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Published by andreaires, 2019-03-12 09:08:14

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ANAIS da Academia Cearense de Ciências Volume 2, n. 2, p. 91 - 160, Ago - Dez, 2018

ANAIS da Academia Cearense de Ciências

ANNALS of Ceará Academy of Science

Publicação Oficial da Academia Cearense de Ciências
Official Publication of Ceará Academy of Science

VOL. 02 - N° 02 Ago – Dez 2018 ISSN 2594-3618

Academia Cearense de Ciências www.aceci.com.br
Aceci



ANAIS da Academia Cearense de Ciências

ANNALS of Ceará Academy of Science
Publicação Oficial da Academia Cearense de Ciências

Official Publication of Ceará Academy of Science

VOL. 02 - N° 02 Ago – Dez 2018 ISSN 2594-3618

Academia Cearense de Ciência ANAIS da Academia Cearense de Ciências
Diretoria: Período: 2018 – 2020 ANNALS of Ceará Academy of Science

Presidente Publicação Oficial da Academia Cearense de
José Albérsio de Araújo Lima Ciências

Vice-Presidente Official Publication of Ceará Academy of Science
João Lucas Marques Barbosa
Comissão Editorial/ Editorial Committee
Secretário Geral Endereço/Address
Luiz Sérgio Gadelha Vieira
Rua Oswaldo Cruz, 2979 – Fortaleza - CE
Diretor Científico Editor/Editor
Geraldo Arraes Maia
José Albersio de Araujo Lima
Diretor Social Editor Adjunto/Adjunct Editor
João Erfon Almeida Ramos
Geraldo Arraes Maia
Diretora de Patrimônio
Maria Clélia Lustosa Costa

Conselho Superior Editores Associados/Associate Editors
Antonio de Albuquerque Sousa Filho Francisco Suetônio Bastos Mota
Francisco Suetônio Bastos Mota Geraldo Arraes Maia
Glauce Socorro Barros Viana Glauce Socorro Barros Viana
José Henrique Leal Cardoso José Henrique Leal Cardoso
José Nilson Bezerra Campos José Nilson Bezerra Campos
Krishnamurti de Morais Carvalho Krishnamurti de Morais Carvalho
Pedro Sisnando Leite

Ficha Técnica

Editoração e Composição
Ana Cláudia M. M. Miranda

Catalogação – Bibliotecária
Perpétua Socorro Tavares Guimarães – CRB 3/801

Impressão & Acabamento
Expressão Gráfica

Ficha Catalográfica
Bibliotecária: Perpétua Socorro Tavares Guimarães – CRB 3/801

ANAIS da Academia Cearense de Ciências. Artigos Científicos. Anais...– v. 2.
n.2 (ago./dez. 2018) - Fortaleza, 2018.

Semestral
ISSN 2594-3618
1. Ciências – Periódico. 2. Ciências Biológicas – Periódico. 3. Ciências
Exatas e da Terra. 4. Ciências Humanas e Sociais Aplicadas. I. Academia
Cearense de Ciências.
CDD 372-46

Acadêmicos Titulares & Acadêmicos Afiliados

Solenidade de Posse de Novos Acadêmicos
Auditório Antonio Martins Filho – Reitoria

Universidade Federal do Ceará
17 de Agosto de 2018

Relação da Esquerda para a Direita e de Cima para Baixo
1- Sérgio Gadelha Vieira (Titular – Cadeira: 41); João César Moura Mota (Titular – Cadeira: 37);

Lucicléia Barros de Vasconcelos (Afiliado); Augusto Teixeira de Albuquerque (Afiliado);
Pedro Sisnando Leite (Titular – Cadeira: 13); Maria Clélia Lustosa Costa (Titular – Cadeira:
21); Jader Onofre de Morais (Titular – Cadeira: 17); Antonio Gomes de Souza Filho (Titular
– Cadeira: 12) e Lucas Antonio de Sousa Leite (Titular – Cadeira: 46).
2- Antônio de Albuquerque Sousa Filho (Titular – Cadeira: 24); Tarcisio Haroldo Cavalcante
Pequeno (Titular – Cadeira: 08); João Lucas Marques Barbosa (Titular – Cadeira: 02);
Krishnamurti de Morais Carvalho (Titular – Cadeira: 47); Renato de Azevedo Moreira
(Titular – Cadeira: 36); Geraldo Arraes Maia (Titular – Cadeira: 42); José Albersio de Araujo
lima (Titular – Cadeira: 16 - Presidente); Glauce Socorro Barros Viana (Titular – Cadeira:
19); Lidriane de Souza Pinheiro (Titular – Cadeira: 45); Selene Maia de Morais (Titular
– Cadeira: 40); Fernanda Montenegro de Carvalho Araújo (Titular – Cadeira: 50) e José
Tarquínio Prisco (Titular – Cadeira: 20).

Membros Titulares da Academia

Cadeira Acadêmico Patrono

01 José Henrique Leal Cardoso Samuel Pessoa
02 João Lucas Marques Barbosa Joaquim Gomes de Souza
03 Antônio Enéas Mendes Bezerra Rodrigues de Andrade
04 Paulo Bonavides Jáder de Carvalho
05 Caio Lóssio Botelho Thomaz Pompeu de S.a Brasil
06 Francisco Militão de Sousa Renato Braga
07 Afrânio Aragão Craveiro Hugo Lopes de Mendonça
08 Tarcísio Haroldo Pequeno Prisco Bezerra
09 Manassés Claudino Fonteles Lauro Solero
10 João Erfon Almeida Ramos Manoel Frota Moreira
11 João Carlos Ribeiro Gonçalves Oceano Atlântico Linhares
13 Pedro Sisnando Leite João Gonçalves de Souza
14 José Wilson de Alencar Nelson Chaves
15 Marta Celina Linhares Sales João Ramos
16 José Albérsio de Araújo Lima Antônio Carlos Estêvão Oliveira
17 Jader Onofre de Morais João Batista V. Dias
18 José Gerardo Beserra de Oliveira Galba Araújo
19 Glauce Socorro Barros Viana Dias da Rocha
20 José Tarquínio Prisco Adolpho Ducke
21 Maria Clélia Lustosa Costa Thomaz Pompeu Sobrinho
22 Maria Zélia Rouquayrol Rodolfo Teófilo
24 Antônio de Albuquerque Sousa Filho José Guimarães Duque
25 Geraldo de Sousa Tomé Luigi Bogliolo
26 José Santiago Lima Verde Rodolpho Von Ihering
27 Vicente de Paulo P. Barbosa Vieira Arrojado Lisboa
28 Teresinha de Maria Bezerra S. Xavier Antônio Bezerra
31 José Nilson Bezerra Campos Francisco Gonçalves de Aguiar
32 Eduardo Diatahy Bezerra de Menezes João Capistrano Honório de Abreu
33 Francisco Suetônio Bastos Mota Delmiro Gouveia
34 José Ferreira Nunes Silvio Barbosa Cardoso
36 Renato de Azevedo Moreira Expedito José de Sá Parente
37 João Cesar Moura Mota Oswaldo Evandro Carneiro
38 Andrelina Noronha Coelho de Souza Oliveira Riedel
39 Joaquim Celestino Júnior José Júlio da Ponte Filho
40 Selene Maia de Morais Francisco José de Abreu Matos
41 Luiz Sérgio Gadelha Vieira Ari de Sá Cavalcante
42 Geraldo Arraes Maia Francisco Alves de A. e Castro
43 Manoel Odorico de Moraes Joaquim Eduardo de Alencar
44 Luquésio Petrola de Melo Jorge Alberto Azevedo
45 Lidriane de Souza Pinheiro Aziz NacibAb´Saber
46 Antonio de Sousa Leite Afrânio Gomes Fernandes
47 Krishnamurti de Morais Carvalho Airton Fontenele Sampaio Xavier
48 Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura João Ambrósio de Araújo Filho
50 Fernanda Montenegro de C. Araújo José Jarbas Studart Gurgel

Membros Honorários da Academia

Acadêmico

Prof. Dr. Benedito Vasconcelos Mendes – Escola Superior de Agricultura de Mossoró
Profa. Dra. Dafna Scwartz - Ben-Gurion University of the Negev – Israel
Prof. Emérito Dr. Raphael Bar-El – Ben-Gurion University of the Negev – Israel
Prof. Dr. Raimundo Braz Filho - Pesquisador Visitante Emérito da FAPERJ/UFRRJ/UENF, Prof. Emérito da UFRRJ

e da UENF, Prof. Honoris causa da UFC e da UFPB, Pesquisador Sênior do CNPq,
Membro Titular da ABC
Prof. Dr. Manoel Abílio Queiroz - Professor Titular Universidade do Estado da Bahia; Prof. Visitante da Universidade

do Estado da Bahia

Membros Afiliados da Academia

Acadêmico CV Lattes

Augusto Teixeira de Albuquerque http://lattes.cnpq.br/3720219051646169
Francisco de Assis Câmara Rabelo Filho http://lattes.cnpq.br/8046962373930767
Geísa Mattos de Araújo Lima http://lattes.cnpq.br/5400490322782974
Lucicléia Barros de Vasconcelos http://lattes.cnpq.br/771739336700937
Paulo Henrique Machado de Sousa http://lattes.cnpq.br/0755288210417310



ANAIS da Academia Cearense
de Ciências

ANNALS of Ceará Science Academy

VOL. 02 - N° 02 Ago – Dez 2018 / Aug - Dec 2018 ISSN 2594-3618

Sumário

Página

Artigos de Revisão / Review Articles

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica e estratégias de controle do 97
amarelo letal no mamoeiro.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M.

Prospecção de procariontes quarentenários regulamentados e dispersos por sementes. 110
Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J.

Artigos Científicos / Cientific Articles

Película da amêndoa de caju (Anacardium occidentale) como fonte de compostos bioativos 120
e conservante natural

Oliveira, L.M.N.; Lima, A.C.S.; Silva, L.M.R.; Dias, F.G.B.; Teixeira, G.S.M.; Maia, G.A.;
Figueiredo, R.W. & Figueiredo, E.A.T.

Evaluation of oral acute tyoxicity of essential oil of Hyptis crenata in mice

Alves-Soares, R.; Gomes-Vasconcelos, Y.A.; Oliveira, K.A.; Diniz, L.R.L. Silva-Alves, K.S.; 126

Ferreira-da-Silva, F.W.; Leal-Cardoso, J.H.; Coelho-de-Souza, A.N.

Cold-induced contraction in detrusor smooth muscle of rat: an investigation on the mechanism 133
of action

Pereira-Gonçalves, Á.; Loiola-de-Araújo, W.; Cabral-Monte-Albuquerque, E.; Santos-
Nascimento, T.; Cardoso-Teixeira, A.C.; Coelho-de-Souza, A.N. & Leal-Cardoso, J.H.

Discursos Acadêmicos / Academic Speeches

Discurso de Posse na Academia Cearense de Ciências, em 15 de setembro de 2005 139
Menezes, E.D.B.

Discurso de posse na Academia de Ciências Farmacêuticas do Brasil, no dia 9 de Novembro 145
de 2018

Viana, G.S.B.

Obituários / Obtuaries Página

CAIO LÓSSIO BOTELHO: Respeitado Mestre da Ciência Geográfica do Ceará 152
Silva, M.G.S. 154

JOSÉ XAVIER: In Memoriam.
Prisco, J.T.

Normas para preparo e submissão de manuscritos / Guidelines for manuscript preparation and 157

submission

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, p. 97 - 109, 2018.
www.aceci.com.br

Artigo de Revisão/ Review Article

Sintomatologia, Etiologia, Diagnose, Distribuição Geográfica e Estratégias
de Controle do Amarelo Letal no Mamoeiro

J. Albersio A. Lima1; Aline Kelly Q. Nascimento1; Roberto C. A. Lima2 & Laianny Morais Maia3

1Academia Cearense de Ciências; 2BioClone Produtora de Mudas Clonadas; 3Estudante de
Doutorado - Universidade Federal do Ceará

(Aceito para Publicação em 18/12/2018)

Autor para correspondência: J. Albersio A. Lima – e-mail: [email protected]

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M. Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição
geográfica e estratégias de controle do amarelo letal no mamoeiro. ANAIS da Academia Cearense de Ciências,
v. 2, n. 2, p. 97-109, 2018.

RESUMO
O mamoeiro (Carica papaya) é uma importante fruteira tropical, cujo cultivo e produção estão crescendo nas áreas
irrigadas do Nordeste brasileiro. O Amarelo letal é uma doença que se manifesta no mamoeiro, ocasionada pelo
Papaya lethal yellowing virus (PLYV), vírus do gênero Sobemovirus, que ocorre somente no Nordeste brasileiro. Os
sintomas do Amarelo Letal consistem em amarelecimento progressivo das folhas que inicia na parte superior da
copa, as quais murcham e finalmente morrem. Manchas circulares esverdeadas aparecem nos frutos, tornando-se
amareladas quando os frutos amadurecem. O PLYV, agente causal do amarelo letal, possui partículas isométricas
com 30 nm de diâmetro, genoma do tipo RNA de hélice simples com 1,6 x 106 Da e uma capa protéica composta
de uma única proteína de 35 KDa. Embora não possua vetor biológico, o PLYV está se disseminando no Nordeste
brasileiro, provavelmente através de mudas infectadas, práticas e ferramentas agrícolas. O PLYV pode ser
transmitido pelo solo, água de irrigação, ferramentas agrícolas e mãos contaminadas. Uma preparação purificada
do PLYV foi obtida de folhas de mamoeiro infectadas e usada na preparação de antissoro policlonal, através da
imunização de coelhos, o qual apresentou título de. Antissoro específico para PLYV foi, também, preparado pela
imunização oral de coelhos, o qual apresentou elevada concentração, com título de 1:1,024,000 em “plate trapped
antigen enzyme linked immune sorbent assay” PTA-ELISA. O PLYV foi detectado em raízes e folhas de plantas
infectadas mantidas em condições ambientais até 120 dias, confirmando sua elevada estabilidade fora das células
das plantas, o que pode explicar sua disseminação por mãos contaminadas, ferramentas agrícolas, água e solo
contaminados. As propriedades físicas determinadas para o PLYV foram: a) Longevidade in vitro: acima de 50 dias;
b) Ponto térmico de inativação: 80 ºC e c) Ponto máximo de diluição: 10-6.

Palavras-chave adicionais: Carica papaya; PLYV; Papaya lethal yellowing virus; Sobemovirus

ABSTRACT

Symptoms, Etiology, Diagnose, Geographic Distribution and Control Strategies of
Papaya lethal yellowing

Papaya (Carica papaya) is an important tropical fruit crop whose production is increasing in irrigated areas of
Northeastern Brazil. Lethal yellowing is a papaya disease caused by Papaya lethal yellowing virus (PLYV), genus
Sobemovirus, which occurs only in Northeastern Brazil. Lethal yellowing symptoms begin with a progressive
leaf yellowing in the third superior part of the plant canopy, which wilt and finally die. Greenish circular spots
also appear on the fruits which turn yellowish when the fruits are ripening. Its causal agent, PLYV has isometric
particles which are 30 nm in diameter, genomic ssRNA of ac. 1.6 x 106 Da and a coat protein composed of a single
component of ac. 35 KDa. Although no biological vector has been confirmed for PLYV, it is spreading every year
in Northeastern Brazil, probably by infected young plants and contaminated tools. The virus can be transmitted
through the soil, irrigation water, agricultural tools and contaminated hands. A purified virus preparation was
prepared from infected papaya leaves and polyclonal antiserum was obtained from immunized rabbit. Reactive
antiserum was also prepared by oral rabbit immunization and the obtained antiserum was shown to be highly
specific to PLYV with a titer of 1:1,024,000 in plate trapped antigen enzyme linked immune sorbent assay (PTA-
ELISA). The virus was detected in dried roots and leaves maintained at room temperature up to 120 days, confirming
its high stability outside plant cells, which could explain its dissemination by contaminated hands, tools, water and
soil. The physical properties determined for the virus revealed a thermal inactivation point of 80 oC, longevity in
vitro over 50 days and dilution end point at ac. 10-6.

Additional keywords: Carica papaya; PLYV; Papaya lethal yellowing virus; Sobemovirus.

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 97

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica ...

