คู่มือการปฏิบัติงาน EB1

คมู่ ือการปฏบิ ัตงิ าน

วิธกี ารตรวจวิเคราะหเ์ ช้อื เอนเทอโรแบคทีเรียซอี โี ดยใช้ แผ่น Petrifilm™

ชอ่ื เรื่อง : วิธที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หน้าท่ี : 1 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนคร้ังที่ : วนั ทอี่ นุมตั ิ :

ผู้อนมุ ัติ....................................................................................... วันท่ี ………………………………
ตำแหนง่ ………………………………………………….

ผู้ทบทวน..................................................................................... วันท…่ี ………….………………..
ตำแหนง่ ………………………………………………….

ผจู้ ัดทาํ ......................................................................................... วนั ท่ี …………..…………………
ตำแหนง่ ………………………………………………….

0. ประวตั กิ ารแก้ไข (Revision history)

วนั /เดอื น/ปี ฉบับแก้ไข เลขท่ี: รายละเอียด

ช่อื เรอ่ื ง : วิธีทดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หน้าที่ : 2 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนครง้ั ที่ : วนั ท่ีอนุมตั ิ :

1. วตั ถุประสงค์

เพอ่ื ให้ผู้ปฏิบัติงานสามารถตรวจวเิ คราะห์หาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้ Petrifilm™
Enterobacteriaceae Count Plates ไดอ้ ย่างถูกต้อง

2. ขอบข่าย
เพ่อื ใช้ทดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae ในตวั อย่างจากสิ่งแวดลอ้ ม และนำ้ เชื่อม

3. คำจำกดั ความ

เชื้อเอนเทอโรแบคทีเรียซีอี (Enterobacteriaceae) เปน็ เชือ้ แบคทเี รยี แกรมลบตระกูลใหญ่และถือเป็น
กลุ่มเชอ้ื ท่ีสำคัญสำหรับการตรวจสอบสขุ อนามยั และการฆ่าเช้ือในอุตสาหกรรมอาหาร กลุม่ เช้อื น้ี ได้แก่ จุลินทรีย์
หลากหลายชนิด รวมถึงโคลิฟอร์ม (Coliform) ทั้งหมด สมาชิกในกลุ่มครอบคลุมตัง้ แตแ่ บคทีเรีย เช่น เชอ้ื
ซาลโมเนลล่า (Salmonella) และอีโคไล (E. coli) ซ่งึ เปน็ ท่ที ราบกนั ดวี ่าเปน็ สาเหตุของโรคท่ีมีอา หาร เป็นสื่อ
ตลอดจนทำให้อาหารเน่าเสยี รวมถึงเช้อื จลุ ินทรียห์ ลากหลายชนดิ ท่ีพบได้ท่วั ไปในทางเดินอาหารของคนซึ่งเป็น
สว่ นของจุลชพี ท่ีอาศัยอยใู่ นทางเดนิ อาหาร การทีเ่ ชอื้ กลมุ่ น้ีมกี ระจายอยู่ท่วั ไปทำให้มโี อกาสท่ีเชอ้ื ในกลุ่มของเชื้อ
Enterobacteriaceae เขา้ มาในหว่ งโซอ่ าหารได้

เชื้อเอนเทอโรแบคทีเรียซีอี (Enterobacteriaceae) มีคุณลักษณะเป็นแบคทีเรียแกรมลบ รูปร่าง
แบบท่อน ไม่สร้างเอนไซม์ออกซิเดส และมีความสามารถในการหมักกลูโคสให้ เป็นกรดและ/หรือก๊า ซ
คาร์บอนไดออกไซด์ได้ สามารถเคลอ่ื นท่ไี ด้ มีความยาวประมาณ 1-5 ไมครอน

ช่ือเรอื่ ง : วธิ ีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ท่ี : 3 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนคร้งั ที่ : วันท่อี นุมัติ :

4. ผู้รับผิดชอบ
……………………………………………………………………………………………………………………………………………….

