บทความวิชาการเพื่อการศึกษาต่อเน่ืองทางเภสชั ศาสตร์
การทดสอบความถกู ต้องของวิธีวิเคราะห์
Analytical Method Validation
ดร.ภญ.สภุ าณี ดวงธรี ปรชี า
1. วตั ถปุ ระสงค์
1. เพอ่ื ใหผ้ อู้ ่านเขา้ ใจแนวทางการทดสอบความถูกตอ้ งของวธิ วี เิ คราะห์
2. เพอ่ื ใหผ้ อู้ ่านสามารถเลอื ก parameter ทเ่ี หมาะสมในการทา method validation ของวธิ ี
วเิ คราะหแ์ ต่ละประเภท
2. บทนา
Method validation คือการทดสอบประเมินวิธีวิเคราะห์ว่ามีความเหมาะสม สามารถใช้
วเิ คราะหต์ วั อย่างไดถ้ ูกตอ้ ง แม่นยา เช่อื ถอื ได้ ตามวตั ถุประสงคท์ ก่ี าหนด วธิ วี เิ คราะหท์ อ่ี ย่ใู นตารายา
ม า ต ร ฐ า น ห รือ ท่ีเ รีย ก ว่ า เ ภ สัช ต า รับ เ ช่ น USP (United State Pharmacopeia), BP (British
Pharmacopeia) ซง่ึ เรยี กว่า compendial methods เป็นวธิ วี เิ คราะหท์ ไ่ี ดร้ บั การทดสอบมาแลว้ วา่ มคี วาม
ถกู ตอ้ ง แมน่ ยา เช่อื ถอื ไดใ้ นขอบขา่ ยการใชท้ ก่ี าหนด จงึ ไมต่ อ้ งทาการศกึ ษา method validation อกี แต่
วธิ วี เิ คราะหอ์ ่นื ๆ นอกเหนือตารายามาตรฐาน ซง่ึ เรยี กวา่ non-compendial methods รวมทงั้ วธิ วี เิ คราะห์
ทพ่ี ฒั นาขน้ึ มาใหม่ หรอื การนา compendial methods มาใชน้ อกขอบขา่ ยทร่ี ะบุไว้ จะตอ้ งทาการศกึ ษา
method validation
ในการย่นื ข้นึ ทะเบียนตารบั ยา บริษัทจะต้องแสดงข้อมูลทงั้ ทางด้าน safety, efficacy และ
quality ของผลิตภณั ฑ์ยา ซ่งึ ขอ้ มูลการศกึ ษา method validation ของวธิ วี เิ คราะห์ท่ใี ชใ้ นการควบคุม
คุณภาพยา จะเป็นขอ้ มูลทส่ี าคญั อย่างหน่ึงทใ่ี ชป้ ระกอบในการขน้ึ ทะเบยี นตารบั ยาในส่วนของ quality
ประเทศไทยมีการกาหนดให้การข้ึนทะเบียนตารบั ยาเป็นไปตามข้อตกลง ASEAN หรือ ASEAN
Harmonization ภายในวันท่ี 31 ธันวาคม พ.ศ. 2550 เป็ นต้นมา โดยวิธีปฏิบัติสาหรับ method
validation ตามแบบ ASEAN เป็นขอ้ ปฏบิ ตั ทิ ร่ี บั มาจาก The International Council for Harmonization
of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline Q2(R1) ซ่ึงจะให้
แนวทางและขอ้ แนะนาเก่ยี วกบั ลกั ษณะเฉพาะ (characteristics) หรอื พารามเิ ตอร์ (parameters) ของ
การทดสอบความถูกตอ้ งสาหรบั วธิ วี เิ คราะหแ์ ต่ละประเภทสาหรบั ยาทเ่ี ป็ นสารเคมี ไมร่ วมผลติ ภณั ฑช์ วี
วตั ถุ และผลติ ภณั ฑท์ ไ่ี ดจ้ ากเทคโนโลยชี วี ภาพ
คาสาคญั : การทดสอบความถกู ตอ้ งของวธิ วี เิ คราะห,์ method validation
ช่ือเร่อื ง : การทดสอบความถกู ตอ้ งของวธิ วี เิ คราะห์ รหสั : 3002-1-000-002-08-2561 จำนวนหน่วยกิต : 2.0 หน่วยกติ
ผเู้ ขียน : ดร.ภญ.สภุ าณี ดวงธรี ปรชี า อีเมล : [email protected] สถำนท่ีทำงำน : กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ กระทรวงสาธารณสขุ
จำนวนหน้ำ 5 หน้า วนั ท่ีรบั รอง : 27 สงิ หาคม 2561 วนั ท่ีหมดอำยุ : 26 สงิ หาคม 2562
สุข
Continuing Pharmaceutical Education Articles
3. วิธีวิเคราะหท์ ี่ต้องทดสอบความถกู ต้อง
แบง่ เป็น 3 ประเภทคอื
1. การพสิ จู น์เอกลกั ษณ์ (Identification tests)
