เทคโนโลยีทาง DNA
จากภาพเป็ นผลทเ ี่กด ิ จากการนา ยน ี ทส ี่ร ้ างโปรตน ี เร ื องแสงสีเขียว ซง ึ่พบได ้ ตามธรรมชาตใิ นแมงกระพร ุ น Aequorea victoria ไปใส่ไว้ใน แบคทีเรีย Enterobacter amnigenus ทา ให ้ แบคทเ ี ร ี ยเร ื องแสงได ้ และเมอน า ื่ แบคทเ ี ร ี ยน ีไ ้ ปเป็ นอาหารแก่ล ู กนา ้ ย ุ ง จะเหน ็ แบคทเ ี ร ี ย เร ื องแสงในล ู กนา ้ ย ุ งได ้
เทคโนโลยีชีวภาพ (biotechnology) = การใช้ประโยชน์ จากสิ่งมีชีวิตหรือระบบของสิ่งมีชีวิตเพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ที่เป็น ประโยชน์ต่อมนุษย์
เทคโนโลยชีี วภาพแบบดัง้เดม ิ
เทคโนโลยีชีวภาพในปัจจุบัน GMO : Genetically Modified Organism
เทคโนโลยี DNA 1. พันธุวิศวกรรม 2. การโคลนยีน 3. การวิเคราะห์ DNA 4. การประยุกต์ใช้ เทคโนโลยีของ DNA
พันธุวิศวกรรม (genetic engineering / DNA recombination) คือ การสร้าง DNA สายผสม โดยนา ชิ น ้ ส ่ วน DNA จาก สมช.หน ึ่ งเข ้ าไปในจีโนมของ สมช. หน ึ่ งเพอ ื่ใหไ้ ดย ้ น ี ทมีสมบัติ ี่ ตามต้องการ วิธีการ ตัดสาย DNA ของสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่งที่มียีนที่ต้องการ ด้วยเอนไซม์ตัดจ าเพาะ (restriction enzyme) เชื่อมต่อกับ DNA ของสิ่งมีชีวิตอีกชนิดที่ถูกตัดล าดับเบสออก ด้วยเอนไซม์ DNA ไลเกส (DNA ligase) สิ่งมีชีวิตใหม่ที่เป็น DNA ลูกผสม (DNA recombination) ที่มีสมบัติตามต้องการ
Hamilton smith Restriction enzyme Restriction site 1.เอนไซม์ตัดจ าเพาะ (restriction enzyme)
ตัวอย่าง Enz. ล าดับเบสที่ตัดจ าเพาะ ผลจากการตัด EcoRI 5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’ HaeIII 5’ G G CC 3’ 3’ C C G G 5’
↓ & ↓ &
ผลจากการตัด DNA โดย enz. ตัดจ าเพาะ มีได้ 2 แบบ ดังนี้ 1. Overhang = Sticky end = ปลายสาย DNA ทั้ง 2 ปลายที่เมื่อถูก restriction enzyme ตัดแล้ว มีนิวคลีโอไทด์สายเดี่ยวยื่นออกมา 2. Blunt ends = ปลายสาย DNA ทั้ง 2 ปลายที่เมื่อถูก restriction enzyme ตัดแล้ว ไม่มีนิวคลีโอไทด์ สายเดี่ยวยื่นออกมา
ตัวอย่าง1 หากน า DNA สายหนึ่งที่มีล าดับเบสดังนี้ 5’ A T G G A T C C G 3’ 3’ T A C C T A G G C 5’ ชิ้ นส่วน DNA ที่จะน ามาต่อควรมีลักษณะอย่างไร
ตัวอย่างที่ 2 หากน า DNA สายหนึ่งที่มีล าดับเบสดังนี้ 5’ A T G G C C T 3’ 3’ T A C C G G A 5’ ชิ้ นส่วน DNA ที่จะน ามาต่อควรมีลักษณะอย่างไร
ค ำถำม 1. restriction enzyme แยกออกมาจากสิ่งมีชีวิตชนิดใด และ มีหน้าที่อย่างไร 2. restriction enzyme ที่ตัดสาย DNA ที่มียีนที่ต้องการจาก สิ่งมีชีวิตและที่ใช้ตัด plasmid ควรเป็นชนิดเดียวกันหรือไม่ เพราะอะไร 3. ปลาย sticky end กับ ปลาย blunt end ของ DNA ที่ถูก ตัดด้วย restriction enzyme แตกต่างกันอย่างไร 4. การเชื่อมสาย DNA ปลาย blunt end จะเหมือนหรือ แตกต่างจากการเชื่อมสาย DNA ปลาย sticky end อย่างไร
