The words you are searching are inside this book. To get more targeted content, please make full-text search by clicking here.
Discover the best professional documents and content resources in AnyFlip Document Base.
Search
Published by ketsaraporn3011, 2019-06-17 07:42:40

Unit 5

Unit 5

บทที่ 5

วิธกี ารทางจุลชวี วิทยา

ครคู ธั รยี า มะลวิ ลั ย์

แผนกวชิ าสตั วศาสตร์
วทิ ยาลยั เกษตรและเทคโนโลยฉี ะเชงิ เทรา

ใบความรู้ที่ 5

วิธีการทางจลุ ชวี วทิ ยา

หัวข้อเรื่อง
1. อาหารเลย้ี งเชอื้
2. การเพาะเช้อื การแยกเช้อื และการย้อมสแี กรม
3. การเตรยี มตวั อย่างสาหรับกล้องจลุ ทรรศน์

จดุ ประสงคก์ ารเรยี นรู้(นาทาง)
1. เพื่อใหม้ ีความรแู้ ละเข้าใจเก่ียวกับชนิดและประเภทของอาหารเลี้ยงเช้อื
2. เพื่อใหม้ ีความรู้และเขา้ ใจเก่ยี วกับการเพาะเช้ือ การแยกเช้อื และการย้อมสีแกรม
3. เพอื่ ใหม้ ีความร้แู ละเขา้ ใจเกย่ี วกบั การเตรียมตัวอย่างสาหรับกล้องจลุ ทรรศน์

จดุ ประสงคก์ ารเรยี นรู้(ปลายทาง)
1. บอกชนิดและประเภทของอาหารเลยี้ งเชอื้ ได้
2. อธิบายการเพาะเชอ้ื การแยกเช้อื และการย้อมสแี กรมได้
3. อธบิ ายการเตรียมตวั อยา่ งสาหรบั กล้องจุลทรรศน์ได้

เน้อื หาการสอน

5.1 อาหารเลีย้ งเชอ้ื
อาหารเลี้ยงเชื้อ (Culture Media) เป็นสิ่งท่ีจาเป็นและสาคัญอย่างยิ่งในการศึกษาทางด้าน

จุลชีววิทยา เนื่องจากอาหารเลี้ยงเช้ือเป็นแหล่งอาหารที่จุลินทรีย์ต้องการในการเจริญและเพ่ิมจานวน
ตามที่ ผู้ศึกษาต้องการ อาหารเล้ียงเชื้ออาจมีส่วนประกอบและลักษณะทางกายภาพและเคมีต่างกัน
ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการเพาะเล้ียงและการนาไปใช้ในการศึกษาน้ันๆ อาหารเล้ียงเชื้อ (Culture
Media) เป็นสารอาหารท่ีเตรียมข้ึนเพ่ือสนองการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ท่ีทาการเพาะเล้ียง บางชนิด
เพาะเล้ียงได้ง่ายโดยอาศัยการเพาะเล้ียงทั่วๆ ไป แต่บางชนิดต้องการอาหารสูตรพิเศษ บางชนิดไม่
สามารถเพาะเลี้ยงใน Media ใดๆ ได้ จุลินทรีย์ท่ีเจริญในหรือบน Media มักจะเรียกว่า Culture
(คัลเจอร์) การเลือกอาหารสาหรับจุลินทรีย์จากตัวอย่างทางคลีนิค Culture Media มีหลักเกณฑ์หลาย
ประการทีจ่ ะตอ้ งคานึงถงึ ดงั นี้

1) ต้องประกอบดว้ ยสารอาหารทีถ่ ูกต้องและตรงตามความต้องการของจลุ ินทรีย์ทตี่ ้องการเล้ียง
2) มคี วามชน้ื ที่พอเหมา : pH เหมาะสม ระดบั หรอื ปริมาณ O2 ทเ่ี พยี งพอหรอื อาจจะไมต่ ้องใช้
O2 เลยก็ได้
3) ต้องผ่านกระบวนการทาให้ปลอดเช้ือหรือ Sterilization ก่อนการนามาใช้ท้ังน้ีเพื่อให้ม่ันใจว่า
เป็นการเพาะเลีย้ งจลุ ินทรีย์เพยี งชนดิ เดียวเทา่ น้ัน

4) อาหารท่ีเพาะแล้วต้องบ่ม ณ อุณหภูมิท่ีเหมาะสม ภายในระยะเวลาท่ีเพียงพอกับความ
ตอ้ งการของจุลินทรียแ์ ตล่ ะชนิด

