คู่มือการเพาะเลี้ยงหอยตะโกรมกรามขาว

1. การแยกเซลล์โดยใช้คาปิลลารี่ปิเปต การทำ คาปิลลารี่ปิเปต ทำ ได้โดยนำหลอดคาปิลปิลารี่หรี่รือรืหลอดแก้วก้เส้นส้ผ่าผ่นศูนศูย์กย์ลางไม่เม่กินกิ 0.7 มิลมิลิเลิมตร มาเผาไฟให้ปห้ลายอ่ออ่นแล้วล้ดึงดึให้ปห้ลายเรียรีวแหลม หักหัปลายที่ตีที่บตีออก นำ ไปส่อส่งดูด้ดูวด้ยกล้อล้งจุลทรรศน์เน์พื่อตรวจสอบว่าปลายเป็นเส้นตรงหรือไม่ หากปลายหลอดเป็นปากฉลามต้องทำ การดึงปลายใหม่ เมื่อได้คาปิลลารี่ปิเปตแล้วจึงนำ ไปดูดเซลล์แพลงก์ตอนที่ต้องการโดยมองผ่านจากกล้องจุลทรรศน์ดูดดูแพลงก์ตก์อนทีลทีะเซลล์หล์รือรืกลุ่มลุ่เล็กล็ๆ มาล้าล้งในน้ำ ทะเลที่ผ่ที่าผ่นการฆ่าฆ่เชื้อชื้หลาย ๆ ครั้งรั้จนกว่าว่จะได้เซลล์เดียว แล้วจึงนำ ไปใส่ในหลอดทดลองที่เติมน้ำ ทะเลที่ผ่านการฆ่าเชื้อ เลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิประมาณ 25 องศาเซลเซียส ความเข้มแสงประมาณ 3,000 ลักซ์ ระยะเวลาประมาณ 15 - 30 วัน จะเห็นแพลงก์ตอนเพิ่มจำ นวนขึ้นมาเป็นสีอ่อน ๆ จากนั้นนำ ไปตรวจสอบจนแน่ใจว่าได้แพลงก์ตอนเพียงชนิดเดียวจึงนำ ไปขยายต่อ2. การทำ ให้เจือจืจาง ถ้าถ้แพลงก์ตก์อนที่คัที่ดคัแยกสามารถเคลื่อลื่นที่ไที่ด้ เช่นช่ Tetraselmis sp.เหมาะสมที่จะใช้วิช้วิธีกธีารนี้ โดยเมื่อมื่วางตัวอย่าย่งทิ้งไว้ แพลงก์ตก์อนที่ว่ายน้ำ ได้จะไปรวมกลุ่มลุ่กันกัมองเห็นเป็นสีเข้ม ดูดเซลล์แพลงก์ตอนกลุ่มนั้นมาใส่ในหลอดทดลอง แล้วทำ ให้เจือจางในน้ำ เลี้ยงใหม่ โดยให้มีความหนาแน่นประมาณ 1 เซลล์/มิลลิลิตรการคัดแยกเซลล์แพลงก์ตอนพืชพืการเลี้ยลี้งเซลล์แพลงก์ตอนพืชพื ในจานอาหารวุ้นFisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทย47การเตรียมอาหารในจานเพาะเชื้อ โดยแบ่งน้ำ ที่จะใช้ทำ อาหารเลี้ยงเชื้อเป็น 2 ส่วนส่วส่นแรกผสมวุ้น 1.5 - 2% ตั้งไฟและคนให้วุ้ห้วุ้นละลาย อีกส่วส่นหนึ่งนึ่นำ ไปเติมสารอาหารตามสูตรในอัตอัราส่วส่นของปริมริาตรน้ำ ทั้งทั้หมด ควรเลือลืกใช้สูช้ตรอาหารที่ไที่ม่มีม่สมีารประกอบแอมโมเนียนีเพื่อพื่ตัดตัปัญปัหาเรื่อรื่งค่าค่พีเพีอช (pH) กับกัการแข็งข็ตัวตัของวุ้นวุ้ นำ ไปฆ่าฆ่เชื้อชื้ในหม้อม้นึ่งนึ่ความดันดั 15 นาที จากนั้นนั้นำ ออกมาผสมกันแล้วเทใส่จานเพาะเชื้อ เมื่อวุ้นแข็งตัวให้วางจานคว่ำ ลง รอจนไม่มีละอองน้ำใช้ปิช้เปิปตที่ปที่ลอดเชื้อชื้ดูดดูแพลงก์ตก์อนที่เที่ลี้ยลี้งไว้มว้าหยดลงบนอาหารวุ้นวุ้ 2 - 3 หยด ใช้ลูช้ปลูที่ฆ่ที่าฆ่เชื้อชื้แล้วล้เขี่ย (Streak) แพลงก์ตอนให้ทั่วบริเวณผิวหน้าของอาหารวุ้น