48 กฎหมายกำหนด ประกาศกระทรวงสาธารณสุขฉบับที่ 283 (พ.ศ.2547) กำหนดให้มีปริมาณสารโพลาร์ในน้ำมันที่ใช้ ทอดหรือประกอบอาหารเพื่อจำหน่ายได้ไม่เกินร้อยละ 25 ของน้ำหนักหรือไม่เกิน 25% ผู้ประกอบการอาหารที่ใช้น้ำมันทอดอาหารที่มีค่าปริมาณสารโพลาร์เกินมาตรฐานที่กำหนดและ จำหน่ายแก่ผู้บริโภค ถือเป็นการจำหน่ายอาหารผิดมาตรฐาน ฝ่าฝืนมาตรา 25(3) ของพระราชบัญญัติอาหาร พ.ศ. 2522 ระวางโทษปรับไม่เกิน 50,000 บาท ตัวอย่างเป้าหมาย ใช้ตรวจน้ำมันที่ใช้ทอดอาหาร 9 ชนิด ประกอบด้วย น้ำมันปาล์ม (จากเนื้อปาล์ม) น้ำมันถั่วเหลือง น้ำมันมะพร้าว น้ำมันรำข้าว น้ำมันหมู น้ำมันมะพร้าวผสมน้ำมันปาล์ม (จากเนื้อปาล์ม) น้ำมันไก่ น้ำมันดอก ทานตะวัน และน้ำมันข้าวโพด ประโยชน์ของชุดทดสอบ ชุดทดสอบนี้ไม่มีการรบกวนจากเครื่องปรุงรสที่ผสมในอาหารสำหรับทอด เช่น ซอส ซีอิ๊วน้ำปลา น้ำตาล กระเทียม พริกไทย และผงปรุงรสต่าง ๆ สามารถตรวจสอบน้ำมันที่อุณหภูมิห้อง และน้ำมันอุ่นที่ อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส จำนวนตัวอย่างที่ตรวจได้/ชุด 25 ตัวอย่าง ชุดทดสอบสารโพลาร์ในน้ำมันทอดซ้ำ มี 2 แบบ แบบสีชมพู และแบบสีน้ำเงิน สามารถเลือกวิธีการตามชุด ทดสอบที่ใช้ให้เหมาะสม อุปกรณ์ชุดทดสอบ (แบบสีชมพู) 1. หลอดทดสอบตัวอย่าง 25 ชิ้น 2. หลอดดูดพลาสติก (ใช้ในการดูดและหยดตัวอย่าง) 25 ชิ้น 3. น้ำยาทดสอบสารโพลาร์ 1 ขวด 4. คู่มือการใช้ทดสอบ 1 แผ่น
49 วิธีการทดสอบ (แบบสีชมพู) 1. เติมน้ำยาทดสอบสารโพลาร์ ลงในหลอดทดสอบตัวอย่างจำนวน 4 หยด 2. จากนั้นเติมตัวอย่างน้ำมันลงในหลอดทดสอบตัวอย่าง จำนวน 2 หยด 3. กดปิดฝาหลอดทดสอบตัวอย่างให้แน่น เขย่าแนวขวาง 30 วินาที แล้วแปลผลทันที การประเมินผล การปฏิบัติเมื่อใช้ชุดทดสอบเสร็จแล้ว • หลอดทดสอบตัวอย่าง: เทสารเคมีในหลอดทดสอบตัวอย่างทิ้งลงในขวดทิ้งสารเคมี แล้วทิ้งหลอด ทดสอบตัวอย่าง • น้ำยาทดสอบสารโพลาร์: ปิดจุกขวดให้แน่นก่อนนำไปเก็บในกล่องชุดทดสอบ ข้อควรระวัง • หลังการใช้ชุดทดสอบแล้วควรทำความสะอาดมือด้วยสบู่ หรือน้ำยาทำาความสะอาด
50 • ควรเก็บชุดทดสอบให้ไกลจากมือเด็ก สัตว์เลี้ยง รวมถึงอาหารและเครื่องดื่ม การเก็บรักษาชุดทดสอบ / อายุการใช้งาน • เก็บน้ำยาทดสอบตัวอย่างหลังการใช้งานไม่ให้ถูกแสงแดดและความร้อน • เก็บที่อุณหภูมิห้อง สามารถเก็บได้นาน 1 ปี • วันหมดอายุที่กล่องบรรจุ แนวทางแก้ปัญหาเมื่อตรวจพบน้ำมันปรุงอาหารไม่ผ่านเกณฑ์กำหนด แนะนำผู้บริโภคให้เลิกใช้น้ำมันปรุงอาหารที่ไม่ผ่านเกณฑ์กำหนดเนื่องจาก มีสีกลิ่นรสและคุณภาพไม่ เหมาะสมต่อการนำมาทอดหรือปรุงอาหาร และอาจเป็นอันตรายต่อสุขภาพถ้าตรวจพบในร้านค้าให้แจ้ง เจ้าหน้าที่ผู้มีหน้าที่ดูแลด้านคุ้มครองผู้บริโภค เช่น เจ้าหน้าที่สำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา (อย.) หรือ เจ้าหน้าที่สาธารณสุขมาเก็บตัวอย่างส่งตรวจที่ห้องปฏิบัติการต่อไป ชุดทดสอบสารโพลาร์ในน้ำมันทอดซ้ำ (New Polar Blue Test) แบบสีน้ำเงิน อุปกรณ์ชุดทดสอบ (แบบสีน้ำเงิน) 1. หลอดทดสอบตัวอย่าง 25 ชิ้น 2. หลอดดูดพลาสติก (ใช้ในการดูดและหยดตัวอย่าง) 25 ชิ้น 3. น้ำยาทดสอบสารโพลาร์Polar 1 1 ขวด 4. น้ำยาทดสอบสารโพลาร์Polar 2 1 ขวด 5. คู่มือการใช้ทดสอบ 1 แผ่น สามารถทดสอบ น้ำมันปาล์ม น้ำมันถั่วเหลือง น้ำมันบัว น้ำมันรำข้าว น้ำมันข้าวโพด น้ำมันดอกทานตะวัน น้ำมันไก่ น้ำมันหมู น้ำมันมะพร้าว อุณหภูมิทดสอบ น้ำมันอุ่น ไม่เกิน 45 องศาเซลเซียส หรือ น้ำมันอุณหภูมิห้อง วิธีการทดสอบ (แบบสีน้ำเงิน) 1. เทน้ำยา Polar 1 ลงใน ขวดน้ำยา Polar 2 ให้หมด 2. หยดน้ำยาจากขวด Polar 2 จำนวน 4 หยดลงในหลอดทดสอบ จากนั้นเดิมตัวอย่างน้ำมัน 3 หอด ลงใน หลอดทดสอบ ปิดฝาหลอดเขย่า 30 ครั้ง แล้วแปลผลทดสอบทันที
