Biologia.molecular

CAPÍTULO 14 • Vectores de clonación y expresión 137

Genoma Promotor Corte con enzimas Producción de proteínas recombinantes
de restricción
La clonación molecular ha permitido determinar la función
E1 E2 E3 E4 de múltiples proteínas y generar proteínas recombinantes,
que han reducido los costos de producción de hormonas o
ARNm 5´ AAAAA proteínas requeridas en la terapéutica, de las cuales previa-
mente sólo se disponía de pequeñas cantidades por la esca-
ARNm 5´ AAAAA Síntesis sez de fuentes, y la dificultad en su aislamiento o purificación.
3´ TTTTT de ADN La facilidad en la producción de las proteínas recombinan-
complementario tes ha revolucionado el área biotecnológica, que ahora es
un mercado dominante en el mundo de la biología molecu-
Degradación del ARNm lar y cubre más de 10% de toda la industria farmacéutica.
Las proteínas recombinantes se producen en bacterias
ADNc de cadena 3´ TTTTT (E. coli, B. subtilis), levaduras (Saccharomyces cereviceae,
sencilla Pichia pastoris), células de insecto (Spodoptera frugiper-
AAAAA da-9) y células de mamífero (células de ovario de hámster
Doble cadena 5´ TTTTT chino –CHO–, línea celular de riñon de hámster bebé
de ADNc 3´ –BHK– y HEK293 de riñón de embrión humano). Para
maximizar la expresión de las proteínas se emplean promo-
Plásmido tores fuertes que aseguren la expresión por arriba de 10%
recombinante del total de las proteínas celulares, aunque esto impone una
con el ADNc carga metabólica a las células bajando la velocidad de su
crecimiento, por lo que ciertas proteínas recombinantes
Figura 14-8. Producción de una genoteca de ADN complementario. Las pueden resultar tóxicas para las células que las producen.
genotecas de ADNc se construyen a partir de la secuencia de También puede alterarse la secuencia del gen de interés sus-
ARNm, de los cuales se sintetiza el ADNc por retrotranscripción. tituyendo codones para los que hay ARNt poco frecuentes
El ARNm remanente es degradado, y la cadena complementaria y reemplazarlos por aquellos que codifican para el mismo
del ADN de cadena sencilla para formar un ADN de doble cadena aminoácido, pero que se usan más en el organismo hués-
se sintetiza con ayuda de una ADN polimerasa. Los fragmentos de ped. Asimismo, la producción de proteínas recombinantes
ADNc de doble cadena se clonan en el vector de elección. en plantas presenta la ventaja de que su disponibilidad es
prácticamente ilimitada de biomasa, y los costos de produc-
Genotecas de ADNg ción son bajos, pues una vez establecido el cultivo no se
requiere personal especializado, no presenta riesgos de
Para construir bancos de ADN es necesario aislar el ADNg contaminación con patógenos animales, endotoxinas bac-
del organismo de interés. Este ADNg se corta con enzimas terianas o secuencias de ADN oncogénicas. Una ventaja
de restricción para generar fragmentos con extremos com- adicional es que las plantas permiten el almacenamiento
plementarios a los del vector de clonación. Una vez que se estable de la proteína recombinante en semillas y tubércu-
ha construido la genoteca, se rastrea el clon o clones que los, lo que facilita su conservación, transporte y distribu-
portan el ADN con el gen de interés. Los métodos más fre- ción. Esto permite el abaratamiento de costos respecto a
cuentes de identificación de clones recombinantes en una otros sistemas de producción. Así, existen ya biorreactores
genoteca son la hibridación usando alguna sonda marcada vegetales que producen vacunas comestibles, en tubérculos
(véase capítulo de técnicas de hibridación), el uso de anti- u hojas de lechuga, como por ejemplo para el antígeno de
cuerpos frente a la proteína de interés o la selección de clo- superficie del virus de la hepatitis B humana.
nas por la actividad biológica de la proteína. En la actualidad,
gracias a los adelantos de la metodología del ADN recombi- La clonación molecular ha incrementado las perspecti-
nante, es posible separar regiones determinadas de ADN, vas iniciales de la metodología del ADN recombinante y, de
secuenciarlas, alterar la secuencia e introducir ese ADN exó- cierta manera, sentó las bases para la clonación de organis-
geno a las células de un organismo, y aun a células germina- mos e impulsó el desarrollo de la biotecnología, que ha
les, para la producción de organismos transgénicos (véanse tomado un papel protagónico en las ciencias de la salud.
detalles en el capítulo de organismos transgénicos).

138 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Ejercicios de integración

1. Correlacione las columnas eligiendo el vector más indica- Pregunta. ¿Es aconsejable preparar el inserto que se va a
clonar en dos enzimas de restricción diferentes, las cua-
do para cada uno de los siguientes insertos. les también se emplean para cortar el vector al cual se
unirá el inserto? ¿Es la única forma posible? Comentar.
Inserto Vector 4. En la imagen que se presenta inserte los siguientes térmi-
nos donde crea conveniente: ADN recombinante, inserto,
Genoma de M. tuberculosis pcADN 3.1 ADN genómico, vector, corte con enzima de restricción,
ligación, transformación celular, E. coli, linearización del
ADNc de insulina pGLO vector.

Gen de colágena Fago

Genoma de M. musculus YAC

ADNc de miostatina BAC

2. Ordene cada paso necesario para la producción de una

proteína recombinante, colocando el número del 1 al 10

que corresponda.

• Corte del inserto con enzima(s) de restricción

• Purificación del vector

• Transformación celular

• Ligación inserto/vector

• Selección del ARNm

• Selección de la clona celular transformada

• Purificación de la proteína recombinante

• Expresión de la proteína recombinante

• Conversión del ARNm a ADNc

• Corte del vector con enzima(s) de restricción

• Purificación del inserto

3.

a) Dibuje la estructura de un extremo de un fragmento

de ADN lineal producido por una digestión con XhoI.

b) Dibuje la estructura resultante si la estructura deriva-

da de la pregunta anterior se trata con una nucleasa

que sólo degrada ADN monohebra.

c) Dibuje la estructura de un extremo de un fragmento

de ADN lineal producido por una digestión con PvuII.

d) Dibuje la estructura producida al ligar el extremo de la

parte (b) con el de la (c).

Pregunta. ¿Cuántos sitios de reconocimiento para la en-

zima EcoRI existen en el plásmido pX si al analizar me-

diante electroforesis en geles de agarosa el producto de

la digestión produce 4 fragmentos de ADN de diferentes

tamaños?

Bibliografía Surzycki S. Basic techniques in molecular biology. DNA Cloning
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Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a labora-
tory manual, 3ª ed. Vol 1. Nueva York: CSHL Press, 2001.

Capítulo 15

Técnicas de hibridación

Miriam Ruth Bueno Topete / Jaime González Cuevas

Introducción fico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el
pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la téc-
Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las nica de hibridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas
células procesan, añaden, eliminan y transfieren informa- de hibridación más comunes se encuentran Southern blot,
ción genética, los biólogos moleculares abrieron el camino Northern blot, Slot blot, Dot blot e hibridación in situ.
para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas. Antes de abordar cada metodología es importante mencio-
En los últimos años, se han desarrollado técnicas que han nar algunos aspectos básicos que facilitarán el entendi-
permitido abordar el análisis y la manipulación del ADN de miento técnico de estas herramientas de la biología mo-
una forma antes inimaginada. La tecnología del ADN lecular, como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la
recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la definición de sondas.
estructura y la función de los genes, en especial de los genes
eucarióticos, inaccesibles por otros métodos. Cuando los Electroforesis de ácidos nucleicos
investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran
tamaño y la complejidad del ADN, incluso el del virus más La electroforesis es una técnica analítica de separación de
simple, la posibilidad de descifrar la información genética macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la dife-
codificada parecía estar más allá de toda esperanza. Se hizo rente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas
evidente que para estudiar un gen individual, se lo debía cuando se someten a la influencia de un campo eléctrico
aislar del resto del genoma ya que, cada gen representa una como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos
pequeña sección dentro de un cromosoma y, en ese contex- nucleicos son moléculas cargadas negativamente, debido a la
to, no puede individualizarse. Para el aislamiento de un gen presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza
o de fragmentos más pequeños, el ADN debe fragmentarse. del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas con-
Si bien la rotura del ADN puede realizarse mecánicamente, diciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximada-
por este medio la fragmentación se produce al azar. La mente igual al número de grupos fosfato. La electroforesis en
obtención de fragmentos específicos de ADN fue posible geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados,
mediante un método desarrollado a partir de herramientas cámaras generalmente horizontales, y requiere de dos ele-
propias de ciertos organismos. Para avanzar hacia un estu- mentos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La
dio más detallado del ADN fue necesaria una metodología fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad
que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspon-
específicos de ADN. Estos fragmentos podían ser ADN dientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacio-
genómico, ADN complementario (ADNc) o ADN obteni- naria, o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa
dos a partir de oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes conocida como agarosa (originalmente obtenido de algas,
de que un determinado fragmento de ADN o de ARN men- como el agar-agar, pero de composición más homogénea).
sajero (ARNm) pueda manipularse de cualquier modo, pri- Dependiendo de su concentración genera poros de cierto
mero debe localizarse. Los cromosomas, incluso los de las tamaño a través de los cuales migran los fragmentos de ADN
células eucarióticas más simples, contienen una enorme o ARN. Normalmente la concentración es de 0.5 a 2%. La
cantidad de ADN, por lo que localizar un segmento especí- agarosa posee la propiedad de permanecer líquida a más de

139

140 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

50 °C y de formar un gel al enfriarse. Los fragmentos de áci- el diagnóstico de mutaciones en enfermedades genéticas o
dos nucleicos separados por electroforesis se visualizan la identificación de un polimorfismo).
mediante su tinción con bromuro de etidio, un colorante que
se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescen- Southern blot
cia cuando se irradia con luz ultravioleta.
Fundamento
Sondas
La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin
Las sondas son segmentos de ADN o ARN de cadena sen- Southern y es una estrategia estándar para analizar ADN
cilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o previamente digerido con enzimas de restricción.
radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño de
la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de
permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del un gen o fragmentos del ADN específicos en una mezcla
genoma de un ser humano, identificar “un solo gen” o “el de ácidos nucleicos previamente extraídos.
fragmento de un gen”. Gran parte del éxito de este tipo de
estrategias moleculares depende de la especificidad de la Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales:
sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 bases, la desnaturalización o separación de las cadenas comple-
conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles de mentarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas
bases de nucleótidos. Pueden sintetizarse y purificarse con complementarias. Este fundamento es compartido por
relativa facilidad por instrumentos comerciales disponibles todas las técnicas de hibridación.
en la actualidad. En términos generales las sondas se obtie-
nen a partir de síntesis química o de plásmidos, que se clo- Procedimiento técnico
nan con la sonda de interés. La especificidad de la síntesis
de la sonda dependerá del objetivo de estudio (por ejemplo, En este procedimiento, primero se aísla el ADN de cual-
quier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que
carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un pacien-

Corte con enzimas Electroforesis Fragmentos
de restricción separados

ADN genómico Fragmentos de ADN Membrana
Película Gel

Papel absorbente

Membrana

Autorradiografía Amortiguador

Detección de la secuencia Hibridación con la
de interés sonda marcada

Figura 15-1. Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Obtención del ADN
genómico y digestión con enzimas de restricción, electroforesis, transferencia, hibridación específica con una sonda y detección
de la secuencia de interés.

CAPÍTULO 15 • Técnicas de hibridación 141

te, el ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce
extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos varios nucleótidos marcados en el extremo 3’ de la sonda).
celulares, células de líquido amniótico, vellosidades corióni-
cas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedi-
se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se miento de nick traslation (figura 15-2). En este método se
separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo combinan dos actividades enzimáticas:
con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles
de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar 1. Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar
son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, de una de las dos cadenas de la sonda.
como ya se mencionó, las muestras se someten a un campo
eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga nega- 2. Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco
tiva (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dejado en la cadena deADN por la ADNsa 1, va incor-
dirección hacia el electrodo positivo, y los fragmentos más porando nuevos nucleótidos por complementariedad
pequeños migran más rápidamente. (entre los que están marcados), tomando como molde la
otra cadena de ADN intacta.
Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse
mediante su tinción con bromuro de etidio. En este momen- A G GT C C A TG C T C*
to el procedimiento no es informativo, debido a que el frag- T C C A GG TAC GA A
mento de interés se encuentra inmerso en millones de
fragmentos creados por las enzimas de restricción. Poste- Actividad ADN sal G*
riormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas OH T
sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por
tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se A G T C C A TG C T
transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de T C C A GG TAC GA
nitrocelulosa o de nailon. Existen diferentes métodos para
la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electro- Actividad ADNp
transferencia. Es importante señalar que la finalidad de A G G* C C A T G C T
la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el T C C A GG TAC GA
gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una
membrana. Por último, para identificar uno o más frag- OH
mentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda A G G* T C A T G C T
específica marcada con alguna molécula reportera (por
ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en T C C A GG TAC GA
contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos
lugares en donde la sonda encuentre su secuencia comple-
mentaria se pegará, proceso conocido como hibridación. La
sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante
un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión
de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de
interés. En la figura 15-1 se observa un esquema de cada
uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern
blot.

A G G* T C* C* A T G* C* T

Marcaje de las sondas T C C AG G TAC GA

Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general Figura 15-2. Marcaje de una sonda del ADN por nick trans-
con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). lation. En el primer paso de la reacción la enzima ADNsa 1
Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez produce una pequeña rotura (nick) en una de las cadenas del
marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mien- ADN. A partir de ésta, la ADN polimerasa 1 añade nucleótidos
tras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15 al extremo 3’ OH generados. Dicha enzima tiene, además, ac-
días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las radiactivas tividad de exonucleasa 5’-3’, que libera nucleótidos del 5’ del
detectan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, nick. La eliminación de nucleótidos del extremo 5’ y la adición
entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo de nuevos nucleótidos al extremo 3’ provoca el movimiento del
o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extre- nick a lo largo del ADN (nick translation). La sustitución de uno
mo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que o más de los nucleótidos que van a ser incorporados de nuevo
introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5’ de por nucleótidos marcados radiactivamente origina la formación
de moléculas marcadas (sondas).

142 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Otro método para marcar sondas es el de random pri- ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su
mers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo,
hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a prácticamente comparten todos los demás pasos, como son
lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima ADN poli- la electroforesis, la desnaturalización (aunque el ARN es de
merasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van cadena sencilla, puede formar estructuras secundarias), la
incorporándose nucleótidos en donde algunos van marca- transferencia y la hibridación con una sonda.
dos radiactivamente hasta que finalmente se completa la
cadena. Aplicaciones

Aplicaciones Es una herramienta muy útil para el estudio de los produc-
tos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación,
La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la
identificar genes asociados con enfermedades de transmi- abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones
sión genética, e identificar mutaciones, como rearreglos, experimentales o comparar condiciones clínicas normales
deleciones y dosis génica en caso de portadores (figura o patológicas.
15-3).
Dot/slot blot
También se utiliza para detectar polimorfismos en los
fragmentos de restricción de diversos genes. Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos,
éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos,
Northern blot según su peso molecular; es decir, no se realiza electrofore-
sis. La fijación se hace generalmente con vacío y en un mol-
Diferencias con Southern blot de cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser
lineal (slot blot) (figura 15-4). Es posible realizar deteccio-
Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico nes no sólo cualitativas (positivo o negativo) sino también
se utiliza ARN en lugar de ADN. A diferencia del Southern cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas
blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción,

Gel de electroforesis teñido

Membrana de hibridación
Normal portador afectado

Kb

20

9
6
4
2

1

Figura 15-3. Southern blot para el diagnóstico de anemia falciforme. El esquema de la izquierda representa el ADN digerido con
enzimas de restricción, separado por electroforesis y teñido con bromuro de etidio. Al extremo del gel, se observa un marcador de
peso molecular como referencia, expresado en kilobases (Kb). El esquema de la derecha muestra el resultado de la hibridación,
donde se observan las bandas que son reconocidas por la sonda. En este caso el diagnóstico fue dirigido hacia una hemoglo-
binopatía (anemia falciforme), una enfermedad autosómica recesiva. Por el método de Southern blot se observa claramente la
dotación génica en caso de sujetos portadores y afectados por la enfermedad.

A) Dot blot B) Slot blot CAPÍTULO 15 • Técnicas de hibridación 143

Laboratorio de Genética - INEN

dots slots

HER-2/neu CEP 17

Figura 15-4. Esquema de la visualización del dot blot y slot blot. Figura 15-5. Técnica de FISH. Identificación del gen HER2/NEU
El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de fijación en cáncer de mama por la técnica de FISH. El gen HER2/NEU
de los ácidos nucleicos en una membrana o filtro es lo que se encuentra localizado en el cromosoma 17q, y su amplifica-
determina la forma en que se visualiza esta técnica molecular. ción está presente en 25 a 30% de las neoplasias de mama;
A) Soporte que se utiliza para realizar un dot blot, donde los se relaciona estrechamente con los estadios avanzados, metas-
orificios están en forma de puntos. B) Soporte que se utiliza tásicos, que implican mal pronóstico. En la actualidad existe
para realizar un slot blot, donde los orificios se encuentran en un tratamiento con anticuerpos monoclonales humanizados
forma de líneas. dirigidos específicamente contra el producto del gen HER2/
NEU que mejora el pronóstico y la sobrevida del paciente.
de concentraciones conocidas del genoma que se está
determinando. fología del tejido y permitir una accesibilidad suficiente
para que la sonda penetre. La fijación con formalina, segui-
Hibridación in situ da de una inclusión con parafina es el procedimiento más
usado. Después de la fijación las secciones de tejido deben
Es un método histoquímico que emplea a la biología mo- adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante
lecular de la misma manera que la inmunohistoquímica uti- el procedimiento de hibridación. Normalmente se utiliza
liza los métodos de la inmunología. Los principios de ambos gelatina crómica, polilisina o Vectabond® (producto comer-
métodos son semejantes y el resultado final es el mismo: la cial). Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con
identificación de componentes tisulares que pueden obser- HCl (que extrae proteínas e hidroliza parcialmente las
varse al microscopio. La especificidad de la inmunohisto- secuencias diana) y proteinasa K (que incrementa la penetra-
química se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras ción y la accesibilidad de la sonda) y se someten a una pos-
que la especificidad de la hibridación in situ se basa en la fijación con paraformaldehído (incrementa la especificidad
unión de una sonda con una secuencia complementaria de de la señal). El procedimiento es muy complejo, por lo que
ADN o ARN dentro de un tejido. A diferencia de Southern únicamente se han mencionado algunos de los aspectos
blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la más relevantes.
extracción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido
se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; Aplicaciones
de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas
que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiac- La hibridación in situ tiene un alto grado de resolución, que
tivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes permite la localización de secuencias génicas a nivel cro-
son las marcadas con fluorescencia, modalidad conocida mosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y
como hibridación in situ acoplada a un sistema de fluoro- otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de
cromos (FISH) (figura 15-5), o con biotina, ya que el detalle expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular. Las
morfológico no se pierde, a diferencia de lo que ocurre con principales aplicaciones son la identificación de infecciones
las modalidades radiactivas. virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico.

Aspectos técnicos

El primer paso para la hibridación es la preparación y fija-
ción del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos
nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la mor-

144 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Ejercicios de integración 4. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una son-
da en el ARNm del virus del papiloma humano en pa-
1. Consulte la secuencia número del ARNm de NFkB cientes con sospecha de presentar la infección. ¿Puede
(NM_001077494.1) del banco de genes (http://www. identificar cuáles individuos están infectados?
ncbi.nlm.nih.gov). Según la información allí reportada,
responda lo siguiente: D
¿En qué posición del ARNm se unen las siguientes son-
das? 12 3 4 5
a) 5’agctctgctggatcggcatggag3’
b) 5’acgcggacccgcgggcgtctaaaatt 3’ 5. ¿Cuál frase es correcta para describir la hibridación in
situ?
¿En qué exón se localizan estas secuencias? a) La técnica permite localizar un segmento concreto de
¿Cuál es la secuencia complementaria de cada sonda? ADN en una posición determinada de un cromosoma
Según lo mencionado en este capítulo, ¿cuál técnica de eucariótico.
hibridación es la más adecuada para detectar el ARNm? b) Si el marcaje es de tipo quimioluminiscente la técnica
se denomina FISH.
2. ¿Cuál de los siguientes enunciados es verdadero para la c) Consiste en detectar determinados ARNm marcados
técnica Southern blot? con fluorescencia, utilizando sondas de ADN marca-
a) Se extrae ARN celular, separado por electroforesis y das procedentes del cromosoma deseado.
transferido a una membrana, se hibrida con una son-
da marcada específica para un gen.
b) Se extrae ADN, se digiere con enzimas de restricción,
los fragmentos generados son marcados con radiacti-
vidad, se separan por electroforesis y se transfieren a
una membrana, donde hibridan con una sonda mar-
cada específica para un gen.
c) Se utilizan fragmentos de ADN cortados con enzimas
de restricción, que se separan por electroforesis y se
transfieren a una membrana, donde se hibridan con
una sonda marcada específica para un gen.

3. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una son-
da en el ADN digerido con enzimas de restricción de los
miembros de una familia con alteraciones en el gen de
distrofina. ¿Puede identificar cuáles individuos presentan
el gen alterado?

1 2 3 4 56

Bibliografía

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Peters PM. Biotechnology: A guide to genetic engineering, 1ª ed.
Dubuque: William C. Brown Publishers, 1993.

