วิจัย

การพัฒนากระบวนการสกัดและแยกสารกลุ่มฟินอลิกจากเปลือกขนุน เพื่อใช้เป็นส่วนผสมสำคัญในผลิตภัณฑ์กลุ่มเวชสำอาง โดย นายภูธเนศ บุญมี 6410941214 นายมูยาอิดดีน ห่าหรับ 6410941215 นางสาวกุลธิดา คชรักษ์ 6410941203 นางสาวนิรมล รักษ์เดชา 6410941210 นางสาวอริสรา จักรา 6410941223 เสนอต่อสาขาวิทยาศาสตร์ทั่วไป คณะครุศาสตร์ มหาวิทยาลัยราชภัฏภูเก็ต เพื่อเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตร ครุศาสตร์บัณฑิต สาขาวิทยาสาสตร์ทั่วไป ปีการศึกษา 2565

บทที่ 1 บทนำ 1.1 ความสำคัญและที่มาของปัญหา ในปัจจุบันผลไม้ไทยเป็นสินค้าที่สำคัญในด้านเศรษฐกิจที่ส่งออกไปหลากหลายทั่วโลกและเป็นสินค้าที่ สามารถสร้างมูลค่าและนำเงินเข้าภายในประเทศไทยได้อย่างมหาศาล ขนุนเป็นไม้ผลทางเศรษฐกิจที่สำคัญชนิดหนึ่ง ของประเทศไทย จากสถิติของกรมการส่งเสริมทางการเกษตรในปี 2559 พบว่าขนุนมีผลผลิตรวมทั้งประเทศปริมาณ 69,560 ตันราคาขายต่อกิโลกรัม 13.10 บาท คิดเป็นมูลค่า 911,236,000 บาท โดยจังหวัดประจวบคีรีขันธ์เป็นจังหวัด ที่มีเนื้อที่ปลูกขนุนมากที่สุดในประเทศไทย คือ 10,600 ไร่ (Department of Agricultural Extension, 2559) ซึ่งจาก รายงานสถาณการณ์ผลิตขนุนของจังหวัดประจวบคีรีขันธ์ ระหว่างเดือนมกราคมถึงธันวาคม 2560 พบว่าขนุนมีปริมาณ ผลผลิตรวม 20,572.80 ตัน โดยผลผลิตส่วนใหญ่ได้จากอำเภอสามร้อยยอด มากที่สุดคือ 13,045.60 ตัน คิดเป็นร้อย ละ 63.41 ของผลผลิตทั้งจังหวัด ส่วนใหญ่ชาวบ้านจะปลูกเพื่อส่งโรงงาน โดยจะมีแผงรับซื้อแล้วนำไปปอกเอาเฉพาะ เนื้อขนุนส่งโรงงานมีจำนวนขนุนที่ปอกส่งโรงงานเฉลี่ยวันละ 2.7-3.6 ตัน ซึ่งจะได้เนื้อขนุนประมาณ 600-800 กิโลกรัม เมล็ดขนุน 400-540 กิโลกรัม และนอกจากนี้ยังมีเปลือกขนุนอีกมากมายมหาศาลที่ไม่ได้นำไปใช้ทำสินค้าส่งออก หาก ปล่อยทิ้งไว้ก็จะกลายเป็นขยะที่ไม่สามารถนำไปใช้ประโยชน์ในด้านอื่นๆได้ (Waewsripong, 2519) “ขนุน” ชื่อสามัญว่า jackfruit เป็นพืชในวงศ์ Moraceae และมีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Artocarpus heterophyllus Lam จากบทความข้างต้น ขนุน มีส่วนประกอบต่างๆได้ถูกนำไปแปรรูปเป็นผลิตภัณฑ์ที่สร้างมูลค่า เช่น ขนุนอบแห้ง (ผลิตมาจากเนื้อขนุน) เม็ดขนุนอบเกลือ (ผลิตจากเมล็ดขนุน) ใบขนุนทอดกรอบ (ผลิตมาจากใบขนุน) และ เฟอร์นิเจอร์ไม้ขนุน (ผลิตจากต้นขนุน) แต่ยังมีส่วนนึงที่ยังไม่ได้มีการวิจัยหรือนำมาใช้ประโยชน์ ก็คือ “เปลือก ขนุน” ซึ่งการนำเปลือกขนุนมาใช้ประโยชน์ในครั้งนี้ ไม่กระทบต่อการเจริญเติบโตของพืชและผลผลิต จากการศึกษา ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับสารสกัดธรรมชาติที่สามารถนำมาทดแทนสารเคมีในกลุ่มของด้านเวชสำอางค์ได้ พบว่า ขนุน มี แนวโน้มที่จะมีฤทธิ์ในการต้านเอนไซม์ Tyrosinase และมีสารต้านอนุมูลอิสระสูงดังตัวอย่างวารสารทางวิชาการที่ได้ อ้างถึงพบว่ามีสารกลุ่มฟีนอลิคโดยเฉพาะอย่างยิ่งกลุ่มฟลาโวนอยด์หลายลักษณะทางคณะผู้จัดทำได้เล็งเห็นความสำคัญ ของเปลือกขนุนจึงได้มาสกัดเพื่อหาสารประกอบที่มีคุณประโยชน์ที่สามารถนำไปผลิตเป็นผลิตภัณฑ์ที่สร้างมูลค่าเพิ่มได้ ดังนั้นในการวิจัยครั้งนี้ผู้วิจัยจึงมีความสนใจในการทำการสกัดสารวิเคราะห์หาปริมาณในสารกลุ่มฟิ นอลิกที่ได้จากเปลือกขนุน ข้อมูลในการทำวิจัยในครั้งนี้สามารถนำไปพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ที่สามารถนำไปใช้ในด้านเวช สำอางค์และยังเป็นการเพิ่มมูลค่าให้กับสิ่งของที่เหลือใช้และสามารถนำไปพัฒนาในด้านอื่นๆต่อไปได้ในอนาคต

1.2 วัตถุประสงค์การวิจัย 1.เพื่อพัฒนากระบวนการสกัดและแยกสารกลุ่มฟินอลิกให้ได้ปริมาณที่เหมาะสมต่อการนำมาใช้ประโยชน์ 2.เพื่อศึกษาปริมาณสารกลุ่มฟินอลิกที่แยกได้จากแต่ละขั้นตอน 1.3 สมมติฐานการวิจัย 1.กระบวนการสกัดและแยกสารกลุ่มฟินอลิกให้ได้ปริมาณที่เหมาะสม 2.การแยกสารกลุ่มฟินอลิกแต่ละขั้นตอนการสกัดและแยกจะได้ปริมาณสารที่แตกต่างกัน 1.4 ขอบเขตการวิจัย ตัวแปรที่ทำการวิจัย ตัวแปรต้น : เปลือกขนุน Artocarpus heterophyllus Lam ตัวแปรตาม : สารสกัดและปริมาตรสารประกอบฟินอลิกที่ได้จากเปลือกขนุน,กระบวนการสลัดและการแยก ตัวแปรควบคุม : น้ำหนักเปลือกขนุนแห้ง,ตัวทำละลาย,ตัวดูดซับ ระยะเวลาในการวิจัย : เดือนธันวาคม พ.ศ.2565 – เดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ.2566 ขอบเขตพื้นที่หรือสถานที่ ศูนย์วิทยาศาสตร์และวิทยาศาสตร์ประยุกต์ (ตึก10) มหาวิทยาลัยราชภัฏภูเก็ต 21 หมู่ 6 ซอยประวัติ ถนน เทพกษัตรี ตำบลรัษฎา อำเภอเมือง จังหวัดภูเก็ต 83000 โทรศัพท์ 076-523094 ละติจูด : 7.908686,98.386032 1.5 นิยามศัพท์เฉพาะ สารฟีนอลิก (phenolic) ประกอบด้วย กรดฟีนอลิก(Phenolic acids) ฟลาโวนอยด์(Flavonoids) แทนนิน (Tannins) สติลบีนส์(Stilbenes) ลิกซ์แนน(Lignans) ซึ่งจัดเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant) ชนิดหนึ่งที่ สามารถพบได้ตามธรรมชาติในพืชหลากหลายชนิด โดยการทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระนั้นอาจเป็นได้หลายแบบ สารต้านอนุมูลอิสระ(Antioxidant) คือ สารที่สามารถยับยั้ง หรือชะลอการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Oxidation) (ปฏิกิริยาออกซิเดชัน คือ ปฏิกิริยาที่อะตอมหรือโมเลกุลเกิดการสูญเสียหรือให้อิเล็กตรอนกับโมเลกุลหรือ อะตอมอื่นเพื่อสร้างความเสถียรให้กับโมเลกุลร่างกายของมนุษย์หรือสิ่งมีชีวิตจะมีการปฏิกิริยานี้ตลอดเวลา)

