วยยีน Imp ท าการทดสอบไพร์เมอร์จ านวน 3 คู่ไพร์เมอร์ และคัดเลือกได้ 1 คู่ (Imp1) ผลผลิตมีขนาด
1250 คู่เบส น ามาตรวจล าดับเบส และออกแบบไพร์เมอร์ใหม่ จ านวน 1 คู่ ผลผลิตขนาด 800 คู่เบส (Imp2)
ั้
น ามาตรวจในอ้อยทตดเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด พบว่าสามารถตรวจพบดเอ็นเอชดเจน และมี
ี่
ั
ื้
ี
ิ
ความจ าเพาะต่อเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย น าผลวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอขนาดประมาณ 800
ี

เบสที่ได้มา เปรียบเทียบกับลาดับนิวคลโอไทดที่มีอยู่ในฐานข้อมูลสากล พบว่ามีความเหมือนกับโปรตีนของ
์

ี่
้
เชอไฟโตพลาสมาในอ้อย 80 เปอร์เซ็นต ทาการออกแบบไพรเมอร์ (Imp 3) ทมีความจาเพาะเพื่อใชในการ
ื้
์


้
ู่
ตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด จากขนาด 800 คเบส ให้ไดดเอ็นเอขนาด 310 คเบส น าไปทาการ
ี
ั้
ื้
ู่
ทดสอบตรวจเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด พบว่าสามารถตรวจจบดเอ็นเอของเชอไฟโตพลาสมาในอ้อยได ้
ั
ื้
ี
ั้
ื้
ี
ผลการตรวจล าดับนิวคลิโอไทด์ของดเอ็นเอ 310 คู่เบสนี้ พบว่าเป็นโปรตีนของไฟโตพลาสมาในอ้อย ที่ความ
่
่
์
ั

เหมือนระดบ 80 เปอร์เซ็นต การจาแนกความแตกตางของ Imp ของเชอทง 3 ชนิดพบว่ามีความแตกตาง
ั้
ื้
ี่
กัน โดยพบว่า SCWL และ SCGS มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกันมากทสด มีค่าความต่างกันที่ 1.64 และตัวอย่าง
ุ
ั
จาก SCGGS และ SCWL มี ความสมพันธ์ทแตกตางกันมากทสด ซึ่งมีคาความตางกันท 4.82 การ
่
ี่
ุ
่
ี่
ี่
่

1 ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน

411



ด าเนินงานต่อยอดได้มีการพัฒนาชุดไพร์เมอร์ชนิด multiplex – PCR จากยีน 16S rDNA สามารถแยกชนิด

ั
ิ
ี่
ั้
ของ phytoplasma genes ในใบขาวของอ้อยทง 3 ชนิดไดอย่างชดเจน มีขนาดผลผลตอยู่ท 322, 262
้
ื้
้
และ 136 bp การพัฒนาวิธีตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยดวยไพรเมอร์ Multiplex โดยใช ้
ุ
ี่
้
้
ื้
เทคนิค HRM สามารถแยกเชอไฟโตพลาสมาดวยชดไพรเมอร์ Multiplex ทประกอบดวย (SCWL, SCGS,
SCGS) ได้ด้วย Tm ต่างกัน เชื้อใบขาว SCWL Tm 77.48 ºC เชื้อใบขาวปนเขียว SCGS Tm 75.53 ºC ละ
้
เชอใบเขียว SCGS Tm 79.13 ºC และการทดลองเบื้องตนดวยการพัฒนาวิธี (LAMP) ทาการออกแบบไพร์
ื้
้

ี่
เมอร์ ส าหรับวิธี LAMP จากส่วนของยีน groEL ของ phytoplasma ศกษาสภาวะทเหมาะสมของปฏิกิริยา
ึ
ื
LAMP พบว่าสามารถตรวจเช้อไฟโตพลาสมาในตัวอย่างได้อย่างชัดเจน ใช้เวลาในการตรวจ 60 นาที มี
ผลตรวจเป็นแบบ realtime การทดสอบความไว (Sensitivity) ของ LAMP เทียบกับวิธี nested-PCR พบว่า
ั
ระดบความเข้มข้นของปริมาณดเอ็นเอของเชอไฟโตพลาสมาทสามารถตรวจดวยเทคนิค LAMP ตรวจจบด ี
ื้
ี่
ี
ั
้
ุ
่
2
-1
้
ิ
ี่
่
ี่
เอ็นเอไดตาสด 1.27X10 copy/µl สวน nested-PCR ทผลผลตขนาด 700 bp ตรวจไดท 2.66X10
้
copies/µl การตรวจความจ าเพาะของวิธีการต่อเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อยทดสอบโดยใชดีเอ็นเอจากพืชอื่นท ี่
้
ี่
้
ั
้

ื้
ิ
ตดเชอไฟโตพลาสมาชนิดอื่น ไดแก่ มันสาปะหลงตดเชอโรคพุ่มแจ และหญ้าทแสดงอาการใบพบว่าไม่
ื้
ิ
้
ุ
่
ื้
ื้
ั
สามารถตรวจเชอดงกลาวไดดวยวิธี LAMP ในการตรวจความครอบคลมในการตรวจเชอไฟโตพลาสมาของ
้
อ้อย ทดสอบโดยใช้ดีเอ็นเอที่ไดจากอ้อยทติดเชื้อ SCWL, SCGS และ SCGGS ที่ท าการตรวจพิสูจน์ชนิดของ
ี่
้
ื้
ุ
้
ื้
์
ั

ั
เชอแลวดวยการตรวจลาดบนิวคลโอไทด พบว่าชดไพร์เมอร์นี้สามารถตรวจจบเชอทงสามชนิดนี้ได โดย
้
้
ั้
ิ
ั้
ั
้
่
ี่

วิธีการทง 2 วิธีการใหม่นี้มีศกยภาพทจะน ามาพัฒนาตอสาหรับการใชในการตรวจคดกรองโรคใบขาวใน
ั
ั
ระดบแปลงทดลองหรือสภาพไร่ ในขณะทเทคนิค M13 two-steps PCR จะถูกน ามาใชทดแทนเทคนิค
ี่
้
nested-PCR เพื่อให้ย่นระยะเวลาและงบประมาณในการตรวจและเป็นการตรวจเพื่อการคดกรองโรค
ั

สาหรับการขยายพันธุ์ดวยการเพาะเลยงเนื้อเยื่อ สวนการตรวจยีน Imp จะถูกน ามาใชในการตรวจแมลง
้
ี้
้
่
พาหะและพืชอาศัยที่ต้องใช้วิธีการตรวจมีความจ าเพาะมากขึ้น

ค าน า
ุ
ิ
ุ

การควบคมการแพร่ระบาดของโรคใบขาวในปัจจบันยังไม่มีประสทธิภาพ ทาให้ประเทศไทยยังไม่
สามารถควบคุมการแพร่ระบาดของโรคนี้ได้ สาเหตุหนึ่งเกิดจากการตรวจคัดกรองโรคที่ไม่ทั่วถึง หน่วยตรวจ
ั

คดกรองโรคมีจานวนจากัด ซึ่งมีสาเหตมาจากวิธีการทใชในการตรวจโรคปัจจบันยังมีความยุ่งยาก ซับซ้อน
ุ
ุ

้
ี่
ราคาแพง ต้องใช้ผู้ช านาญงาน การพัฒนาเทคนิคการตรวจคัดกรองโรคที่มีประสิทธิภาพ ใช้งานง่าย ราคาไม่
ี่
ิ
ุ

แพง จะทาให้สามารถเพิ่มหน่วยตรวจโรคในพื้นทไดมากขึ้น ซึงจะสงผลตอประสทธิภาพในการควบคมการ
่
่
้
้
้
ุ
์
ระบาดไดทันการณ สามารถลดพื้นทการระบาดลงได การตรวจวินิจฉัยโรคใบขาวที่มีใชอยู่ในปัจจบัน มีการ
้
ี่

พัฒนาขึ้นมามาก ทาให้ผใชสามารถเข้าใจผลการตรวจมากขึ้น มีการน าผลการตรวจไปปรับใชกับงานวิจย
ู้
ั
้
้

และพัฒนาอื่นได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น (ศุจิรัตน์ และคณะ, 2558) แต่ยังมีปัญหาของความจากัดด้านเทคนิคทใช ้
ี่
ื้
ุ
ุ
ื้
เนื่องจากเชอไฟโตพลาสมาสาเหตของโรคใบขาวหรือเชอไฟโตพลาสมาสาเหตของโรคในพืชอื่นนั้น
ื้
มีปริมาณน้อยในเซลลพืช รวมทงยังไม่สามารถเพาะเลยงเชอนี้เพื่อขยายปริมาณในอาหารสงเคราะห์ได ้
ี้
ั้
์
ั

412



ั
ี่
ึ
้
ู
้
ดงนั้นการตรวจเชอจงตองตรวจจากเนื้อเยื่อพืช และวิธีตรวจตองเป็นวิธีทมีความแม่นย า และมีความไวสง
ื้
ื้
้
ื้
ุ
สามารถตรวจเชอในปริมาณตามากได ในปัจจบันการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาในเนื้อเยื่อพืชนิยมใชวิธี
้
่
nested-PCR หรือ semi-nested-PCR ซึ่งเป็นวิธีการทตองทาปฏิกิริยาพีซีอาร์เพื่อเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ
ี
ี่
้

้
เป้าหมายให้มากขึ้นถึง 2 ครั้ง แต่ละครั้งมีการใชเครื่องหมายโมเลกุลอย่างละชดแตกต่างกัน ปัญหาที่สาคญ
ุ
ั

ของเทคนิคดงกลาวนี้ คอ การปนเปื้อนชนิด carried-over ซึ่งเกิดจากการปนเปื้อนทเกิดขึ้นในพีซีอาร์ชุดท ี่
่
ื
ั
ี่
หนึ่ง แลวถูกมาขยายเพิ่มปริมาณอีกในพีซีอาร์ชดทสอง ทาให้เกิดการแปลผลทผดพลาด ทมักเป็นชนิด
ี่

้
ี่
ิ
ุ
ี่
้
ี่
ี่
“ผลบวกปลอม” (false positive) นอกจากนี้ยังเป็นปัญหาในเรื่องของเวลาทตองใชในการตรวจผลทอาจ
้
้
ั
ึ
ั
้
้
้
ตองใชเวลานานกว่า 1 สปดาห์อีกดวย ดงนั้นจงมีการน าเทคนิค Realtime PCR มาใชในการตรวจผลแทน
การใช้ Conventional PCR ท าให้ติดตามผลการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ตามปฏิกิริยาทเกิดขึ้นจริงในขณะนั้น
ี่
้
สามารถรู้ผลไดภายในหนึ่งวัน แม้เป็นเครื่องมือทมีประสทธิภาพในดานการย่นเวลาการตรวจผล แต ่
ิ
ี่
้
ประสิทธิภาพด้านความไวของเครื่องมือเทียบเท่ากับเทคนิคอิเลคโตรโฟริซิส (ศุจิรัตน์ และคณะ, 2558) และ
ปัญหาที่ส าคัญของวิธีการนี้คือเครื่องมือที่ใช้ราคาแพงมาก รวมไปถึงชุดน้ ายา และอุปกรณ์ประกอบอื่นที่ต้อง
เฉพาะส าหรับเครื่องและรุ่นของเครื่องมือนั้นๆ ท าให้จ ากัดเฉพาะกลุ่มห้องปฏิบัติการที่มีงบประมาณเพียงพอ
ู้
ึ
่

ี่
้
ู้
ั้
เทานั้น อีกทงผใชงานยังจากัดเฉพาะผทมีความช านาญกับการใชเครื่องมือนี้เทานั้น จงมีความจากัดมากขึ้น

้
่
ุ
ั

ี่
ึ
ไปอีก จงเป็นสาเหตสาคญททาให้การตรวจโรคใบขาวไม่เป็นทแพร่หลายและ มีหน่วยตรวจคดกรองโรคใบ
ี่
ั

ขาวจ านวนน้อยมากในประเทศไทย ไม่เพียงพอต่อการคัดกรองยับยั้งการระบาดของโรค
้
ื
ยีนเป้าหมายทนิยมใชในการตรวจเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยและไฟโตพลาสมาชนิดอื่น คอ
ื้
ี่
ี
ื้
้
่

้
ยีน 16S-23S rDNA ซึ่งนิยมใชในการตรวจจาแนกเชอแบคทเรียหลายชนิดดวยเชนกัน มีรายงานการใช ้
เครื่องหมายโมเลกุลหลายชนิดในการตรวจจับบริเวณต าแหน่งยีนนี้ ในจ านวนนี้ มีรายงานการออกแบบไพร
ุ
้
1
เมอร์ชด MLO-X/ MLO-Y และ P / P2 สาหรับใชตรวจโรคใบขาวอ้อยดวยเทคนิค nested-PCR

้
(Hanboonsong, 2006) แม้มีรายงานว่าเครื่องหมายโมเลกุลชดนี้มีความจาเพาะตอโรคใบขาวอ้อย แตผล
่
่

ุ
้
ี
้
้
ึ
ึ
ุ
ื้
จากการศกษาพบว่าเครื่องหมายโมเลกุลชดนี้สามารถตรวจพบเชอแบคทเรียชนิดอื่นไดดวย จงไดพัฒนา
เครื่องหมายโมเลกุลชุดใหม่ ที่มีความจ าเพาะต่อการตรวจจับยีน secA ของเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อย
(ศุจิรัตน์ และคณะ, 2556) และน ามาใช้ในการตรวจโรคใบขาวอ้อยร่วมกับการตรวจยีน 16S-23S rDNA แต ่
เนื่องจากวิธีการตรวจยีน secA ที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้ ใช้เทคนิค PCR ซึ่งใช้ปฏิกิริยาพีซีอาร์เพียงครั้งเดียว จึงท า
ให้มีความไวน้อยกว่าการตรวจดวย nested-PCR ซึ่งมีการทาปฏิกิริยาพีซีอาร์ถึง 2 ครั้ง แตลดปัญหาการ
่

้
ุ
ปนเปื้อน และเพิ่มความแม่นย ามากขึ้น การตรวจโรคใบขาวของอ้อยของศนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น ปัจจบันมี
ู
การตรวจยีนทั้ง 2 ต าแหน่งด้วยทั้ง 2 วิธีการ เพื่อการยืนยันผล ซึ่งใช้เวลาในการตรวจประมาณ 1 สัปดาห์จึง
์
ั
้
ั

้
จะรู้ผลได หากมีตวอย่างเป็นจานวนมาก จะใชเวลานานยิ่งขึ้นไปอีก ดงนั้นวัตถุประสงคในงานวิจัยนี้ได้แก่
การพัฒนาวิธีการตรวจโรคใบขาวใหม่ ด้วยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR ที่มีความแม่นย า มีความ
้
้
ื้
ี่
ี่
ไวสง ใชงานง่าย ราคาไม่แพง สาหรับการใชงานทตองการความไวในการตรวจเชอทสง สามารถตรวจเชอ
ื้
ู

้
ู
้
ี่

่

ปริมาณตามากไดในเวลาทรวดเร็ว สาหรับทดแทนวิธี nested-PCR เดม และเครื่องหมายโมเลกุลสาหรับ
ิ

413



ี่
้
ั้
้
การตรวจหายีนเป้าหมายใหม่ทสามารถน ามาใชยืนยันผลการตรวจ รวมทงสามารถตรวจใชวิเคราะห์แมลง
พาหะและพืชอาศัยของเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยทั้ง 3 ชนิดได ้

วิธีด าเนินการและอุปกรณ์

สิ่งที่ใช้ในการทดลอง
ต้นอ้อยที่แสดงอาการและไม่แสดงอาการโรคใบขาว

แบบและวิธีการทดลอง: -
วิธีปฏิบัติการทดลอง

ขั นตอนที่ 1 พัฒนาวิธีการตรวจเชื้อโรคใบขาวด้วยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR


วิธีการดาเนินการทดลอง ออกแบบไพรเมอร์ชนิดใหม่ โดยประยุกตใช M13 ร่วมกับไพร์เมอรื
์
้
เป้าหมาย ทดสอบการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอดวยเทคนิค two steps PCR วิเคราะห์หาสภาวะทเหมาะสม
้
ี
ี่
ตรวจผลการทดสอบดวยเทคนิคอิเลคโตรโฟริซีส ตรวจพิสจน์ชนดเอ็นเอทไดดวยการวิเคราะห์ลาดบเบส
้
ี
ิ้

้
ั
้
ี่
ู
ตรวจความจ าเพาะของเครื่องหมายโมเลกุลด้วยการทดสอบกับดีเอ็นเอของตัวอย่างใบอ้อยที่มีอาการ SCWL,
้
SCGS และ SCGGS ทตรวจพิสจน์ชนิดของเชอแลว ตรวจวิเคราะห์ลาดบเบสของชนดเอ็นเอทไดจากการ
ี่
ี่
้
ั
ื้

ู
ี
ิ้
ี่
้
้
ื้
ี
ู
ี
ิ้
ตรวจดวยเชอทง 3 ชนิด ตรวจความไวของวิธีการดวยการเจอจางพลาสมิดดเอ็นเอลกผสมทมีชนดเอ็นเอ
ั้
ื
ี่
ิ
ี
ั
้
เป้าหมาย ทดสอบความใชไดของวิธีการในตวอย่างพืชทตดเชื้อใบขาวในแปลง เปรียบเทยบกับวิธี nested-
้
้
้
ี่
PCR ที่ใช้ยีนเป้าหมาย 16S-23S rDNA ทดสอบปริมาณความเขมข้นของยีนทต่ าทสุดทสามารถตรวจไดดวย
ี่
้
ี่
วิธีที่พัฒนาขึ้น
ขั นตอนที่ 2 การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่ที่ตรวจจับเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อย
วิธีด าเนินการทดลอง สืบค้นข้อมูลลาดบเบสของยีน imp ของเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตุโรคในอ้อย

ั
และพืชอื่น ทมีรายงานในฐานข้อมูลสากล (NCBI) เปรียบเทยบข้อมูลลาดบเบส ออกแบบชดไพร์เมอร์ท ี่
ั

ุ
ี
ี่
จ าเพาะต่อการตรวจจับยีน imp ทดสอบสภาวะในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของยีน imp ตรวจผลการทดสอบ
ี

ด้วยเทคนิคอิเลคโตรโฟริซีส ตรวจพิสูจน์ชิ้นดเอ็นเอที่ไดด้วยการวิเคราะห์ลาดับเบส ตรวจความจ าเพาะของ
้
เครื่องหมายโมเลกุลด้วยการทดสอบกับดีเอ็นเอของตัวอย่างใบอ้อยที่มีอาการ SCWL, SCGS และ SCGGS ท ี่

้
ตรวจพิสจน์ชนิดของเชอแลว ตรวจวิเคราะห์ลาดบเบสของชนดเอ็นเอทไดจากการตรวจดวยเชอทง 3 ชนิด
ู
ื้
ี
ิ้
ื้
ั
้
้
ั้
ี่

์
วิเคราะห์ความแตกต่างของลาดับนิวคลิโอไทดที่ได้ หาต าแหน่งแปรปรวน ตรวจความไวของวิธีการด้วยการ
เจือจางพลาสมิดดเอ็นเอลูกผสมทมีชิ้นดีเอ็นเอเป้าหมาย Imp ทดสอบความใช้ไดของวิธีการในตัวอย่างพืชท ี่
ี
ี่
้
ติดเชื้อใบขาวในแปลง เปรียบเทียบกับวิธี nested-PCR ที่ใช้ยีนเป้าหมาย 16S-23S rDNA
การบันทึกข้อมูล
ลาดบนิวคลโอไทดของยีนเป้าหมาย ขนาดความยาวของชนดเอเอทได้จากการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ
ี
ี่

ิ
ี
ิ้
์
ั
้
ด้วยไพร์เมอร์ที่ออกแบบได สภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณยีน ความไวของวิธีการ ความจ าเพาะของวิธีการ
สถานที่ทดลอง ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น
ระยะเวลา ตุลาคม 2561 - กันยายน 2564

414



ผลการทดลองและวิจารณ์

การพัฒนาวิธีการตรวจเชื อโรคใบขาวด้วยเทคนิค M13-tagged two steps- PCR
ี่
ั่
จุดเดนของเทคนิค nested PCR ทต่างจาก PCR ทวไป คือเป็นการเพิ่มความไว (sensitivity) และ
่
ความจ าเพาะ (specificity) ในการเพิ่มจ านวนและการตรวจสอบดีเอ็นเอบริเวณที่ต้องการศึกษา แต่มีปัญหา
ู

ี่
ู้
ี
ของระยะเวลา และการปนเปื้อนแบบ carried over สงมาก ในกรณทผดาเนินการไม่มีประสบการณ ์
ิ
ี่
เนื่องจากใชผลผลต PCR ทไดจากขั้นท 1 มาเพิ่มปริมาณตออีกในขั้นท 2 ดงนั้นการลดขั้นตอน PCR ลงให้
้
้
ั
่
ี่
ี่
ื
่
้
ึ
ี
เหลอขั้นเดยวจงเป็นแนวทางในการแก้ปัญหานี้ การออกแบบไพร์เมอร์ชนิดใหม่ไดน าสวนของ M13 มาใช ้
ื่
ิ

ิ

เชอมตดกับไพร์เมอร์เดม (MLO-X, MLO-Y และ P1, P2) ทาการออกแบบไพรเมอร์สาหรับ M13 ดวย
้
ื้
โปรแกรม Clustalx2 หลังจากนั้นท าการทดสอบปฏิกิริยาในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายเบองต้น โดย
ิ
่
สวนประกอบในปฏิกิริยาพีซีอาร์ 15 ไมโครลตรตอหนึ่งหน่วยตวอย่าง มีดงนี้ 1X PCR buffer A (500mM
่
ั
ั
KCl, 100mM Tris-HCl, 0.1% Triton™ X-100; Vivantis), 0.2 µM dNTP 1.5 U Taq DNA polymerase
(Vivantis) ไพรเมอร์ความเข้มข้น 0.5 µM สงเคราะห์ดเอ็นเอในเครื่องพีซีอาร์ ก าหนดการเปลยนแปลง
ั
ี่
ี
ี่
ี่
ี่
ี
ี่
ั
อุณหภูมิตามเวลาดงตอไปนี้ ขั้นท 1 ทอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 นาท ขั้นท 2 ทอุณหภูมิ 95
่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี
ี่

ี่
ี่

ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 2 จานวน 20 รอบ ขั้นท 3 ทอุณหภูมิ 95
ี
ี่
ี่
ี่
ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่

ี่
ี

ี
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 3 จานวน 20 รอบ ขั้นท 4 ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท และที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที แล้วท าการปรับเปลยน
สภาวะเพื่อให้ได้ผลผลิตพีซีอาร์ที่ชัดเจน
ี่
ี่
ผลการทดลองปรับเปลยนสภาวะในการทาปฏิกิริยาโดยปรับเปลยนความเข้มข้นของไพร์เมอร์

จ านวนรอบในการเพิ่มปริมาณและอุณหภูมิในการเกาะติดไพร์เมอร์ ด าเนินการจ านวน 10 แบบ พบว่าแบบ
ที่ท าให้ได้ดีเอ็นเอเป้าหมายที่ชัดเจน 2 ต าแหน่ง ที่ประมาณ 200 และ 500 คู่เบส และมีปฏิกิริยาและสภาวะ
ที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ คือแบบที่ 6 (ตารางที่ 1 และ ภาพที่ 1)

ตารางที่ 1 ส่วนประกอบและสภาวะในการท าปฏกิริยา M13-tagged two steps- PCR
ิ
สารเคม ี ปริมาตร (µL) ความเข้มข้นสุดท้าย PCR conditions
Nuclease-free water 6.6 -
10X Taq buffer 1.5 1X 94°C 3 min
25 mM MgCl 2 0.9 2 mM 94 °C 30 s
2.5 mMdNTP 1.2 0.2 mM 65 °C 30 s
10 µM PrimerF 0.15 0.1 µM 72 °C 40 s
10 µM PrimerR 0.15 0.1 µM  20 cycles
Taq DNA polymerase 0.3 1 U 94 °C 30 s
DNA template 3 75 ng 62 °C 30 s
Total 15 - 72 °C 40 s
 15 cycles

415





















ี
ภาพที่ 1 ตัวอย่างผลการสังเคราะห์ดเอ็นเอที่ได้จากการท าปฏิกิริยา M13-tagged two steps- PCR แบบที่
5, 6, 11 และ 12


ความจ าเพาะของวิธีการเทียบกับ nested-PCR

ิ
การทดสอบโดยใชตัวอย่างอ้อยจากแปลงที่ตรวจพบการตดเชื้ออื่นเมื่อตรวจโดยวิธี nested-PCR ท ี่
้

แสดงในลกษณะของแถบดเอ็นเอมากกว่าตาแหน่งดเอ็นเอเป้าหมาย ตาแหน่ง คอ 700 และ 210 คเบสท ี่
ี
ี
ู่
ื
ั

ี่
้
่
รบกวนการแปลผล แตเมื่อตรวจดวยวิธี M13-tagged two steps- PCR พบดเอ็นเอเป้าหมายทประมาณ
ี
200 และ 500 คู่เบส ไม่พบดีเอ็นเอรบกวนจากต าแหน่งอื่น ท าให้การอ่านผลท าได้ง่ายกว่า (ภาพที่ 2)
















ภาพที่ 2 เปรียบเทียบความจ าเพาะของวิธีการตรวจโรคใบขาวด้วย nested-PCR (ซ้าย) และ M13-tagged
two steps- PCR (ขวา) ในตัวอย่างใบอ้อยทเก็บจากแปลงทดลอง
ี่


ความถกตอง (accuracy) และความครอบคลุม (broad spectrum) ในการตรวจเชื อไฟโต
ู
้
พลาสมา
์
เมื่อน าชิ้นดีเอ็นเอที่ได้จากตัวอย่างที่เป็น SCWL และ SCGS ไปเปรียบเทียบล าดับนิวคลีโอไทดแบบ
multiple sequence alignment ด้วยโปรแกรม ClustalW พบว่าล าดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน 16s-



23s rDNA (N_1) จานวน 480 เบส (base) และ 16s-23s rDNA (N_2) จานวน 262 เบส (base) มีความ

เหมือนในฐานข้อมูล NICB ถึง 97 % และน าลาดบนิวคลโอไทดทวิเคราะห์ไดไปสร้างแผนภูมิความสัมพันธ์
ั
์
ี่
ี
้

416



ั
้
ทางพันธุกรรมดวยโปรแกรม MEGA รุ่น 7.0 จากนั้นสร้างแผนภูมิความสมพันธ์ทางพันธุกรรม 4 วิธี โดย
ทดสอบวิธีการจัดกลุ่มทุกวิธี คอ maximum likelihood, maximum parsimony, neighbor joining และ
ื
UPGMA แล้วเลือกวิธีการจัดกลุ่มที่ให้ผลการจ าแนกเป็น 2 กลุ่มใหญ่ (ภาพที่ 3)



SCGS


SCWL
SCGGS

SCWL




480 bp
262 bp






ภาพที่ 3 แผนภูมิความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของล าดับนิวคลิโอไทด์ของดีเอ็นเอที่ได้จากวิธี M13-tagged

two steps- PCR เปรียบเทียบกับข้อมูลสากลของ SCWL และ SCGS


การทดสอบความสามารถในการตรวจจับระดับปริมาณเชื อของวิธีการเทียบกับ nested-PCR
ิ
การทดสอบโดยใชตัวอย่างอ้อยจากแปลงที่ตรวจพบการตดเชื้ออื่นเมื่อตรวจโดยวิธี nested-PCR ท ี่
้

ี่
ี
ั
ู่
ั
ื้
แสดงในลกษณะของแถบดเอ็นเอทตาแหน่ง 210 คเบส ในระดบ 4+ ซึ่งแสดงถึงปริมาณเชอระดบสเหลือง
ี
ั
ื้
(น้อยกว่า 10 copy/µl ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม; ศุจิรัตน์ และคณะ, 2558) และเป็นระดับปริมาณเชอท ี่
ี่
ั
ั
้
ี่
ื้
ู่

ุ
ไม่ปรากฏตาแหน่ง 700 คเบส ทกตวอย่างททดสอบ และเป็นระดบทใชในการประเมินปริมาณเชอก่อน
ี่
ั
้
ระดบวิกฤตทสามารถเกิดโรคใบขาว สวนการทดสอบดวย M13-tagged two steps- PCR พบดเอ็นเอ
่
ี
เป้าหมายทงสองตาแหน่งทประมาณ 200 และ 500 คเบส ทาให้แยกปริมาณเชอก่อนระดบวิกฤตดวยการ
ื้
้
ั


ี่
ู่
ั้
วิเคราะห์ด้วยแถบดีเอ็นเอไม่ได้ ดังนั้นต้องท าการตรวจสอบปริมาณเชื้อและการแสดงแถบดีเอ็นเอของวิธีการ
นี้ ด้วยการใช้พลาสมิดดีเอ็นเอมาตรฐานในการวิเคราะห์ เพื่อให้สามารถประเมินระดับปริมาณเชื้อได้จากการ
ี่
ตรวจด้วยแถบดีเอ็นเอ (ภาพท 3)

417






















ภาพที่ 3 เปรียบเทียบความสามารถในการแสดงระดับปริมาณเชื้อไฟโตพลาสมาด้วยวิธี nested-PCR (ซ้าย)
และวิธี M13-tagged two steps- PCR (ขวา) ในตัวอย่างใบอ้อยที่เก็บจากแปลงทดลอง


การทดสอบความไว (sensitivity) ของวิธีการ

อยู่ระหว่างการด าเนินการตรวจด้วยการเจือจางดีเอ็นเอพืช และการตรวจปริมาณเชื้อด้วยพลาสมิ
ดลูกผสมที่มีชิ้นยีนเป้าหมาย

การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลใหม่ด้วยยีน Imp และความจ าเพาะต่อดีเอ็นเอดป้าหมาย

ู่
ท าการออกแบบไพร์เมอร์จ านวน 3 คู่ไพร์เมอร์ และคัดเลือกได้ 1 ค (Imp2) ที่ได้จากการออกแบบ
ไพร์เมอร์ชุดใหม่จากล าดับเบสที่ได้จากชุด 1250 คู่เบส ได้เป็นชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาด 800 คู่เบส (Imp2) น ามา

ิ
ี่
ื้
ั
ตรวจในอ้อยทตดเชอไฟโตพลาสมาทั้ง 3 ชนิด พบว่าสามารถตรวจพบดีเอ็นเอชดเจน จากนั้นน ามาทดสอบ
ความจ าเพาะกับชนิดของเชอโดยทดสอบในมันส าปะหลังที่แสดงอาการพุ่มแจ้ พบว่าไม่เกิดแถบดีเอ็นอ และ
ื้
ั
ื้
การทดสอบตรวจเชอในตวอย่างอ้อยปลอดโรคให้ผลเช่นเดียวกัน ในขณะที่การตรวจในอ้อยที่มีอาการใบขาว
ใบเขียว และใบเขียวปนขาว สามารถตรวจพบแถบดีเอ็นขนาดประมาณ 800 bp ได้ (ภาพที่ 4)





















ภาพที่ 4 ผลจากการสงเคราะห์ดเอ็นเอดวย Primer Imp2 หมายเลข (1-5) ใบอ้อยจากการเพาะเลยง
้
ั
ี้
ี
ี่
เนื้อเยื่อ (6-9) ใบมันส าปะหลังทมีอาการโรคพุ่มแจ (10-12) อ้อยใบขาว ใบเขียว และใบเขียวปนขาว
้

