คู่มือการตรวจทางห้องปฏิบัติการธาลัสซีเมีย 2558

คณะกรรมการทบทวนคมู่ อื ปฏบิ ัตงิ านการตรวจวนิ จิ ฉัยโรคธาลัสซีเมยี
และฮโี มโกลบนิ ผิดปกตทิ างหอ้ งปฏิบัติการ
สถาบันชีววทิ ยาศาสตร์ทางการแพทย์ และสถาบันวจิ ยั วทิ ยาศาสตรส์ าธารณสุข

6 มิถนุ ายน 2558 1,500 เล่ม

III

คำนิยม

ดิฉันมีความยินดีเป็นอย่างยิ่งที่กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ได้จัดพิมพ์คู่มือปฏิบัติงานด้าน
การตรวจวนิ จิ ฉัยโรคธาลสั ซีเมยี ท่ที ันสมัย กา้ วหนา้ และมคี ณุ ภาพ เพ่อื ใช้ในการฝกึ อบรมและบริการ
ตรวจโรคโลหติ จางธาลสั ซเี มยี ใหถ้ ูกตอ้ ง แม่นยำ รวดเรว็ ทัว่ ประเทศ จะทำใหแ้ ผนการควบคมุ ปอ้ งกัน
และรกั ษาโรคนี้เป็นไปได้อย่างมปี ระสิทธภิ าพยงิ่
ดฉิ นั ขอขอบคณุ ทา่ นคณาจารย์ ผเู้ ชย่ี วชาญจากสถาบนั ตา่ งๆ ซง่ึ รว่ มมอื กนั สรา้ งคมู่ อื นข้ี น้ึ มา
ซึ่งจะเป็นคุณานุประโยชน์อย่างยิ่งต่อผู้ป่วยโรคโลหิตจางธาลัสซีเมียและครอบครัว อันเป็นปัญหา
สำคัญทางสาธารณสุขของประเทศ

ศ. พญ. คณุ หญงิ สดุ สาคร ต้จู นิ ดา
ประธานมลู นิธิโรคโลหิตจางธาลสั ซเี มยี แหง่ ประเทศไทยฯ



(นายแพทยอภชิ ัย มงคล)
อธบิ ดกี รมวิทยาศาสตรการแพทย

มิถุนายน 2558

นพ. อภชิ ยั มงคล

รศ.คลินิก พญ.วารุณี จนิ ารตั น

02-5915231 ตอ 99005-6

สถาบนั วิจัยวทิ ยาศาสตรทางการแพทยทหาร สถาบนั ชวี วิทยาศาสตรโมเลกุล

โทร. 02-6444888 โทร. 02-8892557-8
สถาบนั วิจยั วิทยาศาสตรสาธารณสขุ
ดร. องั คณา หริ ัญสาลี
กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย

โทร. 02-9610000 ตอ 99361

99355

VII

ศนู ยว จิ ัยโลหิตวทิ ยาและเทคโนโลยีสขุ ภาพ
คณะเทคนิคการแพทย
มหาวทิ ยาลยั เชียงใหม
โทร. 053-949288

รศ. พญ.พมิ พล กั ษณ เจริญขวัญ ผศ. ดร.จำนงค นพรตั น
ภาควิชากมุ ารเวชศาสตร คณะแพทยศาสตร ภาควชิ าพยาธวิ ทิ ยา คณะแพทยศาสตร
มหาวทิ ยาลยั เชียงใหม มหาวทิ ยาลัยสงขลานครนิ ทร
โทร. 053-945412-5 โทร. 074-451567

อาจารยชวดี นพรตั น นางสาววรางคณา ออนทรวง
ภาควิชาพยาธวิ ทิ ยา กองแผนงานและวชิ าการ
คณะแพทยศาสตร กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย
มหาวิทยาลยั สงขลานครนิ ทร กระทรวงสาธารณสุข
โทร. 074-451562 โทร. 02-9510000 ตอ 99014

นางสิริภากร แสงกิจพร 7
สถาบนั ชีววทิ ยาศาสตรท างการแพทย กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย
กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย กระทรวงสาธารณสขุ
กระทรวงสาธารณสขุ โทร. 043-240800
โทร. 02-9510000 ตอ 99394
นางณชั ชา หริ โิ อตปั ปะ
นางภัทราภรณ บุญขนั ท
งานโลหิตวิทยา โรงพยาบาลราชวถิ ี กระทรวงสาธารณสุข
กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสุข โทร. 02-5216550-2 ตอ 105
โทร. 02-3548108 ตอ 3620-1

VIII

นางบษุ บา เตชาชัยนิรันดร นางสาวอัมรา โยวงั
ศูนยอนามยั ที่ 4 ราชบุรี ศูนยวิทยาศาสตรการแพทยท ี่ 1/1 เชยี งราย
กรมอนามยั กระทรวงสาธารณสขุ กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย
โทร. 032-310368-71 กระทรวงสาธารณสขุ
โทร. 053-176225-6 ตอ 114
นางบญุ นิภา สวุ รรณกาล
ศนู ยว ิทยาศาสตรก ารแพทย 8 อดุ รธานี ดร. พไิ ลลักษณ อัคคไพบูลย โอกาดะ
กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย สถาบันวจิ ยั วิทยาศาสตรสาธารณสุข
กระทรวงสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย
โทร. 042-207364-6 ตอ 110,106 กระทรวงสาธารณสุข
โทร. 02-9510000 ตอ 99206,99305
นางอารีรัตน ขอไชย
สถาบนั ชวี วิทยาศาสตรทางการแพทย
กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสุข
โทร. 02-9510000 ตอ 99394