เวชสำอาง (Cosmeceuticals) คือ ผลิตภัณฑ์ดูแลผิวประเภทหนึ่ง ที่มีคุณสมบัติเช่นเดียวกับเครื่องสำอาง แต่ รวมเอาคุณสมบัติและความสามารถในการรักษาอาการผิดปกติต่างๆ เช่น สิว, ริ้วรอย, จุดด่างดำ, ฝ้า-กระ ให้กับผิว ทำ ให้มีฤทธิ์ในการรักษาและทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ผิวหนังได้ โดยไม่จัดว่าเวชสำอางเป็นยา 1.6 ประโยชน์ที่คาดว่าได้รับ 1.สามารถนำสารสกัดที่ได้จากเปลือกขนุนไปต่อยอดเพื่อเพิ่มมูลค่าให้กับเปลือกขนุนได้ 2.ได้รู้วิธีการสกัดและแยกสาร กลุ่มฟีนอลิกที่ให้ปริมาณสูงและต้นทุนต่ำ

บทที่ 2 เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง งานวิจัยเรื่อง การพัฒนากระบวนการสกัดและแยกสารกลุ่มฟลาโวนอยด์จากเปลือกขนุนเพื่อใช้เป็นส่วนผสม สำคัญในผลิตภัณฑ์กลุ่มเวชสำอางค์ ผู้วิจัยทำการศึกษาเอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง ดังนี้ 2.1 ขนุน ขนุน (ชื่อวิทยาศาสตร์: Artocarpus heterophyllus หรือ A. heterophylla) เป็นไม้ผลยืนต้นใน วงศ์Moraceae มีถิ่นกำเนิดในเอเชียใต้และแพร่หลายมายังเอเชียตะวันออกเฉียงใต้และได้รับความนิยมมากใน คาบสมุทรมลายูไม่ปรากฏว่าเข้ามายังประเทศไทยเมื่อใด แต่มีกล่าวถึงในเอกสารโบราณตั้งแต่สมัยสุโขทัยและกรุงศรี อยุธยา ชื่อสามัญของขนุนในภาษาอังกฤษคือ jackfruit มาจากภาษาโปรตุเกส jaka ที่เพี้ยนมาจากภาษา มลายูchakka อนุกรมวิธาน Domain : Eukarya Kingdom : Plantae Phylum : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Order : Rosales Family : Moraceae Genus : Artocarpus Species : A. heterophyllus ขนุนเป็นไม้ยืนต้นขนาดใหญ่ อยู่ในวงศ์เดียวกับสาเก สูง 15-30 เมตร ลำต้นและกิ่งเมื่อมีบาดแผลจะมีน้ำยางสี ขาวข้นคล้ายน้ำนมไหล ใบเดี่ยว เรียงสลับ แผ่นใบรูปรี ขนาดกว้าง 5-8 เซนติเมตร ยาว 10-15 เซนติเมตร ปลายใบทู่ถึง แหลม โคนใบมน ผิวในด้านบนสีเขียวเข้มเป็นมัน เนื้อใบหนา ดอกเป็นช่อแบบช่อเชิงลดแยกเพศอยู่รวมกัน เป็นช่อสี เขียว อัดกันแน่น แยกเพศ แต่อยู่บนต้นเดียวกัน ช่อดอกตัวผู้ออกตามปลายกิ่งหรือซอกใบ เป็นแท่งยาว ช่อดอกตัวเมีย เป็นแท่งกลมยาว ออกตามลำต้นหรือกิ่งใหญ่ เมื่อติดผล ดอกทั้งช่อจะเจริญร่วมกันเป็นผลรวมมีขนาดใหญ่ โดย 1 ดอก

กลายเป็น 1 ยวง ในผล ผลดิบเปลือกสีเขียว หนามทู่ ถ้ากรีดเปลือกจะมียางเหนียว เมื่อแก่ เปลือกสีน้ำตาลอ่อนอม เหลือง หนามจะป้านขึ้น ภายในผลมีซังขนุนหุ้มยวงสีเหลืองไว้ เมล็ดอยู่ในยวง ขนุนมีหลายพันธุ์ สีของเนื้อจะต่างไปตามพันธุ์ บางพันธุ์ซังมีรสหวานรับประทานได้ บางพันธุ์ซังรสจืดไม่ใช้ รับประทาน พันธุ์ขนุนที่ปลูกในประเทศไทย ได้แก่ พันธุ์นิยมปลูกเพื่อส่งออก • พันธุ์ทองประเสริฐ • พันธุ์ทวายปีเดียว การใช้ประโยชน์ ขนุนเป็นผลไม้ที่นิยมรับประทานในเอเชียใต้และเอเชียตะวันออกเฉียงใต้เนื้อขนุนสุกใช้ รับประทานเป็นผลไม้ และใช้ทำขนมได้หลายชนิด 2.2 สารกลุ่มฟีนอลิก (phenolic compounds) สารประกอบฟีโนลิก (phenolic compounds) หรือสารประกอบฟีนอล คือสารที่พบตามธรรมชาติในพืช หลายชนิด เช่น ผัก ผลไม้เครื่องเทศ สมุนไพร ถั่วเมล็ดแห้ง เมล็ดธัญพืช ซึ่งถูกสร้างขึ้นเพื่อประโยชน์ในการเจริญเติบโต สารประกอบฟีนอล มีโภชนเภสัช ซึ่งสรรพคุณที่ดีต่อสุขภาพคือ มีสมบัติเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant) สามารถละลายได้ในน้ำ ในปัจจุบันนักวิจัยจากทั่วโลกที่ให้ความสนใจสารประกอบฟีนอลิกกันอย่างต่อเนื่อง เพราะสารประกอบฟีนอลิก เป็นกลุ่มสารที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพค่อนข้างหลากหลาย ซึ่งได้มีการรายงานถึงผลประโยชน์ในเชิงสุขภาพอย่างมากมายใน ทุกวันนี้ จากผลการวิจัยที่ผ่านมาพบว่าสารกลุ่มฟีนอลิกมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ รวมถึงเป็นตัวช่วยลดปริมาณของ โมเลกุลชนิดเรดิคัลอิสระ ทั้งนี้จำนวนและตำแหน่งของหมู่ไฮดรอกซี่ในโมเลกุลของสารกลุ่มฟีนอลลิกจะเป็นตัวแปร สำคัญที่มีส่วนช่วยหยุดกลไกการเกิดเรดิคัลอิสระเหล่านี้ได้ และด้วยการศึกษาวิจัยเกี่ยวกับกระบวนการเนื่องจากการ เกิดภาวะเครียดของออกซิเดนซ์และไนตริกออกไซด์ในเซลล์ก่อให้เกิดเรดิคัลอิสระพบว่ากระบวนการเกิดออกซิเดชั้นใน เซลล์สามารถก่อให้เกิดสารกลุ่มเรดิคัลอสระได้ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อเซลล์เป็นสาเหตุของโรคร้ายแรงหลายชนิด เช่น โรคมะเร็ง โรคหัวใจ โรคหลอดเลือด โรคที่เกี่ยวกับระบบประสาท โรคความดันและโรคเบาหวาน เป็นต้น ฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นๆ ของสารกลุ่มฟีนอลิก นอกจากมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระแล้ว ยังคงพบว่ามีความสำคัญเป็น อย่างมากต่อการบำรุงและซ่อมแซมส่วนที่สึกหรอของอวัยวะต่างๆ ในร่างกายได้เป็นอย่างดีโดยมีส่วนเกี่ยวข้องต่อระบบ ต่างๆ เช่น การยับยั้งแบคทีเรียและการยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง การต้านการอักเสบ ยังสามารถกระตุ้น การค้นหาและพัฒนาสร้างสรรค์ผลิตภัณฑ์ทางด้านโภชนาการใหม่ๆ ขึ้นตลอดเวลา อย่างไรก็ตามแม้ว่าจากการ ศึกษาวิจัยในห้องปฏิบัติการจะพบว่าสารกลุ่มฟีนอลิกจะมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ดี แต่ข้อมูลในการทดลองกับสิ่งมีชีวิต โดยตรงยังคงมีการศึกษาข้อมูลและผลกระทบยังไม่เป็นที่แพร่หลายมากนัก จึงมีหลายสิ่งที่จะต้องทำการศึกษาเพื่อ นำมาใช้ประโยชน์อย่างปลอดภัยต่อไป ที่สำคัญไม่น้อยไปกว่าการนำมาใช้ประโยชน์ทางเภสัชวิทยาในอุตสาหกรรมการ

