ชีววิทยา

ค ณ ะ วิ ท ย า ศ า ส ต ร์ แ ล ะ เ ท ค โ น โ ล ยี ม ห า วิ ท ย า ลั ย ร า ช ภั ฏ กำ แ พ ง เ พ ช ร วันเสาร์ที่ 3 กุมภาพันธ์ 2567 ชื่อ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . สกุล. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ชื่อเล่น. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . มัธยมศึกษาปีที่ 5/. . . . . . . . . . . . . . . . . . . หลักสูตรชีววิทยา ค่ายวิทยาศาสตร์ โรงเรียนตากพิทยาคม

สารบัญ 1-13 14 กำ หนดการ กำ หนดการ สถานที่ทานอาหาร การสกัดดีเอ็นเอ การตรวจสอบคุณภาพและวัดปริมาณกรดนิวคลีอิก กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) การย้อมสีแบบแกรมและลักษณะการติดสี บันทึก ตอบแบบประเมินความพึงพอใจ ภาพกิจกรรม

Schedule 08.30-08.45 To Do List Meal plans กำ หนดการ สถานที่ : 48517 ห้องปฏิบัติการ (ชั้น 5) ลงทะเบียนเข้าร่วมกิจกรรม 08.45-09.00 พิธีเปิด กล่าวรายงาน โดยผู้อำ นวยการ กล่าวเปิดงาน โดยคณบดีฯ 09.00-10.30 อบรมเชิงปฏิบัติการ 10.30-10.40 พักรับประทานอาหารว่าง 10.40-12.00 อบรมเชิงปฏิบัติการ 12.00-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน 13.00-14.00 อบรมเชิงปฏิบัติการ 15.00-15.30 พิธีปิด นักเรียนทำ แบบประเมิน มอบเกียรติบัตรให้แก่ครู/นักเรียน รองคณบดีกล่าวปิดกิจกรรม หน้าห้อง 48517 48233 ห้องประชุมใหญ่ หน้าห้อง 48517 Morning : Lunch : Afternoon : 14.00-14.10 พักรับประทานอาหารว่าง 14.10-15.00 อบรมเชิงปฏิบัติการ