51 การประเมินผล สีที่ปรากฏ ผลการตรวจวิเคราะห์ปริมาณ สารโพลาร์ (%) การแปรผล สีน้ำเงิน น้อยกว่า 20% น้ำมันยังไม่เสื่อมคุณภาพ สีเขียว อยู่ในช่วง 20%-25% น้ำมันใกล้เสื่อมคุณภาพ สีเหลือง มากกว่า 25% น้ำมันเสื่อมคุณภาพ วิธีการเก็บชุดทดสอบ • อุณหภูมิห้อง ไม่เกิน 35 องศาเซลเซียส ให้ห่างไกลจากเด็กและสัตว์เลี้ยง ข้อควรระวัง • น้ำยาทดสอบมีสภาพเป็นด่าง หากหกรดผิวหนังให้ทำความสะอาดด้วยสบู่ และล้างน้ำให้สะอาด อ้างอิง: คู่มือการใช้ชุดทดสอบอาหาร (ชุดทดสอบสารโพลาร์ในน้ำมันทอดซ้ำ) กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข www.dmsc.moph.go.th
52 ปฏิบัติการที่ 11 การทดสอบฟอร์มาลินในอาหาร (น้ำยาดองศพ) ผู้ประกอบการร้านค้าที่ขายอาหารทะเลสด ผักสด เครื่องในสดมักจะมีการนำสารฟอร์มาลินมาแช่ อาหาร เพื่อให้สดเสมอ แต่ฟอร์มาลินเป็นอันตรายต่อสุขภาพและห้ามนำมาใช้ในอาหาร ผลกระทบต่อสุขภาพ • หากบริโภคฟอร์มาลินที่ปนเปื้อนในอาหารเป็นเวลานาน จะทำให้เกิดมะเร็งได้ • สัมผัสหรือสูดดม จะทำให้ผิวหนังอักเสบ ระคายเคืองที่ตา จมูก ระบบทางเดินหายใจ • ถ้ารับประทาน 30-60 มิลลิลิตร จะทำาให้เกิดอาการปวดท้องรุนแรง อาเจียน ท้องเดิน หมดสติ และ เสียชีวิต กฎหมายกำหนด ประกาศกระทรวงสาธารณสุขฉบับที่ 151 (พ.ศ. 2536) กำหนดไว้ “ห้ามนำฟอร์มาลินมาใช้ในอาหาร” ตัวอย่างเป้าหมาย • น้ำแช่อาหารทะเลสด และเนื้อสัตว์ต่าง ๆ (ผ้าขี้ริ้ว ขาไก่เลาะกระดูก แมงกระพรุน ฯลฯ) • ผักสดชนิดต่าง ๆ (ถั่วฝักยาว เส้นมะละกอ เห็ดฟาง ขิงฝอย กระชายฝอย ฯลฯ) หมายเหตุ ห้ามบดหรือหั่น ตัวอย่างเป้าหมายทุกชนิด ประโยชน์ของชุดทดสอบ สามารถตรวจสอบการใช้ฟอร์มาลิน (น้ำยาดองศพ) ในผักสด อาหารทะเลสด ทราบผลได้ทันทีเพื่อเฝ้า ระวังด้านความปลอดภัยของอาหาร จำนวนตัวอย่างที่ตรวจได้/ชุด 1 ตัวอย่าง ความไวของชุดทดสอบ ระดับต่ำสุดที่ตรวจได้ 0.5 มิลลิกรัม / 1 กิโลกรัม (0.5 ppm)
53 ชุดทดสอบฟอร์มาลินแบ่งออกเป็นหลายประเภทขอยกตัวอย่าง 2 ประเภทดังนี้ ชุดทดสอบฟอร์มาลินแบบที่ 1 (สำหรับทดสอบเชิงปริมาณ) อุปกรณ์ชุดทดสอบ ขวดทดสอบฟอร์มาลิน 1 1 ขวด ขวดทดสอบฟอร์มาลิน 2 1 ขวด ขวดทดสอบฟอร์มาลิน 3 1 ขวด วิธีการทดสอบ (กรณีวิเคราะห์แบบเชิงปริมาณโดยใช้ชุดทดสอบแบบที่ 1 กล่องสีส้ม) 1. เทน้ำแช่ตัวอย่างอาหารลงในขวดทดสอบเบอร์ 1 ประมาณ 5 มิลลิลิตร หรือ 1 ใน 3 ของขวด (หากตัวอย่าง อาหารไม่มีน้ำให้ใช้น้ำสะอาดรินผ่านตัวอย่างอาหารให้ได้ปริมาณที่พอตรวจได้) ปิดฝาขวดและเขย่าจนสารเคมี ในขวดทดสอบละลายหมด **ห้ามหั่นหรือบดตัวอย่างอาหาร** 2. เทน้ำแช่ตัวอย่างอาหารจากขวดทดสอบเบอร์ 1 ลงขวดทดสอบเบอร์ 2 ปิดฝาขวดและเขย่าจนสารเคมีใน ขวดทดสอบละลายหมด
54 3. เทน้ำแช่ตัวอย่างอาหารจากขวดทดสอบเบอร์ 2 ลงขวดทดสอบเบอร์ 3 ปิดฝาขวดและแกว่งเบาๆ ให้ ของเหลวในขวดทดสอบเข้ากัน สังเกตสีที่เกิดขึ้น การประเมินผล ถ้าสารละลายเป็นสีชมพูถึงสีแดงแสดงว่ามีฟอร์มาลินเจือปนอยู่ในตัวอย่างอาหารนั้น ขั้นตอนการเตรียมกราฟมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) 1. คำนวณการเตรียม Stock Standard Formaldehyde 100 ppm 100 mL จากนั้นเจือจางเป็น 100 ppm 100 mL
55 2. คำนวณการเตรียมความเข้มข้นสารละลายมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) เพื่อทำกราฟ มาตรฐาน จำนวน 8 ความเข้มข้น ดังนี้ 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00 2.50 และ 3.00 ppm ตามลำดับ 3. เตรียมสารละลายมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) ทั้ง 8 ความเข้มข้นตามภาพ