แนวทางการตรวจวนิ ิจฉัยธาลัสซเี มยี
และฮโี มโกลบนิ ผดิ ปกติทางหอ้ งปฏิบัติการ

ธาลสั ซเี มยี เปน็ โรคโลหติ จางเรอ้ื รงั ทถ่ี า่ ยทอด กระทรวงสาธารณสุข ได้แก่ homozygous -tha-
ทางพันธุกรรม เกิดจากความผิดปกติของยีนที่ lassemia 1 (Hb Bart’s hydrops fetalis), homozygous
สังเคราะหฮ์ โี มโกลบนิ ของเม็ดเลอื ดแดง นำไปสู่การ β-thalassemia และ β-thalassemia/ Hb E
เกิดพยาธิสภาพกับแทบทุกอวัยวะในร่างกาย ผู้ เนอ่ื งจากชนดิ ของธาลสั ซเี มยี และฮโี มโกลบนิ
ที่มียีนธาลัสซีเมียมีทั้งผู้ที่เป็นโรค และไม่เป็นโรค ผิดปกติในประชากรไทยมีความหลากหลาย จงึ ไม่มี
หรือพาหะ ผู้ที่เป็นโรคมีอาการแตกต่างกัน ตั้งแต่ การทดสอบใดการทดสอบหนึ่งทางห้องปฏิบัติการ
มีโลหิตจางเล็กน้อย โลหิตจางมาก เรื้อรัง ไปจนถงึ ที่สามารถให้การวินิจฉัยได้ครอบคลุมความผิดปกติ
อาการรนุ แรงมาก จนเสยี ชวี ติ ตง้ั แตอ่ ยใู่ นครรภม์ ารดา ได้ทุกชนิด โดยทั่วไปการตรวจทางห้องปฏิบัติการ
หรอื หลงั คลอดไมน่ าน สว่ นผทู้ เ่ี ปน็ พาหะมสี ขุ ภาพปกติ เพื่อการวินิจฉัยธาลัสซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกติ
เหมือนคนทั่วไป แต่สามารถถ่ายทอดยีนที่ผิดปกติ ในหญงิ ตั้งครรภแ์ ละคูส่ มรสมี 3 ระดับ ดังน้ี
ไปสูล่ ูกหลานได้ ระดับที่ 1 การตรวจคัดกรอง (screening
อุบัติการณ์ในประเทศไทยพบว่า ประชากร tests) เป็นขั้นตอนแรกที่มีเป้าหมายหลักในการคัด
ทเ่ี ปน็ พาหะมปี ระมาณรอ้ ยละ 30 - 40 หรอื ประมาณ กรองเอาคนปกติหรือคนที่มีความผิดปกติชนิดที่ไม่
18-24 ล้านคน มีผู้ที่เป็นโรคประมาณร้อยละ 1 รุนแรงออกไป เพื่อจะได้ไม่ต้องตรวจเลือดต่อและ
หรอื ประมาณ 6 แสนคน ในแตล่ ะปจี ากหญงิ ตง้ั ครรภ์ เป็นการประหยัดค่าใช้จ่าย คงเหลือแต่ผู้ที่น่าจะมี
ประมาณ 1 ล้านคน มีหญิงตั้งครรภ์ที่เสี่ยงต่อการ ความผดิ ปกตขิ องธาลสั ซเี มยี และฮโี มโกลบนิ ผดิ ปกติ
มบี ุตรเป็นโรคธาลสั ซเี มยี ประมาณ 5 หม่นื คน และ ท่เี ข้าส่กู ระบวนการตรวจวเิ คราะหใ์ นข้นั ตอนต่อไป
มีเด็กเกิดใหม่ป่วยเป็นโรคเพิ่มขึ้นประมาณ 12,000 ระดับที่ 2 การตรวจวิเคราะห์ชนิดและ
คน ธาลัสซีเมียจึงเป็นปัญหาสำคัญทางการแพทย์ ปรมิ าณฮโี มโกลบนิ ในเลอื ด (Hb typing) สามารถตรวจ
และสาธารณสุข ซึ่งไม่เพียงแต่มีผลต่อผู้ป่วยและ วนิ จิ ฉยั ธาลสั ซเี มยี ทไ่ี มซ่ บั ซอ้ นไดเ้ กอื บทกุ ชนดิ ทพ่ี บ
ครอบครัวเท่านั้น หากยังส่งผลกระทบต่อเศรษฐกิจ บอ่ ยในประชากรไทย ยกเวน้ พาหะ -thalassemia
และสงั คมของประเทศอีกดว้ ย ระดับท่ี 3 การตรวจวเิ คราะห์ระดบั ดีเอ็นเอ
การแก้ไขปัญหาโรคธาลัสซีเมียจำเป็นต้อง (DNA analysis) ใชใ้ นกรณีที่ผลการตรวจ Hb typing
อาศัยความร่วมมือของหน่วยงานต่างๆ ในการ ในระดบั ท่ี 2 ไมส่ ามารถใหก้ ารวนิ จิ ฉยั ไดช้ ดั เจน หรอื
ดำเนินการควบคุมและป้องกัน แผนการดำเนิน กรณีต้องการทราบชนิดของมิวเตชั่นของธาลัสซีเมีย
การควบคุมและป้องกันโรค ประกอบด้วยการให้ ท่วี นิ จิ ฉยั ไดใ้ นระดบั ที่ 2 และกรณีการตรวจวนิ จิ ฉัย
ความรู้แก่ประชาชนและบุคลากรทางสาธารณสุข ทารกในครรภ์ที่มีความเสี่ยงต่อการเป็นโรคธาลัส-
การตรวจหาผู้ป่วยและพาหะ การให้คำปรึกษา ซีเมยี ชนิดรนุ แรง
แนะนำทางพนั ธกุ รรม และการตรวจวนิ จิ ฉยั ทารกใน การดำเนนิ งานทางหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทกุ ขน้ั ตอน
ครรภ์ ห้องปฏิบัติการทางการแพทย์นับเป็น ล้วนมีความสำคัญทั้งสิ้น บุคลากรที่เกี่ยวข้องควร
หน่วยงานทม่ี ีบทบาทสำคัญ ทั้งในดา้ นการตรวจหา พจิ ารณาใหเ้ หมาะสมตามหลกั วชิ าการ และสอดคลอ้ ง
ผู้ป่วยและพาหะ ตลอดจนการตรวจวินิจฉัย กับข้อกำหนดด้านคุณภาพ เพื่อให้ผลการตรวจ
ทารกในครรภ์ซึ่งให้ข้อมูลสำคัญนำไปใช้ในการ วิเคราะห์มีความน่าเชื่อถือ สามารถสนับสนุนการ
ให้คำแนะนำทางพนั ธกุ รรม และช่วยในการตดั สินใจ ควบคุมและป้องกันโรคธาลัสซีเมียชนิดรุนแรงได้
สำหรบั สามภี รรยาคเู่ สย่ี งทม่ี โี อกาสใหก้ ำเนดิ บตุ รเปน็ อย่างมปี ระสิทธิภาพ
โรคธาลัสซเี มยี ชนิดรุนแรง 3 โรค ตามนโยบายของ



การตรวจคดั กรอง

การตรวจคดั กรอง

การตรวจคดั กรองเปน็ การทดสอบอยา่ งงา่ ย การตรวจคดั กรองธาลสั ซเี มยี และฮโี มโกลบนิ
มีขน้ั ตอนไมย่ ุ่งยาก ไมต่ ้องใชอ้ ุปกรณ์ราคาแพง และ ผิดปกติในประชากรไทยสามารถเลือกทำได้จาก 2
บุคลากรที่มีความชำนาญมากนัก สามารถทำได้ใน แนวทาง ดงั น้ี
โรงพยาบาลทกุ ระดบั คลนิ กิ และสถานอี นามยั ตา่ งๆ
การตรวจคัดกรองมีเป้าหมายหลักในการคัดกรอง แนวทางท่ี 1 ประกอบดว้ ยการตรวจ osmotic
เอาคนปกติ หรือมีความผิดปกติชนิดที่ไม่รุนแรง fragility (OF) ร่วมกบั การตรวจ dichlorophenolindo-
ออกไป เพื่อจะได้ไม่ต้องตรวจเลือดต่อและเป็น phenol (DCIP) precipitation
การประหยัดค่าใช้จ่าย ดังนั้นผลการตรวจคัดกรอง
จะต้องมคี วามไวสงู อาจมีผลบวกปลอมได้บ้าง ราย แนวทางที่ 2 ประกอบด้วยการตรวจดัชนี
ที่ผลการตรวจคัดกรองเป็นลบไม่จำเป็นต้องนำไป เมด็ เลอื ดแดง (MCV, MCH) รว่ มกบั การตรวจ dichlo-
ตรวจยนื ยนั ตอ่ การตรวจคดั กรองจงึ ชว่ ยลดภาระงาน rophenolindophenol (DCIP) precipitation
และค่าใช้จ่ายในการตรวจทางห้องปฏิบัติการลงได้
มาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องดำเนินงานในกลุ่ม การตรวจ OF และ MCV/ MCH ใช้ใน
ประชากรขนาดใหญ่ในระดบั ประเทศ การตรวจคัดกรอง ความผิดปกติที่มีสาเหตุจาก
ในประเทศไทยการตรวจคัดกรองที่เกี่ยว -thalassemia และ -thalassemia ส่วน DCIP
ข้องในการควบคุมและป้องกันโรคธาลัสซีเมียชนิด ใช้ในการตรวจ Hb E
รุนแรงตามนโยบายของกระทรวงสาธารณสุข มี 3
การทดสอบ คือ
1. การตรวจ OF
2. การตรวจ DCIP
3. การตรวจหาค่าดชั นีเม็ดเลือดแดง

การตรวจคัดกรองธาลัสซีเมยี
ดว้ ยการทดสอบความเปราะของเมด็ เลอื ดแดง
(osmotic fragility test: OF test)