5. ข้อควรระวังและความปลอดภัย

5.1 เครื่องแก้วและอุปกรณท์ ีใ่ ชใ้ นการทดสอบต้องลา้ งดว้ ยน้ำยาลา้ งเครื่องแก้ว ตามดว้ ยนำ้ สะอาดแล้ว
ล้างด้วยน้ำกลนั่ อกี ครง้ั

5.2 การฆ่าเชอ้ื อุปกรณก์ ่อนนำไปใช้ในการทดสอบ

5.2.1 เครื่องแก้วทุกประเภท นำไปฆ่าเชือ้ ในตู้อบ (Oven) ที่อุณหภูมิ 170 องศาเซลเซียส
เป็นเวลาอย่างน้อย 1 ช่วั โมง

5.2.2 ปเิ ปตทิป ใสใ่ นกลอ่ งทิปปิเปตและใส่ในถุงพลาสติกที่ปิดสนิท แลว้ ทำการฆ่าเช้ือโดยใช้
Autoclave ท่ีอณุ หภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที

5.2.3 ปเิ ปต ห้มุ ดว้ ยฟอยล์ท้ัง 2 ด้าน หรอื ใส่ในกระบอกสแตนเลสก่อนนำไปอบฆา่ เช้อื

5.2.4 ไม้พันสำลี (Cotton Swab) ห่อด้วยกระดาษสติกเกอร์ ฆ่าเชื้อโดยใช้ Autoclave ที่
อุณหภมู ิ 121 องศาเซลเซียส เปน็ เวลา 15 นาที

5.3 อุปกรณท์ ใ่ี ช้ในการทดสอบที่ทำการทดสอบเสร็จแลว้ ต้องทำการฆ่าเชอื้ โดยใช้ Autoclave ทอี่ ุณหภูมิ
121 องศาเซลเซียส เปน็ เวลา 15 นาที

ชอื่ เรอ่ื ง : วิธีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ที่ : 4 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนครง้ั ที่ : วนั ทอี่ นุมัติ :

6. ขั้นตอนการปฏิบัตงิ าน
6.1 เครอื่ งมอื อปุ กรณ์
6.1.1 ไมโครปเิ ปต (Micropipettes) พร้อมปิเปตทิป ขนาด 1000 ไมโครลติ ร
6.1.2 ปิเปตปลอดเชื้อ (Sterilized Pipette) ขนาด 10 มลิ ลลิ ิตร
6.1.3 บกี เกอร์ (Beaker) ขนาด 1,000 มลิ ลิลิตร
6.1.4 เอทานอล (Ethanol) ความเข้มขน้ 70% และ 90%
6.1.5 ตะเกยี งแอลกอฮอล์พรอ้ มไฟแช็ค
6.1.6 ตบู้ ม่ เพาะเชอ้ื (Incubator) อณุ หภมู ิ 35±1 องศาเซลเซียส
6.1.7 หลอดทดลองพรอ้ มฝา
6.1.8 3M Petrifilm Flat Spreader หรือตวั กดพลาสติก
6.1.9 เคร่ืองช่ัง (Balance Analytical) ละเอียด 2 ตำแหนง่
6.1.10 ตู้อบลมร้อน (Hot air oven)
6.1.1 ขวดสำหรบั เจอื จางตวั อย่าง หรอื ขวดดูแรน

ชือ่ เรอ่ื ง : วิธที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หนา้ ท่ี : 5 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนครงั้ ท่ี : วนั ท่ีอนมุ ตั ิ :

6.2 สารละลายบฟั เฟอร์และอาหารเลีย้ งเชือ้ (Buffer and Medium)

6.2.1 อาหารเลี้ยงเชื้อสำเรจ็ รูป 3M Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count (EB) Plate

6.2.2 0.85% Sodium chloride (NaCl) 10 มลิ ลลิ ิตร

ชั่งผง Sodium chloride 8.50 กรัม ละลายในน้ำกลน่ั 1,000 มิลลิลติ ร จนสารละลาย
หมด แบ่งบรรจุใสห่ ลอดทดลอง ๆ ละ 10 มิลลิลิตร ปดิ ฝาใหส้ นทิ นำไปฆา่ เช้ือโดยใช้ Autoclave ทอี่ ณุ หภมู ิ 121
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที

เพือ่ การเจรญิ เตบิ โตและการรอดอย่างเหมาะสมของเช้ือจลุ นิ ทรีย์ ให้ปรับ pH ของสาร
แขวนลอยตวั อย่างให้อยทู่ ี่ระหวา่ ง 6.5-7.5 สำหรับผลติ ภณั ฑ์ที่เป็นกรด ให้ปรบั pH ด้วย โซเดียมไฮดร อกไซด์
ความเขม้ ข้น 1 นอรม์ อล สำหรับผลติ ภณั ฑ์ที่เปน็ ดา่ ง ให้ปรับ pH ด้วย ไฮโดรคลอริก ความเขม้ ข้น 1 นอรม์ อล

6.2.3 0.1% Buffered peptone water

ชั่งผง Buffered peptone water 1 กรัม ละลายผง Buffered peptone water ใน
น้ำกลัน่ 1,000 มลิ ลิลติ ร จนสารละลายหมด แบง่ บรรจุใสข่ วดสำหรับเจอื จางตวั อยา่ งขวดละ 225 มลิ ลิลติ ร และ
แบง่ บรรจใุ สห่ ลอดทดลอง หลอดละ 9 มิลลิลติ ร ปดิ ฝาให้สนทิ นำไปฆ่าเชือ้ โดยใช้ Autoclave ทอี่ ณุ หภูมิ 121
องศาเซลเซยี ส เปน็ เวลา 15 นาที

ชอ่ื เรื่อง : วิธีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ท่ี : 6 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนครงั้ ที่ : วนั ทีอ่ นุมัติ :

6.3 การเตรยี มตวั อย่าง

6.3.1 ในการเก็บตวั อย่างไมค่ วรเก็บจนเต็มขวด ควรเหลอื ที่ว่างไวป้ ระมาณ 2.5 เซนตเิ มตร จาก
ปากขวดเพ่อื ให้มีออกซเิ จนสำหรับเช้อื จลุ ินทรีย์และสะดวกในการเขยา่ ขวดตวั อย่าง

6.3.2 การเตรียมตัวอย่างสำหรบั ตวั อย่างน้ำเชอื่ ม : ชงั่ ตวั อยา่ งนำ้ เชื่อม 25±0.1 กรมั ใส่ในขวด
เตรยี มตวั อยา่ ง เตมิ 0.1% Buffered peptone water 225 มลิ ลลิ ติ ร ผสมใหต้ ัวอยา่ งกระจายทั่ว สารละลาย
ตัวอย่างที่ไดถ้ ือวา่ มีความเจือจาง 10-1 (ตวั อยา่ งถูกเจือจาง 10 เท่า) เตรียมสารละลายตวั อยา่ งให้มคี วามเจือจาง
10-2 10-3 และ 10-4 หรือระดบั ความเจือจางท่เี หมาะสม โดยปิเปตตวั อยา่ งทคี่ วามเจือจาง 10-1 จำนวน 1 มลิ ลลิ ติ ร
ใสใ่ นหลอดทดลองท่ีมี 0.1% BPW 9 มลิ ลลิ ิตร จะได้ความเจือจาง 10-2 เขย่าใหเ้ ชอ้ื กระจายท่ัวกัน สว่ นทค่ี วาม
เจอื จาง 10-310-4 กเ็ ตรียมได้ในลักษณะเดียวกนั แต่ใช้ตวั อย่างทีม่ ีความเจือจาง 10-2 และ 10-3 ตามลำดบั

6.3.3 การเตรยี มตวั อย่างสำหรบั ตัวอย่างจากสงิ่ แวดล้อม

1. กำหนดพน้ื ที่ทจ่ี ะทำการ swab เช่น ผนงั หอ้ ง พ้ืนโตะ๊ ท่สี ัมผัสอาหาร และฝา่ มอื เปน็ ตน้

