TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH KHOA ĐIỀU DƯỠNG – KỸ THUẬT Y HỌC BỘ MÔN XÉT NGHIỆM XÉT NGHIỆM VI SINH TRONG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm & Định lượng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
NHÓM BIÊN SOẠN Lê Tuấn Anh Trần Thị Cúc Nguyễn Hoàng Nhật Đông Hà Thị Huế Dương Trương Hoàng Bảo Duy Chung Trần Mỹ Duyên Mai Phùng Huyền My Nguyễn Thị Kiều Ngân Trương Thu Phương Nguyễn Trầm Như Quỳnh Nguyễn Hoàng Minh Tú GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Ths. Nguyễn Thị Ngọc Lâm
i MỤC LỤC MỤC LỤC...................................................................................................................................i MỤC TIÊU BÀI HỌC................................................................................................................ 1 PHẦN A: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS .......................... 2 TRONG THỰC PHẨM.............................................................................................................. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.......................................... 2 1. Clostridium perfringens..................................................................................................2 2. Ngộ độc thực phẩm do nhiễm C.perfringens .................................................................2 CHƯƠNG II: PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM.......... 3 1. Phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống[2] ..................................................................3 1.1. Nguyên tắc................................................................................................................3 1.2. Dụng cụ ....................................................................................................................3 1.3. Môi trường và hoá chất: ...........................................................................................3 1.4. Quy trình thực hiện ..................................................................................................3 1.5. Định lượng C.perfringens trong thực phẩm.............................................................4 2. Phương pháp hiện đại .....................................................................................................7 2.1. Phương pháp PCR phát hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm .................7 2.2. Sự lưu hành vi khuẩn Clostridium perfringens mang gen sinh độc tố CPA trong thịt và rau ăn lá ...................................................................................................................8 2.3. Phát hiện nhanh C.perfringens bằng kĩ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt..........................................................11 2.4. Phương pháp ELISA phát hiện hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm....17 PHẦN B: ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC...................................................................................................... 18 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN HIẾU KHÍ....................................................... 18 1. Khái niệm .....................................................................................................................18 2. Các loài vi khuẩn hiếu khí hiện nay .............................................................................18 3. Định lượng vi khuẩn hiếu khí.......................................................................................18 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC BẰNG KỸ THUẬT ĐỔ ĐĨA[2] ......... 19 1. Nguyên tắc....................................................................................................................19 2. Dụng cụ, môi trường, hóa chất .....................................................................................19 2.1. Dụng cụ ..................................................................................................................19 2.2. Môi trường .............................................................................................................19
ii 3. Quy trình kỹ thuật.........................................................................................................20 3.1. Pha loãng................................................................................................................20 3.2. Cấy - ủ ....................................................................................................................21 3.3. Đếm........................................................................................................................21 3.4. Kết quả ...................................................................................................................21 4. Trường hợp số đếm thấp...............................................................................................21 5. Một số lưu ý trong kỹ thuật ..............................................................................................22 5.1. Bước pha loãng ......................................................................................................22 5.2. Bước cấy - ủ ...........................................................................................................22 5.3. Bước đếm ...............................................................................................................22 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC BẰNG KỸ THUẬT CẤY BỀ MẶT [3] ...................................................................................................................................... 23 1. Nguyên tắc....................................................................................................................23 2. Dụng cụ, môi trường, hóa chất .....................................................................................23 2.1. Dụng cụ ..................................................................................................................23 2.2. Môi trường: Tương tự kỹ thuật đổ đĩa. ..................................................................23 3. Quy trình kỹ thuật.........................................................................................................23 3.1. Pha loãng: Tương tự kỹ thuật đổ đĩa......................................................................23 3.2. Cấy - ủ ....................................................................................................................23 3.3. Đếm........................................................................................................................23 3.4. Kết quả ...................................................................................................................23 4. Trường hợp số đếm thấp...............................................................................................23 CHƯƠNG IV: ƯU, NHƯỢC ĐIỂM CÁC PHƯƠNG PHÁP.................................................. 24 TÓM TẮT: ............................................................................................................................... 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................................iii
1 MỤC TIÊU BÀI HỌC 1. Trình bày được các kỹ thuật và các phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm. 2. Áp dụng sinh học phân tử vào phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm. 3. Trình bày được các kỹ thuật và nguyên tắc định lượng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 4. So sánh hai kỹ thuật đổ đĩa và cấy bề mặt trong định lượng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm.
2 PHẦN A: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 1. Clostridium perfringens Thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, kỵ khí, có hình que, sinh bào tử gây bệnh ở người, đặc biệt là các bệnh liên quan đến đường ruột, thường gặp trong thịt, cá nấu không chín kỹ, đồ đóng hộp không đảm bảo vô trùng, là một trong những tác nhân gây ra các bệnh liên quan đến thực phẩm phổ biến. Theo CDC, loài vi khuẩn này gây ra gần một triệu căn bệnh xuất phát từ thực phẩm mỗi năm tại Mỹ. [1] Một vài triệu chứng thường gặp khi mắc phải C.perfringens như là tiêu chảy phân nước, đau thắt vùng bụng, gây hoại tử ruột non, đi phân ra máu, nôn mửa và sốt là triệu chứng không thường gặp,… Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn, khoảng từ 2 - 24 giờ và bệnh tự hết sau khoảng 1 ngày.[1] Hình 1. Clostridium perfringens 2. Ngộ độc thực phẩm do nhiễm C.perfringens C.perfringens có khả năng sinh ra bào tử, đây là dạng không hoạt động của vi khuẩn giúp chúng tồn tại ở nhiệt độ cao, khô ráo và các điều kiện môi trường khác. Vì thế sau khi bệnh nhân ăn thực phẩm có chứa C.perfringens, có thể bị nhiễm độc tố ruột do vi khuẩn tạo ra dẫn đến tiêu chảy và các triệu chứng khác. Ngộ độc thực phẩm do C.perfringens thường là nhiễm trùng nhẹ. Trong đó, viêm dạ dày ruột nhẹ là phổ biến nhất, với các triệu chứng xuất hiện từ 6 đến 24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm; các trường hợp nặng hoặc tử vong hiếm khi xảy ra. Một số loại thực phẩm dễ bị ô nhiễm C.perfringens thường liên quan đến dịch bệnh bao gồm thịt và gia cầm, đặc biệt là khi chúng được nấu với số lượng lớn và không được làm lạnh hoặc hâm nóng đầy đủ. Các món hầm, nước thịt và thịt hầm cũng được biết đến là thực phẩm có nguy cơ cao vì chúng cung cấp môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn.