1 เทคนิคพันธุวิศวกรรมเบื้องตน การสกัดดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอที่อยูในเซลลของสิ่งมีชีวิต โดยทั่วไปจะไมไดอยูเปนดีเอ็นเอเกลียวคูอิสระ แตจะรวมตัวอยูกับ โปรตีนฮีสโตนและโปรตีนที่ไมใชฮีสโตน เกิดเปนโครงสรางเชิงซอนของโตรติน นอกจากนี้ภายในเซลลของ สิ่งมีชีวิตยังประกอบดวย คารโบไฮเดรต โปรตีน ละอารเอ็นเอ (Nascent RNA) ดั้งนั้นในการสกัดดีเอ็นเอออก จากสิ่งมีชีวิตตองอาศัยหลักการดังนี้ 1. การทำลายผนังเซลล (cell wall lysis) ผนังเซลลจะตองถูกทำลายหรือยอยสลายเพื่อปลอยให องคประกอบที่อยูภายในเซลลออกมา โดยทั่วไปนิยมใชวิธีการเชิงกลเขามาชวยในการบดตัวอยางดวยโกรงหรือ pestle รวมกับไนโตรเจนเหลว จากนั้นตองทำลายเยื่อหุมเซลล (cell membranes) โดยใชสาร lysozyme (นิยม ใชในโปรคาริโอต) หรือใชสาร detergent (นิยมใชในยูคาริโอต) เชน sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauroyl sarcosinate หรือ CTAB (cethyl trimethyl ammonium bromide) เพื่อใหดีเอ็นเอถูก ปลอยออกมาใน extraction buffer 2. การยอยโปรตีนและอารเอ็นเอ โดยใชเอนไซม protease และ ribonucleases (RNase) ตามลำดับ จากนั้นกำจัดโปรตีนที่ปนเปอนออกดวย phenol/chloroform (บางครั้งอาจเติมเกลือเชน sodium chloride หรือ sodium acetate เพื่อชวยเพิ่มประสิทธิภาพในการตกตะกอนโปรตีน 3. การตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยใช absolute ethanol ที่เย็น (อาจเติมเกลือ sodium acetate ดวย) เพื่อทำใหเกิดการดึงน้ำออกจากสายดีเอ็นเอ ทำใหดีเอ็นเอตกตะกอนออกมา และเกิดเปน pellet หลังจากการ ปนเหวี่ยงแลว จากนั้นจึงละลายดีเอ็นเอดวยน้ำหรือ TE buffer และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20°C การเตรียมดีเอ็นเอนี้ ควรระมัดระวังไมใหดีเอ็นเอขาดเปนทอนๆ ซึ่งดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดี เหมาะ สำหรับการนำไปทํา Genomic DNA libraries หรือโคลนนิ่งนั้นควรเปนดีเอ็นเอที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและมี การขาดเปน ทอนหรือถูกทำลายนอยที่สุด อยางไรก็ตามการขาดเปนทอนของดีเอ็นเอนั้น สามารถเกิดขึ้นโดย แรงกระทำเชิงกล ไดในทุกขั้นตอนของการสกัดดีเอ็นเอ ดังนั้น genomic DNA ที่เตรียมไดโดยทั่วไป มักมีความ ยาวไมเกิน 100-150 kb ซึ่งดีเอ็นเอที่มีความยาวประมาณนี้ ก็สามารถนำไปใชในการวิเคราะหขั้นตอไปไดแลว เชนการทำ Southern analysis, PCR และ genomic DNA libraries ใน bacteriophage lamda vectors นอกจากนั้น หากตองการ สราง libraries โดยใช high-capacity vectors หรือตรวจเช็คขนาดน้ำหนักโมเลกุล ของดีเอ็นเอโดยวิธี Pulsed field gel electrophoresis ควรเตรียมดีเอ็นเอใหมีความยาว >200 kb ซึ่งตองใช วิธีการสกัดดีเอ็นเอที่เฉพาะมาก ขึ้น เชนการใช formamide เปนตน (Sambrook and Russell, 2001) วิธีการสกัดดีเอ็นเอ 1. บัฟเฟอรที่ใชสกัดดีเอ็นเอมักมีสาร detergent เปนสวนประกอบสำคัญรวมอยูดวย เชน CTAB (cethyl trimethyl ammonium bromide), SDS (sodium dodecyl sulfate) หรือ MATAB (mixed alkyltrimethyl ammonium bromide) โดย CTAB และ MATAB เปน cationic detergent ที่มีประจุบวก ชวยในการตกตะกอนพอลิแซ็กคาไรด ซึ่งจะจับกับดีเอ็นเอเปนสารประกอบเชิงซอนที่ละลายไดในสารละลายที่ มีความเขมขนของเกลือสูง จากนั้นสามารถแยกดีเอ็นเอออกมาไดโดยการตกตะกอนดวยแอลกอฮอล หรือลด ความเขมขน ของเกลือในสารละลายใหนอยลง สวน SDS เปน anionic detergent ที่มีประจุลบ เปนสารที่ทำ ใหโปรตีนเสียสภาพ ซึ่งสามารถแยกออกจากสารละลายดีเอ็นเอได โดยการทำใหโปรตีนและพอลิแซ็กคาไรด ตกตะกอนเมื่อมีเกลือโพแทสเซียมอะซิเตตความเขมขนสูงอยูดวย