56 4. นำสารละลายมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) ทั้ง 8 ความเข้มข้นมาทดสอบโดยใช้ชุดทดสอบ ฟอร์มาลิน (ตามวิธีการทดสอบข้างต้น) จากนั้นนำสารละลายมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) ทั้ง 8 ความเข้มข้นมาวิเคราะห์ค่าการดูดกลืนแสงโดยใช้เครื่อง UV-VIS Spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 519 nm 5. สร้างกราฟมาตรฐานหาค่าความสัมพันธ์ระว่าง ค่าความเข้มข้นของสารมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) (ppm) และค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 519 nm ดังตัวอย่าง และคำนวณหาค่า ความเข้มข้นของสารมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) (ppm) ของสารตัวอย่างที่ทำการวิเคราะห์
57 ตัวอย่างการคำนวณ y= 0.2154x + 0.0004 y = ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 519 nm x = ค่าความเข้มข้นของสารมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) (ppm) ค่าความเข้มข้นของสารมาตรฐานฟอร์มัลดีไฮด์ (Formaldehyde) (ppm) (x) = (y – 0.0004)/0.2154
58 ข้อควรระวัง 1. ไม่ควรตรวจสอบอาหารประเภทมีกลิ่นฉุน เช่น ผักชะอม กระถิน และผักกระเฉด สะตอ ผักกลุ่มนี้มี ฟอร์มาลินในธรรมชาติประมาณ 40 มก./กก. อาหารทะเลที่ไม่สดจะมีกลิ่นเหม็น จะมีฟอร์มาลินได้ประมาณ 5 มก./กก. 2. สารทดสอบจำเพาะกับ ฟอร์มัลดีไฮด์ ซึ่งเป็นสารกลุ่มอัลดีไฮด์ประเภทหนึ่งเป็นองค์ประกอบของอาหารตาม ธรรมชาติ การทดสอบตัวอย่างจึงต้องหลีกเลี่ยงการบดตัวอย่าง ให้ใช้น้ำล้าง หรือน้ำแช่ตัวอย่างเท่านั้น เพื่อ ป้องกันผลบวกลวง 3. อาหารที่นำมาตรวจสอบ ควรเก็บในสภาพแช่เย็น เนื่องจากฟอร์มาลินสามารถระเหยและเสื่อมสภาพได้ด้วย ความร้อน และภายใต้แสง 4. ควรตรวจสอบตัวอย่างทันที ไม่ควรเก็บตัวอย่างอาหารไว้หลายวัน เนื่องจากปริมาณฟอร์มาลินในอาหารจะ ลดลงได้จากการระเหย และอาจเกิดปฏิกิริยากับสารอาหารจะทำให้ผลคลาดเคลื่อนได้ เป็นได้ทั้งแบบ Irreversible (ทดสอบไม่พบ) และ Reversible (ทดสอบพบ) 5. น้ำยาทดสอบฟอร์มาลิน 3 มีสภาพเป็นกรดหากหกเปื้อนมือ หรือส่วนหนึ่งส่วนใดของร่างกาย ให้ล้างด้วยน้ำ และฟอกสบู่ให้สะอาด 6. อย่าวางชุดทดสอบไว้ใกล้มือเด็ก แนวทางปฏิบัติเมื่อตรวจพบฟอร์มาลินในอาหาร 1. แนะนำร้านค้าให้เลิกใช้ฟอร์มาลินในอาหาร เนื่องจากมีพิษต่อสุขภาพ ถ้าบริโภคอาหารนั้นเข้าไป 2. ถ้าพบมีการใช้บ่อยครั้ง ให้แจ้งเจ้าหน้าที่สาธารณสุขมาเก็บตัวอย่าง ส่งตรวจที่ห้องปฏิบัติการต่อไป ชุดทดสอบฟอร์มาลินแบบที่ 2 (สำหรับทดสอบเชิงคุณภาพ) อุปกรณ์ชุดทดสอบ 1. หลอดทดสอบ 50 อัน 2. หลอดดูดตัวอย่าง 10 อัน 3. กระบอกฉีดยา 1 อัน 4. ถ้วยละลายตัวอย่าง 5 อัน 5. น้ำยา FL 1 5 ขวด 6. น้ำยา FL 2 1 ขวด 7. น้ำยา FL 3 1 ขวด 8. น้ำกลั่น 1 ขวด 9. คู่มือ 1 แผ่น
59 วิธีการทดสอบ (กรณีวิเคราะห์แบบเชิงปริมาณโดยใช้ชุดทดสอบแบบที่ 2 กล่องแบบกลมสีน้ำเงิน) วิธีการเตรียมตัวอย่าง กรณีตัวอย่างแห้ง 1. ตักตัวอย่าง 1 ช้อนโต๊ะ ลงในบีกเกอร์ 2. เติมน้ำกลั่นปริมาตร 5 mL เขย่าเบา ๆ 1 นาที กรณีตัวอย่างที่มีน้ำแช่ 1. ดูดน้ำตัวอย่างมา 10 หยด โดยไม่ต้องละลายตัวอย่าง