3 Từ khóa: Clostridium perfringens, ngộ độc thực phẩm. CHƯƠNG II: PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 1. Phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống[2] 1.1. Nguyên tắc Vi khuẩn C.perfringens khi ở trong môi trường thạch TSC (Tryptose Sulfide Cycloserin), điều kiện kỵ khí sẽ phát triển thành khuẩn lạc có màu đen. Lúc này ta sẽ chọn những khuẩn lạc điển hình và xác định tính chất sinh hóa. Khi làm sinh hóa định danh, vi khuẩn C.perfringens sẽ mang tính di động, chuyển hóa nitrat thành nitrit, lên men lactose và hóa lỏng gelatin. 1.2. Dụng cụ - Que cấy vô trùng - Nồi cách thủy - Bình nuôi cấy kỵ khí - Pipet chia độ (1/5/10 mL) - Đĩa petri 1.3. Môi trường và hoá chất: - Thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC) - Môi trường Iron - Milk - Môi trường lactose - gelatin - Canh thang nuôi cấy nha bào - Dung dịch thioglycolat - Dung dịch đệm glycerin - salt - Nước muối đệm pepton 9‰ - Thuốc nhuộm Gram 1.4. Quy trình thực hiện 1.4.1.Nhuộm Gram Hình 2. Quy trình nhuộm Gram
4 1.4.2.Sinh hoá, định danh Để sinh hóa định danh C.perfringens sử dụng môi trường thử tính di động nitrat và môi trường lactose - gelatin. Các phép thử khẳng định sinh hóa định danh bao gồm: tính di động, chuyển hóa nitrat thành nitrit, lên men đường lactose và hóa lỏng gelatin. Tính di động và chuyển hóa nitrat thành nitrit, cấy đâm sâu từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường nitrat để thử tính di động. Ủ trong điều kiện kị khí ở 37oC trong 24 giờ. Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu. Để kiểm tra sự có mặt của nitrit, nhỏ 0,2 - 0,5mL thuốc thử phát hiện nitrit vào từng ống môi trường nitrat. Với môi trường lactose-gelatin, môi trường chuyển sang màu vàng và có sinh hơi cho thấy có sự lên men lactose. Để kiểm tra sự hóa lỏng gelatin, làm lạnh các ống trong 1 giờ ở 5 oC. Nếu môi trường đông đặc thì ủ thêm 24 giờ để kiểm tra sự hóa lỏng gelatin. Hình 3. Kết quả thử sinh hóa định danh của vi khuẩn C.perfringens Bảng 1. Giải thích kết quả sinh hoá A A1 Di động (-) Chuyển hoá nitrat (-) Đối chứng âm A2 Lên men lactose (-) Hoá lỏng gelatin (-) B C D B1, C1,D1 Di động (+) Chuyển hoá nitrat (+) Clostridium perfringens B2, C2, D2 Lên men lactose (+) Hoá lỏng gelatin (+) 1.5. Định lượng C.perfringens trong thực phẩm 1.5.1. Nguyên lý
5 Là xác định số lượng vi khuẩn C.perfringens mọc trên đĩa thạch và được khẳng định có trong một gam hoặc một mililit mẫu, bằng phương pháp đếm khuẩn lạc thông qua kỹ thuật đổ đĩa. 1.5.2. Chuẩn bị mẫu thử Mẫu được xay nhỏ hoặc cắt nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất. Lưu ý, đối với mẫu thực phẩm nếu xét nghiệm sau 8 giờ phải được bảo quản trong dung dịch muối đệm - glycerin (Buffer glycerin Salt Solution - BGS) bằng cách ngâm thực phẩm trong dung dịch BGS theo tỷ lệ 1:1, bảo quản trong điều kiện lạnh -20oC và cần phải làm tan đông trước khi xét nghiệm. 1.5.3. Pha loãng mẫu Hình 4. Quy trình pha loãng mẫu 1.5.4. Tiến hành BƯỚC 1: Cấy một lượng mẫu quy định vào các đĩa petri đã đánh dấu nồng độ pha loãng - Dùng pipet vô trùng hút 1mL mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1mL huyền phù ban đầu ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào chính giữa đĩa petri, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa. - Rót vào mỗi đĩa 10mL đến 15mL thạch SC được duy trì ở 44°C đến 47°C trong nồi cách thủy và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10mL của cùng loại thạch SC. Để cho đông đặc lại.
6 Hình 5. Cấy mẫu và đổ môi trường BƯỚC 2: Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37°C trong 20 giờ ± 2 giờ Lưu ý : Thời gian ủ kéo dài có thể làm cho các đĩa bị quá đen. BƯỚC 3: Định lượng các khuẩn lạc điển hình - Sau giai đoạn ủ, chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. - Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa - Tính số lượng vi khuẩn C.perfringens/1g thực phẩm bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng. - Chọn năm khuẩn lạc điển hình và sử dụng trong các phản ứng sinh hoá nhằm xác định C.perfringens. Lưu ý: Nếu các khuẩn lạc phân bố trên đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại. BƯỚC 4: Xác định hình thể và tính chất bắt màu - Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục và canh thang nha bào. - Ủ ấm 35oC/18 - 24 giờ. Thu được canh trùng thuần nhất. - Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để xem hình thể và tính chất bắt màu. C.perfringens là trực khuẩn ngắn, bắt màu thuốc nhuộm Gram, Gr (+). - Phát hiện khả năng sinh nha bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy: trực khuẩn ngắn, tròn đầu, giữa có khoảng trắng sáng không bắt màu thuốc nhuộm. BƯỚC 5.1: Thực hiện các phản ứng sinh hoá để định loài tương tự mục 1.4.2 BƯỚC 5.2: Thử nghiệm Iron – Milk Lấy 1mL canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm môi trường Iron – Milk. Đun cách thuỷ 46oC/2giờ.