2. นำไมพ้ ันสำลที ี่ผ่านการฆ่าเช้ือจมุ่ ลงในหลอดทีม่ ี 0.85% NaCl 10 มลิ ลลิ ติ ร แลว้ กดไมเ้ ข้ากับ
ขา้ งในหลอด เพื่อไลน่ ำ้ ส่วนเกินออก

3. นำไม้พนั สำลีมา swab บนพืน้ ผิวไปทางใดทางหน่ึงใหท้ ั่วบรเิ วณท่ีจะตรวจนับจลุ ินทรีย์
(อย่างนอ้ ย 100 ตารางเซนตเิ มตร) ไมพ้ ันสำลที ี่ swab เสร็จแล้วใหจ้ มุ่ ลงในหลอดเดิม หกั ก้านไมพ้ นั สำลที ีถ่ ูกมอื จับ
แลว้ ทง้ิ นำเอาสำลีเขา้ ไปในหลอดแลว้ ปิดหลอด

หมายเหตุ : การทดสอบตวั อยา่ งควรทำทนั ทภี ายหลงั การเกบ็ ตวั อย่าง ในกรณีทไี่ มส่ ามารถทำการทดสอบได้ทันที
จะตอ้ งทำการรกั ษาสภาพตัวอย่าง โดยการแชข่ วดตวั อย่างในตูเ้ ยน็ ทอี่ ุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส)

ชื่อเร่อื ง : วธิ ที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หน้าที่ : 7 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนครง้ั ท่ี : วนั ทอี่ นมุ ตั ิ :

6.4 วธิ กี ารทดสอบ

6.4.1 วาง 3M PetrifilmTM EB Plates บนพ้ืนผิวเรยี บและอยใู่ นแนวราบ

6.4.2 ทำการปัน่ ตวั อย่างโดยการหมุนหลอดไปมาด้วยมือ แล้วเปดิ แผน่ ฟลิ ม์ ท่ีอยู่ดา้ นบนขขึ้นและ
หยดสารละลายเจือจางตัวอยา่ งด้วยปเิ ปต 1 มลิ ลิลติ ร ลงตรงกลางของแผ่นฟิลม์ ดา้ นล่าง ในแนวตงั้ ฉากกับพ้ืนผิว
คอ่ ย ๆ ปลอ่ ยแผ่นฟลิ ม์ ท่ีอยดู่ ้านบนลงบนตัวอยา่ งเพอ่ื ป้องกนั ไม่ให้เกิดฟองอากาศ

6.4.3 วาง 3M Petrifilm Flat Spreader ดว้ ยด้านทเ่ี รียบลงตรงกลางของ 3M PetrifilmTM EB
Plates กดเบา ๆ ตรงกลางตัวกดแบบเรียบ เพอื่ กระจายตวั อยา่ งให้เสมอกัน กระจายสารละลายเชื้อให้ทั่วทั้ง
บริเวณที่เช้ือเจรญิ เติบโตบน 3M PetrifilmTM EB Plates ก่อนทเี่ จลจะก่อตัวขึ้น หา้ มเลอ่ื น 3M Petrifilm Flat
Spreader ไปมาบนแผ่นฟิล์ม

6.4.4 นำ 3M Petrifilm Spreader ออกและปล่อย 3M Petrifilm EB Plates ทิ้งไว้เป็นเวลา
อยา่ งนอ้ ยหน่งึ นาทเี พ่ือใหเ้ จลกอ่ ตัว

6.4.5 นำ 3M PetrifilmTM EB Plates ไปบม่ ท่ีอณุ หภูมิ 35±1 องศาเซลเซยี ส เป็นเวลา 24±2
ช่ัวโมง โดยหนั ด้านใสขน้ึ บน สามารถวางซ้อนกนั ไดไ้ ม่เกิน 20 แผ่น

ช่ือเรอ่ื ง : วิธที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หนา้ ท่ี : 8 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนครง้ั ที่ : วันท่อี นมุ ัติ :

