คู่มือมาตรฐานห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา 2560

แต่เนื่องจากการตรวจสอบซ้�ำ โดยวิธี Southern hybridization ดังกล่าว ใช้เวลานานอีก 2-3 วัน และต้องใช้
เครอื่ งมือและเทคนิคพิเศษอีกหลายชนดิ จงึ ไม่เป็นท่ีนยิ มในห้องปฏบิ ัติการท่ัวไป
3.2 Enzymatic detection of amplified products เปน็ การตรวจหา amplicon ท่เี กิดขึ้น โดยใช้
probe ท่จี ำ� เพาะเปน็ ตวั ตรวจตดิ ตาม ซ่ึง probe ทีจ่ �ำเพาะน้ีจะถูกตดิ ฉลากดว้ ยเอนไซม์ ซงึ่ สามารถท�ำให้เกดิ การ
เรอื งแสงหรอื เปลีย่ นสี ซ่ึงสามารถตรวจสอบได้
3.3 Reverse hybridization เน่ืองจากการท�ำ Southern hybridization เป็นวิธีท่ียุ่งยาก ใช้เวลา
นาน จึงมีการปรับเทคนิคให้สะดวกแก่การใชง้ านจริง และใช้เวลาน้อยลง กลา่ วคอื แทนทจี่ ะใส่ probe ทีจ่ �ำเพาะ
ในปฏิกิริยาตรวจหา amplicon เพ่ือให้เกิด hybridization ก็ดัดแปลง โดยการน�ำ probe ที่จ�ำเพาะมา
immobilize ลงบนแผ่นกระดาษ เพ่ือรอการเติม amplicon ท่ีได้จากการเตรียมโดยการเพ่ิมจ�ำนวนจากส่ิงส่ง
ตรวจ ซ่งึ ถา้ amplicon นนั้ ๆ มีความจ�ำเพาะกบั immobilized probe กจ็ ะเกดิ แถบสีบนแผน่ กระดาษ ซ่ึงจลุ ชพี
แตล่ ะชนดิ นา่ จะทำ� ใหเ้ กดิ amplicon จำ� เพาะทมี่ ขี นาดแตกตา่ งกนั สามารถวนิ จิ ฉยั ชนดิ ของจลุ ชพี ในสง่ิ สง่ ตรวจได ้
ตัวอย่างที่ใช้ในทางคลินิก เช่น INNO-LiPA ท่ีใช้ตรวจหา Mycobacterium spp. ต่างๆ ตลอดจน anti-
tuberculous drug (rifampin, kanamycin, ethambutol) resistant ใน M. tuberculosis กเ็ ปน็ เทคนิคของ
reverse hybridization ซง่ึ ใชเ้ วลาในการด�ำเนนิ การท้ังส้นิ ประมาณ 6 - 8 ชว่ั โมง หลงั ได้รบั สิง่ ส่งตรวจ
3.4 DNA sequencing เปน็ การตรวจหาลำ� ดบั กรดนวิ คลอิ ิกในสาย DNA หรือ amplicon ท่เี กดิ ขนึ้
เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมเพิ่มขึ้น แม้จะยังค่อนข้างยุ่งยากมีเครื่องมือและอุปกรณ์เฉพาะ และต้องอาศัย
ประสบการณ์ การน�ำล�ำดับของนิวคลีโอไทด์มาเทียบกับคลังข้อมูลที่มี ซึ่งนอกจากจะมีประโยชน์ในด้านการ