7 1.5.5. Tính kết quả [3] Tính số vi khuẩn có trong 1g mẫu bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ C.perfringens có trong hai đĩa thạch hoặc ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10. Làm tròn số các kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước nó; nếu chữ số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên một đơn vị. Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x , trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với hai chữ số có nghĩa. Ví dụ: Độ pha loãng 10-2 Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc Như vậy, trong 1 gam thực phẩm có 1,2*102 vi khuẩn C.perfringens. 2. Phương pháp hiện đại 2.1. Phương pháp PCR phát hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm 2.1.1. Nguyên liệu - Taq PCR, master Mix kit - Cặp mồi: mồi xuôi, mồi ngược (bảng 3) - Nước tinh khiết không có nuclease - Dung dịch đệm TAE hay TBE - Ethidi bromua hay chất nhuộm màu SYBR green - Loading dye & DNA 2.1.2. Chuẩn bị mẫu Mẫu kiểm tra là vi khuẩn Clostridium perfringens đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu ở tủ ấm trong điều kiện yếm khí có bổ sung CO2 từ 24 - 48 giờ. Đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là Clostridium perfringens/ chủng Clostridium perfringens chuẩn. 2.1.3. Tách chiết DNA Các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng kit thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit test thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 - 4 khuẩn lạc hòa vào 100L nước vô trùng không chứa các enzyme Rnase và SE (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 phút. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm với gia tốc 12000 vòng trong 4 phút. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện PCR. 2.1.4. Tiến hành - Có thể sử dụng kit test thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nên sử dụng Multiplex PCR kit. - Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt. - Đối chứng dương: tách chiết từ vi khuẩn Clostridium perfringens.
8 - Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn. - Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen. 2.1.5. Chạy điện di Sản phẩm PCR được chạy liên tục trên thạch agarose 1,5% đến 2% trong dung dịch đệm TAE hay TBE. Cho 2L dung dịch loading dye vào 8l sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10L thang chuẩn vào một giếng. Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hay TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) trong thời gian 30 đến 40 phút ở 100V. Sau đó nhuộm bằng dd ethidi bromua 0,2mg/100mL. Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe DNA gel stain của hãng invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất. 2.1.6. Kết quả Phản ứng dương khi: - Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm. - Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch. - Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương. Phản ứng âm khi: - Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm. - Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch. - Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương. Bảng 2. Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR xác định độc tố α, β, ε, ι Độc tố Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước sản phẩm (bp) Chu trình nhiệt α CPA Fw GCTAATGTTACTGCCGTTGA 324 95°C, 10 phút; 40 chu trình: (94°C, 30 giây; 53°C, 90 giây; 72°C, 90 giây) 72°C, 10 phút. CPA Rv CCTCTGATACATCGTGTAAG β Cpb Fw GCGAATATGCTGAATCATCTA 196 Cpb Rv GCAGGAACATTAGTATATCTTC ε Etx Fw GCGGTGATATCCATCTATTC 655 Etx Rw CCACTTACTTGTCCTACTAAC ι lap Fw ACTACTCTCAGACAAGACAG 446 lap Rw CTTTCCTTCTATTACTATACG Vi khuẩn C.perfringens được xác định là type A khi PCR dương tính với độc tố a; âm tính với độc tố β, ε, ι. Vi khuẩn C.perfringens được xác định là type C khi PCR dương tính với độc tố a và β; âm tính với độc tố ε.[4] 2.2. Sự lưu hành vi khuẩn Clostridium perfringens mang gen sinh độc tố CPA trong thịt và rau ăn lá
9 2.2.1. Hóa chất và dụng cụ Nghiên cứu sử dụng các hóa chất chính sau: đệm peptone (BD, Mỹ), thạch TSC (Merck, Đức), thạch Chromagar C.difficile (Chromagar, Pháp), BHI broth (Merck, Đức), kháng sinh (D-cycloserin, cefoxitin, taurocholate - Sigma, Đức), hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR master mix 2x (Thermo); thang ADN kích thước từ 50 bp đến 1.000 bp (Thermo), agarose điện di ADN (Thermo), đệm tải mẫu 6x (Thermo), huốc nhuộm ADN (Intron), đệm TAE 1X (Thermo), đĩa petri vô trùng (Corning, Mỹ), que cấy vô trùng (Biologix, Mỹ). 2.2.2. Chủng chuẩn Nghiên cứu sử dụng chủng chuẩn C.perfringens ATCC 13214 cho quá trình định lượng C.perfringens, chủng C.perfringens phân lập từ mẫu ngộ độc có ký hiệu V.95 cho quá trình khuếch đại gen CPA. Chủng này đã được định danh bằng kỹ thuật ion hóa theo cơ chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser với sự trợ giúp của chất nền (MALDI TOF) và kỹ thuật giải trình tự gen xác định loài và xác định gen gây độc trước khi tiến hành thử nghiệm. Phương pháp khối phổ (MS - Mass spectrometry) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu vật bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. MALDI là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng laser (Matrix - assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn. Dòng Laser - ToF của hệ thống MALDI cung cấp bởi SAI là dải sản phẩm ứng dụng mạnh mẽ và lý tưởng cho việc phân tích các phân tử hữu cơ phân đoạn lớn như phân tử sinh học và polyme. Phương pháp MALDI - TOF và MALDI - TOF MS thường được sử dụng cho các mẫu protein đơn giản, và khá tinh sạch. Ưu điểm là có thể giải chuỗi axit amin mảnh peptit và đo chính xác khối lượng, nhưng nó lại không thích hợp cho việc phân tích hỗn hợp protein phức tạp. 2.2.3. Thiết bị Nghiên cứu sử dụng các thiết bị chính sau: nồi hấp (Hymaraya, Nhật), tủ ấm (Memert, Đức), tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh), máy đồng nhất mẫu (Anh), máy PCR (Biorad), máy điện di, máy giải trình tự Sanger (Thermo). 2.2.4. Xác định vi khuẩn C.perfringens mang gen sinh độc tố Xác định vi khuẩn C.perfringens mang gen CPA bằng kỹ thuật PCR dựa trên độ dài đoạn gen khuếch đại. Sử dụng cặp mồi đã được công bố bởi tác giả Mohiuddin và cộng sự vào năm 2020. Chạy phản ứng PCR với trình tự mồi CPA - F (5’- GCTAATGTTACTGCCGTTGA) và CPA - R (5’- CCTCTGATACATCGTGTAAG - 3’), cho sản phẩm khuếch đại 324 bp. Chu trình phản ứng PCR: Biến tính DNA: 94°C/10 phút; 40 chu kỳ: Biến tính DNA 94°C/45 giây, gắn mồi 55°C/90 giây; kéo dài chuỗi 72°C/90 giây; và giai đoạn ổn định 72°C/10 phút. Điện di sản phẩm khuếch đại trên gel 2%.