6.5 การนับโคโลนแี ละการคํานวณผลการทดสอบ

6.5.1 นบั จำนวนโคโลนีของเช้ือที่เจริญบนเพลทที่มจี ำนวนโคโลนีระหวา่ ง 15-100 โคโลนีต่อ
เพลท Enterobacteriaceae จะปรากฏเปน็ โคโลนีสแี ดงที่มโี ซนสเี หลือง และ/หรอื โคโลนีสแี ดงที่มีฟองก๊า ซที่มี
หรอื ไมม่ โี ซนสีเหลอื ง โคโลนีที่ไม่สรา้ งก๊าซ (ระยะห่างระหว่างโคโลนีและฟองกา๊ ซมากกวา่ เส้นผา่ นศูนย์กลางของ
หนง่ึ โคโลน)ี และโคโลนีที่ไม่สร้างโซนสีเหลอื งจะไมน่ ับเป็น Enterobacteriaceae และนำไปคําน วณตา มสูตร
รายงานผลในหน่วย CFU/g ตวั อยา่ ง และรายงานผลในหน่วย CFU/100cm2 สำหรบั ตัวอยา่ ง swab test

ภาพ ลกั ษณะโคโลนีของ Enterobacteriaceae บน 3M PetrifilmTM EB Plates

ชื่อเรือ่ ง : วธิ ที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ท่ี : 9 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนครั้งที่ : วนั ทอ่ี นมุ ัติ :

การคำนวณเชอ้ื จลุ ินทรยี ท์ ัง้ หมดในหน่วย CFU/g
ΣC

CFU/g= v ∙ (n1+ 0.1n2) ∙ d
เมอ่ื ∑C คอื ผลรวมจำนวนโคโลนที ัง้ หมดจากทุกเพลททีส่ ามารถนบั จำนวนได้

v คือ ปรมิ าณของตัวอย่างท่ใี ชใ้ นการตรวจวิเคราะห์
n1 คอื จำนวนเพลทที่สามารถนบั โคโลนไี ดเ้ ม่อื ใช้สารละลายตัวอยา่ งท่ีมีการเจอื จางน้อย
n2 คอื จำนวนเพลททส่ี ามารถนับโคโลนีได้เมื่อใชส้ ารละลายตัวอย่างท่ีมีการเจอื จางมากขึน้
d คือ ระดบั การเจือจางของสารละลายตัวแรก (n1)

ตวั อย่างการคำนวณ

ทร่ี ะดบั การเจอื จาง 100 เท่า นับจำนวนโคโลนีได้ 88 โคโลนี
88

CFU/g = 1 ∙ (1 + 0) ∙ 10-2
= 8800 CFU/g

= 8.8 x 103 CFU/g

ชื่อเรอ่ื ง : วธิ ที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หน้าที่ : 10 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนคร้ังที่ : วันทอี่ นมุ ตั ิ :

การคำนวณเชอื้ จุลนิ ทรีย์ทง้ั หมดในหน่วย CFU/100cm2

CFU/g= v ∙ ΣC ∙ d ∙ n3
(n1+ 0.1n2)

เม่อื ∑C คอื ผลรวมจำนวนโคโลนีท้งั หมดจากทุกเพลททสี่ ามารถนบั จำนวนได้

v คือ ปรมิ าณของตวั อย่างทีใ่ ชใ้ นการตรวจวเิ คราะห์

n1 คอื จำนวนเพลททสี่ ามารถนบั โคโลนไี ดเ้ ม่ือใชส้ ารละลายตัวอยา่ งท่ีมีการเจือจางน้อย
n2 คอื จำนวนเพลทท่สี ามารถนบั โคโลนีไดเ้ ม่ือใชส้ ารละลายตวั อย่างทมี่ ีการเจอื จางมากขนึ้
n3 คือ ปริมาตรเรม่ิ ตน้ ของการ swab test
d คือ ระดบั การเจือจางของสารละลายตวั แรก (n1)

ตัวอยา่ งการคำนวณ : swab พนื้ ทีข่ นาด 100 cm2

ทีร่ ะดับการเจือจาง 100 เทา่ นับจำนวนโคโลนไี ด้ 64 โคโลนี และ 52 โคโลนี

CFU/100cm2 = 1 ∙ 64 + 52 100 ∙10
(2 + 0) ∙

= 580 CFU/100cm2

= 5.8 x 102 CFU/100cm2

ชอื่ เรือ่ ง : วิธีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หน้าท่ี : 11 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนครง้ั ที่ : วันที่อนุมัติ :