หลกั การ การรายงานผล

เม็ดเลือดแดงปกติเมื่ออยู่ในน้ำเกลือความ - เม่ือได้ผลลบ รายงานผล “Negative”
เข้มข้น รอ้ ยละ 0.85 จะคงสภาพปกตไิ ว้ได้ แต่เม่อื
ลดความเข้มข้นของน้ำเกลือลงเรื่อยๆ น้ำจะแพร่ - เมอ่ื ได้ผลบวก รายงานผล “Positive”
เข้าสู่เซลล์เม็ดเลือดแดง ทำให้เซลล์บวมขึ้น จนถึง
ความเข้มข้นของเกลือระดับหนึ่ง เม็ดเลือดแดงจะ การแปลผล
แตก การทเ่ี มด็ เลอื ดแดงแตกงา่ ย (increased osmotic
fragility) หรอื แตกยาก (decreased osmotic fragility) Negative : ไมเ่ ป็นธาลสั ซเี มยี หรืออาจเปน็
ขน้ึ อยกู่ บั อตั ราสว่ นของพน้ื ทผ่ี นงั เซลลต์ อ่ ความเขม้ ขน้ ธาลัสซีเมียชนิดที่ไม่รุนแรง เช่น -thalassemia 2,
ของสารภายในเซลล์ซึ่งส่วนใหญ่คือ ฮีโมโกลบิน Hb Constant Spring, Hb Paksè
เม็ดเลือดแดงท่ีมอี ัตราส่วนน้ีสูง เชน่ target cell และ Positive : อาจเป็น -thalassemia หรือ
hypochromic cell จะแตกยากในขณะท่ี spherocyte -thalassemia โดย -thalassemia มีโอกาส
จะแตกง่าย ดังนั้นในการทดสอบความเปราะของ เป็นได้ทั้งชนิด -thalassemia 1 และบางรายของ
เม็ดเลอื ดแดง เม็ดเลอื ดแดงปกตจิ ะแตกไดห้ มด แต่ -thalassemia 2 สว่ น -thalassemia กอ็ าจเปน็ ไดท้ ง้ั
เมด็ เลอื ดแดงของผปู้ ว่ ยธาลสั ซเี มยี และพาหะธาลสั ซเี มยี 0-หรอื +-thalassemia เมอ่ื ผลการตรวจเปน็ positive
ที่มี target cell และ hypochromic cell จะไม่แตก ต้องสง่ ตวั อย่างเลอื ดตรวจ Hb typing และดีเอน็ เอ
อยา่ งไรกต็ ามภาวะอน่ื ทท่ี ำใหเ้ มด็ เลอื ดแดงมลี กั ษณะ ตอ่ ไป
เป็น hypochromic cell เช่น ภาวะโลหติ จางจากการ
ขาดเหล็ก หรือเปน็ target cell เช่น ในผู้ปว่ ยโรคตับ ขอ้ จำกดั ของการทดสอบ
สามารถให้ผลบวกปลอมได้
1. การทดสอบ OF เปน็ การตรวจคัดกรองที่
สารเคมีและน้ำยา มวี ตั ถปุ ระสงคใ์ นการคดั กรอง -thalassemia 1 และ
-thalassemia เปน็ หลักเท่านนั้ ไมส่ ามารถใชใ้ นการ
ปจั จบุ นั มนี ำ้ ยาสำเรจ็ รปู หลายชนดิ จำหนา่ ย วนิ ิจฉัยชนิดของความผดิ ปกติได้
การเลอื กใชค้ วรพจิ ารณาใหร้ อบคอบตามขอ้ กำหนด 2. ผทู้ เ่ี ปน็ พาหะ Hb E บางราย อาจใหผ้ ลบวก
ดา้ นคณุ ภาพ และขอ้ มลู อา้ งองิ ทางวชิ าการ บางรายอาจใหผ้ ลลบกับการทดสอบนี้
3. อาจพบผลบวกลวงในภาวะโลหิตจาง
วิธกี าร จากการขาดเหล็ก และจากความผิดปกตอิ ื่นๆ ท่ีพบ
target cell เชน่ โรคตบั
- เป็นไปตามมาตรฐานของน้ำยาทีก่ ำหนด



การตรวจคัดกรอง
ฮีโมโกลบิน อี (Hb E) ด้วยน้ำยา DCIP
dichlorophenolindophenol precipitation test

หลักการ lassemia และหรอื -thalassemia ทม่ี ี Hb E รว่ มดว้ ย
ตอ้ งส่งตวั อยา่ งเลอื ดตรวจ Hb typing ตอ่ ไป
ที่กรดอะHมbิโEนต( ำ2แห22น6G่งluท-Lyี่s)2เ6ป็นขฮอโี มงสโกาลยบิน-ผgิดloปbกiตnิ
เปล่ียนจากกรดกลูตามิก (glutamic : Glu) เป็นไลซนี ขอ้ จำกดั ของการทดสอบ
(lysine : Lys) ทำใหโ้ ครงสร้างทจ่ี ุดสมั ผสั ระหวา่ งสาย
โจกะลถบูกินออก1ซ1ิไไดมซ่แ์ใขห็ง้กแลรงายเมเปอื่ ็นอยโกู่ในลสบาินรสลาะยลเาดยี่ยDวCทIี่มPี - Hb H ซึ่งเป็นฮีโมโกลบินที่ไม่เสถียร ถ้ามี
ซัลฟ์ไฮดริลอิสระจึงตกตะกอนได้ง่าย และเร็วกว่า ปรมิ าณมากจะถกู ออกซไิ ดซต์ กตะกอนเกดิ ผลบวกได้
ฮีโมโกลบินปกติ โดยปริมาณความขุ่นของตะกอน - ไม่ควรใช้กับ heparinized blood เนื่อง
ทเี่ กิดข้ึนจากตัวอยา่ งเลอื ดของ Hb E homozygote จาก heparin รบกวนการตรวจวดั และก่อใหเ้ กดิ ผล
จะมากกวา่ ของพาหะ Hb E บวกปลอมได้

สารเคมีและนำ้ ยา การควบคุมคณุ ภาพ

ปัจจุบันมีน้ำยาสำเร็จรูปหลายชนิด 1. ควรทำการตรวจสอบคุณภาพของน้ำยา
จำหน่าย การเลือกใช้ควรพิจารณาให้รอบคอบตาม ก่อนนำมาใช้ในงานบริการ โดยทำการทดสอบกับ
ขอ้ กำหนดดา้ นคณุ ภาพ และขอ้ มลู อา้ งองิ ทางวชิ าการ เลือดควบคุมคุณภาพ ซึ่งมีแนวทางในการเลือกตัว
อย่างเลือดควบคุมคุณภาพจากเลือดผู้ใหญ่ในงาน
วิธกี าร ประจำวนั ดงั นี้

-เป็นไปตามมาตรฐานของน้ำยาท่ีกำหนด ตวั อยา่ งควบคมุ ผลลบ (Negative control)
เปน็ ตวั อยา่ งเลอื ดทม่ี ชี นดิ ของ Hb เปน็ A2A
การรายงานผล
ตวั อยา่ งควบคมุ ผลบวก (Positive control)
- เมื่อได้ผลลบ รายงานผล “Negative” เปน็ ตวั อยา่ งเลอื ดทีม่ ีชนดิ ของ Hb เป็น EA
- เมอื่ ไดผ้ ลบวก รายงานผล “Positive” ไมค่ วรใช้ EE เพราะใหผ้ ลบวกแรงเกนิ ไป

การแปลผล ห้องปฏิบัติการสามารถเก็บตัวอย่างเลือด
ดังกลา่ วไว้ในต้เู ยน็ 4ºC สำหรบั ใชเ้ ป็นเลอื ดควบคุม
Negative : ไม่มี Hb E คณุ ภาพตอ่ ไปได้ 1 สัปดาห์
Positive : อาจเปน็ ผทู้ มี่ ี Hb E ซึง่ พบได้ทัง้ ในกรณีที่ไม่สามารถหาตัวอย่างเลือด
ท่เี ปน็ พาหะ Hb E, Hb E homozygote หรอื -tha- ดงั กล่าวได้ ผ้ปู ฏิบัตสิ ามารถใช้ตัวอยา่ งเลอื ดที่เหลือ