Capítulo 16

Reacción en cadena
de la polimerasa

Ana Soledad Sandoval Rodríguez / Jorge Fernando Floresvillar Mosqueda
Alejandra Meza Ríos

Introducción polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta
de la ADN polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP) para la
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera síntesis del producto de PCR y oligonucleótidos o primers.
una de las técnicas más sensibles y específicas de las prue- La función de cada uno de estos elementos en la reacción se
bas moleculares. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary describe a continuación y se enlistan en la figura 16-1.
Mullis, en los laboratorios de CETUR Corporation, en Esta-
dos Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel ADN polimerasa
en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener
un gran número de copias de fragmentos específicos de En la actualidad, la Taq ADN polimerasa es la enzima más
ADN de manera rápida y económica, los cuales no podían empleada para la PCR; tiene como función polimerizar una
obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta téc- nueva cadena de ADN tomando como molde otra ya exis-
nica se basa en una replicación exponencial in vitro de una tente. Debido a que en cada ciclo de la PCR se lleva la mezcla
molécula de ADN genómico (ADNg) o ADN complemen- de reacción a temperaturas de 95°C, se requiere de una ADN
tario (ADNc), mediante ciclos repetitivos, que constan de polimerasa capaz de soportar dichas temperaturas. Ante-
tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas riormente, esta necesidad se suplía con la adición de E. coli
se duplican hasta que los reactivos se agotan. en cada ciclo de la ADN polimerasa, que se inactivaba con la
temperatura de 95°C, por lo que debía suplementarse de
La longitud del producto amplificado la delimitan los nuevo después de cada paso de desnaturalización (95°C). Sin
iniciadores, también llamados primers u oligonucleótidos, embargo, el descubrimiento de bacterias habitantes de los
de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los géiser, que viven a temperaturas alrededor del punto de ebu-
iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras llición del agua, permitió el aislamiento de la Taq polimerasa
secundarias entre ellos ni hibridaciones inespecíficas entre de la bacteria Thermophilus aquaticus. Con ello, la técnica
ellos u otra parte de la cadena. pudo hacerse más eficiente, pues dicha enzima soporta los
95°C, y la cantidad inicial de enzima añadida a la reacción es
Características de la amplificación in vitro suficiente como para suplementar los 25 a 40 ciclos de ampli-
ficación. La concentración de Taq polimerasa que se reco-
y requerimientos necesarios para la PCR mienda es de 1 a 2.5 U/reacción de PCR, y su tasa de error en
la incorporación de bases es de 4 × 10-4. Esta enzima es capaz
La amplificación in vitro de la PCR se apega a las mismas de polimerizar un promedio de 1000 nt/minuto.
reglas de la replicación; esto es, se basa en una secuencia
que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la ADN molde
cadena antiparalela. También, la síntesis de la cadena sigue
la dirección 5’-3’, ya que requiere de un nucleótido con el Para la PCR teóricamente se requiere de una sola molécula,
extremo 3’ libre que proporcione el grupo OH para la adi- cuya secuencia sirva de molde para la amplificación, ya sea
ción del siguiente nucleótido, con lo que se forma el enlace de ADN o de ADNg. El ADN se puede obtener de cualquier
fosfodiéster. muestra biológica, y la mayoría de las técnicas de extracción
de ácidos nucleicos proveen de moléculas de calidad adecua-
Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena
de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima ADN

145

146 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

COMPONENTES PARA UNA REACCIÓN DE PCR menores de 50 μM se consideran insuficientes para una sín-
tesis adecuada.
Molde
ADNds o ADNc Amortiguador
Primers u oligonucleótidos
La solución amortiguadora proporciona el pH y concentra-
Enzima ADN polimerasa ciones de sales adecuadas para la correcta función de la
ADN polimerasa. Este buffer maneja un pH de 8.4 y está
O OO base Cofactores (MgCl2) compuesto por Tris-HCl y KCl.
A, T, G,C dNTPs
Cloruro de magnesio
O P O P O P O CH O Termociclador
El magnesio actúa como cofactor de la ADN polimerasa y
O OO H H se suplementa a una concentración de entre 1.0 y 2.5 mM.
H H Esta concentración debe optimizarse de manera experi-
mental para cada PCR, ya que un exceso de magnesio pro-
HH duce una amplificación inespecífica de productos de PCR,
mientras que una baja concentración disminuye la produc-
Figura 16-1. Componentes de la reacción de PCR. Para que se ción del amplificado.
lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere
una cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima Iniciadores
ADN polimerasa, Mn+2 o Mg+2 necesarios como cofactores para
la enzima, dNTPs o desoxinucleótidos y oligonucleótidos para el El diseño adecuado de los iniciadores es la clave del éxito de
inicio de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se someten en una PCR. Estos oligonucleótidos, con secuencia específica,
el termociclador a los ciclos de amplificación. se utilizan para reconocer por complementariedad secuen-
cias blanco en el ADN molde. En la PCR convencional, se
da para realizar la PCR. Si se quiere amplificar ARN, antes de usa un par de iniciadores para delimitar los extremos del
la PCR se requiere realizar una reacción previa: la retro- producto que se desea amplificar. Su función radica en pro-
transcripción, que permite convertir el ARN en ADNc, porcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los
menos lábil que una cadena de ARN (cabe recordar que la nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéster, ya
inestabilidad molecular del ARN es elevada por la presencia que la ADN polimerasa requiere iniciar la síntesis partiendo
del grupo OH en el carbono 2’ de la ribosa). El ADNc puede de un 3’OH preexistente. A partir de ellos, la ADN polime-
manejarse, entonces, con mayor facilidad. Las técnicas rasa inicia la polimerización en dirección 5’-3’. Los iniciado-
actuales empleadas en la PCR permiten realizar la amplifica- res reciben el nombre de sentido y antisentido, según la
ción a partir de 300 ng de ADN genómico, o bien desde 25 a secuencia a la que dan origen. El iniciador sentido es com-
100 ng en el caso de ADNc o ADN proveniente de genes plementario y antiparalelo a la cadena 3’-5’ del ADN molde,
clonados en vectores. Es importante aclarar que en el caso de por lo que la polimerasa, al adicionar nucleótidos en él, ori-
la amplificación de ADNc obtenido por retrotranscripción a gina una cadena sentido (5’-3’). En cambio, el PRIMER
partir de ARN, durante los primeros ciclos de la PCR se rea- antisentido es complementario y antiparalelo a la cadena
liza la síntesis de la cadena complementaria del ADNc, lo 5’-3’, por lo que su polimerización originará la cadena 3’-5’
que permitirá la amplificación de la secuencia como ADN de (figura 16-2). En la PCR la concentración óptima de los ini-
doble cadena (ADNds) en los ciclos posteriores de la PCR. ciadores es de 0.3 a 1 μM/reacción, ya que un exceso favo-
recería la formación de dímeros entre dos primers
Desoxinucleótidos parcialmente complementarios, o bien de estructuras
secundarias por complementariedad parcial de un primer
Para que la polimerasa lleve a cabo su función necesita que con el mismo, como se aprecia en la figura 16-3.
existan desoxinucleótidos (dNTP: dATP, dCTP, dGTP,
dTTP) en la mezcla de reacción para poder sintetizar la Diseño de iniciadores y su papel
nueva hebra del ADN. Los desoxinucleótidos libres, cuando en la especificidad de la PCR
no forman cadenas de ácidos nucleicos, se encuentran en su
forma trifosfatada, estructura molecular necesaria para su Los iniciadores definen el tamaño del fragmento que se ha
estabilidad y para proporcionar el grupo fosfato con el que de amplificar. El tamaño de los productos a amplificar se
se formará el enlace fosfodiéster en la unión nucleótido- encuentra entre 100 y 1000 pb, aunque se recomienda que
nucleótido. Los desoxinucleótidos trifosfatados deben adi- sea entre 200 y 500 pb. En caso de que se desee analizar la
cionarse en una concentración óptima de entre 50 y 200 expresión de un ARN mensajero (ARNm) convertido a
μM, cantidad suficiente para sintetizar de 6.5 a 25 μg de ADNc, los primers se diseñan de tal forma que uno de éstos
ADN. Cantidades mayores de 200 μM pueden producir hibride en una secuencia exónica y el otro oligonucleótido
incorporaciones erróneas, mientras que concentraciones

ADN de interés CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 147

PCR

3’ 95ºC 5’
3’
5’
Desnaturalización 5’

3’

5’ 50ºC 3’

Alineación de primers 5’ 5’
3’ Primer

Primer 3’
sentido antisentido

5’ 3’

5’ 3’
Extensión
72ºC

Figura 16-2. Esquema convencional de un PCR. Los ciclos del PCR constan de los pasos de desnaturalización, alineación y exten-
sión. Estos pasos se realizan mediante el cambio automático de temperaturas en un termociclador. La temperatura de desnatura-
lización permite el rompimiento de los puentes de hidrógeno entre las cadenas del ADN, mientras la temperatura de alineamiento
proporciona las condiciones cinéticas favorables para la unión de los iniciadores con su secuencia complementaria. En la tempe-
ratura de extensión la enzima polimeriza los dNTPs y forma la cadena complementaria basándose en el molde al cual hibridó el
primer correspondiente.

a) Estructura secundaria en 3’ lo haga en otra secuencia exónica; de esta manera, la ampli-
ficación del producto del tamaño esperado asegura que sólo
5’ T G T A C C G T T C C G T A T G G C C C los ARNm se han amplificado. En caso deque se haya ampli-
ficado también una secuencia de ADNg, (proveniente de
G contaminación de la muestra de ARN con ADN durante el
3’ A A G G C A T A C C G G A proceso de extracción), el producto será de un tamaño dife-
rente, ya que tiene secuencias intrónicas de por medio,
Iniciadores de PCR como se aprecia en la figura 16-4.
no adecuados
La secuencia de los iniciadores debe ser altamente espe-
b) Complementariedad de bases cífica para el gen de interés, y procurar un contenido de
nucleótidos G-C de 40 a 60% y una longitud óptima entre los
5’ T G T A C C G T T C C G T A T G G C C C 3’ 18 y los 30 nt. También debe evitarse un diseño que permita
la complementariedad o la formación de estructuras secun-
3’ C A A G G C A T A C C G G G A T C G A T T 5’ darias inter e intra-primers, sobre todo cuando estas estruc-
turas secuestran el extremo 3’, indispensable para la adición
Figura 16-3. Posible secuestro del extremo 3’ en los iniciadores de nucleótidos como se ejemplificó en la figura 16-3.
de PCR. a) Estructura secundaria en 3’: generada por comple-
mentariedad intrainiciador, generando una estructura plegada La secuencia y la longitud de los iniciadores es determi-
de doble cadena que interfiere con el correcto alineamiento nante para su temperatura de fusión (Tm), la cual se define
del iniciador. b) Complementariedad de bases: producida por como aquélla a la que el 50% de los iniciadores se encuentra
complementariedad interiniciadores, generando dímeros que en estructura de cadena lineal. Se procura un diseño tal que
afectan la disponibilidad de los mismos en el PCR.

148 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Exón 2 Intrón Exón 3

5’ 3’
3’
Exón 2 Intrón Exón 3 5’
Primer antisentido
5’ Corte y Empalme
3’ 3’

Primer sentido 5’ Exón 2 Exón 3

5’ Primer antisentido

3’

MOLDE ADNg 3’ 5’

Primer sentido
MOLDE ADNc

MPM ADNg ADNc

Exón 2 Exón 3

1000 pb Exón 2 Exón 3
500 pb

300 pb

100 pb

Figura 16-4. Diseño de iniciadores para la discriminación de ARNm y ADNg. Los iniciadores definen el tamaño del fragmento que se
ha de amplificar, por lo que si éstos se diseñan para que hibriden en dos exones diferentes, el tamaño que genere el producto de
amplificación será mayor cuando el molde sea la molécula de ADNg que contiene la secuencia interexónica, es decir un intrón.
Cuando el molde de la reacción de PCR sea el ARNm (ADNc correspondiente), el amplicón será de menor longitud por carecer
de la secuencia intrónica.

la Tm de ambos primers sea muy similar y no presente más misma secuencia blanco o bien en otras secuencias, emplean-
de 5ºC de diferencia con la Tm del producto que se va a do el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool,
amplificar, lo cual garantiza temperaturas de alineamiento http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Este software coteja
similares para ambos primers y una eficiencia de amplifica- una posible hibridación, total o parcial, con alguna secuencia
ción adecuada. La Tm aumenta según la longitud del inicia- reportada en el Gene Bank que pudiera interferir con la
dor, por lo que un iniciador por debajo de las 18 nt hibridaría especificidad de los primers y su empleo correcto. En caso de
de forma inespecífica en la cadena molde y originaría pro- hibridación con otras secuencias (ARNm o génicas) reporta-
ductos inespecíficos. Por otro lado, iniciadores muy largos das en el banco de genes su diseño debe replantearse.
requieren de Tm superiores a 65°C; por esto, la longitud
óptima está entre los 20 y 30 nucleótidos para que se obtenga Esquema de la PCR
una Tm entre 55 y 65°C, compatible con la amplificación de
la generalidad de los fragmentos. Existen muchos métodos En la figura 16-2 se presenta el esquema convencional de
para calcular la Tm de los iniciadores, pero todos toman en una PCR, que incluye los siguientes pasos:
consideración el contenido de nucleótidos, sobre todo G y C,
la longitud del primer y la concentración de Na+ en el tubo 1. Inicio de la desnaturalización.
de la PCR. En la actualidad, muchos programas computacio- 2. Ciclos de amplificación.
nales permiten el diseño semiautomatizado de los primers,
tomando en cuenta los parámetros mencionados. Algunos • Temperatura de desnaturalización.
de los programas utilizados son Oligo 6.0, Primer Express®, • Temperatura de alineamiento.
Primer Desing®, etc. Una vez diseñados, los oligonucleóti- • Temperatura de extensión.
dos deben verificarse contra alineaciones inespecíficas en la 3. Amplificación final.
4. Almacenamiento temporal.

CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 149

Estos pasos se llevan a cabo mediante el cambio auto- es, se genera la energía cinética necesaria para que los inicia-
mático de temperaturas en un equipo diseñado para este fin dores busquen en las cadenas de ADN su secuencia comple-
denominado termociclador. mentaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena
molde, dejando el extremo 3’OH disponible y listo para la adi-
Termociclador ción de los nucleótidos consecutivos por la ADN polimerasa.

Es el equipo en el cual se realiza la PCR. Es capaz de cam- Extensión
biar la temperatura de la muestra en cuestión de segundos,
lo que por lo general se logra mediante calentamiento/ Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento
enfriamiento por resistencia eléctrica de una placa metáli- de la ADN polimerasa empleada, por lo que dependerá ésta
ca, que distribuye la temperatura de manera homogénea para la PCR. En el caso de la Taq polimerasa, la más utiliza-
durante tiempos programados en el rango de segundos a da es de 72°C.
minutos. Normalmente los rangos de temperatura que
abarca el equipo van de 4 a 96°C. Dado que las PCR que se Amplificación final
incuban son soluciones acuosas, los equipos cuentan con
una placa metálica a manera de tapa, la cual se mantiene a Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la
103°C para evitar la condensación del agua en las tapas de temperatura de extensión (72°C) se mantiene por cinco
los tubos donde ocurre la reacción. De esta manera, se evita minutos, lo que permite que la polimerasa termine la exten-
que la concentración de los solutos se modifique, lo que sión de los productos a los cuales se encuentra unida.
alteraría las condiciones óptimas para la ADN polimerasa y
la termodinámica de hibridación de los primers. Para el Almacenamiento temporal
enfriamiento se generan flujos de aire frío, lo que permite
descensos de temperatura relativamente rápidos. Durante la programación de los ciclos de la PCR se progra-
ma también un ciclo final de 4°C por varias horas, lo que
Inicio de la desnaturalización permite conservar los productos de PCR hasta que se reti-
ren los tubos de reacción del equipo.
Es necesaria una temperatura de 95°C para la desnaturaliza-
ción de la doble cadena de ADN, en el caso del ADN genó- Cantidad del producto de PCR:
mico, o el rompimiento de estructuras secundarias, en el número de copias por cada ciclo
ADNc. Esta temperatura se mantiene por cinco minutos al según la expresión p = (2)nT
inicio de la PCR.
Teóricamente, en cada uno de los ciclos de amplificación se
Ciclos de amplificación duplica la cantidad de producto inicial. Así, el producto
de PCR aumenta exponencialmente conforme al número de
Un ciclo típico de PCR convencional consta de las tres tem- ciclos de PCR (n). Sin embargo, el producto de PCR depen-
peraturas siguientes: de del número inicial de copias del molde de ADN (T), por
lo que se aplica la fórmula que indica que si se parte del
• 95°C: desnaturalización por unos 30 segundos. doble de moléculas iniciales de ADN se obtendrá el doble
• 55 a 60°C: alineación por 30 a 40 segundos. de producto:
• 72°C extensión, según la longitud del producto que se va
P = (2)nT
a amplificar, considerando la adición de 1 000 nucleóti-
dos en 60 segundos. donde:

Este ciclaje de temperatura se repite continuamente por P = número de moléculas producto de PCR;
30 a 35 ocasiones. Cada temperatura cumple con una fun- n = número de ciclos;
ción específica. T = número de copias inicial de la molécula molde.

Desnaturalización Por ejemplo, una PCR de 25 ciclos, partiendo de 10
copias de ADN molde, producirá la cantidad de P = (2)25 × 10;
Se realiza a 95°C y tiene como objetivo desnaturalizar la o sea, 2250, o lo que es lo mismo, 1.8 × 1075 moléculas.
doble cadena de ADN y/o destruir las estructuras secunda-
rias del ADN, lo que permite el acceso de los primers a la En la figura 16-5 se presenta un esquema de esta ampli-
cadena molde en sus secuencias complementarias. Esta ficación exponencial.
temperatura se mantiene por 30 segundos.
Sensibilidad de la técnica de PCR
Alineación
La PCR es una técnica altamente sensible y específica, al
En esta fase, la temperatura se encuentra en un rango entre 55 alcance de la mayoría de los laboratorios de biología molecu-
y 60°C, en el cual la mayoría de los iniciadores hibridan; esto lar. Bajo las condiciones y diseño de oligonucleótidos apro-

150 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Amplificación exponencial 2n

ADN molde Tercer ciclo - 24 16 copias
Cuarto ciclo - 25 32 copias
Primer ciclo - 22 4 copias
Segundo ciclo - 23 8 copias P = 2nT= 230 - 1 073 741 824 copias

Figura 16-5. Amplificación exponencial del producto de PCR. La amplificación del producto de PCR sigue la fórmula P = (2)nT,
donde: P = número de moléculas producto del PCR; n = número de ciclos; T = número de copias inicial de la molécula molde. En
cada ciclo se duplica la cantidad de producto inicial, por lo que el número de moléculas producto del PCR aumenta exponencial-
mente conforme avance la reacción.

piados se puede obtener una sensibilidad y una especificidad (ver el capítulo 12 Electroforesis). La intensidad de la ban-
de 100%. Sin embargo, en experimentación es dif ícil obtener da se considera proporcional a la cantidad de producto
estos resultados, ya que múltiples factores influyen de mane- amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un
ra crucial en el desarrollo de una PCR, como la selección de marcador de peso molecular comercial de longitudes cono-
un sistema adecuado de detección del producto amplificado, cidas como se aprecia en la figura 16-6. El análisis de imagen
el diseño correcto de primers y sondas, la calidad de la mues- de la banda del producto de PCR permite medir su intensi-
tra que se va a amplificar, el control de los inhibidores de la dad mediante software y realizar una medición semicuanti-
reacción, la contaminación ambiental, la contaminación con tativa de las bandas de los productos de PCR obtenidos en
otros productos de PCR, la optimización de las condiciones diversas muestras. La semicuantificación puede ser respecto
de reacción, la concentración de reactivos, el termociclador a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como se
empleado, etc. El control y el manejo correcto de cada uno observa en la figura 16-7A, en la que el carril 3 muestra una
de estos factores influirán en la calidad de la PCR. Esta sen- banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero
sibilidad es su principal característica y desventaja: una PCR la mitad de intensa que la banda de la muestra 2. O bien una
puede proporcionar un diagnóstico temprano, pues tan sólo semicuantificación de las muestras respecto a un gen cons-
con pocas copias del genoma de un patógeno puede deter- titutivo, como se observa en la figura 16-7B. Para este tipo de
minarse su presencia. Sin embargo, esta misma característi- análisis se mide la intensidad relativa de la banda del produc-
ca hace que la realización de una PCR sea una tarea para el to de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo. Se
especialista y que siempre deba tenerse cuidado de evitar un considera un gen constitutivo aquel que tiene una expresión
acarreamiento de material que pueda contaminar la reac- constante, ya que es indispensable para la viabilidad de la
ción y producir falsos positivos. célula y esta expresión no se altera por la presencia de alguna
enfermedad o variaciones en la condición fisiológica, no
Modalidades de la técnica de PCR varía entre los individuos ni durante el desarrollo (edad) y
no se ve afectado por las condiciones del experimento.
Esta técnica ha evolucionado desde su invención. En la GAPDH (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa), HPRT
actualidad, gracias a los múltiples sistemas de detección, a (hipoxanthine guanine phosphoribosyltransferase), β-actina
variantes en los iniciadores y a la cantidad de pares de pri- (beta-actina) y ARNr 18S (ARN ribosomal 18S) son los
mers empleada se dispone de diversas variantes de la técni- genes constitutivos más empleados para este tipo de análisis
ca, que se enlistan a continuación:
Con el valor de intensidad relativa de los genes, los
PCR convencional datos se normalizan respecto al gen constituido y se calcula
un índice:
Se basa en la detección del producto de amplificación
mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida. Intensidad relativa del gen de interés
El producto amplificado se visualiza mediante una banda intensidad relativa del gen constitutivo

Ya que la expresión del gen constitutivo permanecerá
relativamente constante, esta relación indica directamente

CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 151

12 3

Preparar agarosa o BATTERY Pipetear muestras
acrilamida y marcador de PM
Agregar gel a la
(negativo) cámara y buffer de
4
corrimiento

5

muestra M PM pb

Marcador de PM 12,000
Afluente de energía 5,000

2,000
1,650

1,000
850
650
500
400
300 300

200
100

(positivo) Comparar bandas de muestras
Corrimiento vs marcador PM

Figura 16-6. Visualización del producto de PCR mediante electroforesis en gel. La detección del producto de amplificación mediante
una electroforesis en gel de agarosa se observa como una banda. La intensidad de la banda se considera proporcional a la canti-
dad de producto amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un marcador de peso molecular comercial de longitudes
conocidas. En este gel el carril marcado MPM corresponde al marcador de peso molecular de 1 Kb plus ADN ladder; los valores
correspondientes a las bandas se observan en la columna pb (pares de bases). La muestra corresponde a un producto de aproxi-
madamente 300 pb, como se puede apreciar en el carril de muestra.