10 Sự lưu hành của vi khuẩn C.perfringens mang gen CPA mã hóa protein độc tố α. Tất cả 109 khuẩn lạc C.perfringens sau khi định danh được tiến hành phản ứng PCR khuếch đại gen CPA mã hóa protein CPA. Kết quả khuếch đại gen chỉ cho thấy sự hiện diện của gen CPA mã hóa protein độc tố α trong 109 khuẩn lạc đã thu thập. Kết quả của nghiên cứu cho thấy 100% chủng C.perfringens mang gen CPA mã hóa độc tố α, tương đồng với các nghiên đã được thực hiện bởi các nghiên cứu tại nhiều nước trên thế giới. Năm 2020, tác giả Nguyễn Thị Thắm và cộng sự thực hiện nghiên cứu về sự hiện diện của C.perfringens mang gen sinh độc tố trên đường tiêu hoá của đà điểu tại Việt Nam vào năm 2020 cho thấy 116 chủng C.perfringens phân lập được từ 318 mẫu phân và 105 cơ quan tiêu hóa. Trong số 80 dòng phân lập từ mẫu phân, 33 dòng phân lập từ đà điểu khỏe mạnh và 47 dòng phân lập từ đà điểu bị bệnh. Kết quả multiplex PCR cho thấy tất cả 116 chủng Clostridium perfringens từ đà điểu khỏe mạnh và bị rối loạn đường ruột đều mang gen mã hóa độc tố α (CPA). Điều này cho thấy sự hiện diện nguy cơ con người có thể tiếp xúc mầm bệnh C.perfringens mang gen sinh độc tố α. Hình 6. Đoạn khuếch đại gen cpa (324 bp) M: thang DNA 50 bp HM5, HM6, HM12, HM20, B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm DNA vi khuẩn P: Chủng đối chứng Clostridium perfringens; N: Chủng đối chứng âm Clostridium difficile Sự hiện diện của gen CPA mã hóa độc tố α trong tất cả các chủng C.perfringens được phân lập từ người bệnh cho thấy rằng độc tố α đóng vai trò quan trọng trong việc gây nhiễm trùng các vi khuẩn này. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng độc tố α là yếu tố quyết định độc lực chính trong các trường hợp hoại tử khí và độc tố này có thể đóng một vai trò trong một số bệnh khác ở động vật và con người như bệnh Crohn ở người và viêm ruột hoại tử ở gia cầm. Độc tố α là nguyên nhân gây ra bệnh hoại tử cơ ở người khi vết thương hở của người bệnh tiếp xúc với lượng lớn C.perfringens mang độc tố. Do đó, kết quả nghiên cứu này cũng là một cảnh báo đối với các nhà nông cần tránh sự tiếp xúc giữa vết thương hở và các nguồn chứa vi khuẩn như đất, nước tưới, cây trồng, nước thải làm tăng nguy cơ bị hoại tử cơ và nhiễm trùng nghiêm trọng.[5]
11 2.3. Phát hiện nhanh C.perfringens bằng kĩ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Nghiên cứu này ứng dụng kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt để phát hiện nhanh Clostridium perfringens. RPA có thời gian phản ứng nhân bản DNA đích ngắn, thực hiện chỉ tại một nhiệt độ, đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả đã xác lập được một quy trình phát hiện chính xác. Từ khóa đặc trưng của C.perfringens trong thời gian 25 phút tại nhiệt độ 38°C, nhạy hơn 10 lần so với kĩ thuật PCR, tạo tiền đề cho việc phát hiện trực tiếp C.perfringens trên các loại mẫu thực phẩm. Các phương pháp truyền thống phát hiện loài vi khuẩn thực phẩm bao gồm C.perfringens dựa trên nuôi cấy vi sinh, phân lập tế bào, và sinh hóa, cùng các phương pháp chẩn đoán phân tử, PCR với độ chính xác, tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Tuy nhiên, các phương pháp này còn có những hạn chế tiêu tốn thời gian, cần thiết bị luân nhiệt, kĩ thuật viên có kinh nghiệm và khó thực hiện tại thực địa. RPA thay thế quy trình biến nhiệt của phương pháp PCR, bao gồm ba protein chính trong đó protein tái tổ hợp (recombinase) T, UvsX làm tách mạch DNA sợi đôi ban đầu, protein liên kết DNA sợi đơn T, gp32 giúp mồi gắn vào vị trí tương đồng trên DNA mục tiêu, sau đó DNA polymerase (Sau hoặc Bsu polymerase) hoạt động kéo dài mồi tổng hợp mạch khuếch đại tạo sản phẩm và toàn bộ quá trình phản ứng có thể xảy ra chỉ tại một nhiệt độ. Kĩ thuật RPA là một công cụ phân tử hiệu quả, xác định các tác nhân gây bệnh một cách chính xác, nhanh chóng - phản ứng xảy ra trong khoảng thời gian (10 + 30) phút, tiết kiệm chi phí do chuẩn bị mẫu đơn giản, nhiệt độ thấp (25 + 42)°C, không cần máy điều nhiệt và tiện lợi do có sẵn các bộ kit thướng mại đông khô. Ngoài ra, có các phương pháp đọc kết quả RPA khác nhau điện di gel agarose, huỳnh quang định lượng thời gian thực (Real-time quantitative fluorescence) và que thử lateral flow - đơn giản dùng đọc kết quả RPA dựa trên nguyên tắc kháng nguyên - kháng thể, theo đó sản phẩm RPA sẽ được đánh dấu bằng một kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể có trong que thử, nhờ đó phản ứng dương tính sẽ thể hiện vạch trên que thử và có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường. 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và tách chiết DNA C.perfringens được nuôi cấy trong môi trường TSB ở nhiệt độ 37°C. Tế bào vi khuẩn được thu nhận bằng li tâm 10.000 rpm trong 5 phút; DNA bộ gen vi khuẩn được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB. DNA tách chiết được bảo quản trong dung dịch TE 1X tại nhiệt độ -20°C dùng làm mạch khuôn cho các thí nghiệm. 2.3.2. Thiết kế mồi Trình tự mồi RPA đặc trưng cho C.perfringens được thiết kế bằng phần mềm Primer3. Sau khi kiểm tra các thông số mồi và khả năng phát hiện của mồi bằng PCR in silico và NCBI Blast, cặp mồi CF, CR với trình tự thể hiện tại Bảng 1 được lựa chọn, đoạn gen mục tiêu được khuếch đại bởi cặp mồi này có kích thước 230bp.