จากการตรวจคดั กรองทใ่ี หผ้ ลการตรวจเปน็ บวก และ หากทำการทดสอบแลว้ มผี ลลบหรอื บวกทกุ ตวั อยา่ ง
ลบอย่างละ 1-2 ราย เกบ็ ไว้ในต้เู ย็น 2-8ºC เพ่ือใช้ ให้ตรวจสอบเรื่องอุณหภูมิที่ทำปฏิกิริยาเป็น
ควบคุมคุณภาพสำหรับการทดสอบครั้งต่อไป และ อันดับแรก สำหรับประเด็นในเรื่องเวลาทำปฏิกิริยา
เกบ็ เลอื ดใหมท่ ุกคร้งั ทีท่ ำการทดสอบไปเรื่อยๆ จะพบความผิดพลาดได้มากกว่า ถ้าผู้ปฏิบัติทำการ
2. ตัวอย่างเลือดที่นำมาทดสอบควรเป็น ทดสอบครั้งละหลายตัวอย่าง (เช่นมากกว่า 10
เลือดที่เจาะใหม่ในวันนั้น หากไม่สามารถทำการ ตัวอย่างต่อครั้ง) โดยเฉพาะถ้าทำการทดสอบใน
ทดสอบได้ทันที ควรเก็บเลือดไว้ในตู้เย็น 4ºC ห้องที่ไม่ได้ปรับอากาศ และมีอุณหภูมิห้องสูงกว่า
และไมค่ วรเกบ็ ไวน้ านเกนิ 1 สปั ดาห์ แตถ่ า้ ไมม่ ตี เู้ ยน็ 30ºC ตัวอย่างรายแรกๆ ที่เติมเลือดลงไปในน้ำยา
เก็บควรทำการทดสอบภายใน 48 ชั่วโมง เน่ืองจาก ระหว่างที่รอเติมตัวอย่างเลือดรายต่อๆ ไป
เลือดที่เก่าฮีโมโกลบินบางส่วนจะถูกออกซิไดซ์ จนครบรายสุดท้ายได้เกิดปฏิกิริยาไปบางส่วน
ไปแล้ว สังเกตได้จากเลือดมีการเปลี่ยนแปลงเป็น แล้ว เมื่อนำไปอุ่นต่ออีก 15 นาที อาจทำให้เกิด
สีแดงคล้ำไม่ใช่แดงสดเหมือนเลือดเจาะใหม่ ผลบวกปลอมได้
เมื่อนำไปทำปฏิกิริยากบั DCIP จะตกตะกอนไดง้ า่ ย 4. การควบคุมคุณภาพการอ่านผลทำ
ขน้ึ จนเกิดผลบวกปลอมได้ เชน่ เดียวกบั การอ่านผล OF
37±1ºC3.แอลุะณเหวลภาูมทิที่ใี่ทหำ้ทปำฏปิกฏิริกิยิราิยจะาตจะ้อตงเ้อทง่าตกรับง
ตามทีร่ ะบใุ นเอกสารกำกับนำ้ ยา ดงั นัน้ อ่างน้ำหรือ ข้อควรระวงั
บล็อกควบคุมอุณหภูมิ (heat block) จะต้องมีระบบ
ตรวจสอบความถูกต้องของอุณหภูมิเป็นประจำ น้ำยา DCIP เป็นน้ำยาสีน้ำเงินเข้ม มี
เพราะถ้าอุณหภูมิต่ำกว่า 36ºC จะให้ผลลบปลอม ความไวต่อแสง อากาศ และอุณหภูมิที่สูงจึงต้อง
แต่ถ้ามากกว่า 38ºC ก็จะให้ผลบวกปลอมได้ เกบ็ นำ้ ยาในภาชนะทม่ี ฝี าปดิ สนทิ บรรจใุ นกลอ่ งเพอ่ื
ไมใ่ ห้โดนแสง เกบ็ ในต้เู ย็น 4ºC



การตรวจวิเคราะห์ชนดิ
และปริมาณฮโี มโกลบิน
(Hb typing & quantitation)



นอ ยกวา หรอื เทา กบั 3.5%

นอยกวาหรอื เทา กับ 3.5%
>3.5%
3.6-8%

หมายเหตุ

12

ด้วยเครื่องวิเคราะห์ฮีโมโกลบินอัตโนมัติ HPLC Hb Pakse หากเก็บเลอื ดไว้นานเกนิ ไปอาจตรวจไม่
หรอื LPLC แต่จะรายงานผลจากการตรวจวิเคราะห์ พบ ทำให้การแปลผลผดิ พลาดได้
ฮีโมโกลบินเปน็ Hb Constant Spring เน่ืองจาก Hb 11. ในกรณีที่ผลการวิเคราะห์ Hb typing
Constant Spring มคี วามชกุ ในการตรวจพบมากกวา่ เป็น A2F ในเด็กอายุมากกว่า 1 ปี ร่วมกับการมี
Hb Pakse โดยทั่วไปผู้ที่เป็นพาหะจะไม่ซีด และมี อาการของโรคธาลัสซีเมียชัดเจน ซีด ตับม้ามโต
ขอ้ มลู ทางโลหิตวทิ ยาอ่นื ๆ อย่ใู นเกณฑป์ กติ แปลผลเป็น homozygous o-thalassemia with or
8. ในกรณที ผ่ี ลการวเิ คราะห์ Hb typing เปน็ without -thalassemia จากการทต่ี รวจไมพ่ บ Hb A
CS A2A Bart’s แปลผลเปน็ suspected homozygous แสดงว่าผู้ป่วยสังเคราะห์สาย -globin ไม่ได้เลย
Hb Constant Spring ซึ่งผู้ป่วยมักมีภาวะซีดคล้าย จึงมีการสังเคราะห์สาย -globin ขึ้นมาทดแทน
ผู้ทเ่ี ป็นโรค Hb H อย่างไรก็ตามอาจตรวจไม่พบ Hb ทำให้ตรวจพบ Hb F มปี ริมาณสงู มาก สว่ นปรมิ าณ
Bart’s ได้ เนื่องจากสาย -globin มีปรมิ าณนอ้ ย Hb A2 อาจสูงขึ้นเล็กน้อยหรืออยู่ในเกณฑ์ปกติ
9. ในกรณีที่ผลการวิเคราะห์ Hb typing ผลการตรวจ blood smear พบเมด็ เลอื ดแดงมลี กั ษณะ
เปน็ A2A H หรอื A2A Bart’s H ปรมิ าณ Hb A2 ผิดปกติมากกวา่ ในโรค Hb H ไม่พบ Hb H inclusion
ค่อนข้างต่ำกว่าปกติ แปลผลเป็น Hb H disease body ในเม็ดเลือดแดง แต่ผู้ป่วยที่ตัดม้ามแล้วอาจ
( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) เนื่องจาก จะพบตะกอนของฮีโมโกลบินในเมด็ เลือดแดงได้
การตรวจพบ Hb H ( 4) หรือ Hb Bart’s ( 4) ข้อควรระวังหากพบผลการวิเคราะห์
แสดงวา่ สาย -globin จะต้องมีปรมิ าณนอ้ ยลงมาก ฮีโมโกลบินเป็น A2F คือ ต้องตรวจสอบอายุ
จงึ ทำใหส้ าย -globin และสาย -globin เหลอื อยมู่ าก ของผู้ป่วยให้ดี ถ้าเป็นเด็กทารกที่อายุยังไม่ถึง
จงึ จับกนั เอง 4 สาย กลายเปน็ Hb H และ Hb Bart’s 1 ปี จะไม่สามารถวินิจฉัยจีโนไทป์ที่แน่นอนได้
ในผปู้ ว่ ยบางรายอาจไมพ่ บ Hb Bart’s เนอ่ื งจากสาย เนื่องจากปริมาณ Hb F ยงั คงสูงอยู่ ต้องรอให้ Hb F
-globin มีปริมาณน้อย ผลการตรวจ blood smear คอ่ ยๆ ลดลงจนอายมุ ากกวา่ 1 ปี จงึ สามารถแปลผล
ในผู้ป่วยกลุ่มนี้ พบลักษณะเม็ดเลือดแดงแบบ การตรวจ Hb typing ได้
ธาลัสซีเมีย แต่มีลักษณะผิดปกติประมาณ 1+ ถึง 12. ในกรณีที่ผลการวิเคราะห์ Hb typing
2+ ลักษณะจำเพาะที่ใช้วินิจฉัยโรค Hb H ได้ดี เป็น EF โดยมีปริมาณ Hb E ประมาณ 40-80%
คือการตรวจพบเม็ดเลือดแดงที่มี inclusion body Hb F ประมาณ 20-60% ไม่พบ Hb A พบได้
โดยอาจตรวจพบเม็ดเลือดแดงเช่นนี้ได้ถึง 30-90% ในหลายกรณดี งั น้ี
ของเมด็ เลอื ดแดงทงั้ หมด 12.1 กรณีทีเ่ ปน็ ผปู้ ว่ ย 0-thalassemia/ Hb
10. ในกรณีที่ผลการวิเคราะห์ Hb typing E with or without -thalassemia ผู้ปว่ ยมอี าการ
เปน็ CS A2A H หรือ CS A2A Bart’s H แปลผล ของโรคธาลัสซีเมียชัดเจน ซีด ตับม้ามโต คล้าย
เป็น Hb H-CS disease ( -thalassemia 1/ homozygous 0-thalassemia หรืออาจน้อยกว่า
Hb CS หรือ -thalassemia 1/ Hb Pakse ) โดยทั่วไปผู้ป่วยกลุ่มนี้มีปริมาณ Hb 4-10 g/dL
อาการต่างๆ จะคล้ายผู้ที่เป็นโรค Hb H disease MCV ประมาณ 55-75 fL ผลการตรวจ blood smear
( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) ในข้อที่ 9 พบเม็ดเลือดแดงที่มีการเปลี่ยนแปลงทั้งขนาดและ
แตอ่ าการมกั จะรนุ แรงกวา่ เนอ่ื งจากมคี วามไมเ่ สถยี ร รูปร่าง อาจพบเม็ดเลือดแดงตัวอ่อน (nucleated
ของ Hb H ร่วมกบั Hb CS หรอื Hb Pakse และ ข้อ red cell) ในกรณีที่ผู้ป่วยได้รับการรักษาโดยการ
ควรระวังสำหรับห้องปฏิบัติการคือ ความไม่เสถียร ให้เลอื ดมาแล้ว อาจพบ Hb A จาก donor blood
รว่ มกบั มปี ริมาณนอ้ ยของ Hb H และ Hb CS หรอื ทำให้ปริมาณ Hb E และ Hb F เปลี่ยนแปลงไป