60 แผนภาพวิธีการเตรียมตัวอย่างในการทดสอบฟอร์มาลิน วิธีการเตรียมน้ำยา FL.1 ดึงจุกขวดน้ำยา FL.1 ออกแล้วเติมน้ำกลั่น 1 mL ลงในขวด ปิดจุกกลับที่เดิม เขย่าให้สารละลาย ขั้นตอนการทดสอบ 1. ดูดตัวอย่าง แล้วหยดลงในหลอดทดสอบ (Eppendorf Tube or Microcentrifuge Tube) 10 หยด 2. หยดน้ำยา FL.1 ลงหลอดทดสอบ 1 หยด ปิดฝา เขย่าเบา ๆ 5 ครั้ง 3. หยดน้ำยา FL.2 ลงหลอดทดสอบ 2 หยด ปิดฝา เขย่าเบา ๆ 5 ครั้ง 4. หยดน้ำยา FL.3 ลงหลอดทดสอบ 1 หยด ปิดฝา เขย่าเบา ๆ 5 ครั้ง อ่านผลทันที
61 แผนภาพขั้นตอนการทดสอบ วิธีการแปลผล นำหลอดทดสอบเทียบสีกับแทบสีในคู่มือชุดทดสอบเพื่อเปรียบเทียบช่วงความเข้มข้นของฟอร์มาลิน การประเมินประสิทธิภาพชุดทดสอบโดยเทียบกับวิธีมาตรฐาน HPLC
62 ข้อแนะนำ 1. น้ำยา FL.1 1 ขวดใช้ทดสอบได้จำนวน 10 ตัวอย่าง เมื่อผสมแล้วให้เก็บในตู้เย็น 2-8 C เก็บไว้ได้ นาน 7 วัน 2. เก็บชุดทดสอบให้พ้นมือเด็ก และสัตว์เลี้ยง 3. เก็บชุดทดสอบที่อุณหภูมิไม่เกิน 30 C 4. เมื่อน้ำยาทดสอบหกราดผิวหนัง ให้ซับด้วยทิชชู่แล้วล้างออกด้วยสบู่อ่อน ๆ อ้างอิง: คู่มือการใช้ชุดทดสอบอาหาร (ชุดทดสอบฟอร์มาลินในอาหาร (น้ำยาดองศพ)) โดยบริษัท MASTERLAB
63 ปฏิบัติการที่ 12 ปฏิบัติการตรวจวิเคราะห์คุณภาพอาหาร โดยการตรวจวิเคราะห์โคลิฟอร์มแบคทีเรียและฟีคัลโคลิฟอร์ม แบคทีเรีย โดยวิธี Standard Multiple –Tube (MPN) Test หรือ Most Probable Number Concept (MPN) ขอบข่าย (Scope) วิธีนี้ใช้ในการตรวจวิเคราะห์แบคทีเรียกลุ่ม coliforms กลุ่ม fecal coliforms และ E. coli ใน อาหารครอบคลุมการตรวจหา (detection) และการตรวจปริมาณ (enumeration) นิยามศัพท์และคำย่อ (Terms and abbreviation) E. coli = Escherichia coli Shellfish = สัตว์ทะเลมีเปลือกที่บริโภคเป็นอาหารได้ เช่น กุ้ง หอย ปู IMViC = indole, methyl red, Voges-Proskauer, citrate หลักการ (Principle) แบคทีเรียในกลุ่ม coliforms เป็นแบคทีเรียแกรมลบ รูปท่อน ไม่สร้างสปอร์ เจริญได้ในที่ที่มี ออกซิเจนและไม่มีออกซิเจน (facultative anaerobe) สามารถใช้น้ำตาลแลคโตส (lactose) เกิดกรดและ สร้างก๊าซที่อุณหภูมิ 35 C ภายใน 48 ชั่วโมง พบทั่วไปในสิ่งแวดล้อม และในระบบ ทางเดินอาหารของคน และสัตว์ ใช้เป็นตัวบ่งชี้สุขลักษณะของน้ำและสิ่งแวดล้อมในกระบวนการผลิตอาหาร ส่วน fecal coliforms หรือ thermotolerant coliforms เป็นกลุ่มย่อยของแบคที่เรียกลุ่ม coliforms พบมากในระบบทางเดิน อาหารของคนและสัตว์ สามารถใช้น้ำตาลแลค โตส (lactose) เกิดกรดและสร้างก๊าซที่อุณหภูมิ 44.5 ถึง 45.5 C ภายใน 24-48 ชั่วโมง อาจใช้เป็นตัวบ่งชี้มาตรฐาน สำหรับ shellish และน้ำเพาะเลี้ยง shelfish สำหรับ E. coli เป็นแบคที่เรียชนิดหนึ่งในกลุ่ม fecal coliforms นิยมใช้เป็นจุลินทรีย์บ่งชี้สุขลักษณะการผลิตอาหาร การจำแนก E. coli อาศัยหลักการทางชีวเคมีของปฏิกิริยา IMViC ตามปกติการตรวจวิเคราะห์ coliforms, fecal coliforms และ E. coli ในอาหาร มักใช้วิธีมาตรฐาน (conventional method) แต่เนื่องด้วยคุณสมบัติ ที่ E. coli มากกว่า 95% สามารถสร้างเอนไซม์ W-glucuronidase (GUD) ซึ่งย่อย fluorogenic substrate เช่น 4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide (MUG) และให้สารเรืองแสง 4-methylumbelliferon (MU) ซึ่งเห็นเป็นสีน้ำเงิน ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต (UV) ความยาวคลื่นประมาณ 365 นาโนเมตร ในที่มืด ดังนั้นจึงอาจใช้หลักการทำงานของเอนไซม์ดังกล่าวในการตรวจสอบเบื้องต้นและการตรวจยืนยัน เพื่อจำแนก E. coli จากกลุ่ม coliforms เช่น การใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ LST-MUG broth, EC-MUG broth, VRBA-MUG นอกจากนี้อาจใช้chromogenic substrates อื่นแทน MUG สำหรับการตรวจวิเคราะห์ coliforms และ E. coli ได้เช่นกัน