12 Bảng 3. Trình tự mồi đặc trưng cho C.perfringens 2.3.3. Phương pháp PCR Thành phần phản ứng PCR bao gồm 0,4 µM mồi CF, 0,4 µM mồi CR, 4 µL 5X Mytaq reaction buffer, 0,4 µL enzyme 2 µL DNA mạch khuôn và nước sinh học phân tử. Phản ứng được thực hiện với 30 chu kì nhiệt 94°C/ 30 giây, 61,6°C/ 30 giây và 72°C/ 20 giây. Sản phẩm PCR được xác định bằng phương pháp chạy điện di trên gel agarose. 2.3.4. Phương pháp RPA Phản ứng RPA được thực hiện với bộ kit TwistAmp® Basic (TwistDX), phản ứng RPA bao gồm 2,4 µL mồi CF (10 µM), 2,4 µL mồi CR (10 µM), 29,5 µL dung dịch đệm hoàn nguyên TwistAmp® rehydration buffer, 2 µL DNA mạch khuôn và nước sinh học phân tử. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ (35 - 40)°C trong thời gian (15 - 40) phút. Kết quả được phân tích bằng phương pháp điện di gel agarose. 2.3.5. Kết quả kiểm tra hoạt động của mồi Bộ mồi RPA được thiết kế đặc trưng cho C.perfringens được kiểm tra khả năng hoạt động bằng phản ứng PCR thông thường và phản ứng RPA với DNA bộ gen được tách. Kết quả được thể hiện tại cho thấy sản phẩm PCR tạo thành có kích thước lớn hơn 200 bp so với thang chuẩn, tương đồng với kích thước sản phẩm được thiết kế, đồng thời chứng âm không có sản phẩm tạo thành thể hiện trên gel điện di. Kết quả cho thấy bộ mồi được thiết kế có khả năng khuếch đại đúng DNA mục tiêu và có thể sử dụng cho các khảo sát tiếp theo trong nghiên cứu. . Hình 7. Kết quả PCR kiểm tra hoạt động của mồi và DNA tách chiết. Trong đó (+) phản ứng chứa DNA tinh sạch của C.perfrigens, (-) chứng âm, dùng nước sinh học phân tử thay cho DNA mục tiêu.
13 DNA đã tách chiết được dùng làm mạch khuôn để thực hiện phản ứng RPA trên Twist Amp® Basic kit với protocol RPA. Tinh sạch sản phẩm RPA bằng dung dịch Phenol: Chlorofrom: Isoarmyl Alcohol. Kết quả sản phẩm RPA song song với sản phẩm PCR. Kết quả điện di sản phẩm RPA so với sản phẩm PCR được thể hiện tại Hình 8. Hình 8. Kết quả kiểm tra thành phần phản ứng RPA với DNA bộ gen C. perfringens được tách chiết. Trong đó RPA sản phẩm khuếch đại bằng RPA; PCR sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp PCR; Ladder thang DNA 100 bp Kết quả điện di cho thấy, vạch kết quả của phản ứng RPA trên vị trí thang 200 bp, đúng với kích thước sản phẩm mong muốn, đồng thời kích thước sản phẩm RPA cũng tương đồng với kích thước sản phẩm của phản ứng PCR trước đó. Vì thế, cặp mồi đã sử dụng hoàn toàn phù hợp cho cả 2 phương pháp RPA và PCR để khuếch đại DNA vi khuẩn C.perfringens. Kĩ thuật RPA sử dụng DNA tách chiết, mồi được thiết kế phát hiện thành công đoạn gen mục tiêu của C.perfringens. 2.3.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng RPA
14 Hình 9. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng RPA Trong nghiên cứu này phản ứng RPA được khảo sát ở các mốc nhiệt độ (35, 37, 38, 39 và 40°C). Khảo sát được lặp lại 3 lần. Kết quả điện di khảo sát sản phẩm của phản ứng RPA tại các nhiệt độ khác nhau cho thấy xuất hiện các vệt sáng với cường độ khác nhau tại các nhiệt độ phản ứng khác nhau. Sản phẩm tạo ra tại nhiệt độ phản ứng 38°C thể hiện vạch sáng rõ nét, không có sự khác biệt về độ sáng ở sản phẩm ở nhiệt độ cao hơn. Vì thế, nhiệt độ 38°C là nhiệt độ tối ưu cho phản ứng RPA, nhiệt độ này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.7. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng RPA Thời gian kéo dài của phản ứng RPA quyết định tới số lượng DNA sản phẩm được hình thành trong phản ứng. Trong nghiên cứu này, thời gian phản ứng được khảo sát trong khoảng thời gian (15 ÷ 40) phút với các mốc phản ứng cách nhau 5 phút. Các phản ứng RPA này đều được thực hiện ở 38°C với cùng một nồng độ DNA khuôn. Khảo sát được lặp lại 3 lần. Kết quả khảo sát phản ứng RPA tại mốc thời gian khác nhau cho thấy xuất hiện các vạch sản phẩm khác nhau tại các mốc thời gian khác nhau.