418



ิ้
ี่
้
การทดสอบตรวจลาดบเบสของชนยีน Imp ทไดพบว่ามีความใกลเคยงกับเชอไฟโตพลาสมาท ี่

ั
ี
ื้
้
ี่
ี
้
ี
ี่
ื้
้
้
ู

ใกลเคยงกัน น าดเอ็นเอทมี 3 เชอ ไดแก่ SCWL,SCGS,SCGGS ทตรวจพิสจน์แลว มาตรวจวิเคราะห์ลาดับ
เบสด้วยไพร์เมอร์ Imp 2 ได้ผลล าดับเบสของ Imp ดังนี้


















ล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน IMP ขนาด 800 bp ในอ้อย


น าผลวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของแถบดเอ็นเอขนาดประมาณ 800 เบสที่ได้มาแปลผลเป็นสาย
ี
กรดอะมิโนและเปรียบเทียบกับข้อมูลที่มีอยู่ในฐานข้อมูลของ GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)
ด้วยโปรแกรม Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) พบว่า มีส่วนที่เหมือนกับ

ี่
hypothetical protein ใน Saccharum 80 เปอร์เซ็นต์ (ภาพท 5)
ั้
ท าการออกแบบไพรเมอร์ (Imp 3) ใหม่ที่มีความจ าเพาะเพื่อใช้ในการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาทง
ื้
3 ชนิด ดวยโปรแกรม Clustalx2 MEGA-X, Tm calculator ซึ่งมีขนาด 310 คเบส น าไปทาการทดสอบ
้

ู่

่
ตรวจเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิด โดยมีสวนผสมในการทาปฏิกิริยาและขั้นตอนการเพิ่มปริมาณดเอ็นเอ
ื้
ี
ั้
ั
่
้
ั
ิ
สวนประกอบในปฏิกิริยาพีซีอาร์ 15 ไมโครลตรตอหนึ่งหน่วยตวอย่าง โดยใชไพรเมอร์ IMP มีดงนี้ 1x PCR
่
buffer A (500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.1 at 20°C) and 0.1% Triton™ X-100; Vivantis), 0.2
่
ไมโครโมลาร์ dNTP Taq DNA polymerase (Vivantis) ความเข้มข้น 0.1 หน่วยตอหนึ่งหน่วยปฏิกิริยา
ี่
ไพรเมอร์ ความเข้มข้น 0.5 ไมโครโมลาร์ สงเคราะห์ดเอ็นเอในเครื่องพีซีอาร์ ก าหนดการเปลยนแปลง
ั
ี
่
อุณหภูมิตามเวลาดงตอไปนี้ ขั้นท 1 ทอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 นาท ขั้นท 2 ทอุณหภูมิ 95
ี่
ี่
ี
ั
ี่
ี่
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาท ทอุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 40 วินาท และ ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี่
ี

องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1นาท 30 วินาท โดยทาซ้ าขั้นตอนท 2 จานวน 35 รอบ ขั้นท 3 ทอุณหภูมิ 72
ี
ี่
ี่

ี
ี่
ี
ี
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท และทอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท สามารถสงเคราะห์ดเอ็นเอ
ี่
ั
ี
ขนาด 310 คู่เบสได้ (ภาพที่ 6)

419

















































ี
ั
ี่
่

ภาพที่ 5 แสดงผลการเปรียบเทยบลาดบโปรตนของยีน IMP พบว่า มีสวนทเหมือนกับ hypothetical
ี
protein ใน Saccharum 80 เปอร์เซ็นต์













ภาพที 6 ผลจากการสังเคราะห์ดีเอ็นเอด้วย Primer IMP หมายเลข (1-10) ตัวอย่างจากอ้อยที่เป็นเชื้อไฟโต
พลาสมา

420



การตรวจเช็คล าดับนิวคลิโอไทด์ของยีน Imp ขนาด 300 bp ได้ผลดังนี้















ล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน IMP ในอ้อย ขนาด 310 bp


ั
การตรวจวิเคราะห์ล าดบนิวคลิโอไทด์ 300 bp นี้เทียบกับข้อมูลสากล พบว่าเป็น โปรตีนของไฟโต
พลาสมาในอ้อย ที่ความเหมือนระดับ 80 เปอร์เซ็นตเช่นเดียวกัน มีรายละเอียด ดังนี้
์

























FNKIICMFFYIAKLCYNYGIESLKKINKYKKINIGGKIKNILCKMKIFGTQKKVKLLLHLQLLVFQFYLLIINGGLFQKHTKRQKNLKKKYLKVQKKKFQ
MQIKLKKLKNKEKSLKRNCELKNIIKKAQLTKKKTQQLKHLIQLNQMNKINLIILNLILKTNTIQLIHLNYPLLFQTKVIKLNKFKNFILLFKIYFFFFKK
KVKKICKSIFFFLTIKTFFLKKNLKCKGLNSGKLQHNPTIVFTSISQN

่
ี
ั
ี่
การเปรียบเทยบลาดบโปรตนของยีน IMP พบว่า มีสวนทเหมือนกับ hypothetical protein ใน

ี
ุ
Saccharum สามารถแปลเป็นล าดับอะมิโนเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตใบขาวอ้อย จ านวน 249 อะมิโน ดังนี้

421
























ล าดับอะมิโนเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตใบขาวอ้อย จ านวน 249 อะมิโน
ุ


โดยพบว่า สามารถสังเคราะห์ดีเอ็นเอได้ตามที่ขนาดออกแบบ และหลังจากนั้นได้ตรวจสอบด้วยการ

ี่
ั

ื้
วิเคราะห์ลาดบเบสในอ้อยทมีเชอไฟโตพลาสมาทง 3 ชนิดไดแก่ Sugarcane white leaf, sugarcane
้
ั้
grassy shoot และ sugarcane green grassy shoot ได้ผลดังภาพที่ 7















ภาพที 7 Phylogeny และ ค่า Diversity ของเชื้อไฟโตพลาสมาทั้ง 3 ชนิดได้แก่ Sugarcane white leaf,
sugarcane grassy shoot และ sugarcane green grassy shoot วิเคราะห์ด้วยโปรแกรม MEGA X



้
ิ
ั
้
ี่
ผลทไดพบว่า Sugarcane white leaf และ sugarcane grassy shoot มีความสมพันธ์ใกลชดกัน
ี่
ั
ุ
มากทสด มีคาความตางกันท 1.64 และตวอย่างจาก sugarcane green grassy shoot และ Sugarcane
ี่
่
่
white leaf มีความสัมพันธ์ที่แตกต่างกันมากที่สุด ซึ่งมีค่าความต่างกันที่ 4.82
การด าเนินการต่อในการพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล Imp ได้แก่ การทดสอบความไว ความจ าเพาะ
และ การท า multiplex PCR ร่วมกับยีนชนิดอื่น
การพัฒนาเทคนิค multiplex – PCR จากยีน 16S rDNA เพื่อการตรวจจับชนิดของ
phytoplasma genes ในใบขาวของอ้อย
ี
์
้
สาหรับ m-PCR เป็นการประยุกตใชเทคนิค PCR ซึ่งทาการเพิ่มขยายดเอ็นเอเป้าหมายโดยใช ้


ู่
primer หลายคพร้อมกันในปฏิกิริยาเดยวกัน โดย primer แตละคทน ามาตองออกแบบให้ด ไม่มี
่
ู่
ี่
้
ี
ี

422



complementary กัน และเมื่อน าไปท า PCR จะให้ผลผลิตที่มีขนาดความยาวที่แตกต่างกัน การท า m-PCR

ต้องปรับสภาวะพอเหมาะของปฏิกิริยา เพื่อให้สามารถเพิ่มขยายจ านวนดีเอ็นเอจากทุก primer ที่ใส่ลงไปได ้
เท่ากันและเนื่องจากในปฏิกิริยานี้จะมี primer หลายคู่และเมื่อใช้ primer เพิ่มขึ้นส่งผลให้เกิดการรบกวนใน

ปฏิกิริยามากขึ้นจึงท าให้การปรับสภาวะเพื่อให้เหมาะสมที่สุดยิ่งยากไปด้วย (Forbes et al., 2002)

การออกแบบ primer ใหม่ : ทาการออกแบบไพรเมอร์ดวยโปรแกรม ClustalX (version 2.0)

้
ั
ู่

ี่
MultiplexI ประกอบดวย 3 คไพรเมอร์ มีขนาดอยู่ท 322, 262 และ 136 bp ตามลาดบการทดสอบ
้
เครื่องหมายโมเลกุลชนิด mPCR พบว่าสามารถแยกชนิดของเชื้อได ้















ภาพที่ 8 ผลจากการสังเคราะห์ดีเอ็นเอด้วย Multiplex PCR (m-PCR) SCWL,SCGS,SCGGS ในตัวอย่าง

อ้อย (1-2): ขาว (3-4) : ใบเขียว (5-6) : ใบขาวปนเขียว (7-8) : ขาว (9-10) :ใบเขียว (11-12): ใบขาว
ปนเขียว



การพัฒนาวิธีตรวจหาเชื อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยด้วยไพรเมอร์ Multiplex โดยใช้ real-
time PCR :

ี่

็
้
ใช primer ชด Multiplex ทประกอบดวย (SCWL, SCGS, SCGS) โดยเพิ่มปริมาณเปนจานวน 45
้
ุ
รอบ แต่ละรอบประกอบดวยช่วง pre-incubation ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท 1 รอบ,
ี
้
่
ี่
ตามดวย 40 รอบ ของชวง amplification ทอุณหภูมิ 95องศาเซลเซียส, ชวง melting curve ทอุณหภูมิ
่
้
ี่
ี
95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาท1 รอบและชวง cooling ทอุณหภูมิ 40องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30
ี่
่
ื้
้
วินาทีได้ผลดังภาพที่ 9 และ 10 สามารถแยกเชอไฟโตพลาสมาด้วยชดไพรเมอร์ Multiplex ที่ประกอบดวย
ุ
(SCWL, SCGS, SCGS) ได้ด้วย Tm ต่างกัน เชื้อใบขาว SCWL Tm 77.48 C เชื้อใบขาวปนเขียว SCGS Tm
75.53 C และเชื้อใบเขียว SCGSTm 79.13 C

423























ุ
ุ
่
้
ื้
ภาพที่ 9 กราฟแสดงคา Tm ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคในอ้อย 3 ชนิด วิเคราะห์ดวยชดไพรเมอร์
Multiplex ที่ประกอบด้วย SCWL, SCGSและ SCGS ด้วยเทคนิค real-time PCR


















ภาพที่ 10 กราฟแสดงคา Tm ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคในอ้อย 3 ชนิด วิเคราะห์ดวยชดไพรเมอร์
่
ุ
ุ
ื้
้
้
ี่
ี
ี่
ิ้
ี่
Multiplex ทประกอบดวย SCWL, SCGS และ SCGSท ตรวจจากพลาสมิดดเอ็นเอทมีชนยีน
16S rDNA ความเข้มข้นต่างกันด้วยเทคนิค real-time PCR

้
สรุปผลการทดลอง: ไดเครื่องหมายโมเลกุลชนิด multiplex PCR จากยีน 16S rDNA ทสามารถ
ี่
ื้
่
้
้
่
แยกความแตกตางของชนิดของเชอโรคใบขาวได การทดสอบดวย Realtime PCR พบคา Tm ของเชอใบ
ื้
ื้
ื้
ขาว SCWL Tm 77.48 C เชอใบขาวร่วมกับอาการกอฝอย SCGS Tm 75.53 C และเชอกอตะไคร้
SCGSTm 79.13 C

การพัฒนาเทคนิค Loop-Mediated isothermal amplification (LAMP)
ออกแบบไพร์เมอร์ : ทาการออกแบบไพรเมอร์ (Primer) สาหรับวิธี LAMP ออกแบบไพรเมอร์ท ี่


ื้
่
จาเพาะตอเชอจากสวนของยีน16S-23S rDNA ของ phytoplasma จานวน 3 ค ศึกษาสภาวะท่เหมาะสม
ี

ู่
่

ั
ของปฏิกิริยา LAMP โดยทดสอบในอ้อยใบขาวจ านวน 7 ตวอย่าง น าไปเพิ่มจ านวนในสภาวะทเหมาะสม
ี่
ี
(optimal condition) ใน PCR tube โดยมีส่วนประกอบของสารท่เป็น final concentration คือ 0.2
µM Outer primer (F3, B3), 1.6 µM Inner primer (FIP, BIP), 0.4 µM loop primer (Loop F and

424



R) บ่ม 65 องศา นาน 60 นาทีโดยใช้เครื่อง Thermostatic Color Sensor (KANEKA, Japan) พบว่า

ี่
ั
ื้
สามารถตรวจเชอไฟโตพลาสมาในตวอย่างได มีผลการทดสอบดงแสดงใน ภาพท 11
ั
้

A












B










C












D











ภาพที่ 11 ผลการทดสอบความจ าเพาะของเทคนิค LAMP ต่อเชื้อphytoplasma genesด้วยเทคนิค LAMP
ี
ี่
ื้
ี่
ี
(A) ดเอ็นเอทมีเชอไฟโตพลาสมาในอ้อย (B) ดเอ็นเอทไม่มีเชอไฟโตพลาสมา (No. 1 Positive
ื้
ื้
ี
ุ
Control มาจากชด kit, 2-7 ดเอ็นเอพืช No. 8 No Target control) (C) ตรวจเชอไฟโต
ั้
พลาสมา ทง 3 SCGGS, SCWL, SCGS (No. 1 Positive Control No.2-3 SCGGS, No.4-5
SCWL, No.6-7 SCGS, No. 8 No Target control) (C) ผลจากสัญญาณสาร Fluorescent (D)
ี
ู
ี่
ั
ผลจากการดส Fluorescent ทเกิดขึ้นในปฏิกิริยา 1-7 ตวอย่างอ้อยใบขาว 8 negative
control

425



การพัฒนาเทคนิค LAMP ด้วยไพร์เมอร์ groEL


ทาการออกแบบไพร์เมอร์สาหรับ LAMP ในการตรวจจบยีน groEL จากเชอ Sugarcane white
ื้
ั

ึ
leaf phytoplasma molecular chaperonin GroEL gene, ศกษาปฏิกิริยา LAMP โดยใชน้ ายาสาเร็จรูป

้
LavaLamp DNA Master Mix (Lucigen) ในตัวอย่างอ้อยใบขาวที่มีความเข้มข้น (15ng) โดยมีส่วนประกอบ
้
ั
ดงนี้ LavaLamp DNA Master Mix (1x) Green Fluoresent Dye (0.1X) ไพรเมอร์ประกอบดวย final
ื
concentration คอ 0.2 µM Outer primer (F3, B3), 1.6 µM Inner primer (FIP, BIP), 0.4 µM loop
primer (Loop F and R) บ่ม 65 องศา นาน 60 นาทีโดยใช้เครื่อง KANEKA พบว่าสามารถเกิดปฏิกิริยาได ้
และสามารถตรวจดีเอ็นเอได้ในระดับการเจือจางถึง 10 จากดีเอ็นเอตั้งต้น (ภาพที่ 12)
-11

















ี่
-2
ี
ภาพที่ 12 ระดับความเข้มข้นของดเอ็นเอทสามารถตรวจด้วยเทคนิค LAMP No.1-7 (1,10 ,10 ,10 , 10 -
-4
-6
-10
-11
8 , 10 ,10 ) ตามล าดับ ใช้ตัวอย่างอ้อยใบขาว No.8 เป็น negative control โดยใช้น้ า