5.1.1 ชนิดของอาหารเลี้ยงเชอ้ื

อาหารเลี้ยงเชื้อจะมีลักษณะเฉพาะของอาหารแต่ละชนิด ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการใช้งาน
แต่อาหารเล้ียงเช้ือโดยท่ัวไปควรปราศจากเชื้อปนเปอ้ื นหรือปราศจากเช้ือจุลนิ ทรีย์ใด และมีการเก็บรกั ษา
เพื่อไม่ให้มีการปนเป้ือนอยู่ตลอดเวลาเพ่ือให้ได้ผลการศึกษาท่ีถูกต้อง อาหารเล้ียงเชื้อต้องมีค่า pH
เหมาะสมกับการเจริญของแบคทีเรียท่ีต้องการศึกษา อาหารส่วนใหญ่มีค่า pH เป็นกลางอยู่ในช่วง
ประมาณ 6.5-7.5 แต่อย่างไรก็ตามอาหารบางชนิดอาจมีสภาพเป็นกรดหรือด่าง ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของ
จุลินทรีย์ท่ีต้องการศึกษา และอาหารเพาะเล้ียงเช้ือจะต้องมีธาตุและสารอาหารเพียงพอท่ีจุลินทรีย์ที่
ต้องการศึกษานาไปใช้ในการเจริญ ส่วนประกอบของอาหารโดยพื้นฐานแล้วสามารถส่ังซ้ือได้ตามตัวแทน
จาหน่ายทว่ั ไป โดยอาจเปน็ อาหารสาเร็จรูปหรอื เป็นชนิดทีต่ ้องช่ังเตรียมในแต่ละสว่ นประกอบตามสัดส่วน
ของอาหารเลย้ี งเชือ้ แตล่ ะชนดิ

ตารางที่ 5.1 ชนิดวตั ถุดิบและคุณคา่ ทางโภชนาการสาหรับอาหารเพาะเลีย้ งจลุ นิ ทรยี ์

ชนิดวตั ถดุ บิ ลกั ษณะ คุณคา่ ทางโภชนาการ

Beef extract สารสกดั จากเน้ือ สารอินทรีย์ท่สี ามารถละลายนา้ ได้ เชน่
คาร์โบไฮเดรต สารประกอบ ไนโตรเจน
Peptone สารสกัดที่แยกไดจ้ ากโปรตนี หลายชนดิ วิตามนิ และแรธ่ าตุ
Yeast extract เชน่ เคซนี เจลาตนิ ไนโตรเจน วิตามนิ คารโ์ บไฮเดรต บางชนดิ
Agar ผงสกดั จากยสี ต์ในสภาพทเ่ี ป็นของเหลว
กอ่ นทาใหแ้ ห้ง วิตามนิ B ไนโตรเจน คาร์บอน
สารสกดั จากสาหรา่ ยทะเล
ใช้ผสมในอาหารแข็งเพื่อให้อาหารคงรูป
ไม่ได้มีสารอาหารที่จาเป็นต่อการเจริญของ
จุลินทรยี ์

ทม่ี า : สนั ติ (2557)

5.1.2 ประเภทของอาหารเลี้ยงเชอ้ื

โดยท่ัวไปอาหารเพาะเล้ียงจุลินทรีย์มีหลายประเภทขึ้นอยู่กับเกณฑ์ในการแบ่ง ได้แก่ ประเภท
ของอาหารเล้ียงเชื้อแบ่งตามลักษณะทางกายภาพ ประเภทของอาหารเล้ียงเชื้อแบง่ ตาม ลักษณะทางเคมี
ประเภทของอาหารเลีย้ งเชื้อแบง่ ตามวตั ถุประสงค์ของการใช้งาน ดังน้ี

1) ประเภทของอาหารเลี้ยงเช้ือแบ่งตามลักษณะทางกายภาพ ซึ่งสามารถแบ่งได้เป็น 3 ประเภท
ดังน้ี

(1) Solid media (Agar) หรืออาหารแข็ง คืออาหารเลี้ยงเชื้อท่ีมีลักษณะผิวหน้าแข็ง
โดยมีการเติมวุ้นลงไป (15 กรัมต่อลิตรอาหาร) ในการเลี้ยงเช้ือจุลินทรีย์ Solid media อาจถูกเตรียมใน
จานเพาะเลี้ยงเช้อื (Petri dish) หรือเตรยี มในหลอดอาหารซ่ึงถ้าเอยี งอาหาร (Slant) หรือ อาหารไม่เอียง
เรียก Deep tube เพ่ือใช้เลี้ยงจุลินทรยี ์ทต่ี ้องการออกซิเจนในการเจรญิ เล็กนอ้ ย

(2) Semi-solid media หรืออาหารก่ึงแข็ง คือ อาหารเล้ียงเช้ือที่มีการเติมวุ้นลงไปใน
อาหารแต่มีปริมาณน้อยกวา่ อาหารแขง็ คอื ประมาณ 0.5% หรอื น้อยกว่า

(3) Liquid media (Broth) หรืออาหารเหลว คืออาหารชนิดท่ีไม่ได้เติมวุ้นลง ไปทาให้
อาหารมีลกั ษณะเหลว เชน่ Nutrient broth เปน็ ต้น

2) ประเภทของอาหารเล้ียงเช้ือแบ่งตามลักษณะทางเคมี ซ่ึงสามารถแบ่งได้เป็น 2 ประเภท ดังนี้
(1) Non-synthetic media เป็นอาหารชนิดท่ีไม่ทราบส่วนประกอบทางเคมีที่ แน่นอน