15 Hình 10. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng RPA. Trong đó, các vạch sáng thể hiện sản phẩm RPA được thực hiện tại các mốc thời gian (15 + 40) phút. Ladder thang DNA 100 bp. Thời gian tối thiểu để phản ứng RPA xảy ra có thể hiện vạch sáng lên gel điện di là 25 phút; đồng thời lượng sản phẩm tạo ra không có sự thay đổi lớn từ phút 25 của phản ứng. Kết quả là có sự đồng nhất giữa các lần khảo sát. Vì thế thời gian 25 phút được lựa chọn để thực hiện các phản ứng RPA tiếp theo trong nghiên cứu. 2.3.8. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của RPA đối với DNA tách chiết Giới hạn phát hiện của phản ứng được khảo sát với DNA tách chiết có nồng độ 1 ng được pha loãng bậc 10 về các nồng độ (100 + 10) pg và thực hiện phản ứng RPA với các điều kiện phản ứng được tối ưu trước đó để khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng. Kết quả khảo sát (Hình 11B) cho thấy, phản ứng RPA có thể xảy ra với lượng DNA thấp nhất là 1 pg có trong phản ứng. Đồng thời, kết quả quả có thấy RPA nhạy hơn phản ứng (Hình 11A), PCR thông thường 10 lần thể hiện ưu thế phản ứng nhanh nhạy của RPA trong nghiên cứu này. Hình 11. Khảo sát giới hạn phát hiện của RPA và PCR. Trong đó A giới hạn phát hiện phản ứng PCR; B giới hạn phát hiện phản ứng RPA
16 2.3.9. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của mồi đối với DNA tách chiết Tính đặc hiệu của bộ mỗi dành cho phản ứng RPA được đánh giá bằng việc thực hiện phản ứng RPA với các chúng vi khuẩn gần gần gũi bao gồm vi khuẩn S.enterica, S.aureus, P.aeruginosa, L.monocytogenes và B.cereux, các chủng vi khuẩn này là các loại phổ biến gây ngộ độc thực phẩm; đồng thời thể hiện các triệu chứng gây độc trên người với nhiều điểm tương đồng C.perfringens. Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp RPA được tối ưu trong nghiên cứu này có thể phân biệt trình tự gen mục tiêu của C.perfringens so với các vi khuẩn trên, RPA chỉ khuếch đại khi DNA mục tiêu C.perfringens có trong phản ứng. Kết quả cho thấy, bộ mồi lựa chọn thực hiện phương pháp RPA đã được tối ưu có tính chuyên biệt cao cho C.perfringens. Hình 12. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi RPA. Trong đó 1 C.perfringens; 2 S.enterica; 3 S.aureus; 4 P.aeruginosa; 5 L.monocytogenes và 6 B.cereus. 2.3.10. Kết luận Vi sinh thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu trong lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm hiện nay, trong đó C.perfringens là một trong những vi sinh vật phổ biến hàng đầu, gây nên nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam. Thực tế cho thấy việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm luôn đòi hỏi phát triển các kĩ thuật mới nhanh, chính xác, đơn giản và có thể thực hiện tại chỗ trong điều kiện hạn chế về thiết bị. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp RPA để phát hiện nhanh C.perfringens. Dựa trên nguyên lí khuếch đại của PCR với việc sử dụng hai mồi, RPA kết hợp các loại protein tái tổ hợp và DNA polymerase để thực hiện khuếch đại đoạn gen mục tiêu tại một nhiệt độ cố định. Nghiên cứu đã thành công trong việc phát hiện C.perfringens bằng phản ứng RPA trong thời gian phản ứng 25 phút tại nhiệt độ 38°C. Phản ứng có khả năng phát hiện 1 pg DNA tinh sạch của C.perfringens, nhạy hơn 10 lần so với PCR
17 khi sử dụng cùng một bộ mồi. Các kết quả này thể hiện khả năng ứng dụng cao của phương pháp RPA trong vi sinh thực phẩm, đồng thời tạo tiền đề phát triển các bộ kit phát hiện nhanh trong các nghiên cứu tiếp theo. [6] 2.4. Phương pháp ELISA phát hiện hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm Hình 13. Phương pháp ELISA Đĩa plate 96 giếng đã được làm nhạy bằng kháng thể đơn dòng đặc hiệu đối với độc tố β C.perfringens. Sau đó, độc tố β của C.perfringens được thêm vào các đĩa vi thể này. Người sử dụng bộ kit sẽ gửi huyết thanh và huyết tương xét nghiệm đã được pha loãng trước đó vào các giếng của khay vi thể. Sau 2 giờ ủ và bước rửa sạch, người vận hành thêm chất liên hợp, đây là một kháng thể đơn dòng đặc hiệu chống lại độc tố β C.perfringens kết hợp với peroxidase. Sau khi ủ và rửa chế phẩm, người vận hành thêm chất nhiễm sắc tetramethylbenzidine (TMB). Nhiễm sắc thể này có ưu điểm là nhạy hơn các nhiễm sắc thể peroxidase khác và không gây ung thư. Cường độ màu tỷ lệ nghịch với hiệu giá huyết thanh của mẫu. Huyết thanh dương tính và âm tính được cung cấp kèm theo bộ kit để có thể xác nhận kết quả xét nghiệm.[7] Từ khóa: Định lượng C.perfringens, đếm đĩa thạch, PCR, CPA, RPA, DNA tách chiết.
18 PHẦN B: ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1. Khái niệm Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc phải có oxy để tạo ra năng lượng, tăng trưởng, sinh sản và hô hấp tế bào. Những sinh vật này không tồn tại được trong điều kiện thiếu oxy hoặc ngập lụt. 2. Các loài vi khuẩn hiếu khí hiện nay Bacillus sp.: gồm cả hai loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và tùy nghi. Chúng bao gồm các chủng sống tự do hoặc gây bệnh. Nhiều loài Bacillus sp. được sử dụng thương mại để sản xuất enzyme và nghiên cứu gen. Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn gây bệnh gây bệnh lao, là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, đặc trưng bởi sự hiện diện của một lớp sáp trên thành tế bào. Nocardia sp.: một số có khả năng gây bệnh, trong khi số khác thì không. Lactobacillus sp.: vi khuẩn hiếu khí tùy nghi. Vi khuẩn này có ứng dụng trong việc đóng gói và lên men các mặt hàng thực phẩm và thường được tìm thấy trong khoang miệng và ruột mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào. Pseudomonas aeruginosa: gây bệnh ở người và động vật. Ngoài các chủng đã đề cập ở trên, danh sách các vi khuẩn hiếu khí bao gồm Staphylococcus sp. (tùy nghi) và Enterobacteriaceae sp. (tùy nghi) trong số những loài khác.[8] 3. Định lượng vi khuẩn hiếu khí Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong môi trường. Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm có thể sử dụng kỹ thuật đổ đĩa và nuôi cấy trải lên bề mặt thạch. Sau khi lấy một lượng mẫu thử và nuôi cấy mẫu trên môi trường theo quy định, ủ hiếu khí ở nhiệt độ thích hợp 37 ± 1°C trong thời gian từ 72 giờ, ta tiến hành đếm số khuẩn lạc trên các đĩa petri để xác định được lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường tương đương với số lượng vi sinh vật trong 1mL hoặc trong 1g mẫu sản phẩm thực phẩm. Để đếm được kết quả chính xác thì số lượng vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn từ 25 đến 250 khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn phải tiến hành pha loãng theo các đậm độ pha loãng phù hợp. Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc giúp đánh giá chất lượng của mẫu thực phẩm liên quan tới vi sinh vật, về nguy cơ hư hỏng, thời gian bảo quản của thực phẩm cũng như mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, sản xuất, bảo quản thực phẩm.