64 การตรวจ coliforms, fecal coliforms และ E. coli ในอาหารแบ่งออกเป็น 1.1 การตรวจปริมาณ (enumeration) มี 2 วิธี คือ 1.1.1 วิธี MPN แบ่งเป็น 3 ขั้นตอน ดังนี้ 1.1.1.1 การตรวจสอบเบื้องต้น (presumptive phase) นำตัวอย่างเริ่มต้นหรือ ที่เจือจางตามความ เหมาะสมอย่างน้อย 3 ระดับติดต่อกัน ระดับละ 3 หรือ 5 หลอด ใส่ในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลวที่มีน้ำตาล แลคโตสเป็นองค์ประกอบ เพื่อแยก coliform ออกจากแบคที่เรียชนิดอื่นที่ไม่สามารถ ใช้น้ำตาลแลคโตสได้ 1.1.1.2 การตรวจยืนยัน (confirmed phase) นำหลอดที่ให้ก๊าซไปตรวจยืนยัน coliforms และ fecal coliforms โดยถ่ายเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อจำเพาะชนิดเหลว (selective broth) 1.1.1.3 การตรวจขั้นสมบูรณ์ (completed phase) แยกเชื้อและนำไปตรวจยืนยัน E. coli โดย ทดสอบทางชีวเคมี 1.1.2 วิธี pour plate: coliforms และ E. coli นำตัวอย่างเริ่มต้นหรือที่เจือจางตามความเหมาะสม ปิเปตลงบนจานเพาะเชื้อ เทด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ จำเพาะชนิดแข็ง นำไปบ่ม นับจำนวนโคโลนีที่มีลักษณะเฉพาะและนำไปตรวจยืนยันโดยทดสอบทางชีวเคมี 1.2 การตรวจหา (detection): coliforms และ E. coli ตรวจสอบเบื้องต้นโดยนำตัวอย่างเริ่มต้นหรือที่เจือจางตามความเหมาะสม ใส่ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ ชนิดเหลวที่มีน้ำตาลแลคโตสเป็นองค์ประกอบ จำนวน 2 หลอดต่อระดับการเจือจาง และดำเนินการตาม ขั้นตอนการตรวจยืนยันและการตรวจขั้นสมบูรณ์ อาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมี (Culture media and reagents): ภาคผนวก 1 อาหารเลี้ยงเชื้อ 1. 2% Brilliant green lactose bile (BGLB) broth 2. EC broth 3. Lactose broth • Lauryl tryptose (LST) broth • Lauryl tryptose MUG (LST-MUG) broth 4. Levine’s eosin-methylene blue (L-EMB) agar สารละลายสำหรับเจือจาง (diluent) ได้แก่ Butterfield’s phosphate-buffered water (BPB) หรือ equivalent diluent เช่น 0.1% peptone water (กรณี shellfish ใช้ BPB หรือ 0.5% peptone water)
65 เครื่องมือและอุปกรณ์ (Apparatus) เครื่องมือ 1. เครื่องนึ่งฆ่าเชื้อ (autoclave) 121 ± 3 C 2. เครื่องชั่ง (balance) 3. เครื่องบดปั่น (blender) หรือเครื่องตีผสมอาหาร (stomacher) 4. เครื่องนับโคโลนี (colony counter) 5. ตู้บ่มเพาะเชื้อ (incubator) 32 ± 1 C, 35 ± 1 C และ 35 ± 0.5 C (สำหรับ shellfish) 6. กล้องจุลทรรศน์ (microscope) 7. เครื่องวัดความเป็นกรด-เบส (pH-meter) 8. เครื่องผสม (vortex mixer) 9. อ่างน้ำแบบควบคุมอุณหภูมิ (water bath) 44.5 ± 0.2 C, 45.5 ± 0.2 C และ 47 ± 2 C อุปกรณ์ 1. โถปั่น (blender) หรือถุงตีผสมอาหาร (stomacher bag) 2. ขวดรูปชมพู่ (flask) หรือขวดแก้วฝาเกลียว 3. ห่วงและเข็มเขี่ยเชื้อ (loop and needle) 4. จานเพาะเชื้อ (petri dish) 5. ปิเปต (pipette) 6. หลอดทดลอง (test tube) 7. หลอดดักก๊าซ (Durham tube) 8. ตะแกรงหลอดทดลอง (test tube rack) ขั้นตอนการทดสอบ (Procedure) การสุ่มตัวอย่าง (Sampling) 1.กรณีที่ตัวอย่างเป็นของแข็ง ตัดตัวอย่างจากหลายๆ ตำแหน่งให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ ผสมให้เข้ากันกรณีที่ ตัวอย่างเป็นของเหลวข้นหนืดเขย่าให้ทั่ว สุ่มตัวอย่าง 50 กรัม (กรณีมีตัวอย่างน้อยกว่า 50 กรัม ให้ใช้ตัวอย่าง ครึ่งหนึ่ง) ใส่ในภาชนะปราศจากเชื้อ 2. กรณีที่ตัวอย่างเป็นของเหลว เขย่าตัวอย่างในแต่ละภาชนะบรรจุให้เข้ากัน เทหรือปิเปตตัวอย่างจาก แต่ละภาชนะปริมาตรเท่า ๆ กันใส่ในภาชนะปราศจากเชื้อ ให้ได้ปริมาตรรวมไม่น้อยกว่า 100 มิลลิลิตร เขย่า ให้เข้ากัน (ตัวอย่างเริ่มต้น) 3. กรณีที่ตัวอย่างเป็นหอยสองฝา (bivalve molluscan shellfish) สดและแช่แข็ง [ไม่รวม crustaceans (crabs, lobsters, and shrimp) และเนื้อหอยแปรรูป เช่น ชุบเกล็ดขนมปัง (breaded) แกะ เปลือก (shucked) และปรุงสุก (pre-cooked and heat-processed)] สุ่มตัวอย่างหอย 10-12 ตัว (ทั้งเนื้อ