2 หมายเหตุ ในสูตรของบัฟเฟอรสกัดจะมี EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) ผสมอยู ดวย ซึ่งชวยในการยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม endogenous nucleases (DNase) โดย EDTA จะเขาไปจับ กับ Mg2+ ซึ่งเปนโคแฟคเตอรที่สำคัญสำหรับการทำงานของเอ็นไซม nucleases สวนใหญ 2. การสกัดกรดนิวคลีอิกดวยฟนอลและคลอโรฟอรม สิ่งสำคัญในการทดลองทางชีววิทยาโมเลกุล คือการสกัดดีเอ็นเอและอารเอ็นเอใหปราศจากสิ่งเจือปน ดังนั้นวิธีเบื้องตนที่นิยมที่สุดคือการสกัดดวยฟนอล โดยมีเปาหมายเพื่อกำจัดโปรตีนและไขมันออกจาก สารละลาย กรดนิวคลีอิก โดยผสมสารละลายฟนอลในปริมาตรเทากับสารละลายกรดนิวคลีอิกแลวเขยาให ผสมกันเปนครีม แลวนำไปปนแยก ชั้นสารละลายกรดนิวคลีอิกจะอยูสวนบน สวนฟนอลจะอยูชั้นลางและมี โปรตีนสีขาวขุนอยูตรง กลาง ดูดชั้นน้ำที่มีสารละลายกรดนิวคลีอิกอยู มาสกัดซ้ำดวยฟนอล : คลอโรฟอรม (1:1) ในปริมาตรเทากับ สารละลายกรดนิวคลีอิก เขยาใหเขากันแรงๆ และนำไปปนเหวี่ยงเพื่อแยกชั้น โดย สารละลายกรดนิวคลีอิกจะอยูสวนบน ดูดชั้นน้ำใสสวนบนใสหลอดใหมโดยระวังไมใหตะกอนสีขาวที่อยู ระหวางกลางปะปนมาและสกัดซ้ำดวย คลอโรฟอรมอีกรอบ 3. การตกตะกอนกรดนิวคลีอิก เมื่อตองการใหสารละลายกรดนิวคลีอิกเขมขนขึ้นหรือตองการเปลี่ยนตัวทำละลาย นิยมใชวิธีการ ตกตะกอนดวยเอธานอล ซึ่งการตกตะกอนจะเกิดในสภาพที่มีเกลือและอุณหภูมิต่ำ (-20 °C หรือต่ำกวา) แลว จึง แยกตะกอนดีเอ็นเอออกโดยวิธีปนเหวี่ยงแลวแยกเอาสวนน้ำออกไป ทั้งนี้การเลือกเกลือที่ใชเพื่อทำใหกรด นิวคลีอิก ตกตะกอนขึ้นกับสภาวะของตัวอยางและวัตถุประสงคที่ตองการ ขอสังเกตในการเลือกใชเกลือเพื่อตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยทั่วไปใชเกลือโซเดียมอะซิเตตเขมขน 3 M pH 5.5 ปริมาตร 1 ใน 10 เทาของปริมาตรสารละลาย ดีเอ็นเอ และเอธานอล 100% ปริมาตร 2-2.5 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ หรืออาจใชเกลือโปแตสู เซียมอะซิเตตเขมขน 3 M pH 5.5 ปริมาตร 1 ใน 10 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ อยางไรก็ตามวิธีหลัง นี้ นิยมใชในการตกตะกอนอารเอ็นเอมากกวา หากใชเกลือแอมโมเนียมอะซิเตตเขมขน 7 M ปริมาตร 1 ใน 2 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ รวมกับเอธานอล 100% 2.5-3 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ วิธีนี้จะปองกันการตกตะกอนของ dNTP ที่ เปนสวนประกอบในปฏิกิริยา PCR ได และหากตกตะกอนซ้ำ 2 ครั้ง จะสามารถกำจัด dNTP ไดถึง 99% และ ตกตะกอนดีเอ็นเอกลับมาไดถึง 90% แตหากจะนำดีเอ็นเอไปทำปฏิกิริยาการเติมหมูฟอสเฟตหรือตอนิ วคลีโอไท ที่ปลาย 3 อีก ไมควรตกตะกอนดวยแอมโมเนียมอะซิเตต เพราะแอมโมเนียมไอออนจะไปยับยั้งการ ทำงานขอ เอนไซมในกระบวนการดังกลาว หรือสามารถใชเกลือลิเธียมคลอไรดเขมขน 8 M ปริมาตร 1 ใน 10 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ รวมกับเอธานอล 100% ปริมาตร 2-3 เทาของปริมาตรสารละลายดีเอ็นเอ เนื่องจากเกลือลิเธียมคลอไรดละลายได ดีในเอธานอลจึงไมมีเกลือตกตะกอนพรอมกับดีเอ็นเอเมื่อเก็บ สารละลายดีเอ็นเอที่อุณหภูมิ -70°C