6.5.2 สามารถนับจำนวนเชอ้ื บน 3M PetrifilmTM EB Plates ได้โดยใชเ้ ครอื่ งนับโคโลนมี าตรฐาน
หรือเครือ่ งขยายขนาดภาพทม่ี ีการส่องสว่างประเภทอ่ืน ๆ ไม่ต้องนบั โคโลนีบนขอบโฟมเน่อื งจากเป็นบริเวณที่ไม่
สัมผสั กับอาหารเลย้ี งเชอ้ื ไมน่ ับฟองอากาศปลอมทีอ่ าจเกดิ ขนึ้

6.5.3 พื้นที่การเจริญเติบโตเปน็ วงกลมขนาดประมาณ 20 ตารางเซนตเิ มตร การประมาณ
ค่าสามารถทำไดบ้ น 3M PetrifilmTM EB Plates ทม่ี ีมากกวา่ 100 โคโลนีโดยการนบั จำนวนโคโลนีในช่องส่ีเหลี่ยม
สองช่องหรอื มากกวา่ และหาคา่ เฉลีย่ จำนวนโคโลนีตอ่ ช่อง คูณค่าเฉลี่ยนนั้ ด้วย 20 เพื่อคำนวณค่าโคโลนีที่นับได้
โดยประมาณตอ่ แผน่ อาหารเลี้ยงเชือ้ หน่งึ แผน่

6.5.4 เมื่อโคโลนีมีจำนวนมาก 3M PetrifilmTM EB Plates จะมีสีของเจลเข้มขึ้น หรือแผน่
อาหารอาจเปลย่ี นเปน็ สเี หลอื งท้ังหมด และมลี กั ษณะใดลักษณะหนึ่งหรอื มที งั้ สองลักษณะ ดังต่อไปนี้: โคโลนีขนาด
เล็กจำนวนมากท่แี ยกจากกันอย่างเหน็ ได้ชดั และ/หรือมฟี องก๊าซจำน วนมาก ในกรณีเชน่ นี้ ใหจ้ ดบันทึกผลว่ามี
จำนวนมากเกินกวา่ ทจ่ี ะนับได้ (TNTC) กรณที ีจ่ ำเปน็ ตอ้ งรูจ้ ำนวนที่แท้จรงิ ให้ทำการเจือจางเพ่มิ ข้ึน

6.5.5 หากไมส่ ามารถนบั 3M Petrifilm EB Plates ภายใน 1 ชวั่ โมงหลังจากนำออกจากตู้บ่ม
แล้ว อาจนำแผน่ อาหารนน้ั แช่แข็งไว้ในภาชนะทปี่ ิดได้สนิททอ่ี ุณหภูมิต่ำกวา่ หรือเท่ากับ -15 องศาเซลเซียส เป็น
เวลาไมเ่ กนิ หนึ่งสัปดาหเ์ พอ่ื นบั จำนวนโคโลนีในภายหลัง

ช่อื เรือ่ ง : วิธที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หน้าท่ี : 12 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนคร้ังท่ี : วันทีอ่ นุมตั ิ :