13

ถ้าไมท่ ราบประวตั ิการรับเลือดมากอ่ น จะทำ�ใหก้ าร 13.2 ถ้าไม่มีอาการของโรคธาลัสซีเมีย
วินจิ ฉัยผดิ พลาดได้ เลยก็อาจเป็นไปได้ว่าตัวอย่างเลือดรายนั้นเป็น
12.2 กรณที ผี่ ปู้ ว่ ยมี deletional HPFH รว่ มกบั พาหะ HPFH หรือพาหะ ( )o-thalassemia ซง่ึ เป็น
Hb E โดยทว่ั ไปผปู้ ว่ ยกลมุ่ นจี้ ะไมซ่ ดี มปี รมิ าณ Hb > ภาวะทย่ี นี -globin สรา้ งสาย -globin ไดใ้ นปรมิ าณ
10 g/dL ผลการตรวจ blood smear พบลกั ษณะเมด็ สูงโดยไม่แสดงอาการผิดปกติใดๆ ควรแปลผลเป็น
เลือดแดงค่อนขา้ งปกติ รายงานผลเป็น suspected suspected HPFH trait or ( )o-thalassemia trait
HPFH/ Hb E เนอ่ื งจากผลการตรวจ Hb typing ไมส่ ามารถ
เนอ่ื งจากผลการตรวจ Hb typing ไมส่ ามารถ แยกผทู้ เ่ี ปน็ 0-thalassemia/ +-thalassemia, +-tha-
แยกผทู้ ่ีเปน็ 0-thalassemia/ Hb E และ HPFH/ Hb lassemia/ +-thalassemia, พาหะ HPFH และ พาหะ
E ออกจากกันได้ หากผลการตรวจพบ Hb typing ( )o-thalassemia ออกจากกนั ได้ หากผลการตรวจพบ
EF โดยมปี รมิ าณ Hb E ประมาณ 40-80% Hb F Hb typing A2FA โดยปริมาณ Hb F 10–30%
ประมาณ 20-60% ไม่พบ Hb A ห้องปฏิบัติการ ห้องปฏิบัติการสามารถแปลผลเป็น suspected
สามารถแปลผลเปน็ suspected 0-thalassemia/ Hb 0-thalassemia/ +-thalassemia or +-thalassemia/
E or HPFH/ Hb E with or without -thalassemia β+-thalassemia or HPFH trait or ( )o-thalassemia trait
13. ในกรณที ผ่ี ลการวเิ คราะห์ Hb typing เปน็ with or without -thalassemia อยา่ งไรกต็ ามการ
A2FA โดยปรมิ าณ Hb F 10–30% พบไดใ้ นหลายกรณี ตรวจพบ Hb F ในตัวอย่างเลือดผู้ป่วย ก่อนท่ีจะ
ดงั นี้ ท�ำ การวนิ จิ ฉยั ใดๆ ตอ้ งตรวจสอบอายขุ องผปู้ ว่ ยกอ่ น
13.1 ในกรณีที่ผู้ป่วยมีภาวะซีดไม่มีประวัติ เสมอ หากอายยุ งั ไมค่ รบ 1 ปี จะยงั ไมส่ ามารถใหก้ าร
การรบั เลือดภายใน 3 เดือน กอ่ นทำ�การตรวจเลือด วินิจฉัยท่ีถูกต้องได้ นอกจากน้ันควรพิจารณา
ควรแปลผลเป็น suspected 0-thalassemia/ +- อาการทางคลินิกประกอบ หากไม่มีอาการของโรค
thalassemia หรือ +-thalassemia/ +-thalassemia ธาลสั ซเี มยี เลย กอ็ าจเปน็ ไปไดว้ า่ ผปู้ ว่ ยมภี าวะ HPFH

14

หรือ ( )o-thalassemia หรือภาวะที่มี stress ery- และอื่นๆ ควรรายงานตำแหน่งของฮีโมโกลบิน
thropoiesis จากสาเหตอุ น่ื ๆ ทท่ี ำใหม้ ภี าวะเลอื ดจาง ผดิ ปกตทิ พ่ี บบนโครมาโตแกรมหรอื electrophoregram
เช่น การตั้งครรภ์ ภาวะเลือดจางเรื้อรัง มะเร็ง และแปลผลเปน็ suspected abnormal Hb ไมค่ วรระบุ
เม็ดเลือดขาว แต่การเพิ่มขึ้นของปริมาณ Hb F ชนดิ ของฮโี มโกลบนิ ผดิ ปกติ ถงึ แมว้ า่ เครอ่ื งจะรายงาน
ในภาวะที่มี stress erythropoiesis นี้มักจะเพิ่มขึ้น Window ของฮีโมโกลบินเหล่านั้นก็ตาม เนื่องจาก
ไม่เกินร้อยละ 10 ดังนั้นการที่ตรวจพบปริมาณ ฮโี มโกลบนิ ผดิ ปกตหิ ลายชนดิ มคี ณุ สมบตั ใิ กลเ้ คยี งกนั
Hb F สูงข้นึ แลว้ จะสรุปวา่ เปน็ โรค -thalassemia ไมส่ ามารถวนิ จิ ฉยั แยกจากกนั โดยการตรวจ Hb typing
จึงต้องพิจารณาให้รอบคอบ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ไม่ว่าจะโดยเครื่อง HPLC, LPLC หรือ CE เช่น
ต้องทราบประวัติ และอาการของคนไข้ หากมีผล การพบฮีโมโกลบินผิดปกติที่ S window ในระบบ
การตรวจเลือดของครอบครัวประกอบด้วยจะช่วย คอลัมน์โครมาโตกราฟี เมื่อนำไปตรวจวิเคราะห์
ใหว้ นิ จิ ฉัยไดถ้ กู ต้องมากยิ่งขน้ึ DNA พบว่าเป็นได้ทั้ง Hb Tak, Hb D Punjab,
14. ในกรณที ผ่ี ลการวเิ คราะห์ Hb typing เปน็ Hb Queens, Hb Siam และ Hb S หากตอ้ งการทราบ
EFA ผปู้ ว่ ยมภี าวะซดี ไมม่ ปี ระวตั กิ ารรบั เลอื ดภายใน 3 ชนิดของความผิดปกติจะต้องตรวจยืนยันโดยการ
เดอื นกอ่ นทำการตรวจเลอื ด ควรแปลผลเปน็ +-tha- ตรวจวิเคราะห์ DNA หรือตรวจหาลำดับการเรียง
lassemia/ Hb E with or without -thalassemia ตัวของกรดอะมิโนต่อไป
15. ในกรณีที่ผลการวิเคราะห์ Hb typing ที่กล่าวมาทั้งหมดเป็นแนวทางในการแปล
เปน็ EA Bart’s, EE Bart’s, EFA Bart’s, EF Bart’s, ผลการตรวจวิเคราะห์ฮีโมโกลบินเพื่อการวินิจฉัย
CS EA Bart’s, CS EE Bart’s, CS EFA Bart’s และ ธาลัสซีเมียที่พบบ่อยในประเทศไทยซึ่งต้องอาศัย
CS EF Bart’s ทั้งหมดนี้เป็นกลุ่มโรคธาลัสซีเมีย ขอ้ มลู หลายอยา่ งประกอบ ตง้ั แตผ่ ลการตรวจคดั กรอง
ที่มีฟีโนไทป์และจีโนไทป์ซับซ้อน ซึ่งมีภาวะร่วม คา่ ดชั นเี มด็ เลอื ดแดง ผล Hb typing ปรมิ าณ Hb A2
ระหว่าง -thalassemia, -thalassemia และ Hb E ปรมิ าณ Hb F นอกจากนป้ี ระวตั ผิ ปู้ ว่ ยและครอบครวั
ภาวะเหล่านี้เกิดเนื่องจากสาย -globin มีปริมาณ ตลอดจนผลการตรวจเลอื ดของครอบครวั กม็ สี ว่ นชว่ ย
น้อยลง และสาย -globin ชอบจบั กับสาย -globin ใหก้ ารวนิ จิ ฉยั มคี วามถกู ตอ้ งแมน่ ยำมากยง่ิ ขน้ึ
ปกตมิ ากกวา่ สาย E-globin ในกรณที เ่ี ปน็ Hb E trait
จงึ ตรวจพบปรมิ าณของ Hb E ลดลงดว้ ยเสมอเมอื่ ข้อจำกดั
เทยี บกับปริมาณ Hb A โดยจะพบปริมาณนอ้ ยกว่า
ร้อยละ 20 แต่การจะสรุปจีโนไทป์ให้ถูกต้องจริงๆ 1. เครื่องวิเคราะห์ฮีโมโกลบินอัตโนมัติ
ควรจะต้องทำการตรวจวิเคราะห์ DNA ทั้งยีน แสดงผลในลักษณะโครมาโตแกรมหรือโซนต่างๆ
- thalassemia และ -thalassemia ดว้ ยจงึ จะสามารถ ที่ปรากฎร่วมกับปริมาณของฮีโมโกลบินแต่ละชนิด
สรุปเพื่อให้คำปรึกษาเกี่ยวกับการถ่ายทอดทาง โดยไมไ่ ด้สรปุ ผล Hb typing ใหผ้ ้ปู ฏิบัติงานจึงตอ้ ง
กรรมพนั ธ์ุของครอบครัวผู้ปว่ ยได้อย่างถูกต้อง มีความรู้และประสบการณ์สูงในการรายงานผล
16. ในกรณีพบฮีโมโกลบินผิดปกติที่นอก และแปลผล
เหนอื จาก Hb E และ Hb CS จัดเปน็ ฮีโมโกลบิน 2. อนุพันธ์ของฮีโมโกลบิน (hemoglobin
ผิดปกติที่พบไม่บ่อย (rare abnormal Hb) เช่น derivatives) เช่น glycosylated Hb, acetylated
Hb J Bangkok, Hb Hope, Hb Q-Thailand, Hb C, Hb O Hb F และฮีโมโกลบินที่โมเลกุลสลายบางส่วน