3 กลุมที่ 1 ทำความรูจักกับ Genomic DNA Isolation Kit (Blood/Cultured Cell/Fungus) Cat No. PDC09-0100 Size: 100 Reactions Sample: Up to 300 µl of the whole blood Up to 200 µl of the frozen blood Up to 200 µl of the buffy coat Cultured animal cells (up to 1 x 107 ) Cultured bacterial cells (up to 1 x 109 ) Fungus cells (up to 5 x 107 ) Format: Reagent and spin column Yield: Up to 50 μg Operation time: Within 60 minutes Elution volume: 50∼200 μl Description The Genomic DNA Isolation Kit (Blood/Cultured Cell/Fungus) is designed specifically for genomic DNA isolation from the whole blood, frozen blood, buffy coat, cultured animal/bacterial cells and fungus. This unique buffer system ensures genomic DNA with high yield and good quality from samples. The spin column is designed to purify or concentrate genomic DNA products which have been previously isolated using buffers. The entire procedure can be completed in 1 hour without phenol/ chloroform extraction. Purified genomic DNA is suitable for use in PCR or other enzymatic reactions. Feature ➢ Delivering high-quality genomic DNA with the fast procedure ➢ Ready-to-use gnomic DNA for high performance in any downstream application ➢ Highly purified and high yield genomic DNA can be extracted from various samples ➢ Optimized lysis buffer for the efficient lysis ➢ Designed to rapidly purify high-quality DNA using spin column format Kit Contents Contents PDC09-0100 PDC09-0100S Buffer CR 100 ml 4 ml Buffer CC 35 ml 1.5 ml Buffer CB 45 ml 2 ml Buffer W1 45 ml 2 ml Buffer W2 (Add ethanol) 15 ml(60 ml) 300 μl x2 (1.5 ml x2) Buffer E 10 ml 1 ml Columns CC 100 pcs 4 pcs Collection Tubes 100 pcs 4 pcs

4 Quality Control The quality of the Genomic DNA Isolation Kit (Blood/Cultured Cell/Fungus) is tested on a lotto-lot basis to ensure consistent product quality. Required Materials ➢ 1.5 ml Microcentrifuge tubes ➢ RNase A (10 mg/ml) ➢ Absolute ethanol (96~100%) ➢ lysozyme buffer (for Gram-positive Bacteria): 20 mg/ml lysozyme; 20 mM Tris-HCl; 2 mM EDTA; 1% Triton X-100; pH 8.0 ➢ Lyticase or zymolase (for fungus) ➢ sorbitol buffer (for fungus): 1.2 M sorbitol;10 mM CaCl2; M Tris-HCl pH 7.5; 35 mM βmercaptoethanol

5 กลุมที่ 2 ขั้นตอนการสกัดดีเอ็นเอ Genomic DNA Isolation Kit Protocol (Fungus Cells) Step 1 Sample Cells Harvesting 1. Transfer fungus cells (up to 108 ) to a sterile 1.5 ml microcentrifuge tube. 2. Centrifuge at 6,000 x g for 5 minute. 3. Remove the supernatant completely and resuspend the cells in 600 µl of sorbitol buffer by pipetting the pellet. 4. Add 200 U of the lyticase or zymolase. Incubate at 30°C for 30 minutes. 5. Centrifuge the mixture for 10 minutes at 2,000 x g to harvest the spheroplast. Remove the supernatant completely and resuspend the cells in 50 µl of the Buffer CR by pipetting the pellet. Step 2 Lysis 1. Add 300 µl of the Buffer CC to the resuspended cells from Step 1 and mix by vortex. 2. Incubate at 60°C for 10 minutes or until the sample lysate is clear. During incubation, invert the tube every 3 minutes. Optional Step: ◆RNA Degradation (If RNA-free genomic DNA is required, perform this optional step) 3. Add 5 µl of the RNase A (10 mg/ml) to the sample lysate and mix by vortex. Incubate at the room temperature for 5 minutes. Step 3 Protein Removal 1. Add 400 µl of the Buffer CB to the sample from Step 2 and shake vigorously. 2. Centrifuge at 12,000 x g for 1 minute. (Don`t over 1 minute) Step 4 DNA Binding 1. Place a Column CC in a 2 ml Collection Tube. 2. Transfer the clear supernatant completely from the previous step to the Column CC. 3. Centrifuge at 14,000 x g for 30 seconds. 4. Discard the flow-through and place the Column CC back in the same Collection Tube.

6 Step 5 Wash 1. Add 400 µl of the Buffer W1into the Column CC. 2. Centrifuge at 14,000 x g for 30 seconds. 3. Discard the flow-through and place the Column CC back into the same Collection tube. 4. Add 600 µl of the Buffer W2 (Ethanol added) into the Column CC. 5. Centrifuge at 14,000 x g for 30 seconds. 6. Discard the flow-through and place the Column CC back into the same Collection tube. 7. Centrifuge at 14,000 x g again for 2 minutes to remove the residual Buffer W2. Step 6 DNA Elution 1. Transfer the dried Column CC to a new 1.5 ml microcentrifuge tube. 2. Add 50-200 µl of the Pre-Heated Buffer BE or TE into the center of the column matrix. 3. Let stand at 60°C for 3 minutes. 4. Centrifuge for 2 minutes at 14,000 x g to elute the purified DNA