เช่น อาหารเลี้ยงเช้ือ Peptone drextrose agar (PDA) ที่มีส่วนผสมของมันฝร่ัง Peptone หรือ อาหาร
อนื่ ๆ ท่ีมสี ว่ นผสมของ Yeast extract, Meat infusion, Serum, Beef extract

(2) Synthetic media เป็นอาหารที่ทราบส่วนประกอบทางเคมีของอาหารท่ีแน่นอน
ทราบสว่ นประกอบวา่ สารชนิดใดบ้าง ปรมิ าณเท่าใด การเตรยี มจะตอ้ งมปี ริมาณสารเดิม เท่ากันทุกคร้ังทั้ง
สารอินทรยี ์หรอื สารอนินทรีย์ เช่น อาหารเลี้ยงเชือ้ มีกรดอะมิโนชนดิ A มีปริมาณ 0.05 กรัมตอ่ ลติ ร หรือมี
โซเดียมคลอไรด์ปรมิ าณ 0.1 กรัมต่อลิตร เป็นต้น

3) ประเภทของอาหารเล้ยี งเช้ือแบง่ ตามวตั ถุประสงค์ของการใชง้ าน สามารถแบง่ ได้ ดังน้ี
(1) Enriched media เป็นอาหารเลี้ยงเช้ือท่ีเติมสารบางอย่างลงไปเพื่อช่วยให้

แบคทีเรียที่เจริญยากหรือเจริญช้าสามารถเจริญได้เร็วขึ้น เช่น เติมเลือด หรือวิตามินลงไปในอาหารเล้ียง
เช้ือชว่ ยในการเจรญิ จลุ ินทรยี ์

(2) Enrichment media เป็นอาหารเล้ียงเช้ือที่มีการเติมสารบางอย่างลงไปเพ่ือ กระตุ้น
ให้แบคทีเรียที่ต้องการ เจริญได้รวดเร็วกว่าแบคทีเรียท่ีไม่ต้องการ เช่น การเติม Blood serum วิตามิน
หรือสารสกัดท่ไี ด้จากการเย้อื เย่ือสัตว์ลงไปใน Nutrient broth และ Nutrient agar เพื่อให้ จลุ ินทรีย์พวก
ก่อโรคเจรญิ ไดด้ ขี ึ้น

(3) Selective media เป็นอาหารเลี้ยงเช้ือที่เติมสารบางอย่างลงไปเพื่อไปยับยั้ง ไม่ให้
จุลินทรีย์ท่ีไม่ต้องการเจริญ เช่น สาร Crystal violet ที่เติมลงไปในอาหาร Baird Parker มีฤทธิ์ ยับย้ัง
การเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก หรือ Bile salt ที่เติมลงไปในอาหารอาหาร MacConkey agar
เพ่อื ยบั ย้งั แบคทีเรยี แกรมบวก โดยไมม่ ผี ลต่อแบคทเี รยี แกรมลบ

(4) Differential media เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่เติมสารเคมีเฉพาะที่ทาให้เกิดเป็น
ลักษณะโคโลนีของแบคทีเรียและการเปลี่ยนแปลงของอาหารเลี้ยงเชื้อลักษณะต่างๆ กัน ตาม คุณสมบัติ
ของแบคทีเรียแต่ละชนิด เช่น เลือดที่มีการผสมลงไปใน Blood agar แบคทีเรียบางชนิด สามารถย่อย

สลายเม็ดเลือดแดงได้อย่างสมบูรณ์ แต่แบคทีเรียบางชนิดอาจไม่สามารถย่อยสลายได้ ซึ่งสังเกตได้จาก
Clear zone รวมทั้งโคโลนีจะแสดงถึง Hemolysis แบบต่างๆ ซ่ึงสามารถแยกชนิด ของแบคทีเรียท่ี
ต้องการศึกษาได้อาหาร Differential media ชนิดอ่ืนๆ เช่น TCBS ใช้สาหรับคัดแยก แบคทีเรีย Vibrio
sp. หรอื EMB ใช้สาหรับการคัดแยกแบคทเี รียแกรมลบ

(5) Maintenance media คืออาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อใช้ในการเก็บรักษาคุณสมบัติทาง
กายภาพของเช้ือนั้น จะต้องเป็นสารอาหารท่ีแตกต่างจากสูตรท่ีเหมาะสมต่อการเจริญของเช้ือ เน่ืองจาก
หากมีการเจริญเต็มที่อาจทาให้มีการตายของจุลินทรีย์ในภายหลงั เช่น การเติมน้าตาล กลูโคสทาให้มีการ
เจริญเตม็ ที่แตอ่ าจมีการสร้างกรด หรอื สาร Metabolite อืน่ ๆ ทาให้แบคทีเรยี ตายได้

(6) Biochemical test media คืออาหารเล้ียงเชื้อท่ีใช้ในการตรวจสอบคุณสมบัติของ
เชอ้ื แตล่ ะชนดิ หรือใช้ในการจาแนกชนิดของแบคทเี รยี เช่น อาหาร Triple sugar iron media ใช้ ในการ
ทดสอบคุณสมบัติการใช้น้าตาลกลูโคส ซูโครส และแลคโตส ในการสร้างกรด/ด่าง และก๊าซในชุดทดสอบ
เดียวกนั เป็นต้น