66 และส่วนของเหลว น้ำหนักรวม 200 กรัม) ใส่ในภาชนะปราศจากเชื้อ เทสารละลายสำหรับเจือจาง 200 มิลลิลิตรผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องบดปั่นนาน 2 นาที จะได้ตัวอย่างเจือจาง 1:2 การเตรียมตัวอย่าง (Preparation of test sample) เจือจางตัวอย่างตามลำดับ ลำดับละ 10 เท่า (serial ten-fold dilutions) ด้วยสารละลายสำหรับ เจือจาง ดังนี้ กรณี 1 ตัวอย่างเป็นของแข็ง เทสารละลายสำหรับเจือจาง 450 มิลลิลิตร หรือปริมาตร 9 เท่าลงใน ตัวอย่าง ผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องบดปั่น 30-60 วินาที หรือเครื่องตีผสมอาหาร 2 นาที จะได้ตัวอย่างที่เจือ จาง 1:10 (initial suspension หรือ primary dilution) กรณี 2 ตัวอย่างเป็นของเหลว ปิเปตตัวอย่าง 10 มิลลิลิตร ใส่ในสารละลายสำหรับเจือจาง 90 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน จะได้ตัวอย่างเจือจาง 1:10 ปิเปตตัวอย่างที่เจือจาง 1:10 มา 10 มิลลิลิตร ใส่ใน สารละลายสำหรับเจือจาง 90 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน จะได้ตัวอย่างเจือจาง 1:100 ทำเช่นนี้ต่อไปจนได้ ตัวอย่าง ที่เจือจางตามต้องการ กรณี 3 ตัวอย่างเป็นหอยสองฝา หลังจากเตรียมตัวอย่างเจือจาง 1:2 ให้เริ่มทำการตรวจวิเคราะห์ ภายใน 2 นาที โดยนับจากทำการเจือจางเป็น 1:10 ด้วยสารละลายสำหรับเจือจาง (BPB หรือ 0.5% peptone water) ปริมาตร 4 เท่า (เช่น ตัวอย่างเจือจาง 1:2 ปริมาณ 20 กรัม ใส่สารละลายสำหรับเจือจาง 80 มิลลิลิตร) เขย่าให้เข้ากัน เตรียมสารเคมีและอาหารเลี้ยงเชื้อ 1. สารละลายบัฟเฟอร์ สารละลายบัฟเฟอร์ (Potassium Phosphate Buffer Solution, PBS) ละลายเกลือโพแทสเซียมได ไฮโดรเจนฟอสเฟต Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4 ) จำนวน 34.00 กรัม ในน้ำกลั่น 500 มิลลิลิตร ต้มด้วยไฟอ่อนๆ ทิ้งไว้ให้เย็น ปรับค่าความเป็นกรด-ด่าง ให้ได้ 7.2 ด้วยสารละลาย NaOH เข้มข้น 1 N (เตรียมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์โดยชั่ง NaOH 4 กรัม ละลายในน้ำกลั่น และปรับปริมาตรให้ครบ 100 มิลลิลิตร ด้วยขวดปรับปริมาตร) หลังจากนั้นปรับปริมาตรสารละลายที่ปรับ pH เรียบร้อยแล้วด้วยน้ำ กลั่น จนครบ 1000 มิลลิลิตร ด้วยขวดปรับปริมาตร แล้วเก็บไว้ในตู้เย็น เพื่อใช้เตรียมสารละลายเจือจาง ตัวอย่าง (Dilution Sample) สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์เฮกซะไฮเดรท MgCl2 .6H2O ชั่งสารเคมีจำนวน 81.10 กรัม ละลายใน น้ำกลั่น และปรับปริมาตรให้ครบ 1000 มิลลิลิตร ด้วยขวดปรับปริมาตร