พัฒนาอาหารเสริมสุขภาพ ฤทธิ์ทางชีวภาพและข้อมูลจากการวิจัยของสารกลุ่มฟีนอลิกยังเป็นที่สนใจและมีการนำไปใช้ ประโยชน์ทางอุตสาหกรรมด้านอื่นๆ ได้แก่ด้านเครื่องสำอาง ด้านบรรจุภัณฑ์และด้านสิ่งแวดล้อม ทางด้านเคมีผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ (Natural Products Chemistry) พบว่าสารกลุ่มฟีนอลิกเป็นสาร เมตาบอไลต์ทุติยภูมิที่พบมากที่สุดในธรรมชาติโดยเฉพาะอย่างยิ่งในพืช สารกลุ่มดังกล่าวมักแสดงลักษณะเด่นคือ สี และรส ส่วนใหญ่มักมีความสามารถในการป้องกันรังสียูวี ยับยั้งจุลินทรีย์และแมลงต่างๆ ชีวะสังเคราะห์ของสารกลุ่มฟี นอลลิคส่วนมากมีวิถีชีวะสังเคราะห์มาจากสองส่วน คือ ส่วนที่เกิดจาก shikimic acid pathway และส่วนที่เกิดจาก pyruvic acid pathway โดยมีตัวกลางสำคัญหรือ precursor คือ p-coumaroyl CoA นำไปสู่สารอนุพันธ์ต่างๆ ที่ แตกต่างกันหลากหลายลักษณะ ดังแสดงในภาพที่ 1 จากลักษณะดังกล่าวจึงเป็นได้อย่างยิ่งที่จะมีสารประกอบทั้งที่เคย มีการรายงานโครงสร้างรวมไปถึงคุณสมบัติของฤทธิ์ทางชีวภาพดังกล่าวตลอดจนอาจพบสารชนิดใหม่และฤทธิ์ทาง ชีวภาพอื่นๆ ที่น่าสนใจเพียงพอต่อการนำไปต่อยอดเป็นผลิตภัณฑ์ที่มีประโยชน์ใช้พัฒนาชีวิตสังคมตามแนวเศรษฐกิจ พอเพียงได้ สารประกอบฟีโนลิก (phenolic compounds) แบ่งได้ดังนี้ รูปที่ 1 แสดงตัวอย่างชนิดของสารกลุ่มต่างๆ ซึ่งเป็นสารกลุ่มฟีนอลิก

2.2.1 กรดฟีนอลิก (Phenolic acids) สารกลุ่มกรดฟีนอลิก เป็นกลุ่มพื้นฐานที่พบมากในธรรมชาติประกอบด้วยหมู่คาร์บอกซิลิคในวงอะโรมาติก เพียงหนึ่งวง ซึ่งมี 2 กลุ่มด้วยกันคือ 1. กลุ่มกรดไฮดรอกซีเบนโซอิก (hydroxybenzoic acids, C6-C1) ซึ่งเกิดจากกรดคอริสมิกที่ได้มาจากวิถีชีว สังเคราะห์ของกรดชิคิมิก 2. กลุ่มกรดไฮดรอกซีซินนามิก (hydroxycinnamic acids, C6-C3) เกิดจากกรดซินนามิกผ่านวิถีชีวสังเคราะห์ ของกรดชิคิมิกเช่นเดียวกัน นอกจากนี้สารกลุ่มกรดฟีนอลิคในวิถีชีวสังเคราะห์ของกรดชิคิมิกกลุ่มกรดไฮดรอกซี ซินนามิก (hydroxycinnamic acids, C6-C3) ยังมีสารจำพวกกรดคาเฟอิก (caffeic acid) และกรดฟูรูลิก ที่พบมาก และเป็นที่รู้จักดี อีกทั้งมีฤทธิ์ทางชีวภาพอย่างมาก 2.2.2 ฟลาโวนอยด์(Flavonoids) ฟลาโวนอยด์เป็นสารกลุ่มใหญ่และมีมากที่สุดในบรรดาสารกลุ่มฟีนอลิค พบว่ามีมากกว่า 8,000 ชนิดที่มีการ รายงานทางวิชาการแล้ว โครงสร้างหลักประกอบไปด้วยคาร์บอนทั้งสิ้น 15 คาร์บอน (C6-C3-C6) กลุ่มสารฟลาวา นอยด์ได้เป็น - ฟลาโวนอล (flavonol) คือ กลุ่มสารชนิดหนึ่งในกลุ่มฟลาโวนอยด์โดยมีลักษณะสำคัญคือระหว่างคาร์บอนตำแหน่งที่ 2 และ 3 เป็น พันธะคู่ ที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 2 ต่ออยู่กับวงอะโรมาติก วง B ที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 3 มีหมู่ไฮดรอกซิล ตำแหน่งที่ 4 เป็นหมู่คาร์บอนิล ฟลาโวนอลที่พบในพืชพบมากในพืชสมุนไพรหลายชนิดและมีฤทธิ์ทางชีวภาพหลากหลาย รูปแบบ

- ฟลาโวน (flavone) คือ กลุ่มสารที่มีลักษณะคล้ายกับสารกลุ่มฟลาโวนอลยกเว้นที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 3 จะไม่มีหมู่ไฮดรอกซิล ฟลา โวนมักพบในเปลือกไม้ แก่นไม้ ผล และราก ให้สีเหลืองอ่อนถึงแก่ - ฟลาโวโนน (flavonone) คือ สารกลุ่มหนึ่งในหลุ่มสารฟลาโวนอยด์มีลักษณะแตกต่างจากฟลาโวนและฟลาโวนอลคือ ที่คาร์บอน ตำแหน่งที่ 2 กับ 3 ไม่เป็นพันธะคู่ แต่ที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 4 ยังคงมีหมู่ไฮดรอกซิลฟลาโวโนนจะให้สีเหลืองอ่อน หรือไม่มีสี พบได้ทั้งในพืชเลี้ยงเดียว และใบเลี้ยงคู่ เช่น hesperidin และ naringin จากเปลือกส้ม (aglycone: hesperetin และ naringenin) มี รสขมใช้ในอุตสาหกรรม และเภสัชกรรม - ฟลาวานอล (flavanol) คือ สารกลุ่มหนึ่งที่พบจำนวนมากของฟลาโวนอยด์กลุ่มนี้นอกจากไม่มีพันธะคู่ที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 2 กับ 3 แล้ว ยังมีลักษณะเฉพาะสำคัญคือมีหมู่ไฮดรอกซิลที่คาร์บอนตำแหน่ง 3 และในตำแหน่งที่ 4