INTRODUÇÃO femininas, que produzem frutos de formato
arredondado, com pouca cavidade de polpa e
O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma fruteira com baixa preferência pelo consumidor (Oliveira
da família Caricaceae, de alto valor nutricional et al., 1994). O desconhecimento dos tipos de
e econômico, cultivada em diversas regiões flores do mamoeiro, em plantios comerciais,
tropicais e subtropicais do mundo. É uma das faz com que ocorra a presença de um número
fruteiras mais comuns em quase todos os países elevado de plantas masculinas e de plantas
da América tropical. A planta é herbácea, de femininas, as quais produzem frutos sem valor
ciclo semiperene, com picos de produção de três comercial. Tal fato representa uma redução do
a cinco anos e com centro de origem na bacia número de plantas produtivas por área e, como
Amazônica Superior. A base genética de C. papaya consequência, queda acentuada na produtivi-
é bastante restrita, sendo, portanto, limitado o dade do pomar. Para reduzir o número das plan-
número de cultivares ou de variedades cultivadas tas improdutivas é necessário identificar o sexo
nas principais regiões produtoras. No Brasil, as das flores na época do primeiro florescimento a
principais cultivares do mamoeiro, atualmente fim de efetuar o desbaste. O desbaste das plantas
exploradas, são classificadas em função do tipo de indesejáveis ou improdutivas (masculinas e
fruto nos grupos Solo e Formosa (Dantas, 2000). femininas) consiste na identificação das plan-
O mamoeiro é uma das fruteiras mais cultivadas tas hermafroditas e eliminação das demais,
no mundo, especialmente em áreas tropicais e permitindo assim aumento da produtividade e,
subtropicais onde a temperatura média é de 25 °C. consequentemente, da rentabilidade da cultura
(Trindade, 2000). Os frutos oriundos de plantas
O mamão é um excelente alimento, com hermafroditas possuem polpa mais espessa que
polpa muito rica em nutrientes, constituindo os de plantas femininas, representando até 1/3
uma importante fonte de energia, cálcio, fósforo, do diâmetro médio do fruto (Trindade, 2000).
proteínas, vitaminas A e C, além de possuir Assim, a possível produção de plantas hermafro-
pro-riedades digestivas e medicinais (IBGE, ditas e sua clonagem por cultura de tecido
2012). Os frutos apresentam um conteúdo de representam um grande avanço tecnológico
umidade variando entre 87 a 94% e de carboidra- para o agronegócio do mamoeiro. A propósito,
tos, de 2 a 12%. O conteúdo de sacarose, glicose a Empresa Cearense BioClone Produtora de
e frutose flutuam entre 7 a 50%, 14 a 78% e 13 Mudas Clonadas desenvolveu tecnologia
a 50%, respectivamente, do total de açúcares. própria de produção de mudas hermafroditas
Em frutos maduros, o açúcar predominante é de mamoeiro, cuja tecnologia se encontra em
a sacarose, com 48,3%. Os frutos do mamoeiro fase de aperfeiçoamento (Roberto C. A. Lima,
apresentam polpa macia, adocicada e bastante Comunicação pessoal).
aromática, com cor variando entre o amarelo-
pálido e o vermelho, além de diversos tons de O mamoeiro desenvolve-se melhor em solo
laranja e salmão. A casca geralmente é fina, de textura média, sem impedimento físico, bem
bastante resistente, aderida à polpa, lisa, de cor drenado e rico em matéria orgânica. Segundo
verde escura, que vai se tornando amarelada ou Costa & Pacova (2003), o mamoeiro exige pH
alaranjada, à medida que o fruto amadurece. O entre 5,5 a 6,5 e quando plantado em fileira
formato do fruto também varia dependendo da simples, o espaçamento deve variar de 3,0 a 4,0
cultivar ou do grupo. Em geral, o mamoeiro é m entre fileiras e de 1,80 a 2,50 m entre plantas.
classificado conforme as características do fruto
em dois grandes grupos: Solo e Formosa (Sankat O Brasil, incluindo a Região Nordeste, apre-
& Maharaj, 1997; Dantas, 2000). senta grande potencial para produção de fruteiras
tropicais, entre elas, a cultura do mamoeiro. A
O mamoeiro pode possuir flores femininas, fruticultura irrigada vem despontando como
masculinas e hermafroditas, sendo o sexo das uma excelente opção para ajudar a solucionar o
flores o fator determinante dos diferentes forma- grave problema sócio-econômico causado pelas
tos dos frutos (Oliveira et al., 1994; Trindade, 2000). estiagens cíclicas no Nordeste, gerando mais
Flores hermafroditas formam frutos alongados renda e empregos para a população, a exemplo,
e flores femininas, frutos arredondados. Em das regiões do Vale Médio do São Francisco, em
razão da preferência do mercado por frutos com Pernambuco; Vale do Açu, no Rio Grande do
formato piriforme ou alongado, as plantações Norte e a Chapada do Apodi, no estado do Ceará
comerciais de mamoeiro deveriam possuir (Lima et al., 2001a; Lima & Lima, 2002a; Lima et
somente plantas hermafroditas, evitando as al., 2015). No entanto, vários são os fatores que

98 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M

podem inibir a expansão da cultura do mamoeiro e, com a evolução da doença, as folhas se apre-
e reduzir sua produtividade, entre os quais sentam ligeiramente retorcidas e com aspecto
se destacam as doenças causadas por vírus, clorótico (Figura 1). Com o tempo, as folhas ama-
podendo algumas delas causar sérios prejuízos à relecem, murcham e morrem, levando a planta
produção em várias partes do mundo, inclusive à morte (Figura 1), razão da denominação da
no Nordeste brasileiro (Hine et al., 1965; Purcifull doença de Amarelo Letal. Nos frutos aparecem
& Hiebert, 1971; Lima & Gomes, 1975; Barbosa manchas circulares esverdeadas no início que
& Paguio, 1982; Teixeira et al., 1999; Lima & se tornam amareladas com o amadurecimento
Camarço, 1997; Lima et al., 2001; Lima & Lima, (Figura 2). Todos esses sintomas podem ser
2002b; Nascimento et al., 2010a; Lima et al., 2015). observados em plantas naturalmente infectadas
nos campos de produção de mamoeiro (Loreto
Os vírus que infectam a cultura do mamoeiro et al., 1983; Lima & Santos, 1991; Kitajima et al.,
se destacam por reduzirem a longevidade da 1992; Camarço, et al., 1998; Lima & Lima., 2001a;
planta afetando a produção dos frutos de forma Ramos et al., 2008; Lima et al., 2013b, 2014; Lima
quantitativa e qualitativa. Os principais vírus que et al., 2015).
infectam o mamoeiro em diferentes partes do
mundo pertencem às seguintes famílias e gêneros: O Amarelo Letal do mamoeiro, causado
família Potyviridae, gênero Potyvirus: Papaya por PLYV, foi inicialmente constatado em
ringspot virus estirpe Papaya (PRSV-P) (Purcifull variedades de mamoeiro do grupo Solo, no
et al., 1984; Lima et al., 2015); Papaya leaf distortion estado de Pernambuco. Em seguida, a doença foi
mosaic virus (PLDMV) (Kawano & Yonaha, 1992); identificada nos estados da Bahia, do Rio Grande
gênero Sobemovirus: Papaya lethal yellowing virus do Norte, do Ceará e da Paraíba, sendo que a
(PLYV) (Silva et al., 2000; Nascimento et al., 2010a; referência sobre a incidência da doença no estado
Lima et al., 2015); família Rhabdoviridae, gênero da Bahia (Vega et al., 1988) nunca foi confirmada
Rhabdovirus: Papaya apical necrosis virus (PANV) (Lima et al., 2015). Embora a origem do PLYV
(Lastra & Quintero, 1981); gênero Potexvirus: seja desconhecida, o vírus pode ter surgido a
Papaya mosaic virus (PMV) (Cook & Zettler, 1970); partir de uma possível mutação de outro vírus
família Bunyarividae, gênero Tospovirus: Tomato de plantas nativas da região onde o mesmo vinha
spotted wilt virus (TSWV) (Lima et al., 2015); gênero ocorrendo. Avaliações da dispersão do vírus
Tenuivirus: Papaya mild yellow leaf virus (PMYLV) na região Nordeste demonstram que sua ocor-
(Marys et al., 1995) e Papaya meleira virus (PMeV), rência e distribuição vêm-se manifestando no
ainda sem classificação taxonômica pelo ICTV sentido leste para oeste, uma vez que o PLYV
(Kitajima et al., 1993; Marciel-Zambolim et al., foi, inicialmente, detectado em Pernambuco
2003). e, em seguida, nos estados do Rio Grande do
Norte, da Paraíba e em municípios do estado
A seguir serão apresentadas informações do Ceará, vizinhos ao estado do Rio Grande do
sobre sintomatologia, distribuição geográfica, Norte, não havendo sido ainda constatado no
etiologia, gama de plantas hospedeiras e estado do Piauí, nem nos municípios cearenses
alternativas para o controle do Amarelo Letal próximos à divisa com aquele estado. Extensivo e
do mamoeiro. Essa doença tem-se tornado uma detalhado levantamento da doença, realizado em
preocupação constante para os produtores do áreas produtoras de municípios do Rio Grande
Nordeste brasileiro, sobretudo do Ceará, pelo do Norte, revelaram a presença do PLYV em
fato de o Papaya lethal yellowing virus (PLYV) reduzidos graus de incidência por município
estar sendo disseminado para áreas ainda não (Teixeira et al., 1999). Da mesma forma, os
atingidas (Oliveira et al., 1989; Lima & Camarço, graus de incidência com que o PLYV tem sido
1997; Lima et al., 2001; Lima & Lima, 2002b; constatado nos pomares do estado do Ceará são
Ramos et al., 2008; Daltro et al., 2012; Lima et al., sempre reduzidos e dispersos.
2013a; Lima et al., 2015).

SINTOMATOLOGIA, DISTRIBUIÇÃO ETIOLOGIA, DISTRIBUIÇÃO DO VÍRUS
GEOGRÁFICA E OCORRÊNCIA DO EM PLANTAS INFECTADAS, GAMA DE
Papaya lethal yellowing virus NO BRASIL PLANTAS HOSPEDEIRAS E FORMAS DE

Os sintomas em mamoeiros infectados com o TRANSMISSÃO
PLYV, geralmente, têm início com o amare-
lecimento de folhas do terço superior da copa, 1- Etiologia do Amarelo Letal

O Amarelo Letal do mamoeiro é uma doença

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 99

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica ...

Figura 1- Sintomas do Amarelo Letal causado pelo Papaya lethal yellowing virus (PLYV) em plantas
de mamoeiro (Carica papaya), os quais geralmente têm início com o amarelecimento de folhas do

terço superior da copa (A), podendo algumas cair posteriormente. Com a evolução da doença, as

folhas se apresentam ligeiramente retorcidas e com aspecto clorótico (B, C).

Figura 2- Frutos do mamoeiro (Carica papaya) com sintomas do Amarelo Letal
causado pelo Papaya lethal yellowing virus (PLYV), os quais aparecem como

manchas circulares, inicialmente esverdeadas, que se tornam amareladas com o

amadurecimento.

ocasionada por Papaya lethal yellowing virus Estudos sobre a interação sinérgica entre
(PLYV), espécie de vírus pertencente ao gênero PRSV-P e PLYV demonstraram que plantas de
Sobemovirus (Nascimento et al., 2010a; Lima et mamoeiro infectadas com os dois vírus exibem
al., 2015), o qual é constituído por partículas sintomas bastante severos, constituídos de
isométricas de, aproximadamente, 30 nm de clorose, amarelecimento, redução de crescimento,
diâmetro (Figura 3), possuindo genoma do tipo necrose sistêmica e morte de 50% das plantas,
RNA de hélice simples de aproximadamente 1,6 indicando, assim, uma forte interação sinérgica,
x 106 Kb, sendo sua capa protéica (CP) formada entre PRSV-P e PLYV. Plantas com infecção mista
por uma única proteína de aproximadamente 35 de PRSV-P e de PLYV, exibindo sintomas severos
kDa (Figura 4). Partículas isométricas, no interior já foram, também, encontradas em condições
de vacúolos de plantas infectadas, podem ser naturais de campo (Lima et al., 1993; Daltro, et al.,
detectadas, através de exames ao microscópico 2012; Lima et al., 2013b; 2015).
eletrônico, de secções ultrafinas de folhas e de
frutos de plantas com sintomas (Figura 3). 2- Distribuição do Papaya lethal yellowing virus
em Plantas Infectadas
O PLYV foi purificado e antissoros especí-
ficos para o vírus foram obtidos no Laboratório Estudos sorológicos em "plate trapped antigen
de Virologia Vegetal, da Universidade Federal do - enzyme linked immune sorbent assay" (PTA-
Ceará (Lima et al., 1994; Nascimento et al., 2010a; ELISA), com antissoro específico para PLYV,
Lima et al., 2015). usando quantidades iguais de tecidos de dife-

100 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M

Figura 3- Detalhes de células de folhas de mamoeiro concentração do vírus se distribui uniformemente
(Carica papaya) infectadas por Papaya lethal nas diferentes partes das plantas sistemicamente
yellowing virus (PLYV): A) Partículas isométricas infectadas (Anselmo et al., 2013; Lima et al.,
de aproximadamente 30 nm de diâmetro; B) Secção 2015). A presença do PLYV pode ser detectada
ultrafina de célula do parênquima foliar infectadas por PTA-ELISA em folhas, 72 h após as mesmas
pelo PLYV, com partículas virais agrupadas em serem inoculadas, mas somente 25 a 30 dias
vacúolos (Cortesia do Prof. Elliot W. Kitajima). após a inoculação numa folha intermediária, o
vírus infecta, sistematicamente, toda a planta
Figura 4- Genoma (RNA) e proteína da Capa Protéica inoculada (Figura 5). Embora a presença do
do Papaya lethal yellowing virus (PLYV), agente causal PLYV possa ser detectada três dias após a
do Amarelo Letal do mamoeiro (Carica papaya): A- inoculação nas folhas inoculadas, somente após
RNA de hélice simples de aproximadamente 1,6 x 106 seis dias o vírus é detectado no caule e após
Kb - Linha 1- Marcadores de RNA, com padrões em Kb; dez dias nas raízes (Figura 5). Embora o PLYV
Linha 2- RNA extraído de plantas sadias de mamoeiro possa ser detectado 20 dias após a inoculação
e Linha 3- RNA extraído de preparação purificada de nas folhas não inoculadas de mamoeiro, a
PLYV (1:10); B- Capa protéica (CP) formada por uma planta inteira será sistematicamente infectada
única proteína de aproximadamente 35 kDa - Linha somente 30 dias depois da inoculação (Figura 5).
1- Proteínas padrões com pesos moleculares indicados Esses resultados estão de acordo com o que foi
em kDa; Linha 2- Sobrenadante da preparação viral proposto por Agrios (1997), no seu clássico livro
purificada e Linha 3- Preparação purificada de PLYV sobre Fitopatologia, para distribuição dos vírus
(1:10). em plantas infectadas, indicando que os vírus,
em geral, se movem de célula a célula, através
rentes partes de plantas sistemicamente infectadas dos plasmodesmatas, multiplicando-se em cada
demonstraram que o vírus está uniformemente uma delas, e, ao atingirem as células do floema, as
distribuído nos tecidos de plantas, incluindo: partículas de vírus são rapidamente transportadas
folhas jovens, folhas medianas, folhas velhas, à longa distância. Os resultados da pesquisa com
caule e raízes. As leituras de absorção em PTA- mamoeiro indicam que o PLYV começa a se
ELISA foram semelhantes, quando quantidades replicar dentro da célula inoculada logo após a
iguais de cada parte da planta infectada com inoculação (Figura 5), mas leva aproximadamente
PLYV foram testadas, 40 dias após a inoculação. 25 a 30 dias para infectar sistemicamente a planta
inteira. Conforme Matthews (1991, 1992), em
Estudos da movimentação do PLYV em outras clássicas publicações sobre Virologia
plantas de mamoeiro, após a inoculação mecânica Vegetal, a infecção começa a partir da entrada do
de folhas de plantas sadias, demonstraram que a vírus na célula hospedeira e sua concentração em
tecidos da planta infectada aumenta em função
do tempo.

3- Gama de Plantas Hospedeiras do Papaya lethal
yellowing virus

Testes de infectividade do PLYV, em casa de
vegetação, com mais de 30 espécies vegetais de
oito famílias botânicas, indicaram que a gama
de plantas hospedeiros do PLYV está, possivel-
mente, restrita à família Caricaceae. Quatro
espécies vegetais da família Caricaceae, incluindo
Jacaratia heterophila, J. spinosa, Vasconcella
quercifolia e V. monoica foram avaliadas como
possíveis hospedeiras do vírus, em condições
de casa de vegetação, através da inoculação
mecânica das plantas com o PLYV (Amaral
et al., 2006; Nascimento et al., 2010), sendo as
plantas inoculadas, observadas durante um
período de 30 dias, quanto ao aparecimento
de sintomas e testadas por PTA-ELISA com

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 101

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica ...

Figura 5- Presença do Papaya lethal yellowing virus (PLYV) detectada por PTA-ELISA
em folhas de mamoeiro (Carica papaya): 2, 4, 6, 10, 20 e 25 dias após a inoculação (seta),
indicando a presença do vírus na cor cinza. Três dias após a inoculação o vírus pode ser
detectado por PTA-ELISA na folha inoculada. Em seguida, o vírus se desloca para as
raízes (10 dias), depois para as folhas mais jovens (16 dias) e após 25 dias toda a planta é
infectada. (Cortesia de Lima et al., 2015).

antissoro específico para PLYV e por RT-PCR transmitido de plantas doentes de mamoeiro
com oligonucleotídeos específicos PLYV-1 para plantas sadias pelo método de transmissão
(5’CTGAAGCGGATATTTCTGG3’) e PLYV- mecânica, por enxertia de pequenos pedaços
2 (5’GTGTATGGCATACAGTTATC3’) (Silva do pecíolo ou nervuras de plantas doentes,
et al., 2000). Plantas sadias de mamoeiro foram por ferramentas utilizadas no corte de plantas
retroinoculadas com extratos vegetais obtidos infectadas e de plantas sadias, por solos conta-
de folhas de cada uma das quatro espécies minados e por água de rega (Camarço et al., 1996;
inoculadas com o PLYV para confirmação Lima et al., 2001a; Saraiva et al., 2006; Nascimento
da infecção ou ausência do vírus. Das quatro et al., 2010b; Lima et al., 2015). A presença do vírus
espécies vegetais da família Caricaceae, V. infectivo pode ser detectada em solo naturalmente
monoica foi a única que exibiu sintomas uma contaminado, água de rega de plantas infec-
semana após a inoculação, apresentando tadas e superfície de sementes obtidas de frutos
mosaico, amarelecimento e deformação foliar, infectados. Foi confirmado, também, que o PLYV
sendo a presença do PLYV confirmada por PTA- pode ser eficientemente transmitido por mãos
ELISA. As espécies de J. heterophila, J. spinosa contaminadas, mesmo após serem lavadas em
e V. quercifolia não apresentaram sintomas água corrente (Tabela 1), demonstrando grande
mesmo após quatro semanas da inoculação e a estabilidade da partícula viral (Camarço et al.,
ausência do vírus foi confirmada por PTA-ELISA 1998; Saraiva et al., 2006; Nascimento et al., 2010a;
e por RT-PCR. O PLYV, também, não infectou, 2010b; Lima et al., 2015).
experimentalmente, nenhuma das espécies
vegetais testadas, inclusive as indicadoras para Embora nenhum vetor biológico tenha sido
vírus Chenopodium amaranticolor, C. murale, C. confirmado, a disseminação e a distribuição do
quinoa e Nicotina benthamiana (Nascimento et al., PLYV vêm crescendo a cada ano, provavelmente
2010; Lima et al., 2014; Lima et al., 2015). por mudas infectadas ou por ferramentas e mãos
contaminadas (Lima & Santos, 1991; Kitajima et al.,
4- Formas de Transmissão do Papaya lethal 1992; Silva, 1996; Saraiva et al., 2006; Nascimento
yellowing virus et al., 2010; Lima et al., 2015).