ภาพท่ี 5.1 อาหารเลี้ยงเช้ือที่นิยมใช้ในการเพาะเล้ียงจุลินทรีย์ในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา (TSI :
Triple sugar iron media, EMB : Eosin methylene blue agar, TCBS : Thiosulfate Citrate Bile
Salts Sucrose Agar)

5.1.3 การกาจดั เชอื้ ให้ปราศจากเช้ือ
วิธีการทาให้ปราศจากเช้ือ (Sterilization) มีหลายวิธีข้ึนอยู่กับคุณสมบัติของสารที่เป็นอาหาร
เลี้ยงเชื้อ เช่น ถ้ามีสารที่ไม่ทนความร้อนหรืออาจเสียสภาพเม่ือผ่านความรอ้ นอาจต้องใช้วิธีการกรองด้วย
เย่ือกรอง นอกจากนี้ยังมีวิธีการใช้สารเคมีเพื่อกาจัดเช้ือ เช่น การใช้ยาปฏิชีวนะ การใช้รังสี การใช้คล่ืน
เสียง เป็นตน้ ส่วนวิธที ่ีนิยมใช้ในห้องปฏิบัติการ คอื การนาไปน่ึงด้วยเคร่อื งนึ่ง หรือ Autoclave ความดัน
ไอท่ีใช้มีประมาณ 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว ท่ีอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 -20 นาที
ซ่ึง ณ สภาวะน้าลายเชื้อจุลินทรีย์ได้ทุกชนิด รวมถึงโครงสร้างเอนโดสปอร์ที่แบคทีเรียสร้างขึ้น ไอน้าจะ
แทรกเข้าสู่เซลล์และทาให้โปรตีนและเอนไซม์ท่ีอยู่ภายในเซลล์เสียสภาพ การใช้เครื่อง Autoclave
ต้องศึกษารายละเอียดเก่ียวกับหลักการและวิธีการใช้ให้เข้าใจก่อน มิฉะน้ันอาจเกิดอันตรายได้ เนื่องจาก
ในระหวา่ งการใช้มีอณุ หภมู แิ ละความร้อนสงู

5.1.4 วธิ เี ตรียมอาหารเลี้ยงเชอื้
อาหารเลี้ยงเชื้อส่วนใหญ่ท่ีใช้ในห้องปฏิบัติการอาจเตรียมจากอาหารสาเร็จรูปท่ีผลิตมาพร้อมใช้
งาน
1) การเตรียมอาหารเล้ียงเช้ือจากอาหารสาเรจ็ รูป

นักศึกษาเพียงอ่านวิธีการใช้ท่ีระบุไว้ข้างขวดทาการชั่งให้ได้ตามปริมาณที่กาหนด ผสม
น้าหรอื สารบางอย่าง และทาให้ปลอดเช้อื กส็ ามารถนาไปใช้ได้

2) การเตรียมอาหารเล้ยี งเชือ้ ชนดิ ท่ไี มส่ าเร็จรูปหรอื ไม่มใี นห้องปฏิบตั กิ าร
นักศึกษาจะต้องหาสารให้ครบแล้วช่ังส่วนประกอบต่างๆ ทีละอย่างแล้วผสมลงใน

บีกเกอร์เดียวกันละลายน้าแล้วทาใหป้ ราศจากเช้ือก่อนนาไปใช้งาน
การเตรียมอาหารเล้ียงเช้ือแต่ละชนิดจะต้องทาการปรับค่าความเป็นกรดเป็นด่างให้ได้ตามความ

เหมาะสมของแบคทีเรียท่ีต้องการศึกษาแล้วค่อยถ่ายลงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อหรือขวด วิธีการทาให้
ปราศจากเชอ้ื ของอาหารเลี้ยงเช้ือในห้องปฏิบตั กิ ารนิยมใช้การนึ่งด้วยเครอ่ื งความดนั (Autoclave) โดยใช้
อุณหภูมิ 121 ° C ระยะเวลา 15 นาที อาหารเล้ียงเช้ือที่เตรียมลงในจานเพาะเลี้ยงเช้ือ หรือ Petri dish
จะต้องเตรียมลงในขวด หรือ ฟลาสก์ก่อนนาไปทาให้ปราศจากเช้ือแล้วค่อยนาไปเทลงในจานอาหารเลี้ยง
เชื้อที่ปราศจากเชื้อ (ด้วยวิธีการอบด้วยลมร้อนด้วยเคร่ือง Hot air oven ท่ีอุณหภูมิ 180 ° C เวลา
2 ช่ัวโมง) อาหารเล้ียงเช้ือท่ีเตรียมเป็นอาหารเอียง (Slant) เมื่อส่วนผสมอาหารเรียบร้อยให้บรรจุ อาหาร
ลงในหลอดอาหารเล้ียงเชื้อประมาณ 5 มิลลิลิตร จากน้ันนาไปทาให้ปราศจากเชื้อแล้วนาไปวางเอียงบน
Rack หรืออาจใช้วัสดุวางเพ่ือให้อาหารเอียง โดยให้อาหารอยู่ในระดับประมาณ 3-4 เซนติเมตร จากปาก
หลอดทดลองปล่อยไว้ให้อาหารเย็น หากเป็นอาหารชนิด Deep agar ให้นาอาหารเลี้ยงเชื้อที่อยู่ในหลอด
ทดลองวางไว้ใน Rack ปล่อยไว้ให้อาหารเย็น อาหารเล้ียงเช้ือท่ีเป็นอาหารเหลว หรือ Broth ให้บรรจุลง
ในหลอดทดลองหรือ ในฟลาสก์ตามวัตถุประสงค์ของการศึกษา แล้วนาไปทาให้ปราศจากเช้ือก่อนนาไปใช้
อาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิดอาจมีการเติมสารบางอย่างลงไป ซ่ึงสารดังกล่าวไม่สามารถนาไปน่ึงฆ่าเชื้อที่