2. การควบคุมสารปนเป้ือน (Control of impurities)
2.1 Quantitative tests for impurities content
2.2 Limit tests for the control of impurities
3. การวเิ คราะหป์ รมิ าณตวั ยาสาคญั (Assay)
ก่อนการทา method validation จะตอ้ งเขา้ ใจถงึ วตั ถุประสงคข์ องวธิ วี เิ คราะหอ์ ยา่ งชดั เจน
เน่ืองจากจะเป็นสงิ่ ทค่ี วบคมุ วา่ จะตอ้ งประเมนิ performance characteristics หรอื parameters ใดบา้ งใน
การทดสอบความถูกตอ้ งของวธิ วี เิ คราะห์
Parameters ทค่ี วรพจิ ารณาในการทา method validation มดี งั น้ี
- ความเทย่ี ง (accuracy)
- ความแมน่ (precision) มี 3 ระดบั
- Repeatability
- Intermediate precision
- Reproducibility
- ความจาเพาะ (specificity)
- ขดี จากดั ของการตรวจพบ (detection limit)
- ขดี จากดั ของการหาเชงิ ปรมิ าณ (quantitation limit)
- ความเป็นเสน้ ตรง (linearity)
- พสิ ยั (range)
- ความคงทน (robustness)
การประเมนิ ความถกู ตอ้ งของวธิ วี เิ คราะหไ์ มจ่ าเป็นตอ้ งทาครบทุกหวั ขอ้ การจะทาหวั ขอ้ ใดบา้ ง
ขน้ึ อยกู่ บั ประเภทของวธิ วี เิ คราะห์ แนวทางการพจิ ารณาเลอื ก parameter ในการทา method validation
แสดงในตารางท่ี 1
2
บทความวิชาการเพ่อื การศึกษาต่อเน่ืองทางเภสชั ศาสตร์
ตารางท่ี 1 การแบง่ ประเภทการทดสอบและพารามเิ ตอรข์ อง method validation ตามแนวทาง ASEAN
Type of Analytical Procedure
Performance Testing for Impurities Assay
Characteristics
(parameters) Identification Quantitative Limit -dissolution
test (measurement only)
-content/potency
Accuracy - +- +
Precision
- Repeatability - +- +
- Intermediate - +- +
SPrpeeccisifiiocinty + ++ +
Detection limit - -+ -
Quantitation limit - +- -
Linearity - +- +
Range - +- +
+ เป็นพารามเิ ตอรท์ ต่ี อ้ งทดสอบ
-ขเป็นพารามเิ ตอรท์ ไ่ี มต่ อ้ งทดสอบ
-
4. Analytical Performance Characteristics (Parameters)
4.1 Specificity คอื ความสามารถของวธิ วี เิ คราะหใ์ นการจาแนกสารทต่ี อ้ งการวเิ คราะหอ์ อกจาก
สารอน่ื ๆ รวมถงึ สารปนเป้ือน (impurities) สารทเ่ี กดิ จากการสลายตวั (degradants) และ matrix เป็น
พารามเิ ตอรท์ ก่ี าหนดใหท้ ดสอบสาหรบั วธิ วี เิ คราะหท์ กุ ประเภท
4.2 Linearity คอื การประเมนิ ความเป็นเสน้ ตรงระหวา่ งค่าสญั ญานจากการวเิ คราะหก์ บั ความ
เขม้ ขน้ ของสาร โดยตอ้ งประเมนิ ตลอดชว่ ง (range) ทร่ี ะบสุ าหรบั การวเิ คราะหน์ นั้ การศกึ ษา linearity
อาจใชส้ ารละลายชุดความเขม้ ขน้ ทเ่ี ตรยี มจากสารมาตรฐาน หรอื เตรยี มจาก synthetic mixtures ของ
ผลติ ภณั ฑย์ า ควรใชร้ ะดบั ความเขม้ ขน้ อยา่ งน้อย 5 ระดบั การประเมนิ linearity จะประเมนิ ดว้ ยตา
(visual inspection) ถา้ มคี วามสมั พนั ธเ์ ป็นเสน้ ตรง ใหค้ านวณหา regression line โดยวธิ ี least squares
ในการขน้ึ ทะเบยี นตารบั ยา ควรยน่ื ขอ้ มลู correlation coefficient, y-intercept, slope of the
regression line และ residual sum of squares รวมทงั้ กราฟทไ่ี ด้