วินิจฉัยชนิดของเช้ือแล้ว ยังมีประโยชน์ในการหาล�ำดับเบสที่เปล่ียนแปลงบนสาย DNA ซ่ึงสามารถวิเคราะห์การ
กลายพันธ์ุ หรือใชเ้ ปรียบเทยี บความเหมอื นของสายพันธุ์ในเชงิ ระบาดวทิ ยาได้ การทำ� sequencing ในปจั จบุ ัน
มหี ลายวธิ ี ซง่ึ มกี ารดดั แปลงไปจากวธิ ดี ง้ั เดมิ ของ Sanger เชน่ Pyrosequencing ในการวเิ คราะหก์ ารดอื้ ยาของเชอื้
ต่อจากการท�ำ broad-range PCR หรือวิเคราะห์การกลายพันธ์แบบ Single nucleotide polymorphism
(SNP) ในคนท่อี าจเส่ยี งต่อโรค หรอื การตดิ เชือ้ Next-generation sequencing (NGS) เปน็ การวเิ คราะหล์ �ำดับ
กรดนวิ คลิอกิ บนสาย DNA หรือ amplicon หลายสายพรอ้ มๆ กัน ท�ำใหม้ ขี อ้ มลู ล�ำดบั กรดนิวคลอิ ิกจำ� นวนมากที่
น�ำไปวิเคราะหต์ อ่ ดว้ ยวธิ ีทาง bioinformatics และมปี ระโยชน์ในเชิงระบาดวิทยาดว้ ย
3.5 Microarray analysis ไม่ใช่เทคนิคของการวิเคราะห์ล�ำดับกรดนิวคลิอิกโดยตรง แต่เป็นการ
วิเคราะหโ์ ดยใช้ primers หลายๆ คทู่ ี่มกี ารติดฉลากด้วยสารเรอื งแสงหรอื สารมีสี เพื่อการตรวจวิเคราะห์ DNA
หรือ amplicon จ�ำนวนมากที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยาเดียวกัน นิยมใช้ในการวิเคราะห์ยีนดื้อยา การตอบสนองของ
host หรือใช้ในการตรวจหายาใหม่ๆ ตัวอย่างเช่น Verigene system (Nanosphere) ตรวจวินิจฉัยชนิดของ
จลุ ชีพกอ่ โรค (Gram-positive, Gram-negative, Yeast) และ/หรอื การดอ้ื ยา จากขวดเลอื ดท่ีมีสัญญาณเตือนว่า
พบจุลชพี และแยกชนิดเบอ้ื งต้นด้วยการยอ้ มสีแกรม (ในกรณีนี้ ไม่จ�ำเปน็ ต้องเพิ่มจำ� นวนเช้ือกอ่ น เน่อื งจากเชื้อมี
ปริมาณมากเพียงพอ)
3.6 Real-Time nucleic acid amplification (Rapid-cycle PCR) เป็นเทคนคิ ทพ่ี ฒั นาการตรวจ
หา amplicon ที่เกิดจากปฏิกิริยา PCR โดยปรับให้การเพ่ิมและลดอุณหภูมิ ในปฏิกิริยา PCR เกิดขึ้นได้อย่าง
รวดเร็วกว่าปกติ ในเคร่ือง Real-Time PCR และให้มี fluorochrome ในปฏิกิริยา เพื่อตรวจจับ amplicon
ที่เกิดขึ้นได้ทันที ขณะปฏิกิริยาด�ำเนินอยู่ เป็นการลดการปนเปื้อนจากภายนอก และเพิ่มความรวดเร็วในการ