อักษรตัวแรก คือ จีนัสของแบคทีเรีย และต่อด้วยอักษร 2 ตัวแรกของสปีชีส์ (specific epithet) และอักษรตัวเล็กต่อไปเป็นสายพันธุ์ของแบคทีเรีย ตัวสุดท้ายเป็นเลขโรมันแสดงล าดับของเอนไซม์ที่แยกได้จาก เช่น EcoRI (อ่านว่า อีโคอาร์วัน) ที่ได้จาก Escherichia coli RY13 E มาจาก Escherichia co มาจาก coli R มาจากสายพันธุ์ RY13 I มาจากล าดับของเอนไซม์ตัดจ าเพาะที่แยกได้จากแบคทีเรียสายพันธุ์นี้ ควรรู้เพิ่มเติม : การเรียกชื่อเอนไซม์ตัดจ าเพาะ
การโคลนยีน (gene cloning) จุดประสงค์: เพิ่มจ านวน DNA ที่มียีนตามต้องการจาก DNA recombination ให้มีปริมาณมากพอ เพื่อน าไปใช้ประโยชน์ได้ เรียกการเพิ่มจ านวน DNA ให้มากขึ้นว่า การโคลนยีน (DNA cloning) การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย พลาสมิด (plasmid) = DNA วงแหวนที่อยู่นอกโครโมโซม ของแบคทีเรีย ท าหน้าที่เป็นพาหะน า DNA หรือยีนเข้าสู่เซลล์ แบคทีเรีย E. coli
หลักการโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย 1. แยกพลาสมิดที่ใช้เป็นพาหะ และเลือกยีนจากโครโมโซมของ สิ่งมีชีวิต โดยใช้ restriction enzyme 2. เชื่อมชิ้นส่วน DNA กับ plasmid recombination DNA 3. น า recombination DNA ใส่ใน เซลล์แบคทีเรียผู้รับ 4. โคลนยีน โดยอาศัย plasmid ของแบคทีเรีย
การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR) เทคนิค PCR = การโคลน DNA ในหลอดทดลองเพื่อเพิ่มจ านวนโมเลกุลของ DNA ในปริมาณมาก โดยใช้เครื่องเพิ่มปริมาณ DNA อัตโนมัติ (thermocycler หรือ PCR machine) Thermocycler หรือ PCR machine = เป็นเครื่องมือที่ท าหน้าที่ควบคุม อุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนได้ตามที่ก าหนด สามารถก าหนดจ านวนรอบและเวลาได้อัตโนมัติ
กระบวนการโคลนยีนโดยเทคนิค PCR องคป์ ระกอบทท ี่า ให ้ เกด ิปฏก ิ ร ิิ ยาเคม ี มด ีั งน ี ้ 1. DNA template หรือ DNA แม่แบบซึ่งเป็นส่วนของ DNA ที่ต้องการโคลน 2. Primer หรือ DNA สายสั้นๆ ที่ใช้เกาะกับ DNA ที่ต้องการโคลน เพื่อเป็น จุดเริ่มต้นของการสังเคราะห์ DNA 3. นิวคลีโอไทด์ที่มีเบส A, T, G และ C 4. DNA polymerase ที่แยกได้จากแบคทีเรียชนิดพิเศษ ที่ทนต่ออุณหภูมิสูงได้ สารทั้งหมดนี้จะละลายอยุ่ในสารละลายบัฟเฟอร์ เพื่อควบคุมให้เกิดภาวะที่ เหมาะสมในการท าปฏิกิริยา