4.3 Range คอื ช่วงระดบั ความเขม้ ขน้ ต่าสดุ และสงู สดุ ทว่ี ธิ วี เิ คราะหน์ นั้ มคี า่ linearity, accuracy
และ precision ทย่ี อมรบั ไดต้ ามเกณฑท์ ก่ี าหนด
3
Continuing Pharmaceutical Education Articles
การกาหนดคา่ range ขน้ึ อยกู่ บั วตั ถุประสงคข์ องงานทใ่ี ช้ แนวทางในการกาหนดชว่ งความ
เขม้ ขน้ (range) สาหรบั งานวเิ คราะหต์ ่างๆ มดี งั น้ี
- วธิ ี assay ควรใหค้ รอบคลุมชว่ ง 80-120% ของ test concentration
- วธิ ี content uniformity ควรใหค้ รอบคลมุ ชว่ ง 70-130% ของ test concentration
- วธิ ี dissolution test กาหนดชว่ ง + 20% over the specified range
- วธิ หี าปรมิ าณ Impurity กาหนด range ตงั้ แต่ระดบั สารปนเป้ือนทร่ี ายงาน ถงึ 120% ของ
specification
4.4 Accuracy คอื ความเทย่ี งของวธิ วี เิ คราะห์ แสดงโดยความใกลเ้ คยี งกนั ระหวา่ งคา่ ทไ่ี ดจ้ ากการ
วเิ คราะหน์ นั้ เปรยี บเทยี บกบั คา่ จรงิ หรอื คา่ อา้ งองิ ทเ่ี ป็นทย่ี อมรบั
accuracy ตอ้ งประเมนิ ตลอดชว่ งความเขม้ ขน้ ทร่ี ะบุสาหรบั วธิ วี เิ คราะหน์ นั้ โดยทวั่ ไปจะวเิ คราะห์
อยา่ งน้อย 9 ซ้าท่ี 3 ความเขม้ ขน้ ทค่ี รอบคลุม range ทก่ี าหนด โดยการเตมิ สารมาตรฐานทท่ี ราบความ
เขม้ ขน้ ลงใน sample และหาคา่ ความต่างของคา่ ทว่ี เิ คราะหไ์ ดก้ บั ค่าทแ่ี ทจ้ รงิ แลว้ รายงานเป็นคา่ รอ้ ยละ
การคนื กลบั (percent recovery)
4.5 Precision คอื ความแมน่ ของวธิ วี เิ คราะห์ แสดงโดยความใกลเ้ คยี งกนั ระหวา่ งคา่ ทไ่ี ดจ้ ากการ
วเิ คราะหต์ วั อยา่ งเดยี วกนั ซ้าหลายๆครงั้ โดยตวั อยา่ งตอ้ งเป็นเน้ือเดยี วกนั หวั ขอ้ precision น้ีแบ่ง
ออกเป็น 3 ระดบั คอื
- Repeatability คอื การแสดงความแมน่ ของการวเิ คราะหช์ ดุ การวเิ คราะหซ์ ้า ทท่ี าในสภาวะ
เดยี วกนั ในระยะเวลาทห่ี า่ งกนั ไมน่ าน
- Intermediate precision คอื การแสดงความแมน่ ของการวเิ คราะหช์ ดุ การวเิ คราะห์ ทท่ี าซ้า
โดยมกี ารเปลย่ี นแปลงปัจจยั ในการวเิ คราะหใ์ นหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารเดยี วกนั เชน่ เปลย่ี นเครอ่ื งมอื เปลย่ี น
นกั วเิ คราะห์ เปลย่ี นวนั
- Reproducibility คอื การแสดงความแมน่ ของการวเิ คราะหท์ ท่ี าโดยหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารหลายหอ้ ง
โดยทวั่ ไปใชใ้ นการนาเสนอวธิ ใี หมท่ จ่ี ะใชเ้ ป็นวธิ มี าตรฐานในเภสชั ตารบั
การรายงานคา่ precision แต่ละชนิด ใหร้ ายงานเป็น standard deviation, relative standard
deviation และ confidence interval
4.6 Detection limit หรอื Limit of detection (LOD) คอื ปรมิ าณต่าสดุ ของสารทว่ี เิ คราะหใ์ น
ตวั อยา่ งใดๆ ทส่ี ามารถตรวจพบได้ แต่ไมจ่ าเป็นตอ้ งทราบวา่ มปี รมิ าณทแ่ี น่นอนเทา่ ใด การหา LOD มี
หลายวธิ ี ไดแ้ ก่
4.6.1 Based on visual evaluation คอื การประเมนิ ดว้ ยการมองเหน็ โดยการวเิ คราะห์
ตวั อยา่ งทท่ี ราบความเขม้ ขน้ และหาคา่ ต่าสุดของตวั อยา่ งทว่ี ธิ วี เิ คราะหส์ ามารถตรวดวดั ได้
