หลักการทำงานของเครื่องUV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER

26/08/57

UV-Visible Spectroscopy (UV-Vis) สเปกโทรสโคปี (Spectroscopy)

By Supaporn Sangsrichan 1. บทนาํ
CH210 Analytical Chemistry 2. เทคนิคอลั ตราไวโอเลตและวสิ ิเบิลสเปกโทรสโคปี
(UV-VIS Spectroscopy)
Maejo University 3. ส่วนประกอบของเครืองอลั ตราไวโอเลตและวสิ ิ
เบิลสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (UV-VIS Spectrophotometer)
4. การประยกุ ตใ์ ช้ (Application)

2

สเปกโทรสโกปี แสง

 หมายถึง การแยก การตรวจสอบและการบนั ทึกพลงั งานทีเปลียนไป เกียวกบั  แสงเป็นคลืนชนิดหนึงซึงประกอบไปดว้ ยสนามแม่เหลก็ (magnetic field) และ
นิวเคลียส อะตอม ไอออน หรือโมเลกลุ สนามไฟฟ้ า (electric field) ทวี างตวั ตงั ฉากกนั และสามารถเคลือนทีได้ เราจึงเรียกวา่
“electromagnetic spectrum” ดงั รูป
 พลงั งานทีเปลียนไปนนั เนืองจากเกิด อีมิสชนั (Emission) การดูดกลืน (Absorption)
การกระเจิง (Scattering)

 ในธรรมชาติ สสารสามารถดูดกลืนแสง รังสี หรือแสงไดแ้ ตกตา่ งกนั ทาํ ให้วตั ถุ
เหลา่ นนั มีสีสันตา่ งกนั ไปดว้ ย นกั วิทยาศาสตร์จึงนาํ สมบตั ิเหล่านีไปใชเ้ ป็นวธิ ี
วเิ คราะห์

P0 Incident Absorbed transmitted Pt
radiation radiation radiation

Reflection (Pr) Scattering (Ps)

3 4

ช่วงของสเปคตรัมของคลืนแม่เหลก็ ไฟฟ้ า (Electromagnetic spectrum) ตวั อยา่ งสเปคตรัมของคลืนแม่เหล็กไฟฟ้ า

http://mynasadata.larc.nasa.gov/science-processes/electromagnetic-diagram/ 5 http://www.yorku.ca/eye/spectru.htm 6

1

26/08/57

ความสมั พนั ธ์ระหวา่ งพลงั งาน (E) กบั ความถี (frequency, ν (อา่ น nu)) ตวั อยา่ ง

E = hν = hc/λ 1. จงหาความถี (Hz) ของคลืนทีเคลือนทีในอากาศทีมีความยาวคลืนหนึง 5 cm ( = 6 ×
เมือ 103 MHz )

E = พลงั งาน 1 โฟตอน หน่วยเป็น J 2. รงั สีแมเ่ หลก็ ไฟฟ้ ามีเลขคลืน 3.125 × 104 cm-1 จงหาความถี (Hz) และความยาวคลืน
h = คา่ คงตวั ของพลงั ค์ (Planck’s constant) (nm) ( = 9.375 × 1014 Hz และl = 320 nm )

= 6.626 x 10-34 J s 3. จงคาํ นวณหาพลงั งานในหน่วย J ของรงั สีวสิ ิเบิลทีมีความยาวคลืน 300 nm (E = 6.626
= 6.626 x 10-34 m2 kg s-1 × 10-19 J)
= 6.62 x 10-27 เอิร์ก-วินาที (erg-s)
c = speed of light = 3 x 108 m s-1 4. จงหาพลงั งาน (J) และความถี (Hz)’ของรังสีทีมีความยาวคลืน 30 Å (= 1.0 × 1017
Hz และ E = 6.626 × 10-17 J) )
พลงั งานจะสูงขนึ เมือความถีสูงขึน
ความถีแปรผกผนั กบั ความยาวคลืน(wavelength; λ (lambda) 8

7

อลั ตร้าไวโอเลตและวสิ ิเบิลสเปกโทรสโกปี หลกั การดูดกลืนแสงยวู ี

เป็นเทคนิคทวี ดั การดูดกลืนแสงหรือรังสีในช่วงอลั ตร้าไวโอเลตและวสิ ิ เกิดจากการทีสารดูดกลืนแสงทีผา่ นเขา้ มา ทาํ ให้มีการเปลียนแปลงระดบั
เบลิ โดยมีชือเรียก “เครืองยวู วี สิ ิเบลิ ” พลงั งานของอิเลก็ ตรอน (Electronic transition) วงรอบนอกสุด (valence electron)