7 ความเขมขนของดีเอ็นเอสายคู (µg/ml) = OD260 x 50 x dilution factor ความเขมขนของดีเอ็นเอสายเดี่ยว (µg/ml) = OD260 x 33 x dilution factor ความเขมขนของอารเอ็นเอ (µg/ml) = OD 260 x 40 x dilution factor ความเขมขนของโอลิโกนิวคลีโอไทด (µg/ml) = OD260 x 20 x dilution factor การตรวจสอบคุณภาพและวัดปริมาณกรดนิวคลีอิก หลังจากทำการสกัดดีเอ็นเอหรืออารเอ็นเอเรียบรอยแลวและกอนที่จะนำไปใชเปนตนแบบของ ปฏิกิริยา PCR จำเปนตองมีการตรวจสอบคุณภาพและวัดปริมาณกรดนิวคลีอิกที่ไดกอน ซึ่งในเบื้องตนสามารถ ทำได 2 วิธี คือการวัดคาการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเรตโดยใช spectrophotometer หรือการวัดการเรือง แสงของดีเอ็นเอที่ จับตัวกับเอริเดียมโบรไมดหลังจากแยกขนาดดีเอ็นเอโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีส 1. การวัดคาการดูดกลืนแสง (Absorbance) จะใชหลักการที่กรดนิวคลีอิกสามารถดูดกลืนแสง ไดมาก ที่สุดที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร และโปรตีนดูดกลืนแสงไดมากที่สุดที่ความยาวคลื่น 280 นาโน เมตร โดยจะทำการวัดคา optical density (OD) ของสารละลายดีเอ็นเอ จากนั้นนำผลที่ไดมาคำนวณหา ความเขมขนของ สารละลายดีเอ็นเอ จากสูตร หากคา OD260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของดีเอ็นเอสายคู (double-stranded DNA; ds-DNA) เทากับ 50 µg/ml หากคา OD260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single-stranded DNA; ss-DNA) เทากับ 33 µg/ml หากคา OD260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของอารเอ็นเอสายเดี่ยว (single-stranded RNA เทากับ 40 µg/ml หากคา OD 260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของโอลิโกนิวคลีโอไทด (oligonucleotide) เทากับ 20 µg/ml การวัดปริมาณดีเอ็นเอวิธีนี้จะใชไดในกรณีที่สารละลายดีเอ็นเอคอนขางบริสุทธิ์ ไมมีอารเอ็นเอและโอ ลิโกนิวคลีโอไทดอื่นเจือปน และตองมีปริมาณมากพอที่จะอานคา OD ได คาที่ไดจากวิธีนี้จะแนนอนและ สามารถตรวจสอบคุณภาพและความบริสุทธิ์ได โดยเปรียบเทียบคา OD260 และ OD280 ของสารละลายดี เอ็นเอที่เตรียมไดโดยดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์จะมีคา OD260/OD280 ประมาณ 1.8 ซึ่งหากต่ำกวา 1.8 แสดงวาอาจมี โปรตีนปนอยู ควรทำสารสกัดซ้ำดวยฟนอลคลอโรฟอรม และหากคามากกวา 2.0 แสดงวามีฟนอลหรือคลอโร ฟอรมปนอยู ซึ่งควรทำการตกตะกอนดีเอ็นเออีกครั้งดวยเอธานอล สวนการตรวจสอบสุขภาพของอารเอ็นเอดวยวิธีนี้ สารละลายอารเอ็นเอที่บริสุทธิ์จะมีคา OD260/OD280 ประมาณ 1.7-2.1 และ OD260/OD230 ควรมีคา 1.8 ขึ้นไป ซึ่งOD230 จะเปนตัวบงชี้การ ปนเปอนของเกลือในสารละลายอารเอ็นเอ ในปจจุบันดวยเทคโนโลยีที่พัฒนาขึ้น สามารถใชเครื่อง nanodrop แทนเครื่อง spectrophotometer ในการตรวจวัดหาความเขมขนของสารละลายกรดนิวคลีอีก ซึ่งขอดีของการใชเครื่อง nanodrop นี้ คือใช ปริมาณสารละลายกรดนิวคลีอิกนอย ประมาณ 1-2 ไมโครลิตรเทานั้น และเครื่องยังคำนวณคาของอัตราสวน ตางๆและแสดงออกมาใหเห็นบนหนาจอ ซึ่งสะดวกกวาการใชเครื่อง spectrophotometer ที่ใชปริมาณของ ตัวอยางมากกวาและตองการการคำนวณหลังจากไดคาการดูดกลืนแสงดวย อยางไรก็ตาม การเลือกใชวิธีการ ใดวิธีหนึ่งควรคำนึงถึงงบประมาณที่มีของหองปฏิบัติการนั้นๆดวย