4.6.2 Based on signal-to-noise วธิ นี ้สี ามารถใชก้ บั เทคนิคทใ่ี ห้ baseline noise เชน่
เทคนคิ HPLC โดยทาการเปรยี บเทยี บ signal ทว่ี ดั ไดจ้ ากตวั อยา่ งทร่ี คู้ วามเขม้ ขน้ ต่าของสารทว่ี เิ คราะห์
กบั ตวั อยา่ งทเ่ี ป็น blank เรยี กวา่ signal-to-noise ratio โดยทวั่ ไปสาหรบั LOD คา่ ทย่ี อมรบั คอื 3 หรอื 2
ตอ่ 1
4
บทความวิชาการเพ่ือการศึกษาต่อเนื่องทางเภสชั ศาสตร์
4.6.3 Based on the standard deviation of the response on the slope
โดย LOD = 3.3 /S
ซง่ึ = the standard deviation of the response
S = the slope of the calibration curve
ในการยน่ื ขอขน้ึ ทะเบยี นตารบั ยา วธิ วี เิ คราะหส์ ารปนเป้ือนแบบ limit test ตอ้ งมกี ารแสดง
คา่ LOD และระบวุ ธิ ที ใ่ี ชใ้ นการประเมนิ ดว้ ย
4.7 Quantitation limit หรอื Limit of quantitation (LOQ) คอื ปรมิ าณต่าสดุ ของสารทว่ี เิ คราะห์
ในตวั อยา่ งทส่ี ามารถตรวจหาเชงิ ปรมิ าณโดยมคี วามเทย่ี งและความแมน่ อยใู่ นเกณฑท์ เ่ี หมาะสม การหา
LOQ มหี ลายวธิ ี ไดแ้ ก่
4.7.1 Based on visual evaluation คอื การประเมนิ ดว้ ยการมองเหน็ โดยการวเิ คราะห์
ตวั อยา่ งทท่ี ราบความเขม้ ขน้ และหาคา่ ต่าสดุ ซง่ึ สามารถหาปรมิ าณสารทว่ี เิ คราะหไ์ ดด้ ว้ ยความเทย่ี งและ
ความแมน่ ทเ่ี หมาะสม
4.7.2 Based on signal-to-noise วธิ นี ้ีสามารถใชก้ บั เทคนิคทใ่ี ห้ baseline noise เชน่ เทคนิค
HPLC โดยทาการเปรยี บเทยี บ signal ทว่ี ดั ไดจ้ ากตวั อยา่ งทร่ี คู้ วามเขม้ ขน้ ต่าของสารทว่ี เิ คราะหก์ บั
ตวั อยา่ งทเ่ี ป็น blank เรยี กวา่ signal-to-noise ratio โดยทวั่ ไปสาหรบั LOQ คา่ ทย่ี อมรบั คอื 10 ต่อ 1
4.7.3 Based on the standard deviation of the response on the slope
โดย LOD = 10 /S
ซง่ึ = the standard deviation of the response
S = the slope of the calibration curve
ในการยน่ื ขอขน้ึ ทะเบยี นตารบั ยา วธิ วี เิ คราะหป์ รมิ าณสารปนเป้ือน ตอ้ งมกี ารแสดงคา่ LOQ
และระบวุ ธิ ที ใ่ี ชใ้ นการประเมนิ ดว้ ย
5. บทสรปุ
การศกึ ษา method validation ของวธิ วี เิ คราะหท์ ใ่ี ชใ้ นการควบคุมคณุ ภาพยา เป็นขอ้ มลู ทส่ี าคญั
อยา่ งหน่ึงทใ่ี ชป้ ระกอบในการขน้ึ ทะเบยี นตารบั ยาในสว่ นของ quality เพอ่ื แสดงใหเ้ หน็ วา่ วธิ วี เิ คราะหน์ นั้
สามารถใชว้ เิ คราะหต์ วั อยา่ งไดถ้ กู ตอ้ ง แมน่ ยา เช่อื ถอื ได้ ตามวตั ถุประสงคท์ ก่ี าหนด โดยแนวทาง
การศกึ ษา method validation ในอตุ สาหกรรมยาของประเทศไทย จะปฏบิ ตั ติ ามแนวทางของ ASEAN
Analytical Validation Guideline ทร่ี บั มาจาก ICH Guideline Q2(R1) ซง่ึ จะใหแ้ นวทางปฏบิ ตั แิ ละ
ขอ้ แนะนาเกย่ี วกบั ลกั ษณะเฉพาะ (characteristics) หรอื พารามเิ ตอร์ (parameters) ของการทดสอบ
ความถูกตอ้ งสาหรบั วธิ วี เิ คราะหแ์ ตล่ ะประเภท
6. เอกสารอ้างอิง
1. ICH Q2 (R1) : Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2005.
2. ASEAN Technical Guidelines to ACTR on Quality: ASEAN Analytical Validation
Guideline. 2549.
5