วางจานอาหารวุ้นให้ได้รับแสงประมาณ 3,000 ลักลัซ์ ที่อุที่ณอุหภูมิภูปมิระมาณ 25 องศาเซลเซียซีส แพลงก์ตก์อนจะเจริญริเติบติ โตขึ้นขึ้มาโดยเห็นห็เป็นป็จุดจุหรือรืแถบสีตามสีของชนิดนิแพลงก์ตก์อน หลังลัจากนั้นนั้เลือลืกแพลงก์ตก์อนที่ขึ้ที่นขึ้เป็นป็ โคโลนีเดี่ยว ๆ ไปตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ หากเป็นแพลงก์ตอนที่ต้องการ ให้ใช้ลูปแตะแพลงก์ตก์อนโคโลนีนั้นีนนั้ ไปเขี่ยขี่บนจานอาหารวุ้นวุ้ ชุดชุใหม่ รอให้เห้จริญริเติบติ โตขึ้นขึ้มา ทำ ซ้ำ หลาย ๆ ครั้งรั้จนไม่พบแบคทีเรียหรือราขึ้นบนจานอาหารวุ้น เมื่อได้แพลงก์ตอนบริสุทธิ์แล้วจึงย้ายไปเลี้ยงในหลอดทดลองหรือรื ในขวดรูปชมพู่

FisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทยFisheries 48Department ofl กรมประมงประเทศไทย48เมื่อมื่ได้เด้ซลล์แล์พลงก์ตก์อนที่ต้ที่อต้งการแล้วล้ ขั้นขั้ตอนต่อต่ ไปเป็นป็การนำ หัวหัเชื้อชื้บริสุริทสุธิ์ไธิ์ปขยายในห้องปฏิบัติบั ติการ โดยมีขั้นตอนและวิธีกธีารดังต่อไปนี้อุปกรณ์1. ขวดรูปชมพู่ (ทนไฟ) ขนาด 1 ลิตร2. ขวดแก้ว (ทนไฟ) ขนาด 20 ลิตร3. แท่งแก้วกลวงสำ หรับรั ให้อากาศ และสายให้อากาศ4. ปิเปต (ขนาด 1 , 2 , 5 และ 10 มิลลิลิตร)5. จุกสำ ลี6. ลูกยาง 3 ทาง7. ตะเกียงแอลกอฮอล์8. หม้อนึ่งความดันวิธีดำธีดำเนินการ1. การขยายแพลงก์ตอนในขวดรูปชมพู่ ขนาด 1 ลิตร โดยการเตรียมน้ำ ทะเลให้มีความเค็มค็ 25 ppt. นำ มากรองด้วด้ยถุงถุกรองขนาด 1 ไมครอน และฆ่าฆ่เชื้อชื้ด้วด้ยหม้อม้นึ่งนึ่ความดันดั15 ปอนด์/ด์ตารางนิ้วนิ้อุณหภูมิภูมิ121 องศาเซลเซียซีส เป็นป็เวลา 15 นาที ทิ้งทิ้ไว้ใว้ห้เห้ย็นย็จากนั้นนั้กรอกน้ำ ใส่ขวดรูปชมพู่ (ทนไฟ) ขนาด 1 ลิตร แล้วจึงเติมสารอาหารและหัวเชื้อที่ได้จากการขยายพันพัธุ์ใธุ์นระดับดั Stock culture ปริมริาตร 100 มิลมิลิลิลิตลิร ให้อห้ากาศโดยใช้แช้ท่งท่แก้วก้กลวงต่อกับสายให้อากาศจุ่มลงในขวดจนถึงก้นขวด ใช้จุกสำ ลีปิดไว้บริเวณปากขวด ในขั้นตอนนี้จะเติมติก๊าก๊ซคาร์บร์อนไดออกไซด์ลด์งไปด้วด้ย โดยเติมติลงในระบบลมเฉพาะช่วช่งเวลากลางวันวัเท่าท่นั้นนั้2. การขยายแพลงก์ตอนในขวดแก้ว ขนาด 20 ลิตร โดยน้ำ ที่ใช้เลี้ยงแพลงก์ตอนจะใช้คช้วามเค็มค็ 25 ppt. กรองด้วด้ยถุงถุกรองขนาด 1 ไมครอน และฆ่าฆ่เชื้อชื้ด้วด้ยหม้อม้นึ่งนึ่ความดันดั15 ปอนด์/ตารางนิ้ว อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที หรือต้มน้ำ จนถึงจุดเดือดแล้วต้มต่ออีกเป็นเวลา 15 นาที กรอกลงขวดแก้วขณะยังร้อน ตั้งทิ้งไว้ให้น้ำ เย็นแล้วจึงเติมสารอาหารและหัวเชื้อแพลงก์ตอนจากขวดรูปชมพู่ปริมาณไม่น้อยกว่า 10%ของน้ำ เลี้ยง ส่วส่นการเติมอากาศและก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ทำ เหมือนกับข้อ 1.3. นำ หัวเชื้อจากข้อ 2 ไปใช้ขยายต่อในระดับปริมาณมากการเพาะขยายแพลงก์ตอนพืชในห้อห้งปฏิบัติการ