≤ 3.5%
≤ 3.5%
3.6-8%

16

การตรวจวิเคราะห์ความผดิ ปกติ
ของยีนทีเ่ ปน็ สาเหตุของ
-thalassemia 1

17

การตรวจวิเคราะห์ความผิดปกติ
ของยีนท่ีเป็นสาเหตขุ อง -thalassemia 1

ความผดิ ปกตขิ องยนี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ อง -tha- PCR Product โดยการทำ agarose gel electrophore-
lassemia 1 ในประชากรไทยมสี าเหตมุ าจากการขาด sis อาศัยการสร้าง primer ให้คร่อมบริเวณ DNA
หายไปของยีน -globin ทั้งสองยีนบนโครโมโซม ที่ขาดหายไป เมื่อนำไปทำ PCR จะสามารถเพิ่ม
เดียวกัน จึงไม่สามารถสังเคราะห์สาย -globin จำนวนชิ้นส่วนของ DNA ได้ เนื่องจากการขาด
ได้เลย สามี-ภรรยาที่มีความผิดปกติของ -tha- หายไปของ DNA ทำให้ primer ดังกล่าวถูก
lassemia 1 ทง้ั คู่ มโี อกาสถา่ ยทอดความผดิ ปกตริ ว่ ม เลื่อนเข้ามาใกล้กัน ส่วน DNA คนปกติ (normal
กนั ไปสลู่ กู ทำใหล้ กู เปน็ homozygous -thalassemia DNA) primer ทง้ั สองทใ่ี ชอ้ ยหู่ า่ งกนั มากกวา่ 17.5 kb
1 (Hb Bart’s hydrops fetalis) ซึง่ เปน็ โรคธาลัสซเี มยี (SEA deletion) และมากกวา่ 38 kb (THAI deletion)
ที่มีอาการรุนแรงที่สุด ทารกจะเสียชีวิตตั้งแต่อยู่ ซึ่งเป็นขนาดที่ใหญ่เกินกว่าจะเพิ่มจำนวนได้
ในครรภ์ ตายคลอด หรือไม่กี่ชั่วโมงหลังคลอด ในการทำ PCR ทั่วๆ ไป จึงไม่มี PCR product
ในขณะที่มารดาจะเกิดภาวะแทรกซ้อนของการ เกิดขึ้น และเพื่อให้สามารถวินิจฉัยแยกระหว่าง
ตั้งครรภ์ มีอาการครรภ์เป็นพิษ มีการคลอดผิด homozygous -thalassemia 1 และพาหะ -tha-
ปกติ ตกเลือดหลังคลอด หากอาการรุนแรงมาก lassemia 1 จึงมกี ารเพิ่ม primer สำหรับเพ่ิมปริมาณ
อาจเสียชีวิตได้ หากห้องปฏิบัติการมีศักยภาพใน normal DNA ลงไปในการทำปฏิกิริยา PCR ด้วย
การตรวจหาความผิดปกติของยนี -thalassemia 1 จากนน้ั จงึ ตดิ ตามการเกดิ PCR products โดยการทำ
ไดอ้ ยา่ งมปี ระสิทธิภาพ ถกู ต้องและรวดเร็ว จะช่วย agarose gel electrophoresis และเปรยี บเทยี บขนาด
ปอ้ งกนั อนั ตรายทจ่ี ะเกดิ ขน้ึ กบั มารดาทต่ี ง้ั ครรภบ์ ตุ ร DNA ทเ่ี กดิ ขน้ึ ทำใหท้ ราบวา่ บคุ คลนน้ั มคี วามผดิ ปกติ
เป็น Hb Bart’s hydrops fetalis ได้อยา่ งทนั ท่วงที ของยนี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ อง -thalassemia 1 ชนดิ SEA
ความผดิ ปกตขิ องยนี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ อง -tha- deletion หรือชนดิ THAI deletion หรือไม่
lassemia 1 ที่มีรายงานในประชากรไทยมี 2 ชนิด
คือชนิด SEA deletion และชนิด THAI deletion Relative Quantitative PCR
ส่วนใหญ่ที่พบเป็นชนิด SEA deletion ชนิด THAI เทคนิค Relative Quantitative PCR
deletion ถงึ แมจ้ ะพบในอตั ราสว่ นทน่ี อ้ ยกวา่ แตถ่ า้ พบ อาศยั การออกแบบ primer และ probe 3 ชดุ สำหรบั
ความผดิ ปกตริ ว่ มกบั ชนดิ SEA deletion กส็ ง่ ผลใหเ้ กดิ เพม่ิ ปรมิ าณ DNA และตรวจหาความผดิ ปกตขิ องยนี
Hb Bart’s hydrops fetalis ไดเ้ ช่นเดียวกนั ที่เป็นสาเหตุของ -thalassemia 1 ชนิด SEA
deletion และชนดิ THAI deletion เปรียบเทยี บกบั
หลักการ ยนี -globin ทปี่ กติ โดย probe ทง้ั 3 ชนิด ไดร้ บั
การออกแบบให้ติดฉลากด้วยสี fluorescence ที่
Gap PCR/ Agarose Gel Electrophoresis แตกต่างกันจึงสามารถติดตามความผิดปกติของยีน
ความผิดปกติของยีนที่เป็นสาเหตุของ - -thalassemia 1 ทง้ั 2 ชนิดได้
thalassemia 1 สามารถตรวจหาไดโ้ ดยเทคนิค PCR ตัวอย่างที่ไม่พบความผิดปกติของ -tha-
สว่ นใหญ่นยิ มใชว้ ิธี Gap PCR ร่วมกบั การวิเคราะห์ lassemia 1 ทง้ั ชนดิ SEA และชนดิ ไทย จะพบเฉพาะ