19 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC BẰNG KỸ THUẬT ĐỔ ĐĨA[2] 1. Nguyên tắc Lượng quy định của mẫu thử dạng lỏng hoặc lượng quy định của huyền phù ban đầu trong trường hợp các sản phẩm ở dạng khác, được rót vào đĩa petri và trộn với môi trường nuôi cấy thạch tan chảy quy định. Chuẩn bị các đĩa khác dưới cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. Các đĩa được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30°C trong 72 giờ. Tính số lượng vi sinh vật trong một gam hoặc một mililit mẫu thử theo số lượng khuẩn lạc thu được trong các đĩa có chứa ít hơn 300 khuẩn lạc. 2. Dụng cụ, môi trường, hóa chất 2.1. Dụng cụ - Thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) hoặc thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) - Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ± 1°C - Nồi cách thủy điều chỉnh nhiệt độ 45 ± 10°C - Đĩa petri thủy tinh đường kính 90 - 100 mm - Ống nghiệm 16mm x 160mm - Bình thuỷ tinh 250 – 500mL - Pipet vô trùng chia độ xả hết có dung tích 1mL và 10mL, được chia vạch 0,1 và 0,5 mL tương ứng - pH kế hoặc có độ chính xác ± 0,1 đơn vị ở 25°C - Cân phân tích - Đèn cồn - Thiết bị đếm khuẩn lạc 2.2. Môi trường Thành phần môi trường sử dụng: Plate count agar (PCA), pH = 7,0 ± 0,2 Hình 14. PCA - Pepton từ casein: 5g - Cao nấm men: 2,5g - Glucose tinh khiết: 1,0g - Thạch: 9 - 18g - Nước cất : 1000ml 2.2.1. Chuẩn bị: - Hoà tan các thành phần môi trường, đun nóng nước để hoà tan nhanh hơn. - Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C.
20 - Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống từ 12mL- 15mL hoặc vào bình hay chai và hấp tiệt trùng ở 121°C/ 15 phút. - Nếu môi trường được sử dụng ngay thì để nguội 44°C - 47°C trong nồi cách thuỷ, sử dụng càng sớm càng tốt, không nên để quá 4h. - Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở nơi khô ráo, tối với nhiệt độ 5 ± 3°C không quá 3 tháng. Và khi cần sử dụng thì làm tan chảy hoàn toàn môi trường và thực hiện cách bước như sử dụng ngay.[11] 2.2.2. Dịch pha loãng: Hình 15. Peptone water 3. Quy trình kỹ thuật 3.1. Pha loãng Cân một lượng m(g) hoặc đong một thể tích V(mL) của phần mẫu thử đại diện cho vào một chén đựng vô trùng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng. Cho một lượng dịch pha loãng gấp 9 lần m(g) hay V(mL). Để các hạt to lắng xuống trong 15 phút, nếu cần. Dùng pipet vô trùng lấy 1mL huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng. Trộn kỹ, tốt nhất là dùng máy khuấy cơ để trộn trong 5 giây đến 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 . Nếu cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10-2 và các dung dịch pha loãng tiếp theo, thì dùng một pipet vô trùng mới ở mỗi độ pha loãng để thu được các dung dịch pha loãng 10-3 , 10-4 ,.v.v.. Hình 16. Phương pháp pha loãng [13]
21 3.2. Cấy - ủ Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 1mL nếu mẫu thử là chất lỏng hoặc 1mL huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác. Lặp lại quá trình ở các dịch pha loãng tiếp theo với pipet mới vô trùng. Nếu thích hợp chỉ chọn các độ pha loãng tới hạn (ít nhất hai dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy các đĩa petri sao cho thu được từ 10 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên một đĩa. Đổ vào mỗi đĩa 12 – 15mL môi trường thạch để đếm đĩa ở 44 - 47oC Trộn đều dịch nuôi cấy với môi trường thạch bằng cách xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái, phải. Để đĩa trên mặt phẳng cho thạch đông đặc lại. Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa VSV mọc lan trên mặt thạch thì đổ tiếp 4mL thạch đếm đĩa (ở nhiệt độ 44°C đến 47°C) lên trên bề mặt môi trường đã cấy mẫu, để ngăn ngừa hoặc giảm thiểu mọc lan. Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 30 oC ± 1oC. Ủ trong (72 ± 3) giờ. 3.3. Đếm Đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc sau 72h. Sự phân bố các khuẩn lạc phải hợp lý (độ pha loãng càng cao, số khuẩn lạc càng ít), khi không hợp lý cần tiến hành nuôi cấy lại. Các khuẩn lạc mọc lan được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Khi khuẩn lạc mọc lan: - Nếu ít hơn ¼ đĩa → đếm khuẩn lạc trên phần dĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. - Nếu quá ¼ đĩa → loại bỏ đĩa Cần thực hiện đếm trên ít nhất 1 đĩa có 10 ≤ khuẩn lạc ≤ 300. Tính số lượng vi khuẩn có trong mẫu thử (N) theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng: - Công thức: N = ∑ C V(n1+0,1 .n2)d - Trong đó: ∑C là tổng số khuẩn lạc trên hai đĩa petri có độ pha loãng liên tiếp. n1, n2 là số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn d là độ pha loãng tương ứng với n1 (d = 1 khi mẫu thử dạng lỏng không pha loãng) V là thể tích chất cấy được đưa vào mỗi đĩa (mL), thường là 1 (mL) 3.4. Kết quả Kết quả làm tròn đến hai chữ số có nghĩa: N = n.10x (1,0 ≤ n ≤ 9,9 ) 4. Trường hợp số đếm thấp Trường hợp có một đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc. Nếu đĩa chứa ít hơn 10 khuẩn lạc, nhưng có ít nhất 4 khuẩn lạc, thì tính kết quả như sau: N = ∑ C Vd và báo cáo kết quả là số ước tính N vi sinh vật trong một mL (sản phẩm lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác).
22 Nếu tổng số là từ 3 đến 1, thì kết quả được ghi như sau: "Có mặt các vi sinh vật nhưng ít hơn (4/Vd) trên gam hoặc mL". Trường hợp đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) không chứa khuẩn lạc nào. Nếu đĩa của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại không chứa khuẩn lạc nào, thì biểu thị kết quả như sau: “ít hơn 1/Vd vi sinh vật trong mL (sản phẩm dạng lỏng) hoặc ít hơn 1/Vd vi sinh vật trong gam (sản phẩm dạng khác)’’. 5. Một số lưu ý trong kỹ thuật 5.1. Bước pha loãng Cân bằng về tỷ lệ chất cấy/ môi trường cấy do có thể ức chế sự phát triển vi sinh vật do nồng độ các thành phần của thực phẩm tăng. Giữ nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng, tránh vi sinh vật bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột. Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với môi trường không vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút. Nếu nhiệt độ phòng của phòng thử nghiệm quá cao thì hai khoảng thời gian này phải giảm đi. 5.2. Bước cấy - ủ Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút. 5.3. Bước đếm Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Điều quan trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm; tuy nhiên, điều cần thiết là phải tránh đếm nhầm các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa với các khuẩn lạc chính. Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, sử dụng kính lúp có độ khuếch đại lớn hơn khi cần để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất. Trong một số trường hợp, có thể hữu ích khi bảo quản các đĩa đã cấy ở (3 ± 2)°C để sử dụng trong so sánh với các đĩa đã cấy và ủ trong khi đếm, để tránh đếm nhằm các hạt của sản phẩm là khuẩn lạc. Cũng có thể dùng kính lúp để phân biệt các hạt sản phẩm với các khuẩn lạc.