 ใชแ้ สงทีมีความยาวคลืนที 190-800 nm “อยใู่ นช่วง ยวู ี และ วสิ ิเบิล” หรืออิเล็กตรอนทีเกิดพนั ธะ (bonding electron) หรืออิเล็กตรอนทียงั ไมเ่ กิดพนั ธะ
 สารทีสามารถดูดกลืนรงั สีไดแ้ ก่พวกสารอินทรีย์ (Organic compound), (non-bonding electron)
การรบั พลงั งานของธาตหุ รือโมเลกุลแต่ละชนิดแตกตา่ งกนั ขึนอยกู่ บั ชนิดของ
สารประกอบเชิงซ้อน (Complex compound), สารประกอบอนินทรีย์ พนั ธะ ทาํ ใหเ้ ทคนิคนีมีความเลือกเฉพาะ และใชท้ งั ในคณุ ภาพวิเคราะห์และ
(Inorganic compound) ปริมาณวิเคราะห์
วิเคราะห์สารทงั ทีมีสี และไม่มีสี ในรูปธาตุหรือโมเลกลุ
วเิ คราะห์ทงั เชิงคุณภาพ (ตอ้ งใชร้ ่วมกบั เทคนิค IR, NMR spectroscopy) = hc/λ
และเชิงปริมาณ
10
9

Common functional groups

Energy  Compound l(nm) Intensity/ transition with lowest
Bonding Non bonding Anti bonding CH4
 CH3CH3 122 intense energy
CH3OH 130 intense
n CH3SH 183 200 s-s* (C-H)
n CH3NH2 235 180
CH3Cl 210 800 s-s* (C-C)
 CH3I 173 200
  * CH2=CH2 258 380 n-s* (C-O)
CH3COCH3 165 16000
  187 950 n-s* (C-S)
Energy diagram CH3CSCH3 273 14
p - p* (pi to pi* transition) CH3N=NCH3 460 weak n-s* (C-N)
n - p* (n to pi star transition) 347 15
s - s* (sigma to sigma star transition) n-s* (C-Cl)
n - s* (n to sigma star transition)
n-s* (C-I)

p-p* (C=C)

p-p* (C=O)

n-p* (C=O)

http://www.chem.ucla.edu/~bacher/UV-vis/uv_vis_tetracyclone.html.html 11 n-p* (C=S) 12
n-p* (N=N)

2

26/08/57

http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page1_3.html 13  ช่วงคลืนวทิ ยุ มีผลใหเ้ กิดการเปลียนแปลงทิศสปิ นของอิเลก็ ตรอน
 ช่วงคลืนไมโครเวฟ มีผลใหเ้ กิดการเปลียนแปลงทิศทางการหมนุ ของโมเลกลุ
 ช่วงรงั สีอินฟราเรด มีผลใหเ้ กิดการเปลียนแปลงการสันของโมเลกลุ
 ช่วงวสิ ิเบิลและยวู ี มีผลใหเ้ กิดการเปลียนแปลงระดบั พลงั งานของอิเลก็ ตรอนชนั นอก
 ช่วงรังสีเอก็ ซ์ มีผลใหเ้ กิดการเปลียนแปลงระดบั พลงั งานของอิเลก็ ตรอนชนั ใน
 ช่วงรงั สีแกมมา มีผลให้เกิดการเปลียนแปลงสภาวะของนิวเคลียส

ช่วงคลืนวสิ ิเบิลและอลั ตราไวโอเลต (Visible and Ultraviolet region) : อยใู่ นช่วงความถี
3x1014 ถึง 3x1016 Hz หรือมีความยาวคลืนประมาณ 1 µm ถึง 10 mm การเปลียนแปลง
ของพลงั งานทีเกียวขอ้ งเกิดจากการ เปลียนระดบั พลงั งานของอิเลค็ ตรอน ความแตกตา่ ง
ของระดบั พลงั งานของอิเลค็ ตรอน วงนอกสุดประมาณ100 kJ mol-1