8 2. การตรวจสอบผลโดยวิธีอิเล็กโทรโพรีซีสในเจลอะกาโรส (gel electrophoresis) วิธีการนี้สามารถ วิเคราะหดีเอ็นเอที่มีปริมาณนอยในระดับนาโนกรัม (ng) ไดใชหลักการการแยกขนาดและรูปรางโมเลกุลของดี เอ็นเอดวยกระแสไฟฟาบนเจลอะกาโรส เทคนิคนี้จะใชการเขาแทรกตัวของโมเลกุลเอธิเดียมโบรไมดในเกลียว คูของดีเอ็นเอ เมื่อนำไปสองดวยแสงอุลตราไวโอเลต จะเห็นการเรืองแสงของแถบดีเอ็นเอนั้น โดยความเขม ของแสงจะเปนสัดสวนโดยตรงกับปริมาณดีเอ็นเอที่ใสในเจลเริ่มตน สามารถประมาณคาความเขมขนของแถบ ดีเอ็นเอของตัวอยางนั้นไดจากการเทียบความเขมของแถบ DNA ladder ที่ทราบความขมขนเริ่มตน (ดูเพิ่มเติม ในบทปฏิบัติการ) กลุมที่ 3 การเตรียมเจลอะกาโรส การตรวจสอบคุณภาพดีเอ็นเอในเจลอะกาโรสที่มีความเขมขน 0.8 % ทำไดดังนี้ 1. เตรียมถาดสำหรับเทเจลในแนวราบและหวีใหเรียบรอย 2. ชั่งผงอะกาโรส 0.8 g เติมบัฟเฟอรสำหรับทำอิเล็กโทรโพรีซีส (1XTBE หรือ 1XTAE) 100 ml 3. หลอมอะกาโรสโดยอุนใหรอนโดยใชไมโครเวฟ เขยาเปนครั้งคราวใหอะกาโรสละลายจนหมด 4. ตั้งทิ้งไวใหอุณหภูมิเย็นลงประมาณ 50-55 °C แลวจึงเทลงในถาดที่เตรียมไวใหเจลหนาประมาณ 5 mm เสียบหวีลงไปใหตรงตำแหนงเพื่อทำใหเกิดชองสำหรับหยดตัวเอง ปลอยใหเจลแข็งตัวที่ อุณหภูมิหอง 5. เมื่อเจลแข็งตัวแลวคอยๆ ดึงหวีออก นำเจลใสลงในเครื่องสำหรับทำอิเล็กโทรโฟรีซีส ใสบัฟเฟอร 1 เทาใหทวมเจล โดยใหสูงกวาผิวเจล 2-3 mm กลุมที่ 4 การตรวจสอบคุณภาพดีเอ็นเอในเจลอะกาโรส 6. ดูดสารละลายดีเอ็นเอ 5 µl ผสมกับ loading buffer 1 µl แลวหยอดลงในชองเจลที่เตรียมไว 7. ตอกระแสไฟเขากับเครื่องอิเล็กโทรโฟรีซีส (แลวเปดกระแสไฟฟาและมาณ 5 โวลตตอเซนติเมตร หรือ อาจเพิ่มไดถึง 10 โวลตตอเซนติเมตร ในกรณีเจลขนาดเล็กๆและตองการความรวดเร็ว) ปดฝาเครื่อง แลวเปดกระแสไฟฟาใหกระแสไฟฟาวิ่งผานจากขั้วลบไปขั้วบวก โดยใชความตางศักย 135 โวลต ปลอยใหดีเอ็นเอเคลื่อนไปพอประมาณ (15 นาที) โดยสังเกตจากการเคลื่อนที่ของโหลดดิงบัฟเฟอร (loading buffer) ไดระยะทางที่เหมาะสม 8. ปดเครื่อง นำแผนเจลไปยอมในสารละลายเอธิเดียมโบรไมด ความเขมขน 0.5 µg/ml นาน 10 นาที (ขั้นนี้ตองระวังไมใหสัมผัสเอธิเดียมโบรไมดเนื่องจากเปนสารกอมะเร็ง) 9. ลางเอธิเดียมโบรไมดสวนเกินออกดวยน้ำสะอาดประมาณ 5 นาที นำแผนเจลไปสองดูภายใตแสง UV แลวถายภาพดวยเครื่อง gel documentation แลวถายภาพไว สิ่งที่ความคำนึง 1. ความเขมขนของอะกาโรสที่ใช ขึ้นอยูกับขนาดของ linear DNA Gel percentage DNA size range (bp) 0.5 1,000-30,000 0.7 800-12,000 1.0 500-10,000 1.2 400-7,000 1.5 200-3,000 2.0 50-2,000