6.5 การแปลผล

ภาพ รายละเอียด
อินดิเคเตอร์บนแผ่นเพาะเช้อื 3M PetrifilmTM EB จะย้อมสีทุกโคโลนี
Enterobacteriaceae Count = 13 แผ่นเพาะเช้ือให้เป็นสแี ดง แผน่ ฟิล์มด้านบนจะดกั ฟองกา๊ ซทสี่ ร้างจาก
ภาพท่ี 1 เชอ้ื แบคทีเรยี บางชนิด สำหรบั แบคทีเรยี ที่สรา้ งกรดจะเหน็ เป็นโคโลนี
สแี ดงท่ีมโี ซนสีเหลอื งล้อมรอบ แบคทเี รียท่ีสร้างกา๊ ซและ/หรือกรดจะ
นับเปน็ เชอื้ กลุ่ม Enterobacteriaceae โดยมลี ักษณะบนแผ่น เพา ะ
เชื้อ 3M PetrifilmTM EB ดงั น้ี โคโลนสี แี ดงมฟี องกา๊ ซและไม่มีบริเวณ
กรด (ดังวงกลมหมายเลข 1 ของภาพท่ี 1) โคโลนสี ีแดงมีบริเวณกรด
แต่ไมม่ กี ารสร้างก๊าซ (ดงั วงกลมหมายเลข 2 ของภาพท่ี 1) หรือโคโลนี
สีแดงที่มีการสร้างทั้งก๊าซและกรด (ดังวงกลมหมายเลข 3 ของ
ภาพท่ี 1) ลักษณะของฟองก๊าซอาจแตกตา่ งกันไป ฟองก๊าซอาจเบียด
โคโลนีจนเปน็ ขอบล้อมรอบฟองกา๊ ซ (ดังวงกลมหมายเลข 4 ของ
ภาพที่ 1)

ชอื่ เรื่อง : วิธที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ที่ : 13 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนครง้ั ท่ี : วนั ทีอ่ นมุ ัติ :

ภาพ รายละเอยี ด

แสดงลักษณะแผ่นเพาะเช้ือ 3M PetrifilmTM EB ท่มี จี ำนวนโคโลนี
ของ Enterobacteriaceae อยูจ่ ำนวนน้อย และมีจำนวนของโคโลนี
ที่ไมใ่ ช่ Enterobacteriaceae อยูจ่ ำนวนมาก ไมต่ ้องนับโคโลนีที่
ปรากฎบนขอบฟิล์มเพราะโคโลนีเหล่าน้ีเจริญเติบโตอยนู่ อกสภาวะ
ทกี่ ำหนดไว้

Enterobacteriaceae Count = 9
ภาพที่ 2

จากภาพท่ี 3-8 ใหส้ ังเกตการเปลยี่ นแปลงสขี องเจล ถา้ จำนวนของ
Enterobacteriaceae เพิ่มขึ้นสีของเจลจะอ่อนลงจากสีม่วงเปน็
สเี หลืองหรือส้ม

Enterobacteriaceae Count = 0
ภาพที่ 3

ชอ่ื เร่อื ง : วิธีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หนา้ ที่ : 14 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนคร้ังท่ี : วนั ท่ีอนุมตั ิ :

ภาพ รายละเอียด

Enterobacteriaceae Count = 35
ภาพที่ 4

ช่วงการนบั ที่เหมาะสมบนแผ่น 3M PetrifilmTM EB อย่ทู ี่ 10-150
โคโลนี การประมาณจำนวนโคโลนีทำได้เมื่อในแผ่นมีจำนวน
มากกว่า 150 โคโลนี ในการนับจำนวนโคโลนใี น 1 ช่องตาราง
หรือมากกว่า แล้วหาค่าเฉลี่ยของจำนวนโคโลนีต่อ 1 ช่อง
จากนั้นจึงนำค่าเฉลี่ยมาคูณด้วย 20 (พื้นที่วงกลมในกา ร
เจรญิ เติบโตของแบคทเี รยี ) และรายงานจำนวนโคโลนีในแผ่นท่ีได้
เป็นค่าคาดประมาณ

Enterobacteriaceae Count = 77
ภาพทื่ 5

ชอ่ื เร่ือง : วิธที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ท่ี : 15 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนคร้งั ท่ี : วันท่อี นุมัติ :

ภาพ รายละเอียด

แผ่น 3M PetrifilmTM EB ท่มี จี ำนวนมากกว่า 150 โคโลนีและไม่
สามารถนบั แบบประมาณค่าได้ ให้รายงานผลเป็น TNTC (มากเกิน
กว่าจะนับได้) จากภาพที่ 6 จะเห็นลักษณะของเนื้อเจลจะมี
สีออ่ นลง เน่ืองจากมีจำนวนโคโลนเี ล็ก ๆ และฟองก๊าซเป็นจำนวน
มาก