14

Perceiving Color

Wavelength (nm) Absorbed color Complementary color

<380 Ultraviolet -

380 – 435 Violet Yellow-green

435 – 480 Blue Yellow

490 – 500 Blue-green Orange

500 – 560 Green Purple

560 – 580 Yellow-green Violet

580 – 595 Yellow Blue

595 – 650 Orange Green-blue

650 – 780 Red Blue-green

15 >780 Near-infrared - 16

ปัจจยั ทีมีผลตอ่ การดูดกลืนแสง 2. ออกโซโครม (auxochrome) เป็นกลุ่มของธาตุทีไม่ดดู กลืนแสง แต่
สามารถมีผลต่อ absorption spectrum ของโครโมฟอร์ทมี ีออกโซโครม
1. โครโมฟอร์ (Chromophore) คือโมเลกลุ ของสารอนิ ทรียท์ ีมีหมู่ฟังกช์ นั เกาะอยู่ ทาํ ให้เกิดผลดงั ต่อไปนี
แบบไม่เสถียร (Unsaturated functional group) ซึงดูดกลืนแสงในช่วงยวู -ี วสิ ิ
เบลิ และแสดงสมบตั ิของมนั มีดว้ ยกนั 3 แบบ เกิด Bathochromic shift (red shift) ทาํ ให้ spectrum เคลือนไปทางทีมีความยาว
คลืนมากขนึ (lmax เพมิ )
โครโมฟอร์ทีมี multiple bond ระหวา่ ง 2 อะตอมของธาตุ โดยไม่มีอิเลก็ ตรอนคู่
โดดเดียว เช่น C=C เกิด Hypsochromic shift (blue shift) ทาํ ให้spectrum เคลือนไปทางทีมีความ
ยาวคลืนลดลง (lmax ลด)
โครโมฟอร์ทีมี multiple bond ระหวา่ ง 2 อะตอมของธาตุ โดยไม่มีอิเลก็ ตรอนคู่
โดดเดียว เช่น C=O เกิด Hyperchromic effect ทาํ ใหเ้ กิดการดูดกลืนแสงมากขึน max เพมิ ขนึ )
เกิด Hypochromic effect ทาํ ให้เกิดการดูดกลืนแสงนอ้ ยลง maxนอ้ ยลง)
โครโมฟอร์ทีมี benzene ring ไดแ้ ก่สารประกอบพวกอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน
เช่น benzene, phenol 18

17

3

26/08/57

ปัจจยั ทีมีผลตอ่ การดูดกลืนแสง กฎของเบียร์ (Beer’s law) กล่าวไวว้ า่ “อตั ราการลดลงของความเข้ม
ของแสงทีถกู ดูดกลืน เป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของสาร”
3. ตวั ทาํ ละลาย (Solvent effect)
ตวั ทาํ ละลายทมี ีขวั เช่นสารอินทรียบ์ างทีมีหม่คู าร์โบนิล (C=O) ทาํ ใหเ้ กิดการ กฎของแลมเบิร์ต (Lambert’s law)“แสงทีมีความยาวคลืน
เคลือนไปของแถบการดูดกลืนพลงั งานเรียกวา่ solvent shift เดียวผ่านตัวกลางเนือเดียว สัดส่วนของความเข้มของแสงทีถกู ดดู กลืนไม่ขึนอยู่
4. สเตอริกของโมเลกลุ (Steric effect) กบั ความเข้มของแสง แต่จะขึนอย่กู บั ความหนาของตัวกลาง” ดงั นนั ตวั กลาง
ผลของโครงสร้างทมี ีความเกะกะทาํ ให้การเกิดอนั ตรกิริยาของอเิ ล็กตรอน ชนิดเดียวกนั ทีมีความหนาเท่ากนั จะดดู กลืนพลงั งานแสงไดเ้ ท่ากนั
เปลียนแปลงส่งผลให้การวดั การดดู การแสงเปลียนแปลงเช่นสารประกอบทีมี
หม่ฟู ังกช์ นั ใหญ่ๆ จะทาํ ให้ lmax เคลือนไปทางทีสนั กวา่ และค่า max กฎของเบียร์ แลมเบิร์ต (Beer-Lambert’s law): ความเขม้ ของแสงที
ลดลง ถกู ดดู กลืนขึนอยกู่ บั ความเข้มข้นและความหนาของสารละลายตัวกลาง

19 A = bc

20

Beer Lambert’s Law

Transmittance, T = P / P0 A = bc (Beer’s and lambert’s law)
% Transmittance, %T = 100 T
Absorbance, โดยที
A = แอบซอร์บแบนซ์ (Absorbance)
A = log10 P0 / P  = Molar absorptivity (L mole-1 cm-1)
A = log10 1 / T b = ความกว้างของเซลล์ เป็ น (cm)
A = log10 100 / %T C= ความเข้มข้นเป็ นโมลาร์ (mole L-1)
A = 2 - log10 %T