ผลการตรวจความไวของปฏิกิริยา LAMP เทียบกับ nested-PCR
้
ื้
ี่
ี
พบว่าระดบความเข้มข้นของปริมาณดเอ็นเอของเชอไฟโตพลาสมาทสามารถตรวจดวยเทคนิค
ั
ั
้
ิ
4
LAMP ที่ใช้ groELเป็นไพร์เมอร์ สามารถตรวจจบดีเอ็นเอไดตาสุด 1.89 x10 เซลล์ต่อไมโครลตร แต่พบว่า
่
ี
ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่วัดได้ไม่สอดคล้องกับระดับการเจือจาง ท าให้ต้องทดสอบเพิ่มเพื่อหาปริมาณดเอ็น
เอที่ต่ าที่สุด (ตารางที่ 2)
ความไว (sensitivity) ของวิธีการ LAMP และ Nested-PCR
ื้
้
้
ิ
การทดสอบซ้ าโดยใชดีเอ็นเออ้อยที่ตดเชอ SCWL เจือจาง 10 เท่า จ านวน 10 ระดับ จากเริ่มตนท ี่
-10
ื
10 ถึง 10 พบว่า LAMP สามารถตรวจจบดเอ็นเอเปาหมายไดที่ระดับความเจอจางที่ 10 เช่นเดียวกับ
้
ี
ั
-10
0
้
เทคนิค Nested PCR ในระดับพีซีอาร์ชุดที่สอง ผลผลิตขนาด 210 bp ส่วน Nested-PCR ชุดที่หนึ่ง ผลผลต
ิ
-7
ขนาด 700 bp ตรวจจับระดับความเจือจางได้ต่ าสุดที่ 10 (ตารางที่ 3, ภาพที่ 13)
ื้
ี่
้

ุ
่
การวิเคราะห์จานวน copy number ตาสดของเชอไฟโตพลาสมาทสามารถตรวจจบได ทดสอบ
ั
้
ี่
ิ้
โดยใชพลาสมิดลกผสม pUC1318 ทมีชนยีนขนาด 700 bp น ามาเจอจาง ตรวจวัดความเข้มข้นของพ
ู
ื
ลาสมิดทได และคานวณจานวน copy number ตงตนก่อนทาการตรวจดวยวิธี Nested-PCR ผลการ
ี่
้


้
้

ั้
ทดลองพบว่า วิธี LAMP และ nested-PCR ที่ผลผลิตขนาด 210 bp สามารถตรวจได้ระดับต่ าถึง 1.27X10 -
1 copy/µl ส่วน nested-PCR ที่ผลผลิตขนาด 700 bp ตรวจได้ที่ 2.66X10 copies/µl (ตารางที่ 3)
2

426



ี่
ตารางที่ 2 ระดับความเข้มข้นของดีเอ็นเอทสามารถตรวจด้วยเทคนิค LAMP และ Nested PCR
ระดับความเจือจาง ระดับความเข้มข้น LAMP Nested PCR
(copy) 700 bp 210 bp

10 4.78x10 + + +
9
0
-2
10 6.52 x10 + + +
8
7
-4
10 2.17 x10 + + +
-6
10 4.15 x10 + + +
5
-8
4
10 1.89 x10 + + +
-10
10 0.00 - - +

ตารางที่ 3 ระดับความเข้มข้นของดีเอ็นเอทสามารถตรวจด้วยเทคนิค LAMP และ Nested PCR ใช้พ
ี่
ลาสมิด pUC1318 ที่มีชิ้นยีนขนาด 700 คู่เบสของ 16S-23S rDNA ในการทดสอบ copy

number

DNA serial LAMP Nested PCR (DNA) Nested PCR pUC1318 pUC1318 (copy/µl)
dilution (DNA) 700 bp 210 bp 700 bp 210 bp
0 + + + + + 9
10 4.09x10
-1 NT + + + + 9.75X10
8
10
7
-2 + + + + + 9.75X10
10
6
-3 NT + + + + 8.90X10
10
-4 + + + + + 7.46X10
5
10
-5 NT + + + + 6.22X10
4
10
3
-6 + + + + + 1.68X10
10
2
-7 + + + + + 2.66X10
10
1
-8 + - + - + 4.11X10
10
0
-9 NT - + - + 9.55X10
10
-1
-10 + - + - + 1.27X10
10
NT: not tested + : positive - : negative

427







































-4
-2
-6
ภาพที่ 13 ระดับความเข้มข้นของดีเอ็นเอจากตัวอย่างอ้อยใบขาวที่เจือจาง No.1-7 (1,10 ,10 ,10 , 10 ,
-8
-10
ั
10 ) ตามล าดบ No.8 เป็น negative control โดยใช้น้ า ภาพบน : การตรวจด้วยเทคนิค
groEL- LAMP ภาพล่าง : การตรวจด้วยวิธี nested-PCR

้
ู
ความถกตอง (accuracy) และความครอบคลุม (broad spectrum) ในการตรวจเชื อไฟโต
์
พลาสมาในอ้อยของชุดไพร์เมอร GroEL gene
้
ี
ื้
่
ี่
ิ
ในการตรวจความจาเพาะตอเชอไฟโตพลาสมาในอ้อยทดสอบโดยใชดเอ็นเอจากพืชอื่นทตดเชื้อไฟ

ื้
ิ
ี่
โตพลาสมาชนิดอื่น ไดแก่ มันสาปะหลงตดเชอโรคพุ่มแจ และหญ้าทแสดงอาการใบขาว ผลการทดสอบ
้

้
ั
ั
่
พบว่าไม่สามารถตรวจเชอดงกลาวได ในการตรวจความครอบคลมในการตรวจเชอไฟโตพลาสมาของอ้อย
ื้
ื้
้
ุ
ทดสอบโดยใชดเอ็นเอทไดจากอ้อยทตดเชอ SCWL, SCGS และ SCGGS ททาการตรวจพิสจน์ชนิดของเชื้อ
ู
ี่
้
ี
ี่
ื้
ี่
้
ิ

แล้วด้วยการตรวจล าดับนิวคลิโอไทด์ พบว่าชุดไพร์เมอร์นี้สามารถตรวจจับเชื้อทั้งสามชนิดนี้ได้ (ภาพที่ 14)

428



























ิ
ภาพที่ 14 การตรวจดีเอ็นเออ้อยที่ตดเชื้อไฟโตพลาสมาชนิดต่าง ๆ ด้วยวิธี groEL-LAMP No 1-3 : SCWL,
SCGS, SCGGS. No 4-6 : ดีเอ็นเอจากหญ้าที่เป็นโรคใบขาว และ มันส าปะหลังที่เป็นโรคพุ่มแจ ้

No.8: negative control (น้ า)


สรุปผลการทดลองและข้อเสนอแนะ

ในการพัฒนาวิธีการตรวจเชื้อโรคใบขาวแบบใหม่ด้วยเทคนิค M13-tagged two-steps-PCR ได้ท า
การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลแบบใหม่โดยการประยุกตเทคนิคการตรวจลาดบเบสและการใช Tag เป็น
้

ั
์

้
M13 ซึ่งทาให้ไดวิธีการใหม่ทสามารถทดแทนวิธี nested-PCR และแก้ปัญหาของวิธีการนี้ได แตเนื่องจาก
ี่
้
่
้
M13 เป็นส่วนหนึ่งของ phage DNA จึงท าให้ได้ต าแหน่งดีเอ็นเอส่วนที่ไม่ใช่เปาหมายติดมาด้วย และในการ
ทดสอบในตัวอย่างที่มีการติดเชื้อหลายชนิด จะตรวจพบดีเอ็นเอมากกว่า 2 ต าแหน่ง ซึ่งต้องท าการแก้ปัญหา
นี้ ในส่วนของการพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลด้วยการใช้ยีน Imp พบว่าเป็นต าแหน่งยีนที่ยังไม่มีการรายงาน

ั
ึ
้

มาก่อนในอ้อย ดงนั้นจงทาให้การออกแบบไพร์เมอร์ทาไดคอนข้างยาก แตในการทดลองนี้สามารถพัฒนา
่
่


้
เครื่องหมายโมเลกุลสาหรับการตรวจยีนนี้ในอ้อยไดสาเร็จ แตพบปัญหาความจาเพาะของเครื่องหมาย
่

่
่
้
ี
โมเลกุลทได เนื่องจากตรวจพบตาแหน่งทไม่ใชดเอ็นเอเป้าหมายเชนกัน ซึ่งตองพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล
ี่
้

ี่
ู
ตาแหน่งใหม่ หรือพัฒนาสภาวะในการตรวจให้มีความเข้มสงขึ้น เพื่อให้มีความจาเพาะมากขึ้น ในการวิจัย


้
้
เบื้องตนของการพัฒนาเทคนิค LAMP พบว่ามีศกยภาพสงในการน าไปใชงาน สวน multiplex PCR นั้น
ั
่
ู
ต้องท าการตรวจความไวของวิธีการในการตรวจชนิดของเชื้อ

การน าผลงานใช้ประโยชน์
มีการเผยแพร่ผลงานวิจัย ดังนี้
้
ื้
ุ
1. การตรวจเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคในอ้อยอย่างรวดเร็วดวยเทคนิค loop-mediated
ิ
ุ
isothermal amplification (LAMP) โดย ศจรัตน์ สงวนรังศริกุล วีรกรณ แสงไสย์ เบญจวรรณ รัตวัตร์
ิ
์
วิทยา ศรีภักดี รวีวรรณ เชื้อกิตติศักดิ์ และ Youichi Kobori. ใน Thailand Research Expo : Symposium
ิ
๒๐๒๐ ภาคโปสเตอร์ ในงานมหกรรมงานวิจัยแห่งชาต 2563 กทม.

429



ั
็
2. น าเสนอผลงานวิจยเรื่องเตม ภาคโปสเตอร์ “A new efficient and rapid method for
detection of the phytoplasma associated with sugarcane disease based on groEL gene and
ุ
ิ
the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) system งานประชมวิชาการนานาชาต The
ี่
ิ
International Sugar and Sugarcane Conference วันท 31 กรกฎาคม – 2 สงหาคม 2562 ณ โรงแรม
ดุสิตธานี พัทยา ชลบุรี
ั
3. น าเสนอผลงานวิจยเรื่อง “Detection techniques on sugarcane white leaf disease” ใน
งานประชม “Second International Workshop on Network development and Information
ุ
ี่
Sharing for the Management of Sugarcane White Leaf Disease in Asia” ระหว่างวันท 19-20
กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2561 ณ มหาวิทยาลัยขอนแก่น จังหวัดขอนแก่น ภาคบรรยาย

4. บทความเรื่อง “การตรวจเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตุโรคใบขาวในอ้อยด้วยยีน Imp” โดย ศุจิรัตน์
ิ
ุ
สงวนรังศริกุล เบญจวรรณ รัตนวัตน์ วีรกรณ แสงไสย์ วิทยา ศรีภักด จฑามาศ สอนเมือง และ Shigeyuki
์
ี
Kakizawa ตีพิมพ์ในในวารสารแก่นเกษตร ปีที่ 49 ฉบับเพิ่มเติม 1 2564 หน้า 43 (1-2)
ั
ื้
5. บทความเรื่อง “การหาความสัมพันธ์ของปริมาณเชอไฟโตพลาสมากับระดบการแสดงอาการของ
โรคใบขาวอ้อยด้วยวิธีกราฟมาตรฐาน absolute qPCR” โดย ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วิทยา ศรีภักดี ศุภรัตน์
ุ
ั
ศรีทะวงษ์ วีรกรณ แสงไสย์ จฑามาศ สอนเมือง สนิศา สนทร นุชจรี ก้านจกร์ Youichi Kobori และ ยุพา
ุ
ุ
์
หาญบุญทรง ตีพิมพ์ในวารสารแก่นเกษตร ปีที่ 49 ฉบับเพิ่มเติม 1 2564 หน้า 146 (1-3)

เอกสารอ้างอิง
ี
์
์
ิ์
ศุจิรัตน สงวนรังศิริกุล, ธรวฒ วงศ์วรัตน, สุรศักด แสนโคตร, ทักษิณา ศันสยะวชัย และ สุน ศรีสิงห์. 2556. SecA
ุ
ิ
ี
ิ
่
ิ
ี

เครื่องหมายโมเลกุลใหม่ในการตรวจโรคใบขาวของอ้อยที่แม่นยาสูง. ผลงานวจัยดเดนกรมวชาการเกษตร
ิ
ประจ าปี 2555. กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. หน้า 1-15.
ั
ี
ุ
ิ
์
ี
ิ
ศุจิรัตน สงวนรังศิริกุล, ธรวฒ วงศ์วรัตน, ทักษิณา ศันสยะวชัย, สุน ศรีสิงห์ รังสี เจริญสถาพร, ประพนธ ์
์
ประเสริฐศักดิ์ และ กอบเกียรติ ไพศาลเจริญ. 2558. วิธีตรวจและวนิจฉัยโรคใบขาวของอ้อยดวยเทคนิคพซีอาร์.
้
ิ
ี
ผลงานวจัยดเดนกรมวชาการเกษตร ประจ าปี 2557. กรมวชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. หนา
่
ี
ิ
ิ
ิ
้
69-89.
Hanboonsong, Y., W. Ritthison, C. Choosai, and P. Sirithorn, 2006. Transmission of Sugarcane White Leaf
Phytoplasma by Yamatotettix flavovittatus, a New Leafhopper Vector. Journal of Economic
Entomology 99 (5https://doi.org/10.1603/0022-0493-99.5.1531. Submission: Received: 3 October
2005; Accepted: 1 May 2006

430



้
การถ่ายทอดปริมาณเชื อโรคใบขาวในออยสู่อ้อยตอและการแสดงอาการของโรคในสภาพไร่
Transmission of Sugarcane white leaf disease phytoplasma in sugarcane

growing cycle and symptom expression in the field condition


1
ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วีรกรณ์ แสงไสย วสันต สิงห์ค า สินีนารถ พลธิราช จุฑามาส สอนเมือง
1
1
1
์
1
์
ิ์
1
1
เบญจวรรณ รัตวัต ภาคภูมิ ถิ่นค า และรวีวรรณ เชื้อกิตติศักด
1

รายงานความก้าวหน้า
การศึกษาการถ่ายทอดปริมาณเชื้อโรคใบขาวในอ้อยสู่อ้อยตอและการแสดงอาการของโรคในสภาพ

ไร่ไดทาการสารวจและคดเลอกแปลงใน ศวร.ขก. และสมเก็บตวอย่างใบและลา จานวน 20 ลา การตรวจ

ุ่
้
ั
ื



ั
ปริมาณเชื้อในใบพบว่ามีเชื้อในระดับต่ า โดยอยู่ในช่วงสีฟ้าถึงสีเหลือง (<0.5-10 copy ในดีเอ็นเอพืช 25 นา
ี่
โนกรัม) ผลการตรวจใบในต้นที่เพาะจากข้อตาของทั้ง 20 ล า พบว่ามีเชื้อในระดับเดียวกันกับทตรวจพบจาก
ใบ และมีการกระจายของเชอและปริมาณในระดบทสอดคลองกันกับการตรวจทใบของแตละลา ทาการ
ั
ี่
ื้

ี่

้
่

คดเลอกกอ 40 กอในแปลงทดลอง และเก็บใบจากลาหลกมาทาการตรวจเชอ แตพบว่าหลายกอถูกทาลาย
่
ั


ั
ื
ื้
ิ


ู
ี่

้
ื
จากปลวกและสภาพแลง ทาการปลกซ่อมโดยใชตนทไดจากลาของแปลงนี้ เหลอเพียง 25 กอ ทาการตด
้
้
้
เครื่องหมาย โดยติด เครื่องหมายล าหลัก และเมื่อสร้างล าแล้วท าการติดเครื่องหมายเพิ่ม พบว่าทั้งหมดมีการ
ี่
ั
ั้