ข ั ้ นตอนปฏก ิ ร ิิ ยา PCR ใน 1 รอบ มี 3 ข ั ้ นตอน ด ั งน ี ้ 1. denaturation แยกสาย DNA จากสภาพที่เป็นเกลียวคู่ (double helix) ให้เป็น สายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิสูง 95 องศาเซลเซียส เวลา 30 วินาที (ต้องเลือกใช้เอนไซม์ DNA polymerase ที่สามารถทนความร้อนได้สูง เพื่อไม่ให้เอนไซม์เสื่อมสภาพไปก่อน) 2 . annealing ลดอุณหภูมิลงประมาณ 55 องศาเซลเซียส เวลา 20 วินาที เพื่อให้ไพรเมอร์สามารถจับกับบริเวณที่มีล าดับคู่เบสที่เป็นคู่สมกันกับ DNA แม่แบบด้วย พันธะไฮโดรเจนได้
3. extension เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ต่อจากไพร์เมอร์ ท าได้โดยการ ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการท างานของ DNA polymerase (72 o C เวลา 20 วินาที) ท าให้เกิดการจ าลองสาย DNA ** เพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอีกครั้ง (90-95) ท าให้ DNA สายคู่ที่เกิดจากปฏิกิริยาเคมีในรอบที่ 1 แยกออกจากกัน และเกิดปฏิกิริยาเคมีในรอบถัดไป
ปฏิกิริยา PCR จะเกิดขึ้น 25-40 รอบใช้เวลาประมาณ 1.5 -5 ชั่วโมง โดย DNA ที่เกิดขึ้นแต่ละรอบจะถูกใช้เป็นแม่แบบในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ในรอบ ต่อ ๆ ไปจนสิ้นสุดปฏิกิริยา
การเพ่ มิจา นวนโมเลกลุของ DNA ทไี่ดจ ้ ากหยดเลอ ื ด ด้วยเทคนิค PCR
สรุปเทคนิค PCR ทน ี่า มาใช ้ในปั จจ ุ บ ั น 1. ใช้เพิ่มปริมาณ DNA จากซาก mammoth ซึ่งสูญพันธุ์ไปแล้ว 2. ใช้ตรวจสอบ DNA จากคราบเลือด ชิ้นส่วนเซลล์ หรืออสุจิของอาชญากรในคดี อาชญากรรมต่าง ๆ เพื่อประโยชน์ด้านนิติวิทยาศาสตร์ 3. ใช้ตรวจสอบ DNA ของเซลล์ embryo ในครรภ์เพื่อหาความผิดปกติทางพันธุกรรม
การวิเคราะห์ DNA (DNA analysis) การวิเคราะห์ DNA (DNA analysis) = กระบวนการที่ใช้หาล าดับนิวคลีโอไทด์โดยการแยก โมเลกุลของ DNA ที่มีขนาดประจุและรูปร่างแตกต่างกันออกจากสนามไฟฟ้า โดยอาศัยเทคนิค อิเล็กโทรโฟริซิส (electrophoresis) ผ่านตัวกลางที่มีลักษณะคล้ายแผ่นวุ้นที่เรียกว่าเจล (gel) เรียกกระบวนการนี้ว่า กระบวนการเจลอิเล็กโทรโฟริซิส (gel electrophoresis)
หลักการแยกขนาด DNA โดยใช้เทคนิค gel electrophoresis น ามาแยกขนาดภายใต้สนามไฟฟ้า โดยให้ DNA ผ่าน agarose gel โมเลกุล DNA ที่มีขนาดแตกต่างกัน DNA ซึ่งมีประจุลบจะเคลื่อนที่เข้าหาขั้วบวก โมเลกุล DNA ที่มีขนาดใหญ่จะเคลื่อนที่ช้ากว่า โมเลกุลที่มีขนาดเล็ก จึงอยู่ใกล้ขั้วลบ ส่วนโมเลกุล DNA ขนาดเล็กจะเคลื่อนที่เร็วกว่าก็จะอยู่ใกล้กับ ขั้วบวก ย้อมแผ่นวุ้นด้วยสีอีธิเดียมโบรไมด์เพื่อให้สามารถ มองเห็น DNA ได้เมื่อได้รับแสงอัลตราไวโอเลต น า DNA ขนาดต่าง ๆ ไปเปรียบเทียบ กับ DNA ที่รู้ขนาดแล้ว ท าให้ทราบขนาดของ DNA ที่ต้องการศึกษา
ข ั ้ นตอนการแยกขนาด DNA โดยใช้เทคนิค gel electrophoresis
การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีทาง DNA การประยุกต์ใช้ในเชิงการแพทย์และเภสัชกรรม การวินิจฉัยโรค น าเอาเทคโนโลยีของ DNA มาใช้ในการวินิจฉัยโรคที่เกิดจากการติดเชื้อต่างๆ เช่น เชื้อไวรัส โดยการใช้เทคนิคPCR เพื่อตรวจสอบว่ามีจีโนมของไวรัสอยู่ในสิ่งมีชีวิตนั้นหรือไม่ ซึ่งเป็นเทคนิคที่มีความไวสูงและสามารถตรวจพบได้โดยมีตัวอย่างเพียงเล็กน้อย น าไปใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมก่อนจะมีอาการของโรคหรือเป็นเพียง พาหะ ท าให้สามารถป้องกันการถ่ายทอดลักษณะ ดังกล่าวได้ การบ าบัดด้วยยีน น ายีนปกติใส่เข้าไปในเซลล์ร่างกายของคนที่ เกิดความบกพร่องของยีน เพื่อช่วยบ าบัดอาการ บกพร่องที่เกิดขึ้น
การประยุกต์ใช้ในเชิงนิติวิทยาศาสตร์ ลายพิมพ์DNA (DNA fingerprint) มีลักษณะเฉพาะบุคคล โดยสร้างมา จาก DNA ที่ได้รับการถ่ายทอดมาจากพ่อและ แม่อย่างละครึ่งและเปลี่ยนแปลงไม่ได้ ท าให้ สามารถบอกความแตกต่างของบุคคลได้ จึงน ามาใช้ประโยชน์ได้หลายด้าน เช่น การ พิสูจน์ตัวบุคคล การพิสูจน์ความสัมพันธ์ทาง สายเลือด และการตรวจทางนิติเวชศาสตร์เพื่อ หาผู้กระท าความผิด เป็นต้น
หลักการท างานของเทคโนโลยีลายพิมพ์ DNA 1. เก็บตัวอย่างเซลล์ ตัวอย่างต้องมี DNA ที่มีคุณภาพ ไม่เสื่อมสลาย (ปัจจัยที่ท าให้ DNA เสื่อมสลายคือ ระยะเวลา อุณหภูมิ ความชื้ น แสงแดด สารเคมี จุลินทรีย์ ฯลฯ) 2. สกัด DNA จากเซลล์ของตัวอย่าง 3. ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ หลักการคือ เลือกตัด DNA ในส่วนที่แสดง เอกลักษณ์เฉพาะบุคคล โดยใช้ restriction enzyme จากนั้นน า ชิ้ นส่วน DNA ที่ถูกตัดมาวิเคราะห์ตามขนาดด้วยวิธี Gel Electrophoresi 4. แปลผลลายพิมพ์ DNA โดยการอ่านผลจากลักษณะต าแหน่งของแถบ ดีเอ็นหรือกราฟที่ได้
ประโยชน์ของลายพิมพ์ DNA ใช้พิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือด ใช้ในการติดตามการรักษาผู้ป่ วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไข กระดูก ในการรักษาลูคีเมีย ผู้ป่ วยต้องรับการปลูกถ่ายไข กระดูกจากผู้ให้ หากลายพิมพ์ดีเอ็นเอเลือดผู้ป่ วยเปลี่ยนไป แต่ลายพิมพ์เซลล์อื่น ๆ เหมือนเดิม แสดงว่าร่างกายไม่มี ปฏิกิริยาต่อต้านไขกระดูกจากผู้ให้ ใช้พิสูจน์หลักฐานทางนิติเวชศาสตร์
การประยุกต์ใช้ในเชิงการเกษตร การทา ฟารม ์ สัตวเ ์ พอ ื่ส ุ ขภาพของมน ุ ษย ์ นักวิทยาศาสตร์หายีนที่ท าให้สัตว์มีลักษณะตามต้องการ เช่น หมูมีไขมันต ่า วัวให้ นมเร็วขึ้นและมากขึ้น แล้วจึงย้ายยีนดังกล่าวเข้าสู่สัตว์ที่ต้องการ สร้างสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic animal) ที่เสมือนเป็นโรงงานผลิตยา เพื่อสกัดไปใช้ในการแพทย์ เช่น ถ่ายยีนให้ แกะเพื่อให้สร้างน ้านมที่เป็นโปรตีนยับยั้ง เอนไซม์ที่ก่อให้เกิดการท าลายเซลล์ปอด ในผู้ป่ วยที่เป็นโรคซิสติกไฟโปรซิส (cystic fibrosis) และโรคระบบทาง เดินหายใจเรื้อรัง