A = abc 22
a = absorptivity กรณี ความเข้มข้นเป็ นหน่วยอนื เช่น g/L

21

เครือง UV-Vis จะทาํ การวเิ คราะห์ไดถ้ กู ตอ้ งมากทสี ุด เมือวดั ตัวอย่างโจทย์
เปอร์เซนตท์ รานสมิตแทนซ์ (%T) ได้ 30.5% จงคาํ นวณวา่ ท%ี T ดงั กวา่
จะมีค่าการดดู แสง (Absorbance) เท่ากบั เทา่ ไหร่ 1. สารละลายชนิดหนึง ดูดกลืนแสงร้อยละ 40 ทีความยาวคลืน 200 nm สารละลายนี
ใชส้ ารอินทรียท์ ีมีมวลโมเลกลุ เท่ากบั 400 g mol-1 หนกั 0.1 mg ละลายในเฮกเซน 25
จาก εbc = -logT = A cm3 ในการวดั การดูดกลืนแสงใชเ้ ซลลท์ ีมีความหนา 1 cm จงคาํ นวณหาคา่ molar
%T= 30.5 % T= 30.5/100 absorptivity ของสารละลายนี (ตอบ  = 4.0 x 104 L mol-1 cm-1)

A = -log T 2. สารละลายชนิดหนึงวดั คา่ absorbance ได้ 0.6 จงหา %T (ตอบ 25.12%)

= -log (30.5/100) การบ้าน: สารละลายชนิดหนึงมีความเขม้ ขน้ เท่ากบั 0.0010 โมลาร์ จากการ
ทดลอง โดยใชเ้ ทคนิคสเปกโทรสโคปี พบวา่ สารละลายดงั กลา่ วมีคา่ Transmission
= -log (0.305) เทา่ กบั 0.10 และความกวา้ งของเซล เทา่ กบั 10 มิลลิเมตร จงหาคา่ Absorbance
และคา่ molar absorptivity ของสารละลายนี
= -(-0.5157)
24
= 0.516

Absorbance = 0.516 ตอบ 23

4

26/08/57

เครือง UV-VIS spectrometer  การวดั ปริมาณของแสงทถี ูกดูดกลนื ทาํ ได้โดยการให้ลาํ แสงผ่านเข้าไป
ในสารตัวอย่าง (Po) แล้ววดั ปริมาณของแสงทผี ่านทะลุ (P) โดย
องคป์ ระกอบ เปรียบเทยี บกบั แสงทใี ห้ (Po)

ประกอบดว้ ย 5 ส่วนหลกั P0 P

1. ตน้ กาํ เนิดแสง (Light source) 26
2. โมโนโครมาเตอร์ (Monochromator)
3. เซลลใ์ ส่สารตวั อยา่ ง (Cell compartment) 25
4. มาตรแสง (Detector)
5. เครืองบนั ทึกและอ่านผล (Readout system)

ขอ้ กาํ หนด 1. ตน้ กาํ เนิดแสง (Light source)

แสงทใี ชต้ อ้ งเป็นแสงเอกรงค์ (monochromatic radiation) ลกั ษณะตน้ กาํ เนิดแสง (Light source)
ช่อง slit ตอ้ งแคบจึงจะให้การวดั ทีมีประสิทธิภาพ
ตอ้ งไม่มีแสงหลงมาจากแหล่งอืน (stray light)  ตอ้ งใหก้ าํ ลงั พอทีจะวดั ดว้ ยมาตรวดั แสง
กระบวนการดูดกลืนแสงตอ้ งไม่ขึนแก่กนั นนั คือ สารละลายตอ้ งเจือจาง
สารละลายทนี าํ ไปวดั ตอ้ งเป็นเนือเดียวกนั ตอ้ งแผร่ ังสี (radiation) ออกมาตลอด
สารละลายตอ้ งไม่ข่นุ ไม่เป็นตะกอน ไม่เป็นคอลลอยด์ ในช่วงความยาวคลืนทีตอ้ งการ

27 ตอ้ งให้การแผร่ ังสีคงที (Po คงที)

ตวั อยา่ งของตน้ กาํ เนิดแสงไดแ้ ก่ tungsten lamp
หลอดไฮโดรเจน หรือ หลอดดิวเทอเรียม
deuterium lamp
(deuterium lamp) 185-375 nm
หลอดทงั สเตน 320-2500 nm 28
หลอดไอปรอท 365 nm
หลอดซีนอน 250-600 nm