Testes de transmissão do PLYV com espécies de A identificação da presença do PLYV
afídeos Aphis gossypii e Myzus persicae de forma em plantas de mamoeiro isoladas no centro
circulativa persistente e não circulativa não da cidade de Fortaleza (Figura 6), que possui
persistente e com besouros das espécies Diabrotica mais de dois milhões de habitantes, levanta a
bivitulla e D. speciosa revelaram resultados possibilidade da sua transmissão por pássaros
negativos, indicando que esses insetos vetores de conduzindo partículas do vírus junto à seiva de
vírus não estão envolvidos na disseminação do plantas infectadas para plantas sadias. Em razão
PLYV no campo (Lima & Santos, 1991; Kitajima da elevada estabilidade e da alta concentração
et al., 1992; Silva, 1996; Ramos et al., 2008; do PLYV em tecidos de plantas infectadas, o
Nascimento et al., 2010b; Lima et al., 2015). vírus poderia ser transmitido desta forma, em
condições naturais. O PLYV atinge elevadas
No entanto, o PLYV pode ser eficientemente concentrações em tecidos foliares, frutos e raízes

102 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M

de plantas infectadas, em cujos tecidos vegetais, 7). Os resultados de testes sorológicos foram
mesmo secos, podem permanecer ativos no solo e confirmados por avaliação biológica através da
serem levados por longas distâncias, constituindo inoculação em plantas de mamoeiro. Apesar
fontes de vírus. das temperaturas observadas junto ao material
solarizado terem variado de 30 a 55 °C, as quais
As propriedades físicas avaliadas para o são inferiores ao ponto de inativação térmica do
PLYV demonstraram sua elevada estabilidade PLYV (80 ºC), a inativação do vírus nos restos
fora das células de plantas hospedeiras: tempo culturais é explicada pelo tempo de exposição
de inativação térmica (80 ºC), longevidade in destes tecidos a temperatura de 55 ºC.
vitro (60 dias) e ponto máximo de diluição (10-6).
A elevada estabilidade das partículas do PLYV Experimentos com álcool ou detergentes
pode facilitar sua disseminação através de ações neutros não foram eficientes na eliminação do
humanas, o que pode explicar a disseminação PLYV em ferramentas agrícolas contaminadas,
do vírus sem um vetor biológico (Camarço et no entanto, o vírus foi inativado com 10% de
al., 1996; Lima & Lima, 2002a; Lima et al., 2002; hipoclorito de sódio, o que demonstra sua
Saraiva et al., 2006; Nascimento et al., 2010; Lima eficiência para o tratamento de ferramentas
et al., 2014; Lima et al., 2015). Vírus infectivo foi agrícolas contaminadas.
também detectado em solos de vasos contendo
plantas de mamoeiro infectadas e em água usada Embora o PLYV não tenha sido transmitido
na irrigação de vasos com plantas infectadas. por sementes de frutos de plantas infectadas, o
Foi também demonstrado que mudas de vírus foi sorologicamente detectado na superfície
plantas de mamoeiro podem ser infectadas se de sementes (Tabela 2), não sendo sorologica-
forem cultivadas em solo contaminado com
PLYV (Camarço et al., 1996; Nascimento et al., Figura 6- Identificação da presença do Papaya lethal
2010; Lima et al. 2015). Em razão da elevada yellowing virus (PLYV) em planta isolada de mamoeiro
estabilidade do PLYV em tecidos foliares e (Carica papaya) no centro de Fortaleza, cidade com
raízes secas (Nascimento et al., 2010a), os quais mais de dois milhões de habitantes (Cortesia de Lima
podem permanecer no solo e serem levados por et al., 2015).
longas distâncias, constituindo fontes de vírus no
campo, o destino dos restos culturais de plantas
infectadas, resultantes da prática do “roguing”
tem constituído permanente preocupação dos
produtores. Dessa forma, a prática da solarização
de plantas infectadas com PLYV demonstrou ser
um eficiente método de eliminação do vírus dos
restos culturais. A solarização mostrou-se eficiente
na inativação do PLYV tanto nas folhas como no
sistema radicular de plantas infectadas, após um
período de 12 dias (Figura 7), enquanto que o
vírus permaneceu ativo nas folhas e nas raízes de
plantas infectadas e erradicadas, mantidas sobre
o solo natural até um período de 32 dias (Figura

Tabela 1- Confirmação da transmissibilidade do Papaya lethal yellowing virus (PLYV) por mãos contaminadas
com extrato de plantas de folhas de mamoeiro (Carica papaya) infectadas com PLYV determinado por PTA-

ELISA com antissoro para PLYV

Tipo de Inoculação Número de plantas Número de plantas infectadas (%
inoculadas transmissão)
Mãos contaminadas
Mãos contaminadas e lavadas 104 13 (12,5%)
Controle: mãos com extrato de 116 6 (5,2%)
100
plantas sadia -
(Cortesia de Lima et al., 2015)

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 103

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica ...

mente detectado em plântulas desenvolvidas a introduzido por mudas infectadas ou ferramentas
partir de sementes de frutos infectados (Tabela contaminadas e distribuído pelos produtores a
2), nem em embriões de sementes de frutos partir das fontes iniciais de vírus. Por tais razões,
infectados (Tabela 3). A ausência do vírus em a produção de mudas em telados protegidos,
plântulas oriundas de sementes, com e sem distantes dos plantios comerciais de mamoeiro,
mucilagem, de frutos infectados com PLYV reforça constitui uma importante estratégia de controle
a afirmativa da não transmissão embrionária do para o PLYV (Camarço et al., 1996; Nascimento et
vírus por sementes de mamoeiro (Camarço et al., 2010; Lima et al. 2015).
al., 1998, Saraiva et al., 2006; Lima et al., 2015),
embora a presença do vírus tenha sido detectada MÉTODOS DE DIAGNOSE DO
em sementes per si e no tegumento de sementes AMARELO LETAL
oriundas de frutos de plantas infectadas (Tabelas
2, 3). Tais resultados indicam que partículas Vários métodos podem ser usados para uma
virais aderidas ao tegumento de sementes podem correta e segura diagnose do Amarelo Letal no
ser transportadas pelas sementes e penetrarem mamoeiro, incluindo a típica sintomatologia,
nas plântulas através de eventuais ferimentos do constituída de sintomas de amarelecimento das
sistema radicular no momento do transplantio, à folhas e as manchas típicas nos frutos (Figura 1,
semelhança do que ocorre com o Tobacco mosaic 2). No entanto, vários métodos laboratoriais já
virus (TMV) do gênero Tobamovirus (Walkey, foram adaptados para identificação de vírus e
1985). diagnose de viroses vegetais, incluindo o Amarelo
Letal, sobretudo envolvendo técnicas sorológicas
O uso de mudas de mamoeiro infectadas (Almeida & Lima, 2001; Purcifull et al., 2001;
com PLYV tem contribuído para a dispersão do Naidu & Hughes, 2001; Lima et al., 2012; Lima
vírus entre pomares dentro do Estado do Ceará, et al., 2014; Lima et al., 2015). Inúmeras técnicas
introduzindo fontes do vírus nos pomares. sorológicas foram desenvolvidas e adaptadas
A ocorrência do PLYV em pequenos grupos para diagnose de viroses vegetais, demonstrando
de plantas, aleatoriamente distribuídos nos que as mesmas ainda constituem métodos
pomares indica que o vírus é, possivelmente, eficientes, precisos e específicos para identificação

Resultados PTA-ELISA Solarização
(Absorção em 450nm) Sem Solarização
Tecido Sadio

Dias de Solarização

Figura 7- Inativação do Papaya lethal yellowing virus (PLYV) através da solarização
de folhas e de raízes removidas de plantas de mamoeiro (Carica papaya) infectadas
demonstrada por PTA-ELISA. Após um período de 12 dias o PLYV não é mais
detectado nos tecidos solarizados, tendo permanecido ativo nas folhas e nas raízes
de plantas infectadas e erradicadas mantidas sobre o solo natural até um período
de 32 dias (Cortesia de Lima et al., 2015).

104 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M

Tabela 2- Avaliações de sementes, sementes germinadas e mudas obtidas de sementes de frutos de mamoeiro
(Carica papaya) de plantas naturalmente infectadas por Papaya lethal yellowing virus (PLYV). Em todas as situações

as sementes foram testadas com e sem mucilagem por PTA-ELISA

Tipo de órgão de Número de amostras testadas Amostras com PLYV detectado por
mamoeiro PTA-ELISA

Semente per si Mucilagem Sem mucilagem Mucilagem Sem mucilagem
Sementes germinadas 136 174
210 152 --
Mudas 273 183
--

32 17

(Cortesia de Lima et al., 2015).

Tabela 3- Presença de Papaya lethal yellowing virus (PLYV) detectado por PTA-ELISA em embriões e tegumentos
de sementes de frutos de mamoeiro (Carica papaya) naturalmente infetados com PYV

Tipo de órgão de mamoeiro Número de amostras Número de amostras com PLYV
testadas (% transmissão)
Embriões de sementes infectadas
Tegumento de sementes infectadas 1,128 - (-)
Embriões de sementes sadias 670 112 (16,7%)
Tegumento de sementes sadias 210
(Cortesia de Lima et al., 2015). 230 (-)
(-)

de vírus em plantas e diagnose de viroses anticorpo, que reage somente com um epitopo
vegetais (Naidu & Hughes, 2001; Purcifull et al., específico da proteína do vírus (Purcifull et al.
2001; Lima et al., 2014; Lima et al., 2015). O grande 2001; Lima et al., 2015).
valor dos métodos sorológicos para diagnose
de viroses vegetais, inclusive do Amarelo Letal Considerando a importância da sorologia
no mamoeiro, fundamenta-se na especificidade para diagnose de viroses vegetais, um programa
da reação entre antígenos (partículas de vírus para produção de antissoros policlonais para
ou suas proteínas) e seus anticorpos específicos. vírus de plantas foi implantado no Laboratório
Antígeno é uma molécula que, quando injetada de Virologia Vegetal, da Universidade Federal
no corpo de um animal de sangue quente, induz do Ceará, ainda no ano de 1978. O uso dos
uma resposta, com a consequente produção de antissoros produzidos em referido Laboratório
anticorpos específicos que podem se combinar foi de grande importância para programas de
especificamente com o antígeno que induziu sua identificação de mais de 20 espécies de vírus de
formação (Naidu & Hughes, 2001; Purcifull et al., culturas tropicais, incluindo mamoeiro (Carica
2001; Lima et al., 2015). papaya), bananeira (Musa spp.), meloeiro (Cucumis
melo), melancia (Citrullus lanatus) e feijoeiro caupi
Geralmente os métodos que envolvem (Vigna unguiculata, subsp. unguiculata).
as reações dos antígenos e seus anticorpos
correspondentes in vitro são simples e não Antissoros específicos para alguns vírus
necessitam de equipamentos caros. A maior que infectam plantas, inclusive o PLYV, foram,
limitação do uso da sorologia na identificação e também, obtidos através da imunização oral de
na detecção de vírus em plantas é a dificuldade coelhos ou camundongos, com preparações puri-
de purificação dos vírus para produção de ficadas do vírus e até mesmo com preparações
antissoros específicos (Lima et al., 1994; Lima et al., concentradas de folhas de plantas infectadas com
2015). Contudo, atualmente, vários métodos têm os vírus correspondentes. Antissoros específicos
sido desenvolvidos para produção de anticorpos e com títulos elevados para PLYV foram
específicos, inclusive anticorpos monoclonais, obtidos através da imunização de coelhos com
os quais são constituídos de um único tipo de preparações purificadas do vírus em solução 0,15
M de NaCl, na proporção de 1:1 (p/v), clarificado

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 105

Sintomatologia, etiologia, diagnose, distribuição geográfica ...

e centrifugado a 10.000 g por 10 min, usando doses 1- Plantio de Mudas Livres de Vírus- Os viveiros
diárias por um período de sete dias (Lima et al., para formação de mudas devem ser protegido
2001; Rabelo Filho et al., 2005; Lima et al., 2015). Os com telas antiafídeos (Figura 8), localizados
títulos dos antissoros específicos para PLYV foram em áreas livres do vírus, distante de plantações
avaliados por técnicas de PTA-ELISA, usando as antigas de mamoeiro e as mudas devem ser
seguintes diluições: 1:500, 1:1,000, 1:2.000, 1:4.000, indexadas, através de testes sorológicos contra a
1:8.000, 1:16.000, 1:32.000, 1:64.000, 1:128.000, presença de vírus.
1:256.000, 1:512.000 e 1:1.024.000. A reatividade
do antissoro nas diluições de 1:8.000 e 1:16.000 foi 2- Roguing- Efetuar a prática do “roguing”, com a
também avaliada contra extratos de plantas de erradicação das primeiras plantas de mamoeiros
mamoeiro infectadas com PLYV nas diluições de infectadas dentro do pomar com sintomas típicos
1:500 a 1:1.024.000, e os resultados confirmaram a da doença, e eliminação de pomares velhos e
elevada sensibilidade da técnica de PTA-ELISA improdutivos, mesmo que não estejam infectados
para detecção de PLYV em tecidos de plantas pelo PLYV. Em razão de restos de culturas,
infectadas. Com base nos resultados, 1,0 ml de no solo, inclusive os resultantes do “roguing”,
antissoro na diluição de 1:16.000 seria suficiente poderem constituir fontes de vírus estáveis, que
para testar mais de 140.000 amostras com a são facilmente transmitidos mecanicamente,
segurança para detectar a presença do PLYV os restos das plantas erradicadas, por estarem
em ultra baixas concentrações, ou seja: 1:512.000 infectadas com o PLYV, devem ser submetidos
(um grama de tecido vegetal para 512.000 ml à solarização por um período de 15 dias, o qual
de tampão). Segundo Tamm & Truve (2000), foi demonstrado ser eficiente para inativação do
os vírus do gênero Sobemovirus são tipicamente vírus (Figura 7). Caso contrário, os restos das
encontrados em elevadas concentrações nos plantas erradicadas irão constituir fontes do vírus
tecidos de plantas infectadas e possuem exce- no solo, possibilitando sua penetração nas raízes
lentes propriedades imunogênicas, possibilitando das mudas sadias, que venham a ser plantadas na
a produção de antissoros com títulos elevados. mesma cova.
Os antissoros produzidos contra PLYV possuem
títulos de até 1:1.024.000, e semelhantemente aos 3- Desinfestação de Ferramentas Agrícolas-
vírus do gênero Sobemovirus (ICTVdB, 2006; King Proceder a desinfestação das ferramentas
et al., 2012), as propriedades físicas do PLYV agrícolas, especialmente facas, facões e tesouras
confirmam sua elevada estabilidade em seiva e, de poda, com uma solução de 1:10 de hipoclorito
inclusive, no solo (Lima et al., 2015). de sódio (água sanitária)/água, utilizados nos
processos de colheita de frutos.

ESTRATÉGIAS DE CONTROLE DO
AMARELO LETAL EM MAMOEIRO

As estratégias de controle para o PLYV devem Figura 8- Viveiro protegido com telas antiafídeos
consistir de ações de caráter preventivo, como para produção de mudas de mamoeiro (Carica papaya)
o uso de mudas livres de vírus, eliminação de
pomares velhos, erradicação de plantas apre- livres do Papaya lethal yellowing virus (PLYV), o qual
sentando sintomas típicos da doença (“roguing”)
e a desinfestação das ferramentas utilizadas deve ser distante de plantações antigas de mamoeiro
nos processos de desbaste e de colheita dos e as mudas devem ser indexadas através de testes
frutos. A desinfestação das ferramentas pode ser sorológicos contra a presença de vírus.
efetuada com solução de hipoclorito de sódio a
10% (Camarço et al., 1998; Lima et al. 2001b; Lima
& Lima, 2002b; Lima et al., 2015). Em razão da
sobrevivência do vírus no solo, em água de rega
e nas superfícies de sementes, deve-se, sempre,
ter o cuidado para evitar a disseminação do
PLYV dentro do pomar e/ou sua introdução, via
mudas produzidas em locais contaminados. As
medidas preventivas, que são as mais indicadas
para o controle do PLYV, compreendem:

106 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Lima, J.A.A.; Nascimento, A.K.Q.; Lima, R.C.A. & Maia, L.M

4- Cuidados Adicionais com a Transmissão- Dantas, J.L.L. Introdução: Mamão produção. In:
Considerando a elevada estabilidade do PLYV, o Trindade, A.V. Mamão produção: Aspectos técnicos.
qual pode sobreviver em solo, em água de rega Brasília: Embrapa Mandioca e Fruticultura: Embrapa
e na superfície de sementes obtidas de frutos Comunicação para Transferência de tecnologia. p.
infectados, e sua transmissão por ferramentas de 5-13, 2000.
corte, cuidados acionais devem ser tomados, no
sentido de evitar a transmissão do vírus dentro Hine, R.B.; Hotzmann, O.V. & Raabe, R.D. Diseases
de um mesmo pomar e entre pomares de uma of papaya (Carica papaya L.) in Hawaii, Gainesville
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ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, p. 110-119, 2018.
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Artigo de Revisão/ Review Article

Prospecção de Procariontes Quarentenários Regulamentados e
Dispersos por Sementes

Fabiana Rodrigues da Silva1,2, Rhut Mikaella Alves Dantas Medeiros1,3
& Zacarias Ribeiro Júnior1

1Estação Quarentenária-Syngenta Proteção de Cultivos, 2Doutoranda em Agronomia-Fitotecnia, UFERSA,
3Graduanda em Biotecnologia, UFERSA

(Aceito para publicação em 28/12/2018)

Autor para correspondência: Fabiana Rodrigues da Silva – e-mail: [email protected]

Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J. Prospecção de procariontes quarentenários regulamentados e
dispersos por sementes. ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, p.110-119, 2018.