เมื่อเตรียมหัวเชื้อแพลงก์ตอนในห้องปฏิบัติการได้ปริมาณความเข้มข้นที่ต้องการแล้วขั้นขั้ตอนต่อต่ ไปเป็นป็การนำ หัวหัเชื้อชื้จากห้อห้งปฏิบัฏิติบักติารไปขยายเพื่อพื่ให้ไห้ด้ปด้ริมริาณมาก สำ หรับรันำ ไปใช้ในโรงเพาะฟัก ซึ่งมีขั้นขั้ตอนดังต่อไปนี้อุปกรณ์1. ถังเลี้ยงขนาดต่าง ๆ (50 200 500 หรือรื 1,000 ลิตร)2. กระบอกตวงสาร3. แท่งแก้วคนสาร4. ปั๊มน้ำ5. ถุงถุกรองน้ำ ขนาด 1 และ 5 ไมครอน6. สายอากาศและหัวทรายวิธีดำธีดำเนินการ1. การเตรียรีมน้ำ ทะเล ใช้น้ำช้ น้ำทะเลที่ผ่าผ่นการกรองด้วยถุงถุกรองขนาด 1 ไมครอน ปรับรัความเค็มค็ ให้ไห้ด้ 25 ppt. ฆ่าฆ่เชื้อชื้ด้วด้ยคลอรีนรีผง 15 - 30 ppm. หรือรืคลอรีนรีน้ำ 150 - 300 ppm.ให้อห้ากาศภายในถัง ทิ้งไว้ 1 คืน หลังลัจากนั้นนั้ ใช้โช้ซเดียมไธโอซัลเฟต 15 - 30 ppm. เพื่อกำ จัดคลอรีนให้หมดไป โดยทิ้งไว้ประมาณ 5 นาที ก่อนนำ น้ำ ไปใช้ให้ตักน้ำ ใส่ภาชนะใสแล้วหยดสารละลายโพแทสเซียมไอโอไดด์ 2 - 3 หยด คนให้เห้ข้าข้กันกัเพื่อทดสอบว่าว่มีคมีลอรีนรีตกค้าค้งหรือรืไม่ถ้าน้ำ ใสแสดงว่าไม่มีคลอรีนตกค้าง หากพบว่าน้ำ มีสีเหลืองแสดงว่ายังมีคลอรีนตกค้าง ให้ใส่โซเดียมไธโอซัลเฟตครั้งรั้ละ 1 ppm. ทดสอบจนน้ำ ไม่มีสีจึสีจึงนำ น้ำ ไปใช้ไช้ด้2. นำ น้ำ ที่เตรียมไว้มาใส่สารอาหาร และนำ หัวเชื้อแพลงก์ตอนจากห้องปฏิบัติการมาเติมลงในถังปริมาณไม่น้อยกว่า 10% ของน้ำ เลี้ยง ให้อากาศทิ้งไว้ประมาณ 3 วัน จึงนำหัวเชื้อชื้ ไปขยายต่อไปหรือรืนำ ไปเลี้ยงสัตสัว์น้ำการเพาะขยายแพลงก์ตอนพืชระดับปริมาณริมากFisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทย49

วิธีกธีารเตรียรีมตัวอย่าย่ง1. เช็ดทำ ความสะอาด Haemacytometer ด้วยกระดาษเช็ดสไลด์2. วาง Cover glass บน Haemacytometer3. หากแพลงก์ตก์อนที่ต้ที่อต้งการนับนัเป็นป็ชนิดนิมีหมีนวด ให้หห้ยดฟอร์มร์าลินลิความเข้มข้ข้นข้ 5%ลงในขวดตัวอย่างแล้วเขย่าเล็กน้อยเพื่อลดการเคลื่อนไหว4. ใช้ไมโครปิเปต (ใช้ปิเปตธรรมดาหรือดรอปเปอร์ปลายแหลมได้) ดูดตัวอย่างแพลงก์ตอนและนำ ปลายปิเปิปตมาวางใกล้ขอบ Cover glass จากนั้นนั้ค่อย ๆ หยดน้ำ ตัวอย่าย่งลงไปบริเริวณ Loading port หากหยดน้ำ ตัวอย่าย่งมากเกินไปจะทำ ให้ล้ห้ล้น Cover glass หรือรืน้อยเกินไปน้ำ จะไหลไม่เต็มพื้นที่ของ Cover glass ต้องทำ การล้างแล้วหยดตัวอย่างใหม่โดย 1 ตัวอย่าย่งแพลงก์ตอน จะหยดตัวอย่าย่ง 2 ซ้ำ5. ทิ้งไว้สักครู่เรู่ พื่อให้เซลล์ลงสู่พื้สู่พื้นของ Haemacytometer จึงทำ การนับตัวอย่าย่งวิธีกธีารนับจำ นวนแพลงก์ตอนการนับจำ นวนเซลล์แพลงก์ตอนพืชพื1. หากจำ นวนเซลล์น้อยกว่า 100 เซลล์ในแต่ละกริด ให้นับกริด A , B , C และ Dตามรูปด้านบน2. หากจำ นวนเซลล์มากกว่า 100 เซลล์ในแต่ละกริด ให้นับกริดตรงกลางในช่องหมายเลข 1 , 2 , 3 , 4 และ 5 ตามรูปด้านบนFisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทย50

หมายเหตุทำ การนับตัวอย่าง 2 ซ้ำ จากนั้นนำ มาคำ นวณหาความหนาแน่นเซลล์แพลงก์ตอนตามสูตร ดังนี้กรณีนัณี นับจำ นวนเซลล์ตามข้อ 110จำ นวนเซลล์ที่นับได้ในช่อช่ง A + B + C + D 4 ______________________________________________________ X4=ความหนาแน่นเซลล์(เซลล์/มิลลิลิตร)กรณีนัณี นับจำ นวนเซลล์ตามข้อ 210จำ 4___________________________________________________________จำนวนเซลล์รวมที่นับได้ในช่อช่งหมายเลข 1 - 5X5=ความหนาแน่นเซลล์(เซลล์/มิลลิลิตร) 25 XFisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทย51

เอกสารอ้างอิงFisheriesDepartment ofl กรมประมงประเทศไทย52ธิดา เพชรมณี. 2542. คู่มือการเพาะเลี้ยงแพลงก์ตอน. สถาบันวิจัยการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำชายฝั่ง. จังหวัดสงขลา.วรรณาภรณ์ เจริญยิ่งสุขจินดา. การเพาะขยายพันธุ์แพลงก์ตอนพืช. ศูนย์วิจัยและพัฒนาประมงชายฝั่งประจวบคีรีขันธ์. กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ์.ลัดดา วงศ์รัตน์. 2539. คู่มือการเลี้ยงแพลงก์ตอน. ภาควิชาชีววิทยาประมง คณะประมงมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ.สถาบันวิจัยทรัพรัยากรทางน้ำ . 2546. คู่มือมืการเพาะและอนุบนุาลหอยนางรมสำ หรับรัการเลี้ยง.กรุงเทพฯ.สำ นักนัวิจัวิยจัและพัฒนาประมงชายฝั่งฝั่. 2550. การจำ แนกชนิดนิแพลงก์ตก์อนในบ่อบ่เพาะเลี้ยลี้งกุ้งกุ้ทะเลและชายฝั่งทะเลตามมาตรฐานปลอดภัย. กรุงเทพฯ.สุนันท์ ภัทรจินดา. 2553. ประเภทของอาหารมีชีวิต. ภาควิชาวิทยาศาสตร์ทางทะเลคณะประมง มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ.สุวลี รักษาพราหมณ์. 2552. แพลงก์ตอนวิทยาเบื้องต้น. คณะเทคโนโลยีการเกษตรมหาวิทยาลัยราชภัฎสงขลา.