2. โมโนโครมาเตอร์ (monochromator) 2.3.1 ฟิ ลเตอร์ เป็นโมโนโครมาเตอร์ทีง่ายสุด
กระจกสีต่างๆ เป็นแผน่ ใหค้ วามกวา้ งของแถบคลืนแสง 25 nm
เป็นส่วนทีใชค้ วบคมุ แสงทีออกมาจากตน้ กาํ เนิดแสง โมโนโครมาเตอร์จะทาํ ใหแ้ สง 29
โพลีโครเมติกกลายเป็ นแสงโครเมติกทีเป็ นแถบแสงแคบๆ อินเตอร์เฟอเรนซ์เป็นฟิ ลเตอร์ทีฉาบดว้ ยสารทีมีค่าดรรชนีหกั เหตาํ และเป็นไดอิเล็กท
ริกฟิ ลเตอร์
ประกอบดว้ ย
2.3.2 ปริซึม (Prism) เป็นตวั ทีทาํ ใหแ้ สงเกิดการกระจายเป็นความยาวคลืนตา่ งๆ แลว้
2.1 ช่องแสงเขา้ (entrance slit) เพอื ปลอ่ ยใหแ้ สงมีความแรงพอ ดงั นนั เลือกใชค้ วามยาวคลืนทีตอ้ งการ ตอนนีเลิกใชแ้ ลว้

ความกวา้ งของช่องสลิทจึงเป็นส่วนสําคญั Comparison of the spectra obtained
from a diffraction grating by diffraction
2.2 กระจกและเลนส์ (mirror and lens) เพือทาํ ให้แสงเกิดการสะทอ้ น (1), and a prism by refraction (2).
Longer wavelengths (red) are diffracted
หรือบางครังทาํ ให้แสงรวมตวั กนั บางครังทาํ ใหแ้ สงแยกกนั more, but refracted less than shorter
2.3 ส่วนทีทาํ ใหแ้ สงเกิดการกระจายออกเป็นความยาวคลืนตา่ งๆ เพือเหมาะแก่ wavelengths (violet).
การเลือกใช้
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Comparison_refraction_diffr3a0 ction_spectra.svg
2.3.1 ฟิ ลเตอร์

2.3.2 ปริซึม

5

26/08/57

2.3.3 เกรตติง (grating) นิยมใชก้ นั มากในเครืองมือสมยั ใหม่

http://www.physicsforums.com/library.php?do=view_item&itemid=201

1. transmission grating ทาํ ดว้ ยวสั ดุโปร่งใส เป็นกระจกทีนาํ มาขีดใหร้ ่องขนานกนั (A)broad band illumination source (B)entrance slit
ให้แสงออกเป็นหลายๆ ความยาวคลืนในดา้ นทีตรงขา้ มกบั แสงเขา้ (C) curved mirror (the collimator), (D) Grating ; collimated light is diffracted
(E) mirror which refocuses the light, (F) exit slit
2. reflection grating ชนิดสะทอ้ นแสง ผิวหนา้ วสั ดุทีใชท้ าํ ตอ้ งเรียบและสะทอ้ น
Czerny-Turner monochromator
แสงได้ ดา้ นหนา้ จะเซาะสําหรบั ช่วง UV-Vis 300-2000 ร่อง ต่อมิลลิเมตร http://en.wikipedia.org/wiki/Monochromato32r
2.4 ช่องแสงออก (Exit slit) เป็นส่วนทีปลอ่ ยใหแ้ สงผา่ นตวั อยา่ งแลว้ ผา่ น

ไปยงั มาตรวดั แสง 31

3. เซลลส์ าํ หรับใส่สารตวั อยา่ ง 4. เครืองวดั แสง (Radiation detector)

ส่วนใหญ่มีฝาปิ ดเพอื กนั แสงจากภายนอกเขา้ ไปรบกวน เซลลใ์ ส่สารตวั อยา่ ง เครืองวดั แสงทีดีควรมีลกั ษณะดงั ต่อไปนี
(sample cell) หรือ cuvette ทาํ จากแกว้ ควอร์ซ (quartz) ซิลิกา (silica) มีหลายแบบ 4.1 มีสภาพไวสูง แมค้ วามเขม้ แสงตาํ กส็ ามารถตรวจวดั ได้
หลายรูปร่าง ขึนอยกู่ บั ลกั ษณะงานทีใช้ 4.2 มีการตอบสนองเป็นแบบเชิงเส้นตรง
4.3 สญั ญาณรบกวนตอ้ งนอ้ ย
Cuvette 4.4 การตอบสนองขึนอยกู่ บั ความถีหรือความยาวคลืนแสง
4.5 ตอ้ งมีเสถียรภาพดี
http://sciencefair.math.iit.edu/te3c3 hniques/spectrophotometer/ 4.6 ขนาดเลก็
4.7 ราคาไมแ่ พง