อณุ หภูมสิ ูงได้เนือ่ งจากอาจเกิดการเสื่อมสภาพของคุณสมบัตทิ างเคมี นักศึกษาอาจต้องใช้วิธีการอื่นในการ
ทาใหป้ ราศจากเช้ือ เชน่ การนาไปกรองด้วยแผน่ กรองขนาดรูประมาณ 0.45 ไมโครเมตร หรืออาจเตมิ สาร
บางอยา่ งลงไปเพื่อทาลายจุลินทรยี ์ปนเปอื้ นโดยไม่มีผลตอ่ แบคทีเรยี ที่ต้องการศึกษา เมื่ออาหารเล้ียงเชือ้ ที่
เตรยี มไว้ผ่านการนงึ่ ฆา่ เชื้อแลว้ จงึ นาสารที่ทาให้ปราศจากเชอื้ เตมิ ลงไปทีหลงั การกอ่ นนาไปใช้
5.2 การเพาะเชื้อ

จุลินทรีย์ท่ีต้องการเพาะเลี้ยง เรียกว่า อินอคคิวลัม (inoculum) ซ่ึงมาจากแหล่งต่างๆ เช่น
บ่อน้า ดิน อากาศ หรือลาธาร หรืออาจมาจากตัวอย่างของคนไข้ และเรียกอาหารเล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ว่ า
อาหารเพาะเช้ือ (medium) ส่วนจุลินทรีย์ท่ีมาจากการเลี้ยงอินอคคิวลัม เรียกว่า (culture) อาหารที่ใช้
เล้ียงจุลินทรีย์ที่มีลักษณะเป็นของเหลว เรียกว่า บรอธ (broths) จุลินทรีย์ที่เล้ียงบนผิวหน้าอาหารแข็ง
และสามารถมองเห็นด้วยตาเปล่า เรียกว่า โคโลนี (colony) แบคทีเรียแต่ละชนิดมีลักษณะโคโลนีท่ีเฉพาะ
แตกตา่ งกันไป ได้แก่ สี ขนาด รูปรา่ ง ความสงู ขอบโคโลนแี ละเทคเจอร์ (texture)

ภาพที่ 5.2 ลกั ษณะโคโลนีของแบคทีเรยี

5.2.1 เทคนคิ การเพาะเลี้ยงจุลินทรยี ์
เน่ืองจากจุลินทรีย์บางชนิดไม่สามารถเจริญในอาหารเลี้ยงเช้ือได้ หรือบางชนิดไม่

สามารถเจริญในสภาวะปกติท่ัวไปได้ บางชนิดพบในส่ิงแวดล้อมปริมาณน้อย ดังน้ันจึงได้มีการพัฒนา
เทคนิคพิเศษเพ่อื เพาะเลี้ยงจุลินทรยี ์เหล่านี้มา ไดแ้ ก่

1) การเพาะเล้ยี งในสตั ว์และเซลล์ เช่น การเพาะเลีย้ งในตัวน่มิ กระตา่ ย ไขข่ องสัตว์ปีก
2) การเพาะเล้ียงในสภาวะที่มีออซิเจนต่า เป็นการจาลองหรือเลียนแบบสภาวะ
ส่ิงแวดล้อมของเน้อื เย่อื ของคน เช่น บรเิ วณลาไสเ้ ล็ก และทางเดนิ หายใจ เป็นตน้

5.3 การแยกเชือ้ บรสิ ุทธิ์
เช้ือบริสุทธิ์ (Pure culture) หมายถึง เชื้อเพียงชนิดเดียวที่อยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ ซึ่งมีคุณสมบัติ

เหมือนกันทุกประการ หากมีการปนเป้ือน (Contamination) หรือการมีเชื้อผสมมากกว่าหน่ึงชนิดจะทา
ให้คุณสมบัติของการทดลองที่ต้องการศึกษาได้ผลการทดลองที่คาดเคล่ือนและไม่ตรงกับความเป็นจริง
ดังนั้นการศึกษาเทคนิคทางจุลชีววิทยาจะต้องมีความสามารถในการแยกเช้ือให้บริสุทธ์ิด้วยเทคนิคปลอด
เช้ือดังที่ได้กลา่ วมาแล้วน้นั เทคนิคและวธิ กี ารแยกเชอ้ื ใหบ้ ริสทุ ธ์ิมี หลายวิธี ดงั น้ี