A) MPM C1 C2 C3 MPM C1 C2 C3Gen de interés
1000 pb B)

500 pb 1000 pb
300 pb
500 pb
100 pb
300 pb

1 URA Muestra C1: 1/1.2 = 0.83
6 URA Muestra C2: 6/1.1 = 5.45
3 URA Muestra C2: 3/095 = 3.15
100 pb
1 URA MPM C1 C2 C3
6 URA
3 URA

Muestra C2: 6 veces más que la muestra C1 Gen constructivo 1000 pb
Muestra C3: 3 veces más que la muestra C1 500 pb
300 pb

1.2 URA
1.1 URA
0-95 URA
100 pb

Figura 16-7. Análisis de imagen de la banda del producto de PCR. La intensidad de la banda del producto de PCR se mide mediante
un software. A) Análisis semicuantitativo respecto a una muestra, en el cual las bandas de los productos de PCR obtenidos de
varias muestras se comparan respecto a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como en la imagen donde el carril 3
muestra una banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero la mitad de intensa que la banda de la muestra del
carril 2. B) Semicuantificación respecto a un gen constitutivo; es aquella en la cual se mide la intensidad relativa de la banda
del producto de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo para cada una de las muestras, se determina la relación gen de
interés/gen constitutivo para cada muestra, y dicha relación se compara entre muestras indicando cuál de ellas expresa más o
menos el gen de interés normalizado contra el gen constitutivo.

152 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

la variación entre muestras del gen de interés. Esta forma de lizar una relación entre la expresión del gen de interés con
semicuantificación es también posible realizarla con la tec- la expresión del gen constitutivo el índice que se obtenga
nología de detección en tiempo real empleando los métodos indicará la expresión real del gen de interés y se reporta
2ΔΔCt, o el método 2ΔCt, que se describen más adelante. como porcentaje de expresión. Esto permite su compara-
ción con otras muestras analizadas de la misma manera.
PCR cualitativa
PCR cuantitativa
Esta modalidad de PCR permite detectar la presencia o
ausencia de un fragmento de ADN determinado. Es decir, En esta modalidad de PCR, el producto de PCR es cuantifi-
sólo reporta si una muestra es positiva o negativa ante la cable, lo que permite reportar en números absolutos la can-
presencia de un determinado ADN. Se emplea para el diag- tidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una
nóstico de enfermedades infecciosas y sólo permite confir- muestra. Para la cuantificación absoluta se amplifica al mis-
mar la presencia o ausencia de un determinado agente mo tiempo una curva con muestras de concentración cono-
patógeno, esto es, si una persona está o no infectada. cida del ADN que se quiere analizar. Los resultados de las
muestras se traslapan a los valores de la curva y de esta
PCR semicuantitativa manera se conoce la concentración de la muestra.

Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) PCR múltiple (varias regiones o varios genes)
en particular, y normaliza los niveles encontrados de este
gen con los encontrados en un gen de expresión constituti- En este tipo de PCR se realiza la amplificación de más de un
va, que se expresa de manera constante en la célula. Al rea- fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o

ADN de interés

3’ a) Alineación del primer juego de primers 5’
5’ 3’

3’ 5’
Primer Primer
sentido antisentido

5’ 3’

b) Alineación del segundo juego de primers

3’ 5’

Primer sentido

Primer antisentido

5’ 3’

Figura 16-8. PCR anidada. Esta variante de la PCR es más sensible porque amplifica el ADN en dos rondas de amplificación con
distintos pares de iniciadores en cada una. a) La primera reacción de PCR se realiza con un par de iniciadores que amplifiquen
una región de ADN extensa. b) Una segunda PCR se realiza con el producto de amplificación de la primera PCR como molécula
molde con otro par de iniciadores anidados. El producto de amplificación de la PCR anidada será por tanto de longitud más corta
que el primer producto de PCR.

CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 153

más juegos de primers (cada juego para un gen en particu- PCR en punto final
lar). Tiene la ventaja de que ahorra tiempo y reactivos, pero
presenta el inconveniente de que el diseño de los primers Es aquella en la que el producto de PCR se analiza después de
debe ser adecuado para que no se complementen entre 25 a 35 ciclos en el punto previo a la saturación de la reacción,
ellos (hibridaciones inespecíficas). La PCR múltiple o mul- mediante un gel de electroforesis. Presenta el inconveniente
tiplex puede emplearse para la búsqueda de varias delecio- de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a una
nes, mutaciones y polimorfismos en un solo gen o en cantidad diferente de producto al final, además de que dife-
múltiples. Esta técnica se utiliza para el análisis simultáneo rente cantidad de material de inicio da lugar a la misma can-
de múltiples marcadores moleculares asociados a alguna tidad de producto al final, de la reacción. La detección en
enfermedad, para la detección simultánea de varios agentes punto final también presenta las desventajas de que depende
patógenos, organismos genéticamente modificados, etcé- de la resolución del gel de agarosa, que suele ser baja y no
tera. permite detectar pequeños cambios en la concentración;
requiere un procesamiento posreacción, y la tinción de bro-
PCR selectiva (detecta genes muro de etidio es semicuantitativa, pues más de una molécu-
silvestres o mutados) la de bromuro de etidio puede unirse a un solo producto de
PCR y, por tanto, tiene una precisión pobre y presenta una
Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibri- sensibilidad menor que la PCR en tiempo real.
dar solamente en secuencias con presencia de una muta-
ción, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un PCR en tiempo real
producto de PCR. Como control se produce una PCR con
primers diseñados para la amplificación de la forma silves- Las desventajas que presenta la PCR en punto final llevaron
tre del gen, cuyos resultados deben coincidir con los obteni- a los investigadosres a diseñar una tecnología que solventa-
dos con los primers que amplifican la mutación. En caso de ra estos inconvenientes conocida como PCR en tiempo real.
homocigatos sólo una de las dos reacciones debe resultar La reacción de amplificación es la misma, lo que cambia es
positiva, en el caso de heterocigenos ambas reacciones el método de detección del producto amplificado y su tem-
resultan positivas. poralidad. La detección de las copias del producto de PCR
se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación,
PCR in situ mediante intercalados en el producto de PCR, un láser que
detecta fluorocromos acoplados a los primers o a una sonda
Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafina que hibrida en medio de los primers, que se degrada y libera
(laminilla) o congelada y cortada en criostato. No requiere su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’ de la poli-
extracción del ADN del tejido. En la laminilla se añaden los merasa. Mediante la detección de la fluorescencia liberada
reactivos necesarios para la PCR y se colocan en un termo- durante la reacción de amplificación puede medirse la can-
ciclador especial, ya que en lugar de tener orificios para tidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emi-
colocar tubos contiene ranuras para colocar las laminillas. sión de fluorescencia producida en la reacción es
Esta modalidad de PCR permite saber qué tipo celular pre- proporcional a la cantidad de producto de PCR formado.
sente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula Esto permite conocer y registrar en todo momento la ciné-
está infectada por un patógeno. tica de la reacción de amplificación.

PCR anidada (nested-PCR) Cabe mencionar que para la técnica de PCR en tiempo
real la temperatura de alineación y extensión es la misma,
Esta variante de la PCR convencional proporciona mayor por lo que ambos pasos se unifican. Esto se logra porque la
sensibilidad a la técnica, al amplificar las secuencias de temperatura óptima para la enzima AmpliTaq Gold® es de
ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de 60ºC, lo que aunado a un diseño de primers que permite su
iniciadores o primers en cada una. Esto es, primero se reali- alineación óptima a la misma temperatura permite que este
za una PCR con un par de iniciadores externos para ampli- paso sea conjuntado y reduce el tiempo de reacción.
ficar una región de ADN extensa, que contiene el segmento
diana que se desea amplificar. Después, este producto de Los sistemas de detección por fluorescencia empleados
amplificación sirve de molde para una segunda PCR con en la PCR en tiempo real pueden ser iniciadores marcados
otro par de iniciadores internos (primers anidados) para por fluoróforos (primers LUX —light uponextension fluoro-
amplificar una región más pequeña (interna). Por lo tanto, genic—), sondas específicas marcadas con fluorócromos
la longitud del producto de amplificación de la segunda (sondas TaqMan) o bien agentes intercalantes fluorescen-
PCR, o PCR anidada, será menor que la del primer produc- tes, como SyberGreen o SyberSafe.
to de PCR (figura 16-8).
PCR en tiempo real empleando SyberGreen

Para la detección en tiempo real, puede emplearse un agen-
te intercalante denominado SYBERreen. En este método,

154 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

SyberGreen método consiste en la transferencia de energía fluorescente
mediante resonancia entre dos moléculas. Estas moléculas
SyberGreen sin fluorescencia son dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor, y
SyberGreen con fluorescencia su principio se basa en que una molécula de alta energía
cercana a otra de baja energía (quencher) promueve una
Figura 16-9. PCR en tiempo real con SyberGreen. La detección en transferencia energética sin emisión de fluorescencia. Una
tiempo real con SYBERGreen se basa en que esta molécula es vez que se separan dichas moléculas se emite la fluorescen-
un agente intercalante en la doble cadena de ADN que se une cia, que capta el lector del equipo . Las sondas TaqMan son
de manera inespecífica, produciendo fluorescencia. Al unirse a cortas y para separar las dos moléculas fluorescentes nece-
toda molécula de ADN de doble cadena se puede unir también sitan la rotura de su estructura por la ADN polimerasa con
a dímeros de primers, por lo que es poco específico, pero debi- actividad endonucleasa y así liberar la fluorescencia. En esta
do a su menor costo es ampliamente utilizado. tecnología se emplea la ADN polimerasa (AmpliTaq Gold®),
que se mantiene inactiva por la unión de un anticuerpo y se
muy utilizado por su bajo costo, el fluoróforo se une al ADN libera cuando la reacción se incuba a los 95°C iniciales de
de doble cadena de manera inespecífica y produce fluores- desnaturalización. Los dNTP empleados contienen dUTP
cencia (figura 16-9). La desventaja estriba en que la unión, en lugar de dTTP, por lo que los productos de PCR contie-
al ser inespecífica, será a lo largo de toda la molécula de nen dUTP. La mezcla de reacción contiene uracil-N-glico-
ADN de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer silasa (UNG) (AmpErase®). La enzima UNG degradados
que pudieran formarse. El uso de SYBERGreen implica un productos de PCR de reacciones previas, previniendo la
diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar la contaminación de la reacción de PCR actual con ADN
formación de dímeros. La detección del producto amplifi- endógenos. Ya que durante los ciclos normales de PCR las
cado corresponderá a la intensidad de la fluorescencia; sin altas temperaturas inactivan la UNG, sólo los ADN presen-
embargo, ya que varias moléculas de SYBERGreen pueden tes en la muestra servirán de molde para ser amplificados.
unirse a una sola molécula de ADNds, se considera un Asimismo, el fluorocromo ROX (conjugado de glicina de
método de cuantificación menos preciso que las tecnolo- 5-carboxi-X-rodamina, succinimidiléster) se incluye como
gías con primers LUX o sondas TaqMan. referencia pasiva a una concentración final de 500 nM para
normalizar la fluorescencia entre reacciones por cualquier
PCR en tiempo real con sondas TaqMan posible fluctuación asociada con variación en el volumen.
El empleo de este tipo de sondas se esquematiza en la figura
En esta tecnología (de Applied Biosystems), la reacción de 16-10.
amplificación se lleva a cabo en un termociclador que reali-
za, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz PCR en tiempo real con primers LUX
láser. En esta tecnología, además de un juego de primers se
utiliza una sonda marcada con fluorescencia. La sonda Taq- La PCR con primers LUX se fundamenta en que uno de los
Man® empleada se diseña de manera que hibrida en algún iniciadores se encuentra marcado con un fluoróforo; cuan-
punto intermedio de la secuencia franqueada por el primer do el iniciador hibrida con la cadena blanco, el fluoróforo es
sentido y el antisentido. Estos primers están diseñados para excitado, lo que da como resultado un incremento significa-
amplificar fragmentos de entre 60 y 150 pb. La sonda tiene tivo de la señal de fluorescencia que el láser detecta. Para la
acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por amplificación con primers LUX se emplea una enzima Taq-
otro fluorocromo o quencher (referencia pasiva). La sonda Platinum® ADN polimerasa que se activa sólo después del
hibrida en la cadena molde del ADN que va a ser amplifica- hot-start inicial de la PCR (5 minutos a 95°C). De la misma
da y libera su fluorocromo sólo cuando la sonda se degrada manera que con la tecnología TaqMan, la mezcla de reac-
por la acción de exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa. ción contiene una UNG para prevención de contaminación
Las sondas TaqMan se basan en el método FRET. Este por acarreamiento. Además, el mix contiene Tris-HCl, KCl,
6 mM de MgCl2, 400 μM de desoxiguanina trifosfato
(dGTP), 400 μM de desoxiadenosina trifosfato (dATP), 400
μM de desoxicitidina trifosfato (dCTP), 800 μM de des-
oxiuridina trifosfato (dUTP), UNG, 1 μM de fluorocromo
ROX y estabilizadores. Su empleo se esquematiza en la figu-
ra 16-11.

Semicuantificación en tiempo

real con el método 2DDCt

En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtie-
ne interpolando todas las muestras en un punto umbral,

CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 155

Sonda Taqman 1 ADN

Primer R sonda 3’ 3’ 3’
5’ 5’ 5’
Alineación y polimerización 3’ 5’
3’
5’
5’
Primer

2 R
Primer

Primer R marcado
sonda
3’

Desplazamiento de hebra y 5’ 5’ 3’ 5’
actividad exonucleasa de la AND 3’ 3’ 3’
5’
polimerasa sobre la sonda 5’ 5’

Primer

Primer

Primer R 3
3’ Primer R
marcado

Escisión de la sonda y liberación 5’ 5’ 3’ 5’
del fluorocromo 3’ 3’ R No fluorescencia 3’
5’
5’ 5’ Primer

Primer R Fluorescencia

Polimerización completa y Primer R 3’ 5’ Figura 16-11. PCR en tiempo real empleando iniciadores LUX. La
emisión de la fluorescencia 5’ Primer 3’ detección del producto amplificado se fundamenta en que uno
3’ 5’ de los iniciadores está marcado con un fluoróforo; cuando el
iniciador hibrida con la cadena blanco y se realiza la polimeri-
5’ zación, el fluoróforo es excitado, resultando en un incremento
de la fluorescencia, lo que es detectado por el láser.

Extintor o Quencher R Reportero fluorescente

Figura 16-10. PCR en tiempo real con sondas Taqman®. Esta absoluta) o con un grupo de referencia (cuantificación rela-
PCR implica el uso de una sonda que hibrida en algún punto tiva). La cuantificación relativa puede utilizarse para deter-
intermedio de la secuencia franqueada por el par de primers minar la expresión de los niveles de ARNm de un grupo de
sentido y antisentido. La sonda tiene acoplado un fluorocromo células o tejidos respecto a una referencia (control o condi-
en su extremo 5’, el cual está silenciado por otro fluorocromo ción experimental). Para la cuantificación relativa debe
llamado extintor o quencher en el extremo 3’ de la sonda. La tenerse en cuenta que todas las muestras provienen de indi-
amplificación de la cadena donde la sonda está unida libera el viduos diferentes; por tanto, debe realizarse un procedi-
fluorocromo sólo cuando la sonda es degradada por la acción miento conocido como normalización, con un gen control
exonucleasa de la ADN polimerasa, lo que asegura que sólo endógeno (constitutivo), para eliminar la variabilidad entre
habrá detección cuando un producto de amplificación haya muestra y muestra. El cálculo se realiza mediante la fórmu-
sido generado. la 2ΔΔCt relativo a un grupo que se considera calibrador.
Donde:
ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT es el ciclo elegi-
do por el usuario de la fase exponencial en donde la canti- ΔCT = CT promedio del grupo de muestras para el gen
dad inicial de moléculas del gen de interés presentes en una de interés – CT promedio del grupo de muestras para el
muestra es inversamente proporcional a la intensidad de gen constitutivo;
fluorescencia. El CT permite discriminar el comportamien- ΔΔCT = ΔCT grupo calibrador – ΔCT grupo de interés.
to de las muestras, ya que a un menor valor de CT existe
mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en Por tanto, después de la normalización de los datos res-
una muestra. El CT lo determina un software a un umbral pecto al gen constitutivo (ΔCT) se selecciona un grupo que
de fluorescencia fijo (threshold) seleccionado por el analis- funciona como calibrador del experimento y los datos del
ta, como se expone en la figura 16-12. Estos valores pueden resto de los grupos se comparan con el grupo calibrador
relacionarse con una curva estándar para determinar la tendrá el valor de 1 y el resto de los grupos, un valor menor
cantidad de moléculas de ADN existentes (cuantificación o mayor lo que proporciona un valor semicuantitativo.

156 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Plateau tras. La curva estándar se construye a partir de concentra-
ciones conocidas de un plásmido que contiene clonado el
Amplificación cADN de la muestra a analizar. Debe asegurarse que la efi-
lineal ciencia de la PCR sea la misma para la muestra y para el
estándar. Las diferentes diluciones de la curva presentarán
Amplificación Threshold CT proporcionales a la cantidad de muestra, y mediante la
éxponencial 35 40 fórmula de regresión lineal (y = mx + b), interpolando los
valores de las muestras en el gráfico obtenido se puede
20 25 30 conocer la concentración absoluta de las muestras.
Cycle
Retrotranscripción como
Threshold
paso previo a la PCR
15 20 Valor de Ct25 30 Valor de Ct 35
Cycle 23.6 32.2 La retrotranscripción es una reacción para la conversión
del ARN en ADNc y en general se lleva a cabo antes de una
Figura 16-12. Gráficas de PCR en tiempo real. La interpretación PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN. La
de datos en la PCR en tiempo real se realiza interpolando todas realización consecutiva de una retrotranscripción y una
las muestras en un ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT PCR se conoce como RT-PCR. Esta técnica es una variante
es aquel ciclo presente en cualquier punto de la fase exponen- de la técnica convencional de PCR, con el objetivo de
cial de amplificación en donde la cantidad inicial de moléculas amplificar un ARN específico para evaluar su expresión o
del gen de interés presentes en una muestra determinada es presencia. Esta técnica es más sensible y rápida que otras
inversamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. técnicas de análisis de la expresión de genes (Northen blot,
El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, Dot blot, Slot blot, ensayos de la nucleasa) y se basa en el
ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial uso de transcriptasa inversa de los retrovirus cuya función
de moléculas del gen de interés en una muestra. El CT es es sintetizar ADN a partir de ARN (figura 16-13).
determinado por un software a un umbral de fluorescencia fijo
“Threshold” seleccionado por el analista. En la reacción de retrotranscripción una cadena de ARN
se transcribe a ADN de secuencia complementaria al ARN,
Semicuantificación en tiempo por lo que se le denomina ADNc. La transcriptasa inversa
real con el método 2∆Ct más empleada es la del M-MLV (Murine-Moloney leukemia
virus). Además del ARN molde, que se convertirá en ADNc,
Este método de semicuantificación para muestras procesa- se requieren primers, generalmente hexámeros formados de
das en tiempo real se realiza cuando no se desea tomar un secuencias aleatorias de 6 nt. Estos hexámeros hibridarán
grupo de muestras como referencia, como cuando la mues- con las secuencias complementarias a ellos, que se localizan
tra se desea comparar frente a ella misma en diferentes con- por azar en todos los ARN presentes en la muestra. Para la
diciones. La fórmula se aplica: reacción se requiere también un inhibidor de ARNsas (RNA-
sin®, RNAseout®), un componente enzimático que impide la
ΔCT = CT promedio de la muestra para el gen constitu- acción de estas enzimas que puedan estar presentes en la
tivo – CT promedio de la muestra para el gen de interés. muestra. Los dNTP (A, G, C, T) se emplearán en la síntesis
de las cadenas de ADNc, mientras que una solución amorti-
PCR cuantitativa mediante guadora proporcionará las condiciones de pH y cofactores
la tecnología en tiempo real necesarios para un funcionamiento óptimo de la retrotrans-
criptasa. A diferencia de lo que sucede en la PCR, en esta
Para una PCR cuantitativa se emplea la metodología en reacción no se requieren ciclos, y basta con una hora a la
temperatura óptima de la enzima para realizar la conversión
tiempo real y una curva con estándares de concentración del ARN a ADNc (para la M-MLV son 37°C). Los pasos de
conocida. Esta curva debe tener en cuenta que el ADN o que consta esta reacción son desnaturalización del ARN a
ARN que se emplee debe estar diluido de manera precisa, y 70°C por 10 minutos para eliminar estructuras secundarias,
en el caso particular de ARN se asume que la eficiencia de alineación de los hexámeros por 10 min a 25°C y polimeriza-
retrotranscripción ha sido la misma para todas las mues- ción por la retrotranscriptasa a 37°C por una hora. Una vez
obtenida la cadena de ADNc, ésta se emplea como molde
para la técnica de PCR. Este método se utiliza principalmen-
te para detectar genomas virales compuestos por ARN (como
la influenza A, el VIH y la hepatitis C), así como para cuanti-
ficar ARNm de cualquier proteína expresada en un tejido.