- ไอโซฟลาโวน (isoflavone) คือ กลุ่มสารที่มีลักษณะเฉพาะเป็นอย่างมากเนื่องจากการเกิดการแทนที่บนคาร์บอนตำแหน่งที่ 3 ด้วยอะโร มาติก วง B ลักษณะโดยรวมจึงดูคล้ายกับสารในกลุ่มฟลาโวน ซึ่งเกิดการแทนที่บนคาร์บอนตำแหน่งที่ 2 ด้วยอะโร มาติก วง B โดยสารในกลุ่มดังกล่าวพบว่ามีการรายงานมากว่า 2,000 ชนิดจนถึงปัจจุบัน - ฟลาวาโนนอล (flavanonol) คือ สารกลุ่มฟลาโวนอยด์อีกกลุ่มที่มีลักษณะเช่นเดียวกันกับสารกลุ่มฟลาโวน คือ ไม่มีพันธะคู่ที่คาร์บอน ตำแหน่งที่ 2 กับที่ 3 โดยที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 3 มีหมู่ไฮดรอกซิล ส่วนใหญ่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ บางตัวมีศักยภาพ เพียงพอในการใช้เป็นยารักษาโรค

- แอนโทไซยานิน คือ สารประกอบที่ได้มาจากฟลาวานอลที่มีหมู่ไฮดรอกซิลอยู่ที่ตำแหน่ง 3 โดยมักอยู่ในรูปออกโซเนียมไอออน ทำให้เกิดพันธะคู่ระหว่างอะตอมออซิเจนกับคาร์บอนตำแหน่งที่ 2 และคาร์บอนตำแหน่งที่ 3 เป็นพันธะคู่กับคาร์บอน ตำแหน่งที่ 4 สารในกลุ่มนี้นอกเหนือจากเป็นประโยชน์ต่อสุขภาพที่แล้ว แอนโธไซยานินยังถูกนำมาใช้เป็นสีธรรมชาติ โดยเฉพาะในอุตสาหกรรมอาหาร 2.2.3 แทนนิน (Tannins) แทนนิน (tannin) หรือ กรดแทนนิค (tannic acid) ที่มีโมเลกุลใหญ่ หนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 500 ถึง 3,000 และโครงสร้างซับซ้อน มีสูตรโมเลกุล (C75H52O46) และแทนนินเป็นสารให้รสฝาด (astringency) และรสขม (bitter) พบได้ในพืชหลายชนิด เช่น ใบชา ใบฝรั่ง ใบพลู ใบชุมเห็ด ผลไม้ดิบ เช่น กล้วยดิบ ในเปลือกและ เมล็ดของผลไม้ เช่น เปลือกมังคุด องุ่น เม็ดในของมะขาม เปลือกมะพร้าวอ่อน และพบในไวน์แดง แทนนิน มี ส่วนสำคัญ เป็นสารตั้งต้นในปฏิกิริยาการเกิดสีน้ำตาลที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ (enzymetic browning reaction) ของผลไม้มีฤทธิ์เป็นสารกันเสีย (preservative) ยับยังการเจริญของจุลินทรีย์สารแทนนินที่พบในชา ที่สำคัญ คือ catechin ชาดำ (black tea) และชาอู่หลง (oolong tea) จะมีปริมาณแทนนินสูงกว่า ชาเขียว (green tea)

- Condensed tannins เป็นสารประกอบที่มีความ ซับซ้อน มีสภาพความคงตัวสูง สลายตัวด้วยน้ำยากกว่าชนิดไฮโดรไลเซเบอแทนนิน พบได้ใน ส่วนเปลือกต้นและแก่นไม้เป็นส่วนใหญ่ เช่น พืชกลุ่มอบเชย ชินโคนา หลิว โอ๊ค โกโก้ และใบ ชา - Hydrolyzable tannins เป็นชนิดที่ ประกอบด้วยโครงสร้างของสาร 2 กลุ่ม คือ ส่วนที่เป็นน้ำตาล ได้แก่ น้ำตาลกลูโคส และ สารประกอบโพลีออล ทั้งนี้องค์ประกอบส่วนใหญ่จะพบส่วนกรดฟีนอลมากกว่าน้ำตาล พบมาก ในส่วนใบ ฝัก และส่วนที่ปูดออกมาจากปกติเมื่อต้นไม้ได้รับอันตราย แบ่งออกเป็นชนิดย่อยได้ 2 ชนิด คือ แกลโลแทนนิน (Gallotannins) เป็นสารที่ประกอบด้วยกรดแกลลิกเชื่อมต่อ กับน้ำตาลด้วยพันธะเอส เทอร์ เมื่อสลายตัวจะได้กรดแกลลิก และน้ำตาลกลูโคส พบในพืช ได้แก่ โกศน้ำเต้า กานพลู กุหลาบแดง และ เหลือก แอลลาจิกแทนนิน (Ellagitannins) เป็นชนิดที่ประกอบด้วยโครงสร้างของ กรดเฮกซะไฮดรอกซิได ฟีนิก (Hexahydroxydiphenic acid) เช่น กรดซิบิวลิก และกรด ไฮโดรเฮกซะไฮดรอกซิไดฟีนิกที่รวมอยู่กับ น้ำตาลแอลลาจิกแทนนิน เมื่อสลายตัวจะได้กรดเฮก ซะไฮดรอกซิไดฟีนิก และเกิดปฏกิริยาที่ได้กรดแอลลาจิก ตามมา พบได้ในพืช เช่น ผลทับทิม ผลสมอไทย ต้นโอ๊ค ต้นยูคาลิปตัส เป็นต้น

2.2.4 สติลบีนส์ (Stilbenes) สติลบีนส์สามารถจำแนกได้โดยดูจากโครงสร้างที่เป็น นิวเคลียส คือ 1,2-diphenylethylene และบริเวณ หมู่ไฮดรอกซีวงแหวนจะถูกแทนที่ด้วยโมโนเมอร์ หรือ โอลิโกเมอร์ สติลบีนส์ที่รู้จักกันดี คือ ทรานส์เรสเวอรา โทรล (tran-resveratrol) ในธรรมชาติจะถูกสร้างขึ้นโดยพืช เพื่อป้องกันเชื้อโรคและแมลงกัดกิน และป้องกัน แสงแดด จึงจัดเป็นสารไฟโตอเล็กซิน (phytoalexins) จากการศึกษา พบว่ามีฤทธิ์ในการต้านออกซิเดชัน และ ต้านการอักเสบ ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ดี 2.2.5 ลิกซ์แนน (Lignans) ลิกแนนเป็นสารในกลุ่มฟีนอลลิคที่เป็นสารเมทาบอไลต์ทุติยภูมิจากพืชและโครงสร้างทางเคมีค่อนข้าง หลากหลายรูปแบบ อย่างไรก็ตามโครงสร้างพื้นฐานประกอบด้วยการรวมกันของ phenylpropanoid (C6- C3) ที่เชื่อมโยงโดยคาร์บอนปลายโมเลกุล (dimerization)การเกิดได้ในหลายลักษณะขึ้นอยู่กับหมู่แทนที่บน ปลายคาร์บอน และสามารถเป็นได้ทั้งในลักษณะที่เกิดจากโมเลกุลสองตัวเหมือนกันหรือแตกต่างกันก็ได้ ดังนั้น จึงมีสมบัติทางชีวภาพที่หลากหลายเช่นกัน สมบัติของฤทธิ์ทางชีวภาพที่พบ ได้แก่ การต้านอนุมูลอิสระ ต้าน การอักเสบ ต้านมะเร็ง ยับยั้งเชื้อราและการต้านไวรัสเป็นต้น ในปัจจุบัน มีการค้นพบโครงสร้างทางเคมี รวมถึงสเตอริโอเคมีแบบใหม่ของสารในกลุ่มลิกซ์แนนที่หลากหลายมากขึ้น และสารบางตัวที่พบใหม่เหล่านี้มี สมบัติทางชีวภาพที่น่าสนใจที่อาจนำไปศึกษาต่อและเป็นประโยชน์ในงานวิจัยทางด้านเคมีเภสัชได้อีกใน อนาคต สารในกลุ่มนี้ที่เป็นที่รู้จักคือ เซซามิน (sesamin)