5.3.1 เทคนิคการขีดเช้ือ (Steak plate) เป็นการขีดเช้ือโดยการใช้ห่วงเข่ียเช้ือ (Loop) ลนไฟ
จนร้อนแดงและทิ้งให้เย็น จากน้ันแตะท่ีเชื้อจุลินทรีย์ท่ีต้องการแยกให้บริสุทธ์ิ โดยนามาขีดบนอาหารวุ้น
แข็ง ลากเป็นแนว เชื้อจุลินทรีย์จะเจริญตามแนวรอยขีด เทคนิคการขีดเช้ือสามารถทาได้หลายแบบตาม
วตั ถปุ ระสงค์ของการศกึ ษา

5.3.2 Simple steak เป็นการขีดเชื้ออย่างง่ายโดยการขีดเชื้อเพียงแนวเดียว มักใช้ในกรณีท่ี
ตัวอย่างมีเชื้อจานวนน้อยๆ หรือใช้สาหรับการถา่ ยเช้ือลงในอาหารแข็งเพื่อเก็บรักษาเช้ือ หรอื ตอ้ งการเชื้อ
จานวนมากขน้ึ เทา่ นั้น

5.3.3 Cross steak การขีดเช้ือแบบตัดกัน นิยมใช้มากในห้องปฏิบัติการ การขีดเช้ือวิธีนี้มี
วัตถุประสงค์เพื่อแยกเช้ือให้ได้โคโลนีเดี่ยวๆ โดยจะทาการขีดเส้นบนอาหารวุ้นแข็งตามแนวประมาณ
3-4 แนว ซ่ึงทุกครั้งท่ีทาการขีดเชื้อในแต่ละแนวต้องลนไฟท่ี Loop และรอให้เย็น โดยลากเชื้อให้ตัดกัน
(Cross) กับแนวเชอ้ื ที่ลากผ่านมาแลว้ เล็กน้อย ซึง่ จะลากเส้นจากห่างไปถจ่ี นได้โคโลนเี ด่ยี วๆ แยกออกมา

ภาพท่ี 5.3 ลักษณะการขีดเชือ้ แบบ Cross steak และลักษณะโคโลนเี ดย่ี วทีแ่ ยกได้

5.3.4 เทคนิคการเทเพลต (Pour plate) เป็นเทคนิคการเทอาหารท่ีมีวุ้นผสมท่ียังอุ่นๆ โดย
เตรียมให้มีอุณหภูมิโดยประมาณ 50 องศาเซลเซียส และไม่แข็งตัวผสมลงในตัวอย่างท่ีต้องการศึกษา
โดยทั่วไปการเตรียมตัวอย่างเชื้อจะใช้เชอื้ ปรมิ าณ 1 มิลลิลิตร ปิเปตลงในจานเพาะเลีย้ งเช้อื กอ่ นเทอาหาร
เลี้ยงเช้ือผสม และทาการหมุนเพลตเพ่ือกระจายเชอื้ ให้ผสมเข้ากับอาหารเลี้ยงเช้ือ ข้อดีของเทคนิคน้ี คือ
สามารถแยกเช้ือบางชนิดท่ีเจริญโดยไม่ต้องการ/หรือต้องการออกซิเจนในปริมาณน้อย เน่ืองจากเช้ือ
สามารถเจริญไดใ้ นอาหารหลงั จากท้ิงไว้ให้อาหารแข็งตัวที่อุณหภูมิห้อง ประมาณ 20 – 30 นาที คว่าจาน
เพาะเลย้ี งแลว้ นาไปบม่ ทตี่ ูบ้ ่มเช้อื สามารถนามาคานวณหาจานวนโคโลนใี นหนว่ ย CFU/mL ได้

5.3.5 เทคนิคการกระจายเช้ือ (Spread plate) เป็นเทคนิคที่มีการกระจายเช้ือหรือเกล่ียเชื้อลง
บนอาหารแข็งท่ีเตรียมไว้แล้วในจานเพาะเลี้ยงเชื้อ โดยปกติแล้วใช้ตัวอย่างเช้ือปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร
การกระจายเช้ือจะใช้แท่งแก้วรูปตัว L ท่ีมีการทาให้ปราศจากเชื้อด้วยการจุ่มในแอลกอฮอล์ความเข้มข้น
95 เปอร์เซ็นต์ แล้วเผาไฟเพ่ือทาลายเช้ือ กระจายเชื้อจนกระทั่งตัวอย่าง กระจายท่ัวทั้งอาหารในจาน
เพาะเลี้ยงเช้อื ควา่ จานเพาะเล้ียงแลว้ นาไปบ่มทีต่ ูบ้ ่มเช้ือ