RT 2 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 157
1 Hexameros
3
ARN
4 Transcriptasa
cADN Reversa

5 6
cADN

cADN

ARN Rnasa

Figura 16-13. Reacción de retrotranscripción. Las moléculas de ARN son retrotranscritas a ADNc. En la reacción participa una trans-
criptasa reversa que polimeriza los dNTPs. Se requiere además del RNA molde que será convertido a ADNc, hexámeros aleatorios
de 6 nt que funcionen como iniciadores de la retrotranscripción e inhibidores de ARNsas mientras se realiza la síntesis del ADNc.
Una vez concluida la transcripción inversa el ARN será degradado por las ARNsas del medio y las moléculas de ADNc servirán de
molde a la reacción de PCR.

Aplicaciones de la PCR una técnica indispensable para el diagnóstico médico. Con
ella se pueden amplificar segmentos que contienen una
Los productos de PCR pueden utilizarse para la secuencia- mutación conocida (diagnóstico) o bien mutaciones desco-
ción, detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, nocidas que se secuenciarán y determinarán después de
hongos), amplificación de segmentos para su análisis una PCR. Esto ha sido de gran ayuda para el diagnóstico y la
mediante ADN finger-printing, o huella deADN, en medici- correlación de variaciones génicas con enfermedades. En
na forense, detección de mutaciones, análisis de la expre- cuanto a las enfermedades adquiridas, la detección de
sión génica o determinación de carga viral, entre otras genomas de patógenos es la aplicación diagnóstica más
muchas aplicaciones. empleada de la PCR. Debido a su alta sensibilidad, permite
la detección aun de pocas copias del genoma, lo que suele
Diagnóstico como aplicación de la PCR suceder en los periodos iniciales de la infección; por lo tan-
to, la PCR permite un diagnóstico temprano.
La PCR se encuentra al alcance económico de la mayoría de
los laboratorios y en los últimos 20 años se ha convertido en

158 PARTE II • Metodología del ADN recombinante a) Si la secuencia del iniciador es de 20 pares de bases
y uno de ellos hibrida en la posición 91, y el fragmen-
Ejercicio de integración 1 to a amplificar es de 65 pb, escriba el iniciador sentido
y antisentido:
1. La enfermedad de Parkinson (EP) se considera la segun- 1. Sentido:
da enfermedad neurodegenerativa en cuanto a prevalen- 5’– – 3’
cia, y afecta de 1 a 2% de las personas en edad madura. 2. Antisentido:
Es de origen multifactorial, por interacción de factores 5’– – 3’
ambientales y uno o más genes que confieren susceptibi-
lidad. Los pacientes con esta afección presentan un 80% b) Escriba el amplicón de ADNds resultante, indicando
de muerte neuronal; y se ha observado que en el cito- los extremos 5´-3´y la ubicación de los iniciadores sen-
plasma de las neuronas sobrevivientes hay inclusiones tido y antisentido.
proteicas de α-sinucleína, codificada por el gen SNCA,
conocidos como cuerpos de Lewy. c) En la siguiente esquematización de un gel de electro-
Diversos polimorfismos en este gen se han relaciona- foresis indique con una banda dónde aparecería el
do con EP dominante, esporádica y en otras formas de producto de PCR según su longitud.
demencia, con alteraciones en los cuerpos de Lewy, por
lo que se propone que estos polimorfismos pueden afec- MPM Muestra
tar la agregación proteica e influir en el desarrollo de EP
(Ramírez-Jirano L.J., 2006). 150 pb
Para estudiar la posible vinculación del polimorfismo, 100 pb
116C-G, se requiere la búsqueda del genotipo en pacien-
tes con EP y en individuos sanos, mediante la técnica de 50 pb
PCR y la posterior digestión con enzimas de restricción 25 pb
de los productos de PCR.
El fragmento del gen en el cual se encuentra la parte
polimórfica de la α-sinucleína es:

91

↓
5’- CGCGGAAGTG AGGTGCGTCG GGGCTGCAGC
GCAGACCCCG GCCCGGCCCC TCCGAGAGCG TCCT-
GGGCGC TCCCTCACGC CTTGCCTTCA AGCCTTCTGC
- 3’

CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 159

Ejercicio de integración 2 Ejercicio de integración 3

Complete las frases del tema de PCR, RT y modalidades La PCR para la detección del genoma del VHB genera un
de PCR con las siguientes palabras: amplicón de 325 pb. Interprete el siguiente gel obtenido
Iniciadores, ARN, PCR en tiempo real, constitutivo, curva tras procesar el suero de tres pacientes sospechosos de
estándar ADN polimerasa, transcriptasa inversa, uracil-n- portar la infección.
glicosilasa, punto final, electroforesis, desnaturalización,
ADNc MPM P1 P2 P3
1. De una reacción de retrotranscripción in vitro se obtie-
150 pb
ne: ___________ 100 pb
2. Extracción de ___________ de la muestra es el primer
50 pb
paso para la realización de una RT-PCR
3. Por la acción de la ___________ se obtiene una molécu- 25 bp

la de ssADNc. 1. ¿Cuál paciente (o pacientes) porta el genoma del VHB
4. La ___________ utiliza las cadenas sencillas de ADNc en su sangre?

como molde para la síntesis de moléculas de cadena 2. ¿Cuál paciente (o pacientes) es negativo a la infección?
doble 3. ¿Cómo interpreta el hecho de que la banda de P1 sea
5. El ___________ se inserta en vectores de clonación y se
someten al proceso de clonación. más intensa que la banda de P3?
6. Los ___________ son los reactivos clave para una PCR
específica.
7. La ___________ es una modalidad de PCR que emplea
sondas TaqMan.
8. Se denomina gen ___________ a aquel cuya expresión
no se modifica con las condiciones experimentales.
9. La PCR cuantitativa requiere forzosamente la interpola-
ción de las muestras contra una ___________
10. La modalidad de ___________ presenta el inconvenien-
te de que la diferente cantidad de material de inicio da
lugar a la misma cantidad de producto final debido a la
saturación.
11. A la temperatura de ___________ se destruyen estruc-
turas secundarias del ADNc y corresponde a los 95°C.
12. La enzima ___________ elimina los residuos de uracilo
del ADNss o ADNds previniendo que amplicones sirvan
de molde en una PCR posterior.
13. La visualización del producto de amplificación se realiza
mediante una ___________

Bibliografía

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and applications. Houston: Institute for Molecular Genetics, multiplex PCR. Hilden: QIAGEN GmbH, Núm 2, 1999.
Baylor College of Medicine, Feb, 2011.
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Hunt M. Real time PCR tutorial. The Board of Trustees of the Co- Nucleic Acids Res, 2002;30:1292-1305.
lumbia: University of South Carolina, 2006.

Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. PCR strategies. Nueva York:
Academic Press, 1995.

Capítulo 17

Secuenciación del ADN
y microarreglos

Belinda Claudia Gómez Meda / Guillermo Moisés Zúñiga González
José María Vera Cruz / Bertha Adriana Álvarez Rodríguez

ERRNVPHGLFRV RUJ

Introducción gel de poliacrilamida. El método está limitado por el poder de
resolución del gel de poliacrilamida que, en el contexto histó-
A pesar del papel tan importante que desempeña la secuen- rico de la época, permitía secuenciar aproximadamente 100
cia de ADN en la materia viva, el desarrollo de los métodos bases a partir del punto de marcaje.
para su determinación es relativamente reciente, debido
sobre todo al tamaño tan grande de las moléculas de ADN La electroforesis es una técnica para la separación de
en las células. moléculas según su movilidad en un campo eléctrico a tra-
vés de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por
En los decenios de 1960 y 1970, dos grupos de investiga- tamaños moleculares y carga eléctrica, según la técnica que
ción independientes, liderados por los británicos Frederick se use. La electroforesis en gel en general se utiliza con pro-
Sanger y Alan Coulson y los estadounidenses Alan Maxam pósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa
y Walter Gilbert, idearon de manera prácticamente simul- para purificar parcialmente moléculas antes de aplicar
tánea dos procedimientos diferentes para determinar de espectrometría de masas, reacción en cadena de la polime-
modo directo la secuencia del ADN. Estos métodos sólo rasa (PCR), clonación o secuenciación de ADN (para mayo-
requieren de pequeñas cantidades de ADN, son altamente res detalles, consultar el capítulo relacionado).
confiables y han revolucionado la biología molecular. En la
actualidad, el equipo automatizado hace que la secuencia- Antes del tratamiento químico que genera el corte, se
ción sea un procedimiento rápido y de rutina en los labora- marca un fragmento de doble hebra producido por diges-
torios (figura 17-1). tión con una enzima de restricción (fragmento de restric-
ción) de una determinada longitud en sus dos extremos;
Secuenciación primero, se trata con fosfatasa alcalina para eliminar el fosfa-
to terminal en su extremo 5’, y después, se añade un fosfato
Método químico o de degradación marcado con 32P para producir una hebra marcada de forma
de Maxam y Gilbert terminal. La fragmentación selectiva de una cadena de ADN
marcada se consigue con el uso de cuatro tratamientos quí-
Es un método de secuenciación que depende de la degrada- micos independientes, cada uno de los cuales está diseñado
ción química específica del ADN que describieron Maxam y para producir patrones específicos de rotura y observación
Gilbert, en 1977. Este método tiene la ventaja de que puede mediante autorradiograf ía. El procedimiento consiste en
emplear ADN de doble hebra, pero requiere una separación “atacar” químicamente al ADN con reactivos que primero
de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmen- dañan y después eliminan una base del nucleótido. La des-
to de restricción estudiado, lo cual lo hace laborioso. oxirribosa expuesta es, entonces, un punto débil en el esque-
leto de la cadena y es susceptible de roturas. Posteriormente,
La fragmentación específica del ADN es la base de este se llevan a cabo reacciones químicas para desprender com-
método, desarrollado en cinco pasos, que a grandes rasgos pletamente la desoxirribosa de los enlaces 5’ y 3’ de sus fos-
implican el marcaje radiactivo del extremo 5’ con 32P, la fatos, y la reacción es tan específica que permite dañar sólo
modificación de una base, la eliminación de la base modifica- uno de los residuos a lo largo de pocos pares de bases del
da, rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada ADN. El reactivo específico para purinas es el dimetilsulfato,
y el análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en mientras que el reactivo para pirimidinas es la hidracina.

160

CAPÍTULO 17 • Secuenciación del ADN y microarreglos 161

EXTREMO FIJO

ATTCGTGAGACTACCG

REACCIÓN REACCIÓN REACCIÓN REACCIÓN
“A” “T” “G” “C”

PP PPP P A AT ATTCG ATTC
AGGT T AA ATTCGTGA ATT ATTCGTG ATTCGTGAGAC
ATTCGTGAGA ATTCGT ATTCGTGAG ATTCGTGAGACTAC
ATTCGTGAGACTA ATTCGTGAGACT ATTCGTGAGACTACCG ATTCGTGAGACTACC

T CCAA T T A TGC
PP PP P-P-P P-P-P

P-P

5´ Iniciador dGTP ddCTP
H La incorporación del
OH OH
análogo dideoxi detiene
A A T GC C G T G
T T A CG G C A CG T A la síntesis de la cadena

Cadena molde

Figura 17-1. Estrategia general de secuenciación de ADN. Los métodos de secuenciación se basan en la síntesis de ADN, en cuatro
reacciones en paralelo, una para cada nucleótido, a fin de producir el paro de la reacción cuando un ddNTP se añada a la reac-
ción. Los ddNTP pueden marcarse diferencialmente con fluorocromos de diferente color. Se obtendrá la secuencia de la cadena
complementaria a la cadena molde por autorradiografía o fluorescencia, leyendo de abajo hacia arriba (5’ → 3’).

Debido a que el enlace glucosídico de una purina meti- con una en paralelo en la cual se suprime el rompimiento de
lada es inestable y se rompe fácilmente, las bases pueden guaninas, lo que permite que las adeninas se evidencien.
eliminarse calentando las hebras a pH neutro, dejando la
desoxirribosa libre. El tratamiento que de preferencia rom- La evidencia de corte de adeninas se basa en que los
pe residuos guanílicos se basa en un álcali suave a 90°C enlaces glucosúricos de las adenosinas metiladas son menos
(NaOH 0.1 M), que libera completamente los restos de des- estables que las de las guanosinas, de manera tal que de pre-
oxirribosa despurinados de los grupos fosfato adyacentes ferencia las adeninas se liberan con un tratamiento suave
en sus enlaces 3’ y 5’, o ácido fórmico para corte en bases con ácido diluido. Subsecuentemente, el rompimiento con
púricas indiferenciado (A + G), mientras que para los resi- álcali producirá un patrón de bandas oscuras correspon-
duos adenílicos el tratamiento es a 0°C en condiciones lige- diente a las adeninas y con bandas claras para las guaninas.
ramente ácidas (HCl 0.1 M). Cuando los fragmentos
marcados en su extremo se resuelven en gel de poliacrila- Para el caso de detección de pirimidinas, la reacción con
mida, la autorradiograf ía contiene un patrón de bandas hidracina producirá roturas en posiciones ocupadas tanto
oscuras y claras. Las bandas oscuras se generan del rompi- por citosina como por timina. La reacción se repite en pre-
miento de guaninas, que se metilan cinco veces más rápido sencia de NaCl 2 M, la sal suprime la reacción de la hidraci-
que las adeninas. Este patrón de guanina/fuerte y adenina/ na con la timina, tal que en la autorradiograf ía sólo se
débil contiene, al menos, la mitad de la información necesa- detectan fragmentos cortados mediante tratamiento con
ria para la secuenciación; sin embargo, en la interpretación piperidina en posiciones ocupadas por citosinas. Cuando se
de estos patrones puede haber ambigüedad, ya que la eva- comparan los patrones autorradiográficos de C y C + T, la
luación de la intensidad de las bandas aisladas no es senci- banda oscura (correspondiente a la marca del radioisótopo)
lla. Para determinar las bases de forma diferencial se que aparezca en ambas radiograf ías indicará rotura en la C,
compara la información que contiene esta columna del gel mientras que un enlace sólo presente en C + T representará
la rotura en una T.

162 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

5’ 3’ ADN de doble cadena G A+G T+C C
3’ 5’ Electroforesis en paralelo
Marcaje de extremos de las cuatro reacciones
3’
Corte con enzima de restricción y autorradiografía C
G
Desnaturalización (sólo los Descartar A
extremos marcados serán visibles T
T
en la autorradiografía) C
C
Exposición de las cuatro muestras a diferentes químicos en la G
reacción que rompen el ADN en la base indicada G
T
G A+G T+C C G
T
La reacción prosigue hasta producir A
T
rompimiento en todos los fragmentos, de tal G

manera que se generan fragmentos marcados T

T

T

A

C
5’

AT C de diferentes tamaños representando todas las
G ++ posiciones de la base indicada en la secuencia

GC

G A+G T+C C 5’
G
5’ 3’
GT T C A AT C G T A C G C A T
T
SO4(CH3)2 H2NNH2 C
NaCl2M A
pH7/∆ H+/∆ A

Piperidina/OH- Piperidina/OH- T
G A+G T+C C C
G
Gel de acrilamida T

A
C
G
C Secuencia de la
A hebra molde
3’

Figura 17-2. Método de secuenciación químico de Maxam-Gilbert. En la secuenciación química la última base que se va agregando a la
lectura de la secuencia de cada fragmento generado indica la base que fue químicamente modificada y después eliminada del
fragmento durante la reacción de rotura mediada por la piperidina, es decir, la base que se indica es la que en realidad falta.

Para lograr el corte en citosinas y timinas, la hidracina una hebra sencilla se comienza en la parte baja izquierda y se
reacciona con timina y citosina, cortando la base y dejando lee hacia arriba; así, la secuencia que se lee de abajo hacia
ribosilurea. La hidracina puede reaccionar para producir arriba es la correspondiente a 5’ → 3’ de la hebra original de
hidrazona. Después de una lisis de hidracina parcial en ADN analizada. La sencillez de este método radica en que
solución acuosa de hidracina 15 a 18 M a 20°C, el ADN se sólo se necesitan cuatro radiografías para establecer la
corta con piperidina 0.5 M. La amina cíclica secundaria, así secuencia de ADN.
como la base libre, desplaza todo el producto de la reacción
con hidracina de la desoxirribosa y cataliza la eliminación La secuenciación química tiene ventajas específicas. En
de β-fostatos. El patrón final contiene bandas de intensidad primer lugar, los tratamientos químicos son sencillos de con-
similar para los cortes en citosinas y timinas. trolar; el ataque químico ideal, una base eliminada por hebra,
produce una buena distribución de materiales marcados a
Cuando se analiza el patrón autorradiográfico de un gel través de la secuencia. En segundo lugar, cada base es ataca-
de secuenciación obtenido de los cuatro tratamientos quími- da, tal que en un corrimiento se desplegará cada base indivi-
cos, si se considera una secuencia de carriles con A, G, C y dual. La distinción química entre cada base es clara y la
C + T, una banda fuerte en la primera columna con una ban- secuencia de ambas hebras permite un chequeo más adecua-
da débil en la segunda genera una A; una banda fuerte en la do. Estas reacciones específicas fueron elegidas para proveer
segunda columna con una banda débil en la primera colum- información más que suficiente para la secuenciación. En
na es una G; una banda que aparezca en la tercera y cuar- principio, podría secuenciarse ADN con tres reacciones quí-
ta columnas es una C, y una banda solamente en la cuarta micas específicas para cada base, utilizando la ausencia de
columna es una T (figura 17-2). Para obtener la secuencia de banda para identificar la posición de la cuarta base; sin

CAPÍTULO 17 • Secuenciación del ADN y microarreglos 163

embargo, las aproximaciones tienden a error o a malinterpre- Por ejemplo, una muestra de ADN se incuba con ADN
tarse por otra base, por esa razón se describen las reacciones polimerasa en presencia de una mezcla de ddTTP (didesoxi-
para diferenciar que son redundantes. timidina fosfato) y con bajas concentraciones de TTP junto
con concentraciones normales de los otros tres dNTP (uno
El método de Maxam y Gilbert es óptimo para ADN que de los cuales puede marcarse con 32P, 35S o con marcadores
no puede secuenciarse de forma adecuada mediante otros quimioluminiscentes o fluorocromos). Conforme la cadena
métodos (por ejemplo, oligonucleótidos pequeños y secuen- de ADN se forma en el extremo 3’ del iniciador, la posición de
cias de ADN que producen terminación prematura debida a T se estará agregando en algunos casos con el sustrato nor-
estructuras secundarias fuertes). Además, la secuenciación mal y, por ende, la cadena seguirá extendiéndose. En ocasio-
de Maxam y Gilbert puede usarse para mapear modificacio- nes se agregará un ddTTP, lo que hará que acabe la síntesis,
nes de ADN, como alquilaciones y roturas producidas por tal que al término de la incubación seguirá habiendo una
carcinógenos, antineoplásicos y otros agentes que tienen mezcla de cadenas de longitud variable con terminación T
como blanco el ADN. En ensayos de huella digital química o en su extremo 3’, pero todas con el mismo extremo 5’ (el
enzimática, la técnica permite la identificación precisa de extremo 5’ original del iniciador). Incubaciones similares se
secuencias específicas de ADN que se unen a moléculas llevan a cabo en presencia de cada uno de los otros 3 ddNTP,
pequeñas y proteínas. Por ello, las mejoras al método son lo que da mezclas de terminación en la posición de cada uno
benéficas para gran variedad de aplicaciones en biología de los nucleótidos restantes C, A o G, respectivamente.
molecular y bioquímica.
Las cuatro mezclas son separadas en paralelo (cada
El método “didesoxi” de Sanger mezcla de reacción en un carril) por electroforesis vertical
en gel de poliacrilamida-urea en condiciones desnaturali-
Sanger también desarrolló otro método, el cual emplea aná- zantes (acrilamida 12% con urea 8 M), con resolución de un
logos de dNTP específicos de terminación de cadena. Los solo nucleótido. Este sistema separa las cadenas de ADN de
análogos más utilizados son los didesoxinucleótidos trifos- acuerdo con su longitud; así, las más pequeñas migrarán
fatados (ddNTP), iguales que los dNTP pero sin el grupo más rápido y las más grandes, más lento.
hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa. Estos pueden
incorporarse a una cadena de ADN en crecimiento por En teoría, cada una de las fracciones de las mezclas ten-
medio de la ADN polimerasa, pero actúan como termina- drá suficientes fragmentos terminados en cada una de las
dores porque, una vez incorporados a la cadena, y al no posiciones del nucleótido y podrán visualizarse mediante
contar con el OH en el extremo 3’, no permiten que se una autorradiograf ía cuando se utiliza marcaje radiactivo, ya sea
otro nucleótido. Este método es más rápido y acertado que en el iniciador o en alguno de los dNTP. El tiempo de expo-
el método químico de Maxam y Gilbert, por lo que es el sición de la placa de rayos X sobre el gel varía de 20 a 30
utilizado en la actualidad de manera rutinaria en los labora- horas y se expone a temperatura ambiente. En la actualidad,
torios. El proceso consiste en encontrar diferentes cadenas, se emplean marcas quimioluminiscentes (fluorescentes)
tantas como número de bases tenga el fragmento que son para evitar el manejo de radiactividad. En este caso el mar-
copias de la cadena de ADN que se va a secuenciar, cada caje es con fluorocromos en el extremo 5’ del iniciador y la
uno de un tamaño diferente y terminado con la incorpora- identificación se hace separando los diferentes fragmentos
ción de un 2’ 3’ didesoxinucleótido (figura 17-3). por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida, para
que, de esta manera, la secuencia pueda leerse directamente
El principio del método “didesoxi” es el siguiente: se aís- sobre el gel, de acuerdo con el patrón de bandas.
la y se clona el ADN que se desea secuenciar; este ADN se
desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuencia- En general, secuencias de entre 15 a 200 nucleótidos
ción. En la secuenciación se utiliza un iniciador o primer desde el sitio del iniciador pueden determinarse con preci-
marcado radiactivamente, el cual usualmente es un frag- sión mediante un solo iniciador e inclusive es posible leer
mento de restricción, que suministra el extremo 3’ OH que hasta 300 nucleótidos. El problema más grave es el apila-
necesita la ADN polimerasa para continuar la adición de miento de bandas, causado por las asas de apareamiento de
nucleótidos. El iniciador y el molde de ADN se alinean para bases que se forman en el ADN en las condiciones de la
formar un complejo iniciador-molde y la mezcla resultante electroforesis del gel de acrilamida y que se observan como
se divide en cuatro partes. Con estas mezclas se preparan un número de bandas en la misma posición o inusualmente
cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de muy cercanas unas a otras en la electroforesis.
hebra sencilla que se desea secuenciar, la ADN polimerasa,
el iniciador marcado radiactivamente y los cuatro dNTP. A Método automatizado
cada tubo se le añade uno de los ddNTP en exceso, es decir,
en mayor proporción respecto a su dNTP convencional Uno de los mayores avances en la tecnología de secuencia-
(10:1). En cada uno de estos tubos se producirán cadenas de ción del ADN fue el desarrollo de la secuenciación automa-
ADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar tizada, ya que aunque los procedimientos propuestos tanto
en el que se incorporó el “didesoxi” correspondiente (ddATP, por Sanger como por Maxam y Gilbert son relativamente
ddTTP, ddGTP, ddCTP) añadido al tubo. sencillos y su interpretación es fácil, su capacidad de resolu-
ción de los procedimientos utilizados es limitada.

164 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

5’ -TGACAGTACCTGGCA- 3’ Secuencia de la hebra
molde

Mezclas de reacción para cada CCGT Iniciador
didesoxinucleótido marcado con
ADN polimerasa
fluorocromos diferentes Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
Didesoxinucleótidos marcados

ddATP ddCTP ddTTP ddGTP

5’

5’-TTACGGCCATGACAGT-3’ 5
(
ddACCGT Electroforesis en gel "
ddATGGACCGT poliacrilamida y detección de bandas $
"
por autorradiografía (
5
ddACTGTCATGGACCGT "
$
ddATP $
ddCTP 5
ddTTP (
ddGTP (
$
Fragmentos más 5’ -TGCCAGGTACTGTCA- 3’ "
grandes
3’

Fragmentos más Lectura de la secuencia del
pequeños corrimiento electroforético de la base

hacia arriba (5’ 3’), que
corresponde a la secuencia
complementaria a la hebramolde

Figura 17-3. Método de secuenciación “didesoxi” de Sanger. La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada
radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. La reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base,
cada tubo contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP y se continúa con la polimerización incorporando los
nucleótidos en sentido 5’ → 3’. Cuando se marcan con flurocromos la reacción total se puede hacer en un solo tubo, ya que el
color emitido servirá para diferenciar las cadenas.

El método de Maxam y Gilbert fue muy popular en sus tizar las reacciones de secuenciación del método didesoxi.
inicios; sin embargo, con la descripción del método enzimá- Este sistema utiliza microrreacciones a temperatura con-
tico didesoxi, o de terminación de cadena, esta técnica quedó trolada; en un ciclo de reacción (alrededor de 50 minutos)
en desuso, ya que involucra el uso de sustancias químicas se procesan arriba de 48 moldes. Con este robot se resuel-
peligrosas y cantidades elevadas de ADN marcado radiacti- ven más de 450 bases en secuenciación automática de
vamente, además de ser técnicamente más complejo. Por ADN, protocolo que es aplicable tanto a marcaje radiactivo
ello, en la actualidad los procedimientos de secuenciación como fluorescente.
automatizada están basados en el método enzimático de
Sanger, que suple el marcaje radiactivo con métodos quimio- En estos sistemas automatizados el fragmento de ADN
luminiscentes con el uso de fluorocromos. De esta manera, fluorescente pasa por el punto de tensión del secuenciador
para la lectura de la secuencia se utilizan sistemas ópticos automático, y estas señales se envían a una computadora
que detectan los diversos fluorocromos empleados, con con un programa especial. Así, un golpe de láser excita la
lo que se logra un método más directo, fácil, rápido y seguro. tinción fluorescente, la señal de fluorescencia emitida se
Esta variante es conocida como dye-primer sequencing digitaliza y es captada por detectores que una computadora
(secuenciación mediante colorantes acoplados al iniciador). analiza y descifra, y pueden observarse los resultados obte-
nidos en tiempo real. En minutos, este programa procesa la
Para evitar el error debido a lo repetitivo y a los pasos de imagen del gel capilar. Para cada muestra secuenciada se
pipeteo, en la actualidad un robot industrial puede automa- crean curvas de cuatro colores, uno por cada nucleótido, y

CAPÍTULO 17 • Secuenciación del ADN y microarreglos 165

Cadena molde 5’ CC TAT GCT A Computadora y
Alineación con 5’ CC A analizador de imagen
GG TAT GCT
el iniciador 3’ A
ADNpol G T TC A
Mezcla de A G A
reacción A
C A A
A
dNTPs dNTPs
marcados con
Elongación CC TA T fluorocromo Capilar
GG A
T GCT
5’ C C TA Láser Pol líquido -
3’ G G A T GCT Placa
A caliente
5’ C C TA T GCT
3’ G G AT A Detectores Prismas + Ventanas Reacción de
T GCT secuenciación
5’ C C TA A
3’ G G AT T GCT
A CGA
5’ C C TA GCT Fragmentos de ADN
3’ G G AT C GA
T marcados, generados a partir Se aplican los fragmentos
5’ C C TA C
3’ G G AT

de la cadena molde de ADN marcados en el gel

5’ C C T A GCT A capilar para la electroforesis

3’ G G A G T
C
5’ C C T A T G C T A A Desnaturalización G

Productos de 3’ G G A T A
la reacción 5’ C C T A T G C T A
T

de secuenciación 3’ G G A T A Migración
del ADN
5’ C C T A T G C T A T2 3

3’ G G A T AC

5’ C C T A T G C T A
3’ G G A T AC G
5’ TAGCATTGCCTAGCTAT3’
5’ C C T A T G C T A ADN 3’ ATCGTAACGGATCGATA5’ 4
3’ G G A T AC GA polimerasa Detector
4 dNTPs 7
5’ C C T A T G C T A 4 ddNTPs 5

3’ G G A T AC GA T Cadena molde de 1 Láser

5’Iniciador 3’ secuencia
desconocida

Electroferograma 6

AT C G TA A C G G AT C G ATA Se genera un electroferograma
como resultado de la detección

de la migración de los
fragmentos marcados

Figura 17-4. Método de secuenciación automatizado. Para realizarlo se obtienen fragmentos de ADN de la hebra molde de interés, se
marcan los cuatro nucleótidos con fluorocromo de distinto color, se realiza el ciclo de secuenciación mediante PCR, se eliminan
NTP sobrantes. Los fragmentos son sometidos a electroforesis en gel y mediante el sistema automatizado; el láser emitirá la luz
que el detector interpreta diferencialmente de acuerdo con el fluorocromo que pase por el haz de luz para generar un patrón de
curvas de acuerdo a la longitud de onda diferente para cada base, a fin de poder leer la secuencia obtenida.

debajo de cada pico de la secuencia se identifica la secuencia rente color para cada base, con lo cual la terminación de
de nucleótidos correspondientes al fragmento analizado. cada cadena determinará el color y, por ende, el NTP res-
Puede analizarse la secuencia de 10 muestras simultánea- pectivo. Esto hará que al fluorescer a diferentes longitudes
mente o bien estudiar 40 fragmentos de ADN. de onda, el sistema óptico del equipo identifique directa-
mente en un gráfico las señales de fluorescencia de cada
La secuenciación por terminación fluorescente es un una de las bases (figura 17-4). El gráfico generado es acorde
método para el análisis de la secuencia del ADN mediante con el color del fluorocromo, en el cual se representa cada
automatización parcial. Es una variante modificada en la base con picos de intensidad de luz.
cual el marcaje se realiza con un fluoróforo unido de forma
covalente en el oligonucleótido iniciador utilizado. En esta Las investigaciones siguen progresando de tal forma
opción se utiliza un color diferente para cada fluoróforo de que se ha planteado la utilización de la tecnología de espec-
cada reacción específica para nucleótidos A, C, G o T, mar- trofotometría de masas para secuenciar ADN. Otras pro-
cándolos como terminadores reversibles mediante la unión puestas adaptan la técnica de Maxam y Gilbert en una
del fluoróforo a la base en el grupo 3’-OH, de tal forma que tecnología innovadora denominada secuenciación multi-
la ADN polimerasa aún la puede reconocer como sustrato. plex, que permite aumentar la velocidad de secuenciación y
Después, las mezclas de reacción se combinan en una faculta al investigador para analizar un gran grupo de frag-
coelectroforesis en un mismo gel, y la información de la mentos de ADN como una mezcla a través de los pasos
secuencia se lee directamente mediante una computadora. de secuenciación de ADN, lo cual incrementa la eficiencia de
Cuando el fluoróforo se agrega en la terminación de la los procedimientos estándares por un factor de 10.
cadena, se tiene la ventaja de que este último método puede
llevarse a cabo en una sola reacción en lugar de en cuatro, La pirosecuenciación es un sistema basado en el método
como en el método en que se marca el iniciador. En esta enzimático, que aprovecha la liberación de pirofosfato cuan-
reacción los ddNTP se marcan con fluorocromos de dife- do un nucleótido se incorpora en la hebra de ADN en creci-
miento, mediante bioluminiscencia; es un sistema útil para

166 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

analizar tanto secuencias cortas de ADN como polimorfis- capacidad y la rapidez con que ha evolucionado la secuen-
mos de nucleótido simple (SNP) y genotipificación. La lon- ciación, sobre todo en los últimos cinco años.
gitud de lectura tendrá que seguir mejorando para dar
aplicaciones más precisas y más amplias a esta alternativa. Las plataformas actuales comparten características tec-
Este método tiene la dificultad de que descifra de forma ade- nológicas comunes, como secuenciación masiva en parale-
cuada las regiones homopoliméricas del molde de ADN; lo de moléculas únicas de ADN separadas en un flujo de
sin embargo, existen abordajes metodológicos que permiten células o clonadas in vitro, para lograr muchas copias de la
modificar nucleótidos en posición 3’-OH mediante enlaces molécula original y después ser amplificadas, con ciclos
químicos reversibles para terminación de cadena usando un repetidos de extensión de nucleótidos mediados por poli-
grupo alil o un grupo 2-nitrobencilo. merasas o por ligación de oligonucleótidos. Como se trata
de un proceso masivo en paralelo, estos sistemas pueden
Se han propuesto métodos de secuenciación del ADN generar centenares de megabases (Mb) y gigabases (Gb) de
que no involucran ni electroforesis en gel o reacciones quí- secuencias nucleotídicas en un solo corrimiento de un apa-
micas o enzimáticas. Entre ellos se encuentran métodos rato.
con fluorescencia para detección mediante citometría de
flujo como alternativa a la técnica de secuenciación en Por ejemplo, la tecnología 454 (Roche; http://www.454.
geles, la posibilidad del marcaje de la ADN polimerasa o la com) se deriva de la pirosecuenciación y la PCR de emulsión,
secuenciación por nanoporos; otros enfoques están dirigi- en la cual se detecta la quimioluminiscencia generada por la
dos a la utilización de microscopia electrónica de túnel liberación de pirofosfatos cuando se incorpora un dNTP en
para leer las bases directamente en la hebra de ADN una reacción de polimerización. Según estas bases, en 2005
mediante el marcaje de las bases con halógenos para la se presentó el GS20 como el primer secuenciador de nueva
detección visual. generación, mediante el cual se pudo secuenciar el genoma
de Mycoplasma genitalia (580 069 pb secuenciadas a 96%
La dificultad para secuenciar fragmentos de ADN de con 99.96% de precisión) en una sola corrida. Posteriormen-
longitudes grandes (> 300 nucleótidos) se debe a la capaci- te, en 2007, Roche Applied Science adquirió la 454 Life
dad limitada para resolver fragmentos grandes de ADN que Sciences y presentó una nueva versión, GS-FLX, el cual
difieran en un solo nucleótido. Una de las soluciones es la mediante el mismo principio permite hacer microtitulacio-
secuenciación sobrelapada, en la cual el ADN genómico nes (a nivel de picolitros, es decir, la millonésima parte de un
se fragmenta y se clona en un vector de ADN, se amplifica, se mililitro) mediante un haz de fibra óptica.
purifica y se analiza para ensamblarse en una secuencia lar-
ga y continua, donde se identifican las regiones sobrelapa- El método para secuenciar con este tipo de tecnología
das (secuenciación shotgun, de fuerza bruta o de un tiro). requiere preparar una genoteca de ADN molde mediante
Para llevar a cabo esta técnica no se requiere contar con fragmentación por nebulización o sonicación, los fragmen-
antecedentes de la secuencia de ADN, por lo que se le cono- tos se reparan en sus extremos y ligados a oligonucleótidos;
ce como secuenciación de novo. después, la genoteca de ADN se diluye hasta la concentra-
ción de molécula única; luego se desnaturaliza e hibridada a
Técnicas desarrolladas recientemente permiten secuen- una microesfera que contiene oligonucleótidos adaptadores
ciar ADN genómico de células microbiales individuales con secuencias complementarias, con las cuales se lleva a
(secuenciación de célula única). Ésta es una estrategia útil cabo la PCR de emulsión; posteriormente, se liberan los frag-
para determinar secuencias naturales de microorganismos mentos y se someten a enzimas de secuenciación mediante
que suelen cambiar cuando se cultivan en laboratorio. Ade- un flujo sucesivo de los 4 dNTP. Cada evento de incorpora-
más, las reacciones de amplificación pueden producir re- ción de un dNTP produce la liberación de un pirofosfato, y el
arreglos en el ADN, de tal forma que, al no requerir ni el sistema reconoce la luminiscencia producida, que se trans-
cultivo ni la reacción, se puede llevar a cabo la determina- mite por la fibra óptica que dirige y traduce la señal. Una ven-
ción de la secuencia de la célula original tomada directa- taja reconocida de la tecnología 454 es la amplia longitud de
mente del ambiente. En la actualidad, en los centros de lectura de secuencias, ya que puede leer fragmentos de más
secuenciación más de 70% de los genomas se recuperan de 400 bases de longitud mediante el principio de pirose-
de célula única. cuenciación y en el tiempo de una sola corrida (10 horas) se
pueden secuenciar 500 Mb.
Secuenciación de alto rendimiento:
Además, la secuenciación de la nueva era permite llevar
la secuenciación de la próxima generación a cabo la secuenciación de transcriptomas, un enfoque muy
poderoso denominado ARN-Sec, para mapear y cuantificar
A partir del Proyecto Genoma Humano, en 2008 se secuen- tránscritos a partir de muestras biológicas. El rango dinámi-
ció un genoma humano completo en cinco meses con 1.5 co del ARN-Sec para determinar niveles de expresión es
millones de dólares; en 2009 el proceso se realizó en horas y de 3-4 órdenes de magnitud, comparado con dos órdenes de
con sólo 10 000 dólares, y actualmente, con un menor tiem- magnitud de expresión por microarreglos. De esta manera,
po y costo, en una sola reacción se puede conocer la secuen- esta alternativa permite la detección cuantitativa tanto de
cia completa de un individuo, lo cual demuestra la gran tránscritos producidos a bajo y alto nivel, además de poder

CAPÍTULO 17 • Secuenciación del ADN y microarreglos 167

deducir la diversidad de la información cualitativa y cuanti- intensidad de fluorescencia será directamente proporcional
tativa del corte y empalme. La ARN-Sec se ha aplicado a al nivel de expresión del gen (figura 17-5).
gran variedad de organismos, incluidos Saccharomyces cere-
visiae, Arabidopsis thaliana, ratón y células humanas. Para poder interpretar los resultados debe existir pre-
viamente una cédula de identificación, es decir, una planti-
La secuencia de nucleótidos de los genes humanos ha lla que defina la codificación que se esté manejando de
sido y continúa siendo de gran importancia como herra- acuerdo con la base de datos que se trabaje, a fin de saber en
mienta de investigación para el entendimiento de las bases qué posición se ubica un determinado gen o marcador y
de los procesos celulares que definen la fisiología y el desa- cuál muestra fue aplicada. Para poder diferenciar los puntos
rrollo. La organización de los genes en los genomas existe que emiten fluorescencia y poder relacionarlos de forma
en un cromosoma concreto en un orden particular. La com- correcta con el gen correspondiente, y así poder “leer” el
paración de mapas cromosómicos de animales superiores resultado claramente, deberán determinarse diferencias
proporciona información acerca de cuál organización géni- significativas que muestren datos relevantes en el estudio.
ca está asociada con qué expresión génica y qué función Por esto, el diseño de los microarreglos debe obedecer a un
génica. Sin embargo, conocer la secuencia de ADN de los diseño de estudio bien planeado que responda a las incóg-
genes y cómo se traducen en proteínas no es suficiente para nitas que plantea la investigación para los genes de interés.
establecer cómo están controlados o cómo la función del Para ello, debe contarse con una muestra de análisis de muy
producto génico en una célula particular en el organismo es buena calidad, en que la pureza e integridad se aseguren
un todo. Entender la relación entre la estructura de la pro- para contar con resultados confiables y sin contaminación.
teína y su función es el siguiente paso crucial. Además, debe contarse con un buen método bioestadístico
para inferir resultados.
Microarreglos
A fin de estandarizar la metodología se ha propuesto
La bioinformática es el campo de la ciencia en la cual las trabajar con duplicados, de diferentes fuentes o eventos
tecnologías de la información, las ciencias de la compu- —duplicado biológico— o mediante dos ensayos diferentes
tación y la biología se unen para formar una sola disciplina. de una misma muestra para verificar la calidad y reproduci-
Este campo ha sido indispensable para la interpretación bilidad de los resultados —duplicado técnico—. Para ello se
de la secuenciación de los genomas, ya que por la cantidad de ha sugerido el uso de moléculas de ARNm que funcionen
nucleótidos, el gran número de reacciones, el análisis del como controles internos, ya que esta técnica permite detec-
sobrelapamiento y la coordinación de las secuencias sólo tar incluso un solo tránscrito, lo que da confiabilidad al
pueden evaluarse de forma adecuada gracias a los progra- ensayo.
mas y a las bases de datos que guardan toda la información
que se produce día a día. Por ejemplo, el genoma humano El tipo de ensayo de microarreglos dependerá de la son-
consta de 3 mil millones de pares de bases, si la fragmenta- da utilizada. Entre los más comunes se encuentran los
ción del genoma se llevara a cabo cada 500 nucleótidos y empleados para determinar cambios en los niveles de expre-
éstos pudieran secuenciarse sin sobrelapamiento, sería sión de genes o análisis de mutaciones o polimorfismos. En
necesaria la secuenciación de 6 millones de fragmentos. el caso de las sondas, los oligonucleótidos son ADN sintéti-
co de cadena sencilla (15 a 25 o 50 a 120 nucleótidos). En la
El uso de la bioinformática desembocó en la implemen- actualidad, la tendencia es utilizar oligonucleótidos de longi-
tación de una nueva herramienta de la biología molecular y tud corta. En esta presentación existen los bioarreglos
la genómica denominada microarreglos (microarrays). (bioarrays), con genes preseleccionados para diagnóstico de
enfermedades precisas. Su aplicación está enfocada al desa-
Los microarreglos constituyen una distribución orde- rrollo de fármacos y terapias, respuesta a medicamentos y
nada de más de 10 mil genes por cm2 en una pequeña asesoramiento de riesgos de enfermedades o progresión.
superficie, del tamaño de un portaobjetos, en el cual pue-
den estudiarse simultáneamente mediante hibridación y Además, existe la alternativa del ensayo de microarre-
puede obtenerse una interpretación instantánea de la glos de proteínas, donde las sondas son anticuerpos fijos en
expresión de múltiples genes (distinguibles unos de otros) el soporte; sin embargo, aún no se ha estandarizado por
en un solo análisis. completo, debido a la complejidad de estructuras tridimen-
sionales en estas moléculas. Por otro lado, los microarre-
Para ello, es necesario contar con un soporte o matriz glos en tejidos son una buena alternativa cuando se cuenta
sólida (membranas o vidrio) donde se inmovilicen las son- con cantidades limitadas de muestra para realizar pruebas
das de unos cuantos pares de bases de longitud, para su de ADN, ARN o proteínas.
exposición a la muestra que se pretende analizar.
Adicionalmente, se integra un método citogenético
El fundamento de la técnica de microarreglos se basa en molecular llamado hibridación genómica comparativa (com-
la hibridación de ácidos nucleicos y su detección por fluo- parative genomic hybridization, CGH), basado en la hibrida-
rescencia mediante análisis de imagen, de tal manera que, ción competitiva por coloración diferencial entre el tejido
como en otras técnicas, sólo se obtendrá señal fluorescente con la anomalía y sin ella, a partir del análisis de metafases o
en los puntos (genes) donde haya habido hibridación; la de ADN genómico. Para este tipo de análisis se utilizan gran-

168 PARTE II • Metodología del ADN recombinante Luz

Fabricación de la sonda
PCR

Detección de
la señal

Biochip Hibridación Excitación Emisión de fluorescencia

ADN 1
(control)

ADN 2 Incubación de los dos ADN Microarreglo o chip por pocillos, en cada uno hay
(control) en cada pocillo, si es fragmentos de ADN conocidos
complementario habrá
Se fragmenta el ADN de los pacientes. hibridación
Posibilidades:
a) Para estudio de ADN, obtener el ADN del paciente.
b) Para estudio del ADN, primero se obtiene

el ADNc por RT-PCR

Si se hibrida el ADN1 emite en color verde, si se
hibrida el ADN2 en rojo y si se hibridan ambos

emite amarillo

Figura 17-5. Microarreglos. Un microarreglo es una distribución ordenada de genes en una pequeña superficie, y mediante hibrida-
ción con el ADN problema se puede obtener respuesta instantánea de la actividad o expresión de múltiples genes en un solo aná-
lisis. La intensidad de fluorescencia es directamente proporcional al nivel de expresión del gen. La interpretación de los marcajes
indicará un patrón de colores; así, cada punto en el soporte del microarreglo se asocia con el gen localizado según su color.