33 34

4.1 โฟโตโวลตาอิกเซลล์ (Photovoltaic cells) เป็นเซลลท์ ีใชต้ รวจวดั ทีความยาวคลืน 550 4.2 หลอดรับแสง (Phototube) เป็นหลอดทีทาํ ดว้ ยซิลิกา ภายในหลอดเป็น
nm ไดด้ ี แตค่ วามไวจะลดลง 10% ทีความยาวคลืน 350 หรือ 750 nm เมือแสงจาก สุญญากาศ ฉาบผวิ แคโทดดว้ ยสารทีสามารถให้อิเลก็ ตรอนเมือถูกแสง แลว้
ภายนอกตกลงบนผิวของสารกึงตวั นาํ (ใช้ selenium) ทาํ ให้เกิดอิเลก็ ตรอนแลว้ วงิ ไปยงั อิเลก็ ตรอนวิงไปยงั ขวั แอโนด ดีเทคเตอร์ ชนิดนีจะตอ้ งตอ่ กบั ชุดขยายสัญญาณอีก
โลหะทีต่อไปยงั วงจรภายนอก ปริมาณของกระแสจะมากหรือนอ้ ยขนึ อยกู่ บั ปริมาณของ ครงั เพือทาํ ใหก้ ระแสมากพอทีจะวดั ได้

แสงทีตกกระทบ

http://www.apec-vc.or.jp/e/mod35ules/tinyd00/index.php?id=74 36

6

26/08/57

4.3 หลอดโฟโตมลั ติพลายเออร์ (Photomultiplier tube : PMT) มีลกั ษณะคลา้ ยหลอดรบั 4.4 หลอดวดั แสงชนิดซิลิกอนไดโอด ทาํ งานโดยการเกิด depletion layer ทีการทาํ ให้
แสง แตใ่ ห้สภาพไวดีกวา่ และสามารถใช้ไดท้ ีความยาวคลืน 190-900 nm ภายในหลอด การนาํ ไฟฟ้ าลดลง เมือแสงตกกระทบ depletion layer จะเกิดกระแสไฟฟ้ าและเป็น
PMT ประกอบดว้ ยชุดไดโนด Dynodes 9 ชุด ซึงแต่ละชุดไดโนดจะเพมิ ขนึ 90 โวลต์ จน ปฏิภาคกบั กาํ ลงั แสงทีได้รบั
ครบ 9 ไดโนด ทาํ ให้ศกั ยไ์ ฟฟ้ าแตกต่างกนั ระหวา่ งขวั แคโทดและ อโนดเป็น 900 โวลต์

ดงั นนั หลอดชนิดนีจึงมีประสิทธิภาพสูงเหมาะสาํ หรับวดั แสงตาํ หลอดวดั แสงชนิดนีนิยม
ใชม้ ากทีสุดในปัจจุบนั

http://www.olympusconfocal.com/theory/pmtintro.html http://people.whitman.edu/~dunnivfm/FAASICPMS_Ebook/CH2/2_2_9.html

37 38

5. เครืองขยาย-แยกสญั ญาณและประมวลผล เครืองสเปกโทรมิเตอร์แบบตา่ งๆ

เป็นการนาํ สัญญาณทไี ดไ้ ปเขา้ กระบวนการของระบบอิเลก็ ทรอนิก 1. single beam เป็นเครืองทีใชล้ าํ แสงเดียวจากตน้ กาํ เนิดแสงผา่ นโมโนโครมาเตอร์ แลว้ ผา่ น
เช่น ขยายสัญญาณ กรองสัญญาณ แลว้ นาํ ผลของการวเิ คราะห์ สารละลาย แลว้ จึงไปยงั มาตรวดั แสง ทาํ ให้การวดั ตอ้ งปรับ 0 และ 100% T ดว้ ยสารละลาย
ดงั กล่าวเสนอ ในรูปของมิเตอร์ ดิจิทลั มิเตอร์ เครืองบนั ทกึ เรคคอร์ แบลงค์
เดอร์ และเครืองไมโครคอมพวิ เตอร์