2.3 การสกัด 2.3.1 การสกัดด้วยตัวทำละลาย ( Solvent extraction ) เป็นวิธีการแยกสารที่เป็นของเหลว หรือของแข็งปนอยู่ กับของแข็ง โดยอาศัยสมบัติของการละลายของสาร หลักการสำคัญของการสกัดด้วยตัวทำละลายคือ การเลือกตัวทำ ละลายที่เหมาะสมในการสกัดสารที่ต้องการออกมาให้ได้มากที่สุด โดยหลักการในการเลือกตัวทำละลายที่เหมาะสม มี ข้อควรระวังดังนี้ 1.ต้องละลายสารที่ต้องการสกัดได้ดี และไม่ละลายสารอื่น ๆ ที่ไม่ต้องการออกมาด้วย 2.ไม่ทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการแยก 3.ราคาถูก และหาได้ง่าย 4.ไม่มีพิษ มีจุดเดือดต่ำ 5.ควรแยกออกจากสารที่เราต้องการสกัดได้ง่าย และทำให้บริสุทธิ์ได้ง่าย เพื่อที่จะสามารถนำกลับมาใช้อีกได้ 2.3.2 การสกัดด้วยตัวทำละลาย ถูกนำไปใช้ประโยชน์อย่างกว้างขวางในวงการอุตสาหกรรม ได้แก่ การสกัดน้ำมัน พืชออกจากเมล็ดพืชชนิดต่างๆ การสกัดน้ำมันหอมระเหยจากพืช รวมถึงการสกัดตัวยาออกจากสมุนไพร 2.3.3 การสกัดสารด้วยของไหลวิกฤติยิ่งยวด (Supercritical Fluid Extraction) คือ การใช้ของไหลยิ่งยวดในการ สกัดสารจากวัตถุดิบที่สนใจ ซึ่งของไหลเกิดจากการ เพิ่มความดัน และ อุณหภูมิเกินจุดวิกฤต สารจะประพฤติตัวเป็นของ ไหลยิ่งยวด คุณสมบัติของ Supercritical Fluid Extraction 1.คุณสมบัติการถ่ายเท 2.คุณสมบัติของการละลายของตัวทำละลาย 3.คุณสมบัติในการเลือกสกัด การนำมาใช้ประโยชน์ ในอุตสาหกรรมอาหารและยาใช้เพื่อสกัดสาร เช่น สารให้กลิ่นรส สารให้สีน้ำมันหอมระเหย คาเฟอีน วิตามิน คอลเลสเตอรอล เป็นต้น สารสกัดที่ได้จากวิธีการนี้ มีความปลอดภัยต่อสิ่งแวดล้มและผู้บริโภค

2.3.4 การสกัดสารด้วยวิธีไมโครเวฟ (microwave-assisted exraction, MAE) เป็นการใช้คลื่นไมโครเวฟช่วย ในการสกัด ร่วมกับตัวทำละลาย หลักการ คือ อาศัยการส่งผ่านคลื่นไมโครเวฟไปยัง เซลล์พืช โดยทำให้โมเลกุลของน้ำ หรือความชื้นที่มีอยู่ ในเซลล์พืชสั่นสะเทือน เกิดแรงดันขึ้นภายในเซลล์ทำให้เซลล์แตก และปล่อยสารสำคัญที่อยู่ภายใน ออกมา ผสมกับตัวทำละลายที่ใช้สกัด ข้อดีของวิธีนี้คือ ใช้เวลา ในการสกัดสั้น ไม่เปลืองตัวท าละลาย ช่วยป้องกันการ สลายตัวขององค์ประกอบสำคัญที่สกัดได้ เนื่องจาก ความร้อนที่เกิดขึ้น และช่วยเพิ่มปริมาณผลผลิตของ สารสกัดที่ได้ ปัจจุบันมีการนำ MAE มาใช้ในการสกัดสาร สำคัญจากพืชหลายชนิด เนื่องจากมีประสิทธิภาพดีกว่า วิธีการสกัดแบบ ทั่วไปในหลายด้าน จึงสนใจในการนำMAE 2.4 การแยกสารโดยวิธีโครมาโทกราฟี โครมาโทกราฟี อาศัยสมบัติ 2 ประการ คือ - สารต่างชนิดกันมีความสามารถในการละลายในตัวทำละลายได้ต่างกัน - สารต่างชนิดกันมีความสามารถในการถูกดูดซับด้วยตัวดูดซับได้ต่างกัน โครมาโทกราฟี (chromatography) เป็นการแยกสารผสมที่มีสี หรือสารที่สามารถทำให้เกิดสีได้ วิธีการนี้จะมี เฟส 2 เฟส คือ เฟสอยู่กับที่ (stationary phase) กับ เฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) โดยที่สารในเฟสอยู่กับที่จะทำ หน้าที่ดูดซับ (adsorb) สารผสมด้วยแรงไฟฟ้าสถิตย์ สารที่ใช้ทำเฟสอยู่กับที่จึงมีลักษณะเป็นผง ละเอียดมีพื้นที่ผิวมาก เช่นอลูมินา (alumina,Al2O3) ซิลิกาเจล(silica gel,SiO2) หรืออาจจะใช้วัสดุที่สามารถดูดซับได้ดี เช่น ชอล์ก กระดาษ ซึ่งสารที่ทำหน้าที่ดูดซับในเฟสอยู่กับที่ เช่น น้ำ ส่วนเฟสเคลื่อนที่จะทำหน้าที่ชะ (elute)เอาสารผสมออกจาก เฟสอยู่กับที่ให้เคลื่อนที่ไปด้วย การจะเคลื่อนที่ ได้มากหรือน้อยขึ้นอยู่กับแรงดึงดูดระหว่างสารในสารผสมกับตัวดูดซับ ในเฟส 2.4.1 โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์ (column chromatography) ทำได้โดยการบรรจุสารที่เป็นเฟสอยู่กับที่ เช่น อลูมินาหรือซิลิกาเจลไว้ ในคอลัมน์ แล้วเทสารผสมที่เป็นสารละลายของเหลวลงสู่คอลัมน์ สารผสมจะผ่าน คอลัมน์ช้าๆ โดยตัวทำละลายซึ่งเป็นเฟสเคลื่อนที่ เป็นผู้พาไป สารในเฟสอยู่กับที่จะดูดซับสารในสารผสมไว้ ส่วนประกอบใดของสารผสมที่ถูกดูด ซับได้ดีจะเคลื่อนที่ช้าส่วนที่ถูกดูดซับไม่ดีจะเคลื่อนที่ได้เร็ว ทำให้สารผสมแยก จากกันได้ 2.4.2 โครมาโทกราฟีแบบชั้นบาง (thin layer chromatography) เป็นโครมาโทกราฟีแบบระนาบ(plane chromatography) โดยทำเฟสอยู่กับที่ให้มีลักษณะเป็นครีมข้น แล้วเคลือบบนแผ่นกระจกให้ความหนาของการเคลือบ เท่ากันตลอดแล้วนำไปอบให้แห้ง หยดสารละลายของสารผสมที่ต้องการแยกบนแผ่นที่เคลือบเฟสอยู่กับที่นี้ไว้ แล้ว นำไปจุ่มในภาชนะที่บรรจุตัวทำละลายที่เป็นเฟสเคลื่อนที่ไว้ โดยให้ระดับของตัวทำละลายต้องอยู่ต่ำกว่าระดับของจุดที่ หยดสารผสมไว้ ตัวทำละลายจะซึมไปตามเฟสอยู่กับที่ด้วยการซึมตามรูเล็กเหมือนกับน้ำที่ซึมไป ในกระดาษหรือผ้า เมื่อซึมถึงจุดที่หยดสารผสมไว้ ตัวทำละลายจะชะเอาองค์ประกอบในสารผสมนั้นไปด้วยอัตราเร็วที่แตกต่างกัน ทั้งนี้