9 Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) เปนเทคโนโลยีทางอณูชีววิทยาที่มีบทบาทอยางมากโดยเฉพาะ อยางยิ่งในการวินิจฉัยโรค การศึกษาลายพิมพของสิ่งมีชีวิต การศึกษาวิวัฒนาการ และการสรางสิ่งมีชีวิตตัดตอ พันธุกรรม เทคโนโลยีนี้เปนการจำลองกระบวนการ DNA replication ที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิตท ซึ่ง นักวิทยาศาสตรไดเลียนแบบธรรมชาติโดยการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมขึ้นในหลอดทดลอง โดยมีดีเอ็นเอ ตนแบบ และมีดีเอ็นเอสายสั้น (primer) ที่สามารถจับกับดีเอ็นเอตนแบบไดอยางจำเพาะ และเปนจุดเริ่มตน ของการสรางดีเอ็นเอสายใหมที่ตองการ 1. หลักการทำ PCR การเตรียมชิ้นสวนดีเอ็นเอที่ตองการจากปฏิกิริยา PCR ประการสำคัญคือ การออกแบบและสังเคราะหโอลิ โกนิวคลีโอไทดสายสั้นๆ หรือที่เรียกวา ไพรเมอร (primer) 2 สาย คือ forward และ reverse primers ที่ จำเพาะกับยีนหรือบริเวณบน genomic DNA ใดๆ ตามที่ตองการ เพื่อนำมาใชในปฏิกิริยา PCR เพื่อการเพิ่ม จำนวนชิ้นสวนของดีเอ็นเอที่ตองการไดในเวลาอันรวดเร็ว โดยเมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยา PCR จะไดชิ้นสวน DNA ที่มี ความยาวตามไพรเมอรที่จำเพาะจำนวน = [2n -(n + 1)] เมื่อ n คือจำนวนรอบของการทำ PCR 2. หลักการของขั้นตอนการทำ PCR มีดังนี้ 1. Denaturing step คือ การคลายสายดีเอ็นเอเกลียวคู (double strand DNA) ใหเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single strand DNA) โดยเกิดอุณหภูมิสูง (90-95°C) 2. Annealing step คือ การที่ forward และ reverse primers เขาไปจับคูสมบน single strand DNA ตนแบบ โดยเกิดที่อุณหภูมิต่ำประมาณ 40-60°C [การเลือกใช annealing temperature ควรพิจารณาจาก คา Tm (melting temperature) ของ primer ทั้งนี้ขึ้นอยูกับชนิดและจำนวนนิวคลีโอไทดของ primer] 3. Primer extension คือ กระบวนการสังเคราะห DNA สายใหมดวยเอนไซม DNA polymerase โดย เปนการตอลำดับนิวโอไทดที่ปลาย 3 ของ primer ซึ่งเกิดที่อุณหภูมิประมาณ 70-73 °C ซึ่งเปนอุณหภูมิที่ เหมาะสมตอการทำงานของเอนไซม Tag DNA polymerase 3. องคประกอบในการทำ PCR ประกอบดวย 1. ดีเอ็นเอตนแบบ (DNA template) โดยดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีจะใหผลผลิตมาก ซึ่งปริมาณที่นิยมใช อยู ในชวง 10-50 ng ตอปฏิกิริยา 2. Buffer ที่มีความเขมขน 10 เทา ซึ่งมักจะใสในปริมาณ 1 ใน 10 ของปริมาตรรวมของปฏิกิริยา 3. dNTP ประกอบดวย dNTP, dCTP, dGTP และ dTTP โดยจะใสในปฏิกิริยาใหมีความเขมขนสุดทาย ชนิดละประมาณ 200 µM 4. ไพรเมอร นิยมใชโอลิโกนิวคลีโอไทด 2 ชนิด forward และ reverse primers ขนาด 20-25 นิวคลีโอ ไทด ที่มีองคประกอบของเบส G และ C อยูระหวาง 40-60 เปอรเซ็นต โดยไพรเมอร 2 ชนิดที่ใชคูกันควรมี สวนประกอบของเบส G+C เทากัน เพื่อใหคา Tm เทากันหรือใกลเคียงกันมากที่สุด ไพรเมอรที่ใชสามารถ เตรียมเปน stock ที่มีความเขมขน 5 pg/µl (5 µM) หรือความเขมขนอื่นใดก็ได โดยใหสอดคลองกับปริมาณที่ จะใชในปฏิกิริยา ซึ่งจะไดความเขมขนสุดทายเปน 0.1-2.0 µM 5. แมกนีเซียมคลอไรด (MgCl2) มีสวนสำคัญในการเรงปฏิกิริยาของเอ็นไซม DNA polymerase อาจผสม รวมอยูในบัฟเฟอรของชุดน้ำยาสำเร็จรูป แตโดยมากนิยมแยกออกมา เพื่อใหสามารถปรับความเขมขนไดตาม ความเหมาะสมในแตละปฏิกิริยา PCR โดยความเขมขนที่แนะนำใชประมาณ 1.5-10 mM 6. Enzyme เนื่องจากขั้นตอนในการสังเคราะหดีเอ็นเอโดยเทคนิค PCR ตองมีการทำใหดีเอ็นเอคลาย เกลียวสายคูกอนดวยความรอน เอนไซม DNA polymerase ที่ใชจึงตองสามารถทนความรอนไดสูง ซึ่ง