RESUMO

Muitas espécies vegetais cultivadas em um país provém do exterior, resultado de intercâmbio, devido à necessidade
de se conseguir variabilidade genética; entretanto, existe um risco da introdução simultânea de agentes patogênicos.
A preocupação com a sanidade das espécies vegetais importadas é clara, pois, a introdução de uma praga ou agente
patogênico junto a determinada espécie vegetal não exclui a possibilidade de que ele venha a se adaptar, tornando-
se portanto um risco potencial. A Instrução Normativa (IN) 41/2008 do Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA), traz uma Lista de Pragas Quarentenárias Ausentes (A1), incluindo cerca de 450 pragas
e patógenos, dentre vírus, viróides, fungos, insetos, ácaros, plantas infestantes, nematoides e procariontes todos
considerados de risco para o Brasil, pois não ocorrem no país. A introdução de um agente fitopatogênico ou uma
praga junto com determinada espécie vegetal não exclui a possibilidade de que a mesma venha a se adaptar as
outras culturas, tornando-se, portanto um risco potencial. O objetivo desse artigo foi analisar os procariotos contidos
nas IN 41/2008 que são transmitidos por sementes e realizar um embasamento bibliográfico, técnico e científico
para cada procarioto, através do conhecimento da classificação taxonômica, morfologia, método de dispersão,
culturas afetadas, sintomas ocasionados, forma de detecção, método de controle. Dos 27 procariotos listados, seis
são potencialmente transmitidos por sementes, fato importante porque parte das espécies vegetais cultivadas no
Brasil provém do exterior, a maioria na forma de sementes, existindo assim risco muito grande da introdução
simultânea de patógenos. Assim sendo, a presente revisão é relevante por servir de embasamento para as Estações
Quarentenárias Brasileiras que atuam juntamente com MAPA na prevenção e controle da disseminação de pragas
A1.

Palavras-chave adicionais: Estação quarentenária; MAPA; Pragas quarentenárias.

ABSTRACT
Prospections of Quarentenary Procarion Regulated and Dispersed by Seeds

Most of the plant species grown in a country come from abroad, the result of exchanging material, due to the
need to achieve a possible genetic variability; however, there is a very high risk of simultaneous introduction of
pathogens. The need to concern itself with the sanity of imported plant species is clear, since the introduction of
a pest or a pathogen together with a particular plant species does not preclude the possibility that it will adapt,
thereby becoming a potential hazard. The Normative Instruction (IN) 41 / 2008- provided by the MAPA brings a
List of Absent Quarantine Pests (A1) including about 450 pests among viruses, viroids, fungi, insects, mites, weeds,
nematodes and prokaryotes are all considered to be at risk for Brazil, since they do not occur in the country, and the
introduction of a phytopathogenic agent or pest along with a certain plant species does not exclude the possibility
that they will adapt to other crops, becoming, therefore a potential risk. The objective of this article was to analyze
the prokaryotes contained in the IN 41/2008 that are transmitted by seeds and to perform a bibliographic, technical
and scientific basis for each prokaryote, through the knowledge about the taxonomic classification, morphology,
dispersion method, affected cultures, symptoms detection methods and control methods. As six from the 27
prokaryotes listed are potentially transmitted by seeds, they are very important because some of the plant
species grown in Brazil come by seeds from the outside with the risk to introduced those organisms together. .
Therefore, such works are relevant and serve as a basis for the Brazilian Quarantine Stations that work together
with MAPA in the prevention and control of the dissemination of A1 pests.

Additional keywords: Quarantine stations; MAPA; Quarantine pests.

110 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J.

INTRODUÇÃO IN 41/2008: Burkholderia glumae; Clavibacter
michiganensis subsp. nebraskensis; C. michiganensis
No ano de 2008 o Ministério da Agricultura, subsp. sepedonicus; Pantoea stewartii; Pectobacterium
Pecuária e Abastecimento (MAPA) disponi- rhapontici e Rhodococcus fascians.
bilizou a Instrução Normativa (IN) 41/2008- Lista
de Pragas Quarentenárias Ausentes (A1)- que Abordagem Sistemática da
contempla, dentre outras pragas, os procariontes Burkholdeira glumae
considerados de risco para o Brasil, constituindo
aproximadamente 27. Pragas quarentenárias Foi descrito pela primeira vez no Japão na década
regulamentadas A1 são aquelas que não ocorrem de 1950, é o agente causal da podridão bacteriana
no país e o mesmo tem ciência da importância do grão ou crestamento bacteriano da panícula a
econômica e do dano potencial que a mesma depender da fase de crescimento do arroz (Oryza
seria capaz de causar. sativa) (Nandakumar et al., 2007; Zhu et al., 2008;
Ham et al., 2011; Kim et al., 2012) pertence à família
Na IN 41/2008 encontram-se listadas, com Burkholderiaceae, gênero Burkholdeira.
o nome científico de cada espécie de procarionte
A1, servindo de orientação às principais Insti- 1- Morfologia: É uma bactéria gram-negativa,
tuições que trabalham diretamente com Defesa aeróbica, móvel com dois a quatro flagelos
Vegetal, de forma mais específica com Proteção polares, em forma de haste, com tamanho
de Plantas, como as Estações Quarentenárias variando entre 0,5-0,7 x 1,5-2,5 mm de largura
que precisam se atentar tanto às Pragas e comprimento, respectivamente; é capaz de
Quarentenárias Regulamentadas, que são as crescer em temperatura variando entre 11 a 40
contempladas na IN 41/2008, como às Pragas °C, porém a temperatura ótima seria 30 a 35 °C.
Quarentenárias Não Regulamentadas, que são Apresentam colônias em agar nutriente e possui
as conhecidas como Pragas Exóticas, e como coloração cinza - branco, ligeiramente elevadas
próprio nome enfatiza, são exóticas e, portanto com margens lisas (Zhu et al., 2008; Ham et al.,
se tem pouquíssimo ou praticamente nenhum 2011).
conhecimento sobre as mesmas. A IN 41/2008
das pragas quarentenárias regulamentas é uma 2- Transmissão: A principal e mais preocupante
contribuição considerável para uma gestão de forma de transmissão ocorre através das sementes
qualidade eficiente, a fim de evitar a entrada verdadeiras. Esse meio pelo qual se propaga a
dessas pragas no território brasileiro, portanto é bactéria é considerado de alto risco potencial
imprescindível o conhecimento específico de cada e altamente eficiente na transmissão a longas
procarioto disponibilizado na mesma. Afinal só distâncias (Ham et al., 2011).
se pode combater um inimigo se o conhecermos
muito bem. A transmissão de fitopatógenos 3- Gama de Hospedeiro: A principal espécie
associados a sementes tem sido a forma de vegetal hospedeira da B. glumae é o arroz (Oryza
dispersão mais preocupante, pois a mesma é sativae) (Nandakumar et al., 2007; Zhu et al., 2008;
capaz de realizar a transmissão eficiente e a Ham et al., 2011; Kim et al., 2012). Segundo Jeong et
longas distâncias. O patógeno pode ser carregado al. (2003) há relato também da bactéria infectando
internamente e/ou transportado por frações as seguintes espécies: tomate (Lycopersicon
impuras do lote, que podem conter micélios, esculentum), gergelim (Sesamum indicum), perilla
corpos de frutificação e esporos de fungos; cistos (Perilla frutescens), berinjela (Solanum melongena) e
ou galhas de nematoides, partículas de vírus ou pimentão (Capsicum annuum).
células bacterianas. Dos 27 procariotos descritos
na lista A1, seis são transmitidos por sementes 4- Distribuição Geográfica: A bactéria corre nos
(Tabela1). seguintes países: Japão, Estados Unidos, Panamá,
Cuba, Haiti, República Dominicana e Colômbia
O objetivo desse artigo é servir de (Nandakumar et al., 2007).
embasamento bibliográfico, técnico e científico
para cada procarioto, transmitido por sementes, 5- Sintomas: Ferrugem da panícula do arroz
descrito na IN através do conhecimento sobre a (Figura 1) é o sintoma típico dessa doença, porém
classificação taxonômica, morfologia, método é evidente o abortamento de sementes, grãos
de dispersão, culturas afetadas, sintomas descolorados e vazios devido ao enchimento
ocasionados, forma de detecção, método de irregular de grãos, podridão das plântulas.
controle dos seguintes procariotos listados na Esses sintomas também têm sido observados
com várias outras espécies de bactérias, por

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago –Dez 2018. 111

Prospecção de procariontes quarentenários regulamentados e...

Tabela 1- Listagem dos procariontes contidos na Instrução Normativa 41/2008 com ênfase na forma de dispersão
por semente

PROCARIONTE TRANSMISSÃO POR SEMENTE
Apple chat fruit phytoplasma NÃO
Apple proliferation phytoplasma NÃO
Burkholderia glumae SIM
Candidatus liberibacter africanus NÃO
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus NÃO
C. michiganensis subsp. nebraskensis SIM
C. michiganensis subsp. sepedonicus SIM
Erwinia amylovora NÃO
E. salicis NÃO
Grapevine flavescencedorée phytoplasma NÃO
Palm lethal yellowing phytoplasma NÃO
Peach X-disease phytoplasma NÃO
Pantoea stewartii SIM
Peachrosette phytoplasma NÃO
Peachyellows phytoplasma NÃO
Pear decline phytoplasma NÃO
Pectobacterium rhapontici SIM
Pseudomonas syringae pv. atrofaciens NÃO
Rhodococcus fascians SIM
Spiroplasma citri NÃO
Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii raça B NÃO
Xanthomonas campestris pv. Cassavae (=Xanthomonas cassavae) NÃO
Xanthomonas oryzae pv. oryzae NÃO
X. oryzae pv. oryzicola NÃO
X. populi NÃO
X. vasicola pv. musacearum NÃO
Xylophilus ampelinus NÃO

isso que a identificação precisa dos patógenos e suas variações como, por exemplo, as realizadas
os levantamentos epidemiológicos não podem por Jeong et al. (2003); Zhu et al. (2008); Ham et al.
considerar somente os sintomas (Nandakumar et (2011); Kim et al. (2012); Nandakumar et al. (2007)
al., 2007; Kim et al., 2012). e Zhu et al. (2008) sugerem para realização dessa
técnica o uso do par de primers: F-5’- ACA.CGG.
6- Método de Detecção: Realização do AAC.ACC.TGG.GTA-3’e R-5’- G.CTC.TCC.
teste imunoenzimático “Enzyme-linked CGA.AGA.GAT-3’, que amplificaum fragmento
Immunosorbent Assay” (ELISA), para indexação de 50 pb.
da B. glumae, cujo kit pode ser adquirido através
de empresas especializadas na fabricação de kit 7- Método de Controle: A medida de controle
ELISA comercial como, por exemplo: Agdia, mais indicada para B. glumae é a certificação
Agri-Analysis, Ksbio, Loewe-info, etc. Teste de fitossanitária do material propagativo. É
PCR através da extração de DNA, seguido de PCR indicado o tratamento quimíco das sementes

112 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J.

e da planta com ácido oxolínico de quinolina, tades de granizo, jateamento, vento ou até mesmo
uso de cultivares resistentes, desinfestação de danos físicos causados pelo homem (Schlund,
equipamentos, retiradas dos restos culturais 2015). A transmissão também pode ocorrer por
(Nandakumar et al., 2007; Ham et al., 2011). semente, sendo esse, o meio de transmissão a
longa distância (Ahmad et al., 2015).
Abordagem Sistemática da Clavibacter
michiganensis subsp. nebraskensis 3- Gama de Hospedeiro: A principal hospedeira
da Cmn é o milho (Zea mays), havendo relatos
Os primeiros relatos de ocorrência da Clavibacter também da bactéria infectando as seguintes
michiganensis subsp. nebraskensis (Cmn) foi em espécies: cana de açúcar (Saccharum officinarum),
1969 em três campos de produção de milho capim-sudão (Sorghum bicolor), capim-arroz
(Zea mays) no estado de Nebraska,dos Estados (Echinochloa crus-galli), gamagrass oriental
Unidos da América do Norte, sen do, por (Tripsacum dactyloides), rabo de raposa verde
esse motivo, denominado subespécie de C. (Setaria viridis), sorgo (Sorghum vulgare) e teosinto
nebraskensis (Langemeier et al., 2014).É o agente (Euchlaena mexicana) (Langemeier et al., 2014).
causal da murcha bacteriana, mancha foliar ou
"sarda da folha" do milho, pertencente à família 4- Distribuição Geográfica: A bactéria ocorre nos
Microbacteriaceae, gênero Clavibacter (Agarkova Estados Unidos e Canadá (Eppo, 2017a).
et al., 2011; Eppo, 2017a).
5- Sintomas: Infecções nas folhas (Figura 2) são
O gênero Clavibacter é composto por uma mais comuns e apresentam sintomas distintos,
espécie Clavibacter michiganensis (Cm) e cinco que podem ser lesões amarelas, margens
subespécies: C. michiganensis subsp. michiganenses onduladas, mosaico de verde escuro ao preto
(Cmm), C. michiganensis subsp. nebraskensis descontínuo ou exsudado bacteriano brilhante.
(Cmn), C. michiganensis subsp. insidiosus (Cmi), As bactérias foram confirmadas nos feixes
C. michiganensis subsp. tessellarius (Cmt) e C. vasculares intercelular. As lesões foliares são
michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) (Carlson grandes e podem ser elípticas, ou em forma de
& Vidaver, 1979; Davis et al., 1984). V, como estas lesões continuam a crescer, eles
se aglutinam e causam requeima nas folhas.
1- Morfologia: É uma bactéria não-móvel, gram- Além disso, na raiz é possível observar coloração
positiva e apresenta catalase positiva, oxidase castanha e no caule podridão e nanismo.
negativa e produz colônias laranja-amarelos
fluidas sobre extrato caldo de levedura de 6- Método de Detecção: Realização do teste de
nutrientes (Schlund, 2015). ELISA, para indexação da Cmn (Zhang et al.,
2013). Realização da Extração de DNA, seguido
2- Transmissão: Não há vetor conhecido para de PCR e suas variações. Ribeiro (2011); Ahmad
a transmissão, mas as lesõessão muitas vezes et al (2015) e Schlund (2015) utilizaram primers
utilizadas para iniciar a infecção, os ferimentos específicos para realizar pesquisas com Cmn e
podem ocorrer a partir de fortes chuvas, tempes- obtiveram resultados satisfatórios.

Figura 1- Sintoma do apodrecimento bacteriano de grãos de arroz (Oriza sativae) causado 113
pela Burkholdeira glumae.
Fonte: https://www.croplifela.org/pt/pragas/lista-do-pragas/burkholderia-glumae.

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago –Dez 2018.

Prospecção de procariontes quarentenários regulamentados e...

Figura 2 - Sintomas típicos (sardas e remoção de água) ser disseminada por insetos contaminados, que
da ferrugem das folhas de Goss observado no milho criam feridas, como pulgões e besouro, embora
(Zea mays) doce Golden Cross Bantam causada pela seu papel na epidemiologia não seja claro (Van
Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis. Der Wolf et al., 2005).
Fonte: Four Common Setaria Species are Alternative Hosts
for Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, Causal 3- Gama de Hospedeiros: A infecção natural
Agent of Goss’s Bacterial Wilt and Blight of Corn. causada por Clavibacter michiganensis subsp.
sepedonicus foi encontrada somente em batata
7- Método de Controle: A medida mais eficiente (Solanum tuberosum). A beterraba (Beta vulgaris)
de controle de bactéria é a prevenção, portanto foi descrita como hospedeira natural, porém
indica-se o uso de medidas preventivas como uso sem apresentar sintomas. Existem ainda relatos
de material propagativo sadio, desinfestação de de que a bactéria foi encontrada em sementes
equipamentos, retiradas dos restos culturais e infectadas de beterraba (Bugbee & Gudmestad,
cultivares resistentes (Zerbini, 2002; Smith, 2007). 1988). Outras espécies da família Solanaceae
que apresentaram sintomas quando inoculadas
Abordagem Sistemática da Clavibacter artificialmente com uma estirpe da bactéria
michiganensis subsp. sepedonicus foram: Lycopersicon pimpinellifolium, Athenaea sp.,
Solanum lycopersicum, S. antipoviczii, S. balsii, S.
Foi descrito pela primeira vez na Alemanha, cariophyllum, S. chacoens, S. citrullifolium (Van Der
no ano de 1906 (Appel, 1906). É o agente Wolf et al., 2005).
causal da podridão anelar bacteriana, uma das
doenças mais destrutivas da batata (Solanum 4- Distribuição Geográfica: Ocorre na África,
tuberosum) no hemisfério norte. Pertence à família Argélia, América do Norte, Canadá, Estados
Microbacteriaceae, gênero Clavibacter (Agarkova Unidos, América do Sul, Peru, Ásia, Cazaquistão,
et al., 2011; Eppo, 2017a) China, Coréia, Japão, Nepal, Taiwan, Uzbequistão,
Europa: Alemanha, Áustria, Bielorússia, Chipre,
1- Morfologia: Bactéria gram-positiva, aeróbica, Dinamarca, Espanha, Eslováquia, Estônia, Fin-
não móvel, com células pleomórficas, medindo lândia, França, Grécia (Creta), Letônia, Lituânia,
de 0,5 μm a 1,0 µm (Alipour, 2013). Em meio de Noruega, Países Baixos, Polônia, República Checa,
cultura apresentam colônias de coloração que Reino Unido, Romênia, Rússia (inclusive Sibéria),
variam de branco a creme, com crescimento Suécia e Ucrânia (CABI INTERNACIONAL,
geralmente lento com morfologias celulares que 2006).
vão desde grandes formas globosas até as típicas
varas curtas (Alipour, 2013). 5- Sintomas: No tubérculo é possível observar
rotulação característica do anel; nos estágios
2- Transmissão: Todas as espécies desse gênero iniciais do desenvolvimento dos sintomas, o
disseminam-se via semente (Xu, 2010), porém anel vascular torna-se vítreo e o tecido vascular
a forma de transmissão mais preocupante é via na extremidade começa a escurecer. Mais tarde,
tubérculos infectados, que pode ser disseminados quando os tubérculos são cortados e espremidos,
por contato direto, via implementos agrícolas. as gotas leitosas do pus bacteriano são apagadas,
Potencialmente, C. michiganensis também pode depois disso, o tecido vascular se torna amarelo
cremoso, em última análise, todo o tubérculo
pode apodrecer, porém a podridão é inodora
(Van Der Wolf et al., 2005).