des porciones de ADN genómico en las que se incluyen Los elementos que hay que tomar en cuenta para un
regiones conocidas de cromosomas, a fin de estudiar anoma- buen ensayo de microarreglos deben contemplar el diseño
lías cromosómicas, como ganancias y pérdidas de genes rela- experimental, el diseño del arreglo que se utilizará y la loca-
cionados con una enfermedad particular (por ejemplo, para lización de cada punto en el arreglo, las muestras utilizadas
la detección de tumores, defectos congénitos, presencia o y su marcaje, así como los controles, la hibridación, los
ausencia de genes predisponentes o número de copias de datos generados y su análisis e interpretación. El proceso
genes involucrados en la evolución de la enfermedad). Este implica preparar el soporte con los ADN elegidos, incubar
método presenta la ventaja de poder analizar muestras de e hibridar con el ADNc y las marcas fluorescentes, detectar
archivo, incluso embebidas en parafina. En el ensayo se utili- la unión de ADNc mediante tecnología láser, almacenar los
zan sondas con regiones cromosómicas específicas y se datos y analizar las imágenes con métodos estadísticos ade-
hibrida con ADN genómico marcado de los tejidos enfermo cuados. La interpretación de los marcajes indicará un
y sano. De esta manera, la fluorescencia emitida se diferen- patrón de colores, en el que de manera general un color “A”
ciará de acuerdo con la presencia del gen o el número de representaría al ADN control, uno “B” al ADN de la mues-
copias, comparado con el tejido sano o control; así, la aplica- tra de análisis, uno “C” indicaría una doble hibridación y el
ción del ensayo es útil para la clasificación de tumores, el ase- negro, o sin color, la no hibridación. De esta manera, cada
soramiento de riesgos, la predicción de la evolución clínica, punto en el soporte del microarreglo se asocia, según su
así como para determinar qué tratamientos farmacológicos color, con el gen localizado. Según el tipo de arreglo, la loca-
son adecuados y su efectividad. lización, así como la intensidad de color, se obtendrá infor-

CAPÍTULO 17 • Secuenciación del ADN y microarreglos 169

mación acerca del estado del gen y de su nivel de expresión con microarreglos aún están en desarrollo, por lo que se
(ver la figura 17-5). prevé que poco a poco se estandaricen procesos. Así, los
nuevos enfoques estarán destinados a estudiar las familias
La tecnología de microarreglos surgió hace poco más de génicas, el nivel de coordinación de su expresión entre
una década y fue recibida con entusiasmo, ya que permitía familias y a conocer nuevos genes. De esta manera, la inte-
conocer la expresión de gran número de genes al mismo gración de la información acerca de los patrones de expre-
tiempo. Esta tecnología revolucionó el área por su aplica- sión génica múltiple y simultánea, la interacción y la
ción en el entendimiento de las enfermedades complejas y coordinación de la función celular permitirán revelar cómo
de la medicina personalizada. En la actualidad, su uso se ha los múltiples productos génicos trabajan en conjunto para
diseminado a campos de la biología básica, estudio del cán- producir la gran gama de manifestaciones f ísicas y quími-
cer, diagnósticos de enfermedades, guías de tratamiento e cas que las células requieren. Mientras más se perfeccione
investigación de nuevos fármacos. Sin embargo, ahora es esta tecnología, más precisa, confiable y útil será la infor-
claro que la gran cantidad de información que se genera con mación, a fin de prevenir o pronosticar enfermedades o su
esta tecnología se vuelve un problema más que una ayuda, evolución, e integrar el diagnóstico y la terapia con fárma-
ya que la interpretación de datos es complicada incluso para cos o tratamientos personalizados. Incluso puede tener
los estadísticos, por la gran cantidad de información obte- aplicación en la búsqueda de formas de vida en ambientes
nida, y aún no hay un consenso definitivo sobre cómo ana- extremos o externos a nuestro planeta.
lizar e interpretar esta información. De hecho, los estudios

Ejercicios de integración c) Es la base previa a una guanina, porque por la reac-
ción específica la G fue modificada y eliminada.
1. ¿Cuál es la secuencia de la hebra complementaria a esta
secuencia de ADN? d) Es la base previa a una adenina, porque la reacción es
5’-AGCGTCATGTTATAGCTATCGGTCTAGCTCTGCAATC- específica para purinas.
GAGCTCG-3’
a) 5’-TCGCAGTACAATATCGATAGCCAGATCGAGACG- 4. En el método de secuenciación de Sanger, el punto de
TTAGCTCGAGC-3’ paro de la síntesis se da como resultado de:
b) 3’-TCGCAGTACAATATCGATAGCCAGATCGAGACG- a) La incorporación de una base modificada por reacti-
TTAGCTCGAGC-5’ vos específicos.
c) 5’-AGCGTCATGTTATAGCTATCGGTCTAGCTCTGCA- b) La eliminación de un análogo de base marcado con
ATCGAGCTCG-3’ un fluorocromo que emite en una longitud de onda
d) 3’-TCGCATAGCCAAGACGTTAGGTACAATATCGA- específica.
CTCGGATCGAGC-5’ c) La incorporación de un didesoxinucleótido en la hebra
que se está sintetizando.
2. La secuenciación química tiene ventajas específicas so- d) La incorporación de un desoxinucleótido análogo en la
bre otras técnicas, señale cuál de las siguientes afirma- hebra que se está sintetizando.
ciones no es cierta:
a) Los tratamientos químicos son sencillos de controlar, 5. Respecto al método de secuenciación automatizado, se-
sólo una base es eliminada por hebra, lo que produce ñale cuál de las siguientes afirmaciones no es cierta:
que los materiales marcados a través de la secuencia a) Para llevar a cabo el proceso, como requerimientos
se distribuyan de forma correcta. básicos se debe contar con el marcaje diferencial fluo-
b) Cada base es atacada, tal que cada base individual rescente de los dNTP, sistema de electroforesis, láser,
será desplegada en un corrimiento electroforético. detectores de fluorescencia, computadora, analizador de
c) Es un método óptimo para ADN que no puede ser imágenes.
secuenciado de forma adecuada mediante otros mé- b) Se han desarrollado alternativas que permiten analizar
todos, por ejemplo oligonucleótidos pequeños y se- un gran grupo de fragmentos de ADN como una mez-
cuencias de ADN que producen una terminación pre- cla, otros que no involucran ni electroforesis en gel o
matura debida a estructuras secundarias fuertes. reacciones químicas o enzimáticas, como la citome-
d) La interpretación de los marcajes indica un patrón de tría de flujo o microscopia electrónica de túnel para
colores, en el cual el verde representa el ADN control, leer las bases directamente en la hebra de ADN.
el rojo el ADN de la muestra de análisis, el amarillo c) Según la sonda utilizada para la hibridación se deter-
una doble hibridación y el negro la no hibridación. minan cambios en los niveles de expresión de múlti-
ples genes a la vez, mediante el uso de ADNc o de
3. En el método de secuenciación química, cuando se pro- oligonucleótidos, los cuales se amplifican selectiva-
ducen los fragmentos y se determina en el carril del gel mente en placas por PCR y una vez verificada la cali-
la posición de una guanina, eso significa que el punto de dad y pureza, se colocan en portaobjetos de vidrio por
terminación del fragmento secuenciado era: capilaridad.
a) Guanina, porque es la base que se está detectando. d) La técnica permite secuenciar ADN genómico de células
b) Citosina, porque es la base complementaria a la cade- microbiales individuales, estrategia útil para determi-
na molde.

170 PARTE II • Metodología del ADN recombinante dación; la intensidad de fluorescencia es directamente
proporcional al nivel de expresión del gen.
nar mutaciones en la secuencia de microorganismos c) Se basa en la fragmentación específica del ADN, pro-
que suelen cambiar cuando se cultivan en laboratorio. ceso que implica la modificación de una base, elimi-
6. ¿Cuál es la base de la técnica de microarreglos? nación de la base modificada, rotura de la cadena de
a) Se basa en la polimerización de una hebra molde de ADN en la desoxirribosa modificada y el análisis de la
ADN mediante bases modificadas, y la obtención fragmentación por electroforesis en gel de poliacrila-
de diferentes cadenas, tantas como número de bases mida.
tenga el fragmento, cada uno de un tamaño diferente d) Se basa en la separación de moléculas según la movi-
y terminado con la incorporación de un didesoxinu- lidad de éstas en un campo eléctrico a través de una
cleótido. matriz porosa, la cual finalmente las separa por tama-
b) Se basa en la hibridación de ácidos nucleicos y su ños moleculares y carga eléctrica.
detección por fluorescencia mediante análisis de ima-
gen, de tal manera que sólo se obtendrá señal fluores-
cente en los puntos (genes) donde haya habido hibri-

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Capítulo 18

Polimorfismos de ADN
y huella genética

Belinda Claudia Gómez Meda / Ana Lourdes Zamora Pérez
María Guadalupe Sánchez Parada

Introducción de ADN, los cuales no son un sello exacto, pero sí permiten
relacionar muestras de un mismo origen o de personas
El ADN de todas las especies de organismos conocidas tie- emparentadas (familiares, ancestros comunes). Estas secuen-
ne la misma estructura química; sin embargo, cada organis- cias se eligieron porque se conoce que varían entre indivi-
mo es completamente diferente a otro; la diferencia se debe duos no relacionados, de tal manera que el análisis de un
al orden de las bases nitrogenadas en la molécula de ADN. grupo de ellas para encontrar concordancias permite inferir
Los organismos de una misma especie comparten secuen- asociaciones con probabilidades altas de que tener un mismo
cias en su molécula de ADN, pero aún dentro de la misma origen o ser de la misma persona.
especie existen variaciones entre individuos. Organismos
de una misma especie compartirán regiones de su secuen- Un gen está representado como una sección de cromoso-
cia hasta en más de 99%, lo que les confiere características ma, que equivale a un segmento de ADN con una secuencia
similares; más aún, los familiares cercanos tendrán secuen- determinada, con la información necesaria para crear una
cias con mayor parecido entre ellos, pero nunca serán igua- proteína específica. Los genes de un organismo contienen
les, lo que define la variabilidad genética intra e interespecies. toda la información de manera precisa acerca de cada aspec-
to y proceso de la formación y desarrollo de un individuo; si
En el caso del ADN humano, las secuencias que contie- bien, los genes no pueden dictar su comportamiento, por lo
nen a los genes son poco variables dentro de la especie; no que hay que considerar que el ambiente desempeña un papel
obstante, el resto de la secuencia es muy propenso a la muy importante en cómo estos genes se expresan a lo largo
variabilidad y, debido a que hay millones de pares de bases de la vida del organismo.
por molécula de ADN y un alto porcentaje de ésta no codi-
fica para una proteína, cada persona tiene una secuencia de Un gen se presenta en doble dosis, uno que aporta el
ADN única, lo que permite identificarlo tan sólo por el padre y otro la madre; a estas copias se les llama alelos, por
orden de sus pares de bases. Estas secuencias variables se lo que hay dos alelos por cada gen, uno de origen materno y
denominan polimorfismos. otro paterno. Estas formas alélicas de un mismo gen existen
porque la secuencia del ADN está sometida a cambios, en
Existen dos tipos de polimorfismos genéticos: los que ocasiones debido a mutaciones que suceden al azar pero
muestran cambio de un solo nucleótido por sustitución de que originan formas alternas de un gen, estables y hereda-
bases y los que implican cambios en el tamaño de la secuencia; bles, a veces con una función diferente al alelo original o
esto puede deberse a inserciones o deleciones de secuen- silvestre. La mutación es la base de la variación gradual de
cias de ADN, o bien a la repetición de bases (o combinación la estructura genética de las poblaciones; esto es, la base de la
de bases) de manera continua en un segmento del ADN. evolución.

Esta variabilidad es un proceso biológico común, ya que La posición f ísica donde se ubica un gen en el genoma
30% de la secuencia de ADN es altamente repetitivo, lo se denomina locus (loci en plural), por tanto los alelos sil-
que permite establecer patrones genéticos específicos para vestres o modificados de un mismo gen residen en un mis-
identificar individuos, es decir, para establecer una huella mo locus. Cuando un individuo tiene diferentes formas
genética o huella de ADN (ADN fingerprinting). alélicas en el locus se dice que es heterocigoto, ya que la
secuencia de cada alelo puede generar variantes de la mis-
Por ello, los científicos han desarrollado estrategias para ma proteína. Por el contrario, un homocigoto sería identifi-
poder identificar individuos al analizar patrones repetitivos

171

172 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

cado cuando el individuo presente la misma forma alélica código genético, por alterar codones que cambian el senti-
(de origen paterno y materno) en el locus, el resultado de la do de la traducción de un aminoácido por otro. Además, se
expresión génica será un mismo producto proteico, ya sea a considera que los polimorfismos neutros, que son los que
partir del alelo silvestre o del modificado. varían en su secuencia en regiones no codificables del ADN
también son silentes. Un polimorfismo se considera neutro
Polimorfismos si la presencia o ausencia del alelo no confiere ninguna ven-
taja o desventaja al individuo. Además, un polimorfismo
Las secuencias variables son múltiples en los organismos, puede representar ventajas evolutivas para una determina-
los análisis de genética poblacional han permitido detectar da población, como conferirle resistencia a condiciones
dos o más alelos por cada una, y cuantos más alelos diferen- medioambientales, de acuerdo con la zona geográfica en la
tes hay es más polimórfico; es decir, hay mayor poder de que habita.
identificación, ya que como existe mayor variabilidad en las
secuencias, será menos probable que dos individuos com- El término polimórfico es útil para definir genes o alelos,
partan las mismas regiones polimórficas. e incluso se observan secuencias que varían mucho, como
en los alelos que definen los grupos sanguíneos y las molécu-
Se considera que hay un polimorfismo genético cuando las de los antígenos leucocitarios humanos (HLA, human
existen múltiples alelos de un gen en una población definida leukocyte antigen, que constituye el complejo mayor de his-
o, de manera más específica, cuando la secuencia de bases tocompatibilidad), a los que se considera altamente poli-
nitrogenadas de la molécula de ADN de un locus en particu- mórficos.
lar es variable entre los organismos de una población.
En genética, el concepto básico de polimorfismo mencio-
La palabra polimorfismo está compuesta por poli na que cuando un alelo en un locus en la población presenta
(muchos), morfo (forma) e ismo (proceso o estado); es decir, una frecuencia de más de 1% se denomina polimórfico. Este
“de muchas formas”. Los ácidos nucleicos y las proteínas tie- porcentaje indica que la presencia de estas variantes es
nen la propiedad de presentarse en diferentes formas molecu- común y no se da por azar, es decir, que el alelo menos común
lares o en múltiples alelos, lo que puede tener implicaciones no puede mantener su frecuencia simplemente por muta-
en las patologías moleculares. Un polimorfismo puede ción.
observarse en un individuo completo (polimorfismo fenotí-
pico), en formas variables de proteínas o grupos sanguíneos Los polimorfismos se acumulan en las poblaciones hasta
(polimorfismo bioquímico), en las características morfoló- que se tornan comunes entre las especies; entonces se deno-
gicas de los cromosomas (polimorfismo cromosómico) o minan divergencia genética. Así, con el paso del tiempo, un
en el ADN, por diferencias en la secuencia nucleotídica polimorfismo podría llegar a presentarse en un alto porcen-
(polimorfismos del ADN). taje de una población e incluso ser tan común como un alelo
silvestre. Por tanto, un alelo que originalmente pudo consi-
Las variantes alélicas de las secuencias codificantes de derarse polimórfico puede llegar a ser el alelo más común en
genes en el ADN, debidas a procesos normales de la función una población.
celular, propician la producción de codones polimórficos y,
con ello, de formas alternas de las proteínas, aunque gene- La combinación de secuencias en los alelos que se here-
ralmente sin que se altere la función del producto sintetiza- dan es única para cada descendiente; así, el análisis de sus
do, lo que permite diferenciar un polimorfismo de una polimorfismos permite obtener un patrón o perfil definido
mutación, lo que se da generalmente al azar. único para cada organismo, semejante al código de barras de
los productos de los supermercados. A esto se le denomina
El polimorfismo puede presentarse en la región promo- huella genética individual, por su semejanza a las huellas
tora del gen, lo cual influye en la expresión génica del ARN dactilares, también únicas y características de cada persona.
mensajero y, por ello, en la proteína que codifica (diferentes
fenotipos) o inclusive identificarse en regiones no traduci- Los polimorfismos se utilizan como marcadores genéti-
das (intrones), de tal forma que no se tiene una interpreta- cos para identificar o relacionar a personas, ya que al ser
ción de su función, al menos conocida hasta ahora, pero heredables, generalmente sin cambios de padres a hijos,
siguen siendo secuencias que permiten diferenciar indivi- permiten establecer parentescos biológicos directos, ya que
duos y especies. comparten los mismos marcadores.

Los polimorfismos, como las mutaciones, pueden clasi- Para poder llevar a cabo estos estudios de marcadores,
ficarse, de acuerdo con su efecto, como polimorfismos en primer lugar hay que definir los tipos de polimorfismos
sinónimos o silentes (los que no cambian la traducción del genéticos, ya que pueden clasificarse de acuerdo con dife-
producto proteico en la variación de la secuencia; esto es, rencias de estructura, forma de transmisión, distribución,
los que, cuando la secuencia nucleotídica cambia, el co- estabilidad, tamaño. Dado a que los métodos de estudio e
dón que codificaba al aminoácido original se cambia por otro identificación de polimorfismos son diversos y cada opción
que codifica para el mismo aminoácido o por otro con tiene ventajas y desventajas, la utilización de varios tipos de
características químicas similares), y polimorfismos no polimorfismos que aporten diferente información sobre su
sinónimos (los que sí producen variación en la lectura del herencia e individualidad permite obtener resultados más
amplios y útiles para una interpretación adecuada.

CAPÍTULO 18 • Polimorfismos de ADN y huella genética 173

Tipos de polimorfismos Gen Polimorfismos genéticos
CODONES POLIMÓRFICOS
Las características de las secuencias que permiten detectar Segmento
sitios polimórficos son muy variables. Así, pueden diferen- exón/intrón EXÓN 2
ciarse dos tipos de polimorfismos: los que involucran cam-
bios en un solo nucleótido y en los que intervienen Alelo 1
deleciones o inserciones de pocos o muchos pares de bases. GCT TACC CGT ACTCG

De acuerdo con esta clasificación, los marcadores poli- Alelo 2
mórficos más utilizados para realizar un perfil genético son: GCT TACA CGT ACTCGN

• Polimorfismos de un solo nucleótido o nucleótido único Codón polimórfico C>A
(single nucleotide polymorphism, SNP).
Figura 18-1. Polimorfismo SNP. Representado por el cambio de
• Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción una base por otra.
(restriction fragments length polymorphism, RFLP).
resolver los fragmentos en un corrimiento electroforético
• Número variable de repeticiones continuas o en tán- se obtendrá como resultado una sola banda en el gel, a una
dem (variable numbers of tandem repeats, VNTR). De distancia determinada (figura 18-2).
estos polimorfismos se diferencian dos tipos: minisaté-
lites y microsatélites. El hecho de que un individuo sea heterocigoto significa
que tiene alelos diferentes en un determinado locus, por
• Repeticiones cortas y continuas (short tandem repeats, lo que al identificar su secuencia en un gel se observará más de
STR). una banda: una para el fragmento sin corte de restricción y
otras con el corte. En este caso, el número de variantes alé-
• Polimorfismos del cromosoma Y. licas es siempre dos (C: corta/NC: no corta) y se maneja en
• Marcadores mitocondriales. función de la identificación del sitio de restricción por la
• Insertion-deletion (InDel). enzima utilizada en la digestión, es decir, si corta o no corta
en la secuencia analizada. En cambio, pueden identificarse
Polimorfismos de un solo nucleótido o nucleótido único tres genotipos: homocigoto para corte C/C, heterocigoto
C/NC y homocigoto para no corte NC/NC (figura 18-3).
Como su nombre lo indica, los SNP son variaciones en un De esta manera se identifica a los individuos con reconoci-
solo nucleótido o par de bases en una secuencia dada (figu-
ra 18-1). Estos polimorfismos pueden estar representados 560 pb
por la deleción, inserción o sustitución de una base nitroge-
nada en la secuencia nucleotídica normal. Este tipo de poli- Alelo 1
morfismo es muy frecuente, y se ha descrito que es posible
encontrar un SNP en el ADN humano cada 1 000 a 3000 pb, 400 pb 160 pb
en secuencias codificantes de proteínas. Además, es posible
que estén presentes de manera más cercana en el ADN no Alelo 2
codificante, inclusive entre 500 a 1000 pb en promedio.
Sonda Sitio de reconocimiento y corte
Las ventajas de los SNP como biomarcadores son bási-
camente su amplia distribución a través de todo el genoma Figura 18-2. Polimorfismos genéticos RFLP. Sitio de reconocimiento
humano, su frecuencia y su estabilidad; además, debido a su de la enzima de restricción en un fragmento de ADN, me-
alta frecuencia, muchas enfermedades genéticas están cau- diante el cual se pueden evidenciar segmentos de diferente
sadas por un SNP o se relacionan con la identificación de un longitud de acuerdo con el fragmento de restricción generado.
SNP específico. Resultado de la digestión. Alelo 1. Bandas variables (hay
reconocimiento del sitio de restricción y hay corte enzimático;
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción se evidencian dos fragmentos de 400 y 160 pb). Alelo 2. Banda
única (no hay reconocimiento del sitio de restricción por la
Este tipo de polimorfismos se evidencian mediante el uso enzima, y por lo tanto no hay corte observando sólo una banda
de enzimas de restricción, que cortarán determinadas de 560 pb).
secuencias de ADN. De este modo se generan fragmentos
(de restricción), que pueden hibridar con sondas específi-
cas para poder reconocerlos. Si un SNP afecta el sitio de
restricción de una enzima, se evidenciará un polimorfismo
de restricción o RFLP. Cuando el cambio de un nucleótido
altera la secuencia diana para una determinada enzima de
restricción puede detectarse el polimorfismo en función
de la variación que éste genera en el patrón de restricción.
En los casos en que el sitio de restricción se reconozca en
ambas cadenas de ADN, se considerará un homocigoto, y al

174 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Marcador AA CC AC Polimorfismos genéticos
25 pb MICROSATÉLITES

Gen

Segmento INTRÓN 4
exón/intrón
300 pb
275 pb 199 pb Alelo 1 (GC)5
250 pb 135 pb NNGC GC GCG C GCNNN
225 pb
200 pb 64 pb Alelo 2 (GC)8
175 pb
150 pb GC G C GCG CG CGCGCGC

125 pb Nucleótidos polimórficos
100 pb
Figura 18-4. Detección de microsatélites. La detección de micro-
75 pb satélites se realiza en regiones no codificantes del ADN, en
el cual se muestran alelos con diferencia en la repetición de
50 pb nucleótidos de una secuencia analizada.