39 40

2. แบบ double beam แสงทีผา่ น monochromator ถูกแยกออกเป็น 2 ลาํ แสงดว้ ย beam Absorbance Spectrophotometer
splitter แสงแรกผา่ นsample cell และอีกแสงหนึงผา่ น blank แลว้ ผา่ นไปยงั เครืองวดั แสง

http://www.public.asu.edu/~laserweb/woodbury/classes/chm467/bioanalytical/spectroscopy/absflr.html
41 42

7

26/08/57

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/ http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/
Electronic_Spectroscopy%3A_Application
Electronic_Spectroscopy%3A_Application 43
44

การตรวจวดั การทาํ ปริมาณวเิ คราะห์

1. เลือกตวั ทาํ ละลายทีไมด่ ูดกลืนแสงในช่วงเดียวกบั สาร Solvent lower limit วธิ ีหาปริมาณสาร โดยการทาํ calibration curve มีหลายวิธี เช่น
ตวั อยา่ ง และมีคา่ ความยาวคลืนตาํ สุด (cut-off points) ทีจะ (nm)
ใชไ้ ดอ้ ยตู่ าํ กวา่ สารตวั อยา่ ง 1. วิธีสารมาตรฐานภายนอก External standard method
2. เลือกใชแ้ หล่งกาํ เนิดแสงและความกวา้ งช่อง slit ให้ถกู ตอ้ ง Acetonitrile 190
3. สแกนสเปกตรมั สเปกตรัมทีไดแ้ สดงคณุ สมบตั ิเฉพาะตวั 1.1 เตรียมสารมาตรฐานหลายๆ ความเขม้ ขน้ วดั คา่ Abs และสร้างกราฟ
ของสารนนั ๆ แลว้ เลือกใช้ที lmax หรือ l ทีเหมาะสม Chloroform 240
สาํ หรับหาปริมาณสารต่อไป มาตรฐาน (calibration graph)
Cyclohexane 205

95% Ethanol 205 1.2 วิเคราะห์สารตวั อยา่ งแบบเดียวกนั กบั สารมาตรฐาน และนาํ คา่ การดูดกลืนของสาร
ตวั อยา่ ง ไปเทียบกบั calibration graph เพือหาความเขม้ ขน้ ของสารตวั อยา่ งโดยตรง
n-Hexane 195

Methanol 205 1.3 คาํ นวณหาความเขม้ ขน้ ทีแทจ้ ริง (ในกรณีทีเกิดการเจือจาง หรือเพมิ ความเขม้ ขน้ )

Water 190

2. วิธีเติมมาตรฐาน (standard addition method)

2.1 เติมสารมาตรฐานทีมีปริมาณตา่ งๆ กนั ลงไปในสารตวั อยา่ ง

2.2 วดั คา่ Abs และสร้างกราฟมาตรฐาน (calibration graph)

2.3 จากกราฟมาตรฐาน หาจุดตดั แกน x คือปริมาณสารตวั อยา่ ง

45 2.4 คาํ นวณหาความเขม้ ขน้ ทีแทจ้ ริง (ใ46นกรณีทีเกิดการเจือจาง หรือเพมิ ความเขม้ ขน้ )

Calibration curves การหาปริมาณเหลก็ รวมดว้ ยวิธีสเปกโทรโฟโตเมทรี

1 External calibration curve 2 Standard addition calibration curve Fe3+ + SCN- = [FeSCN]2+ 1 2 3 4 5 6 Sample

Abs สีสม้ แดง

ปริมาณสารตวั อยา่ ง วิธีที 1 สารมาตรฐานภายนอก

Abs Conc. 1. เตรียมสารโดยขวดที 1-5 เป็นสารละลายเหลก็ มาตรฐาน เติมสารเพือเกดิ สี ปรับปริมาตร 50.0 mL
!!!อยา่ ลืม
Dy คาํ นวณความเขม้ ขน้ ทีแทจ้ ริงกรณีทีเจือ 2. เตรียมสารตวั อยา่ งขวดที 6 เติมสารทีทาํ ให้เกิดสี แต่ไม่เติมเหล็ก และปรับปริมาตร 50.0 mL
จางหรือเพมิ ความเขม้ ขน้ 3. วดั คา่ การดูดกลืนแสง ทีความยาวคลืน 450 nm
Dx
47 ขวดที เหลก็ มาตรฐาน นาํ ตวั อย่าง reagent ความเข้มข้นเหลก็ Absorbance Corrected