ขึ้นอยู่กับสภาพมีขั้ว (polarity) ของสารที่เป็นองค์ประกอบกับสารที่เป็นตัวทำละลาย ถ้าตัวทำละลายเป็นโมเลกุลมีขั้ว (polar molecules) จะชะเอาสารในสารผสมที่เป็นสารมีขั้วไปด้วยได้เร็ว ส่วนสารที่ไม่มีขั้วในสารผสมจะถูกชะพาไป ได้ช้า สารผสมก็จะแยกออกจากกัน 2.4.3 โครมาโทกราฟีแบบกระดาษ (paper chromatography) เป็นโครมาโทกราฟีแบบระนาบอีกแบบหนึ่ง มีวิธีการและหลักการเหมือนกับโครมาโทกราฟีแบบชั้นบาง แตกต่างกันที่เฟสอยู่กับที่ใช้กระดาษที่สามารถดูดซับได้แทน กระจกที่เคลือบ ด้วยซิลิกาเจล 2.4.4 โครมาโทกราฟีแบบแก๊ส (gas chromatography , GC) ใช้สำหรับแยกสารผสมที่เป็นแก๊ส โดยมีเฟส เคลื่อนที่เป็นแก๊สเช่นกันแต่ไม่ทำปฏิกิริยากับสารผสม เช่น ฮีเลียม จะทำหน้าที่เป็นตัวพา (carier) สารผสม ส่วนเฟส อยู่กับที่อาจจะเป็นของแข็งหรือของเหลวที่บรรจุอยู่ในคอลัมน์ เมื่อทั้งตัวพาและสารผสมเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์นี้ เฟสอยู่ กับที่ในคอลัมน์จะดึงดูดด้วยแรงดึงดูดไฟฟ้าสถิตย์ตามความเป็นขั้วของ สารกับโมเลกุลในสารผสมทำให้องค์ประกอบใน สารผสมถูกพาไปด้วยอัตราเร็วที่ต่าง กัน สารผสมก็จะแยกออกจากกันปัจจุบันเทคนิคของโครมาโทกราฟีได้ถูกพัฒนาให้ สามารถทำงานได้รวดเร็ว และใช้แยกสารตัวอย่างได้ครั้งละหลายสารตัวอย่าง เช่น Gas – Liquid Chromatography (GLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) เป็นต้น งานวิจัยอ้างอิง สูไวบะห์ มีนา ซูไฮดาและคณะ(2561) [542] ศึกษาประเมินปริมาณฟินอลิกทั้งหมดและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ในสายพันธุ์อื่นๆ อาจเป็นอีกทางหนึ่งในการค้นหาสารต้านอนุมูลอิสระและพัฒนาเป็นยารักษาโรคต่อไปในการวิจัยครั้ง นี้ผู้วิจัยมีความสนใจศึกษาปริมาณฟินอลิกรวมและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากใบและเปลือกผลดิบของสายพันธุ์มะม่วง เบา ซึ่งอาจนำมาใช้ประโยชน์ทางยาและอาหาร วนิสา รุ่งพาณิชย์และ ทานตะวัน พิรักษ์(2560)[730] ในประเทศไทยเปลือกของผลไม้บางชนิดที่ไม่นิยมนำ ส่วนเปลือกมารับประทานและถูกทิ้งให้กลายเป็นของเสียจากอุตสาหกรรมที่พบมากเช่นผลไม้ตระกูลส้ม โดยที่เศษเหลือ ทิ้งในกระบวนการผลิตน้ำผลไม้จากพืชตระกูลส้มมีปริมาณสูงถึง 50% ของน้ำหนักเริ่มต้น ซึ่งเศษเหลือทิ้งเหล่านี้ นอกจากจะมีปริมาณใยอาหารสูง อีกทั้งยังมีสารต้านอนุมูลอิสระอยู่มาก จึงเหมาะที่จะนำมาศึกษาคุณสมบัติของสาร ต้านออกซิเดชัน

รัญชนา ชิตามระ(2562)[3] การวิเคราะห์หาปริมาณฟลาโวนอยด์ในสารสกัดจากพืช สามารถทำได้หลาย เทคนิคเช่น thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC),capillary electrophoresis (CE) เป็นต้น โดยเทคนิคที่นิยมใช้มากที่สุดคือ HPLC เนื่องจากเป็นวิธีที่มีความสามารถในการแยกสูง และยังสามารถวิเคราะห์ฟลาโวนอยด์ได้ทุกกลุ่ม (Andersen &Markham, 2005) อย่างไรก็ตามชนิดของฟลาโวนอยด์ และสารสกัดที่ต้องการวิเคราะห์ ล้วนมีผลต่อการกำหนดสภาวะในวิเคราะห์ ดังนั้นการพัฒนาและตรวจสอบความ ถูกต้องของวิธีวิเคราะห์จึงเป็นสิ่งจำเป็น เพื่อให้ได้วิธีวิเคราะห์ที่ผลการวิเคราะห์ที่ถูกต้องและแม่นยำ สุวรรณา ผลใหม่, ฐิติกร พรหมบรรจง (2562)[9] สารในกลุ่มฟลาโวนอยด์เหมาะที่จะนํามาพัฒนาพัฒนาเป็น ผลิตภัณฑ์บํารุงผิว ที่เหมาะกับทุกสภาพผิวทั้งใบหน้าและเรือนร่าง มีสรรพคุณช่วยเพิ่มความชุ่มชื้นให้กับเซลล์ผิวหนัง ต่อต้านการเกิดริ้วรอยก่อนวัยและป้องกันการเกิดมะเร็งผิวหนัง อรนุช นาคชาติ, วรรณา เอกทอง และ อรนุช คงลัก(2557)[57] สารประกอบฟีนอลิกที่พบในผักและผลไม้มี ความสัมพันธ์กับความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ (Daduang et al., 2011) ดังนั้นการบริโภคผักผลไม้หรืออาหาร ที่มีสารประกอบฟีนอลิกอาจช่วยให้ร่างกายนำไปใช้ต่อต้านอนุมูลอิสระและช่วยลดอัตราเสี่ยงต่อการเป็นโรคต่างๆ ได้

บทที่ 3 วิธีการดำเนินการวิจัย 3.1 การสกัดและแยกสาร จากสารกลุ่มฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์ เพื่อเป็นสารสำคัญเพื่อพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์เวช สำอางในอนาคต กลุ่มตัวอย่าง เปลือกขนุน 3.1.1 เก็บตัวอย่าง 3.1.2 สกัดและทดสอบพฤษเคมีจากการสกัดและการแยก ด้วยวิธีไอออนเอ็กซ์เชนจ์โครมาโทกราฟี โดยมี รายการทดสอบพฤษเคมีเบื้องต้น ดังนี้ สารกลุ่มอัลคาลอยด์ (Alkaloids) สารกลุ่มฟลาโวนอยด์ (Flavonoids) สารกลุ่มแทนนิน (Tannins) สารกลุ่มเทอร์พีนอยด์ (Terpenoids) สารกลุ่มสเตอรอยด์ (Steroids) ทดสอบความแตกต่างของการแยกและกลุ่มสาร ด้วยเทคนิคทินแลร์โครมาโทกราฟี (thin layer chromatography, TLC) เพื่อยืนยันข้อมูลด้วยรีเอเจนท์ สำหรับตรวจสอบสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ของแต่ละ fractions ที่ ได้ 3.1.3 ทดสอบหาปริมาณของสารกลุ่มฟีนอลลิก (Phenolic) สารกลุ่มฟลาโวนอยด์(Flavonoids) และสารกลุ่ม แทนนิน (Tannins) จากข้อมูลที่ได้จากการทดสอบพฤษเคมี และ TLC จากข้อ 1.2 3.1.4 นำ fraction ที่ให้ผลดีที่สุดจากข้อ 12.1.3-12.1.4 และมีปริมาณฟีนอลลิค หรือฟลาโวนอยด์มากที่สุด ทำ ระเบียนสารฟีนอลลิค หรือฟลาโวนอยด์ ด้วยวิธีลิควิดโครมาโทกราฟีสมรรถนะสูง (high performance liquid chromatography) 3.1.5 สรุปผลการทดลองทั้งหมด เพื่อประเมินศักยภาพ และความเป็นไปได้ ในการพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ครีม หรือเซรั่มต้นแบบ จากสารสกัดกลุ่มฟีนอลลิค หรือฟลาโวนอยด์ จากเปลือกขนุน