Nos estágios iniciais do desenvolvimento
de sintomas em plantas de batata em desen-
volvimento, as folhas começam a murchar e são
ligeiramente enroladas nas margens, os espaços
interveinais das folhas tornam-se de cor verde
claro a amarelo pálido, como a doença progride,
as folhas tornam-se necróticas; a necrose começa
nas margens (Figura 3) (De Boer & Slack, 1984;
Van Der Wolf et al., 2005).

6- Método de Detecção: Realização de ELISA,
teste imunoenzimático para indexação da Cms

114 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J.

que pode ser adquirido através de empresas retiradas dos restos culturais e uso de cultivares
especializadas na fabricação de kit ELISA resistentes.
comercial como, por exemplo: Agdia, Agri-
Analysis, Loewe-info, etc. Realização da Extração Abordagem Sistemática
de DNA, seguido de PCR e suas variações (Mills da Pantoea stewartii
et al.,1997; Jacques et al., 2012; Cho et al., 2015)
através do uso de primers específicos. Pantoea stewartii, outrora denominação de Erwinia
7- Método de Controle: A certificação de stewartii, é o agente causal da murcha bacteriana
sementes que estipula tolerância zero à doença e crestamento foliar em milho (Zea mays), perten-
é fundamental na redução da dispersão da cente ao reino Bactéria, filo Proteobacteria, classe
bactéria. Em locais de ocorrência ou em que já Gammaproteobacteri, ordem Enterobacteriales,
tenha ocorrido a doença, recomenda-se a rotação família Enterobacteriaceaee, gênero Pantoea
de culturas, a desinfestação de material e outras (Eppo, 2017b).
práticas sanitárias como medidas necessárias
para impedir o retorno da doença ou a sua 1- Morfologia: É uma bactéria gram-negativa,
dispersão (Martins et al., 2009). Desinfestação de não móvel, colônias em Agar nutriente–glucose
equipamentos, com aplicações de desinfetantes apresentam coloração creme-amarelo, amarelo-
como amônia quaternária, água sanitária, cloro, limão ou laranja-amarelo e liso, elevada ou
iodo ou compostos contendo fenol, produtos a convexa (Correa, 2010; Ribeiro, 2011; Eppo, 2017b).
base de dióxido de cloro e ácido peroxiacético
demonstraram eficácia na erradicação da bactéria 2- Transmissão: Ocorre por insetos vetores e por
(Van Der Wolf et al., 2005). Indica-se ainda a sementes verdadeiras, sendo a disseminação mais
eficiente via inseto vetor, popularmente chamado
A de pulguinha do milho (Chaetocnema pulicaria).
Uma vez que as bactérias tenham sido adquiridas,
B o inseto pode transportar e transmiti-las ao longo
de sua vida e a distâncias consideravelmente
Figura 3 - A) Tubérculo de batata (Solanum tuberoso) grandes (Block et al., 1998; Ribeiro, 2011; Eppo,
com sintomas da podridão do anel causados pela 2017b). A transmissão via semente ocorre em
bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. baixa frequência, porém devido ao risco potencial
B) Coloração amarelo e castanho das folhas de batata e a eficiência, essa forma de transmissão tem sido
causadas por C. michiganensis subsp. sepedonicus. a mais preocupante (Ribeiro, 2011).
Fonte: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
(Spieckermann & Kotthoff) Dye & Kemp Actinomycetales: 3- Gama de Hospedeiro: A principal hospedeira
Microbacteriaceae. da P. stewartii é o milho (Zea mays) (Block et
al., 1998; Ribeiro, 2011; Eppo, 2017b) havendo
relato informal também da bactéria infectando
as seguintes espécies: cana de açúcar (Saccharum
officinarum), capim-sudão (Sorghum bicolor),
capim-arroz (Echinochloa crusgalli), gamagrass
oriental (Tripsacum dactyloides), rabo de raposa
verde (Setaria viridis), sorgo (Sorghum vulgare),
teosinto (Euchlaena mexicana) (Langemeier et al.,
2014).

4- Distribuição Geográfica: Ocorre nos seguintes
países China, Malásia, Tailândia, Vietnã, Canadá,
México, EUA, Costa Rica, Porto Rico, Guiana,
Peru (Eppo, 2017b). Existe um relato da P. stewartii
no Brasil no ano de 1968 por Pereira & Zagoto, os
quais relatam a ocorrência da bactéria no estado
de São Paulo.

5- Sintomas: Devido a forma de colonização da P.
stewartii no tecido vascular da planta hospedeira,
o sintoma mais comum é a murcha das folhas
e das demais partes da planta (Ribeiro, 2011).
Em plantas mais jovens observam-se colorações

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago –Dez 2018. 115

Prospecção de procariontes quarentenários regulamentados e...

verde-claro ao amarelo, com margens irregulares (Beta vulgaris) (Huang et al., 2003; Thapa et al.,
ou onduladas, que por vezes se estendem ao 2012; Eppo, 2017c).
longo da folha (Ribeiro, 2011).
4- Distribuição Geográfica: Ocorre nos Estados
6- Método de Detecção: Realização do teste de Unidos, Canadá, Inglaterra, França, Alemanha,
ELISA para indexação da P. stewartii, cujo Kit pode Iugoslávia, Japão, Tchecoslováquia, Ucrânia,
ser adquirido através de empresas especializadas Israel, Coréia, Itália, Irã, Rússia, Lituânia, México
na fabricação de kit ELISA comercial, como por (Huang et al., 2003; Thapa et al., 2012; Eppo,
exemplo: Agdia, Agri-Analysis, Ksbio, Loewe- 2017c).
info, etc. Realização da Extração de DNA,
seguido de PCR e suas variações. Ribeiro (2011) 5- Sintomas: Pectobacterium rhapontici pode oca-
sugere para realização dessa técnica o uso de par sionar dois tipos de sintomas típicos nas plantas:
de primers: F 5’-CCT GTA AGT CTC GAA CC -3’ semente rósea e podridão-da-coroa ou podridão
e R 5’-ATC TCG AAC CGG TAA CC -3’, que pro- mole, porém é válido ressaltar que os sintomas
duziu um fragmento amplificado de 1.100 pb. variam dependendo da planta hospedeira
(Huang et al., 2003).
7- Método de Controle: A medida mais eficiente
de controle de bactéria é a prevenção, portanto, 6- Método de Detecção: Não há relatos sobre a
indica-se o uso de medidas preventivas, como disponibilidade de teste imunoenzimático para
uso de material propagativo sadio, desinfestação indexação da P. rhapontici, porém a realização
de equipamentos, retiradas dos restos culturais, da extração de DNA, seguido de PCR e suas
cultivares resistentes e nesse caso indica-se tam- variações podem ser adotadas. Thapa et al.
bém a pulverização com inseticida para reduzir a (2012) realizaram a caracterização molecular
população do inseto vetor (Ribeiro, 2011). dessa bactéria utilizando os seguintes pares de
primers, F-5′-CCTGCAGTGCCGGGCCAGAT-3′
Abordagem Sistemática e R-5′- AGTGTGACTGTTGTTTTCAG-3′ que
da Pectobacterium rhapontici produziram 1.600 pb.

Outrora Pectobacterium rhapontici foi também 7- Método de Controle: A medida mais eficiente
denominada de Erwinia rhapontici, é o agente de controle de bactéria é a prevenção, portanto
causal da semente rósea e da podridão-da-coroa indica-se o uso de medidas preventivas como
ou podridão mole do trigo (Triticum aestivum). É uso de material propagativo sadio, desinfestação
considerada um patógeno oportunista, pertence a de equipamentos, retiradas dos restos culturais,
família Enterobacteriaceae, gênero Pectobacterium cultivares resistentes, além disso, indica-se o
(Huang et al., 2003; Thapa et al, 2012; Eppo, 2017c). tratamento térmico da semente, uso do controle
biológico utilizando fungos antagonistas da P.
1- Morfologia: É uma bactéria gram-negativa, rhapontici. (Huang et al., 2003).
anaeróbica facultativa, que produz um pigmento
rosa, difuso em meio de Agar, contendo Abordagem sistemática
sacarose-peptona (Huang et al., 2003). As células da Rhodococcus fascians
bacterianas não formam esporos, apresentam
hastes não capsulares 0,5-0,8 x 1,2-1,5µ, move-se Rhodococcus fascians é o agente causal da fas-
através dos cinco flagelos peritricosos (Huang et ciação bacteriana. Fasciação é caracterizada por
al., 2003; Thapa et al., 2012). hiperplasia de tecido, conformação anormal ou
formação defeituosa dos órgãos das plantas que
2- Transmissão: A transmissão de P.rhapontici deveriam ser cilindricos. A bactéria pertence a
ocorre por semente, solo, água e por demais família Nocardiaceae, gênero Rhodococcus. Esse
partes da planta (Huang et al., 2003). gênero também é conhecido por abrigar outros
patógenos que afetam humanos e animais
3- Gama de Hospedeiro: A principal hospedeira (Putnam & Miler, 2007; Stes et al., 2013; Bacdive,
da P. rhapontici é o trigo (Triticum aestivum). 2017).
Também há relatos da bactéria infectando as
seguintes espécies: centeio (Lolium sp.), ervilha 1- Morfologia: É uma bactéria gram-positiva,
(Pissum sativum), feijoeiro comum (Phaseolus anaeróbica,formaesporos,sem motilidade,possui
vulgaris), lentilha (Lens culinaris), cebola (Allium parede celular contendo ácido micólico (Vereecke
cepa), tomateiro (Lycopersicon lycopersicum), et al., 2000; Putnam & Miller, 2007; Stes et al.,
amoreira (Morus sp.) e beterrraba-açúcareira 2013). Bactérias gram-positivas frequentemente

116 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Silva, F.R.; Medeiros, R.M.A.D. & Zacarias, R.J.

recebem pouca atenção, sendo ofuscadas pelas 7- Método de Controle: A medida mais eficiente
mais numerosas espécies gram-negativas, porém, de controle de bactéria é a prevenção, portanto
devido a gravidade do problema fitossanitário indica-se o uso de medidas preventivas como
ocasionado pela R. fascians foi necessária uma uso de material propagativo sadio, desinfestação
maior atenção (Vereecke et al., 2000; Putnam & de equipamentos, retiradas dos restos culturais,
Miller, 2007; Stes et al., 2013). cultivares resistentes, além disso, indica-se o
tratamento térmico da sementes (Putnam &
2- Transmissão: A transmissão da R. fascians Miller, 2007).
ocorre por água e por semente. Existem relatos
de que seja provável que as bactérias fiquem CONSIDERAÇÕES FINAIS
restritas ao revestimento da semente, e não no seu
interior. Por materiais de propagação vegetativa Parte das espécies vegetais cultivadas no Brasil
e no solo a presença da bactéria só ocorre se a provém do exterior, sendo a maioria vinda como
mesma estiver junto ao resto cultural da planta sementes, existindo assim um risco muito grande
hospedeira (Putnam & Miller, 2007). da introdução simultânea de patógenos, jus-
tificando a necessidade de os órgãos públicos
3- Gama de Hospedeiro: Rhodococcus fascians intervirem na qualidade das espécies vegetais,
possui uma diversidade de plantas hospedeiras, no que diz respeito a sanidade. A introdução
desde herbáceas, monocotiledôneas a dicotiledô- de agente fitopatogênico ou praga junto com
neas. Putnam & Miller (2007) citam mais de 100 determinada espécie vegetal não exclui a
espécies de plantas infectadas pela R. fascians, possibilidade de que venham a se adaptar as
dentre elas estão: alface (Lactua sativa), beterrraba- outras culturas, tornando-se, portanto um risco
açúcareira (Beta vulgaris), batata (Solanum potencial. Outro grande risco da introdução de
tuberosum), ervilha (Pissum sativum), feijoeiro agentes fitopatogênicos é que não se pode prever
comum (Phaseolus vulgaris), milho (Zea mays) e o comportamento e a adaptabilidade desses
tomateiro (Lycopersicon lycopersicum). organismos nas novas áreas, por isso que quando
se trata de patógeno considerado quarentenário a
4- Distribuição Geográfica: Ocorre nos Estados principal forma de controle é a exclusão, ou seja,
Unidos, México, Canadá, Alemanha, Oriente prevenir a entrada do patógeno numa área em
Médio, Ásia, Austrália,Nova Zelândia, Egito e que o mesmo ainda não exista. Tais preocupações
Colômbia (Putnam & Miller, 2007; Bacdive, 2017). têm sido levadas em consideração, sobretudo nas
Estações Quarentenárias do Brasil, juntamente
5- Sintomas: Rhodococcus fascians ocasiona hiper- com o MAPA, através dos testes e análises da
plasia do tecido, ou seja, anormalidade nos tecidos, sanidade dos materiais vegetais vindo do exterior.
e nas folhas é possível observar a proliferação
de brotos nas axilas; no caule observa-se uma REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
proliferação de coloração preta, e os sintomas
menos severos também são observados, como Agarkova, I.V.; Lambrecht, P.A. & Vidaver, A.K.
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6- Método de Detecção: Realização de teste de
ELISA para indexação da R. fascians (Vereecke et Appel, O. Neuere Untersuchungenü ber Kartoffel-
al., 2000). Kits de ELISA podem ser adquiridos und Tomatener krankungen. Jahresbericht der
através de empresas especializadas como, por Vereinigung der Vertreterder Angewandten Botanik,
exemplo: Agdia, Agri-Analysis, Ksbio, Loewe- v.3, p. 122-136, 1906.
info. Realização da Extração de DNA, seguido
de PCR e suas variações como, por exemplo, Ahmad, A.; Mbofung, G.Y.; Acharya, J.; Schmidt, C.L.
as realizadas por Stange et al. (1996); Putnam & & Robertson, A.E. Characterization and comparison
Miller (2007) e Nikolaeva et al. (2012). Stange et of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis strains
al. (1996) realizaram o estudo molecular dessa recovered from Epiphytic and symptomatic infections
bactéria, utilizando os seguintes pares de primers of maize in Iowa. PloSone, v. 10, n. 11, 2015.
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Artigo/ Article

Película da Amêndoa de Caju (Anacardium occidentale) como Fonte de
Compostos Bioativos e Conservante Natural

Leilanne Marcia Nogueira Oliveira 1, Ana Cristina Silva de Lima 1, Larissa Morais Ribeiro da
Silva 1; Flayanna Gouveia Braga Dias 1, Gisani de Sousa Maia Teixeira1, Geraldo Arraes Maia1

Raimundo Wilane de Figueiredo1 & Evania Altina Teixeira de Figueiredo

1Departamento de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Ceará. Av. Mister Hull, 2977,
Campus Universitario do Pici, bl. 858, CEP 60356-000, Fortaleza, Ceará, Brazil

(Aceito para publicação em 15/12/2018)

Autor para correspondência: Larissa Silva. Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do
Ceara, Campus do Pici, 12.168, Fortaleza, Ceara, 60356-000, Brazil - Fone: + 55 (85) 33669748; e-mail: larissamrs@
yahoo.com.br

Oliveira, L.M.N.; Lima, A.C.S.; Silva, L.M.R.; Dias, F.G.B.; Teixeira, G.S.M.; Maia, G.A.; Figueiredo, R.W. &
Figueiredo, E.A.T. Película da amêndoa de caju (Anacardium occidentale) como fonte de compostos bioativos e
conservante natural. ANAIS Academia Cearense de Ciências. v. 2, n. 2, p.120-125, 2018.

RESUMO
A indústria farmacêutica e de alimentos vem buscando encontrar substâncias de origem natural que possam
ser utilizadas, visando substituir aditivos sintéticos. Estudos relacionados a película de castanha de caju na área
de alimentos, ainda podem ser considerados escassos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar
a atividade antimicrobiana de extrato da película de amêndoa de caju, contra Salmonella enteritidis IAL 1132,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Listeria monocytogenes ATCC 19115. A película também foi submetida a
quantificação de compostos bioativos (polifenóis extraíveis, taninos condensados e atividade antioxidante
total). A película da amêndoa de caju apresentou elevado teor de compostos bioativos, podendo ser utilizada
na indústria farmacêutica e de alimentos, visando enriquecer esses produtos. A amostra analisada apresentou
atividade antimicrobiana contra S. enteritidis, S. aureus e L. monocytogenes, podendo ser utilizada industrialmente,
visando inibir ou matar esses microrganismos, quando utilizadas em concentrações de 6.000; 6000 e 100 µg/mL,
respectivamente.

Palavras-chave adicionais: Concentração inibitória mínima; Concentração bactericida mínima; Compostos
fenólicos.

ABSTRACT

Cashew (Anacardium occidentale) Almond film as Source of Bioactive
Compounds and Natural Preservative

The pharmaceutical and food industry has been searching for substances of natural origin that can be used for
replacing synthetic additives. Studies related to cashew apple nut testa in the food area can still be considered
scarce. Thus, this study aimed to evaluate the antimicrobial activity of extract of cashew nut testa against
Salmonella enteritidis IAL 1132, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Listeria monocytogenes ATCC 19115. The
testa was also subjected to quantification of bioactive compounds (polyphenols extractable, condensed tannins
and total antioxidant activity). The testa cashew nut showed high levels of bioactive compounds and can be used
in the pharmaceutical and food industry aimed at enriching these products. The sample showed antimicrobial
activity against S. enteritidis, S. aureus and L. monocytogenes, can be used industrially order to inhibit or kill these
microorganisms when used in concentrations of 6,000; 6000 and 100 ug/ml, respectively.