Figura 18-3. SNP TNFR1-383 A>C, identificado por PCR-RFLP. Frag- cientos o miles de veces a lo largo del genoma. Estas secuen-
mentos de digestión esperados para el polimorfismo TNFR1 cias están localizadas en la heterocromatina constitutiva
-383 A>C. Se muestra el patrón de bandeo obtenido de un gel (por ejemplo, en los centrómeros o en regiones cercanas a
de electroforesis donde se evidencia la digestión con la enzima los telómeros), aunque en ocasiones están presentes en
Bgl II para el polimorfismo TNFR1-383 A>C y se identifican algunas regiones intracromosómicas.
diferentes genotipos: AA (135 y 64 pb), que identifica el homo-
cigoto para corte de la enzima de restricción; AC (199, 135 y Asimismo, a lo largo de la secuencia de ADN es posible
64 pb), donde se observa un heterocigoto, el cual muestra una encontrar secuencias en las que se repiten de 2 a 9 pb, deno-
banda sin corte debido a que no hubo reconocimiento por la minados microsatélites, o repeticiones de 10 a 60 pb, llama-
enzima, y otro par de bandas que muestran el corte enzimático dos minisatélites, que son más útiles para estudios de
por el reconocimiento del sitio de restricción, y CC (199 pb), identificación que los satélites. Su identificación se lleva a
que muestra al homocigoto sin corte, es decir, que no presenta cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
el sitio de reconocimiento para el corte por la enzima, y por lo con iniciadores específicos que flanquean el sitio de la
tanto, ambos alelos se evidencian con una sola banda. secuencia donde están localizados los mini o microsatélites,
y su variación se identifica de acuerdo con el número de
miento de la enzima de restricción en ambos alelos, en uno secuencias repetidas presentes, que puede ir desde dos
solo o en ninguno de ellos (figura 18-3). repeticiones hasta cientos. Los mini o microsatélites se
encuentran muy distribuidos a lo largo del genoma, aunque
El hecho de poder diferenciar homocigotos de heteroci- los minisatélites, en particular, se localizan con frecuencia
gotos mediante este tipo de polimorfismos permite definir cerca de la región telomérica. Se consideran polimorfismos
a los RFLP como codominantes; es decir, que ambos alelos codominantes, de tal forma que un heterocigoto generará
se manifiestan sin dominar la expresión de uno sobre el dos bandas en un corrimiento electroforético, mientras que
otro. Sin embargo, a pesar de que los RFLP son prueba de los homocigotos generarán sólo una banda con tamaño
que existe variación heredable en el ADN, este tipo de poli- variable, de acuerdo con el número de repeticiones existen-
morfismos suele ser dif ícil de encontrar, y en todo caso, tes en el individuo (figura 18-4).
sólo permite determinar si se presenta o no un sitio poli-
mórfico en una secuencia específica. Por ello, su utilización Estas regiones de ADN repetidas en bloque o en tán-
en el diagnóstico indirecto es limitada, ya que normalmente dem están sujetas a procesos como duplicación o recombi-
presentan un número de alelos bajo. nación, por lo que pueden ser altamente variables y diferir
mucho entre individuos, lo que las convierte en marcadores
Satélites, microsatélites y minisatélites genéticos muy informativos.

El ADN satélite se define como secuencias repetitivas de Polimorfismos con número variable de repeticiones con-
tamaño variable, que pueden ir desde los 100 a los 200
nucleótidos repetidos en bloque uno tras otro (en tándem), tinuas o en tándem, y con repeticiones cortas y continuas

Los VNTR y STR se consideran microsatélites o minisatéli-
tes, es decir, loci que corresponden a secuencias cortas de
ADN (un par o trío de bases), repetidas en bloque o tándem
un número específico de veces. La longitud de estas secuen-
cias puede ser de pocas bases hasta algunas decenas de

CAPÍTULO 18 • Polimorfismos de ADN y huella genética 175

Alelo 1 Polimorfismos genéticos F1 D,G Abuelos
Alelo 2 VNTR A,F B,C E,H
Alelo 3
3 repeticiones F2 Padres
F,G C,H
6 repeticiones

10 repeticiones

Sonda (southern blot) Unidad repetida en tándem

F,3 Hijos
F,C C,F F,H
Figura 18-5. Análisis de VNTR. Se muestra el análisis de VNTR
en alelos de diferentes individuos, en el cual se observa la A
variación en el número de secuencias repetidas en bloque o B
tándem, que será distintivo para cada individuo, de acuerdo C
con el marcador evaluado. D
E
nucleótidos, y la cantidad de repeticiones determinará la F
variabilidad de alelos distintos en un mismo locus. Así, en G
un mismo cromosoma pueden existir regiones con diferen- H
te número de repeticiones en la población (figura 18-5).
Figura 18-6. Identificación de parentesco. De acuerdo con el patrón
Estos polimorfismos se localizan con frecuencia en de bandeo de un análisis de marcadores heredados de padres
regiones intrónicas o no codificantes, su longitud es varia- a hijos se realiza la identificación del parentesco.
ble, de entre 20 y 100 pb repetidas y su variabilidad es alta
dentro de las poblaciones, lo que permite su uso confiable polimorfismos de utilidad serían secuencias específicas del
en la identificación de individuos. cromosoma Y, las cuales se identifican mediante amplifica-
ción de regiones determinadas, utilizando iniciadores espe-
Debido a que los polimorfismos son heredables, una cíficos.
persona podrá presentar VNTR heredados de su madre y
padre, pero no podría presentar VNTR que sus padres no La secuencia de la heterocromatina del cromosoma Y es
tengan. De esta manera, las secuencias repetidas de un indi- variable y a lo largo de la molécula se han identificado secuen-
viduo presentan un patrón único, y mientras más VNTR cias repetitivas tipo microsatélites, como repeticiones AC.
sean analizados más distintivo e individualizado será el per- Además, hay que considerar que el índice de mutación para
fil o patrón polimórfico obtenido, tal como las huellas dac- el cromosoma Y es muy bajo y no tiene implicaciones nega-
tilares, sólo que a escala molecular (figura 18-6). tivas para la reproducción, de manera que son variaciones
muy útiles para identificar parentescos o rastrear descen-
El análisis con STR se basa en los microsatélites y se dientes por línea paterna. Esto también ha servido, en los
diferencian en motivos repetidos, denominados perfectos estudios evolutivos de la especie humana, para la determina-
cuando se presentan sin interrupción y de forma ordenada ción de un origen común, producto de una sola migración
(por ejemplo, TATATATATATATA); en caso contrario, se procedente de África.
trata de repeticiones interrumpidas (TATATAGCTATAT)
o combinadas (TATATAGCGCGCGCGCTATATA). Marcadores polimórficos mitocondriales

La desventaja principal de este tipo de polimorfismos es La mitocondria es un organelo celular que existe en múlti-
que no están distribuidos por todo el genoma, lo que limita ples copias según el tipo de célula. Las mitocondrias son
su uso para determinadas condiciones o enfermedades; sin exclusivamente de herencia materna, es decir, todos los des-
embargo, su aplicación ha sido amplia en pruebas de pater- cendientes tendrán en sus células mitocondrias de su madre.
nidad y en genética forense. Esto se debe a que en el momento de la fecundación el óvulo
conserva las mitocondrias en el citoplasma, mientras que las
Polimorfismos del cromosoma Y mitocondrias de espermatozoide, que se encuentran en el
cuello, entre la cabeza y la cola, se eliminan y no se integran
El cromosoma Y tiene recombinación genética con su homó- al interior del óvulo para la formación del embrión. Este
logo (cromosoma X) sólo en aproximadamente 1% de su método permite identificar a individuos de acuerdo con
secuencia; por ello, la porción no recombinante es de espe- parentescos por línea materna, ya que todos los hermanos,
cial interés, ya que contiene secuencias que no se encuentran hombres y mujeres, compartirán la misma información en
en otras regiones del ADN nuclear, además de que son pura- su ADN mitocondrial (ADNm).Las ventajas del análisis del
mente de herencia paterna a hijos varones.

Si el interés es determinar relaciones familiares de heren-
cia paterna, comparar familiares o descendientes varones, los

176 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

ADNm es que existen múltiples mitocondrias (1 × 103-1 × pero no si esta secuencia se presenta en múltiples alelos o
104 copias) por célula, cada una con varias moléculas de sólo en uno.
ADNm, caracterizado por ser una doble hebra circular y
tener un genoma pequeño (16569 pb, que codifica para 37 Polimorfismos de proteínas
genes). Además, este genoma presenta una alta tasa de
mutación (5 a 10 veces más que el ADN nuclear), lo que le Pueden realizarse estudios de polimorfismos de proteínas,
confiere hipervariabilidad. Este tipo de análisis es útil, sobre mediante la identificación de la secuencia de aminoácidos.
todo para análisis evolutivos, antropológicos o forenses, o Esto es especialmente útil para la diferenciación de isoenzi-
cuando no se tiene fácil acceso al ADN nuclear, éste está mas en el citoplasma celular, mediante la detección de
deteriorado o existe en ínfimas cantidades. mutaciones no sinónimas en el ADN, que ocasionarían que
la estructura primaria de la proteína tuviera variaciones,
Para llevar a cabo este tipo de análisis, es necesario aunque sin alterar su acción sobre un mismo sustrato, sino
extraer el ADNm. Para ello, se requiere amplificar regiones que sólo afectaría su afinidad por el mismo.
determinadas del ADNm, en particular las regiones hiper-
variables HV1 (16024-16035, 342 pb) y HV2 (73-340, 267 Este análisis se lleva a cabo mediante electroforesis,
pb), localizadas en la región control, que es la zona que basado en que, al cambiar en la secuencia un aminoácido
regula la transcripción de la molécula. Estos segmentos de por otro con propiedades fisicoquímicas diferentes (por
ADNm son luego secuenciados y comparados con mues- ejemplo, un aminoácido por uno básico, o uno polar por uno
tras de familiares provenientes por línea materna, por el no polar), la estructura final de la proteína sería diferente y
tipo de herencia mitocondrial, para detectar diferencias en sus patrones de migración en la electroforesis se verían
la secuencia génica. afectadas, ya que las cargas e interacciones entre aminoáci-
dos tendrían variaciones. Estas variantes se consideran
Insertion-deletion polimorfismos codominantes, ya que pueden tener función
proteica a la par de su homólogo silvestre.
Se han descrito polimorfismos que consisten en bases inser-
tadas o suprimidas. Las secuencias involucradas son peque- Este análisis es útil para identificar polimorfismos en pro-
ñas, en general de hasta 10 pb; sin embargo, es posible que se teínas que tienen función enzimática. Las variantes pue-
presenten secuencias de hasta 1000 a 1500 pb, como en el den dar diferente respuesta metabólica y ocasionar que
caso de la inserción de elementos transponibles o transposo- la homeostasis se altere. Hay que considerar, sin embargo, la
nes (fenómeno de transposición, presente en algunos genes influencia ambiental, ya que si ésta es mínima es más sencillo
que pueden moverse a través del genoma y reinsertarse en analizar las consecuencias de un polimorfismo en la activi-
lugares definidos en otra región cromosómica). dad de la enzima. Como ejemplo cabe mencionar las enzi-
mas metabólicas de la familia citocromo P-450 (CYP450),
Polimorfismos de secuencias aleatorias que intervienen en la transformación, neutralización y elimi-
nación de compuestos, por ejemplo, de los medicamentos.
Es posible analizar polimorfismos de fragmentos o secuen-
cias de ADN amplificado de forma aleatoria (Random Utilidad del análisis de patrones
Amplified Polymorphic ADN, RAPD). La ventaja de esta
técnica es que no se requiere conocimiento previo de la polimórficos o huella genética de ADN
secuencia ni sondas homólogas, como en los RFLP, lo que
la convierte en una opción como prueba tamiz. Los métodos de estudio, cada vez más precisos, permiten
llevar a cabo los análisis de marcadores genéticos casi con
En este caso, para la amplificación se utilizan iniciado- certeza absoluta. Sin embargo, el estudio de polimorfismos
res de 8 a 10 pb con secuencia aleatoria, de manera que, de requiere de conocimientos técnicos y científicos adecuados,
encontrarse las secuencias de complementariedad entre el además de una gran experiencia en la interpretación de los
iniciador y la muestra de estudio, puede amplificarse una resultados, a fin de que éstos sean confiables.
muestra representativa del genoma.
La creación de perfiles genéticos por medio de polimor-
Al realizar análisis por electroforesis se evidenciarán fismos se realiza con marcadores o regiones con patrones de
múltiples bandas que muestran fragmentos de ADN; es repetición definidas (micro o minisatélites). El perfil genético,
decir, si existiera homología en las secuencias éstas serían o huella de ADN, determinará el genotipo de un individuo de
amplificadas y evidenciadas como una sola banda, mientras acuerdo con los marcadores genéticos analizados. Cuanto
que si no existiera homología entre el iniciador y la muestra, mayor sea el número de marcadores analizados, mayor será la
debido a algún cambio en la secuencia que hiciera perder la certeza para la identificación del individuo o para la confir-
región de acoplamiento del iniciador, entonces el fragmento mación de la relación filial, lo que permite realizar estudios de
no amplificaría y no habría banda. Con este método no es paternidad, filogenéticos, o de genética forense o criminalísti-
posible diferenciar heterocigotos de homocigotos que pre- ca, para la identificación molecular de individuos.
senten la secuencia, ya que en ambos se presentaría la ban-
da en el gel, por eso se dice que es una prueba tamiz, ya que Los polimorfismos pueden asociarse directa o indirec-
sólo identifica si se encuentra la secuencia en la muestra, tamente a patologías o procesos de enfermedad específicos,

CAPÍTULO 18 • Polimorfismos de ADN y huella genética 177

o incluso servir para establecer asociaciones entre la pre- nar toxicidad, debido a la falta de uno de los alelos funcio-
sencia del polimorfismo con un gen defectuoso cercano a nales (lento) o por tener alelos que producen variantes poco
él, por estudios de desequilibrio de ligamiento o solamente funcionales de la enzima (isoenzimas) o carecer de la enzi-
como marcadores de susceptibilidad, en los que su identifi- ma (pobre). Por otro lado, un metabolizador rápido (o
cación permite establecer riesgos para el desarrollo de ultrarrápido) puede tener más de dos copias del alelo activo,
enfermedades multifactoriales. lo que produce enzimas altamente funcionales con activi-
dad enzimática acelerada, de manera que el compuesto se
Los polimorfismos conocidos y más útiles son general- metaboliza tan rápido que posiblemente pierda eficacia.
mente modificaciones puntuales de la secuencia de ADN.
Estas modificaciones se estudian principalmente para estu- También son importantes los polimorfismos de acetila-
dios de riesgo genético para diversas enfermedades, aunque ción de genes involucrados en el metabolismo de una gran
también se consideran las variaciones de secuencia de frag- variedad de compuestos con arilaminas e hidracinas, ade-
mentos de cromosomas, como las alteraciones cromosómi- más de carcinógenos. Estos compuestos son metabolizados
cas estudiadas en el cariotipo, los segmentos polimórficos por la enzima citosólica N-acetiltransferasa (NAT2), donde
en la heterocromatina del cromosoma Y, o las secuencias la identificación de polimorfismos se ha asociado con una
repetitivas, inserciones o deleciones, entre otras. Estas últi- función disminuida de la enzima. A esto se le conoce como
mas, si bien también sirven para el diagnóstico genético, fenotipo acetilador lento y conlleva riesgo o susceptibilidad
son más útiles para estudios de identificación familiar, filia- aumentada a padecer cáncer colorrectal o de vejiga.
ción, identificación de individuos en accidentes, criminalís-
tica y ciencia forense, entre otros. Para el diagnóstico genético, el estudio de polimorfis-
mos tipo SNP permite identificar variantes alélicas que se
La identificación de SNP tiene una gran importancia en han asociado con riesgo de presentar enfermedades, sobre
la investigación biomédica, ya que ha permitido conocer y todo multifactoriales. Estas determinaciones ayudan a esta-
entender el proceso de enfermedad, así como poder esta- blecer programas de prevención, ya que al ser multifacto-
blecer estrategias de tratamiento, control y prevención. rial, el componente ambiental tiene una gran importancia.
Así, si se sospecha o existe la certeza de tener variantes
Su aplicación clínica incluye, por ejemplo, la identifica- génicas de riesgo es posible hacer cambios en diversos fac-
ción de genotipo E4 del gen de apolipoproteína E humano tores del estilo de vida que puedan desencadenar la enfer-
(APOE), que se ha asociado con enfermedades del metabo- medad. Por ejemplo, diversos SNP se han asociado con la
lismo de lípidos y con susceptibilidad a desarrollar la enfer- predisposición a padecer diabetes tipo 2, entre ellos SNP en
medad de Alzheimer. el gen PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor
gamma o receptor de glitazona NR1C3, rs1801282 Pro12Ala,
En el gen del metil-tetrahidrofolato reductasa (MTHRF), C/G), receptor nuclear implicado en el metabolismo de glu-
involucrado en el metabolismo de folatos, se reconoce como cosa y en el catabolismo y almacenamiento de los ácidos
distintivo el polimorfismo Cis677Tre, que genera una enzi- grasos. El gen ENPP1 (ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfo-
ma termolábil menos activa. Esto produce niveles bajos de diesterasa 1 o PC1, rs1044498 Lis121Gln, C/A), que codifi-
folato en plasma y niveles elevados de homocisteína, lo que ca para una glucoproteína de membrana clase 2, se ha
está ligado a enfermedad cardiovascular. asociado con resistencia a la insulina. Además, el gen IL6
(interleucina 6, rs1800795 -174, G/C) es citocina con fun-
Los polimorfismos en enzimas metabolizadoras de fár- ciones biológicas diversas, incluida la respuesta inmune.
macos ocasionan diferencias en la respuesta al tratamiento Además, en muchos de los SNP asociados se han encontra-
y en efectos de éste entre pacientes, ya que la biotransfor- do variantes no sinónimas, de tal manera que el producto
mación de cada compuesto puede variar, según el genotipo génico de la secuencia modificada tendría una alta probabi-
del individuo. Los SNP en estas enzimas han servido para lidad de conferir alteraciones funcionales.
identificar de forma temprana efectos secundarios a fárma-
cos, incompatibilidad o resistencia a terapias y variación Por otro lado, la tipificación de genomas microbianos per-
en la eficacia de medicamentos. Todo esto ayuda al médico en mite determinar la distribución de los tipos microbianos en
la toma de decisiones de la terapéutica adecuada para cada determinada población, su patogenicidad y resistencia a trata-
paciente. A este proceso se le conoce como medicina perso- mientos o inmunogenicidad. Esto permite monitorizar pobla-
nalizada. ciones en riesgo de manera anticipada, identificar patrones de
transmisión y crear nuevos fármacos o vacunas.
Para la farmacogenética es de gran utilidad el estudio de
los genes CYP450, entre ellos el CYP2D6, que metaboliza Métodos de detección de patrones
una gran cantidad de fármacos y presenta múltiples varian-
tes alélicas. Se definen cuatro fenotipos, de acuerdo con la polimórficos o huella de ADN
actividad que presente su producto génico, es decir, si serán
metabolizadores rápidos, funcionales, lentos o pobres (sin A fin de encontrar secuencias específicas con un patrón
función enzimática). Todo ello conlleva implicaciones clíni- determinado que permitan el corte con enzimas de restric-
cas importantes. Por un lado, en un metabolizador lento o ción o que puedan hibridarse para su detección, se emplean
pobre la permanencia en la célula de los compuestos o sus
formas reactivas más tiempo del necesario podría ocasio-