การสร้างสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic animal) * เริ่มจากการแยกเซลล์ไข่ออกจาก เพศเมีย และฉีดยีนที่ต้องการเข้าไปใน นิวเคลียสของเซลล์ไข่ จากนั้นท าการผสม พันธุ์ในหลอดทดลอง (in vitro fertilization) และถ่ายฝากเข้าในตัวแม่ผู้รับ เพื่อให้เจริญ เป็นตัวใหม่ ซึ่งจะมียีนที่ต้องการอยู่โดยไม่ จ าเป็นต้องมาจากสปีชีส์เดียวกัน
การสร้างพืชดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic plant) •ชะลอการสุกของผลไม้ ยืดระยะเวลาการเก็บรักษาผลผลิต • ต้านทานต่อโรคและแมลง • ต้านทานต่อสารฆ่าแมลง • มีคุณค่าทางอาหารมากขึ้น พืชดัดแปลง พนัธ ุ กรรมทมีี่ ความสามารถ ในการต้านทาน แมลง ฝา ้ ยทไี่ดร ้ บัการถ่ายยน ี ทส ี่รา ้ งสารพษิจาก Bacillus thuringiensis (BT)
พชื ดัดแปลงพนัธ ุ กรรมทม ี่ค ี วามต ้ านทานต่อโรค น ายีนที่สร้างโปตีนเปลือกไวรัส (coat virus protein gene) ถ่ายฝากในเซลล์ มะละกอ เพื่อป้องกันโรคใบด่างจุดวง แหวน พชื ดัดแปลงพนัธ ุ กรรมทต ี่้ านทานสารปราบวัชพืช น ายีนที่ต้านทานสารปราบวัชพืชถ่าย ฝากในเซลล์ถั่วเหลือง ข้าวโพด เพื่อให้ พืชทนต่อสารปราบวัชพืชได้
พชื ดัดแปลงพนัธ ุ กรรมทม ี่ค ี ุ ณค่าทางอาหารเพม ิ่ข ึ น้ + แบคทีเรีย Erwinia bacteria ต้น daffodil ข้าว ขา ้ วสท ี องทส ี่ามารถสรา ้ ง Vit A ในเมล็ดได้
พชื ดัดแปลงพนัธ ุ กรรมเพอ ื่ยด ื อาย ุ ของผลผล ิ ตใหน ้ านข ึ น้ น ายีนที่มีผลต่อการยับยั้งการสร้างเอนไซม์ที่ สังเคราะห์เอทิลีน ใส่ในมะเขือเทศ ท าให้ มะเขือเทศสุกช้าลง เก็บรักษาได้นานขึ้น สรุป เทคนิคพันธุวิศวกรรมน ามาสร้าง DNA รีคอมบิแนนท์ โดยการตัดสาย DNA ที่มียีนที่ ต้องการต่อกับ plasmid น ายีนที่ได้เข้าสู่สิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ได้สิ่งมีชีวิตที่มี ลักษณะตามต้องการ เรียกสิ่งมีชีวิตที่เกิดขึ้นว่า จีเอ็มโอ (GMOs)
ความปลอดภัยของเทคโนโลยีทาง DNA
มุมมองทางสังคมและจริยธรรม 1. อาจเกิดเชื้อโรคสายพันธุ์ใหม่ที่ดื้อยา ปฏิชีวนะ เพราะมีการใช้ยาปฏิชีวนะ ในการคัดเลือก 2. พืช GMOs มียีนของสิ่งมีชีวิตอื่นอยู่ ด้วย อาจท าให้เกิดอันตรายต่อ สุขภาพ 3. อาจมีการถ่ายเทยีนจากพืช GMOs ออกสู่สิ่งแวดล้อม ท าให้วัชพืช ต้านทานสารปราบวัชพืชได้ แนวทางการแก้ไข 1. จัดท าระบบป้องกันอันตรายทางชีวภาพ ที่ระบุข้อปฎิบัติอย่างชัดเจน 2. ท าลายสิ่งมีชีวิตที่ดัดแปลงพันธุกรรม ทันทีหลังเสร็จการทดลองด้วยวิธีการที่ เหมาะสม 3. การจ าหน่ายสิ่งมีชีวิตที่ดัดแปลง พันธุกรรมเพื่อเป็นอาหารหรือใช้ใน กระบวนการผลิต ต้องมีฉลากระบุ ชัดเจน