การตรวจวเิ คราะหค์ วามผดิ ปกติ
ของยนี ทเี่ ป็นสาเหตขุ อง
-thalassemia

19

การตรวจวเิ คราะหค์ วามผิดปกติ
ของยีนที่เปน็ สาเหตขุ อง -thalassemia

ความผดิ ปกตขิ องยนี ทเ่ี ปน็ สาเหตขุ อง -tha- polymerase ชนิดทไี่ มม่ ฤี ทธขิ์ อง 3’-5’ exonuclease
lassemia ในประชากรไทยส่วนใหญ่เป็นชนิด point ภายใต้สภาวะในการทำ PCR ที่เหมาะสม primer
mutation ซง่ึ เกดิ จากการมเี บสเปลย่ี นแปลงไป (base sub- จำเพาะแต่ละชนิด จะทำให้เกิดการเพิ่มจำนวน
stitution) หรอื เบสจำนวนนอ้ ยๆ ขาดหายไป หรอื เกนิ มา -globingeneจากAlleleใดAlleleหนง่ึ ทจ่ี ำเพาะเทา่ นน้ั
(small deletion หรอื insertion) ทำใหเ้ กดิ mutation จึงสามารถแยก -globin gene ปกติ และ -tha-
ที่เรียกว่า frameshift mutation ความรุนแรงของ lassemia ออกจากกันได้โดยตรวจดูชิ้นส่วน DNA
-thalassemia ขึ้นกับชนิดของ mutation ที่เกิดขึ้น ทเ่ี พม่ิ จำนวนขน้ึ มาได้ โดยการแยกดว้ ยกระแสไฟฟา้
วา่ สามารถสรา้ ง mRNA หรอื สาย -globin ไดห้ รอื ไม่ (agarose gel electrophoresis)
หากไม่สามารถสรา้ งสาย -globin ไดเ้ ลย เรยี ก 0- ในการทำ ASPCR ตัวอย่างที่ให้ผลลบ
thalassemia แตถ่ า้ สามารถสรา้ งสาย -globin ไดบ้ า้ ง จะไม่ปรากฏแถบ DNA ใดๆ ให้เห็นบนแผ่นเจล
เรียก +-thalassemia ความผิดปกติของยีนที่เป็น ที่แยกด้วยกระแสไฟฟ้า ดังนั้นนอกเหนือจาก
สาเหตขุ อง -thalassemia ในประชากรไทยมีความ ตัวอย่างควบคุมที่ให้ผลบวก (positive control)
หลากหลายมาก ปจั จุบันมรี ายงานมากกว่า 30 ชนดิ และให้ผลลบ (negative control) แล้ว จะต้องมกี าร
โดยแต่ละภูมิภาคแตล่ ะชุมชนกม็ คี วามแตกตา่ งกัน ควบคุมคุณภาพปฏิกิริยา PCR ในหลอดทดลอง
การตรวจหาความผิดปกติของยีนที่เป็น (internal control) ของการทำ PCR ด้วย โดยเป็น
สาเหตขุ อง -thalassemia ในปจั จุบนั นิยมใช้เทคนิค การเพิ่มจำนวนของยีนอื่นที่ไม่ใช่ -globin gene
allele specific PCR (ASPCR), เทคนิค reverse dot และมีขนาดชิ้นส่วน DNA ที่แตกต่างจากยีนที่เป็น
blot hybridization (RDB) และการตรวจหาลำดบั การ สาเหตขุ อง -thalassemia ท่ีกำลงั จะตรวจ
เรยี งตวั ของสารพนั ธุกรรม (DNA sequencing) วธิ ี ASPCR นับเป็นวิธที ี่รวดเร็ว และสะดวก
ในการตรวจหาความผิดปกติของยีน เนื่องจาก
หลักการ ขน้ั ตอนทต่ี อ้ งทำการวเิ คราะหภ์ ายหลงั ขน้ั ตอน PCR
(post PCR) มเี พยี งการตรวจหา DNA ท่ีเพม่ิ จำนวน
เทคนคิ Allele Specific PCR (ASPCR) ได้โดยการแยกดว้ ยกระแสไฟฟา้ เท่าน้นั
เทคนิค allele specific PCR (ASPCR)
อาศัยการออกแบบและสังเคราะห์ primer ให้มี เทคนคิ Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)
ความจำเพาะตอ่ mutation ชนดิ ใดชนดิ หนง่ึ ชนดิ ละ เทคนิค Reverse Dot Blot Hybridization
2 primer, primer ที่ 1 จำเพาะต่อ Allele ปกติ (RDB) อาศัยการออกแบบและสังเคราะห์ Allele
และ primer ท่ี 2 จำเพาะตอ่ mutation ชนดิ นน้ั ๆ Specific Oligonucleotide (ASO) Probe หลายๆ
โดยออกแบบให้มีเบสจำเพาะที่ปลายด้าน 3’ ยชนึดดิตทิดม่ีบปีนลแาผย่นขไา้ นงหลอนนง่ึ เเปมน็ มหเบมรู่อนะ(มnyิโlนon(NmHem2) bนraำnมeา)
จากนั้นนำ primer ทั้งสองชนิดนี้ไปทำ PCR คู่กับ ท่ีเป็นประจลุ บ แลว้ นำ DNA ของผปู้ ่วยที่ไดท้ ำ PCR
primer ปกตอิ กี ชนดิ หนง่ึ ซง่ึ เปน็ common primer โดยใหน้ วิ คลโิ อไทดบ์ นสาย DNA ตดิ ฉลากดว้ ย Biotin
โดยอาศยั เอนไซม์ Taq DNA polymerase หรอื DNA

20

มาhybridizeกบั ASOProbeบนแผน่ เมมเบรนดงั กลา่ ว วิธีการ
แลว้ ตรวจสอบปฏกิ ิริยา hybridization ระหวา่ ง ASO
Probe กับ DNA ผู้ปว่ ย โดยการทำ color detection ส่วนใหญ่แต่ละหน่วยงานจะพัฒนาวิธีการ
วธิ กี ารดงั กลา่ วสามารถตรวจหาความผดิ ปกตขิ องยนี ตรวจวิเคราะห์ขึ้นใช้เอง หลักการวิเคราะห์จึงอาจ
-thalassemia ไดห้ ลายชนดิ จากการทำ hybridization แตกตา่ งกนั ขน้ึ กบั ปรมิ าณตวั อยา่ งสง่ ตรวจ ตลอดจน
เพียงครั้งเดยี ว นบั เปน็ วิธีที่สะดวก รวดเร็ว ความพร้อมของบุคลากรและเครื่องมือ สิ่งที่สำคัญ
การตรวจหาลำดบั การเรยี งตวั ของ คือจะต้องมีการตรวจสอบความถูกต้องของวิธี
สารพันธกุ รรม (DNA sequencing) วเิ คราะห์ (method validation) กอ่ นเปดิ บรกิ าร เพอ่ื ให้
สอดคลอ้ งตามขอ้ กำหนดในมาตรฐานสากล และมี
ความมนั่ ใจในประสิทธิภาพของการตรวจวิเคราะห์

วิธีตรวจหาลำดับการเรียงตัวของสาร การรายงานผล
พนั ธุกรรม (DNA sequencing) ทน่ี ิยมใช้ในปจั จบุ นั
คือวิธี chain termination ของ Sanger ซ่ึงสามารถ รายงานผล Negative ในกรณีตรวจไม่พบ
พัฒนาใช้ร่วมกับเครื่องอัตโนมัติ ทำให้การอ่าน ความผิดปกติของยีน -thalassemia ที่ตรวจสอบ
และการวิเคราะหผ์ ลทำไดส้ ะดวกมากขนึ้ อาศยั การ เชน่ Negative for -thalassemia codons 41/ 42
เพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการตรวจหาลำดับ (-TTCT), codon 17 (A-T) and IVS I - 5 (G-C)
การเรียงตัวของสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค PCR รายงานผล Positive for -thalassemia และ
โดย DNA สายใหม่ที่สร้างขึ้นจะถูกจำกัดความ ระบคุ วามผดิ ปกติของยนี -thalassemia ทีต่ รวจพบ
ยาวด้วย dideoxy nucleotide ตัวใดตัวหนึ่งใน 4 เช่น Positive for -thalassemia [Codons 41/42
ตัว คือ ddATP, ddGTP, ddCTP และ ddTTP (-TTCT)]
ที่ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ที่แตกต่างกัน รายงาน Positive for compound heterozygous
เมื่อนำปฏิกิริยาที่ได้ไปทำ polyacrylamide gel -thalassemia และระบุชนิดของยีนที่ผิดปกติ
electrophoresis จะสามารถแยกชิ้นส่วนของ DNA ในกรณที ต่ี รวจพบความผดิ ปกตขิ องยนี 2 ชนดิ รว่ มกนั
ทม่ี คี วามยาวตา่ งกนั 1 เบสได้ การทำ electrophore- เชน่ Positive for compound heterozygous -tha-
sis โดยใช้เครื่องอัตโนมัติ ซึ่งมีอุปกรณ์การอ่าน lassemia [Codons 41/42 (-TTCT) and IVS I-5
และการแปลผลข้อมูล จะช่วยอำนวยความสะดวก (G-C)]
ในการตรวจวิเคราะห์ไดเ้ ปน็ อย่างดี