์
้
้

ิ

ิ
ี่
เจริญเตบโตทชาเนื่องจากความไม่สมบูรณของตน ทาเก็บตวอย่างใบจากลาทตดเครื่องหมายทง 25 ลา อีก
จ านวน 5 ครั้ง ในช่วง 2562-2563 ตั้งแต่ เดือนพฤศจิกายน ธันวาคม มีนาคม มิถุนายน และ สิงหาคม ครั้ง

ื้
ที่ 1-4 เก็บตัวอย่างล าหลัก ครั้งที่ 5 เก็บตัวอย่างจากลาหลักและลาใหม่ มีการเก็บตัวอย่างเพื่อตรวจเชอใบ

ื

ขาวตงแต 1-9 ลาขึ้นกับความสมบูรณของกอ พบว่ามีตนตาย 5 กอ ในระหว่างการตดตามการเพิ่มปริมาณ
ั้
่
้
ิ
ื้
ื้
่
้
เชอในสภาพไร่ ผลการตรวจปริมาณเชอโรคใบขาวพบว่ามีปริมาณเชอเริ่มตนอยู่ในชวงสเขียวถึงสเหลอง
ี
ื
ื้
ี
่
(<0.5- 10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) ยังไม่มีการแสดงอาการใบขาว แตพบการเริ่มมีปริมาณ
ี
่
ั
ั
ี่

เชอระดบสเหลองเพิ่มขึ้นในชวงหน้าแลงระหว่างเดอนมีนาคมททาการเก็บตวอย่าง ในจานวนนี้มีตัวอย่างท ี่
ื
้
ื
ี
ื้


ี
อยู่ในกลมเชอระดบสสม (10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) จานวน 3 ตวอย่าง ซึ่งเป็นระดบท ี่
้
ื้
ี
ั
ั
ั
ุ่
ื้
้
ิ
ี่
้
ั่
สามารถแสดงอาการใบขาวไดชวคราวหากมีสภาวะเครียด ผลการตรวจเชอในตนทสามารถเจริญเตบโตได ้
ื
จานวน 5 ครั้ง ทก 2 เดอน รวม 10 เดอน พบว่า 65% ของตวอย่างทใชมีเชอเริ่มตนในระดบตาท 0.5
ั
ื้

้
้
ื
ั
ี่
่
ี่
ุ
ั
ื
ื
copy/µl ในดเอ็นเอ 25 นาโนกรัม หรือระดบสเขียวและสฟ้า หลงจาก 4 เดอนแรก ในระยะ 7 เดอน
ี
ั
ี
ี
15.8% ของกลมตวอย่างมีการเพิ่มปริมาณเชอเข้าสระดบสสม (10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม)
ู่
ั
ุ่
ั
ื้
้
ี
ี
ี
ั
ื้
ื้
ี
ี่
ในขณะท 68.4% มีเชอในระดบสเหลอง (1-10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) และ 15.8% มีเชอ
ื
ั
ื้
ี
ี
ในระดบสเขียว (>0.5 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) แสดงให้เห็นว่าเชอใบขาวมีการเพิ่มปริมาณ

ภายในตนตามการเจริญเตบโตของพืช ไดเก็บลาจากกอทเหลอมาเพาะแยกข้อตาเพื่อการวิเคราะห์การ
ิ
้
ี่
ื
้
ถ่ายทอดปริมาณเชื้อกระจายภายในล า อยู่ระหว่างการเพาะต้นเพื่อการตรวจเชื้อใบขาว

1 ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน

431



ค าน า

ื้
ุ
โรคใบขาวของอ้อย (sugarcane white leaf disease) มีสาเหตจากเชอไฟโตพลาสมาซึ่งเป็น
ี
้
ี่
ี
ั่
ี
ั
ั
่
แบคทเรียชนิดทไม่มีผนังเซลล อาศยอยู่ในทอลาเลยงอาหารของพืช มีเพลยจกจนสน้ าตาล 2 ชนิด ไดแก่
์
ี้

Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura) (Chen, 1978) และ Yamatotettix flavovitatus (ยุพา
และคณะ, 2548) เป็นแมลงพาหะ ลกษณะการแสดงอาการของโรคใบขาวอ้อยเกิดขึ้นไดกับทกระยะของ
้
ั
ุ
ิ
้
ื้
การเจริญเตบโต ความรุนแรงของอาการของโรคเกิดจากปริมาณเชอไฟโตพลาสมา ความแข็งแรงของตน
ื้
ี่
ิ
ื้
อายุทเริ่มตดเชอ และสภาพอากาศ (Marzachì et al., 2004) การก าจดเชอด้วยวิธีการต่างๆ จากรายงานท ี่
ั

ผ่านมา ยังไม่ประสบความสาเร็จ
จากการศึกษาของศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่นพบว่า การแสดงอาการใบขาวจะเกิดขึ้นได้ ประกอบดวย
้
้
้
ปัจจัยหลัก คือ ปริมาณเชื้อโรคใบขาว ความสมบูรณ์ของตนอ้อย และสภาพแวดลอม ในปีที่มีช่วงแล้งนานกว่า
ิ
ิ
ุ่
ิ
ี่
้
ปกต จะเกิดใบขาวมาก และกลมดนทรายมักพบตนทมีอาการใบขาวไดมากกว่าในกลมดนทมีความอุดม
ี่
ุ่
้
ื้
ิ
สมบูรณแม้บางต้นจะมีปริมาณเชอสูงเชนกันจากการศึกษาของ กอบเกียรต และคณะ (2553) ที่ด าเนินการท ี่
่
์
้
้
ี่
ั
ุ่
ู
แปลงทดลองในศนย์วิจยพืชไร่ขอนแก่น โดยใชพันธุ์ขอนแก่น 3 พบว่ากลมตนอ้อยทไม่ให้น้ าแสดงอาการใบ
้
ี่
้
ุ่
ี
้
ุ่
ี่
ขาวมากกว่ากลมทไดรับน้ า แม้ว่าในกลมตนทไม่มีอาการใบขาวจะมีปริมาณเชอสงใกลเคยงกับตนทแสดง
้
ื้
ี่
ู
ึ
อาการใบขาวก็ตามและจากการศกษาเบื้องต้นของ ศุจิรัตน์ และคณะ (2557) พบว่าต้นอ้อยทแสดงอาการใบ
ี่
ี่
ขาว มีคาสารโพรลนสงมากกว่าตนทไม่แสดงอาการ 2-3 เทา แสดงให้เหนว่าอ้อยใบขาวแสดงสภาวะขาดน้ า
็
่
่
้
ู
ี
ิ
์
ี่
ภายในเซลลสอดคลองกับรายงานของ กอบเกียรต และคณะ (2553) ซึ่งพบว่า ปริมาณน้ าในใบอ้อยทแสดง
้
็
่
อาการขาวมีน้อยกว่าในใบทไม่มีอาการประมาณ 2 เทาดวยจากข้อมูลเหลานี้แสดงให้เหนว่าสภาพแวดลอม
้
้
ี่
่
็
ุ้
ั
ี
เปนปัจจยทมีผลตอการกระตนให้เกิดอาการใบขาวแม้จะมีปริมาณเชอสงในระดบใกลเคยงกัน อย่างไรก็ตาม
ู
้
ื้
ั
ี่
่
ุ้
ยังคงมีคาถามถงระดบของปริมาณเชอต่ าทสดททาให้เกิดอาการใบขาวไดเมื่อถูกกระตนดวยสภาพแวดลอม
้
ี่
ี่

ื้
้

ั
ุ
ึ
้
ื้
ิ
์
่
้
้
เพื่อน ามาใชในการคาดการณ โดยคาดว่าหากมีเชอในปริมาณตาลงน่าจะสามารถไว้ตอและให้ผลผลตไดอีก
ื้
หลายรุ่นกว่าปริมาณเชื้อจะสะสมถึงขั้นแสดงอาการ นอกจากนี้ยังมีค าถามถึงพัฒนาการของเชอเมื่ออ้อยอยู่ใน
่
้
สภาพแวดลอมททาให้เกิดความเครียดหรือในสภาพไร่ ซึ่งข้อมูลทไดจากการศกษาโจทย์ดงกลาว จะเป็น
ั
ี่
้
ี่
ึ

ั้
่
้
่
ิ
์
ิ
ั
ประโยชน์อย่างยิ่งตอการจดการขบวนการผลตและการคาดการณผลผลตทควรจะได ตงแตการวางแผน การ
ี่
คดเลอกแปลงแม่พันธุ์ การขยายพันธุ์ รวมไปถงการคดเลอกแปลงปลก ทงนี้ข้อมูลทไดจากการศกษาเหลานี้
ึ
ื
ั
ึ
่
ู
้
ี่
ั้
ั
ื
้
ั
้
ื
ยังอาจน ามาใชเป็นแนวทางในการคดเลอกพันธุ์ทนโรค ททาให้สามารถจดการโรคใบขาวไดอย่างยั่งยืน
ั

ี่
โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแหลงทสภาพไม่เหมาะสมต่อการปลูกอ้อย ในงานวิจัยนี้จงมีวัตถุประสงคเพื่อศกษาการ
ึ
่
์
ี่
ึ
ถ่ายทอดปริมาณเชื้อโรคใบขาวในอ้อยสอ้อยตอและการแสดงอาการของโรคในสภาพไร่ ซึ่งจะท าการติดตาม
ู่
พัฒนาการของปริมาณเชื้อภายในอ้อยเมื่ออยู่ในสภาพไร่ การถ่ายทอดปริมาณเชื้อภายในกอ และปริมาณเชื้อ
่

ในข้อตาตาแหน่งตาง ๆ เพื่อให้เกิดความเข้าใจในกลไกของการเกิดโรค และสามารถวางแผนการจดการได ้
ั
อย่างอย่างมีประสิทธิภาพ

432



วิธีด าเนินการและอุปกรณ์

พืชที่ใช้ในการทดลอง : อ้อยพันธุ์ขอนแก่น 3
วิธีการ : แบ่งเป็น 2 ขั้นตอน

ขั นตอนที่ 1 ตรวจติดตามปริมาณเชื้อไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยในอ้อยรุ่นที่ 1 และในรุ่นอ้อยตอ

ในแปลงทดลองของศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น
ั
ื
วิธีด าเนินการทดลอง : ส ารวจและคดเลอกต้นอ้อยในแปลงทดลองใน ศวร.ขก. ประมาณ
ุ
ึ

ิ
ี่

ี

50 กอทมีอาการและไม่มีอาการใบขาว นับจานวนลา/หน่อในกอ ตดเครื่องหมายทกลา บันทกอาการสใบ

้
เก็บใบตาแหน่งท 3 จากยอด บันทกอาการสใบ ตรวจปริมาณเชอใบขาวดวยเทคนิค PCR ตามวิธีการของ
ี่
ื้
ี
ึ
ศจรัตน์และคณะ (2558) ทาการตรวจปริมาณเชอใบขาวทั้งสน 3 อายุ : 3 เดอน, 6 เดอน, 9 เดอน ในอ้อย
ื
ื
ื
ิ
ิ้

ื้
ุ

ี
ึ
ั
ี่
่
ี่
รุ่นท 1 และรุ่นอ้อยตอจานวน1-2 รุ่น บันทกอาการสใบ สภาพอากาศ และการจดการแปลงในชวงทเก็บ
ตัวอย่าง
ื้
้
ขั นตอนที่ 2 ตรวจตดตามการถ่ายทอดปริมาณเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวในอ้อยทไดจากการช า
ี่
ิ
ข้อตาจากล าที่ได้จากการปลูกในสภาพแปลง

ี่

ื

ั
ิ

วธีดาเนินการทดลอง : คดเลอกลาอ้อยจากขั้นตอนท 1 ชาข้อตาในถุงเพาะจานวน 100

ี่
ื้
ึ
่


ี่
ข้อ บันทกหมายเลขลาทไดในขั้นตอนท 1 ตาแหน่งข้อของแตละลา เมื่องอกใบ ทาการตรวจปริมาณเชอใบ
้

ขาวตามวิธีการในขั้นตอนที่ 1
การบันทึกข้อมูล
จ านวนหน่อ/ ล าต่อกอ อาการสีใบ ปริมาณเชื้อใบขาวตรวจด้วยเทคนิค PCR
สถานที่ทดลอง ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น
ระยะเวลาเริ่มต้นและสิ นสุด : 2559-2564

ผลการทดลองและวิจารณ์
จากการส ารวจแปลงใน ศวร.ขก. และติดเครื่องหมายกอที่ต้องการทดสอบที่มีอาการใบขาว จ านวน
20 กอ เก็บตวอย่างใบน าไปสกัด DNA ตรวจ PCR ตนพ่อแม่ 20 ตวอย่าง พบว่ามีปริมาณเชอในใบระดบ
ื้
ั
ั
้
ั
่
ตั้งแตสีฟ้าถึงสีเหลือง (<0.5-10copies/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) (ภาคผนวก ตารางที่ 1) และเมื่อน า
ลาทไดไปเพาะข้อตา เมื่อตนอ้อยอายุได 2 เดอน เก็บตวอย่างใบทไดจากแตละลาไปตรวจปริมาณเชอดวย
้
ื้
้
้
ี่
ั
้
ี่
้

ื
่

่
ั

ี่
เทคนิค PCR พบว่ามีการกระจายของเชื้อและปริมาณในระดบทสอดคล้องกันกับการตรวจที่ใบของแตละลา
ั
ยกเว้นล าที่ 16 เนื่องจากตัวอย่างที่ได้มีปริมาณเชื้ออยู่ในระดบตา จึงท าให้ไม่เห็นการสะสมของเชื้อทชัดเจน
่
ี่
ในล า

433



















้
ึ
ู
ั
ี่
สภาพแปลงอ้อยภายในศนย์วิจยพืชไร่ขอนแก่นทใชในการศกษาและการระบุลาและข้อในการศกษาการ
ึ

กระจายของเชื้อในล าโดยตรวจจากต้นที่เพาะได้จากข้อตา

จากการคัดเลือกกอในแปลง ท าการคัดได้ 40 กอ เพื่อศึกษาการถ่ายทอดปริมาณเชื้อ โดยท าการตัด
ิ
ต้นที่อยู่ในแปลงที่คัดเลือกไว้เพื่อตดตามการงอกของหน่อ แต่พบว่าหลายกอถูกท าลายจากปลวก และสภาพ
ี่
้
้
้
้
้
ั
ู

แลง ไม่สามารถเก็บตวอย่างได ทาการปลกซ่อมโดยใชตนทไดจากลาของแปลงนี้ พบว่าเหลอตวอย่างท ี่
ั
ื

้
ั้

สามารถน ามาศกษาตอไดจานวน 25 กอ โดยตดเครื่องหมายลาหลก เนื่องจากตนเลกและพบว่าทงหมดมี

ั
ิ
็
้
่
ึ
้

์
ิ
ี่

ั
การเจริญเตบโตทชานื่องจากความไม่สมบูรณของตน ทาเก็บตวอย่างใบจากลาทตดเครื่องหมาย จานวน 5
ิ
ี่

้
ครั้ง ได้แก่ พ.ย.2562, ธ.ค. 2562, มีนาคม 2563, มิถุนายน 2563, สิงหาคม 2563 ครั้งที่ 1-4 เก็บตัวอย่าง
ใบจากล าหลัก ครั้งที่ 5 ในเดือนสิงหาคม เก็บตัวอย่างใบจากล าหลักและล าใหม่ที่เกิดจากหน่อ จ านวนตั้งแต่
1 ล า ถึง 9 ล า ขึ้นกับความสมบูรณ์ของต้น น ามาตรวจปริมาณเชื้อโรคใบขาว การส ารวจในครั้งที่ 3 พบต้น
ตายจ านวน 2 กอ เนื่องจากเป็นช่วงแล้ง เดือนมีนาคม และ ครั้งที่ 4 ในเดือนมิถุนายน มีต้นตายจ านวนมาก