Additional keywords: Testa; Antimicrobial activity; Cashew nuts.

INTRODUÇÃO consideração a visibilidade que novas publicações
cientificas apresentam, comprovando efeitos
Atualmente os consumidores de alimentos maléficos a saúde decorrentes do consumo dos
estão cada vez mais exigentes no que diz mesmos, condenando substâncias utilizadas
respeito a composição do produto, levando em

120 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Oliveira, L.M.N.; Lima, A.C.S.; Silva, L.M.R. et al.

comumente como aditivos há décadas. Dessa (Donkoh et al., 2012); nessa pesquisa os autores
forma, as indústrias farmacêutica e de alimentos constataram que a película é uma excelente
vêm buscando encontrar substâncias de origem fonte mineral e energética. Calderon-Montano
natural que possam ser utilizadas, visando a et al. (2011) descrevem que a mesma é rica em
substituir esses aditivos sintéticos. proteínas.

O cajueiro (Anacardium occidentale L.) Levando em consideração a necessidade de
apresenta-se como uma planta com larga pesquisas cientificas relacionadas a identificação
disseminação na região litorânea do Brasil de produtos de origem natural que possam ser
(Oliveira et al., 2015). É uma árvore de aparência utilizados como conservantes naturais, este
exótica e seu pedúnculo super desenvolvido é trabalho teve como objetivo avaliar os compostos
muito apreciado localmente pela suculência, bioativos e a atividade antimicrobiana de extrato
sendo frequentemente confundido com o fruto, da película de castanha de caju, contra Salmonella
quando na verdade se trata do pseudofruto, enteritidis IAL 1132, Staphylococcus aureus ATCC
cientificamente denominado de pedúnculo 25923 e Listeria monocytogenes ATCC 19115,
floral, com coloração variante entre o amarelo e visando propor a utilização desse material na
o vermelho (Mazetto et al., 2009), sendo bastante indústria de alimentos, como conservante natural
utilizado para processamento pela indústria de e/ou fonte de bioativos.
sucos, polpas e doces regionais (Moro et al., 2009).
MATERIAL E METODOS
O fruto do cajueiro, popularmente
conhecido como castanha de caju, apresenta Material
comprimento e largura variáveis, casca coriácea
lisa, mesocarpo alveolado, repleto de um líquido As películas de amêndoa de castanha de caju
escuro chamado de líquido da casca da castanha foram coletadas em indústria localizada no
do caju, conhecido como LCC (Mazetto et al., município de Fortaleza-Ce, Brasil. As castanhas
2009). foram provenientes de produtores locais e as
películas são consideradas coprodutos industriais
Na parte mais interna da castanha está resultantes do processamento.
localizada a amêndoa, constituída de dois cotilé-
dones carnosos e ricos em lipídeos, que compõem A película foi submetida à quantificação de
a parte comestível do fruto, revestida por uma compostos bioativos (polifenóis extraíveis, taninos
película em tons avermelhados (Mazetto et al., condensados e atividade antioxidante total) e à
2009), que apresenta função de proteção do fruto. determinação da atividade antimicrobiana, cujas
metodologias estão descritas a seguir.
As indústrias de beneficiamento da
castanha estão concentradas principalmente Quantificação de compostos bioativos
no estado do Ceará, que detém cerca de 70%
da capacidade instalada da região nordestina. a) Determinação de polifenóis extraíveis totais
Somente a agroindústria processadora de Os polifenóis extraíveis totais foram determinados
castanha de caju no Ceará emprega cerca de 20 através de metodologia que utiliza o reagente de
mil pessoas, além de proporcionar 280 mil postos Folin-Ciocalteu, utilizando ácido gálico como
de trabalho no campo (Moura, 2008; Mazetto et padrão, conforme metodologia descrita por
al., 2009). Levando em consideração esse elevado Larrauri et al. (1997).
processamento da castanha de caju na região,
verifica-se alta viabilidade na utilização da A extração foi realizada usando 1 g de
película da castanha de caju. amostra, em seguida foi adicionado 40 mL
de solução etanólica 50% (primeira solução
A película da castanha de caju representa extratora). A mistura obtida foi homogeneizada
1 a 3% do peso total da castanha (Oliveira et al., e deixada em repouso por 1 h para extração,
2015), sendo obtida durante o processamento da protegida da luz. Em seguida, a mistura foi
castanha de caju e normalmente descartada pela centrifugada a 3.000 rpm por 15 min. Após a
indústria, por ser considerada um subproduto centrifugação, o sobrenadante obtido foi filtrado
industrial. e transferido para um balão de 100 mL protegido
da luz. Ao precipitado foi adicionado 40 mL de
Estudos relacionados à película de castanha uma solução de acetona 70% (segunda solução
de caju na área de alimentos ainda podem ser extratora), ficando em repouso por mais 1 h,
considerados escassos. A utilização da película protegido da luz. Em seguida, a mistura foi
já foi realizada envolvendo pesquisa sobre centrifugada a 3.000 rpm por 15 min.
nutrição animal, visando a alimentação de porcos

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 121

Película da amêndoa de caju (Anacardium occidentale)...

O segundo sobrenadante obtido foi d) Atividade Antimicrobiana
misturado ao primeiro no mesmo balão de
100 mL, o qual foi aferido com água destilada, Para a determinação da atividade antimicrobiana
obtendo-se assim o extrato para determinação dos da película de amêndoa de castanha de caju,
polifenóis extraíveis totais. Em tubos de ensaio formulou-se um extrato metanólico semelhante
foram adicionadas alíquotas de 25 μL do extrato ao utilizado na determinação de taninos
e adicionada água destilada para completar o condensados, no qual a película de amêndoa de
volume de 0,5 mL. Foram então adicionados 0,5 castanha de caju foi submetida a aquecimento
mL do reagente Folin-Ciocalteu (1:3), 1,0 mL de a 65 °C por 30 min com metanol, em seguida o
NaCO3 e 1,0 mL de água destilada. Os tubos de homogeneizado foi filtrado em papel de filtro
ensaio foram agitados em agitador vortex para qualitativo e o sobrenadante concentrado em
homogeneização e deixados em repouso fora do um evaporador a vácuo a 70 ºC. Posteriormente,
alcance da luz, por 30 min. Decorrido o tempo, foi liofilizado para a retirada total do solvente
a leitura foi realizada em espectofotômetro de orgânico e analisado quanto ao teor de polifenóis
marca Shimadzu, modelo UV-1800 a 700 nm, extraíveis totais segundo método descrito por
usando como referência a curva padrão de ácido Larrauri et al. (1997). A partir desta quantificação,
gálico. Os resultados foram expressos em g de foram formuladas soluções com concentrações
ácido gálico (AG).100 g-1 de amostra. de polifenóis de 10000; 8000; 4000; 2000; 1000;
500; 400; 300; 200 e 100 ppm.
b) Determinação de taninos condensados
A atividade antimicrobiana do extrato
Os taninos condensados totais foram determi- da película de amêndoa de castanha de caju foi
nados pelo método da vanilina-HCl (Price & determinada através do método de microdiluição
Butler, 1977; Earp et al., 1981; Steadman et al., em caldo utilizando placas contendo 96 poços,
2001). Elaborou-se um extrato metanólico a partir segundo o protocolo estabelecido pelo NCCLS
da película de amêndoa de castanha de caju e (2012) onde foram determinadas a concentração
submeteu-se a aquecimento a 65 °C por 30 min. inibitória mínima (CIM) e a concentração bacte-
Retirou-se 0,5 mL do extrato, adicionou-se 5 ricida mínima (CBM). Utilizaram-se as bactérias
mL de vanilina 0,5% acidificada (1:1 mistura de S. enteritidis IAL 1132, S. aureus ATCC 25923 e L.
10g/L vanilina em metanol e 80 ml/L de HCl em monocytogenes ATCC 19115 com uma quantidade
metanol) e esperou-se reagir por 15 min. A absor- de inóculo de 105 UFC/mL.
bância foi medida a 500nm e metanol foi utilizado
como branco. Concentrações foram calculadas Em cada poço adicionou-se 100 µL de caldo
para curva padrão de catequina em metanol e o BHI ou caldo TSB (para a L. monocytogenes), 20
resultado expresso em catequina equivalente. µL de inóculo correspondente a diluição que
apresentar 105 UFC/mL e 80 µL do extrato da
c) Atividade Antioxidante Total película de amêndoa de castanha de caju nas
concentrações estabelecidas. Poços contendo o
A atividade antioxidante total foi determinada meio de cultura, os reagentes utilizados para
pelo método da captura do radical 2,2´-azinobis elaboração do extrato (mesma concentração)
(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS), e inóculo dos micro-organismos em estudo
conforme metodologia adaptada por Rufino et al. serviram como controle negativo. As microplacas
(2010). O radical livre ABTS foi obtido pela reação foram submetidas a leitura em espectrofotômetro
do ABTS (7mM) com persulfato de potássio Biotwt Elx808 a 630 nm e incubadas a 35 °C por
(0,45 mM). O sistema foi mantido em repouso 24 h, sendo então realizada nova leitura espec-
e em temperatura de 25 oC/16 h, na ausência trofométrica, utilizando o mesmo comprimento
de luz. Decorrido o tempo para formação do de onda. A menor concentração que apresentou
radical, o mesmo foi diluído com álcool etílico até diferença entre as leituras menor ou igual a 0,05
obtenção de absorbância variando de 700 a 705 foi considerada a concentração inibitória mínima
nm. A leitura espectrofotométrica foi realizada (CIM). Nos poços contendo a CIM e as três
a 734 nm, após 6 min da mistura do radical com concentrações seguintes, retirou-se uma alíquota
o extrato (elaborado inicialmente para análise de 50 µL e colocou-se em Agar Palcam (L.
de polifenóis totais). Foi obtida uma curva de monocytogenes) ou Agar Baird-Parker (S. aureus)
concentrações e absorbâncias e os resultados ou Agar Entérico de Hektoen (S. enteritidis) e
foram expresso em μM de Trolox/g de película espalhou-se com alça de Drigalski. As placas
de castanha de caju. foram incubadas a 35 ºC por 24 h e observadas à
presença de crescimento. A menor concentração

122 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Oliveira, L.M.N.; Lima, A.C.S.; Silva, L.M.R. et al.

na qual não ocorreu crescimento foi considerada Tabela 1- Compostos bioativos de película da
como a concentração bactericida mínima. amêndoa de castanha de caju

RESULTADOS E DISCUSSÃO Análise Película da
amêndoa de
A película da amêndoa da castanha de caju Polifenóis extraíveis totais castanha de caju
apresentou elevado teor de polifenóis extraíveis (g EAG*/100 g)
totais e taninos condensáveis (Tabela 1). Trox Taninos condensados 42,60 ± 7,59
et al. (2011) detectaram diferentes substâncias (g Catequina/100g)
bioativas em película de castanha de caju, como Atividade antioxidante total 38,80 ± 1,52
os compostos fenólicos catequina e epicatequina. (ABTS) (mM de Trolox g-1)
Os autores destacaram teores maiores dessas 3,21 ± 0,23
substancias na película quando comparados ao EAG = equivalente de ácido gálico
chá verde e chocolate amargo. A quercetina pode
ser considerada o composto fenálico presente em Tabela 2- Concentração inibitória mínina (CIM) e
maior concentracão, de acordo com Nnaji et al. concentração bactericida mínima (CBM) em µg/
(2014). Chandrasekara & Shahidi (2011) avaliaram
osteores de compostos fenólicos em película de mL referente ao extrato de película de amêndoa de
castanha de caju, destacando a presença de ácido
siringico, ácido galico, ácido cumarico, catequina castanha de caju.
e epicatequina. Nnaji et al. (2014) identificaram a
forte presença de taninos na película de castanha Micro-organismo CIM CBM
de caju, resultado semelhante ao obtido neste
estudo. Salmonella enteritidis 6000 6000
Staphylococcus aureus 6000 6000
Foi observada elevada atividade antioxi- Listeria monocytogenes 100 100
dante para a película da castanha de caju. Kamath
& Rajini (2007) avaliaram a atividade antioxidante concentração inibitória e bactericida de 100 µg/
de película de castanha de caju comercializada mL. Enquanto que para as bactérias Salmonella
na Índia, utilizando para análise o método ABTS, enteritidis e Staphylococcus aureus obteve-se uma
sugerindo que a mesma pode ser utilizada como concentração necessária de 6000 µg/mL para se
uma fonte de antioxidantes. obter esse efeito antimicrobiano.

Devido ao elevado teor de substâncias Os compostos fenólicos são metabólitos
bioativas presentes na película da castanha secundários produzidos pelos vegetais. Em
de caju, sugere-se que a mesma seja utilizada concentrações elevadas, os compostos fenólicos
na indústria farmacêutica ou alimentícia. O podem ser considerados substâncias tóxicas para
desenvolvimento de produtos alimentícios que a célula bacteriana, inibindo seu crescimento
contenham essa película irá reduzir os resíduos (Garcia-Ruiz, 2007).
industriais provenientes do processamento
da castanha de caju, diminuindo problemas Dessa forma, pode-se sugerir que os
ambientais decorrentes da eliminação desse resultados positivos para atividade antimi-
resíduo. Além disso, a utilização da película na crobiana dos extratos da película de castanha
elaboração de novos alimentos será responsável de caju obtidos neste estudo estão relacionados
por maior oferta de alimentos com apelo ao elevado teor de compostos fenólicos totais
nutricional, oferecendo aos consumidores novas presentes na amostra, conforme apresentado
opções de diversos produtos, como cookies, anteriormente.
bolos, entre outros.
Estudos envolvendo a avaliação da
A Tabela 2 mostra os resultados referentes atividade antimicrobiana de outras partes do caju
a atividade antimicrobiana do extrato de película são apresentados na literatura. Gonçalves & Gobo
de amêndoa de castanha de caju. O extrato (2012) avaliaram a atividade antimicrobiana de
elaborado neste estudo apresentou atividade extratos elaborados com o pseudofruto do caju
antimicrobiana contra todos os micro-organismos contra S. epidermidis e S. aureus, visualizando
testados. Nota-se que o extrato de película de ausência de crescimento na concentração de
amêndoa de castanha de caju foi mais eficiente 37.49%. Silva et al. (2007) avaliaram o efeito
para a Listeria monocytogenes apresentando

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 123

Película da amêndoa de caju (Anacardium occidentale)...

antimicrobiano de extratos de folha de cajueiro REFERÊNCIAS
contra uma linhagem resistente de S. aureus,
observando resultados satisfatórios para ação Calderon-Montano, J.; Burgos-Morón, E.; Pérez-
antimicrobiana. Guerrero, C. & López-Lázaro, M. A review on the
dietary flavonoid kaempferol. Mini reviews in
Atualmente, observa-se uma crescente medicinal chemistry, v. 11, n. 4, p.298-344, 2011.
busca por alimentos que não apresentem adi-
tivos químicos em sua composição, como os Chandrasekara, N. & Shahidi, F. Effect of Roasting
conservantes. Dessa forma, a procura por on Phenolic Content and Antioxidant Activities of
substâncias de origem natural que apresentem Whole Cashew Nuts, Kernels, and Testa. Journal of
atividade antimicrobiana pode ser considerada Agricultural and Food Chemistry, v. 59, n.9, p. 5006–
crescente, mundialmente. Levando em consi- 5014, 2011.
deração que a película da castanha de caju
analisada neste estudo apresentou atividade Donkoh, A.; Attoh-Kotoku, V.; Kwame, R.O. & Gascar,
antimicrobiana contra alguns dos principais R. Evaluation of Nutritional Quality of Dried Cashew
micro-organismos responsáveis por doenças Nut Testa Using Laboratory Rat as a Model for Pigs.
transmitidas por alimentos (S. enteritidis, S. aureus The Scientific World Journal, p.1-5, 2012.
e L. monocytogenes), a mesma pode ser utilizada
visando a elaboração de um conservante de Earp, C.F.; Akingbala, J.O.; Ring, S.H. & Rooney, L.W.
origem natural. Evaluation of several methods to determine tannins in
sorghums with varying kernel characteristics. Cereal
Deve-se levar em consideração que este seria Chemistry, v. 58, p. 3, p. 234-238, 1981.
um conservante de baixo custo, tendo em vista
que a película de castanha de caju apresenta-se García-Ruiz, A.; Bartolomé, B.; Martínez- Rodrigues,
como um resíduo do processamento da castanha A.J.; Pueyo, E.; Alvarez, P.J.M. & Arribas, M. Nuevas
de caju. Também se deve destacar que além da perspectivas de la aplicación de los polifenoles
atividade antimicrobiana, serão incluídas no como antimicrobianos en enología, ACE: Revista de
produto substâncias que apresentam benefícios enología, n. 83, 2007.
comprovados a saúde, conforme apresentado
anteriormente. Gonçalves, G.M.S. & Gobbo, J. Antimicrobial Effect
of Anacardium Occidentale Extract and Cosmetic
CONCLUSÕES Formulation Development.Brazilian Archives Of
Biology And Technology, v. 55, n. 6, p. 843-850, 2012.
A película da castanha de caju apresentou
elevado teor de compostos bioativos, podendo ser Kamath, V. & Rajini, P.S. The efficacy of cashew nut
utilizada na indústria de alimentos visando enri- (Anacardium occidentale L.) skin extract as a free
quecer esses produtos, adicionando aos mesmos radical scavenger. Food Chemistry, v. 103, p. 428–433,
compostos fenólicos e taninos condensados, além 2007.
de aumentar a capacidade antioxidante presente
no produto, trazendo benefícios a saúde do Larrauri, J.A.; Rupérez, P. & Saura-Calixto, F. Effect of
consumidor. drying temperature on the stabilitity of polyphenols
and antioxidant activity of red grape pomace peels.
A amostra analisada apresentou atividade Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, n.
anti-microbiana contra S. enteritidis, S. aureus 4, p. 1390-1393, 1997.
e L. monocytogenes, podendo ser utilizada
industrialmente visando inibir ou matar Mazetto, S.E.; Lomonaco, D. & Mele, G. Óleo da
esses microrganismos, quando utilizadas em castanha de caju: oportunidades e desafios no contexto
concentracoes de 6000; 6000 e 100 µg/mL, do desenvolvimento e sustentabilidade industrial.
respectivamente. Quimica Nova, v. 32, n. 3, p. 732-741, 2009.