คูม่ ือ84 ทมาาตงรกฐาารนแหพ้องทปยฏ์แบิ ลตั ิกะาสราจธลุ าชรีวณวทิ สยุขา

ตรวจหา amplicon หลกั การของ Real-Time PCR เปน็ ทน่ี ยิ มแพรห่ ลายในปัจจุบนั ในการตรวจหาจลุ ชีพกอ่ โรค
ท่ัวไป เช่น S. aureus หรือตรวจหาจุลชีพโดยตรงจากสิ่งส่งตรวจ เช่น nasal colonization for MRSA
หรือตรวจหา toxin ของ Clostridium difficile จากอุจจาระ รวมถึงการตรวจหายีนด้ือยาในกรณีของ
M. tuberculosis จากเสมหะโดยตรงด้วย วิธีการตรวจหามหี ลายวธิ ี เช่น
3.6.1 SYBR Green ซ่ึงเป็น fluorochrome ชนิดหน่ึง ที่สามารถจับกับ DNA สายคู่ (double
stranded DNA) ไดด้ ี และเมือ่ จับกับ DNA สายค่แู ลว้ จะเกิดการเรืองแสงทีส่ ามารถตรวจวดั ได้ ทำ� ให้มีความไวใน
การตรวจจับสูง แต่มีความจ�ำเพาะต่�ำ เพราะสามารถจับกับ DNA สายคู่ใดๆ ก็ได้ จึงอาจต้องใช้ SYBR Green
ควบคกู่ ับ detector ตัวอ่นื เพ่อื เพม่ิ ความจำ� เพาะ
3.6.2 Third-Generation DNA-Binding Dyes เปน็ ชนดิ ของ dye ทม่ี ปี ระสทิ ธภิ าพสงู ราคาไมแ่ พง
และสามารถแยกความแตกต่างของ SNP ได้ แต่ยังไม่มีผู้ผลิตจำ� หน่ายในปัจจบุ นั
3.6.3 Hybridization probes ท่ีนยิ มใช้ในปจั จุบนั มีหลายชนดิ ไดแ้ ก่ Hydrolysis หรอื Taqman
probes, FRET probes, Molecular beacons การเลือกใช้ probe ชนิดใด ถูกก�ำหนดโดยเครอ่ื งมอื ด้วย เช่น
ABI 7500 series (Applied Biosystems) และ Roche (COBAS) จะใช้ hydrolysis probes ถ้าเป็น Light
Cycler จะใช้ FRET-probe ในขณะที่ SmartCycler อาจใช้ Molecular beacon หรือ hydrolysis probe ก็ได้
แตบ่ างเครือ่ ง เชน่ RotorGene (Qiagen) ไมจ่ ำ� กดั ชนดิ probe
4. Mass spectrometry โดยหลักการของ Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization-Time-
of-Flight (MALDI-TOF) กระบวนการเริ่มจากการตรงึ โปรตีนหรอื เปปไทดก์ บั ผลึกของเมทริกซ์ (matrix) เมื่อยงิ
แสงเลเซอร์ลงบนตัวอย่างโปรตีน ท�ำให้เกิดการแตกตัวเป็นไอออน แล้วเคล่ือนท่ีไปตามท่อสูญญากาศที่มีสนาม
ไฟฟ้า เข้าสู่ส่วนวเิ คราะห์มวล TOF MS ซึง่ การเคลอื่ นทขี่ องไอออนไม่เท่ากนั ขึ้นอยูก่ บั อตั ราส่วนของขนาดและ
ประจุของไอออน โดยสารที่มวลโมเลกลุ น้อยจะเคล่อื นท่ไี ปได้เรว็ กว่าสารทมี่ ีมวลโมเลกุลมาก และเมือ่ เดนิ ทางต่อ
ไปตกกระทบกบั สว่ นตวั ตรวจจบั (Detector) จะเกิดเป็นแมสสเปกตรัมขนึ้ แล้วน�ำไปเปรียบเทยี บกับสเปกตรัมใน
ฐานขอ้ มลู มาตรฐานทม่ี อี ยแู่ ละวเิ คราะหผ์ ลเชอ้ื แตล่ ะชนดิ ได้ โดยแตล่ ะเชอ้ื จะมชี นดิ และปรมิ าณโปรตนี ทแ่ี ตกตา่ งกนั
จึงมีความจ�ำเพาะสามารถวินิจฉัยชนิดของเชื้อได้ ซ่ึงเทคนิคนี้ได้ถูกพัฒนาให้สามารถตรวจวิเคราะห์ได้ง่ายและ
รวดเร็ว ขอ้ จำ� กัดในการจัดจำ� แนกเช้อื อาจจะไม่สามารถจดั จำ� แนกเชอื้ ได้ทกุ ชนิด เนอื่ งจากจำ� กัดด้วยฐานขอ้ มูล

คูม่ อื 85ทมาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลัตกิะาสราจธุลาชรีวณวทิ สยุขา

ผนวก ช

คำ� สั่งแต่งต้งั

คู่มอื86 ทมาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

ค่มู อื 87มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

คมู่ อื88 มทาาตงรกฐาารนแหพ้องทปยฏ์แิบลัตกิะาสราจธลุ าชรวี ณวทิ สยุขา

ค่มู อื 89มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

คมู่ อื90 มทาาตงรกฐาารนแหพ้องทปยฏ์แิบลัตกิะาสราจธลุ าชรวี ณวทิ สยุขา

ค่มู อื 91มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

คมู่ อื92 มทาาตงรกฐาารนแหพ้องทปยฏ์แิบลัตกิะาสราจธลุ าชรวี ณวทิ สยุขา

ค่มู อื 93มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

ผนวก ซ

รายนามผู้เขา้ ร่วมการประชุมประชาพิจารณ์
30 สงิ หาคม 2560

รายนามผูเ้ ขา้ ร่วมการประชมุ ประชาพจิ ารณ์รับฟงั ความคดิ เห็น

ร่างมาตรฐานห้องปฏบิ ตั กิ ารจุลชวี วิทยาทางการแพทย์ และ รา่ งมาตรฐานความปลอดภัยหอ้ งปฏบิ ัตกิ ารฯ

วนั พุธที่ 30 สงิ หาคม 2560 เวลา 9.30 – 14.00 น.