้
ขึ้น รวมเป็น 5 กอ และมีการปลูกซ่อมโดยใชข้อตาจากลาที่ได้จากกอเดิมมาปลูก ในระหว่างการติดตามการ
เพิ่มปริมาณเชื้อในสภาพไร่ (ภาคผนวก ตารางที่ 2)
ี
ผลการตรวจปริมาณเชื้อโรคใบขาวพบว่าตัวอย่างจากทั้ง 25 กอ เริ่มต้นมีเชื้อใบขาวอยู่ในระดับสฟ้า
ื้
ถึงสเหลอง (<0.5- 10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) จดเป็นปริมาณเชอทตา ยังไม่มีการแสดง
่
ี่
ั
ี
ี
ื
ี
ั
ื้
ี
อาการใบขาว โดยมีเชอในระดบสฟ้า 20% ระดบสเขียว 45% ระดบสเหลอง 35% แสดงให้เห็นว่า 65%
ั
ื
ี
ั
ของตัวอย่างมีปริมาณเชื้อในระดับที่ปลอดภัย (ภาพที่ 1)

434
































ิ
่
ั

ี่
ั
ื้
ภาพที่ 1 สดสวนปริมาณเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาวอ้อยในอ้อยทเก็บตวอย่างจากลาเดมในระหว่างเดือน
พฤศจกายน 2562 ถึง สงหาคม 2563 จากอ้อย 25 กอตรวจดวยวิธี nested-PCR รหัสสระบุถึง
ี
ิ
้
ิ
ระดับปริมาณเชื้อ สีฟ้า : <0.5 ; สีเขียว: >0.5 ; สีเหลือง : 1-10 ; สีส้ม: 10-100 copy/ul ในดีเอ็น
เอพืช 25 นาโนกรัม

ั
ื้
่
ี
้
ื
่
ึ้
ื
แตพบการเริ่มมีปริมาณเชอระดบสเหลองเพิ่มขนในชวงหน้าแลงระหว่างเดอนมีนาคมททาการเก็บ

ี่
ตัวอย่าง ในจ านวนนี้มีตัวอย่างที่อยู่ในกลุ่มเชื้อระดับสีส้ม (10 copy/ul ในดีเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) จ านวน
3 ตัวอย่าง ซึ่งเป็นระดับที่สามารถแสดงอาการใบขาวได้ชั่วคราวหากมีสภาวะเครียด ผลการตรวจเชื้อในต้นท ี่
้
ื
ื
ั
ั
สามารถเจริญเตบโตได แสดงให้เห็นว่าหลงจาก 4 เดอนแรก ในระยะ 7 เดอน 15.8% ของกลมตวอย่างมี
ิ
ุ่
ี
้
ื้
การเพิ่มปริมาณเชอเขาสระดบสสม (10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) ในขณะท 68.4% มีเชอใน
ี
ี่
้
ื้
ู่
ั
ั
ี
ี
ั
ื
ื้
ระดบสเหลอง (1-10 copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) และ 15.8% มีเชอในระดบสเขียว (>0.5
ี
ั
ี
ี
ื้
copy/ul ในดเอ็นเอพืช 25 นาโนกรัม) และไม่มีระดบสฟ้า แสดงให้เห็นว่าเชอใบขาวมีการเพิ่มปริมาณ
ภายในต้นตามการเจริญเติบโตของพืช (ภาพที่ 1)
ี่
ื
จากการทดลองนี้ ได้เก็บล าจากกอทเหลอมาเพาะแยกข้อตาเพื่อการวิเคราะห์การถ่ายทอดปริมาณ
เชื้อกระจายภายในล า อยู่ระหว่างการเพาะต้นเพื่อการตรวจเชื้อใบขาว

สรุปผลการทดลองและข้อเสนอแนะ

ื้
การตรวจการกระจายปริมาณเชอภายในลาอ้อยโดยการตรวจใบจากลาแม่ ก่อนน ามาข้อมาเพาะ

ั
ื้
ขยาย พบว่าระดบของเชอในข้อต่าง ๆ มีการกระจายทสอดคลองกับระดบปริมาณเชอจากลาแม่ ในกรณท ี่
ี
ื้

ั
ี่
้
้
ี่
่
ื้
เชอมีปริมาณทตา การตรวจหาตาแหน่งสะสมของเชอทาไดไม่ชดเจน ตองใชตวอย่างทมีปริมาณเชอในลา
ั
ื้
ี่
ั
ื้

้
้


มาก จะท าให้เห็นการสะสมของเชื้อชดเจนยิ่งขึ้น การตรวจพัฒนาการของการเพิ่มปริมาณเชื้อภายในลาอ้อย
ั

ั
่
ู
ู
ทปลกในสภาพไร่ พบว่ามีการเพิ่มปริมาณขึ้นสงขึ้นอีก 1 ระดบ โดยพบการเพิ่มปริมาณในชวงทมีภาวะแล้ง
ี่
ี่

435




ิ
ั้
ื้
ู่
่
้
จากนั้นเชอจะมีการสะสมมากขึ้นเมื่อเข้าสหน้าฝน ทงนี้การดาเนินงานไม่สามารถตดตามตอไดเนื่องจาก
ั
แปลงทดลองทใชประสบปัญหาแลงจดและปลวก ทาให้ตนอ้อยตาย จงทาให้ไม่สามารถตดตามการเพิ่ม
้
ี่
้


ึ
ิ
้
ปริมาณเชื้อในอ้อยตอรุ่นต่อไปได ้

การน าผลงานวิจัยไปใช้ประโยชน์
อยู่ระหว่างการด าเนินการทดลองและรวบรวมข้อมูล

ค าขอบคุณ
ู้
ขอขอบคณที่ปรึกษางานวิจัย ผช่วยนักวิจัยทุกท่าน ที่ร่วมกันด าเนินงานอย่างจริงจัง ท าให้งานวิจัย
ุ

สามารถดาเนินการได้เป้นอย่างด ี

เอกสารอ้างอิง
กอบเกียรติ ไพศาลเจริญ ธงชัย ตั้งเปรมศรี ศุภกาญจน์ ล้วนมณี ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล วันทนา ตั้งเปรมศรี นิลุบล ทว ี

กุล ทักษิณา ศันสยะวิชัย และ เกษม ชูสอน. 2553. การจัดการสมดุลธาตุอาหารพืชเพื่อเพิ่มความทนทานของ
อ้อยที่มีต่อโรคใบขาวในเขตภาคตะวนออกเฉยงเหนือ. หน้า 302-304. ใน รายงานผลงานวิจัยศูนย์วิจัยพืชไร่
ี
ั
์
ขอนแก่น ประจ าปี 2553. ศูนยวิจัยพืชไร่ขอนแก่นสถาบันวิจัยพืชไร่ กรมวิชาการเกษตรกระทรวงเกษตรและ
สหกรณ์.
ยุพา หาญบุญทรง วรรณภา ฤทธฺสนธิ์ และ ชุตินันท์ ชูสาย. 2548. การตรวจสอบเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตุโรคใบขาวอ้อย
ในเพลี้ยจักจั่นและการถ่ายทอดโรคโดยเทคนิคทางชีวโมเลกุล. วารสารวิจัย มข. 10(1): 13-21.
ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล ธีรวุฒิ วงศ์วรัตน ทักษิณา ศันสยะวิชัย สุนี ศรีสิงห์รังสี เจริญสถาพร ประพันธ์ ประเสริฐศักด ิ์
์
้
ิ
และ กอบเกียรติ ไพศาลเจริญ. 2558. วธีตรวจและวนิจฉัยโรคใบขาวของอ้อยดวยเทคนิคพีซีอาร์. ผลงานวิจัย
ิ
ดีเด่นกรมวิชาการเกษตร ประจ าปี 2557. กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. หน้า 69-89.
ศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล ทักษิณา ศันสยะวิชัย และ สุนี ศรีสิงห์. 2557.การศึกษาการเปลี่ยนแปลงของสารชีวเคมีบางชนิดใน
อ้อยที่เป็นโรคใบขาว. ใน :รายงานไตรมาส 2 ประจ าปี 2557. สถาบันวิจัยพืชไร่ กรมวิชาการเกษตร
Chen, C.T. 1978. Vector pathogen relationships of sugarcane white leaf disease. Taiwan Sugar J. 25:50-54.
Marzachì, C., R.G. Milne and D. Bosca. 2004. Phytoplasma-plant-vector relationships. In: Research signpost
recent research development in plant pathology p. 3-31.

436
10 >0.5-1/3 >0.5-3/3 >0.5-1/3 >0.5-3/3 >0.5-2/3 <0.5 <0.5 <0.5

<0.5 <0.5

9 >0.5-2/3 >0.5-1/3 >0.5-1/3 >0.5-3/3 <0.5 <0.5 <0.5 >0.5-1/3 >0.5-1/3
ปริมาณเชื อไฟโตพลาสมาในต้นที่เพาะจากข้อเรียงล าดับจากยอด (1) ไปโคน (10)



8 >0.5-3/3 <0.5 >0.5-1/3 >0.5-2/3 >0.5-3/3 >0.5-3/3 >0.5-3/3 >0.5-2/3 <0.5 >0.5-1/3 >0.5-3/3 <0.5 <0.5 >0.5-2/3



7 >0.5-3/3 >0.5-3/3 >0.5-2/3 >0.5-3/3 <0.5 <0.5 >0.5-2/3 <0.5 >0.5-1/3 <0.5 >0.5-2/3



6 >0.5-1/3 >0.5-1/3 >0.5-2/3 >0.5-2/3 >0.5-3/3 >0.5-2/3 1 <0.5 <0.5 >0.5-2/3 >0.5-1/3 >0.5-3/3 <0.5 <0.5 <0.5 1



5 >0.5-1/3 >0.5-1/3 1 >0.5-1/3 >0.5-3/3 <10 <0.5 >0.5-1/3 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 >0.5-3/3



4 >0.5-1/3 >0.5-2/3 >0.5-1/3 <0.5 <0.5 <0.5 >0.5-3/3 <0.5 >0.5-2/3 <0.5 <0.5 >0.5-1/3


>0.5-2/3 >0.5-2/3 >0.5-3/3 >0.5-1/3 >0.5-2/3 >0.5-1/3 >0.5-1/3

ภาคผนวก 3 1 1 1 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5

2 >0.5-3/3 >0.5-2/3 <0.5 >0.5-2/3 >0.5-1/3 >0.5-1/3 >0.5-1/3
ตารางที่ 1 ปริมาณเชื้อโรคใบขาวในอ้อยต้นอ่อนที่ได้จากการเพาะข้อตาจากอ้อยพันธุ์ขอนแก่น 3 ที่ได้จากแปลงอ้อยภายใน ศวร.ขก. จ านวน 20 ล า <0.5

1 >0.5-3/3 >0.5-2/3 <0.5 >0.5-2/3 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5
<0.5




รหัสสีและปริมาณเชื อในใบจากล าหลัก copy/ul in 25 ng plant DNA 1 >0.5-3/3 >0.5-3/3 >0.5-3/3 <0.5 <10 0.5-1/3 >0.5-2/3 >0.5-3/3 <0.5 >0.5-3/3 1 <0.5 >0.5-2/3 >0.5-2/3 <10 >0.5-3/3 1 >0.5-2/3 1





SecA +/- +/- +/- +/- +/- 1+ 1+ 1+ 0.5+ +/- +/- +/- +/- 0.5+ 1+ 2+ +/- 1+ 0.5+ 0.5+



PCR Product 210 bp 3+ 2+ 2+ 2+ +/- 4+ 0.5+ 1+ 2+ +/- 2+ 3+ +/- 1+ 1+ 4+ 2+ 3+ 1+ 3+
700 bp - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -



ตัวอย่าง ที่ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

437



ิ
ื
ี่
ู
ตารางที่ 2 ปริมาณเชอไฟโตพลาสมาในใบจากอ้อย 25 กอ ทปลกในสภาพไร่ ในระหว่างเดอนพฤศจกายน
ื้
2562 ถึง สิงหาคม 2563 ตรวจด้วยวิธี nested-PCR
ปริมาณเชื อcopy/ul in 25 ng plant DNA
*ปลูกซ่อม ใช้ท่อนจากต้นเดิม

ครั งที่ 1 ครั งที่ 2 ครั งที่ 3 ครั งที่ 4 ครั งที่ 5 หมายเหต ุ

ต้นที่ พย 62 ธค 62 มีค 63 มิย 63 สค 63 จ านวนล าที่ตรวจในครั งที่ 6
A1 >0.5 >0.5 <0.5 ต้นตาย ต้นตาย -
A2 >0.5 <0.5 <10 <10 <10 3

A3 >0.5 >0.5 <10 10 <10 6
A4 >0.5 <0.5 <10 <10 <10 7
A5 1 <10 >0.5 ต้นตาย ต้นตาย -

A6 <0.5 >0.5 <10 <10 <10 1
A7 <0.5 <10 <10 <10* <10 1
A8 >0.5 >0.5 <10 >0.5 <10 5

A9 <0.5 <0.5 <10 10 10 9
A10 >0.5 <0.5 <10 <10 1 3
A11 <10 <0.5 <10 <10 <10 6

A12 >0.5 >0.5 ต้นตาย 10* <10* 1
A13 <10 >0.5 <10 1 >0.5 1

A14 <10 <10 <10 <10* <10* 5
A15 <0.5 >0.5 <10 ต้นตาย ต้นตาย -
A16 <10 <0.5 ต้นตาย >0.5* <10 4
A17 <10 <0.5 <10 <10 <10 1

A18 >0.5 <10 <10 >0.5 10 1
A19 <10 >0.5 <10 <10 <10* 4

A20 >0.5 <0.5 <10 <10 >0.5 1
A21 N 1 >0.5 ต้นตาย ต้นตาย -
A22 N >0.5 >0.5 ต้นตาย <10 6

A23 N <10 >0.5 ต้นตาย ต้นตาย -
A24 N <10 >0.5 <10 <10 4
A25 N <0.5 <10 <10 <10 4









(ศุจิรัตน์ และคณะ, 2558)

438



การใช้เทคนิค HRM ตรวจสอบชนิดเชอแบคทีเรียและเชื อไฟโตพลาสมาสาเหตุโรคใบขาวในอ้อย
ื
Using High-Resolution Melting (HRM) Method for Identification of Bacteria and

Phytoplasma in Sugarcane


วีรกรณ์ แสงไสย กัญญ์ชิตา เคนเหลื่อม เบญจวรรณ รัตวัตร์ และศุจิรัตน์ สงวนรังศิริกุล
1
1
1
์
1

รายงานความก้าวหน้า
ั
ั้
เชอแบคทเรียสาเหตโรคอ้อยมีหลากหลายชนิดมีทงก่อโรคและและลกษณะแฝงอยู่ในพืช สร้างความ
ี
ื้
ุ
ี่
ิ
ี
ิ
่
ั
้
้
เสยหายกับการผลตอ้อยของไทยอย่างมาก บางโรคตดไปกับทอนพันธุ์อ้อยได การคดกรองโรคใชวิธี PCR ทมี
้
ู
ความไวสง จากปัญหาในการใชไพรเมอร์ 16S-23S ในการตรวจเชอเมื่อน าผลผลตพีซีอาร์ไปวิเคราะห์ด้วยวิธี
ื้
ิ
ี
gel electrophoresis ผลที่ได้ไม่สามารถแยกความแตกต่างของเชื้อในสกุลเดียวกันในเวลาเดยวกัน งานวิจัยนี้
มีเป้าหมายเพื่อศึกษาวิธีการตรวจและจ าแนกเชื้อวิธีใหม่ทีรวดเร็วขึ้นโดยใช้เทคนิค High-Resolution Melting
้
(HRM) การทดลองดาเนินการโดยใชไพรเมอร์จากยีน 16S-23S rDNA (p210/p1370) แลววิเคราะห์ผลดวย
้

้
เครื่อง Light Cycler® 480 Real-time PCR, Roche, Germany ผลการทดลองพบว่าวิธี HRM สามารถ
่