ภาพที่ 5.4 ขนั้ ตอนวธิ ีการเทเพลตและการกระจายเช้ือ

5.4 เทคนิคการยอ้ มสีเซลล์แบคทีเรยี
เซลล์จุลินทรีย์มีน้าเป็นองค์ประกอบเสียส่วนใหญ่ เมื่อถูกแขวนลอยในตัวกลาง (Medium)

ที่เป็นน้าเสมอื นกับนาวตั ถุสขี าววางบนพ้ืนสีขาว จงึ ไมส่ ามารถจะแยกแยะเซลลจ์ ากตัวกลางได้ จาเป็นตอ้ ง
ใช้สีย้อมเซลล์เพื่อให้เด่นชัดขึ้น ก่อนที่จะทาการย้อมเซลล์แบคทีเรียจาเป็นต้องทาการแพร่เซลล์ลงบน
สไลด์อย่างบางๆ เพ่ือแยกเซลล์ออกเป็นเซลล์เดี่ยวๆ ให้มากที่สุด เรียกว่า การทา Smear โดยใช้ลูป
(Loop) แตะเช้ือแบคทเี รียจากโคโลนีเดี่ยวๆ เพียงเล็กน้อยแล้วผสมเข้ากบั หยดน้าบนสไลด์ ปล่อยท้ิงไวใ้ ห้
แห้งในอากาศ แล้วนาไปลนเปลวไฟเพ่ือเป็นการตรึงเซลล์แบคทีเรีย โดยการขับน้าออกจากเซลล์แล้วฆ่า
เชอื้ แบคทเี รยี ดว้ ย วธิ นี ้เี รยี กวา่ การทา Heat fix เซลลแ์ บคทีเรียกพ็ รอ้ มทจี่ ะถกู ยอ้ มสี

การย้อมสีจุลินทรีย์ในเทคนิคทางจุลชีววิทยา มีวิธีการย้อมหลายแบบ ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของ
การศึกษา เช่น การย้อมสีแกรม การย้อมสีเอนโดสปอร์ การย้อมสีแฟลกเจลลัม การย้อมสีจุลินทรีย์อาศัย
หลักการของประจุเซลล์ โดยผนังเซลล์ช้ันนอกรวมไปถึงไซโทพลาสซึมของเซลล์แบคทีเรีย จะมีประจุลบ
(Negatively charged) เป็นผลเนื่องจากอิทธิพลของประจุลบจากกรดนิวคลีอิก (DNA) และโปรตีน
โมเลกุล เม่ือเทสีย้อมประเภท Basic dye (ตัวสี, Chromophore, เป็นประจุบวก) เชน่ สี Crystal violet,
Methylene blue ตัวสีของสีย้อมจะถูกดึงเข้าเกาะผนังเซลล์ และCytoplasm การย้อมสีประเภทน้ี
เรียกว่า Positive staining technique ในทางตรงกันข้ามเม่ือย้อมสีที่มีประจุเป็นลบ คือสีประเภท
Acidic dye เช่น Nigrosin, Congored ตัวสีย้อมจะถูกผลักให้อยู่รอบๆ เซลล์ เนื่องจากทั้งเซลล์และ
ตัวสีเป็นประจุเดียวกัน การย้อมสีประเภทน้ีเรียกว่า Negative staining นอกจากน้ีการย้อมสีอาจมีการ
ยอ้ มสีมากกว่าหนึ่งสี เพื่อวัตถุประสงค์บางประการในการย้อมสีจะต้องมีการล้างสีออก เมื่อต้องการย้อมสี
ท่ีสอง ซึ่งนิยมใช้สารละลายอินทรีย์ล่างสีย้อมออกจากเซลล์ (สารละลายอาจเป็น 95% alcohol หรือ
Acid alcohol) การย้อมสีด้วยวิธีน้ีเป็นเทคนิคการย้อมสีแบบ Differential staining technique เช่น
การย้อมสีแกรม (Gram’s staining) การย้อมสีนี้ สามารรถแยกแบคทีเรียออกเป็น 2 กลุ่ม คือแบคทีเรีย
แกรมบวก (Gram-positive bacteria) และแบคทีเรียแกรมลบ (Gram-negative bacteria) การย้อมสี
Acid Fast เทคนคิ การยอ้ มสแี บบนจ้ี ะเป็น ส่วนหนง่ึ ของการใชใ้ นการวินจิ ฉัยหาเชื้อแบคทีเรียที่เปน็ ตน้ เหตุ
ของวัณโรค (Mycobacterium tuberculosis) ในการย้อมจะมีการใช้กรดในการชะล้างไขมันที่เป็น
ส่วนประกอบของเซลล์และใช้ ความร้อนในการส่งเสริมให้เซลล์ติดสีได้ดียิ่งขึ้น การย้อมสีโครงสร้างของ
แบคทเี รยี เชน่ การย้อม แฟลกเจลลัม การย้อมแคปซลู เปน็ ต้น