100 ppm (mL) (mL) SCN-/H2O2 (ppm) Absorbance

ปริมาณสารตวั อยา่ ง Conc. 10 0 0.5/0.5 0 0.002 0

2 2.5 0 0.5/0.5 5 0.029 0.027

สมการเส้นตรง y = mx + c 35 0 0.5/0.5 10 0.065 0.063
Slope= m=Dy/Dx
4 10 0 0.5/0.5 20 0.124 0.121

5 20 0 0.5/0.5 40 0.256 0.254

60 25 0.5/0.548 ??? 0.098 0.096

8

26/08/57

5 สร้างกราฟระหวา่ งความเขม้ ขน้ และ คา่ การดูดกลืนแสง 7 คาํ นวณความเขม้ ขน้ ทีแทจ้ ริงในสารตวั อยา่ ง

4 ขอ้ มูลจากการทดลอง Absorbance 0.3 สมการเสน้ ตรงจากกราฟมาตรฐาน
0.25
ความเข้มข้น Corrected 10 20 30 40 50 y = 0.0064x-0.0029
เหลก็ (ppm) Absorbance 0.2 ความเขม้ ขน้ (ppm)
0.15 แทนคา่ y ดว้ ยคา่ Abs ของสารตวั อยา่ ง = 0.096
00
5 0.027 0.1 0.096 = 0.0064x-0.0029
10 0.063 0.05
20 0.121 หาความเขม้ ขน้ ของเหลก็ x
40 0.254 0
??? 0.096 0 x = (0.096/0.0064) +0.0029

6 เพิมเส้นแนวโนม้ สมการเส้นตรง และคา่ ความเป็นเสน้ ตรง = 15 ppm

Absorbance 0.3 นาํ ตวั อยา่ งมา 25 mL เจือจางเป็น 50 mL ดงั นนั นาํ ตวั อยา่ งมีความเขม้ ขน้ ของเหลก็ เท่ากบั
y = 0.0064x - 0.0025
ความเขม้ ขน้ ของนาํ ตวั อยา่ ง = ความเขม้ ขน้ (จากกราฟ) x dilution factor
0.25 R² = 0.9992 = 15ppmx(50mL/25mL)
0.2 = 30ppm 50

0.15

0.1

0.05

0 10 20 30 40 50
-0.05 0 ความเขม้ ขน้ (ppm)

15 ppm 49

วิธีที 2 วธิ ีเติมสารมาตรฐาน 1 y = 0.0152x + 0.222
0.8 R² = 0.9998
Fe3+ + SCN- = [FeSCN]2+ ความเข้มข้น Absorbance Absorbance
เหลก็ (ppm) จดุ ตดั -15.0 0.6
สีส้มแดง 0.224
5 0 0.299 -20 0.4 15.0 ppm
1 23 4 5 0.375
1. เตรียมสารโดยขวดที 1-5 มีนาํ ตวั อยา่ งปริมาตรเท่ากนั ทุกขวด 10.0 mL 10 0.52 0.2
2. เติมสารละลายเหลก็ เขม้ ขน้ ตา่ งกนั ยกเว้นขวดแรก 20 0.834
3. เติมสารทาํ ใหเ้ กิดสีทุกขวดและปรับปริมาตร 50.0 mL 40 0 40 50
4. วดั คา่ การดูดกลืนแสง ทีความยาวคลืน 450 nm -10 0 10 20 30

-0.2
ความเขม้ ขน้ (ppm)

ขวดที เหลก็ มาตรฐาน 100 นําตวั อย่าง reagent ความเข้มข้นเหล็ก Absorban 5. สร้างกราฟระหวา่ งคา่ การดูดกลืนแสงและความเขม้ ขน้
(ppm) ce 6. ลากเส้นกราฟ และลากส่วนขยายไปตดั แกน X ดา้ นลบ ทาํ คา่ ให้เป็นบวก
ppm (mL) (mL) SCN-/H2O2
0 0.069 คา่ ความเขม้ ขน้ ของเหลก็ = 15.0 ppm
10 10 0.5/0.5 5.0 0.129 7. หรือหาจดุ ตดั บนแกน x เมือ y = 0 คา่ ความเขม้ ขน้ ของเหล็ก = 14.61 ppm
10 0.204
2 2.5 10 0.5/0.5 20 0.356 คา่ ละเอียด ถกู ตอ้ งกวา่
40 0.611
3 5.0 10 0.5/0.5 8. คาํ นวณความเขม้ ขน้ ทีแทจ้ ริง (คว52ามเขม้ ขน้ จากกราฟ x dilution factor)

4 10 10 0.5/0.5
5 20 51

10 0.5/0.5

GOOD LUCK

53

9