้
ื้
ื้

ื้
ตรวจเชอและจาแนกเชอตัวอย่างอ้อยไดอย่างน้อย 8 ชนิด แสดงถึงความจาเพาะตอเชอในอ้อย ความแม่นย า
้
้
่
้
ั
ความถูกตอง และรวดเร็ว สามารถตรวจวิเคราะห์ไดหลายตวอย่างตอครั้ง สรุปไดว่าวิธี HRM มีความรวดเร็ว
สามารถน ามาใช้ในการตรวจคัดกรองโรคในอ้อยได้อย่างมีประสิทธิภาพ
ค าส าคัญ : เชื้อแบคทีเรีย เชื้อไฟโตพลาสมา อ้อย การจ าแนกเชื้อ HRM

ค าน า
ิ
อ้อย (Sugarcane) เป็นพืชไร่ที่ส าคัญในเขตร้อน ปลูกมากกว่า 60 ประเทศ ผลิตเพื่อใช้เป็นวัตถุดบใน
การผลิตน้ าตาล โดยผลิตเป็นน้ าตาลถึง 70 เปอร์เซ็นต์ทั่วโลก (Magarey, 2020) และยังเป็นพืชเศรษฐกิจหลก
ั
ที่ส าคัญของประเทศไทย ใช้เป็นวัตถุดบหลักที่ใช้ในการผลิตน้ าตาลทรายและพลังงานทดแทน มีความส าคัญตอ
่
ิ
ระบบเศรษฐกิจของไทยเป็นอย่างมาก ไทยยังเป็นผผลตอ้อยรายใหญ่เป็นอันดับ 4 ของโลก ในปี 2563 ไทยมี
ิ
ู้
ิ
พื้นที่ปลูกอ้อยประมาณ 11 ล้านไร่ สามารถท ารายได้เป็นจ านวนเงินหลายพันล้านบาทต่อปี การเพิ่มผลผลตได ้
มากหรือน้อยยังขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย ซึ่งโรคก็เป็นปัจจัยสาคัญที่ทาให้ผลผลิตต่อไร่ลดลงถึงร้อยละ 2.93 ต่อปี


ิ
ทาให้ผลผลตของอ้อยลดลงมาเป็นเวลานาน (สานักงานคณะกรรมการอ้อยและน้ าตาลทราย, 2563) โรคอ้อย


้
ุ
้
้
ี่
ี
นั้นเกิดไดจากเชอหลายสาเหต ไดแก่ เชอรา แบคทเรีย ไวรัส และไฟโตพลาสมา เป็นตน ซึ่งโรคของพืชทเกิด
ื้
ื้

จากเชอไฟโตพลาสมา ทาความเสยหายแก่พืชเศรษฐกิจ และสร้างความเสยอย่างมหาศาลให้กับอุตสาหกรรม
ื้
ี
ี

ั
ี่
ิ
การผลตพืช ทสงผลกระทบตอการบริโภคและธุรกิจการงาน กรณโรคใบขาวของอ้อยทมีความสาคญในความ
่
ี่
ี
่

1 ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน
* Corresponding Author E-mail: [email protected]

439



ุ
ิ
เป็นโรคที่มีความรุนแรงอันดบหนึ่งของประเทศไทยมาหลายสบปีจนถึงปัจจบัน ท าให้ผลผลิตในอ้อยปลูกลดลง
ั
ู
้
้
ื
่
ี่
่
ถึง 50-70% และไม่สามารถไว้ตอได ตองปลกใหม่ ซึ่งจะมีผลทตอเนื่อง คอปัญหาการขาดแคลนทอนพันธุ์ ใน
่

แปลงทเป็นโรคไม่รุนแรงเมื่อเกษตรกรใสปุ๋ยและให้น้ากับอ้อยจะทาให้อาการของโรคเห็นไม่ชดเจน เกษตรกร
ั
ี่
ยังคงเก็บเกี่ยวผลผลตไดและใช้ขยายพันธุ์ต่อไป ท าให้ปัญหาโรคใบขาวยังคงอยู่ ในการส ารวจแปลงอ้อยมักจะ
้
ิ
ี
พบโรคที่เกิดจากเชื้อแบคทเรียร่วมด้วย ได้แก่ โรคใบลวก โรคตอแคระแกร็น เกิดจากเชอโรคเน่าคออ้อย และ
ื้
ี่
่
่
โรคใบขีดแดงและยอดเน่า ซึ่งอาการของโรคนั้นแสดงแตกตางกันในแตละอาการทปรากฏ ซึ่งบางอาการของ



ุ
้
ื้
โรคนั้นเกิดร่วมกันทาให้เกิดความลาบากในการจาแนกเชอสาเหตโรค ปัจจบันโรคนั้นไดแพร่กระจายอย่าง
ุ
กว้างขวางและเพิ่มความเสียหายให้อ้อยเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ จึงจ าเป็นต้องศึกษาการจ าแนกชนิดของเชื้อเป็นข้อมูลไว้
ื้
ี่
ั
สาหรับในการป้องกันก าจด ปัจจบันมีวิธีการจาแนกและตรวจสอบเชอสาเหตุโรคทมีความรวดเร็ว โดยเฉพาะ
ุ


้
ทางดานชวโมเลกุลให้สามารถน ามาประกอบการวินิจฉัย และสร้างความเชอมั่นในความแม่นย าและถูกตอง
้
ื่
ี
ั

เพียงพอ สาหรับการไดมาซึ่งข้อมูลสาคญในการวิเคราะห์ประกอบการเกิดโรคและการแพร่ระบาด เพื่อการ

้
้
้
ี่
ั
ี
ี่
จดการควบคมโรคทมีประสทธิภาพ เทคนิคทางชวโมเลกุลทสามารถตรวจไดรวดเร็วและแม่นย า มีอยู่ดวยกัน
ุ
ิ
ื้
หลายวิธี โดยวิธีการอาศยการตรวจหาดเอ็นเอเป้าหมายของเชอ วิธีทนิยมในปัจจบัน ไดแก่ เทคนิค PCR
้
ั
ุ
ี
ี่
ี
ื
ิ้
่
(Polymerase chain reaction) และ Real time PCR คอ วิธีการเพิ่มปริมาณชนสวนดเอ็นเอดวยปฏิกิริยา
้
้
่
ิ
ี่
ุ
ี
ลกโซ่โพลเมอเรส สามารถชวยให้ปริมาณดเอ็นเอเป้าหมายมากขึ้นอย่างรวดเร็ว ดวยชดไพรเมอร์ทมี
ู
ั่
ื้
่

ความจาเพาะตอยีนเป้าหมายของเชอ ใชเวลาใน 2 ถึง 3 ชวโมงในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (Chatenet
้
et al. 2005) ปัจจุบันนิยมใช้ดีเอ็นเอไพร์เมอร์ เช่นยีน 16S RNA, 16S-23S rRNA, gyrase gene, ribosomal
protein genes และ tuf gene ซึ่งมีความจ าเพาะเจาะจงกับเชอ จากปัญหาในการใชไพรเมอร์ 16S-23S ISR
ื้
้
ี่
ในการตรวจเชอไฟโตพลาสมา เมื่อน าผลผลตพีซีอาร์ไปวิเคราะห์ดวยวิธี gel electrophoresis ผลทไดไม่
้
ื้
ิ
้
สามารถแยกความแตกตางของเชอในสกุลเดยวกันในเวลาเดยวกัน ขณะนี้ไดมีเทคนิคการวิเคราะห์การคลาย
่
ื้
้
ี
ี
เกลียวของสายดีเอ็นเอหรือเทคนิค HRM (high-resolution melting analysis) มาใช้ส าหรับตรวจหาดเอ็นเอ
ี
ั
้
ึ
ี
ี
่
เป้าหมายซึ่งดเอ็นเอเป้าหมายแตละชนิดจะมี melting temperature เฉพาะตว จงสามารถใชยืนยันดเอ็นเอ
ื้
เป้าหมายที่ต้องการได้ ดังนั้นการใช้วิธี HRM สามารถตรวจและจ าแนกเชอที่เป็นสาเหตุของลักษณะอาการของ

ั

ี
์
ู

้
ื้
้
โรคอ้อยได โดยไม่ตองวิเคราะห์ลาดบนิวคลโอไทดเพื่อพิสจน์ชนิดของเชอ ทาให้แก้ปัญหาเรื่องการจาแนก
ี่
้
ุ
อาการโรคอ้อย ทมีลักษณะที่คล้ายกันมากออกจากกันได โดยไม่ต้องใช้วิธี gel electrophoresis จึงลดตนทน
้
้
้
ิ
ุ
้
ี
ในการวิเคราะห์และลดปัญหาดานสขภาพและของเสยจากห้องปฏิบัตการได ปัจจบันนิยมใชเทคนิคนี้ในดาน
ุ
้
ื้
การแพทย์ และสัตวแพทย์ ในการจ าแนกชนิดเชอโรคที่ก่อโรคในคนและสัตว์ ส าหรับด้านเกษตรยังไม่มีการน า
้
้
่
เทคนิคมาใช และเทคนิคนี้ยังสามารถใชตรวจสอบความผดปกตของยีน และใชหาจโนไทป์ของยีนตาง ๆ ท ี่
้
ิ
ี
ิ
สนใจได้ (Wittwer et al. 2003) จึงเป็นที่มาของงานวิจัยนี้เพื่อตรวจสอบชนิดสาเหตุโรคอ้อยด้วยเทคนิค HRM
ที่มีความถูกต้อง แม่นย า เพื่อระบุชนิดของเชื้อได ้

440



วิธีการด าเนินการ

1. การส ารวจเก็บตัวอย่างอ้อยและแยกเชื อแบคทีเรีย
ส ารวจโรคและเก็บตัวอย่างอาการโรคอ้อยจากแหล่งปลูกของเกษตรกร จังหวัดขอนแก่น นครราชสีมา

็
และก าแพงเพชร การแยกเชื้อแบคทีเรีย เลือกตัดชิ้นส่วนพืชทแสดงอาการ โดยตัดบริเวณทเปนโรคและไม่
ี่
ี่
่
ื้
ุ่
่
ิ้
ิ้
ิ
เป็นโรค ขนาดชนสวนพืชประมาณ 0.5 x 0.5 มิลลเมตร 1-2 ชน จมแชในน้ านึ่งฆ่าเชอ นาน 1-2 นาท ใช ้
ี
ี
ั
่
ปากคบฆ่าเชอหยิบชนสวนพืชดงกลาว วางบนหยดน้ า 10-20 ไมโครลตร ตดให้เป็นชนเลก ๆ ทงไว้ 3-5
ื้
่
ิ้
ิ้
ิ
ั
็
ิ้
้
ื้
้
ู
ี่
ื้
ี้
นาทแลวใชลปทฆ่าเชอ จมในหยดน้ า น ามาลาก (streak) บน อาหารเลยงเชอ วางจานเลยงเชอใสใน
่
ื้
ี
ี้
ุ่
ื้
ื
ี่
ิ
ถุงพลาสตก คว่ าจานลง บ่มเชอไว้ทอุณหภูมิห้อง (ประมาณ 30 องศาเซลเซียส) 1-2 วัน จากนั้นเลอก
ี้
ื้
โคโลนีของเชื้อแบคทีเรียที่เจริญมีเลือกแตะโคโลนีเดี่ยวน ามาเลยงบนอาหารจนได้เชื้อบริสุทธิ์ เก็บรักษาเชอ
บริสุทธิ์โดยเลยงเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ บ่มเชื้อไว้ที่อุณหภูมิห้อง 24-48 ชั่วโมง เขี่ยเชื้อ 1 ลูปเต็มละลายใน
ี้
น้ ากรองนึ่งฆ่าเชื้อ ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เก็บที่อุณหภูมิห้อง เก็บเชื้อบนอาหารเอียงเททับด้วยพาราฟินเหลว
ี
์
ย้อมแกรมศึกษาแบคทเรียย้อมสี สีจะติดตามผนังเซลลท าให้เห็นความแตกต่างระหว่างเซลล์แบคทีเรียชนิด
่
ี
ี่
ิ้
้
่
่
ตาง ๆ ได โดยน าแบคทเรียมาเกลยบนแผนสไลดทงไว้ให้แห้ง น าไปผานเปลวไฟ 2-3 ครั้ง เพื่อตรึง
์
่
้
แบคทเรียให้ตดกับแผนสไลด หยดส Crystal violet ลงให้ทวมทงไว้ 30 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน หยด
ั่
ิ้
ี
้
ิ
่
ี
์
ี
สารละลายไอโอดีน ทิ้งไว้ 30 วินาที ล้างออกด้วยน้ ากลั่น ล้างสีออกด้วยแอลกอฮอล์ 95เปอร์เซนต์ประมาณ
ี
้
์
ั่
้
้
ั่
20 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน ย้อมดวยส Safranin O ทงไว้ 30 วินาท ลางออกดวยน้ ากลน ซับสไลดให้
ี
้
ิ้
้
ี
ิ
ี
ุ
แห้ง น าไปสองดแกรมแบคทเรียภายใตกลองจลทรรศน์ แบคทเรีย แกรมบวกจะย้อมตดสน้ าเงินของ
้
ี
่
ู
ี
้
Crystal violet และแบคทีเรียแกรมลบจะย้อมติดสีแดง Safranin O
2. การสกัดดีเอ็นเอ
ี
2.1 การสกัดดีเอ็นเอแบคทเรีย : สกัดดีเอ็นเอจากโคโลนีของเชอแบคทเรียที่แยกจากตัวอย่างอ้อย
ี
ื้
ด้วยชุดสกัดส าเร็จรูป NucleoSpin Tissue (MACHEREY-NAGEL, Germany) ตรวจพิสูจน์ชนิดของเชื้อใน
ตัวอย่างแต่ละอาการด้วยการตรวจล าดับนิวคลีโอไทด์ต าแหน่ง 16S-23S rDNA
2.2 การสกัดดีเอ็นเอพืช : ตัวอย่างใบสดจากอ้อยทแสดงอาการและไม่แสดงอาการทส ารวจไดจาก
ี่
้
ี่
ี
ั
้
่
แหลงระบาดของโรคในจงหวัดขอนแก่น นครราชสมา และก าแพงเพชร สกัดดเอ็นเอจากใบดวยการ
ี
ี
ประยุกต์ CTAB method ตามวิธีของ Li and Midmore (1999) ตรวจวัดปริมาณและคณภาพดเอ็นเอพืช
ุ
ด้วย Nano drop (Nano Drop Lite Spectrophotometer, Thermo Scientific, USA) ตรวจพิสูจน์ชนิด
ของเชื้อในตัวอย่างแต่ละอาการด้วยการตรวจล าดับนิวคลีโอไทด์ต าแหน่ง 16S-23S rDNA
3. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ และวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด ์
ท าการเพิ่มปริมาณชนดีเอ็นเอด้วยเทคนิค PCR โดยแต่ละปฏิกิริยามีปริมาตรสทธิ 15 µl มีความ
ิ้
ุ
้
เข้มข้นสุดทายของส่วนผสมดังนี้ 1X PCR buffer, 1.5 mM MgCl , 0.2 mM dNTP, 0.1 U Taq
2
polymerase, 0.34 µM Primer และ 25 ng/µl สารละลายดีเอ็นเอที่สกัดได้แล้วน าไปท าปฏิกิริยาใน
เครื่อง เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (Veriti Thermal Cycler, USA) มีขั้นตอนดังนี้ Pre-denaturing 94 °C นาน
5 นาท, denaturing 94 °C นาน 1 นาท, annealing 50 °C นาน 1 นาท, extension 72 °C นาน 1 นาท ี
ี
ี
ี

441



(ท าซ้ า denaturing, annealing และ extension จ านวน 35 รอบ) และ final extension 72 °C นาน 7

ิ
นาที น าผลผลต PCR มาตรวจสอบด้วยวิธี agarose gel electrophoresis และน ามาทาให้ผลผลิต PCR