β o(rHHbbDNhoenabpuorliis) Unstable Hb

30. 105 bp deletion ( β)0 (mild
31. 619 bp deletion β-thalassemia)
32. 3485 bp deletion
33. 45 kb deletion β-thalas(smeimldia)
34. 12.5 kb deletion
35. Asian Indian inversion deletion
36. 101 kb deletion

22

การควบคุมคณุ ภาพ สว่ นการตรวจหา mutation ของยนี -thalassemia
ในหญิงตั้งครรภ์ และหรือคู่สมรสที่มีผลการตรวจ
1. ควรทำ positive control และ negative คดั กรองเปน็ บวก และผลวเิ คราะหฮ์ โี มโกลบนิ ทว่ี นิ จิ ฉยั
control โดยใชต้ วั อยา่ ง DNA ทผ่ี า่ นการตรวจยนื ยนั ไwไมดihแ้จ่ ลำhเว้igปวhน็า่ Hเตปbอ้ น็ งAพต2)ารเวหมจะอ่ื กใบั ห-ผ้tphลraiบmlaวseกsreกNmบั iตmaอ่ u(HtabtiotynpiใnดgแลAว้2Aก็
แลว้ ทำปฏกิ ริ ยิ าควบคไู่ ปกบั ตวั อยา่ งสง่ ตรวจทกุ ครง้ั 2. จำเปน็ ตอ้ งใช้ primer หลายชนดิ ในการ
2. ควรเขา้ รว่ มโครงการทดสอบความชำนาญ ตรวจ แตถ่ า้ เลอื กศกึ ษาในกลมุ่ ประชากรเปา้ หมายแลว้
ทางห้องปฏิบัติการเพื่อเปรียบเทียบผลการตรวจ จะมี mutation ทต่ี อ้ งตรวจไม่มากนกั
วเิ คราะหก์ บั หนว่ ยงานอน่ื หากไมม่ โี ครงการดงั กลา่ ว
อาจเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์กับหน่วยงานอื่นที่ เทคนคิ Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)
นา่ เชอ่ื ถอื (inter-laboratory comparison) เปน็ ระยะๆ 1. กรณีที่เป็น compound heterozygote
ตามความเหมาะสม ของ mutation ที่มีตำแหน่งใกล้กัน เช่น IVS 1 nt
3. ควรใหค้ วามสำคญั ในการดแู ลบำรงุ รกั ษา 1 และ IVS 1 nt 5 หรือ codon 17 และ codon
และสอบเทยี บครภุ ณั ฑท์ ม่ี ผี ลกระทบตอ่ ความนา่ เชอ่ื 19 จะไมพ่ บการเกดิ สบี น normal probe เนื่องจาก
ถือของการตรวจวิเคราะห์ ตำแหน่งทผี่ ดิ ปกติใกล้กัน ทำให้ normal probe ท้ัง 2
4. บุคลากรที่ปฏิบัติหน้าที่ควรได้รับการฝึก ชนดิ ไมส่ ามารถ hybridize กับ DNA template ได้
อบรมเปน็ ประจำอยา่ งตอ่ เนอ่ื ง 2. เปน็ วธิ ที ค่ี อ่ นขา้ งยากและมหี ลายขน้ั ตอน
จงึ ตอ้ งอาศัยผู้เชี่ยวชาญและมีประสบการณส์ งู
ขอ้ จำกดั
การตรวจหาลำดบั การเรยี งตวั ของสารพนั ธกุ รรม
เทคนคิ Allele Specific PCR (ASPCR) (DNA sequencing)
1. การตรวจยีน -thalassemia ด้วยวิธี 1. เปน็ วธิ ที ค่ี อ่ นขา้ งยากและมหี ลายขน้ั ตอน
multiplex ASPCR เมื่อพบผลบวกกับ mutation จึงต้องอาศยั ผ้เู ชี่ยวชาญและมีประสบการณส์ งู
ชนิดใดชนิดหนึ่งจะสรุปจีโนไทป์ยังไม่ได้จะต้องทำ 2. เป็นวิธีที่ต้องใช้เครื่องมือที่มีราคาแพง
PCR อีกหลอดด้วย primer ปกติ (N) ที่ codon จึงเหมาะกับห้องปฏิบัติการอ้างอิงที่ให้บริการตรวจ
ทม่ี ี mutation นั้น ถ้าตรวจพบแถบ DNA ทจี่ ำเพาะ หาลำดับการเรียงตัวของสารพันธุกรรมในด้านอื่น
เมอ่ื ใช้ primer N ด้วย กแ็ สดงวา่ เป็น heterozygote ที่นอกเหนือจากการตรวจหาความผิดปกติของยีน
แต่ถ้าไม่พบก็แสดงว่าเป็น homozygote การตรวจ ธาลัสซีเมีย
ด้วย primer N นี้จะใช้ในกรณีที่ทำการตรวจ
วินิจฉัยตัวอย่างทารกที่พ่อและแม่มี mutation
ชนดิ เดยี วกัน แต่ถา้ พ่อและแมม่ ี mutation ตา่ งชนิด
กัน เช่น พ่อมี -thalassemia codon 17 [A-T] แม่มี
Hb E ตัวอย่าง DNA ของทารกก็จะตรวจด้วย
primer M ของ codon17 [A-T] และ Hb E เท่านั้น

สรปุ แนวทางการดำเนินงาน
ทางหองปฏิบตั กิ าร

และตารางแสดงชนิดธาลสั ซีเมีย
ของคูสามีภรรยาที่เส่ียงตอการมบี ุตร

เปนโรคธาลสั ซีเมียชนดิ รนุ แรง

≤ 3.5% 3.6-8%

24

ชนิดธาลสั ซีเมยี ของค่สู ามีภรรยาทเ�ี สี�ยงต่อการมีบุตรเป็ นโรคธาลสั ซีเมียชนิดรุนแรง

ธาลสั ซีเมียในค่สู ามีภรรยา โรคที�เป็นความเส�ียงของบุตร (โอกาสเป็นโรค)
Hb Bart’s Hydrop fetalis (1/4)
-thal 1 trait + -thal 1 trait Hb Bart’s Hydrop fetalis (1/4)
-thal 1 trait + Hb H disease Hb Bart’s Hydrop fetalis (1/4)
Hb H disease + Hb H disease -thal Major (1/4)
-thal trait + -thal trait -thal Major (1/2)
-thal trait + -thal Major -thal Major (100%)
-thal Major + -thal Major -thal with Hb E (1/4)
-thal trait + Hb E trait -thal with Hb E (1/2)
-thal trait + Homo Hb E -thal with Hb E (100%)
-thal Major + Homo Hb E -thal with Hb E (1/2)
-thal with Hb E + Homo Hb E -thal with Hb E (1/4) และ -thal Major (1/4)
-thal with Hb E + -thal trait -thal with Hb E (1/2) และ -thal Major (1/4)
-thal with Hb E + -thal with Hb E -thal with Hb E (1/2) และ -thal Major (1/2)
-thal with Hb E + -thal Major

หมายเหตุ -thal with Hb E และ -thal Major บางรายแต่งงานและมีบตุ รได้

บรรณานกุ รม

10. สทุ ัศน ฟเู จรญิ ,วรวรรณ ตนั ไพจติ ร, กติ ติ
ตอจรัส, วิปร วิประกษิต และอรุโณทัย มีแกวกุญชร
(บรรณาธิการ). แนวทางการวินิจฉัยและการรักษาโรค
โลหติ จางธาลสั ซีเมีย พิมพคร้ังท่ี 1. กรุงเทพฯ: สถาบัน
สุขภาพเด็กแหงชาติมหาราชิน,ี 2557.

26

ภาคผนวก

27

คำย่อ

ASO allele specific oligonucleotide
ASPCR allele specific polymerase chain reaction
CE capillary electrophoresis
CS constant spring
DCIP dichlorophenolindophenol
Hb hemoglobin
Hct hematocrit
HPFH hereditary persistance of fetal hemoglobin
HPLC high pressure liquid chromatography
LPLC low pressure liquid chromatography
MCH mean corpuscular hemoglobin
MCV mean corpuscular volume
OF osmotic fragility
PCR polymerase chain reaction
RDB reverse dot blot
SEA Southeast asia
Taq Thermus aquaticus
Thal thalassemia







32