10 เอนไซมชนิดแรกที่ใช แยกไดจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus ที่อาศัยในบอน้ำบุรอน จึงสามารถทนความ รอนไดสูง เปนชนิดที่ใชกันมาก และรูจักกันในชื่อ Taq polymerase ทำงานไดดีที่อุณหภูมิ 70-80°C ใน ปฏิกิริยา PCR มักใชที่ความเขมขน 2.5-5 ยูนิตตอปฏิกิริยา 100 µ การทำปฏิกิริยา PCR กลุมที่ 5 เตรียม PCR reagents PCR reagents สารที่ใช ปริมาตร (µl) ความเขมขนสุดทาย PCR buffer (2x) contains 3mM MgCl2 และ dNTPs 12.50 1x; 1.5 mM Mg2+ forward primer (10 µM) 0.75 0.3 µM Reverse primer (10 µM) 0.75 0.3 µM Taq DNA Polymerase (2.5U/µl) 0.20 1U/50 µl PCR grade water 10.80 Total 25 กลุมที่ 6 การตั้งโปรแกรมพีซีอาร(PCR conditions) ขั้นตอน อุณหภูมิ ( o C) เวลา (นาที) จำนวนรอบ 1. Initial denaturation 95 10 1 2.Denaturation 95 20 วินาที 30 3.Annealing 55* 15 วินาที 4.Extension 72 1 5.Final extension 72 1 1 6.storage 4 ∞ 1

11 กลองจุลทรรศน (Microscope)

12 ขั้นตอนการยอมสีแบบแกรม และลักษณะการติดสี ของแบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบ การยอมสีแกรมแบคทีเรีย เพราะเหตุใดแบคทีเรียจึงถูกแบงออกเปน 2 แกรม ........................................................................................................................................................... เพราะเหตุใดตองทำการ heat fix หรือปฏิกิริยา fixation ...........................................................................................................................................................

13 จากภาพขางลาง จงระบายสีที่ตัวเซลลการติดสีคริสตัลไวโอเลตใหใชปากกาสีน้ำเงิน สวนการติดสีแดงของซาฟานินโอใหใชปากกาสีอื่น จงบอกชื่อสารเคมีและเวลาในแตละขั้นตอน แบคทีเรียแกรม.......................... แบคทีเรียแกรม...............................

บั น ทึ ก ภ า พ กิ จ ก ร ร ม ต อ บ แ บ บ ป ร ะ เ มิ น ค ว า ม พึ ง พ อ ใ จ 14