ุ
บริสุทธิ์ด้วยชุดน้ ายาส าเร็จรูป GF-1 AmpbiClean Kit (Vivantis, Vivantis) ส่งผลผลิต PCR บริสทธิ์ไปหา
ล าดับนิวคลีโอไทด์โดย Solegent (Korea)

4. การสร้าง Phylogenetic tree
์
ั


ั
ี
ทาการจดลาดบนิวคลโอไทดให้ถูกต้องด้วยโปรแกรม BioEdit v 7.1 และ Clustal W จากนั้นทาการ

สร้าง phylogenetic tree ด้วยโปรแกรม MEGA ver. 5.05 ด้วยวิธี Neighbor-Joining โดยใช้โมเดล Kimura
2- parameter ด้วยการสุ่มข้อมูล (bootstrap) จ านวน 1,000 ครั้ง
5. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี Real-time PCR และการวิเคราะห์ HRM
ี
ิ้
้
น าสารละลายดเอ็นเอ (25 ng/µl) ทสกัดไดมาเป็นตนแบบในการเพิ่มปริมาณชนเอ็นเอ โดยใชไพร
ี่
้
้
ิ
ี่

เมอร์ 16S-23S ทาปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดเอ็นเอตามข้อ 2 จากนั้น น าผลผลตทไดมาเจอจางอัตราสวน 1:200
ี
ื
้
่
ี
่
ั
ุ
้


สาหรับเป็นดเอ็นเอตนแบบในทา PCR ปริมาตรสทธิ 15 µl ซึ่งมีสวนผสมของปฏิกิริยาดงนี้ 1X PCR buffer,
2.0 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.1 U Taq polymerase 0.2 µM p210-R (5’GAGGAAIGIGGAIGACGT3’)/p1370
F(5’AGICCCGIGAACGTATTCAC3’) และ 3.34 µM Syto9 dye วิเคราะห์คาการคลายเกลยวของสายดเอ็น
ี
่
ี
ี่
เอ (melting temperature; Tm) ทตดตงอยู่ในเครื่องเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรมในสภาพจริง (Light
ั้
ิ
Cycler® 480 Real-time PCR, Roche, Germany) มีขั้นตอนดงนี้ initial-denaturing 94 °C นาน 5 นาท,
ี
ั
ี
denaturing 94 °C นาน 30 วินาท, annealing 50 °C นาน 30 วินาท, extension 72 °C นาน 40 วินาท ี
ี

(ทาซ้ า denaturing, annealing และ extension จานวน 40 รอบ) จากนั้นทาการ เพิ่มอุณหภูมิตงแต 65 °C

่
ั้

ถึง 95 °C โดยเพิ่ม 0.03 °C ต่อวินาที เมื่อสนสุดให้ลดอุณหภูมิลงที่ 40° C นาน 30 วินาท วิเคราะห์ melting
ี
ิ้
peak ดวยโปรแกรม Tm calling และสร้าง Normalized melting curves โดยโปรแกรม Gene Scanning
้
1.5.0 (Roche Diagnostics, Germany)

ผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
1. การจัดกลุ่มเชื อแบคทีเรียในอ้อย
ี
การย้อมแกรมแบคทีเรียสามารถแบ่งกลุ่มแบคทีเรีย เป็น 2 กลุ่ม จากลักษณะการติดสีแกรมแบคทเรีย
กลมท 1 คอ แบคทเรียแกรมลบ Sphinggomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans,
ี
ุ่
ี่
ื
Pantoea stewartii, Curtobacterium sp., Acinetobacter radioresistens, Entrobacter sp. และ
้
ี่
ี
ุ่
ื
Acinetobacter radioresistens กลมท 2 คอ แบคทเรียแกรมบวก ไดแก่ Bacillus pumilus, และ
Streptomyces spp. (ภาพที่ 1)


การทาปฏิกิริยา PCR และการวิเคราะห์ลาดบนิวคลโอไทด พบว่ามีขนาดความยาวของชนยีน 1,000
ี
์
ิ้
ั
้
ุ่
ั
ี่
ี่
ั
bp (ภาพท 2) เมื่อน ามาสร้าง Phylogenetic tree (ภาพท 3) พบว่าสามารถจดกลมตวอย่าง ไดเป็น 2 กลม
ุ่
ุ่
ี่
ุ่
คอ กลมท 1 เป็นกลมของเชอแบคทเรียแกรมลบ ไดแก่ Sphinggomonas paucimobilis, Pseudomonas
้
ี
ื้
ื
oryzihabitans, Pantoea stewartii, Curtobacterium sp., Acinetobacter radioresistens,

442



Entrobacter sp. และ Acinetobacter radioresistens กลุ่มที่ 2 เป็นกลุ่มของเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกและ

้
ไฟโตพลาสมา ไดแก่ Bacillus pumilus, Streptomyces spp. และ Sugarcane white leaf เมื่อพิจารณา
ั
ื้
้
ี
ื้
คาความเหมือน (% similarity) พบว่า เชอแบคทเรียและเชอไฟโตพลาสมา มีระดบความคลายคลง 95-99%
่
ึ
ี
ั

ี
ื้
ตามลาดบ พบว่าเชอไฟโตพลาสมามีวิวัฒนาการมาจากแบคทเรีย บรรพบุรุษเป็นแบคทเรียแกรมบวกอยู่ใน
คลาสเดียวกับเชื้อ Bacillus sp. ท าให้เชื้อทั้งสองมีความคล้ายคลึงกัน (Chen et al. 2012)
2. การจ าแนกเชื อแบคทีเรียด้วยวิธี HRM
ผลการทาปฏิกิริยา PCR ดวยไพรเมอร์ HRM p210-R / HRM p1370-F จากตวอย่างจานวน 96
้


ั
ตวอย่าง มีทงแสดงและไม่แสดงอาการจากการตดเชอ มาวิเคราะห์คาการคลายเกลยวของสายดเอ็นเอ
ี
ั
ี
ิ
ื้
ั้
่
้
ุ่
้
ื้
ี่
ี่
่
(melting temperature; Tm) ดวยโปรแกรม Tm calling ไดคาเฉลย Tm (ภาพท 4) แบ่งเป็น 6 กลมเชอ
ุ่
ื
ี่
ั
่
ื้
ดงนี้ กลมท 1 คา คอ เชอ Pantoea stewatii, Sphinggomonas paucimobilis และ Pseudomonas
oryzihabitans มีคา Tm 85.01 C จานวน 5 ตวอย่าง Bacillus mycoides มีคา Tm 85.01 C จานวน 3
๐
่

่
ั

๐
ตวอย่าง กลมท 2 คอ Sugarcane white leaf มีคา Tm 85.84 C จานวน 13 ตวอย่าง กลมท 3 คอ
ื
ี่

ุ่
ั
๐
ื
ั
ี่
ุ่
่
Bacillus pumilus มีคา Tm 85.84 C จานวน 8 ตวอย่าง กับ Curtobacterium sp. มีคา Tm 85.84 C
๐
๐
ั
่

่

ั
ื้
๐
่
ุ่
ุ่

ั
ี่
ี่
ื
จานวน 6 ตวอย่าง กลมท 4 คอ เชอ Streptomyces sp. มีคา Tm 86.04 C จานวน 14 ตวอย่าง กลมท 5
่
ื
ุ่
ื้
๐
ั
คอ เชอ Acinetobacter radioresistens มีคา Tm 86.33 C จานวน 16 ตวอย่าง และ กลมท 6 คอ เชอ
ี่
ื้

ื
Enterobacter sp. มีค่า Tm 87.64 จ านวน 31 ตัวอย่าง พบว่าภายในกลุ่มที่ 1 และ 3 มีค่า Tm ใกล้เคียงกัน
ี
มากไม่สามารถแยกออก การจาแนกความแตกตางของจโนไทป์ จากการสร้างกราฟ Normalized melting

่
ื้
ุ
ี่
curve ดวยโปรแกรม Gene Scanning (ภาพท 2) พบว่าสามารถแยกเชอแบคทเรียจากเชอบริสทธิ์ ออกเป็น
ื้
้
ี
ั
ุ่
ั
8 กลม อย่างชดเจนดงนี้ 1) Enterobacter sp. 2) Bacillus subtilis 3) Pseudomonas oryzihabitans
4) Acinetobacter radioresistens 5) Pantoea stewartii 6) Sphinggomonas paucimobilis 7)
่
ี่
Sugarcane white leaf และ 8) Curtobacterium sp. (ภาพท 5 และ 6) สวนตวอย่างอ้อย สามารถแยก
ั
ุ่
เชอแบคทเรีย ออกเป็น 8 กลม อย่างชดเจนดงนี้ 1) Streptomyces spp. 2) Bacillus pumilus 3)
ั
ี
ั
ื้
Entrobacter sp. 4) Acinetobacter radioresistens 5) Pantoea stewartii 6) Bacillus mycoides 7)
ื้

Curtobacterium sp. และ 8) Sugarcane white leaf ดังนั้นการใช้วิธี HRM สามารถตรวจและจาแนกเชอ
้
แบคทีเรียที่มีอาการและไม่แสดงอาการได โดยไม่ต้องวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์เพื่อพิสูจน์ชนิดของเชื้อ ท าให้
ี
ื้
ี่

แก้ปัญหาเรื่องการจาแนกอาการโรคอ้อย โดยเฉพาะโรคทเกิดจากเชอแบคทเรียและไฟโตพลาสมา ซึ่งมี
้
ิ
ั
ี่
้
้

้
ลกษณะทคลายกันออกจากกันได มีรายงานการวิจยใช เทคนิค PCR และวิเคราะห์ผลผลตดวย HRM ทาให้
ั
ื้
้
สามารถแยกจโนไทป์ ของเชอ Mycoplasma gallisepticum 30 ไอโซเลทไดอย่างรวดเร็ว (Seyed et al.,
ี
2010 และ ธีรวุฒิ และคณะ, 2559) ไดใช้วิธีการวิเคราะห์ HRM เพื่อแยกความแตกต่างของเชื้อไฟโตพลาสมา
้
ุ่
้
ุ่
้
สาเหตของโรคอ้อย พบว่า สามารถแยกเชอได 3 กลม ไดแก่ กลมเชอไฟโตพลาสมาโรคใบขาว ใบขาวกอฝอย
ุ
ื้
ื้
้
้
และกอตะไคร้ Choochai et al. (2013) ไดพัฒนาวิธีการตรวจสนิป rs5896 ของยีน prothrombin ดวยวิธี
PCR และ HRM โดยใชตวอย่างประชากรจงหวัดขอนแก่นททราบจโนไทป์แลวน ามาเพิ่มปริมาณดวยวิธี PCR
้
้
ั
ั
้
ี่
ี
และวิเคราะห์ดวยวิธี HRM ผลการทดลองสามารถแยกความแตกตางระหว่างจโนไทป์ตาง ๆ ได สาหรับการ
่
่

้
ี
้

443



ิ
ตรวจสนิป rs5896 ของ prothrombin ซึ่งมีความเกี่ยวพันกับการเกิดนิ่วไตในคนไทยภาคอีสาน ปรางทพย์
ี่
ื้
่
ั
้

ู
อุทยวัตร (2558) ไดตรวจจาแนกสายพันธุ์เชอ Human Papillomavirus ชนิดเสยงสงตอ การเกิดมะเร็งปาก
้
ู
ื้
มดลกดวยเทคนิค real-time PCR ร่วมกับ HRM พบว่ามีความไวในการตรวจหาเชอ HPV ท 103 copies ใช ้
ี่
เวลาเพียง 90 นาท และไม่พบการ cross-reaction ระหว่างสายพันธุ์ การวิเคราะห์ผลผลตจาก PCR ดวยวิธี
้
ิ
ี
ั

้

ี่
ี
์

HRM ไม่จาเป็นรู้ลาดบนิวคลโอไทด และเป็นวิธีทให้ผลการทดลองเร็ว สามารถทาไดง่าย มีความไวของ
ู
ปฏิกิริยาสง เหมาะสาหรับการวิเคราะห์ตวอย่างจานวนมากในแตละครั้ง (Chia-Cheng et al. 2011) มี
่
ั


ั
้

่
ั
คาใชจายทประหยัดกว่าการจาแนกเชอไฟโพลาสมาดวยหาลาดบนิวคลโอไทดของแตละตวอย่าง และน ามา
ี
์
่
้
ื้
ี่

่
ี่
ั
สร้าง phylogenetic tree การใชวิธี HRM มีประโยชน์ในการตรวจสอบและจาแนกเชอในตวอย่างทไม่แสดง
ื้

้
อาการของโรคอ้อยและงานวิจัยด้านการติดเชื้อข้ามชนิด



้
ื้
้
ี่
ี
ั
ภาพที่ 1 เชอแบคทเรียทแยกไดจากตวอย่างอ้อย ไดแก่ 1.1 Enterobacter cloacae 1.2 Acinetobacter
Radioresistens 1.3 Pantoea stewartii 1.4 Sphingomonas paucimobilis 1.5 Bacillus subtilis 1.6
Streptomyces spp. 1.7 Pseudomonas oryzihabitans 1.8 Curtobacterium sp.




ภาพที่ 2 ผลการวิเคราะห์ขนาดชิ้นดีเอ็นเอบริเวณ 16s rDNA เชื้อแบคทีเรียและเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย

444



























ภาพที่ 3 ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของเชื้อแบคทีเรียและเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย
























้
ื้
ภาพที่ 4 การวิเคราะห์ Melting curve ดวยวิธี real-time PCR บริเวณยีน 16S-23S rRNA เชอแบคทเรีย
ี
และเชื้อไฟโตพลาสมาในอ้อย














ภาพที่ 5 การวิเคราะห์ Normalized ดวยวิธี real-time PCR บริเวณยีน 16S-23S rRNA ตวอย่างเชอ
ื้
้
ั
แบคทีเรียที่แยกจากตัวอย่างอ้อย

445




















่
้
ภาพที่ 6 การวิเคราะห์ความแตกตาง High-resolution difference plots ดวยวิธี real-time PCR บริเวณ
ยีน 16S-23S rRNA ตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียที่แยกจากตัวอย่างอ้อย













้
ภาพที่ 7 การวิเคราะห์ Normalized ดวยวิธี real-time PCR บริเวณยีน 16S-23S rRNA ตวอย่างจาก
ั
ตัวอย่างอ้อย

















ภาพที่ 8 การวิเคราะห์ความแตกต่าง High-resolution difference plots ด้วยวิธี real-time PCR บริเวณ

ยีน 16S-23S rRNA ตัวอย่างจากตัวอย่างอ้อย

สรุปผลการทดลองและข้อเสนอแนะ
เชอแบคทีเรียและเชอไฟโตพลาสมาในอ้อยจากการสร้างกราฟ Phylogenetic tree ด้วยล าดับนิวคล ี
ื้
ื้
ื้
ั
โอไทดบริเวณ 16S-23S rDNA พบว่าสามารถจดกลมเป็น 2 กลม ไดแก่ 1) เชอแบคทเรียแกรมลบ ซึ่งระดบ
ี
้
ั
ุ่
ุ่
์
ั
ความเหมือนกันที่ 95-99% 2) เชื้อแบคทเรียแกรมบวกและเชื้อไฟโตพลาสมาสาเหตโรคใบขาว มีระดับระดบ
ี
ุ
ความเหมือนกันที่ 98-99% ซึ่งเชื้อไฟโตพลาสมามีวิวัฒนาการมาจากแบคทีเรีย บรรพบุรุษเป็นแบคทีเรียแกรม
่
บวกอยู่ใน คลาสเดียวกับเชื้อ Bacillus sp. ท าให้เชื้อทั้งสองมีความคล้ายคลึงกัน ผลการจ าแนกความแตกตาง
ของจีโนไทป์ของเชื้อแบคทีเรียด้วยวิธี HRM ท าให้สามารถแยกเชื้อสาเหตุโรคและเชื้ออื่นๆ ที่อยู่ในตัวอย่างอ้อย