3.2 พื้นที่ที่ทำการศึกษาวิจัย ศูนย์วิทยาศาสตร์และวิทยาศาสตร์ประยุกต์ (ตึก10) มหาวิทยาลัยราชภัฏภูเก็ต 21 หมู่ 6 ซอยประวัติ ถนน เทพกษัตรี ตำบลรัษฎา อำเภอเมือง จังหวัดภูเก็ต 83000 โทรศัพท์ 076-523094 ละติจูด : 7.908686,98.386032 3.3 วิธีการทดลอง 3.3.1 การเก็บตัวอย่างพืชขนุน โดยซื้อตัวอย่างขนุน จากเกษตรกรในพื้นที่ โดยส่วนของพืชที่นำมาใช้ มุ่งเน้นไป ที่ผลสุก ในระยะเก็บเกี่ยวสำหรับพืชที่มีผล เพื่อส่งเสริมและสร้างรายได้เพิ่มแก่เกษตรกร 3.3.2 การสกัดด้วยตัวทำละลาย สกัดพืชโดยนำส่วนของเปลือกขนุน ที่แห้งผ่านการอบที่อุณหภูมิ 70 องศา 2 วัน มาบดให้ละเอียด นำส่วนที่บดละเอียดมาชั่งน้ำหนัก สกัดส่วนที่ได้ ด้วยการต้มที่อุณหภูมิประมาณ 78-80 องศา เซลเซียส โดยใช้ตัวทำละลายเอทานอล 4 ลิตร เป็นเวลา 4 ชั่วโมง 3 ครั้ง หลังจากนั้นทำการกรองสารละลายเอทานอล นำสารละลายที่กรองได้ไประเหยตัวทำละลายออก ด้วยเครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน (Rotary evaporator) จะได้ สารสกัดหยาบเอทานอล ชั่งน้ำหนักส่วนสกัดหยาบ นำส่วนสกัดหยาบเอทานอล ประมาณ 50 กรัม เติมน้ำเอทานอล 500 mL และทำการสกัดแบบ Liquid – liquid extraction กับตัวทำละลายเฮกเซน 1 ลิตร ในกรวยแยกขนาด 2000 mL สกัดและแยกสารละลายส่วนเฮกเซนออก แล้วนำไประเหยตัวทำละลายเฮกเซนออก ได้สารสกัด EtOH ส่วนที่ ละลายได้ในเฮกเซน ชั่งน้ำหนักส่วนสกัดที่ได้ทั้งสองส่วน จากนั้นนำส่วนของชั้นเอทานอลที่เหลือ ระเหยตัวทำละลาย ออก ด้วยเครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน (Rotary evaporator) ทำการวิเคราะห์ระบบการแยกด้วยเทคนิคทินแลร์ โครมาโทกราฟี (thin layer chromatography, TLC) เพื่อยืนยันข้อมูลด้วย รีเอเจนท์ สำหรับตรวจสอบสารกลุ่มฟลา โวนอยด์ของแต่ละส่วนสกัดที่ได้จากนั้นนำไปทำการวิเคราะห์ในขั้นตอนต่อไป 1. การตรวจสอบสารพฤกษเคมีเบื้องต้น (Phytochemical screening) นำสารสกัดจากส่วนของเปลือกขนุน ที่ให้ผลดีจากการทดสอบฤทธิ์เบื้องต้น ทดสอบหากลุ่มสารสำคัญ ทั้งหมด 5 กลุ่ม ได้แก่ อัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ แอ นทราควิโนน แทนนิน เทอร์พีนอยด์และสเตอรอยด์ โดยอาศัยการเกิดสีหรือตะกอน ดังนี้ 1. การตรวจสอบอัลคาลอยด์ (Alkaloids) ชั่งสารสกัด 0.2 กรัม เติมสารละลาย 10% กรดซัลฟิวริก (10% H2SO4 ) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร เขย่า นำไปอุ่นบนเครื่องอังน้ำ (Water bath) เป็นเวลา 2 นาที กรองส่วนที่ไม่ละลายออก ปล่อยให้สารละลายเย็นลงที่ อุณหภูมิห้อง นำของเหลวที่ได้จากการกรอง แบ่งใส่หลอดทดลองจำนวน 4 หลอด แล้วทำการทดสอบ ดังนี้ หลอดที่ 1 เป็นชุดควบคุม หลอดที่ 2 หยดน้ำยา Wagner’s reagent จำนวน 3 หยด เขย่า หากปรากฏตะกอนสีเหลือง แสดงว่าพบอัลคาลอยด์

หลอดที่ 3 หยดน้ำยา Mayer’s reagent จำนวน 3 หยด เขย่า หากปรากฏตะกอนสีขาวถึงครีม แสดงว่าพบอัลคาลอยด์ หลอดที่ 4 หยดน้ำยา Dragendorff’s reagent จำนวน 3 หยด เขย่า หากปรากฏตะกอนสีส้ม แดง แสดงว่าพบอัลคาลอยด์ 2. การตรวจสอบฟลาโวนอยด์ (Flavonoids) ชั่งสารสกัด 0.2 กรัม ละลายด้วยเอทานอล ปริมาตร 2 มิลลิลิตร กรองส่วนที่ไม่ละลายออก นำมาทดสอบ ด้วยวิธี Shinoda test โดยแบ่งสารละลายเป็น 2 หลอด หลอดที่ 1 เป็นชุดควบคุม หลอดที่ 2 เติม magnesium ribbon ชิ้นเล็กๆ ลงไป 2-3 ชิ้น แล้วหยดกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น (conc. HCl) ลงไป หากปรากฏสีแดง ส้ม หรือเลือดหมู แสดงว่าพบฟลาโวนอยด์ 3. การตรวจสอบแทนนิน (Tannins) ชั่งสารสกัด 0.2 กรัม ละลายด้วยน้ำกลั่น ปริมาตร 3 มิลลิลิตร นำไปอุ่นบนเครื่องอังน้ำ (Water bath) เป็นเวลา 2 นาที กรองส่วนที่ไม่ละลายออก ปล่อยให้สารละลายเย็นลงที่อุณหภูมิห้อง แบ่งสารละลาย เป็น 3 หลอด หลอดที่ 1 เป็นชุดควบคุม หลอดที่ 2 ทดสอบด้วยวิธี Gelatin test โดยนำสารละลาย เติมสารละลาย 0.5% เจลาติน (0.5 % gelatin solution) หากปรากฏตะกอนสีขาวหรือสีเหลือง แสดงว่าพบแทนนิน หลอดที่ 3 หยด สารละลาย 1% เฟอริกคลอไรด์ (1% FeCl3 ) จำนวน 3 หยด สังเกตสีที่เกิดขึ้น หากปรากฏสีเขียวดำหรือน้ำเงินดำ แสดงว่ามี tannins หรือ phenolic compounds หากไม่เกิดตะกอนกับสารละลาย 0.5% เจลาติน แต่เกิดสีกับ สารละลาย 1% เฟอริกคลอไรด์ แสดงว่าไม่มีแทนนิน แต่มี phenolic compounds 4. การตรวจสอบเทอร์พีนอยด์ (Terpenoids) ชั่งสารสกัด 0.2 กรัม นำมาทดสอบด้วยวิธี Liebermann-Burchard test โดยสกัดด้วย คลอโรฟอร์ม 2 มิลลิลิตร แบ่งสารละลายเป็น 2 หลอด หลอดที่ 1 เป็นชุดควบคุม หลอดที่ 2 เติมแอซีติกแอนไฮไดรด์ (acetic anhydride) 3 มิลลิลิตรเขย่าให้เข้ากัน เติมกรดซัลฟิวริกเข้มข้น (conc. H2SO4 ) ปริมาตร 2-3 หยด หาก ปรากฏสีน้ำเงินจนถึงเขียวแสดงว่าเป็น sterols แต่ถ้าเป็นสีแดงชมพูถึงม่วงแดงแสดงว่าพบไตรเทอร์พีนอยด์ (Triterpenoids) 5.การตรวจสอบสเตอรอยด์ (Steroids) ชั่งสารสกัด 0.2 กรัม นำมาทดสอบด้วยวิธี Salkowski test โดยสกัดด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ (petroleum ether) ปริมาตร 3 มิลลิลิตร 2-3 ครั้ง แบ่งสารละลายเป็น 2 หลอด หลอดที่ 1 เป็นชุดควบคุม หลอดที่ 2 เติมคลอโรฟอร์ม ปริมาตร 2 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน ค่อยๆ เติมกรดซัลฟิวริกเข้มข้น (conc. H2SO4 ) ปริมาตร 1