Enterobacteriaceae Count = TNTC
ภาพที่ 6

จากภาพที่ 7 มจี ำนวนโคโลนมี ากกว่าจะนับได้ จนทำให้ไมส่ ามารถ
เห็นลกั ษณะของบริเวณกรดและฟองกา๊ ซได้ชัดเจนสีของเน้ือเจ ลท่ี
อ่อนลง บง่ บอกว่าเป็นลกั ษณะของ TNTC

Enterobacteriaceae Count = TNTC
ภาพท่ี 7

ช่อื เรอื่ ง : วิธที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ที่ : 16 จาก 20
สำเนาท่ี : ทบทวนครงั้ ท่ี : วนั ทีอ่ นมุ ตั ิ :

ภาพ รายละเอียด

จากลกั ษณะบนแผ่น 3M PetrifilmTM EB ในภาพที่ 8 บ่งบอกว่า
เป็น TNTC เน่ืองจากเนือ้ เจลมสี ีอ่อนลงและมีโคโลนีเลก็ ๆ เป็น
จำนวนมาก

Enterobacteriaceae Count = TNTC
ภาพท่ี 8

ฟองอากาศที่เกิดขึ้นขณะถา่ ยตัวอย่างลงบน 3M PetrifilmTM EB
ฟองเหล่านี้จะมีรูปร่างไม่แน่นอนและไม่เกี่ยวข้องกับโคโลนี
ดังภาพที่ 9

Enterobacteriaceae Count = 44
ภาพที่ 9

ชื่อเรอื่ ง : วิธที ดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หน้าท่ี : 17 จาก 20
สำเนาที่ : ทบทวนคร้งั ท่ี : วันทอ่ี นมุ ัติ :

7. บนั ทึกคุณภาพ
……………………………………………………………………………………………………………………………………………….

8. เอกสารอา้ งองิ

ค่มู ือการแปรผล. 3M Petrifilm Enterobacteriaceae count Plate. แผนกผลติ ภัณฑจ์ ลุ ชวี วทิ ยาบรษิ ทั

3 เอ็ม ประเทศไทย จำกัด. กรงุ เทพฯ

FDA. Bacteriological Analytical Manual (BAM), Reagents Index for BAM found at:
http://www.fda.gov/Food/ FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm055791.htm.

Horwitz, W. & Latimer, G. W. (eds) (2010) Official Methods of Analysis of AOAC International. 18th
edition, revision 3. Gaithersburg, Maryland, AOAC International.

ISO 7 2 1 8 . Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological
examination.

ISO 6 8 8 7 . Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination.

ISO 1 6 1 4 0 - 2 . Microbiology of the food chain – Method Validation -- Protocol for the validation
of alternative (proprietary) methods against a reference method.

ISO 2 1 5 2 8 - 2 . Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the
detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: colony count method.

ชื่อเร่อื ง : วธิ ีทดสอบหาปริมาณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หนา้ ท่ี : 18 จาก 20

สำเนาท่ี : ทบทวนครั้งท่ี : วันท่ีอนมุ ตั ิ :

Diagram of procedure for Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates (1/3)

การเตรียมสารละลายบฟั เฟอร์

ชอ่ื เร่ือง : วิธที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหัสเอกสาร : หน้าที่ : 19 จาก 20

สำเนาที่ : ทบทวนครั้งท่ี : วนั ทีอ่ นมุ ัติ :

Diagram of procedure for Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates (2/3)

การเตรยี มตัวอยา่ งสำหรับตวั อย่างน้ำเช่อื ม การเตรยี มตวั อย่างสำหรับ swab test

ชื่อเรือ่ ง : วธิ ที ดสอบหาปรมิ าณ Enterobacteriaceae โดยใช้
Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates

หมายเลข : รหสั เอกสาร : หนา้ ท่ี : 20 จาก 20

สำเนาที่ : ทบทวนครง้ั ที่ : วนั ทอ่ี นุมตั ิ :

Diagram of procedure for Petrifilm™ Enterobacteriaceae Count Plates (3/3)

วิธีการทดสอบ