ภาพท่ี 5.5 การยอ้ มสีแบคทเี รยี แบบตา่ งๆ

5.5 การเตรยี มตัวอย่างสาหรับกล้องจลุ ทรรศน์

ในการเตรียมตัวอย่างทางชีววิทยาเพ่ือศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ ตัวอย่างทางชีววิทยาทจ่ี ะนามา
ศึกษาจะต้องผ่านกระบวนการเตรียมให้อยู่ในสภาพท่ีเหมาะสมแก่การศึกษา กล่าวคือ อยู่ในสภาพท่ีแสง
ส่องผ่านได้ และอยู่บนภาชนะหรือสไลด์แก้วที่แสงส่องผ่านได้เช่นกัน ในกรณีอยู่บนสไลด์แก้ว ตัวอย่าง
จะต้องอยู่ในตัวกลางท่ีมีความใสและหักเหแสงได้ เช่น น้า น้ามัน หรือ resin (เรซิ่น) และ ต้องมีแผ่น
กระจกปิดสไลด์ (cover glass) ปิดไว้ เพ่ือให้เกิดระนาบท่ีเสมอกันทางด้านบนซึ่งมีผลต่อการ หักเหแสง
เข้าส่เู ลนสข์ องกลอ้ งจลุ ทรรศน์ ในการเตรียมตัวอย่างทางชวี วทิ ยาเพอื่ ศกึ ษาภายใตก้ ล้องจุลทรรศน์ วธิ กี าร
เบื้องต้นที่ง่ายท่ีสุด คือ การเตรียมสไลด์สด (wet mount) ซึ่งเป็นการนาตัวอย่างทางชีววิทยาที่อยู่ใน
ตวั กลางที่เป็นน้า เช่น ส่ิงมีชีวิตในนา้ หรือช้ินเนื้อเย่อื ท่ีแชใ่ นน้า มาทาสไลด์ท่ีสามารถนาไปใช้ศึกษาภายใต้
กล้องจุลทรรศน์ได้ทันทีโดยไม่ต้องผ่านกระบวนการท่ีซับซ้อน หากการเตรียมสไลด์สดไม่เพียงพอท่ีจะ
ศึกษารายละเอียดโครงสร้างของตัวอย่างได้ จึงจะมีการนาเทคนิคการเตรียมสไลด์แบบอ่ืน ๆ เข้ามาใช้
วิธีการพน้ื ฐานในการเตรียมตัวอย่างทางชีววิทยาเพื่อศึกษาภายใตก้ ลอ้ งจุลทรรศนท์ ่ีนิยมใชก้ นั ในปัจจุบนั มี
3 วธิ ี ได้แก่

1. การเกล่ยี ใหบ้ าง หรือการ smear (สเมียร)์
การเตรียมสไลด์ smear เป็นเทคนิคท่ีนิยมใช้ในการเตรียมตัวอย่างทางชีววิทยาที่มี ลักษณะเป็น
ของเหลว หรือค่อนข้างเหลว เช่น เลือด เมือก ไขกระดูก ไขสันหลัง และเซลล์ ท่ีเพาะเลี้ยงไว้
(cell culture)
2. การเตรียมสไลด์ทง้ั ชิน้ ตัวอย่าง หรอื การทา whole mount (โฮล เมา้ ท์)
การเตรียมสไลด์ whole mount เป็นเทคนิคที่นิยมใช้กับตัวอย่างสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก เช่น
protozoa (โปรโตซัว) พืชขนาดเล็ก หรือสัตว์ขนาดเล็ก ท่ีสามารถนาชิ้นส่วนที่ต้องการศึกษามาวางลงบน
สไลด์ได้ท้ังชิ้นหรอื ท้ังตัว มขี อ้ จากัดคือช้นิ สว่ นหรอื ตัวสิ่งมชี ีวติ นั้นจะตอ้ งใส และแสงสามารถส่องผา่ นได้
3. การตัดใหบ้ าง หรอื การตดั section (เซค็ ช่ัน)
การเตรียมสไลด์ section เป็นเทคนิคการเตรียมสไลด์เพื่อใช้สาหรับศึกษาโครงสร้าง ภายในของ
สง่ิ มีชีวิต เช่น เซลลต์ ่าง ๆ ท่ีเป็นโครงสรา้ งของเนื้อเยือ่ และอวัยวะของพืชและสตั ว์ นอกจากการตดั ให้บาง
แล้ว ยังมีวิธีทาให้บางอีกวิธีหน่ึง คือ การลอก (peeling) ซ่งึ นิยม ใช้ในการศึกษาเซลลแ์ ละเน้ือเย่ือพืช เช่น
การลอกผวิ ใบไม้

ภาพที่ 5.6 สไลด์ของตัวอยา่ งทางชวี วทิ ยาทใ่ี ชศ้ ึกษาดว้ ยกล้องจลุ ทรรศน์แบบใชแ้ สง เตรยี มโดยเทคนิค
(1) การเกลย่ี ใหบ้ าง หรือการ smear
(2) การทาสไลด์ท้ังช้ินตัวอยา่ ง หรอื การทา whole mount และ
(3) การตดั ชิ้นเนอ้ื ใหบ้ าง หรือการตัด section


Click to View FlipBook Version