67 KH2PO4 1.25 mL + MgCl2 .6H2O 5 mL เติมน้ำกลั่นให้ได้ 1000 mL Autoclave ความดันไอน้ำ 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว (15 PSI) อุณหภูมิ 121 0C เป็นเวลา 15 นาที 2. อาหารเลี้ยงเชื้อโคลิฟอร์ม วิธี MPN (คำนวณอัตราส่วนตามที่ต้องการใช้) - Lauryl Tryptose Broth (LTB) double ชั่งสารจำนวน 71.2 g ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่น 1000 mL ให้ ความร้อนจนละลาย ตวง 10 mL ใส่หลอดทดลองที่มีหลอดดักก๊าซบรรจุไว้ภายใน ปิดฝา Autoclave 121 C 15 min - Lauryl Tryptose Broth (LTB) ชั่งสารจำนวน 35.6 g ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่น 1000 mL ให้ความร้อนจน ละลาย ตวง 10 ml ใส่หลอดทดลองที่มีหลอดดักก๊าซบรรจุไว้ภายใน ปิดฝา Autoclave 121 C 15 min. - Brillian Green Lactose Bile Broth (BG) ชั่งสารจำนวน 40 g ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่น 1000 mL ให้ ความร้อนจนละลาย ตวงใส่หลอดทดลองที่มีหลอดดักก๊าซบรรจุไว้ภายใน ปิดฝา Autoclave 121 C 15 min. - EC Medium ชั่งสารจำนวน 37 g ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่น 1000 ml ให้ความร้อนจนละลาย ตวงใส่หลอด ทดลองที่มีหลอดดักก๊าซบรรจุไว้ภายใน ปิดฝา Autoclave 121 C 15 min. 3. อาหารเลี้ยงเชื้อ EMB Agar วิธี streak plate (คำนวณอัตราส่วนตามที่ต้องการใช้) - EMB Agar ชั่งสารจำนวน 37.46 g ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่น 1000 ml คนให้เข้ากัน ต้มสารละลายให้เดือด เทใส่ขวด Duran ทำการ Autoclave 121 C 15 min. เตรียมใส่หลอดทดลอง หลอดละ 9 มิลลิลิตร แล้วปิดฝา (สำหรับเจือจางตัวอย่างอาหารเป็น 1:100 และ 1:1000) เตรียมกลุ่มละ 2 หลอด เตรียมใส่ขวด Duran size 100 mL แล้วปิดฝา (สำหรับผสมกับตัวอย่างอาหาร อัตราส่วน อาหาร:บัฟเฟอร์ = 1:9) เตรียมกลุ่มละ 1 ขวด
68 การทดลอง MPN การเตรียมตัวอย่างอาหารเพื่อการวิเคราะห์ วิธีการตรวจวิเคราะห์หาโคลิฟอร์มแบคทีเรียในตัวอย่างอาหาร โดยวิธี MPN การตรวจขั้นสมบูรณ์ (completed phase): E. coli 1. นำหลอด EC broth ที่ให้ผลบวกขีดบน EMB agar (Streak Plate technique) 2. บ่มที่ 35 C 18-24 ชั่วโมง 3. สังเกตจำนวนโคโลนีที่เกิดขึ้น โดยโคโลนีลักษณะแบนและมีสีตรงกลาง มี metallic sheen บดตัวอย่างอาหาร ผสม Buffer (1 ส่วน) (9 ส่วน) (= 1:10)
69 ตาราง MPN ตารางที่ 1 ค่า MPN และ Confidence limits สำหรับผลบวกและผลลบ เมื่อใช้ตัวอย่าง 0.1, 0.01, 0.001 กรัม จำนวน 3 หลอดต่อระดับการเจือจาง
70 ตาราง MPN ตารางที่ 2 ค่า MPN และ Confidence limits สำหรับผลบวกและผลลบ เมื่อใช้ตัวอย่าง 0.1, 0.01, 0.001 กรัม จำนวน 5 หลอดต่อระดับการเจือจาง
71 ตาราง MPN (ต่อ)
72 เอกสารอ้างอิง (Reference) 1. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2002; updated 2013, Chapter 4 “Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria”. [ออนไลน์]. 2002; [สืบค้น 1 มิถุนายน 2565]. เข้าถึงได้ที่ http://www.fda.gov/Food/FoodScience Research/LaboratoryMethods/ucm064948.htm. 2. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2010; Appendix: 2 Most Probable Number from Serial Dilutions. [ออนไลน์]. 2010; [สืบค้น 1 มิถุนายน 2565]. เข้าถึงได้ที่ http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/ Laboratory Methods/ ucm109656.htm. 3. วิธีมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์อาหาร เล่มที่ 3 กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์