AGRADECIMENTOS Moura, D Castanha de caju proposta de preço
mínimo safra 2006/2007.http://www.conab.gov.br/
Os autores agradecem ao Conselho Nacional conabweb/download/precos_minimos/proposta_
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico de_precos_ minimos_safra_2006_07_castanha_de_
(CNPq) e Fundação Cearense de Apoio ao caju.pdf, acesso em fevereiro 2008.
Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP). Oliveira, N.F.; Leal, R.S. & Dantas, T.N.C. The
importance of the cashew nut (Anacardium occidentale
L) coat: a review. American International Journal of
Contemporary Scientific Research, v. 2, n. 4, p. 52-84,
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NCCLS. Methods for Dilution Antimicrobial
Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically;
Approved Standard—Sixth Edition. NCCLS document
M7-A6 (ISBN 1-56238-486-4). NCCLS, 940 West Valley
Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898
USA, 2012.

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www.aceci.com.br

Artigo Científico/ Scientific Article

Evaluation of Acute Oral Toxicity of Essential Oil of Hyptis crenata in Mice

Rutyleia Alves-Soares1, Yuri de Abreu Gomes-Vasconcelos1, Keciany Alves de Oliveira1, Lúcio
Ricardo Leite Diniz, Kerly Shamira da Silva-Alves, Francisco Walber Ferreira-da-Silva, José
Henrique Leal-Cardoso1,2, Andrelina Noronha Coelho-de-Souza1,2

1Laboratório de Eletrofisiologia e Contração Muscular, Instituto Superior de Ciências Biomédicas,
Universidade Estadual do Ceará; 2Membro Titular da Academia Cearense de Ciências

(Aceito para publicação 12/12/2018)

Autor para correspondência: Andrelina Noronha Coelho de Souza. [email protected]

Alves-Soares, R.; Gomes-Vasconcelos, Y.A.; Oliveira, K.A.; Diniz, L.R.L. Silva-Alves, K.S.; Ferreira-da-Silva,
F.W.; Leal-Cardoso, J.H.; Coelho-de-Souza, A.N. Evaluation of oral acute tyoxicity of essential oil of Hyptis
crenata in mice. ANAIS da Academia Cearense de Cências, v. 2, n. 2, p.126-132, 2018.

ABSTRACT
Hyptis chrenata is an aromatic plant, widely used in folk medicine as anti-inflammatory to treat several diseases.
H. crenata is rich in essential oil composed, mainly, of monoterpenes and sesquiterpenes. Due to the great
popular use for medicinal therapeutic purposes, this work aims to evaluate the oral toxicity of the essential oil
of H. crenata in mice. The test was done according to the experimental protocol for oral acute toxicity proposed
in Guideline 425 – Acute Oral Toxicity – Up-and-Down-Procedure (UDP), modified. The essential oil was
administered by orogastric gavage, at the doses of 100, 300 and 2000 mg/kg of body weight. After an observation
period of 14 days, the animals were weighed, anesthetized and blood samples were collected for measurement
of blood serum concentration of the following substances: amilase, lipase, aspartate aminotransferase, alanine
aminotransferase, alcaline fosfatase, lactate dehydrogenase, gamma glutamyltransferase, urea, and uric acid.
Afterwards, the animals were sacrificed and the following organs were removed and weighted: kidney, spleen,
heart and lung. During the observation period (14 days), the animals did not present any alteration of behavior
or of physical apearance considered to be sign of toxicity. The calculated LD50 after 14 days of observation
was considered higher than 2000 mg/kg. In the animal’s group that received 2000 mg/kg, as compared to
control, there was a decrease in weight gain and, in relation to the biochemical parameters, there was an increase
of alanine-aminotransferase and alkaline phosphatase values. In this way, ours results show that the EOHc,
administered by oral route, presents low toxicity in rodents.

Additional keywords: Essential oil, Hyptis crenata; Oral toxicity; Monoterpenes aromatic plants.

RESUMO
Avaliação da Toxicidade Oral Aguda do Óleo Essencial de Hyptis crenata em Camundongos

Hyptis chrenata é uma planta aromática, bastante utilizada na medicina popular como anti-inflamatório, no
tratamento de diversas afecções. H. crenata é rica em óleo essencial composto, principalmente, de monoterpenos
e sesquiterpeno. Devido ao grande uso popular para fins medicinais terapêuticos, nosso objetivo foi avaliar a
toxicidade oral aguda do óleo essencial de H. crenata em camundongos. O teste foi realizado de acordo com o
protocol experimental para toxicidade oral aguda proposto no Guideline 425 – Acute Oral Toxicity – Up-and-
Down-Procedure (UDP), modificado O óleo essencial foi administrado por gavagem oro-gástrica, nas doses de
100, 300 e 2000 mg/kg de peso do animal. Após o período de observação os animais foram pesados, anestesiados
e o sangue coletado para análise sérica de amilase, lipase, aspartato aminotranferase, alanina aminotransferase,
fosfatase alcalina, lactato desidrogenase, gama-glutamiltransferase, ureia e ácido úrico. Foram retirados e
pesados os seguintes órgãos: fígado, baço, coração e pulmão. Durante o período de observação (14 dias), os
animais não apresentaram nenhum sinal considerado tóxico. A DL50 estimada, após 14 dias de observação foi
considerada maior que 2000 mg/kg. Apenas no grupo de animais que recebeu a dose de 2000 mg/kg, em
relação controle, foi verificado redução no ganho de peso e, em relação aos parâmetros bioquímicos, aumento de
alanina-aminotransferase e fosfatase alcalina. Desta forma, é possível concluir que o óleo essencial de H. crenata
é pouco tóxico, quando administrado por via oral em roedores.

Palavras-chave adicionais: Óleos essenciais, Hyptis crenata; Toxicidade oral; Monoterpenos; Plantas aromáticas.

126 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Alves-Soares, R.; Gomes-Vasconcelos, Y. A.; Oliveira, K. A et al..

INTRODUCTION plant popularly known as “salva-do-marajó”,
“hortelã-brava”, “salsa-do-marajó”, “malva-do-
The Hyptis crenata Pohl (ex) Benth species marajó” (Corrêa, 1984) and “hortelã-do-campo”
(Figura 1) is an herbaceous plant which grows (Berg, 1993). Tea from its leaves is popularly used
spontaneously on sandy and wet soil, near to as sudorific and tonic agent (Diniz et. al., 2013). It
streams, reaching a height at most 0.5 m tall is also used to treat gastrointestinal disturbances,
(Zoghbi et al., 2002). It occurs in several regions including gastric ulcers (Diniz et al., 2013),
of Brazil: in North Region, in the States of inflammation of the eyes and throat, constipation
Tocantins, Amazonas and Pará; in the Northeast and arthritis (Berg, 1993). Besides tea, its leaves
Region, in the States of Maranhão, Piauí and are used as insect repellent when rubbed on the
Bahia; in the Midwest Region, in the States of skin (Pott & Pott, 1997).
Mato Grosso, Goiás and Mato Grosso do Sul;
and in the Southeast Region, in the States of Hyptis crenata is rich in essential oil
Minas Gerais. Also, H. crenata usually occurs in composed mainly by monoterpenes and
Amazon rainforest, Cerrado (Brazil, 2016) and in sesquiterpenes (Scramin et al., 2000). The essential
the Pantanal (Scramin et. al, 2000). oil H. crenata (EOHc) presents antioxidant
and cytotoxic activity (Rebelo, 2006). Recent
Hyptis crenata is an aromatic medicinal studies from our research group have shown
that EOHc exerts a gastroprotective effect, due
to its significant inhibition of gastric lesions
in ethanol- and indomethacin-induced gastric
ulcer models, which may be associated with
its accelerating effect on gastric emptying and
reduction in oxidative damages (Diniz et al.,
2013). In addition, we also show that EOHc plays
a protective effect against liver injury induced
by sepsis (Lima et al., 2018) since normalized
serum of alanine transaminase (ALP), aspartate
transaminase (AST), and bilirubin to inhibition
of morphological alterations, elevation in hepatic
lipid peroxidation and reduction of glutathione
peroxidase activity induced by sepsis.

Due to the great use of H. crenata in popular
medicine, for therapeutic purposes and due to
the potential for therapeutic application of EOHc,
the goal of this work was to evaluate the acute
oral toxicity of EOHc in mice.

MATERIAL AND METHODS

Solutions and Drugs

All salts and drugs used were of analytical
purity, purchased from Sigma Chemical, Becton,
Dickinson and BD Biosciences Companies. The
kits for Transaminase Oxalecetic (TGO), Pyruvic
Transaminase (TGP), and Alkaline Fostatase
enzymatic assay and Gama GT Liquiform, Urea
and Uric Acid Liquiform colorimetric assays were
purchased from LabTest. EOHc was obtained
by hydrodistillation and analyzed using gas
chromatography–mass spectrometry (GC–MS).

Figure 1- Hyptis crenata Pohl (ex) Benth. Animals
Fonte: https://science.mnhn.fr/taxon/species/hyptis/crenata
Male Swiss mice weighing between 30 and
40 g (eight to 10 weeks of life) were used.

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 127

Evaluation of oral acute tyoxicity of essential oil of...

The animals were from Vivarium of Christus Serum enzymes
University Center (UNICHRISTUS) and kept in
the Vivarium of the State University of Ceará After the observation period, animals were
(UECE). Ethics Committee of State University of anesthetized with xylazine (10 mg/kg) and
Ceará approved all procedures (CEUA/UECE, ketamine (75 mg/kg), and blood was collected
process: 2960651/2015). for clinical chemistry analysis of hepatic and renal
toxicity biomarkers. Blood samples were collected
Study of Acute toxicity in tubes containing separator gel and left to clot
retraction. Samples were centrifuged at 1770 g
The acute oral toxicity test was performed (Laboratory centrifuge, Daiki, DTR-5000-Bl),
according to the experimental protocol Guideline during 15 min, at 4º C and the following enzymes/
425 – Acute Oral Toxicity – Up-and-Down- substances presence in serum were quantified:
Procedure (OECD, 2008), modified to include amylase, lipase, aspartate aminotransferase
previous information based on pharmacological (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline
effects of EOHc. The limit test was used, as phosphatase (AP), lactate dehydrogenase (LDH),
it estimates the limit value related to LD50 by gamma-glutamyltranspeptidase (GAMA-GT),
sequentially testing individual animals, with one urea and uric acid. For necropsy, general aspects
dose for each animal being adjusted up or down, such as, organ appearance and absolute and
depending on the previous result of the previous relative weight of the liver, kidneys, spleen, heart,
animal. Prior to the test, the animals were kept and lungs were considered.
in the laboratory, housed individually, for a
minimum of five days for acclimatization. Statistical analysis

For the assay, five mice with 10 weeks age The results are expressed as mean ± SEM (n)
were used. Initially, only one animal was used (standard error of the mean), where n represents
for oral test with EOHc. The mouse were fasted the number of animals. The graph and the
for 12, and 4 h, of food and water, respectively, statistical analysis were done with the software
before receiving a single dose of 2,000 mg/kg of Sigmaplot® (version 11.0, Systat Software). One-
EOHc diluted in 0.1% Tween 80. After gavage, way analysis of variance (ANOVA) was used to
the animals remained fasted for another 2 h. If compare the means between groups, followed by
the mouse remained alive after 48 h of EOHc Bonferroni post hoc test, a multiple comparison
administration, another animal was submitted to method. The results showing a probability of
the same EOHc protocol and dose (if not, a new, occurrence of the null hypothesis less than 5% (P
10% smaller dose, would be selected) and so on. <0.05) were considered statistically different.
The dose selected was 2,000 mg/kg because it
is recommended as limit dose for essential oils RESULTS
and constituents whose toxicological potential
is known (OECD, 2008). In this test, the LD50 is In order to evaluate the acute oral toxicity of
considered greater than the selected dose (2,000 EOHc, LD50 was calculated after 14 days of single
mg/kg) if 50 % or more animals survive (OECD, dose of EOHc oral administration, by Up-and-
2008). In addition to the limit test, it was also Down-Procedure (Guideline 425 – Acute Oral
evaluated the acute oral toxicity of doses that Toxicity). During the 14 days of observation,
possess pharmacological effect and were used the mice did not present any toxicity signal
in the other experiments (300 and 100 mg/kg, as changes in the skin, hair, eyes and mucous
respectively) (Diniz et al., 2013; Lima et al., 2018). membranes, and in the respiratory, circulatory,
After administration of EOHc, the animals were and central nervous systems, somatomotor
observed for determination of the appearance activity and pattern of behavior. There were no
of toxic signs, initially every 30 min during the deaths in the groups receiving vehicle, 100 mg/
first 4 h, then periodically every 4 h in the first kg or 300 mg/kg. However, at the dose of 2,000
24 h, and then daily for a total of 14 days. The mg/kg, one death occurred (of 5 animals used)
signs considered as toxic were: changes in the and this death occurred within the first hour after
skin, hair, eyes and mucous membranes, and in EOHc administration. Thus, the percentage of
the respiratory, circulatory, and central nervous death was 20% and the LD50 value was considered
systems, somatomotor activity and pattern of higher than 2,000 mg/kg. The percentage of
behavior. deaths occurred with the different doses of EOHc
(Table 1).

128 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Alves-Soares, R.; Gomes-Vasconcelos, Y. A.; Oliveira, K. A et al..

Table 1- The percentage of deaths in different doses
EOHc

Dose of EOHc Deaths
(mg/kg)
Number of Percentage (%)
100 Occurrence*
300
2000 -0 Weight gain (g)

-0

1 20

* data presented as absolute value (Number of occurrence)
and as percentage of occurrence of deaths observed on the

total population studied, five mice (n=5)

Regarding the weight of the animals, there was a Days
reduction in this value in the groups treated with
doses 300 and 2,000 mg/kg (Figure 2). However, Figure 2 – Temporal course of EOHc effect on body
there were no significant changes in the relative weight gain.
weight of the organs (Table 2). Meam ± SEM. *significantly different from control,
p<0.05.
As can be seen in Figure 3, in the evaluation
of biochemical parameters that may indicate absolute organs weigh and blood biochemical
hepatic and renal toxicity, it was found significant dosage) that demonstrated no major acute
increase of ALT and AP (p < 0.05, ANOVA and toxicity by oral route.
Bonferroni’s test), in relation to the control, in
the group that receiving EOHc 2,000 mg/kg. In In the group receiving the dose of 2,000
the other groups as well as in the all parameters mg/kg, EOHc caused the death of one out of five
evaluated, there was no statistically significant animals. So, since one is less than 50% of five,
difference change. the results estimated for LD50 of EOHc, given
orally, was greater than 2,000 mg/kg. This value
DISCUSSION of LD50 allows it to be classified into the category
of essential oil with low toxicity (Tisserand &
In this work the acute toxic effect of EOHc, per Balacs, 2013) and be considered as safe in relation
oral route, was investigated for the first time in to acute toxicity. It is to mention that the Up-and-
mice. The investigation of the systemic acute Down-Procedure for the determination of oral
toxicity of EOHC in mice, per oral route, was acute toxicity was the selected protocol because
assessed by Limit Test for Acute Oral Toxicity it uses a small number of animals (Botham, 2004).
(Up-and-Down-Procedure (UDP) and by several
parameters (survival, body weight, relative and

Table 2 - Effect of EOHc on relative weight of the organs: liver, kidney, spleen, heart and lungs

Organs 2000mg/kg 300mg/kg 100mg/kg Vehicle (%)
(g) (%) (g) (%) (g) (%) (g) 4,98
Liver 1,7050±0,071b 5,77 1,8070±0,1451 5,13 1,7410±0,0759 4,87 2,1290±0,0694 0,73
Right kidney 0,2607±0,002 0,88 0,2669±0,0236 0,75 0,2943±0,0250 0,82 0,3137±0,0159 0,72
Left kidney 0,2581±0,006 0,87 0,2519±0,0263 0,71 0,2724±0,0066 0,76 0,3083±0,0060 0,21
Spleen 0,1246±0,011 0,42 0,1030±0,0065 0,29 0,0897±0,0128 0,25 0,09265±0,0099 0,52
Heart 0,1882±0,012 0,63 0,1801±0,0042 0,51 0,1885±0,0099 0,52 0,2254±0,0066 1,17
Lungs 0,1822±0,004 0,61 0,4396±0,0576 1,24 0,2990±0,0766 0,83 0,5037±0,0751

aweigh, in % of body weight, bdate presented as mens ± SEM; n = 4-5 animals per group. One-way ANOVA, followed by,
Bonferroni’s post hoc te

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 129

Evaluation of oral acute tyoxicity of essential oil of...

Figure 3– EOHc effect on hepatic and renal enzymes.
Date presented as mens ± SEM; n = 4 or 5 animals per group. One-way ANOVA, followed by,

Bonferroni’s post hoc test. *, significantly different from control, p<0.05.

Doses of 100, 300 and 2,000 mg/kg values were be done with caution, since the composition of
the doses selected because they are the doses EOHc has a relatively high percentage (33.62%) of
used in our previous work with pharmacological camphor. Camphor is a monoterpene (Marmulla
effects (Diniz et al., 2013; de Almeida Pinheiro et & Harder, 2014), and is used in folk medicine
al., 2015; Lima et al., 2018). Although a death at the to treat inflammation, infections, congestion,
dose of 2,000 mg/kg occurred, the same occurred pain and irritation (Hamidpour, 2013), but it is
within the first hour after administration of considered to be orally toxic in humans when
EOHc. This very fast occurrence led us to suspect administrated between 6 and 10 g. Although
that death was due to some injury caused by the studies point to a daily, long term use, safety
orogastric administration cannula (Atcha et al., margin of 1.73 mg/kg/day in humans and
2010) and not by EOHc toxicity itself. However, rodents, signs of toxicity begin to appear at 464
other hypotheses should not be eliminated. The mg/kg (Zuccarini, 2009).
interpretation of an orogastric lesion should
In addition, in the group treated with

130 ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018.