ณ หอ้ งประชุม 110 อาคาร 14 ช้นั 1 กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์

---------------------------------------------

ผู้มาประชมุ

หนว่ ยงานภายนอกกรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์

1. นายสมนึก เตม็ วฒุ ิโรจน ์ กองควบคมุ อาหารและยาสัตว์ กรมปศุสตั ว์

2. นางสาวสภุ าพร วงศ์ศรไี ชย ส�ำนักตรวจสอบคุณภาพสนิ คา้ ปศสุ ตั ว์ กรมปศุสตั ว์

3. นายสรเฉลิม ศักดิศ์ ร ี ส�ำนักตรวจสอบคณุ ภาพสินคา้ ปศสุ ตั ว์ กรมปศุสัตว์

4. นายวชั รชยั ณรงศักดิ์ สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศสุ ัตว์

5. นางสาวปรศิ นา บัวสกลุ ส�ำนกั โรคเอดส์ วณั โรคและโรคติดตอ่ ทางเพศสัมพันธ์ กรมควบคุมโรค

6. นางสาวมาฆมาส ประกอบผล สำ� นกั โรคเอดส์ วัณโรค และโรคติดตอ่ ทางเพศสัมพนั ธ์ กรมควบคมุ โรค

7. นางสาววชั รี จรกา โรงพยาบาลชลบุรี

8. นายบญุ ช่วย เอ่ียมโภคลาภ สภาเทคนิคการแพทย์

9. นายไกรฤกษ์ สุธรรม สำ� นักงานปอ้ งกนั ควบคมุ โรคที่ 5 จงั หวัดราชบุรี

10. นางสาววรัญญา ศรีจนั ทะ โรงพยาบาลสระบรุ ี

11. นายวริ ชั พวงภู ่ โรงพยาบาลสริ ินธร จงั หวดั ขอนแก่น

12. พ.ต.ท.อำ� นาจ กล�่ำเอม โรงพยาบาลต�ำรวจ

13. พ.ท.หญงิ พริ าภรณ์ จันทนาววิ ัฒน ์ โรงพยาบาลพระมงกฏุ เกล้า

14. นางจินตนา เส็งสุข โรงพยาบาลลาดยาว จงั หวัดนครสวรรค์

15. นายวสอุ นันต์ ทองด ี โรงพยาบาลสมเด็จพระยุพราชปวั จ.นา่ น

16. นางธิดา รักษาสขุ สถาบันวจิ ยั จุฬาภรณ์

17. นางอรุณลกั ษณ์ ลุลิตานนท์ คณะเทคนคิ การแพทย์ มหาวิทยาลยั ขอนแกน่

18. นางสาวจิราภรณ์ เกตุดี คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยรังสติ

คมู่ อื94 มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แบิ ลตั กิะาสราจธุลาชรีวณวิทสยุขา

19. นางสาวเขมาภรณ์ บญุ บ�ำรงุ คณะสหเวชศาสตร์ จฬุ าลงกรณ์มหาวทิ ยาลัย
20. นางวรดา สโมสรสุข คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลยั ธรรมศาสตร์ ศนู ย์รงั สติ
21. นางสาวดารณี นตุ าลัย คณะสตั วแพทยศาสตร์ วชริ พยาบาล มหาวิทยาลยั นวมนิ ทราธริ าช
22. นางจไุ ลวรรณ รุ่งกำ� เนดิ วงศ์ ศนู ย์วิจัยสุขภาพสัตว์นำ้� สงขลา
23. นางสาวพรพมิ ล ทิวแพ ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั ว์น้ำ� สงขลา
24. นางฉันทนา แก้วตาปี ศนู ยว์ จิ ัยและพัฒนาประมงชายฝ่งั ภูเกต็
25. นายอาสตู ร สงวนเกยี รติ คณะสตั วแพทยศ์ าสตร์ มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์
26. นางสาวอรวรรณ ลิ้มศิวิลยั คณะสตั วแพทยศ์ าสตร์ มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์
27. นางสาวธัญญาพฒั น์ บำ� รุงพันธ ์ คณะสัตวแพทยศ์ าสตร์ มหาวทิ ยาลัยเกษตรศาสตร์
28. นางสาวชมพูเนกข์ ยุรญาต ิ คณะสัตวแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
29. นางสาวณฐั กานต์ อวยั วานนท ์ คณะสตั วแพทย์ศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยเชยี งใหม่
30. นายชาญณรงค์ รอดค�ำ คณะสตั วแพทยศ์ าสตร์ จุฬาลงกรณม์ หาวทิ ยาลยั
31. นางสาวธดิ ารัตน์ วงศ์รตั น์ บรษิ ทั ซพี เี อฟ (ประเทศไทย) จำ� กัด (มหาชน)
32. นางสาวอรกญั ญา คำ� เปลว บริษทั N-health
33. นางสาวศุกลภา เจยี รส�ำราญ บรษิ ทั ไทยฟดู ส์
34. นางสาวสายใจ สมิทธิการ ส�ำนกั วณั โรค
35. นางสุจติ รา ดุษฏีเชษตกุล โรงพยาบาลนนทเวช
36. นางสาวสชุ รี า แกว้ ประไพ โรงพยาบาลคลองหลวง
37. นายดุลยทรรศน์ กรณตวแ์ สง คณะสัตวแพทยศ์ าสตร์ มหาวทิ ยาลยั มหิดล
38. นายบญุ มี กาญจโน บรษิ ทั ศูนยว์ ิทยาศาสตร์เบทาโก
39. นางสาวขนษิ ฐา ประพิณ บรษิ ทั ศูนยว์ ทิ ยาศาสตร์เบทาโก
40. นายนพพร โตะ๊ มี บรษิ ทั ศูนยว์ ิทยาศาสตร์เบทาโก

กรมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์ ผ้อู �ำนวยการสถาบันวจิ ัยวิทยาศาสตรส์ าธารณสขุ
1. นายแพทยส์ มชาย แสงกิจพร ขา้ ราชการบำ� นาญ
2. นางสาวอรอนงค ์ รัชตราเชนชัย นักวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทยช์ ำ� นาญการพิเศษ
3. นางสาวนภวรรณ เจนใจ นักเทคนิคการแพทยช์ �ำนาญการพิเศษ
4. นางจุฑามาศ ศริ ปิ าณ ี นักวิทยาศาสตร์การแพทยช์ �ำนาญการพเิ ศษ
5. นางดวงดาว วงศส์ มมาตร นักวทิ ยาศาสตร์การแพทย์เชยี่ วชาญ
6. นางสาววันทนา ปวีณกติ ตพิ ร นักวทิ ยาศาสตร์การแพทยเ์ ชีย่ วชาญ
7. นางสาวปิยะดา หวงั รุง่ ทรัพย์ นักวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ชำ� นาญการ
8. นายรตกิ ร กัณฑะพงศ์

คมู่ ือ 95ทมาาตงรกฐาารนแหพ้องทปยฏ์แบิ ลัติกะาสราจธุลาชรีวณวทิ สยุขา

9. นายอธิวฒั น์ ปริมสิริคณุ าวุฒ ิ นกั วิทยาศาสตร์การแพทย์ช�ำนาญการ

10. นางพนดิ า เกษรประเสรฐิ นกั วทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ชำ� นาญการ

11. นางสาวพจพร พิณรอด นกั วิทยาศาสตร์การแพทย์

12. นางพไิ ลลกั ษณ์ อัคคไพบลู ย์ โอกาดะ นักเทคนิคการแพทย์ชำ� นาญการพเิ ศษ

13. นางสาวอจั ฉรยี า อนกุ ลู พพิ ัฒน์ นักเทคนิคการแพทยช์ �ำนาญการพเิ ศษ

14. นายเอกวฒั น์ อุณหเลขกะ นกั วิทยาศาสตรก์ ารแพทยช์ �ำนาญการ

15. นางสาวรัตนา ตาเจรญิ เมือง นกั วทิ ยาศาสตร์การแพทยช์ �ำนาญการ

16. นางสาวมาลนิ ี จติ ตกานตพ์ ชิ ย์ นกั วิทยาศาสตร์การแพทยเ์ ช่ียวชาญ

17. นางสาวอุรุญากร จันทรแ์ สง นกั วทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์เช่ยี วชาญ

18. นางสาวศรวี รรณา หทั ยานานนท์ นกั วิทยาศาสตรก์ ารแพทยช์ �ำนาญการ

19. นายเรอื งชัย โลเกตุ นักวิทยาศาสตร์การแพทย์ช�ำนาญการ

20. นายวรวฒุ ิ เพช็ รยงั นักวทิ ยาศาสตร์การแพทยป์ ฏบิ ตั ิการ

คมู่ อื96 มทาาตงรกฐาารนแหพอ้ งทปยฏ์แิบลัตกิะาสราจธลุ าชรีวณวทิ สยุขา



TEXT & JOURNAL PUBLICATION CO., LTD.

บริษทั เทก็ ซ แอนด เจอรน ลั พับลเิ คช่ัน จำกัด

เช่ียวชาญเฉพาะ

งานพิมพหนงั สือ-ตำรา

158/3 ซอยยาสบู 1 ถนนวภิ าวดีรังสิต แขวงจอมพล
เขตจตจุ ักร กรงุ เทพฯ 10900

โทร. 0 2617 8611 - 2
แฟกซ 0 2617 8616 อีเมล [email protected]