178 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

varios abordajes comunes, basados en la homología de las para confirmar, por ejemplo, la situación legal de un menor,
secuencias de ADN con sondas específicas. su nacionalidad u origen, y también son útiles para determi-
nar la compatibilidad de órganos en trasplantes, así como
Según las reglas de Chargaff, el grado en el cual dos para definir el origen y/o la composición de alimentos; inclu-
secuencias de ADN se complementen o emparejan se le lla- so puede usarse en estudios evolutivos de poblaciones ani-
ma homología. Una complementariedad total entre dos frag- males salvajes o para postular hipótesis acerca de la genética
mentos de ADN demuestra una alta homología, mientras poblacional y las migraciones humanas a través del tiempo.
que una complementariedad sólo en una pequeña porción de
pares de bases pone de manifiesto una baja homología. A pesar de que este método de identificación mediante
la huella de ADN se considera equivalente al código de
Para detectar polimorfismos se pueden emplear diversas barras de un producto comercial, ya que cada persona tiene
técnicas el Southern blot es un método ideal para detectar un patrón genético específico, hasta ahora los VNTR sólo
polimorfismos en el ADN, ya que mediante el uso de sondas dan evidencia de probabilidad (mayor o menor) de que el
específicas para identificar secuencias repetidas (VNTR o patrón genético analizado sea homólogo o concuerde con
STR), localiza regiones de hibridación homólogas a una el de una persona en particular. Sin embargo, esta probabi-
secuencia de interés. Asimismo, la PCR con enzimas de res- lidad estaría definida como de homología de 1 en 2 mil
tricción y electroforesis permite localizar secuencias blanco millones, lo que no descarta la posibilidad de que no lo sea
(ver el capítulo 15, Técnicas de hibridación). o, lo que es más común, de que la técnica se haya llevado a
cabo de manera poco confiable y haya error o falsos positi-
Existe también una técnica en la cual, mediante PCR, se vos. Esto se ha abordado con prontitud y actualmente exis-
amplifican regiones polimórficas que incluyen varios poli- ten normas y reglamentaciones universales de seguridad y
morfismos (AmpFLP). Esta técnica se ha automatizado y precisión en el análisis de huella de ADN, que permiten
permite estudiar y crear árboles filogenéticos, basados en minimizar el error técnico.
análisis comparativo de muestras de ADN individuales. Así,
pueden distinguirse VNTR de manera sencilla y a un costo Para solventar estos problemas es útil la automatización
relativamente bajo, lo que hace a este tipo de métodos de los procesos, así como el análisis de combinaciones de
populares aun en laboratorios o países con bajos recursos. polimorfismos raros (o poco comunes entre las personas).
Éstos permiten crear patrones que incrementan la probabi-
Para el análisis de STR, los loci con STR, en primer lidad de que las muestras en comparación efectivamente
lugar, se tratan con iniciadores específicos para amplificar coincidan, en el caso de identificar que provengan de la
fragmentos que contengan secuencias cortas (cuatro bases misma persona, o que correlacionen, en el caso de estable-
repetidas) con repeticiones continuas, para después ser cer relaciones biológicas familiares, considerando las varia-
separadas por electroforesis en gel o capilar, a fin de docu- ciones debido a diferencias en raza o etnia. Todo ello
mentar el número de repeticiones y distinguir patrones de involucra en gran medida a la genética de poblaciones para
repetición que puedan compararse y asociarse con un establecer relaciones entre líneas raciales.
estándar o blanco. Se debe contar con una secuencia de
referencia para establecer o descartar asociaciones, por En un futuro la huella del ADN podría ser una herra-
ejemplo, en una investigación criminal, contar con mues- mienta útil de identificación para todas las personas al
tras de ADN obtenidas de una víctima, para que puedan nacer, aunque sobre este tema todavía existe controversia
compararse con la muestra del sospechoso. respecto a asuntos bioéticos. Hasta el momento existen
bases de datos, sobre todo de carácter judicial, que permi-
Los STR son comunes, los comparten 5 a 20% de las ten identificar a sospechosos en juicios criminales, lo que
personas, lo que obliga a la búsqueda de combinaciones de deja fuera a todas las personas que no hayan pasado por
loci en reacciones multiplex, para lograr un método ade- algún proceso de este tipo. Se plantea que solicitar la huella
cuado de discriminación e identificación precisa, al consi- genética de cualquier persona sin alguna razón de carácter
derar siempre una secuencia base o de referencia con la cual penal podría considerarse discriminatoria. Esto sería fácil-
hacer la comparación. mente rebatible si la prueba se aplicase a toda persona al
nacer, ya que sería una forma de identificación personal
Controversias en el análisis válida y confiable; sin embargo, los costos que implica llevar
a cabo el análisis para cada persona aún son muy altos, lo
de la huella genética que lo vuelve de momento una alternativa no práctica y
poco viable.
La identificación de polimorfismos para establecer un
patrón genético o huella genética es útil en diversos campos Otra implicación de carácter ético se refiere al diagnós-
de estudio. Por ejemplo, en ciencias forenses permite com- tico genético, ya que realizar análisis de polimorfismos aso-
parar sospechosos mediante muestras de sangre, cabello, ciados a enfermedades produce resultados (positivos o
saliva o semen, a fin de determinar responsabilidad o exone- negativos) que atañen a la familia por completo y no sólo al
ración en juicios criminales. También es útil en la identifica- propositus o individuo en estudio. Ello, en ocasiones, ante
ción de restos humanos, familiares extraviados, pruebas de enfermedades o situaciones delicadas, genera conflictos
paternidad, identificación de inmigrantes o personas indo-
cumentadas, para establecer relaciones biológicas familiares

CAPÍTULO 18 • Polimorfismos de ADN y huella genética 179

entre lo que deben o no saber los demás miembros de la la identificación de factores de riesgo o predisposición a
familia y/o cuánto poder tiene el propositus para evitar que diversas enfermedades sería sumamente útil para la pre-
dicha información pueda difundirse o utilizarse para otros vención y el tratamiento adecuados de las enfermedades y
fines, de carácter comercial o legal que pudieran afectarle generaría beneficios médicos y socioeconómicos evidentes,
en su vida laboral o personal. Éste sería el caso si las compa- sin dejar de lado por supuesto el estudio y el control del
ñías aseguradoras pudieran definir primas específicas a factor ambiental, con grandes implicaciones en el desarro-
personas con determinado patrón genético. Por otra parte, llo y la expresión de cierto perfil genético.

Ejercicios de repaso F1 3,4 Abuelos
1,2 5,6 7,8
I. Identificación de fragmentos de restricción para genotipifi-
car de forma diferencial homocigotos de heterocigotos: F2 Padres
5,7
1. Indique en la línea inferior de cada carril los genotipos 1,4
correspondientes a los siguientes fragmentos de diges-
tión, para cada una de las muestras de los pacientes re- F3 Hijos
presentadas en el siguiente gel.
Fragmentos de digestión esperados: Genotipos
GG (131, 103, 60 pb), GC (163, 131,103, 60 pb), CC
(131 y 163 pb). 1
Enzima de restricción utilizada: BglII 2
Gel donde se muestra la digestión para el polimorfismo 3
TGFB1+915 C>G 4
5
Marcador 1 PACIENTES 5 6
25 pb 234 7
8

300 pb 2. Considere el siguiente análisis de marcadores de una fa-
275 pb milia y, tomando como base los alelos distintivos de am-
250 pb bos padres, identifique y explique la filiación de cada uno
225 pb de los hijos.
200 pb
175 pb Madre Padre Hijo 1 Hijo 2 Hijo 3 Hijo 4
150 pb
125 pb

100 pb

75 pb

50 pb

25 pb

II. Identificación de parentesco a partir de la herencia de ale-
los

1. De acuerdo con el siguiente patrón de bandeo, identifi-
que en la línea el genotipo de cada uno de los hijos en
esta genealogía.

180 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

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Parte III
Bases moleculares de
las enfermedades

Contenido

Capítulo 19 Bases moleculares de las patologías humanas
Capítulo 20 Enfermedades monogénicas
Capítulo 21 Bases moleculares del cáncer
Capítulo 22 Bases moleculares de la diabetes mellitus
Capítulo 23 Bases moleculares de la obesidad
Capítulo 24 Bases moleculares de la hepatitis B
Capítulo 25 Bases moleculares de la hepatitis C
Capítulo 26 Bases moleculares del virus de la inmunodeficiencia humana



Capítulo 19

Bases moleculares de
las patologías humanas

José Macías Barragán / Selene G. Huerta Olvera

Introducción clasificación, la enfermedad se encuentra dada por disfuncio-
nes celulares y/o tisulares, y genera cambios temporales o
El desarrollo tecnológico en la biología molecular y, en permanentes en el organismo así como variaciones en la fun-
especial, en la genética molecular ha abierto un sinf ín de ción de órganos y sistemas, que en último término se reflejan
ventajas clínicas indiscutibles en la práctica médica diaria. en forma de padecimiento, incluso aquellas debidas a otras
La sensibilidad y la especificidad de las técnicas usadas en el causas y que no se consideran de origen molecular.
diagnóstico directo de defectos genéticos o agentes etiopa-
togénicos asociados a los procesos mórbidos representan Existen diferentes tipos de diagnóstico de una enferme-
una herramienta valiosa en la medicina, a lo que hay que dad de acuerdo con la información analizada:
añadir la velocidad con la que se obtienen los resultados.
Por ello, es esencial conocer cómo el ADN se replica, se 1. El diagnóstico clínico se lleva a cabo a partir de la
transcribe y se traduce a proteínas (dogma central de la bio- observación médica (exploración), con el apoyo de los
logía molecular), así como los mecanismos de expresión datos de laboratorio (análisis clínicos, radiología e ima-
basal e inducible de genes en el genoma. Uno de los princi- gen, etc.), y se basa en un criterio fenotípico y de las
pales objetivos es conocer los mecanismos de regulación y manifestaciones bajo la forma de síndrome clínico.
expresión genética en los procesos de la enfermedad para
tratar de detenerla e incluso prevenirla, ya que mediante 2. El diagnóstico molecular de una enfermedad se basa
estudios genéticos pueden saberse las probabilidades de en criterios genotípicos que alteran la constitución del
que se presente en individuos susceptibles. genoma. Desde el punto de vista molecular, las enfer-
medades se pueden clasificar en: genéticas, exógenas y
A partir del descubrimiento en que se relacionó que mixtas. Esta clasificación no es aceptada de forma gene-
todas las enfermedades tienen una causa molecular, se han ralizada, debido a que no se conoce con precisión la
llevado a cabo grandes progresos para conseguir un trata- causa molecular de muchas enfermedades.
miento eficaz a dichas enfermedades. Cualquier enferme-
dad cursa, en mayor o menor grado, con alteraciones en la El objeto de estudio de la patología molecular es el
estructura, propiedades, metabolismo o función de una o conocimiento de la enfermedad desde el punto de vista de
varias biomoléculas. su alteración molecular para contribuir a su diagnóstico y
terapéutica. A principios del siglo xx se estableció la expre-
Entre las causas que pueden inducir una enfermedad se sión errores congénitos del metabolismo para describir alte-
encuentran agentes f ísicos (radiaciones, polvos, traumatis- raciones hereditarias presentes durante la vida del paciente,
mos, etc.), exposición a compuestos tóxicos (solventes, que afectan vías metabólicas específicas, debido a la ausen-
metales pesados, toxinas, etc.) o biológicos (virus, bacte- cia o a la falta de actividad de moléculas particulares (en su
rias, parásitos, etc.) y trastornos de origen genético cuya mayoría enzimas), como el albinismo, la alcaptonuria, cisti-
etiología radica en la información genética contenida en el nuria y galactosemia.
organismo.
El inicio sistemático de la patología molecular tiene
Según la biomolécula alterada, las enfermedades también lugar en el decenio de 1950, con las técnicas que permiten
pueden clasificarse en hormonales, inmunológicas, nutricio- el estudio de los cromosomas humanos y el conocimiento
nales y metabólicas, entre otras. Con independencia de su de su papel en el desarrollo sexual y de las anomalías cro-
mosómicas relacionadas.

183

184 PARTE III • Bases moleculares de las enfermedades

La genómica incluye el genoma, así como la aplicación Enfermedades monogénicas
de pruebas genéticas, para identificar las alteraciones res-
ponsables de una enfermedad. De manera análoga, la Enfermedades nucleares
transcriptómica y la proteómica definen el papel que des-
empeña el ARN y las proteínas en el inicio o establecimien- Enfermedades hereditarias causadas por la mutación o alte-
to de la enfermedad. ración de un solo gen (o locus). También se les conocen
como enfermedades mendelianas, ya que se transmiten en
Clasificación molecular de la descendencia según las leyes de Mendel. Se conocen más
de 6 000 enfermedades hereditarias monogénicas, con una
las enfermedades humanas prevalencia de un caso por cada 200 nacimientos. Si el alelo
anormal aparece en ambos cromosomas homólogos, el
Desde el punto de vista molecular, una enfermedad genéti- individuo es homocigoto para dicha alteración, mientras
ca es una situación causada por un cambio, llamado muta- que si lo hace en uno solo de los alelos cromosómicos se
ción, que se presenta durante la replicación, transcripción o denomina heterocigoto para la mutación.
traducción de uno o varios genes. En general, dicha altera-
ción interfiere con la producción de la proteína codificada Para su inclusión en este grupo, la enfermedad ha de
por el gen que presenta dicha mutación. Las enfermedades cumplir las siguientes características:
genéticas se transmiten de generación en generación debi-
do a que se originan por una alteración presente en las célu- • Debe estar determinada genéticamente; es decir, deber-
las madre, por lo que son de carácter hereditario. En se a mutaciones que alteran la secuencia o la organiza-
cambio, alteraciones en las células somáticas no son heredi- ción del genoma codificante.
tarias y sólo afectan al organismo que las desarrolla.
• Debe afectar a moléculas en cantidad, estructura, acti-
Las enfermedades genéticas pueden clasificarse según vidad o función. En especial, se alteran las proteínas, en
características específicas en alteraciones genéticas, según cantidad o en actividad.
su extensión: mutación puntual (es la alteración de un solo
nucleótido y la causa de las enfermedades monogénicas); • La alteración bioquímica que afecta a estructuras celu-
mutación mediana (normalmente tiene lugar en secuencias lares o vías metabólicas y causa la enfermedad debe ser
repetidas, como los satélites o microsatélites, e implica la dele- el resultado de las alteraciones en las moléculas.
ción o inserción de secuencias de más de dos nucleótidos), y
finalmente, mutación a gran escala (pueden ser cromosómi- Las alteraciones monogénicas generan múltiples enfer-
cas o citogenéticas, y afectan a cromosomas completos o a medades; entre las más conocidas se encuentran: albinis-
grandes fragmentos de ellos). Se distinguen translocaciones, mo, anemia falciforme, daltonismo, distrofia muscular de
deleciones o inserciones de fragmentos cromosómicos, ade- Duchenne, hemofilias o hipercolesterolemia familiar, entre
más de anomalías en el número de cromosomas de la célula. otras. Para obtener una mayor información acerca de estos
Las alteraciones numéricas se deben a segregación cromosó- temas se puede acceder por vía electrónica a la base de
mica errónea, mientras que las anomalías estructurales o cro- datos del OMIM (Online Mendelian Inheritence of Man;
mosomopatías lo hacen a reordenamientos cromosómicos. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim). Esta base de datos de
consulta en línea es un catálogo actualizado de genes huma-
Además, las enfermedades genéticas también pueden nos y alteraciones genéticas. El OMIM se centra principal-
clasificarse en alteraciones genéticas, según el genoma mente en las enfermedades genéticas heredables.
afectado, ya que pueden presentarse en el genoma nuclear
o mitocondrial; las primeras son más frecuentes, ya que el Algunos ejemplos de enfermedades monogénicas
tamaño del material genético nuclear es mayor. A su vez, las comunes son: anemia falciforme, fibrosis quística, enferme-
alteraciones genéticas nucleares pueden clasificarse según dad de Batten, enfermedad de Huntington (cromosoma 4),
el tipo de cromosoma afectado, ya que el defecto puede enfermedad de Marfan, hemocromatosis, deficiencia de
estar localizado en los cromosomas sexuales (cromosomas alfa-1 antitripsina, distrofia muscular de Duchenne, síndro-
X o Y) o en los cromosomas autosómicos (22 pares). Esta me de cromosoma X frágil, hemofilia A y fenilcetonuria.
distinción combinada con el carácter dominante o recesivo Cada enfermedad y gen tienen asignados un código de seis
con el que se expresa la enfermedad es la clasificación más dígitos. A este número se le denomina código MIM (heren-
sencilla y la empleada de forma más común en genética. cia mendeliana en el hombre, por sus siglas en inglés), en el
cual se concentran las alteraciones genéticas heredadas y
Sin embargo, clásicamente, desde el punto de vista no heredadas. Además, es una base de datos referente al
molecular, las enfermedades del ser humano se dividen en: proyecto del genoma humano. A esta información se acce-
1) enfermedades monogénicas o mendelianas (nucleares y de mediante el OMIM, que se actualiza a diario. Debido a
mitocondriales); 2) enfermedades exógenas, adquiridas o los avances científicos que inducen un constante reordena-
ambientales, y 3) enfermedades multifactoriales de origen miento de las diferentes enfermedades genéticas es más
complejo. aconsejable basarse en la versión on line que en la impresa.

Las enfermedades monogénicas (cuadro 19-1) se trans-
miten según los patrones hereditarios mendelianos y pue-
den clasificarse como:

CAPÍTULO 19 • Bases moleculares de las patologías humanas 185

Enfermedad autosómica dominante. Sólo se necesita un A. Patrón de herencia autosómica dominante
alelo mutado del gen para que la persona manifieste una
enfermedad autosómica dominante. Por lo menos uno de Padre Madre
los dos progenitores de una persona afectada padece la afectado no afectada
enfermedad y este progenitor tiene 50% de probabilidad de
transmitir el gen mutado a su descendencia, que manifesta- Gen mutado
rá la enfermedad (figura 19-1A). Gen normal

Enfermedad autosómica recesiva. Para que la enferme- 50% 50%
dad se manifieste, se requiere que los dos alelos del gen se Hijos afectados Hijos no afectados
encuentren mutados en la persona afectada, cuyos padres
en general no padecen la enfermedad, pero portan cada uno B. Patrón de herencia autosómica recesiva
al menos una copia del gen mutado, por lo que pueden
transmitirlo a la descendencia. La probabilidad de tener un Padre Madre
hijo afectado por una enfermedad autosómica recesiva portador portadora
entre dos personas portadoras de una sola copia del gen
mutado (que no manifiestan la enfermedad) es de 25% Gen mutado
(figura 19-1B). Una de las enfermedades genéticas más Gen normal
comunes e importantes de tipo autosómica recesiva son las
hemoglobinopatías, como por ejemplo la anemia falcifor- 25% 50% 25%
me, también llamada anemia drepanocítica o enfermedad de Hijos
la hemoglobina SS (Hb SS). Esta afección es el resultado Hijos Hijos portadores afectados
de la sustitución de adenina por timina en el gen de la glo-
bina beta, lo que conduce a una mutación de ácido glutámi- no afectados no afectados
co por valina en la posición 6 de la cadena polipeptídica de
globina beta y a la producción de una hemoglobina funcio- Figura 19-1. Patrón de herencia autosómica dominante A) y recesiva
nalmente defectuosa, la hemoglobina S. Debido al cambio B). Los rasgos autosómicos se asocian con un único gen en
de ese aminoácido, las moléculas de hemoglobina se agre- un autosoma (cromosoma no sexual). Se le llama dominante
gan formando fibras y dándole al hematíe su característica porque un solo ejemplar heredado de cualquiera de los padres
forma de hoz. Aunque esta enfermedad está presente al es suficiente para causar la aparición de este rasgo. El carácter
nacer, generalmente los síntomas no ocurren hasta después autosómico recesivo es un patrón de herencia de un rasgo, en-
de los cuatro meses de edad. Esta anemia puede volverse fermedad o trastorno que se transmite a través de las familias.
potencialmente mortal y los pacientes pueden presentar Para que un rasgo o enfermedad recesiva se manifieste, dos
“crisis” o episodios dolorosos y agudos causados por vasos copias del gen (o los genes) responsable (s) de la aparición de
sanguíneos bloqueados y órganos dañados. Se conocen ese rasgo o alteración tienen que estar presentes en el genoma
varios tipos de crisis: crisis hemolítica (cuando se dañan los del individuo.
glóbulos rojos), crisis de secuestro esplénico (cuando el bazo
se agranda y atrapa células sanguíneas) y crisis aplásica que la manifestación de la enfermedad es generalmente
(cuando una infección hace que la médula ósea deje de pro- más leve en mujeres que en varones, por la compensación
ducir glóbulos rojos). Estas crisis dolorosas, que ocurren en que realiza el alelo no-mutado en las mujeres (figura 19-2).
casi todos los pacientes en algún momento de sus vidas,
pueden durar de horas a días y afectar los huesos de la Los varones afectados sólo transmiten la enfermedad a
espalda, los huesos largos y el tórax. Algunos pacientes pre- sus hijas y sus hijos nacerán sanos. Estas enfermedades pue-
sentan un episodio con intervalos de unos cuantos años, den transmitirse a su vez de forma dominante (figura 19-2A)
mientras que otros, muchos episodios por año. Estas crisis o recesiva (figura 19-2B). En el cuadro 19-2 pueden observar-
pueden ser tan graves que requieren hospitalización para el se algunos ejemplos de estos tres tipos de enfermedades.
control del dolor. Además, las crisis repetitivas pueden oca-
sionar daños a los riñones, los pulmones, los huesos, el
hígado y el sistema nervioso central (figura 19-1).

Enfermedad ligada al cromosoma X. Se manifiesta en
las mujeres con una mutación en, por lo menos, uno de los
alelos de un gen presente en el cromosoma X, mientras en
los hombres se manifiesta en aquellos que presentan el alelo
mutado en el único cromosoma X que portan. Tanto los
hijos como las hijas de una madre afectada en uno de sus
alelos tienen 50% de probabilidades de estar afectados, aun-

186 PARTE III • Bases moleculares de las enfermedades

A. Patrón de herencia dominante ligado al cromosoma X

Padre Madre Padre Madre
afectado no afectada no afectado afectada

XY XX XY XX

XX XX YX YX XX XX YX YX

100% Hijas afectadas 100% Hijos no afectados 50% Hijas 50% Hijas 50% Hijos 50% Hijos
no afectadas afectadas no afectados afectados

B. Patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X

Padre Madre Padre Madre
afectado no portadora no afectado portadora

XY XX X Y XX

XX XX YX YX XX XX YX YX

100% Hijas 100% Hijos 50% Hijas 50% Hijas 50% Hijos 50% Hijos
portadoras no afectadas no afectados no portadoras portadoras no afectados afectados

Figura 19-2. Patrón de herencia autosómica dominante A) y recesiva B) ligada al cromosoma X. Los genes ligados al cromosoma X se encuen-
tran en el cromosoma sexual X y, tal como los genes autosómicos, tienen tipos recesivos y dominantes. Las alteraciones recesivas
ligadas al cromosoma X raramente se ven en mujeres y usualmente afectan únicamente a hombres. Esto se debe a que los hom-
bres heredan su cromosoma X (y todos los genes ligados a X) de su madre. Los padres únicamente pasan su cromosoma Y a sus
hijos varones, así que ningún rasgo ligado a X es pasado de padre a hijo. Las mujeres expresan alteraciones ligadas a X cuando
son homocigotas para el mismo y se convierten en portadoras cuando son heterocigotas