Alves-Soares, R.; Gomes-Vasconcelos, Y. A.; Oliveira, K. A et al..

2,000 mg/kg it was verified reduction in animal contribuição ao seu conhecimento sistemático. Belém:
weight gain. Studies with other essential oil show Museu Paraense Emílio Goeldi, p. 207-250, 1993.
a reduction in weight gain attributed to one of
its constituents (Coelho-de-Souza et al., 2018). Botham, P.A. Acute systemic toxicity-prospects for
On the other hand, constituents of essential oils, tiered testing strategies. Toxicology in Vitro, 18(2),
for example, trans-anethole, main constituent 227–230, 2004 doi:10.1016/s0887-2333(03)00143-7 
of essential oil of Croton zehntneri, also leads to
weight loss by reducing food intake (Newberne Coelho-de-Souza, A.N; dos Santos, C.F.; Lopes-
et al., 1999). We hypothesize that the reduction Filho, L.N.; Holanda, F.R.; Oliveira, A.C.; Gomes-
in weight gain here demonstrated could be Vasconcelos, Y.A.; Oliveira, K.A.; Ferreira-da-Silva,
attributed predominantly to one of constituent of F.W.; Silva-Alves, K.S. & Leal-Cardoso, J.H. Essential
EOHc, camphor, due to its relatively high toxicity, oil of Croton zehntneri Pax et Hoffm offers security by
as compared to that of other constituents. oral route: perspective of therapeutic use Brazilian
Journal of Pharmacognosy, Accepted 2018, Ref: BJP-
Treatment with EOHc did not alter the 2018-141.
blood biomarkers of pancreas, hepatic and
kidney function, studied in this work, except the Corrêa, M.P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e
dose of 2000 mg/kg that increase two markers of das exóticas cultivadas. Ministério da Agricultura –
liver function, ALT and AP. Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal. RJ,
v. 6, p. 24, 1984.
It is worth mentioning that our research
group showed some pharmacological effects of De Almeida Pinheiro, Magalhães, R.M.; Torres, D.M.;
OEHc, such as antiulcerogenic activity (Diniz et Cavalcante, R.C.; Mota, F.S.X.; Coelho, E.M.A.O.;
al., 2013) and protective effect against liver injury Moreira, H.P.; Lima, G.C.; Araújo, P.C.C.; Leal-
induced by sepsis in doses lower than those Cardoso, J.H.; Coelho-De-Souza, A.N. & Diniz,
proved possible to induce toxic effect on the liver L.R.L. Gastroprotective effect of alpha-pinene and its
(Lima et al., 2018). In addition, and in coherence correlation with antiulcerogenic activity of essential
with that, it is well documented the popular use oils obtained from Hyptis species. Pharmacognosy
(Diniz et al., 2013; de Almeida Pinheiro et al., magazine, v. 11, n. 41, p. 123, 2015.
2015; Lima et al., 2018), in the form of tea, of H.
crenata as a medicine to treat various pathological Diniz, L.R.L.; Vieira, C.F.X.; dos Santos, E.C.; Lima,
conditions (Violante et al., 2012). The concentration G.C.; Aragão, K.K.V.; Vasconcelos, R.P.; Araújo,
of essential oil found in teas (in µg/L (Yang et al., P.C.C.; Vasconcelos, Y.A.G.; Oliveira, A C.; Oliveira,
2013)) is supposedly much lower than that used H.D.; Portella, V.G. & Coelho-de-Souza, A.N.
in this study. On the other hand, the composition Gastroprotective effects of the essential oil of Hyptis
of an essential oil of a plant species varies largely crenata Pohl ex Benth. on gastric ulcer models. Journal
with the soil conditions, season of plant collection of Ethnopharmacology, v. 149, n. 3, p. 694-700, oct.,
as well as other factors (Leal-Cardoso & Fonteles, 2013.
1999; Zoghbi et al., 2002; Mcneil et al., 2011; Yang
et al., 2013). Thus, our results show that EOHc, Hamidpour, R.; Hamidpour, S.; Hamidpour, M.;
similar to other essential oils, has low acute Shahlari, M. Camphor (Cinnamomum camphora), a
toxicity in rodents as shown by the high LD50 as traditional remedy with the history of treating several
well as by other toxicity indicators evaluated in diseases. International Journal of Case Reports and
this study such as survival, body weight, relative Images (IJCRI), v. 4, n. 2, p. 86-89, 2013.
and absolute organs weigh and biochemical
blood parameters that may indicate hepatic and Leal-Cardoso, J.H. & Fonteles, M.C. Pharmacological
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ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, p. 133-138, 2018.
www.aceci.com.br

Artigo Científico/ Scientific Article

Cold-Induced Contraction in Detrusor Smooth Muscle of Rat: An
Investigation on the Mechanism of Action

Átila Pereira-Gonçalves1, Welton Loiola-de-Araújo1, Emerson Cabral-Monte-Albuquerque1, Tiago
dos Santos-Nascimento1, Ana Carolina Cardoso-Teixeira1, Andrelina Noronha Coelho-de-Souza1,2,

José Henrique Leal-Cardoso1,2

1Laboratório de Eletrofisiologia e Contração Muscular, Instituto Superior de Ciências Biomédicas,
Universidade Estadual do Ceará; 2Membro Titular da Academia Cearense de Ciências

(Aceito para publicação 27/11/2018)

Author for correspondence: José Henrique Leal Cardoso – email: [email protected]

Pereira-Gonçalves, Á.; Loiola-de-Araújo, W.; Cabral-Monte-Albuquerque, E.; Santos-Nascimento, T.; Cardoso-
Teixeira, A.C.; Coelho-de-Souza, A.N. & Leal-Cardoso, J.H. Cold-induced contraction in detrusor smooth muscle
of rat: an investigation on the mechanism of action. ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, p.133-138,
2018.

ABSTRACT

Studies have shown that cold induces contraction in some types of smooth muscle. However, the mechanism
that surrounds this phenomenon is little studied. The present investigation aims to study the mechanisms of
cold-induced contraction (CIC) in detrusor smooth muscle (DSM) of bladder and, in particular, the participation
of calcium biochemistry in this mechanism. Bladder strips were used with DSM from male Wistar rats (180-
250 g). The contractile activity of DSM strips, maintained in an isolated organ bath, was measured by the
isometric recording of contraction force. DSM, at low temperatures, suffers CIC. CIC was reduced by removal
of extracellular Ca2+, presence of nifedipine (specific blocker of voltage-dependent calcium channels of type L
(VDCC-L)) or 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB; antagonist of receptors of IP3) to 3.67 ± 1.92%, 50.39 ±
10.49%, and 40.65 ± 5.71%, respectively, of the control contraction caused by cooling DSM from 37 to 16 °C. Thus,
it can be concluded that CIC is dependent: completely, on the influx of extracellular calcium, and partially, on
inflow of extracellular calcium by VDCC-L and the activation of IP3 receptors; IP3 receptors are located mainly
in the sarcoplasmic reticulum (SR). However, tapsigargine, a SERCA specific blocker, did not block CIC in
DSM (95.89 ± 6.62%). Thus, it is concluded that the CIC in DSM of rats is dependent on the extracellular and
intracellular calcium sources and it is suggested that the intracellular source is the SR.

Additional keywords: Cold-induced contraction; Detrusor smooth muscle; Urinary bladder; Calcium
extracellular; Calcium intracelullar.

RESUMO
Contração Induzida pelo Frio em Músculo Liso Detrusor de Ratos: um Estudo do Mecanismo de Ação

Estudos demonstram que o frio induz contração em alguns tipos de músculo liso. Entretanto o mecanismo que
envolve este fenômeno é pouco estudado. A presente investigação tem como objetivo estudar os mecanismos
da contração induzida pelo frio (CIF) em músculo liso detrusor (MLD) de bexiga e, em particular, a participação
do cálcio na bioquímica desse mecanismo. Foram utilizadas tiras de bexiga com MLD de ratos Wistar machos
(180-250 g). A atividade contrátil de tiras de MLD, mantidas em banho de órgãos isolados, foi medida pelo
registro isométrico de força de contração. MLD, em baixas temperaturas, sofre CIF. A CIF foi reduzida pela,
remoção do Ca2+ extracelular, presença de nifedipina (bloqueador específico de canais de cálcio dependentes
de voltagem do tipo L (CCDV-L)) ou de 2-Aminoethyl diphenylborinato (2-APB; antagonista de receptores
de IP3) para 3.67 ± 1.92 %, 50.39 ± 10.49% e 40.65 ± 5.71%, respectivamente, da contração controle causada por
resfriamento de 37 para 16 ºC. Entretanto, tapsigargina, um bloqueador específico da SERCA, não bloqueou a
CIF em MLD (95.89 ± 6.62%). Assim, pode-se concluir que a CIF é dependente, completamente, de influxo do
cálcio extracelular, e parcialmente, de influxo do cálcio extracelular pelo CCDV-L e da ativação de receptores de
IP3, que são localizados principalmente no retículo sarcoplasmático (RS). Dessa forma, conclui-se que a CIF em
MLD de ratos é dependente das fontes do cálcio extracelular e intracelular e sugere-se que a fonte intracelular
seja o RS.

Palavras-chave adicionais: Contração induzida pelo frio; Músculo liso detrusor; Bexiga; Cálcio extracelular;
Cálcio intracelular.

ANAIS da Academia Cearense de Ciências, v. 2, n. 2, Ago – Dez, 2018. 133

Cold-Induced contraction in detrusor smooth muscle...

INTRODUCTION of smooth muscle can be blocked by nifedipine,
specific blocker of L-type voltage dependent Ca2+
The urinary bladder is a compliant organ that has channels (VDCC-L) (Bean, 1984; Liao et al., 2007).
two main functions: urine storage and emptying. Smooth muscle contraction, however, depends
These two functions can be modulated by on the functioning of a complex biochemical
temperature (Combrisson et al., 2007). Many types cascade of intracellular events, in which the
of smooth muscle respond to rapid lowering, activation of L-type Ca2+ channel conductance
relative to the body temperature of homeothermic is only the initial stage (Andersson & Arner,
mammals (approximately 37.0 °C), of many °C in 2004). Among the intracellular events, the role
their temperature, with a contraction called rapid of the sarcoplasmic reticulum (SR) in the control
cooling contraction or cold-induced contraction of free Ca2+ concentration in the intracellular
(CIC) (Mustafa & Thulesius, 1998; Mustafa et environment (Andersson & Arner, 2004) stands
al., 1999; Mustafa & Oriowo, 2005). The bladder out.
is an organ whose detrusor smooth muscle has
CIC (Mustafa & Thulesius, 1998; Combrisson Given the richness of possibilities of
et al., 2007). The CIC of a given type of smooth physiological events that can participate in
muscle has a variable sensitivity to various drugs the CIC in smooth muscle and the absence of
and endogenous substances (Park et al., 1984; information regarding the participation of the
Combrisson et al., 2007). Thus, although there are intracellular stages of the contraction mechanism,
studies available in the literature that determine in the present study we aimed to investigate the
the effects of low temperatures on the contractile SR participation in the CIC causation.
reactivity of smooth muscles, only few studies
proposed to study the mechanism of action of METHODOLOGY
cold-induced contraction in detrusor smooth
muscle (Atalik et al., 2010). Solutions and Drugs

It is believed that CIC mechanisms Muscle reactivity experiments were performed
participate in the anomalous behaviour of using Krebs Henseleit (KH) nutrient solution
hyperreactive bladders (Atalik et al., 2010). In of the following composition (mM): NaCl, 118;
the clinic, an ice-water test is used to evaluate KCl, 4.7; NaHCO3, 25.0; CaCl2, 2.5; KH2PO4, 1.2;
neurogenic continence disorders as part of an MgSO4-7H2O, 1.2; and glucose, 11.0; pH, 7.40.
urodynamic examination in the differential For experiments that required the absence of
diagnosis of hyperactive bladder subtypes. If the extracellular calcium (calcium free KH), CaCl2
result of this test is positive, bladder contraction was removed and EGTA (2 mM) was added. The
is followed by urination caused by damage to KH solution was oxygenated with a carbogenic
the upper motor neuron (Bors, 1957; Hellstrom et mixture (95% O2 - 5% CO2) and pH adjusted to
al., 1991), which shows that neural mechanisms 7.40 with HCl / NaCl. All reagents used in this
participate in pathological changes in certain study were of analytical purity and purchased
types of hyperactive bladders. However, the from Sigma Chemical Corporation (St. Louis,
hypothesis that other mechanisms exist for Missouri, USA) or VETEC (Rio de Janeiro,
hyperactive bladders is not ruled out. It is Brazil). 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB)
documented that CIC in smooth muscle, which and thapsigargin were diluted in DMSO and
is related to overactive bladder, is not blocked by nifedipine was diluted in ethyl alcohol, both
tetrodotoxin, which has led to the suggestion that diluents with a final maximum concentration of
it is both mainly of myogenic origin (Mustafa & 0.002%.
Thulesius, 1998).
Animals and tissue preparation
CIC occurs and has been studied in some
types of smooth muscle, such as: tracheal and Wistar rats (Ratus novergicus) (180-250 g) were
bronchial smooth muscle (Mustafa et al., 1999), kept in a vivarium at the State University of Ceará
urinary bladder (Mustafa & Thulesius, 1998) (UECE) under controlled humidity (50-60%) and
and gastrointestinal muscle (Mustafa & Oriowo, temperature (23-25 ºC), with a 12/12 light /dark
2005). These studies suggest that CIC do not cycle and free access to food and water. Animals
depend on neurogenic mediation, as they were were cared according to the Guide to the Care
not blocked by tetrodotoxin. Additionally, studies and Use of Laboratory Animals, 8th edition,
have shown that these contractions in some types published by the US National Institutes Health
in 2011 (https: //www.nap.edu/read/12910/
chapter/1). All experimental procedures were

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Pereira-Gonçalves, A.; Araújo, W.L.; Cabral-Monte-Albuquerque, E. et al.

approved by the Committee for the Use of Figure 1 - Induction of cold-induced contraction
Animals of the UECE (nº 12235246-7). by the reduction of temperature in the smooth
muscle detrusor of the rat bladder. Amplitude of
The animals were sacrificed by means of contractions is normalized by the magnitude of the
CO2 inhalation and after that the urinary bladder contraction promoted by the increase, at 37 °C, of the
was removed and placed in KH solution. The K+ concentration ([K+]) of the extracellular medium
bladder was cut longitudinally into four equal from 4.7 ([K+] 4.7 mM) to 80.0 mM ([K+] 80.0 mM),
strips. Each strip was mounted in an isolated whose amplitude is considered 100%. 16 °C and 24
organ chamber with a capacity of 5.0 mL. The °C, amplitude of contractions caused by the lowering
bladder strip preparations were connected to of the temperature of the detrusor muscle, [K+]
an isometric force transducer (Grass, model maintained at 4.7 mM, from 37 °C to 16 °C, 24 °C and
F03, Quincy, Mass., USA) by means of a cotton 30 ºC, respectively. Mean ± SEM, n = 15. *, significantly
thread. The power transducer was connected to different from the control ([K+] 80.0); p < 0.05, ANOVA
a data acquisition system (PM-1000; CWE Inc., and Holm-Sidak post hoc test.
Akron, OH, USA). After assembly, the biological
preparation was stretched under a basal tension induced by the increase of the extracellular
of 1 gF for a stabilization period of 60 min. concentration of potassium (K+) ions from 4.7
Thereafter, tissue viability was verified by two mM to 80 mM (Figure 1) at 37 °C. After CIC,
consecutive K+-induced contractions ([K+] = 60 when the bath temperature returned to 37 °C, the
mM). tonus returned rapidly to baseline.

Protocol for the CIC This temperature-dependent contraction
of the detrusor muscle is also dependent on the
The temperature of the organ bath was reduced presence of Ca2+ in the extracellular medium at
through an organ bath cold circulator (Q214M; concentrations close to normal (2.5 mM) (Figure
Quimis, São Paulo, Brazil) which had been 1). Reduction of extracellular [Ca2+] to values < 10-8
adjusted to the appropriate temperature. It M, by means of incubating the muscle in nutrient
took approximately 3 minutes to reach 90% the solution with the presence of 2.0 mM EGTA
desired final temperature, from 37 °C to 16, 24 and no addition of Ca2+, blocked the CIC almost
or 30 °C. We used 16 °C as the standard cooling completely (Figure 2 and Table 1). Exposure of
temperature to study the effects of different drugs the preparation, during 10 min to nifedipine (10
used throughout this study. After the drugs were μM), a specific blocker of the VDCC-L (Bean,
added, the cooling (16 °C) was repeated after 10 1984; Liao et al., 2007), inhibited the CIC partially
min of incubation of the preparation with the (Figure 2 and Table 1).
drug.
Tapsigargine (1 μM), a Ca2+-ATPase pump
Statistical analysis inhibitor of the SR (Davidson & Varhol, 1995;
Treiman et al., 1998) did not cause any significant
Data were expressed as mean ± standard error changes in the cold-induced responses. CIC was
of the mean (E.P.M), where (n) represents the also partially inhibited by 2-APB (50 μM), an
number of experiments. It was considered antagonist of IP3 receptors in the sarcoplasmic
statistically significant when p <0.05. One- reticulum (Maruyama et al., 1997) (Figure 2 and
way analysis of variance (ANOVA) was used, table 1).
followed by the Holm-Sidak post-hoc test.

RESULTS

Rapid lowering (seconds to few minutes) of
temperature of the bladder segment (detrusor
muscle) by replacing the nutrient solution (KH)
in which it is immersed at 37.0 ºC per KH solution
below approximately 24 ºC promotes a CIC.
Reducing the temperature from 37 °C to 30 °C
did not promote contraction (Figure 1).

When this temperature reduction extended
to 24 °C and 16 °C, they promoted tonic
contractions that represented 16.42 ± 5.60% and
75.75 ± 9.71%, respectively, of the contraction

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