23 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC BẰNG KỸ THUẬT CẤY BỀ MẶT[3] 1. Nguyên tắc Lượng quy định của mẫu thử dạng lỏng hoặc lượng quy định của huyền phù ban đầu trong trường hợp các sản phẩm ở dạng khác, được rót lên bề mặt môi trường nuôi cấy thạch đặc trong đĩa petri. Chuẩn bị các đĩa khác dưới cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. Các đĩa được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30°C trong 72 giờ. Tính số lượng vi sinh vật trong một gam hoặc một mililit mẫu thử theo số lượng khuẩn lạc thu được trong các đĩa có chứa ít hơn 300 khuẩn lạc. 2. Dụng cụ, môi trường, hóa chất 2.1. Dụng cụ Các dụng cụ trong kỹ thuật đổ đĩa Que trải, que cấy 2.2. Môi trường: Tương tự kỹ thuật đổ đĩa. 3. Quy trình kỹ thuật 3.1. Pha loãng: Tương tự kỹ thuật đổ đĩa. 3.2. Cấy - ủ Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào tâm 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 0,1mL nếu mẫu thử là chất lỏng hoặc 0,1mL huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác. Lặp lại quá trình ở các dịch pha loãng tiếp theo với pipet mới vô trùng. Cẩn thận dàn đều chất cấy càng nhanh càng tốt lên khắp bề mặt đĩa thạch, không để bộ dàn mẫu chạm vào thành đĩa (cấy xoắn). Nếu có thể, sử dụng cùng một bộ dàn mẫu cho tất cả các độ pha loãng từ một mẫu có độ pha loãng cao nhất. Để các đĩa đậy nắp khoảng 15 phút ở nhiệt độ môi trường để chất cấy hấp thụ vào thạch. Lật úp các đĩa đã chuẩn bị rồi đặt vào tủ ấm ở 30°C. Ủ trong (72 ± 3 giờ). 3.3. Đếm Tương tự kỹ thuật đổ đĩa. 3.4. Kết quả Tương tự kỹ thuật đổ đĩa. 4. Trường hợp số đếm thấp Tương tự kỹ thuật đổ đĩa.
24 CHƯƠNG IV: ƯU, NHƯỢC ĐIỂM CÁC PHƯƠNG PHÁP Phương pháp đổ đĩa (Pour plate method): là phương pháp đếm tiêu chuẩn. Có vài nhược điểm là hạn chế số lượng tối đa của vi khuẩn trên môi trường do nhiệt độ ủ và thời gian xét nghiệm. Nhiệt độ môi trường 44 - 46°C có thể gây sốc nhiệt cho vi khuẩn và môi trường giàu dinh dưỡng có thể làm giảm sự phát triển của những vi khuẩn thiếu dinh dưỡng. Kỹ thuật cải tiến có thể khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp trải đĩa (Spread plate method): Không bị sốc nhiệt do nhiệt độ của thạch. Thêm vào đó, tất cả khuẩn lạc mọc trên mặt thạch có thể được nhìn thấy và đếm dễ dàng và cũng dễ phân biệt những khuẩn lạc riêng biệt hoặc những bong bóng khí. Kỹ thuật này có hạn chế chỉ sử dụng những mẫu thể tích nhỏ: 0,1 - 0,5mL phụ thuộc vào khả năng hấp phụ của thạch.[13] TÓM TẮT: Hình 17. Quy trình kỹ thuật đổ đĩa và trải đĩa[13] Từ khóa: Định lượng, vi khuẩn hiếu khí, khuẩn lạc, đổ đĩa, trải đĩa.
iii TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). About Clostridium perfringens Food Poisoning. April 3, 2024. Accessed May 1, 2024.https://www.cdc.gov/clostridiumperfringens/about/index.html. [2]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4991:2005 (ISO 7937 : 2004). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc. 2005. [3]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4991:2005 (ISO 7937 : 2004). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc. 2005. [4]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-28:2014. Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium perfringens. 2014. [5]. Tạ Thị Yến, Ninh Thị Hạnh, Vũ Thị Hải Hà, Phạm Văn Quân, Nguyễn Thành Trung. Sự lưu hành vi khuẩn Clostridium perfringens và Clostridium difficile mang gen sinh độc tố cpa, tcdA trong thịt và rau ăn lá. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm. 2023;6(1). https://doi.org/10.47866/2615-9252/vjfc.4047. [6]. Trần Hồng Diễm, Lâm Ngọc Ngân Anh. Phát hiện nhanh Clostridium perfringens bằng kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành. 2021;13. [7]. Công ty TNHH Quốc tế PTC Việt Nam. Bộ ELISA chẩn đoán huyết thanh độc tố Beta của Clostridium perfringens BIO K 317/2. January 10, 2024. Accessed May 1, 2024.https://ptchems.com/ch%C6%B0a%20ph%C3%A2n%20lo%E1%BA%A1i/ bo-elisa-chan-doan-huyet-thanh-doc-to-beta-cua-clostridium-perfringens-bio-k317-2/ [8]. Vi khuẩn hiếu khí là gì? Bao gồm những loại vi khuẩn hiếu khí nào?. TienLab. December 10, 2021. [9]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833- 1:2013). Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 1: đếm khuẩn lạc ở 30 độ c bằng kỹ thuật đổ đĩa. 2015 [10]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2:2013 đính chính kỹ thuật 1:2014). Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 2: Đếm khuẩn lạc ở 30 độ C bằng kỹ thuật cấy bề mặt. 2015. [11]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6507-1:2005 (ISO 6887-1 : 1999). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân. 2005.
iv [12]. Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật. 2016. [13]. Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Âu. Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; 2020.