มิลลิลิตร โดยปล่อยลงข้างหลอดทดลองอย่างระมัดระวัง หากปรากฏวงแหวนสีน้ำตาลแดงที่ระหว่างรอยต่อของ สารละลายกับกรดซัลฟิวริก แสดงว่าพบสเตอรอยด์ 1. การหาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด (Total phenolic content) การหาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด ด้วยวิธี Folin-Ciocalteu colorimetric เป็นวิธี ที่ดัดแปลงจาก Thomas และคณะ, (2012) ใช้กรดแกลลิก (Gallic acid) เป็นสารมาตรฐาน ผสมสารละลายมาตรฐาน กรดแกลลิกที่ละลายในอะซีโตไนไทล์ (ความเข้มข้น 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือสารตัวอย่างที่ต้องการทดสอบใน 96-well plate ปริมาตร 25 ไมโครลิตร กับน้ำ DI ปริมาตร 75 ไมโครลิตร จากนั้นเติมสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent ความเข้มข้น 50% ปริมาตร 25 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6 นาที แล้วเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (Na2CO3 ) ความเข้มข้น 7.5% ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้ากัน บ่มที่อุณหภูมิห้อง ในที่มืด เป็นเวลา 90 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 760 นา โนเมตร ด้วยเครื่อง spectrophotometric microplate reader ทำการทดลองทั้งหมด 3 ซ้ำ และหาปริมาณ สารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดของสารตัวอย่าง จากกราฟมาตรฐานกรดแกลลิก ในหน่วยมิลลิกรัมสมมูลของกรดแกลลิ กต่อน้ำหนักสารสกัด (mg GAE/g extract) จากสมการดังนี้ C = c V M เมื่อ C = ปริมาณสารฟีนอลิกทั้งหมดในสารสกัด (มิลลิกรัมสมมูลของกรดแกลลิกต่อน้ำหนักสารสกัด) c = ความเข้มข้นของกรดแกลลิก (Gallic acid) ที่ได้จากกราฟของสารสกัด (ไมโครกรัม/ มิลลิลิตร) V = ปริมาตรของสารสกัด (มิลลิลิตร) M = น้ำหนักของสารสกัด (กรัม) 2. การหาปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (Total flavonoids content) การหาปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด ด้วยวิธี colorimetric เป็นวิธีที่ดัดแปลงจาก Thomas และคณะ, (2012) ใช้คาเทชิน (Catechins) และ รูทิน (Rutin) เป็นสารมาตรฐาน ผสมสารละลายมาตรฐาน (ความ เข้มข้น 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือสารตัวอย่างที่ต้องการทดสอบใน 96-well plate ปริมาตร 25 ไมโครลิตร กับสารละลาย NaNO2 ความเข้มข้น 5% ปริมาตร 10 ไมโครลิตร และเติมน้ำ DI ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เขย่าและตั้งทิ้งไว้ให้เข้ากันที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเติมสารละลาย AlCl3 ความเข้มข้น 10% ปริมาตร 15 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้ากันบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6 นาที แล้วเติมสารละลาย NaOH ความเข้มข้น 1 Molar ปริมาตร 50 ไมโครลิตร และเติมน้ำ DI ปริมาตร 50 ไมโครลิตรเขย่า 30 วินาที วัดค่า

การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 510 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง spectrophotometric microplate reader ทำการ ทดลองทั้งหมด 3 ซ้ำ และหาปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดของสารตัวอย่าง จากกราฟมาตรฐานใช้คาเทชินและรู ทิน ในหน่วยมิลลิกรัมสมมูลของคาเทชินและรูทินต่อน้ำหนักสารสกัด (mg Catechin/g extract) และ (mg Rutin/g extract) จากสมการดังนี้ C = c V M เมื่อ C = ปริมาณสารฟลาโวนอย์ทั้งหมดในสารสกัด (มิลลิกรัมสมมูลของคาเทชินหรือรูทินต่อน้ำหนัก สารสกัด) c = ความเข้มข้นของคาเทชิน (Catechins) หรือรูทิน (Rutin) ที่ได้จากกราฟของสารสกัด (ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) V = ปริมาตรของสารสกัด (มิลลิลิตร) M = น้ำหนักของสารสกัด (กรัม) 3. การหาปริมาณแทนนินทั้งหมด (Total tannins content) การหาปริมาณแทนนินทั้งหมด ด้วยวิธี Folin-Ciocalteu colorimetric เป็นวิธีที่ดัดแปลงจาก Thomas และคณะ, (2012) ใช้กรดแทนนิก (Tannic acid) เป็นสารมาตรฐาน ผสมสารละลายมาตรฐานกรดแทนนิกที่ ละลายในอะซีโตไนไทล์ (ความเข้มข้น 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือสารตัวอย่าง ที่ต้องการทดสอบใน 96-well plate ปริมาตร 25 ไมโครลิตร กับน้ำ DI ปริมาตร 75 ไมโครลิตร จากนั้นเติมสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent ความเข้มข้น 50% ปริมาตร 25 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 6 นาที จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (Na2CO3 ) ความเข้มข้น 7.5% ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้า กัน บ่มที่อุณหภูมิห้องและมืด เป็นเวลา 90 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 690 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง spectrophotometric microplate reader ทำการทดลองทั้งหมด 3 ซ้ำ และหาปริมาณสารประกอบแทนนินทั้งหมด ของสารตัวอย่าง จากกราฟมาตรฐานกรดแทนนิก ในหน่วยมิลลิกรัมสมมูลของกรดแทนนิกต่อน้ำหนักสารสกัด (mg TA/g extract) จากสมการดังนี้

C = c V M เมื่อ C = ปริมาณแทนนินทั้งหมดในสารสกัด (มิลลิกรัมสมมูลของกรดแทนนิกต่อน้ำหนักสารสกัด) c = ความเข้มข้นของกรดแทนนิก (Tannic acid) ที่ได้จากกราฟของสารสกัด (ไมโครกรัม/ มิลลิลิตร) V = ปริมาตรของสารสกัด (มิลลิลิตร) M = น้ำหนักของสารสกัด (กรัม)