73 ปฏิบัติการที่ 13 ปฏิบัติการทดสอบอาหารที่ปนเปื้อนเชื้อ Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (Compendium method) เตรียมสารเคมี (คำนวณอัตราส่วนตามที่ต้องการใช้) 1. เตรียมสารละลาย 0.85 % NaCl สำหรับเจือจางตัวอย่างอาหาร โดยชั่ง NaCl 8.5 g ละลายในน้ำ กลั่น ปรับปริมาตรเป็น 1000 mL คนให้เข้ากัน เทใส่ขวด Duran ขนาด 100 mL กลุ่มละ 90 mL ต่อตัวอย่าง ปิดฝา Autoclave 121 C 15 min. 2. สารละลายบัฟเฟอร์สำหรับ swab มือ สารละลาย KH2PO4 1.25 mL + MgCl2 .6H2O 5 mL เติมน้ำกลั่นให้ได้ 1000 mL ตวง 5 mL ต่อ ตัวอย่าง ใส่หลอดทดลอง ปิดฝา จากนั้นนำไป Autoclave 121 C 15 min. 3. อาหารเลี้ยงเชื้อ Staphylococcus medium no.110 ชั่งจำนวน 149.5 กรัม ผสมในน้ำกลั่น 1000 mL คนให้เข้ากัน ต้มสารละลายให้เดือด เทใส่ขวด Duran ปิดฝา จากนั้นนำไป Autoclave 121 C 15 min. เทใส่เพลทที่ผ่านการ Autoclave ฆ่าเชื้อแล้ว แล้วตั้งทิ้งไว้จนวุ้นแข็งตัว เตรียมอุปกรณ์เครื่องแก้ว เตรียมอุปกรณ์ดังต่อไปนี้เข้าเครื่อง Autoclave ได้แก่ ช้อนตักตัวอย่างอาหาร, ปิเปต 0.1 mL, Petri Dish
74 รายงานผล จาก ปิเปต 0.1 mL มา Spread plate ดังนั้น จำนวนโคโลนี (CFU/g, CFU/ml) = จำนวนโคโลนีที่นับได้ x จำนวนเท่าที่เจือจาง x 10
75 เทคนิคการทดสอบเชื้อในจานเพาะเชื้อมีหลายเทคนิควิธีการดังนี้ เทคนิค Pour plate เมื่อตัวอย่างถูกเจือจางลงระดับละ 10 เท่า ทำการเพาะเชื้อจุลินทรีย์จากตัวอย่างที่มีระดับการเจือจาง เหมาะสม โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ 1 mL หยดไปบนจานอาหารแล้วเทอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอุณหภูมิ 44 – 46 C ลงไป ผสมเชื้อจุลินทรีย์กับให้เข้าอาหารโดยแกว่งจานอาหารไป-มาเบาๆ (รูปที่ 1) ทิ้งให้อาหารแข็งตัวแล้ว นำไปบ่ม ภายหลังบ่มแล้ว โคโลนีของจุลินทรีย์จะเจริญทั้งในและบนอาหารเลี้ยงเชื้อ นับจำนวนจุลินทรีย์ใน จานอาหารที่มีจำนวนเซลล์ 25-250 เซลล์ ก็จะทำให้สามารถคำนวณหาเชื้อจุลินทรีย์ต่อมล.หรือต่อกรัม ตัวอย่างได้ วิธีนี้หากใช้วุ้นที่ร้อนไปอาจทำให้ sensitive cell ตายหรือบาดเจ็บไม่สามารถสร้างโคโลนีได้ รูปที่ 1 วิธีการ pour plate เทคนิค Spread plate เป็นวิธีการนับจำนวนโคโลนีของจุลินทรีย์ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ 0.1 mL หยด ลงบนจานอาหารที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งแข็งตัวแล้ว (solidified agar medium) เชื้อจุลินทรีย์จะถูกแผ่กระจาย ทั่วผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยแท่งแก้วพิเศษที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (spreader) (รูปที่ 2) วิธีนี้ผู้วิเคราะห์จะ สามารถสังเกตลักษณะโคโลนีของจุลินทรีย์ได้ง่าย ในบางครั้งวิธี spread plate อาจนับปริมาณเซลล์ได้ มากกว่าวิธี pour plate เนื่องจากจุลินทรีย์ไม่ได้เจอกับความร้อนจากอาหารเลี้ยงเชื้อหลอมเหลวเหมือนวิธี pour plate ในกรณีที่ตัวอย่างมีเซลล์ จุลินทรีย์อยู่น้อย การใช้วิธีนี้อาจขาดความถูกต้องแม่นยำเนื่องจากใช้ ปริมาณตัวอย่างค่อนข้างน้อย (0.1 mL) ในการ plating รูปที่ 2 วิธีการ spread plate
76 เทคนิค Streak plate วิธีแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีนี้เป็นวิธีที่ประหยัดและง่ายที่สุด โดยเขี่ยเชื้อจากตัวอย่างลงบนจาน อาหารที่เหมาะสม แล้วทำการเจือจางเชื้อจุลินทรีย์บนอาหารด้วย loop ที่ผ่านการลนไฟ โดยแตะ loop ให้ โดนบริเวณที่มีเชื้ออยู่แล้ว ลากเชื้อออกไปจากแนวเดิมสัก 4 แนว แล้วจึงนำ loop ไปลนไฟ ทิ้งให้เย็น แล้ว ลากเชื้อออกจากแนวที่ 2 ออกไปอีกสัก 4 แนว จากนั้นนำ loop ลนไฟทิ้งให้เย็นแล้วลากเชื้อออกจากแนวที่ 3 อีกสัก 4 แนว ทำจนจานอาหารไม่มีที่ว่างให้ขีดอีก เมื่อบ่มให้เชื้อจุลินทรีย์เจริญแล้วจะพบว่า แนวเชื้อจุลินทรีย์ ที่ขีดตอนท้าย ๆ จะมีเชื้อจุลินทรีย์เจือจางลงจนได้โคโลนีเดี่ยว ๆ แยกออกมา รูปที่ 3 วิธีการ Streak plate
สาขาวิชาอนามัยสิ่งแวดลnอมคณะสาธารณส ุ ขศาสตรqมน.